DE60129860T2

DE60129860T2 - Rekombinante rsv-virus-expressionssysteme und -impfstoffe

Info

Publication number: DE60129860T2
Application number: DE60129860T
Authority: DE
Inventors: Hong Cupertino JIN; Roderick San Mateo TANG; Shengqiang Los Altos LI; Martin Carlisle BRYANT
Original assignee: MedImmune Vaccines Inc
Current assignee: MedImmune Vaccines Inc
Priority date: 2000-11-28
Filing date: 2001-11-28
Publication date: 2008-04-24
Anticipated expiration: 2021-11-29
Also published as: EP1480671B1; WO2002044334A2; PT1480671E; EP1920783A1; DE60129860D1; CA2797703A1; EP1480671A4; JP2004534514A; CY1107786T1; JP2009028041A; JP4268407B2; CA2430115C; DK1480671T3; AU3652202A; ATE369148T1; ES2291370T3; EP1480671A2; WO2002044334A3; AU2002236522B2; CA2430115A1

Description

1. Einleitung
Die vorliegende Erfindung umfasst rekombinante Template für Negativstrang-RNA-Viren, die verwendet werden können, um heterologe Genprodukte in geeigneten Systemen von Wirtszellen zu exprimieren und/oder um rekombinante Viren herzustellen, welche die heterologen Genprodukte exprimieren, verpacken und/oder darstellen. Die Expressionsprodukte und die chimären Viren können vorteilhaft für Impfstoff-Formulierungen verwendet werden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Herstellen von rekombinanten respiratorischen Syncytialviren und die Verwendung dieser rekombinanten Viren als Expressionsvektoren und Impfstoffe. Die Erfindung wird anhand von Beispielen beschrieben, bei welchen rekombinante respiratorische Syncytialvirus-Genome zur Erzeugung von infektiösen Viruspartikeln verwendet werden.
2. Hintergrund der Erfindung
Etliche DNA-Viren wurden genetisch verändert, um die Expression von heterologen Proteinen in Wirtzellsystemen zu steuern bzw. leiten (z.B. Vacciniavirus, Baculovirus usw.). Kürzlich wurden ähnliche Fortschritte mit Positivstrang-RNA-Viren (z.B. Poliovirus) gemacht. Es wird nachgedacht, ob die Expressionsprodukte dieser Konstrukte, d.h. die heterologen Genprodukte oder die chimären Viren, welche das heterologe Genprodukt exprimieren, möglicherweise in Impfstoff-Formulierungen nützlich sind (entweder eine Untereinheit oder Gesamtvirus-Impfstoffe). Ein Nachteil bei der Verwendung von Viren, wie etwa Vacciniavirus, bei der Herstellung von rekombinanten oder chimären Viren für die Verwendung in Impfstoffen ist die fehlende Variation in deren Hauptepitopen. Diese fehlende Variabilität in den Virusstämmen setzt bei der wiederholten Verwendung von chimärem Vacciniavirus dahingehend strenge Grenzen, dass mehrere Impfungen eine Resistenz des Wirts gegenüber dem Stamm erzeugen, sodass der geimpfte Virus den Wirt nicht infizieren kann. Die Impfung eines resistenten Individuums mit chimären Vacciniavirus wird folglich keine Immunstimulation induzieren.
Im Gegensatz dazu zeigen Negativstrang-RNA-Viren, wie etwa das Influenzavirus und das respiratorische Syncytialvirus, hinsichtlich ihrer Hauptepitope eine breite Variabilität. In der Tat sind Tausende von Influenzavarianten identifiziert worden, wobei sich jeder Stamm durch Antigenverschiebung entwickelt hat. Die Negativstrang-Viren, wie etwa das Influenzavirus und das respiratorische Syncytialvirus (RS-Virus) wären bei der Herstellung von chimären Viren für die Verwendung in Impfstoffen attraktive Kandidaten, da ihre genetische Variabilität die Herstellung eines riesigen Repertoires von Impfstoff-Formulierungen ermöglicht, welche die Immunität stimulieren, ohne das Risiko, dass eine Toleranz entwickelt wird.
2.1. Respiratorisches Syncytialvirus (RS-Virus)
Virusfamilien mit einer umhüllten Einzelstrang-RNA des Negativstranggenoms werden in Gruppen klassifiziert mit nicht segmentierten bzw. kontinuierlichen Genomen (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae) oder in diejenigen mit segmentierten Genomen (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae und Arenaviridae). Die Paramyoxviridae wurden in drei Gattungen klassifiziert: Paramyxovirus (Sendaivirus, Parainfluenzaviren Typ 1-4, Mumps, Newcastle-Disease-Virus), Morbillivirus (Masernvirus, Hundestaupevirus und Rinderpestvirus) und Pneumovirus (respiratorisches Syncytialvirus und respiratorisches Syncytialvirus des Rindes).
Das humane respiratorische Syncytialvirus (RSV) ist die Hauptursache von schweren Erkrankungen der unteren Atemwege bei Säuglingen und Kleinkindern und ist für eine beträchtliche Morbidität und Mortalität verantwortlich. In humanen Populationen sind zwei bezüglich der Antigene unterschiedliche RSV-Subtypen A und B vorhanden. Es wurde auch erkannt, dass das RSV bei abwehrgeschwächten Erwachsenen und bei Älteren ein bedeutender Krankheitserreger ist. Aufgrund der durch eine natürliche Infektion induzierten unvollständigen Resistenz gegenüber einer erneuten RSV-Infektion kann man sich während Kindheit und Lebens mehrere Male mit dem RSV infizieren. Das Ziel einer RSV-Immunprophylaxe ist die Induktion einer Resistenz, die ausreicht, um die schwere Erkrankung zu verhindern, die mit einer RSV-Infektion zusammenhängen kann. Die gegenwärtigen Strategien zur Entwicklung von RSV-Impfstoffen drehen sich im Allgemeinen um die Verabreichung eines gereinigten viralen Antigens oder die Entwicklung eines lebendattenuierten RSV für eine intranasale Verabreichung. Jedoch gibt es für das RSV bislang keine zugelassenen Impfstoffe oder eine hochwirksame antivirale Therapie.
Eine RSV-Infektion kann von einer nicht wahrnehmbaren Infektion bis zu einer schweren Pneumonie und zum Tod reichen. RSV besitzt ein einzelsträngiges, nicht segmentiertes Negativstrang-RNA-Genom mit 15 221 Nukleotiden (Collins, 1991, In: "The paramyxoviruses", S. 103-162, D.W. Kingsbury (Editor), Plenum Press New York). Das Genom des RSV codiert 10 mRNAs (Collins et al., 1984, J. Virol. 49: 572-578). Das Genom enthält an den 3'-Enden eine Leader-Sequenz mit 44 Nukleotiden, gefolgt von NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L und einer Trailer-Sequenz mit 155 Nukleotiden an den 5'-Enden (Collins, 1991, siehe oben). Jede Gentranskriptionseinheit enthält ein kurzes Stück einer konservierten Genstart (GS)-Sequenz und von Genend (GE)-Sequenz.
Als nackte RNA ist die virale genomische RNA nicht infektiös. Das RNA-Genom des RSV ist mit dem hauptsächlichen Nukleocapsid (N)-Protein eng verkapselt und es hängt mit dem Phosphoprotein (P) und der großen Untereinheit (L) der Polymerase zusammen. Diese Proteine bilden den Nukleoproteinkern, welcher als kleinste infektiöse Einheit erkannt wurde (Brown et al., 1967, J. Virol. 1: 368-272). Die RSV-Proteine N, P und L bilden die virale RNA-abhängige RNA-Transkriptase für die Transkription und Replikation des RSV-Genoms (Yu et al., 1995, J. Virol. 69: 2412-2419; Grosfeld et al., 1995, J. Virol. 69: 5677-86). Neuere Untersuchungen deuten darauf hin, dass die M2-Genprodukte (M2-1 und M2-2) an der Transkription beteiligt und für die Transkription erforderlich sind (Collins et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. 93:81-5).
Das M-Protein wird als peripheres Membranprotein exprimiert, wohingegen das F- und G-Protein als integrale Membranproteine exprimiert werden und mit der Anheftung des Virus und den Eintritt des Virus in Zellen verbunden sind. Die G- und F-Proteine sind die Hauptantigene, die in vivo neutralisierende Antikörper auslösen (wie von Mclntosh und Chanock, 1990 In: "Respiratory Syncytial Virus", 2. Auflage, Virology (D.M. Knipe et al., Editor) Raven Press, Ltd, N.Y. im Überblick dargestellt). Der Antigen-Dimorphismus des RSV zwischen den Subtypen A und B ist hauptsächlich mit dem G-Glykoprotein verbunden, wohingegen das F-Glykoprotein zwischen den Subtypen enger verwandt ist.
Trotz Jahrzehnten der Forschung wurde kein sicherer und wirksamer RSV-Impfstoff für die Prävention der schweren Morbidität und Mortalität entwickelt, die mit einer RSV-Infektion in Zusammenhang stehen. Ein mit Formalin inaktivierter Virusimpfstoff konnte gegenüber einer RSV-Infektion und den verschlimmerten Symptomen während einer nachfolgenden Infektion mit dem Wildtypvirus bei Säuglingen keinen Schutz bereitstellen (Kapikian et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89: 405-21, Chin et al., 1969, Am. J. Epidemiol. 89: 449-63). Seitdem haben sich die Anstrengungen auf die Entwicklung von lebend-attenuierten temperatursensitiven Mutanten durch chemische Mutagenese oder kalte Passage von Wildtyp-RSV konzentriert (Gharpure et al., 1969, J. Virol. 3: 414-21; Crowe et al., 1994, Vaccine 12: 691-9). Jedoch ergaben frühere Untersuchungen mit diesen lebend-attenuierten temperatursensitiven Mutanten entmutigende Ergebnisse. Die Viruskandidaten waren entweder zu wenig oder zu stark attenuiert (Kim et al., 1973, Pediatrics 52: 56-63; Wright et al., 1978, J. Pediatrics 88: 931-6) und einige der Impfstoffkandidaten waren genetisch instabil, was einen Verlust des attenuierten Phänotyps ergab (Rodes et al., 1974, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 145: 1158-64).
Es wurden auch Versuche gemacht, um rekombinante Vaccinia-Vektoren zu konstruieren, die F- oder G-Hüllglykoproteine des RSV exprimieren. Jedoch hat die Verwendung dieser Vektoren als Impfstoffe zum Schutz gegen eine RSV-Infektion in Tierversuchen widersprüchliche Ergebnisse gezeigt (Olmsted et al. 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 7462-7466; Collins et al., 1990, Vaccine 8: 164-168).
Somit haben sich die Anstrengungen auf die Konstruktion eines rekombinanten RSV zur Erzeugung von Impfstoffen gerichtet. Für eine lange Zeit waren Negativstrang-RNA-Viren gegenüber Untersuchungen nicht zugänglich. Erst kürzlich war es möglich, Negativstrang-RNA-Viren unter Verwendung eines rekombinanten reversen genetischen Ansatzes zu gewinnen ( U.S. Patent Nr. 5,166,057 von Palese et al.). Obwohl dieses Verfahren ursprünglich zur Konstruktion von Influenzavirusgenomen angewandt wurde (Luytjes et al., 1989, Cell 59: 1107-1113; Enami et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11563-11567), wurde es erfolgreich auf eine breite Auswahl von segmentierten und nicht segmentierten Negativstrang-RNA-Viren angewandt, einschließlich Tollwut (Schnell et al, 1994, EMBO J. 13: 3195-4203); VSV (Lawson et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-81); Masernvirus (Radecke et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-84); Rinderpestvirus (Baron & Barrett, 1997, J. Virol. 71: 1265-71); humanes Parainfluenzavirus (Hoffman & Banerjee, 1997, J. Virol. 71: 3272-7; Dubin et al., 1997, Virology 235: 232-32); SV5 (He et al., 1997, Virology 237: 249-60); Respiratorisches Syncytialvirus (Collins et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9663-9667) und Sendaivirus (Park et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5537-5541; Kato et al., 1996, Genes to Cells 1: 569-579). Obwohl dieser Ansatz zur erfolgreichen Gewinnung von RSV verwendet wurde, haben etliche Gruppen berichtet, dass das RSV bei der Untersuchung von mehreren bestimmten Eigenschaften des RSV, die es von den besser charakterisierten Paramyxoviren der Gattung Paramyxovirus, Rubulavirus und Morbillivirus unterscheiden, noch immer nicht zugänglich ist. Diese Unterschiede umfassen eine größere Anzahl von RNAs, eine ungewöhnliche Genreihenfolge am 3'-Ende des Genoms, eine intensive Sequenzvielfalt von Stamm zu Stamm, mehrere Proteine, die bei anderen, kontinuierlichen Negativstrang-RNA-Viren nicht zu finden sind, und das Erfordernis des M2-Proteins (ORF1), um mit dem vollständigen Processing der Volllängentranskripte fortzufahren und ein Volllängengenom zu erhalten (Collins et al., PCT WO97/12032 ; Collins, P.L. et al., S. 1313-1357 von Band 1, Fields Virology, et al., Ed. (3. Auflage, Raven Press, 1996).
3. Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft genetisch konstruierte rekombinante RS-Viren und virale Vektoren, die heterologe Gene enthalten, für die Verwendung als Impfstoffe. Erfindungsgemäß sind die rekombinanten RS-Virusvektoren und Viren so verändert, dass sie heterologe Gene enthalten, einschließlich Gene von anderen Viren, Pathogenen, zelluläre Gene, Tumorantigene, oder dass sie Kombinationen von Genen aus unterschiedlichen RSV-Stämmen codieren.
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen isolierten infektiösen RSV (Respiratorisches Syncytialvirus)-Partikel mit einem attenuierten Phänotyp, umfassend ein RSV-Antigenom oder -Genom, wobei das Genom oder Antigenom folgendes aufweist: (a) eine heterologe Sequenz, die für ein G- und F-Protein des RSV-Stamms 9320 codiert, und (b) eine Deletion des offenen Leserahmens M2-2.
Es werden rekombinante virale Negativstrang-RNA-Template beschrieben, die zur Transfektion von transformierten Zellen verwendet werden können, welche die RNA-abhängige RNA-Polymerase exprimieren und eine Komplementation ermöglichen. Alternativ kann ein Plasmid, das die Bestandteile der RNA-Polymerase unter einem geeigneten Promotor exprimiert, zur Transfektion von Zellen verwendet werden, um die Komplementation der viralen Negativstrang-RNA-Template zu ermöglichen. Eine Komplementation kann auch unter Verwendung eines Helfervirus oder Wildtypvirus erreicht werden, um die RNA-abhängige RNA-Polymerase bereitzustellen. Die RNA-Template werden durch Transkription von geeigneten DNA-Sequenzen mit einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase hergestellt. Die sich daraus ergebenden RNA-Template besitzen eine negative oder positive Polarität und enthalten geeignete terminale Sequenzen, welche eine Erkennung des Templats durch den viralen RNA-Syntheseapparat ermöglichen. Um eine interne Initiierung der Translation von viralen Sequenzen zu erlauben und die Expression von fremden, für Proteine codierenden Sequenzen von der regulären terminalen Initiationsstelle zu ermöglichen, oder umgekehrt, können bicistronische mRNAs konstruiert werden.
Wie durch die Beispiele hierin gezeigt wird, wird das rekombinante RSV-Genom in der positiven oder negativen Orientierung mit Expressionsvektoren cotransfiziert, welche das virale Nukleocapsid (N)-Protein, das assoziierte Nukleocapsid-Phosphoprotein (P), das Protein der großen Untereinheit (L) der Polymerase codieren, mit oder ohne M2/ORF1-Protein des RSV, um infektiöse virale Partikel zu erzeugen. Plasmide, die RS-Viruspolypeptide codieren, werden als Ursprung der Proteine verwendet, welche synthetisch hergestelltes RNP replizieren und transkribieren können. Es wurde gefunden, dass die minimale Menge der für eine spezifische Replikation und Expression des viralen RNP benötigten RSV-Proteine die drei Proteine des Polymerasekomplexes (N, P und L) sind. Dies deutet darauf hin, dass die vollständige M2-1-Genfunktion, bereitgestellt durch ein gesondertes M2-1-exprimierendes Plasmid, für die Replikation, Expression und den Erhalt von infektiösem RSV nicht unbedingt erforderlich ist.
Die erhaltenen Expressionsprodukte und/oder chimären Virionen können vorteilhaft in Impfstoff-Formulierungen verwendet werden. Insbesondere kann das rekombinante RSV, das genetisch so verändert ist, dass es einen attenuierten Phänotyp zeigt, als ein RSV-Lebendimpfstoff verwendet werden. Erfindungsgemäß wird das rekombinante RSV so verändert, dass es heterologe G- und F-Polypeptide des RSV-Stammes 69320 exprimiert, um ein chimäres RSV zu erzeugen, welches als Impfstoff dient, der bei Vertebraten sowohl humorale als auch zellvermittelte Immunreaktionen auslösen kann. Die Verwendung von rekombinantem RSV für diesen Zweck ist besonders attraktiv, da diese Viren eine enorme Variabilität zwischen den Stämmen aufweisen, was die Konstruktion eines riesigen Repertoires von Impfstoff-Formulierungen ermöglicht. Durch die Möglichkeit, bei der Konstruktion von chimären Viren aus Tausenden von Virusvarianten auszuwählen, wird das auftretende Problem der Wirtsresistenz vermieden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter die Attenuierung des humanen respiratorischen Sycytialvirus durch eine Deletion des offenen Leserahmens M2-2.
3.1. Definitionen
Die folgenden Begriffe haben bei einer Verwendung hierin die angegebenen Bedeutungen:

cRNA: = Antigenom-RNA
HA: = Hämagglutinin (Hüllglykoprotein)
HIV: = Humanes Immundefizienzvirus
L: = Große Untereinheit der Polymerase
M: = Matrixprotein (kleidet die Innenseite der Hülle aus)
MDCK: = Madin Darby-Hundenierenzellen
MDBK: = Madin Darby-Rindernierenzellen
moi: = Multiplizität der Infektion
N: = Nukleocapsidprotein
NA: = Neuraminidase (Hüllprotein)
NP: = Nukleoprotein (in Zusammenhang mit RNA und für die Polymeraseaktivität erforderlich)
NS: = Nichtstrukturprotein (unbekannte Funktion)
nt: = Nukleotid
P: = Nukleocapsidphosphoprotein
PA, BA1, PB2: = Bestandteile der RNA-abhängigen RNA-Polymerase
RNP: = Ribonukleoprotein (RNA, PB2, PB1, PA und NP)
rRNP: = rekombinantes RNP
RSV: = Respiratorisches Syncytialvirus
vRNA: = Genomische Virus-RNA
Viraler Polymerasekomplex: = PA, PB1, PB2 und NP
WSN: = Influenza A/WSN/33-Virus
HK-Virus:: Reassortment-Virus mit sieben Genen des WSN-Virus und dem NA-Gen des Influenza A/HK/8/68-Virus

4. Beschreibung der Figuren
1. Schematische Darstellung des RSV/CAT-Konstrukts (pRSVA2CAT), das bei den Gewinnungsexperimenten verwendet wurde. Die ungefähr 100 Nukleotide lange Leader- und die ungefähr 200 Nukleotide lange Trailer-Region des RSV wurden durch kontrollierte bzw. gesteuerte Hybridisierung von synthetischen Oligonukleotiden mit einer teilweise überlappenden Komplementarität konstruiert. Die überlappenden Leader-Oligonukleotide werden durch die in dem Konstrukt angegebenen 11-51 angezeigt. Die überlappenden Trailer-Nukleotide werden durch die in dem Konstrukt angegebenen 1T-9T angezeigt. Die Nukleotidsequenzen der Leader- und Trailer-DNA wurden an den angegebenen XbaI- bzw. PstI-Stellen in gereinigte CAT-Gen-DNA ligiert. Dieses gesamte Konstrukt wurde dann in pUC19 ligiert, welcher mit KpnI/HindIII verdaut worden war. Der Einschluss einer T7-Promotorsequenz bzw. einer die Trailer- und Leader-Sequenz flankierenden Hgal-Stelle ermöglichte in vitro die Synthese von RSV/CAT-RNA-Transkripten mit der exakten genomischen Sequenz der 3' und 5' Enden.
2. Dünnschichtchromatogramm (TLC), das die CAT-Aktivität zeigt, die in 293-Zellextrakten nach Infektion und Transfektion mit einer RNA vorliegt, die von dem in 1 gezeigten RSV/CAT-Konstrukt transkribiert wurde. Konfluente Monolager von 293-Zellen in Sechs-Well-Platten (–10⁶ Zellen) wurden entweder mit RSV A2 oder B9230 mit einer m.o.i. von 0,1-1,0 pfu pro Zelle infiziert. 1 Stunde nach der Infektion wurden die Zellen mit 5-10 μg CAT/RSV unter Verwendung des Protokolls Transfect-Act^TM von Life Technologies transfiziert. 24 Stunden nach der Infektion wurden die infizierten/transfizierten Monolager geerntet und für einen nachfolgenden CAT-Assay gemäß Current Protokols in Molecular Biology, Vol. 1, Kapitel 9.6.2; Gorman et al., (1982) Mol. Cell Biol. 2: 1044-1051 bearbeitet. Die Spuren 1, 2, 3 und 4 zeigen die CAT-Aktivität, in (1) liegen nicht infizierte 293-Zellen vor, infizierte 293-Zellen, die mit CAT/RSV-A2 transfiziert wurden, coinfiziert mit dem Überstand von (2) oben. Die in jeder Spur beobachtete CAT-Aktivität wurde durch 1/5 des gesamten zellulären Extrakts von 10⁶ Zellen produziert.
3. Schematische Darstellung des Genoms des RSV-Stamms A2, welche die relativen Positionen der Primerpaare zeigt, die für die Synthese von cDNAs verwendet wurden, welche das gesamte Genom umfassen. Es werden die zum Zusammenfügen dieser Klone verwendeten Endonukleasestellen angegeben; diese Stellen waren in der nativen RSV-Sequenz vorhanden und wurden in die für die cDNA-Synthese verwendeten Primer eingefügt. In den RT/PCR-Reaktionen für die separate Synthese von jeder der sieben cDNAs wurden ungefähr 100 ng virale genomische RNA verwendet. Es werden auch die Primer für die Synthese der Erststrang- und Zweitstrang-cDNA vom genomischen RNA-Templat gezeigt. Die Primer für die Synthese des Erststrangs für jede cDNA haben die Nummern 1–7 und die Primer für die Synthese des Zweitstrangs die Nummern 1'–7'.
4. Schematische Darstellung des RSV-Stamms B9320 Subtyp B. In den für die RT/PCR verwendeten Oligonukleotidprimern wurden BamHI-Stellen erzeugt, um die G- und F-Gene aus dem 69320-Stamm in die Antigenom-cDNA des RSV Subtyp A2 zu klonieren (4A). Ein cDNA-Fragment, das die G- und F-Gene von Nukleotid 4326 bis Nukleotid 9387 des A2-Stamms enthielt, wurde zuerst in pUC19 (pUCRVH) subkloniert. An den Positionen 4630 (Verbindung zwischen Genen SH/G) (4B) und 7554 (Verbindung zwischen Genen F/M2) (4C) wurden BgI II-Stellen erzeugt. B93260 A-G und -F cDNA wurde in pUCR/H insertiert, welcher bezüglich des A-G- und -F-Gens deletiert war. Der sich ergebende Antigenom-cDNA-Klon wurde als pRSVB-GF bezeichnet und zur Transfektion von Hep-2-Zellen verwendet, um infektiöses RSVB-GF-Virus zu erzeugen.
5. Rekombinantes RSVB-GF-Virus wurde durch RT/PCR unter Verwendung von Primern charakterisiert, die für den Subtyp B spezifisch sind. Die für den RSV-Subtyp B spezifischen Primer in der G-Region wurden mit Aliquots der rekombinanten RSV-Virusgenome inkubiert und einer PCR unterzogen. Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese auf einem 1%igen Agarosegel analysiert und durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Wie gezeigt, wurde in der RT/PCR-Reaktion unter Verwendung von RSV-A2 als Templat kein DNA-Produkt erzeugt. Jedoch war in der RT/PCR der RSVB-GF-RNA und der PCR-Kontrolle mit Plasmid-DNA von pRSV-GF als Templat ein erwartetes Produkt mit 254 Basenpaaren zu sehen, was zeigt, dass das gewonnene Virus die vom B9320-Virus stammenden G- und F-Gene enthielt.
6. Identifizierung des chimären rRSVA2(B-G) durch RT/PCR und Northern Blotting-Analyse der RNA-Expression. 6A. RT/PCR-Analyse des chimären rRSV A2(B-G) im Vergleich mit dem Wildtyp A2(A2). Virionen-RNA, extrahiert aus rRSVA2(B-G) (Spuren 1, 2) und rRSVA2 (Spuren 3, 4) wurde revers transkribiert unter Verwendung eines Primers, der an die (-)-Strang-vRNA in dem RSV-F-Gen gebunden war, in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (-) von reverser Transkriptase (RT), gefolgt von einer PCR mit einem Primerpaar, das die B-G-Insertionsstelle flankiert. In der RT/PCR wurde keine DNA nachgewiesen, wenn die reverse Transkriptase (RT) fehlte (Spuren 2, 4). Von rRSVA(B-G) wurde ein cDNA-Fragment erzeugt, welches um etwa 1 kb größer ist als die von A2 stammende cDNA. Dieses längere PCR-DNA-Produkt wurde durch das Restriktionsenzym Stu I verdaut, das einzig im insertierten B-G-Gen vorliegt (Spur 5). Es wird ein DNA-Größenmarker mit 100 bp angezeigt (M). 6B. Northern Blotting-Analyse der G-mRNA-Expression. Hep-2-Zellen wurden mit RSV B9320, rRSVA2 und chimärem rRSVA2 (B-G) infiziert. 48 Stunden nach der Infektion wurde die gesamte zelluläre RNA extrahiert und auf einem 1,2%igen Agarosegel mit Formaldehyd einer Elektrophorese unterzogen. Die RNA wurde auf eine Hybond-Nylonmembran übertragen und der Filter wurde mit einer mit ³²P markierten Oligonukleotidsonde hybridisiert, die für A2-G spezifisch ist oder für die B9320-G mRNA spezifisch ist. In den mit rRSVA2 (B-G) infizierten Zellen wurden sowohl A2-G-spezifische als auch 69320-G-spezifische Transkripte nachgewiesen. Ebenso wird das entscheidende RNA-Transkript (G-M2) aus den mit rRSV A2 (B-G) infizierten Zellen angezeigt.
7. Analyse der Proteinexpression durch rRSVA2 (B-G). Hep-2-Zellen wurden zum Schein infiziert (Spuren 1, 5), mit RSV B9320 infiziert (Spuren 2, 6), mit rRSVA2 infiziert (Spuren 3, 7) und mit rRSV A2 (B-G) infiziert (Spuren 4, 8). 14-18 Stunden nach der Infektion wurden die infizierten Zellen mit einem ³⁵S-Promix markiert und die Polypeptide wurden durch ein polyklonales Ziege-Antiserum gegen den RSV-Stamm A2 (Spuren 1-5) oder durch ein polyklonales Maus-Antiserum gegen den RSV-Stamm B9320 (Spuren 5-8) immunpräzipitiert. Die immunpräzipitierten Polypeptide wurden auf einem 10%igen Polyacrylamidgel getrennt. In mit rRSV A2 (B-G) infizierten Zellen wurden sowohl das RSV A2-spezifische G-protein als auch das RSV B9320-spezifische G-Protein produziert. Die Migration des G-Proteins wird durch * angezeigt. Es wird die Mobilität des F1-Glykoproteins und von N, P und M angezeigt. Die molekularen Größen sind an der linken Seite in Kilodalton angezeigt.
8. Plaquemorphologie von rRSV, rRSVC4G, rRSVA2(B-G) und Wildtyp A2-Virus (wt A2). Hep-2-Zellen wurden mit jedem Virus infiziert und bei 35°C für sechs Tage inkubiert. Die Zellmonolayer wurden fixiert, durch Immunfärbung sichtbar gemacht und fotografiert.
9. Wachstumskurve von rRSV, rRSVC4G, Wildtyp A2 RSV (wt A2) und chimärem rRSVA2 (B-G). Hep-2-Zellen wurden mit jedem Virus mit einer moi von 0,5 infiziert und das Medium wurde in Intervallen von 24 Stunden geerntet. Der Titer jedes Virus wurde zweifach durch einen Plaqueassay auf Hep-2-Zellen bestimmt und durch Immunfärbung sichtbar gemacht.
10. Cluster von geladenen Resten des RSV-L-Proteins, anvisiert für eine ortsgerichtete Mutagenese. Benachbarte geladene Aminosäurereste in Clustern wurden durch ortsgerichtete Mutagenese des RSV L-Gens unter Verwendung des QuikChange-Kits für ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene) zu Alaninresten umgewandelt.
11. Cysteinreste des RSV-L-Proteins, die für eine ortsgerichtete Mutagenese angesteuert werden. Die Cysteinreste wurden durch eine ortsgerichtete Mutagenese des RSV-L-Gens unter Verwendung des QuikChange Kits für die ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene) zu Alaninresten umgewandelt.
12. Identifizierung von RSV M2-2 und SH-Deletionsmutanten. Die Deletionen in M2-2 wurden erzeugt durch einen Hindill-Verdau von pET(S/B), gefolgt von einer erneuten Klonierung eines verbleibenden Fragments von Sac I bis BamHI in einen Volllängenklon. Die SH-Deletionen wurden erzeugt durch einen Sac I-Verdau von pET(A/S), gefolgt von einer erneuten Klonierung eines verbleibenden Fragments von Avr II bis Sac I in einen Volllängenklon. 12A. Die Identifizierung der erhaltenen rRSVΔSH und rRSVΔM2-2 wurde mittels RT/PCR unter Verwendung von Primerpaaren durchgeführt, die für das SH-Gen bzw. für das M2-2-Gen spezifisch waren. 12B. rRSVΔSHΔM2-2 wurde ebenso durch RT/PCR unter Verwendung von Primerpaaren nachgewiesen, die für das M2-2- und SH-Gen spezifisch waren. Die RT/PCR-Produkte wurden auf einem Ethidiumbromid-Agarosegel gefahren und die Banden wurden durch ultraviolettes (UV) Licht sichtbar gemacht.
13. Struktur des rA2ΔM2-2 Genoms und Gewinnung von rA2ΔM2-2. (A). Die gezeigten Sequenzen stellen die Region des M2-Gens dar, worin die offenen Leserahmen von M2-1 und M2-2 überlappen. Durch die eingebrachten Hind III- Stellen (unterstrichen) wurden ingesamt 234 Nukleotide deletiert, welche die 78 C-terminalen Aminosäuren von M2-2 codieren. Die 12 N-terminalen Aminosäurereste des offenen Leserahmens von M2-2 werden beibehalten, da sie mit dem M2-1 Gen überlappen. (B). RT/PCR-Produkte von viraler RNA von rA2ΔM2-2- und rA2 unter Verwendung der Primer V1948 und V1581 in Anwesenheit (+) oder Abwesenheit (-) von reverser Transkriptase (RT). Es ist die Größe des DNA-Produkts angegeben, das von rA2 oder rA2ΔM2-2 stammt.
14. Virale RNA-Expression durch rA2ΔM2-2 und rA2. (A). Aus Vero-Zellen, die mit rA2 oder rA2ΔM2-2 infiziert wurden, wurde 48 Stunden nach der Infektion Gesamt-RNA extrahiert, durch Elektrophorese auf 1,2%igen Agarose/2,2 M Formaldehyd-Gelen aufgetrennt und auf Nylonmembranen übertragen. Jeder Blot wurde mit einer Dig-markierten Ribosonde hybridisiert, die für das M2-2-, M2-1--, F-, SH-, G- oder N-Gen spezifisch war. Die Größe der RNA-Marker ist auf der linken Seite angegeben. (B). Hep-2- und Vero-Zellen wurden für 24 Stunden mit rA2 oder rA2ΔM2-2 infiziert und die gesamte zelluläre RNA wurde extrahiert. Ein RNA-Northern Blotting wurde mit einer ³²P-markierten Ribosonde hybridisiert, die für das Negativstrang-F-Gen spezifisch war, um Virus-Genom-RNA nachzuweisen, oder wurde mit einer ³²P-markierten Ribosonde hybridisiert, die für die Positivstrang-F-Gen spezifisch war, um Virus-Antigenom-RNA und F-mRNA nachzuweisen. Das obere Feld des Northern Blottings auf der rechten Seite wurde aus dem oberen Teil des im unteren Feld gezeigten Gels entnommen und wurde für 1 Woche exponiert, um das Antigenom zu zeigen. Das untere Feld des Northern Blotting wurde für 3 Stunden exponiert, um die F-mRNA zu zeigen. Genom, Antigenom, F-mRNA und dicistronische F-M2 RNA werden angezeigt.
15. Virale Proteinexpression in mit rA2ΔM2-2 und mit rA2 infizierten Zellen. (A). Scheininfizierte, mit rA2ΔM2-2 und mit rA2 infizierte Vero-Zellen wurden zwischen 14 bis 18 Stunden nach der Infektion metabolisch mit ³⁵S-Promix (100 μCi/ml) markiert. Die Zelllysate wurden für eine Immunpräzipitation mit polyklonalem Ziege-Anti-RSV-Antiserum oder einem polyklonalen Kaninchen-Anti-M2-2-Antiserum präpariert. Die immunpräzipitierten Polypeptide wurden auf einem 17,5%igen Polyacrylamidgel mit 4 M Harnstoff aufgetrennt und für eine Autoradiographie bearbeitet. Die Positionen von jedem Virusprotein sind auf der rechten Seite angegeben und die Marker für die Molekulargewichtsgröße werden auf der linken Seite angegeben. (B). Proteinsynthesekinetik in Hep-2- und Vero-Zellen durch Western Blotting. Hep-2- und Vero-Zellen wurden mit rA2 oder rA2ΔM2-2 infiziert und 10 Stunden, 24 Stunden oder 48 Stunden nach der Infektion wurden die gesamten Polypeptide der infizierten Zellen auf einem 17,5%igen Polyacrylamidgel mit 4 M Harnstoff aufgetrennt. Die Proteine wurden auf eine Nylonmembran übertragen und der Blot wurde mit polyklonalen Antiseren gegen M2-1, NS1 oder SH, wie angegeben, untersucht.
16. Plaquemorphologie von rA2ΔM2-2 und rA2. Hep-2- oder Vero-Zellen wurden mit rA2ΔM2-2 oder rA2 unter einer halbfesten Schicht, die aus 1% Methylcellulose und 1 × L15 Mediuim mit 2% FBS zusammengesetzt war, für 5 Tage infiziert. Die Virusplaques wurden durch Immunfärbung mit einem polyklonalen Ziege-Anti-RSV-Antiserum sichtbar gemacht und unter einem Mikroskop fotografiert.
17. Wachstumskurven von rA2ΔM2-2 in Hep-2- und Vero-Zellen. Vero-Zellen (A) oder Hep-2-Zellen (B) wurden mit rA2ΔM2-2 oder rA2 mit einer m.o.i. von 0,5 infiziert, und in den angegebenen Intervallen von 24 Stunden wurden Aliquots des Mediums geerntet. Die Virustiter wurden durch einen Plaqueassay in Vero-Zellen bestimmt. Der Virustiter für jedem Zeitpunkt ist ein Durchschnitt von zwei Experimenten.
18. Northern Blotting Analyse von rA2ΔNS1, rA2ΔNS2 und rA2ΔNS1ΔNS2. Aus Vero-Zellen, die mit rA2, rA2ΔNS1, rA2ΔNS2 und rA2ΔNS1ΔNS2 infiziert wurden, wurde 24 Stunden nach der Infektion die gesamte zelluläre RNA extrahiert, durch Elektrophorese auf Gelen mit 1,2% Agarose/2,2 M Formaldehyd aufgetrennt und auf Nylonmembranen übertragen. Jeder Blot wurde mit einer Dig-markierten Ribosonde hybridisiert, die spezifisch für das NS1-, NS2- oder M2-2-Gen war, wie angegeben.
19. Plaquemorphologie von Deletionsmutanten. Hep-2- oder Vero-Zellen wurden mit jeder Deletionsmutante, wie angegeben, unter einer halbfesten Schicht, die aus 1% Methylcellulose und 1 × L15 Medium mit 2% FBS zusammengesetzt war, für 6 Tage infiziert. Die Virusplaques wurden durch Immunfärbung mit einem polyklonalen Ziege-Anti-RSV-Antiserum sichtbar gemacht und unter einem Mikroskop fotografiert.
20. Wachstumskurven von rA2ΔNS1 in Vero-Zellen. Vero-Zellen wurden mit rA2ΔNS1 oder rA2 mit einer m.o.i. von 0,5 infiziert, und Aliquots des Mediums wurden in den angegebenen 24 Stunden-Intervallen geerntet. Die Virustiter wurden durch einen Plaqueassay in Vero-Zellen bestimmt.
21. Wachstumskurven von rA2ΔNS2 in Vero-Zellen. Vero-Zellen wurden mit rA2ΔNS2 oder rA2 mit einer m.o.i von 0,5 infiziert, und Aliquots des Mediums wurden in den angegebenen 24 Stunden-Intervallen geerntet. Die Virustiter wurden durch einen Plaqueassay in Vero-Zellen bestimmt.
22. Wachstumskurven von rA2ΔSHΔM2-2 in Vero-Zellen. Vero-Zellen wurden mit rA2ΔSHΔM2-2 oder rA2 mit einer m.o.i. von 0,5 infiziert, und Aliquots des Mediums wurden in den angegebenen 24 Stunden-Intervallen geerntet. Die Virustiter wurden durch einen Plaqueassay in Vero-Zellen bestimmt.
23. Northern Blotting-Analyse von mehreren Deletionsmutanten. Zelluläre Gesamt-RNA wurde 24 Stunden nach der Infektion aus Vero-Zellen extrahiert, die jeweils mit der angegebenen Deletionsmutante infiziert wurden, durch Elektrophorese auf Gelen mit 1,2% Agarose/2,2 M Formaldehyd aufgetrennt und auf Nylonmembranen übertragen. Jeder Blot wurde mit einer Dig-markierten Ribosonde hybridisiert, welche für das NS1-, NS2-, SH- oder M2-2-Gen spezifisch war, wie angegeben.
24. Wachstumskurven von rA2ΔNS2ΔM2-2 in Vero-Zellen. Vero-Zellen wurden mit rA2ΔNS2ΔM2-2 oder rA2 mit einer m.o.i. von 0,5 infiziert, und Aliquots des Medium wurden in den angegebenen 24 Stunden-Intervallen geerntet. Die Virustiter wurden durch einen Plaqueassay in Vero-Zellen bestimmt.
25. Wachstumskurven von rA2ΔNS1ΔNS2 in Vero-Zellen. Vero-Zellen wurden mit rA2ΔNS1ΔNS2 oder rA2 mit einer m.o.i von 0,5 infiziert, und Aliquots des Mediums wurden in den angegebenen 24 Stunden-Intervallen geerntet. Die Virustiter wurden durch einen Plaqueassay in Vero-Zellen bestimmt.
26. Insertion der G- und F-Gene des RSV-Stamms B9320 in den rekombinanten A2-Stamm. Die G- und F-Gene von B9320 wurden durch RT/PCR amplifiziert unter Verwendung von Primern, welche die BamHI-Restriktionsenzymstellen enthielten. Eine DNA-Kassette mit den G- und F-Genen von B9320 wurde dann unter Verwendung der eingefügten BgI II-Restriktionsenzmstellen, welche die RSV-G- und F-Gene des A2-Stamms flankierten, in den pRSV(R/H)-Subklon eingebracht. Das cDNA-Fragment mit den G- und F-Genen von B9320 wurde anschließend durch Ligation der XhoI- und BamHI-Stellen in die Volllängen-Antigenom-A2-cDNA eingeschoben. Das Genstart-Signal des G-Gens und das Genend-Signal des F-Gens von B9320 wurden unterstrichen, und die für die Klonierung verwendeten Restriktionsenzymstellen werden angegeben.
27. Stammspezifische Expression des chimärem RSV rA-G_BF_B und rA-G_BF_BΔM2-2. A. Virale RNA-Expression. Zelluläre Gesamt-RNA wurde aus mit Virus infizierten Vero-Zellen extrahiert und die Northern Blots wurden mit Sonden hybridisiert, die jeweils für das G- oder F-Gen des RSV-Subtyps A oder B spezifisch waren. Die M2-2-Genexpression wurde unter Verwendung einer Ribosonde untersucht, die für den offenen Leserahmen M2-2 spezifisch war. B. Virale Proteinexpression. Die infizierten Vero-Zellen wurden mit ³⁵S-Methionin und ³⁵S-Cystein markiert und das Zelllysat wurde mit einem polyklonalen Anti-RSV-Antikörper oder Anti-M2-2-Antikörper immunpräzipitiert. Um die G-Proteinexpression nachzuweisen, wurden die Extrakte der infizierten Zellen einem Western Blotting unterzogen, unter Verwendung eines Subtyp-spezifischen, monoklonalen Antikörpers gegen das G-Protein. Sowohl rA-G_BF_B als auch rA-G_BF_BΔM2-2 exprimierten die für den Subtyp B spezifischen G- und F-Proteine und behielten die normale Expression der anderen Gene bei, die von dem Grundgerüst des Subtyps A2 stammten. In den mit rA-G_BF_BΔM2-2 infizierten Zellen wurde kein M2-2 Protein exprimiert. Spur 1: rA2, Spur 2: rA2ΔM2-2, Spur 3: B9320, Spur 4: rA-G_BF_B, Spur 5: rA-G_BF_BΔM2-2.
28. Wachstumskinetik der chimären Viren in Hep-2- und Vero-Zellen. Hep-2- oder Vero-Zellen wurden Viren in zweifachen Ansätzen mit einer m.o.i. entweder von 0,1 oder von 0,01 infiziert. In 24 Stunden-Intervallen wurden die Überstände der infizierten Kulturen geerntet und die Virustiter wurden durch einen Plaqueassay in Vero-Zellen bestimmt.
5. Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft genetisch veränderte RS-Viren und virale Vektoren, die heterologe G- und F-Gene exprimieren und eine Deletion des offenen Leserahmens M2-2 umfassen. Die Erfindung betrifft die Herstellung und die Verwendung von rekombinanten Negativstrang-RS-Virus-RNA-Templaten, welche mit einer viralen, RNA-abhängigen RNA-Polymerase verwendet werden können, um von heterologen Genprodukten in geeigneten Wirtszellen zu exprimieren und/oder die heterologen Gene in Viruspartikeln zu erhalten. Die RNA-Template der vorliegenden Erfindung können durch Transkription von geeigneten DNA-Sequenzen unter Verwendung einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase, wie etwa der T7-, T3- oder Sp6-Polymerase, aus Bakteriophagen hergestellt werden. Die rekombinanten RNA-Template können verwendet werden, um kontinuierliche/transfizierte Zelllinien zu transfizieren, welche die Proteine der RNA-abhängigen RNA-Polymerase exprimieren, was eine Komplementation ermöglicht.
Die Erfindung wird durch Arbeitsbeispiele veranschaulicht, in denen infektiöser RSV aus cDNA gewonnen wird, die das RSV-Genom als Genom oder Antigenom enthält, die in Zellen eingebracht wird, welche die N-, P- und L-Proteine des RSV-Polymerasekomplex exprimieren. Die zusammenhängenden Beispiele zeigen weiter, dass die Expression des M2-1-Expressionsplasmids im Gegensatz zu früheren Berichten für die Gewinnung von infektiösem RSV aus cDNA nicht erforderlich ist (Collins et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11563-7). Weiterhin ergibt die Deletion des M2-ORF2 aus rekombinanter RSV-cDNA die Gewinnung von attenuierten RSV-Partikeln. M2-2-deletiertes RSV ist ein ausgezeichnetes Vehikel zur Erzeugung von chimärem RSV, das heterologe Genprodukte codiert, wobei diese chimären viralen Vektoren und gewonnenen Viruspartikel als Expressionsvektoren für die Expression von heterologen Genprodukten und als lebend-attenuierte RSV-Impfstoffe nützlich sind, die entweder Antigen-Polypeptide des RSV oder Antigen-Polypeptide von anderen Viren exprimieren.
Die Erfindung wird weiterhin anhand von Arbeitsbeispielen veranschaulicht, in denen ein cDNA-Klon, der neben einem T7-Promotor, einem Hepatitis-delta-Virusribozym und einem T7-Terminator das vollständige RSV-Genom enthielt, bei einer Cotransfektion mit Expressionvektoren, welche die N-, P-, L-Proteine des RSV codieren, zur Erzeugung eines infektiösen Viruspartikels verwendet wird. Außerdem beschreiben die Arbeitsbeispiele RNA-Transkripte von klonierter DNA mit der codierenden Region – in Negativstrangorientierung – des Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT)-Gens oder des GFP (Green Fluorescent Protein)-Gens, flankiert durch die terminalen 5'-Nukleotide und die terminalen 3'-Nukleotide des RSV-Genoms. Die Arbeitsbeispiele zeigen weiter, dass ein mutierter RSV-Promotor mit einer erhöhten Aktivität zur hocheffizienten Gewinnung von infektiösen RSV- Partikeln aus einer Volllängen-RSV-cDNA führt. Diese Ergebnisse zeigen die erfolgreiche Verwendung von rekombinanten viralen Negativstrang-Templaten und von RSV-Polymerase mit einer erhöhten Aktivität zur Gewinnung von RSV. Dieses System ist ein ausgezeichnetes Werkzeug zur Konstruktion von RSV-Viren mit definierten biologischen Eigenschaften, z.B. lebend-attenuierte Impfstoffe gegen RSV, und zur Verwendung von rekombinantem RSV als Expressionsvektor für die Expression von heterologen Genprodukten.
Diese Erfindung betrifft die Konstruktion und Verwendung von rekombinanten viralen Negativstrang-RNA-Templaten, die in geeigneten Wirtszellen mit einer viralen, RNA-abhängigen RNA-Polymerase zur Expression von heterologen G- und F-Genprodukten aus dem RSV-Stamm B9320 verwendet werden können, um heterologe Gene in Viruspartikeln zu erhalten und um mutierte chimäre rekombinante virale Negativstrang-RNA-Template zu exprimieren (siehe U.S. Patent Nr. 5,166,057 von Palese et al., hierin insgesamt durch Bezugnahme enthalten). Das heterologe Genprodukt ist ein Peptid oder ein Protein, das vom RSV-Stamm B9320 stammt. Die RNA-Template können in Positiv- oder Negativstrang-Orientierung vorliegen und werden durch Transkription von geeigneten DNA-Sequenzen unter Verwendung einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase, wie etwa der T7-, T3- oder Sp6-Polymerase aus Bakteriophagen, hergestellt.
Die Fähigkeit zur Wiederherstellung von RNPs in vitro ermöglicht die Konstruktion von neuen chimären Influenza- und RSV-Viren, die fremde Gene exprimieren. Ein Weg zum Erreichen dieses Ziels betrifft die Modifikation von vorhandenen viralen Genen. Beispielsweise kann das G- oder F-Gen so modifiziert werden, dass es fremde Sequenzen enthält, wie etwa das Influenza-HA-Gen in den externen Domänen. Wenn die heterologe Sequenz Epitope oder Antigene von Pathogenen darstellt, können diese chimären Viren verwendet werden, um gegen den Krankheitserreger, von welchem diese Determinanten stammen, eine schützende Immunreaktion zu induzieren. Beispielsweise kann eine chimäre RNA konstruiert werden, in der eine codierende Sequenz, die von der codierenden gp120-Region des humanen Immundefizienzvirus stammt, in die codierende Sequenz des RSV insertiert wurde, und durch Transfektion dieses chimären RNA-Segments in eine Wirtszelle, die mit Wildtyp-RSV infiziert wurde, wird chimäres Virus produziert.
Neben der Modifikation von Genen, die Oberflächenproteine codieren, können Gene verändert werden, die keine Oberflächenproteine codieren. Es wurde gezeigt, dass letztere Gene mit den meisten der wichtigen zellulären Immunreaktionen im RS-Virussystem zusammenhängen. Somit kann der Einschluss einer fremden Determinante in das G- oder F-Gen des RSV – nach Infektion – eine wirksame zelluläre Immunreaktion gegen diese Determinante induzieren. Solch ein Ansatz kann insbesondere in Situationen hilfreich sein, in denen eine schützende Immunität stark von der Induktion der zellulären Immunreaktionen abhängt (z.B. Malaria usw.).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Erzeugung eines attenuierten reokmbinanten RSV, der durch Einbringen einer spezifischen Deletion des viralen akzessorischen M2-2-Gens hergestellt wird. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung speziell die Erzeugung eines attenuierten, rekombinanten RSV, der eine kombinierte Deletion der viralen akzessorischen M2-2/SH-Gene, der viralen akzessorischen M2-2/NS2-Gene oder der viralen akzessorischen NS1/NS2-Gene trägt.
Die Erfindung wird durch die hierin dargestellten Arbeitsbeispiele veranschaulicht, in welchen ein infektiöses attenuiertes RSV aus RSV-cDNA mit Deletionen in viralen akzessorischen M2-2-Gen(en) entweder einzeln oder in Kombination, beispielsweise M2-2/SH, M2-2/NS2 erhalten wird, das deletierte RSV stellt ausgezeichnete Vehikel für die Erzeugung von lebend-attenuierten RSV-Impfstoffen dar.
5.1. Herstellung der rekombinanten RNA-Template
Heterologe codierende Gensequenzen, die vom Komplement aus viraler Polymerasebindungsstelle/Promotor flankiert werden, z.B. vom Komplement der 3'-RSV-Termini oder der 3' und 5'-RSV-Termini, können unter Verwendung der im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Heterologe codierende Gensequenzen können unter Verwendung der im Stand der Technik bekannten Verfahren auch vom Komplement von RSV-Polymerasebindungsstelle/Promotor flankiert werden, z.B. von Leader- und Trailer-Sequenz des RSV. Rekombinante DNA-Moleküle mit diesen Hybridsequenzen können durch eine DNA-abhängige RNA-Polymerase, wie etwa T7-, T3- oder die Sp6-Polymerase aus Bakteriophagen und dergleichen, kloniert und transkribiert werden, um rekombinante RNA-Template zu erzeugen, die geeignete virale Sequenzen besitzen, welche eine Erkennung durch virale Polymerase und Aktivität der viralen Polymerase ermöglichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammen die heterologen Sequenzen vom Genom eines anderen RSV-Stamms, beispielsweise wird das Genom des RSV-Stamms A so verändert, dass es die Nukleotidsequenzen enthält, welche die Antigenpolypeptide G und F des RSV-Stamms B9320 oder Fragmente davon codieren. In einer solchen Ausführungsform der Erfindung können heterologe codierende Sequenzen von einem anderen RSV-Stamm verwendet werden, um Nukleotidsequenzen zu ersetzen, die Antigenpolypeptide des Ausgangsstammes codieren, oder sie können zusätzlich zu den Antigenpolypeptiden des Elternstamms exprimiert werden, sodass ein rekombinantes RSV-Genom auf eine solche Art und Weise verändert wird, dass es die Antigenpolypeptide von einem, zwei oder mehreren RSV-Stämmen exprimiert.
Ein Ansatz zur Konstruktion dieser Hybridmoleküle ist die Insertion der heterologen codierenden Sequenz in ein DNA-Komplement einer genomischen RSV-RNA, sodass die heterologe Sequenz von den viralen Sequenzen flankiert wird, die für die virale Polymeraseaktivität erforderlich sind, d.h. durch virale Polymerasebindestelle/Promotor, hierin nachfolgend als die virale Polymerasebindungsstelle bezeichnet. In einem alternativen Ansatz können Oligonukleotide, welche die virale Polymerasebindungsstelle codieren, d.h. das Komplement des 3'-Terminus oder beider Termini der genomischen Virussegmente, mit der heterologen codierenden Sequenz unter Bildung des Hybridmoleküls ligiert werden. Die Positionierung eines fremden Gens oder eines fremden Gensegments innerhalb einer Zielsequenz wurde früher durch das Vorliegen von geeigneten Restriktionsenzymstellen innerhalb der Zielsequenz vorgegeben. Jedoch haben neuere Fortschritte in der Molekularbiologie dieses Problem zum großen Teil gelöst. Restriktionsenzymstellen können durch Verwendung einer ortsgerichteten Mutagenese leicht an jeder Stelle innerhalb der Zielsequenz positioniert werden (siehe z.B. die von Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 beschriebenen Verfahren). Ebenso ermöglichen Variationen der Technologie der Polymerasekettenreaktion (PCR), unten beschrieben, die spezifische Insertion von Sequenzen (d.h. Restriktionsenzymstellen) und ermöglichen die einfache Herstellung von Hybridmolekülen. Alternativ können PCR-Reaktionen verwendet werden, um rekombinante Template herzustellen, ohne dass eine Klonierung erforderlich ist. Beispielsweise können PCR-Reaktionen verwendet werden, um doppelsträngige DNA-Moleküle herzustellen, die einen DNA-abhängigen RNA-Polymerasepromotor (z.B. Bakteriophage T3, T7 oder Sp6) und die Hybridsequenz mit dem heterologen Gen und die Influenzavirus-Polymerasebindungsstelle enthalten. RNA-Template können dann direkt aus dieser rekombinanten DNA transkribiert werden. In einer anderen Ausführungsform können die rekombinanten RNA-Template unter Verwendung einer RNA-Ligase durch Ligation von RNAs hergestellt werden, welche die negative Polarität des heterologen Gens spezifizieren, und der viralen Polymerasebindungsstelle. Sequenzanforderungen für eine virale Polymeraseaktivität und für Konstrukte, welche erfindungsgemäß verwendet werden können, werden in den Abschnitten unten beschrieben.
5.1.1. Insertion der heterologen Gene
Das Gen, welches das L-Protein codiert, enthält einen einzigen offenen Leserahmen. Die für M2 codierenden Gene enthalten zwei offene Leserahmen für ORF1 bzw. ORF2. NS1 und NS2 werden von den zwei Genen NS1 und NS2 codiert. Die G- und F-Proteine, die durch getrennte Gene codiert werden, sind die wichtigsten Oberflächenglykoproteine des Virus. Entsprechend sind diese Proteine nach einer Infektion die Hauptziele für die humorale Immunreaktion. Die Insertion einer fremden Gensequenz in eine beliebige dieser codierenden Regionen könnte entweder durch die Addition der fremden, zu exprimierenden Sequenzen erreicht werden, oder durch einen vollständigen Austausch der viralen codierenden Region durch das fremde Gen, oder durch einen teilweisen Austausch. Die in das RSV-Genom insertierten heterologen Sequenzen können eine beliebige Länge bis zu ungefähr 5 Kilobasen aufweisen. Ein vollständiger Austausch würde wahrscheinlich am besten durch die Verwendung einer PCR-gerichteten Mutagenese erreicht werden.
Alternativ kann eine bicistronische mRNA konstruiert werden, um eine interne Initiierung der Translation von viralen Sequenzen zu erlauben und die Expression von fremden, für Proteine codierende Sequenzen von der regulären terminalen Initiationsstelle zu ermöglichen. Alternativ kann eine bicistronische mRNA-Sequenz konstruiert werden, worin die virale Sequenz vom regulären terminalen offenen Leserahmen translatiert wird, während die fremde Sequenz von einer internen Stelle initiiert wird. Es können bestimmte Sequenzen für interne Ribosomen- Eintrittsstellen (IRES) verwendet werden. Die ausgewählten IRES-Sequenzen sollten kurz genug sein, um nicht die Grenzen der RS-Virusverpackung zu stören. Somit sind die für einen solchen bicistronischen Ansatz gewählten IRES bevorzugt nicht mehr als 500 Nukleotide lang, wobei weniger als 250 Nukleotide vorzuziehen sind. Weiterhin weisen die verwendeten IRES keine Sequenz- oder Strukturhomologie mit Picornaviruselementen auf. Bevorzugte IRES-Elemente umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die BiP-IRES aus Säugern und die IRES des Hepatitis C-Virus.
5.2. Expression von heterologen Genprodukten unter Verwendung eines rekombinanten RNA-Templats
Die wie oben beschrieben hergestellten rekombinanten Template können auf eine Vielzahl von Arten verwendet werden, um die heterologen Genprodukte in geeigneten Wirtszellen zu exprimieren, oder um chimäre Viren zu erzeugen, welche die heterologen Genprodukte exprimieren. In einer Ausführungsform kann das rekombinante Templat mit einem zuvor gereinigten viralen Polymerasekomplex kombiniert werden, um infektiöses rRNP zu erzeugen. Zu diesem Zweck kann das rekombinante Templat in Gegenwart des viralen Polymerasekomplexes transkribiert werden. Alternativ kann das rekombinante Templat mit dem viralen Polymerasekomplex, der unter Verwendung von rekombinanten DNA-Verfahren hergestellt wurde, gemischt werden, oder in Gegenwart des viralen Polymerasekomplexes transkribiert werden (siehe z.B. Kingsbury et al., 1987, Virology 156: 396-403). In einer weiteren Ausführungsform kann das rekombinante Templat verwendet werden, um geeignete Wirtszellen zu transfizieren, um die Expression des heterologen Genprodukts in großen Mengen anzusteuern. Wirtszellsysteme, die hohe Expressionsmengen bereitstellen, umfassen kontinuierliche Zelllinien, die virale Funktionen bereitstellen, wie etwa mit RSV superinfizierte Zelllinien, veränderte Zelllinien, die virale RSV-Funktionen komplementieren usw.
5.3. Herstellung eines chimären Negativstrang-RNA-Virus
Um chimäres Virus herzustellen, kann wiederhergestelltes RNP mit modifizierter RSV-RNA oder mit RNA, welche fremde Proteine codiert, für die Transfektion von Zellen verwendet werden, die auch mit einem "elterlichen" RSV-Virus infiziert werden. Alternativ können die wiederhergestellten RNP-Präparationen mit dem RNPs vom elterlichen Wildtypvirus gemischt und direkt für die Transfektion verwendet werden. Nach der Transfektion können die neuen Viren isoliert und ihre Genome durch eine Hybridisierungsanalyse identifiziert werden. In weiteren hierin beschriebenen Ansätzen für die Produktion von infektiösem chimärem Virus kann rRNP in Wirtszellsystemen repliziert werden, welche virale Polymeraseproteine von RSV oder Influenza exprimieren (z.B. in Virus/Wirtszell-Expressionssystemen, transformierten Zelllinien, die bezüglich der Expression der Polymeraseproteine verändert wurden usw.), sodass infektiöses chimäres Virus gewonnen wird; in diesem Fall muss kein Helfervirus verwendet werden, da diese Funktion durch die exprimierten viralen Polymeraseproteine bereitgestellt wird. In einem besonders erstrebenswerten Ansatz können Zellen, die mit rRNPsw infiziert werden, die hinsichtlich aller acht Influenzavirussegmente verändert wurden, die Produktion eines infektiösen chimären Virus ergeben, das den gewünschten Genotyp enthält, wobei kein Selektionssystems benötigt wird.
Theoretisch kann man ein beliebiges RSV-Gen oder einen Teil eines beliebigen RSV-Gens durch eine fremde Sequenz ersetzen. Jedoch ist ein notwendiger Teil dieser Gleichung die Fähigkeit, das defekte Virus (defekt, da ein normales virales Genprodukt fehlt oder verändert ist) zu propagieren. Es gibt zahlreiche mögliche Ansätze, um dieses Problem zu umgehen.
Ein dritter Ansatz zur Propagation des rekombinanten Virus kann eine Cokultivierung mit Wildtypvirus einbeziehen. Dies kann durch einfache Coinfektion von Zellen mit dem rekombinanten Virus und einem anderen Wildtypvirus (bevorzugt einem Impfstamm) durchgeführt werden. Das Wildtypvirus sollte das fehlende Virusgenprodukt ergänzen und das Wachstum sowohl des Wildtyps als auch des rekombinanten Virus ermöglichen. Dies wäre eine analoge Situation wie die Propagation von defekten interferierenden Partikeln des Influenzavirus (Nayak et al., 1983, In: Genetics of Influenza Viruses, P. Palese und D.W. Kingsbury, Editoren, Springer-Verlag, Wien, S. 255-279). Im Fall von defekten interferierenden Viren können die Konditionen so modifiziert werden, dass die Mehrzahl der propagierten Viren eher defektive Partikel als Wildtypvirus sind. Deshalb kann dieser Ansatz bei der Erzeugung hochtitriger Stammlösungen von rekombinantem Virus nützlich sein. Jedoch enthalten diese Stammlösungen notwendigerweise etwas Wildtypvirus.
Alternativ kann synthetisches RNP in Zellen repliziert werden, die mit rekombinanten Viren coinfiziert wurden, welche die RS-Viruspolymeraseproteine exprimieren. Tatsächlich kann dieses Verfahren verwendet werden, um erfindungsgemäßes rekombinantes infektiöses Virus zu gewinnen. Zu diesem Zweck können die RSV-Viruspolymeraseproteine in einem beliebigen System aus Expressionsvektor/Wirtszelle exprimiert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf virale Expressionsvektoren (z.B. Vacciniavirus, Adenovirus, Baculovirus usw.) oder Zelllinien, welche die Polymeraseproteine exprimieren (siehe z.B. Krystal et al. 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2709-2713).
5.4. Erzeugung von chimären Viren mit einem attenuierten Phänotyp durch Deletion von M2-2
Die erfindungsgemäßen Verfahren können verwendet werden, um Mutationen oder heterologe Sequenzen einzubringen, um chimäre attenuierte Viren zu erzeugen, welche viele Anwendungen besitzen, einschließlich die Analyse der Molekularbiologie, Pathogenese und Wachstum und Infektionseigenschaften des RSV. Erfindungsgemäß können heterologe G- und F-Sequenzen eingebracht werden, beispielsweise in die Sequenzen, welche das F- oder G-Protein codieren, in NS1-, NS2-, M1ORF1-, M2ORF2-, N-, P- oder L-codierende Sequenzen. Erfindungsgemäß wird das M2-2 Gen eliminiert, um einen attenuierten Phänotyp zu erzeugen.
Erfindungsgemäß weist ein attenuiertes RSV im Vergleich mit einem Wildtypvirus ein wesentlich geringeres Ausmaß an Virulenz auf, einschließlich einer geringere Wachstumsrate, sodass in einem immunisierten Individuum keine Symptome einer viralen Infektion auftreten.
5.5. Impfstoff-Formulierungen unter Verwendung von chimären Viren
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung bivalente RSV-Impfstoffe, welche einen Schutz gegen RSV-A und RSV-B verleihen. Um solch einen Impfstoff zu formulieren, wird ein chimäres RS-Virus verwendet, das sowohl die Antigenpolypeptide vom Subtyp RSV-A als auch vom Subtyp RSV-B exprimiert.
Es kann entweder ein lebender rekombinanter Viursimpfstoff oder ein inaktivierter rekombinanter Virusimpfstoff formuliert werden. Ein Lebendimpfstoff kann bevorzugt sein, da die Multiplikation in dem Wirt zu einem verlängerten Stimulus führt, der bezüglich Art und Ausmaß dem Stimulus ähnlich ist, welcher bei natürlichen Infektionen auftritt und deshalb eine wesentliche, lang anhaltende Immunität verleiht. Die Herstellung von solchen lebenden rekombinanten Virusimpfstoff-Formulierungen kann unter Verwendung von konventionellen Verfahren erreicht werden, welche die Propagation des Virus in Zellkultur oder in der Allantois eines Hühnerembryos einbeziehen, gefolgt von einer Aufreinigung.
In dieser Hinsicht kann die Verwendung eines genetisch veränderten RSV (bzw. von Vektoren) für Impfzwecke bei diesen Stämmen das Vorliegen von attenuierten Eigenschaften erfordern. Aktuelle lebende Influenzavirus-Impfstoffkandidaten für die Verwendung beim Menschen sind entweder kalt adaptiert, temperaturempfindlich oder so passagiert, dass sie mehrere (sechs) Gene von Vogelinfluenzaviren enthalten, was eine Attenuierung ergibt. Das Einbringen von geeigneten Mutationen (z.B. Deletionen) in die Template, welche für die Transfektion verwendet werden, kann die neuen Viren mit attenuierten Eigenschaften ausstatten. Beispielsweise können spezifische Missense-Mutationen, die mit Temperaturempfindlichkeit oder Kälteadaption verbunden sind, in Deletionsmutationen eingefügt werden. Diese Mutationen sollten stabiler sein als die Punktmutationen, die mit kälte- oder temperaturempfindlichen Mutanten in Zusammenhang stehen, und die Häufigkeit von Rückmutationen sollte extrem niedrig sein.
Alternativ können chimäre Viren hergestellt werden, die "Selbstmord"-Eigenschaften aufweisen. Solche Viren durchlaufen im Wirt nur eine oder wenige Replikationsrunden. Wenn das rekombinante Virus als Impfstoff verwendet wird, durchläuft es einen einzigen Replikationszyklus und induziert ein ausreichendes Ausmaß der Immunreaktion, aber es würde im humanen Wirt nicht so weit kommen, dass eine Erkrankung verursacht wird. Rekombinante Viren, denen ein oder mehrere der essenziellen RS-Virusgene fehlen, können keine aufeinanderfolgenden Replikationsrunden durchlaufen. Solche defekten Viren können durch Cotransfektion von wiederhergestellten RNPs, denen ein spezifisches Gen (spezifische Gene) fehlt, in Zelllinien mit einer permanenten Expression dieses Gens (dieser Gene) erzeugt werden. Viren ohne das essenzielle Gen (die essenziellen Gene) werden in diesen Zelllinien repliziert, aber wenn sie einem humanen Wirt verabreicht werden, können sie keine Replikationsrunde vollständig durchlaufen. Solche Präparationen können – in diesem unvollkommenen Zyklus – eine ausreichende Anzahl von Genen transkribieren und translatieren, um eine Immunreaktion zu induzieren. Alternativ können größere Mengen der Stämme verabreicht werden, sodass diese Präparationen als inaktivierte (abgetötete) Virusimpfstoffe dienen. Bei inaktivierten Impfstoffen wird das heterologe Genprodukt bevorzugt als viraler Bestandteil exprimiert, sodass das Genprodukt mit dem Virion verbunden ist. Der Vorteil von solchen Präparationen ist der, dass sie native Proteine enthalten und durch die Behandlung mit Formalin und anderen Mitteln, die bei der Herstellung von abgetöteten Virusimpfstoffen verwendet werden, nicht inaktiviert werden.
In einer anderen Ausführungsform dieses Erfindungsaspekts können inaktivierte Impfstoff-Formulierungen unter Verwendung von konventionellen Verfahren zum "Abtöten" der chimären Viren hergestellt werden. Inaktivierte Impfstoffe sind in der Hinsicht "tot", dass ihre Infektiosität zerstört wurde. Idealerweise ist die Infektiosität des Virus zerstört, ohne seine Immunogenität zu beeinflussen. Um inaktivierte Impfstoffe herzustellen, kann das chimäre Virus in Zellkultur oder in der Ailantois eines Hühnerembryos angezogen werden, durch Zonenultrazentrifugation aufgereinigt werden, durch Formaldehyd oder β-Propiolacton inaktiviert und vereinigt werden. Der resultierende Impfstoff wird normalerweise intramuskulär geimpft.
Inaktivierte Viren können mit einem geeigneten Adjuvans formuliert werden, um die immunologische Reaktion zu verstärken. Solche Adjuvanzien können Mineralgele, z.B. Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie etwa Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen; Peptide, Ölemulsionen, und eventuell verwendbare humane Adjuvanzien, wie etwa BCG und Corynebacterium parvum umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt.
Es können viele Verfahren verwendet werden, um die oben beschriebenen Impfstoff-Formulierungen einzubringen bzw. zu verabreichen, diese umfassen orale, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane und intranasale Wege, sind aber nicht darauf beschränkt. Es kann bevorzugt sein, die chimäre Virusimpfstoff-Formulierung über den natürlichen Infektionsweg des Pathogens, für den der Impfstoff entworfen ist, einzubringen. Wenn eine lebende chimäre Virusimpfstoff-Präparation verwendet wird, kann es bevorzugt sein, die Formulierung über den natürlichen Infektionsweg für Influenzavirus einzubringen. Die Fähigkeit von RSV- und Influenzavirus, eine kräftige sekretorische und zelluläre Immunreaktion zu induzieren, kann auf vorteilhafte Weise ausgenutzt werden. Beispielsweise kann eine Infektion der Atemwege durch chimäres RSV oder Influenzaviren eine starke sekretorische Immunreaktion induzieren, beispielsweise im Urogenitalsystem, mit einem gleichzeitigen Schutz gegen ein bestimmtes krankheitsverursachendes Mittel.
Die folgenden Abschnitte beschreiben beispielhaft und ohne Beschränkung die Manipulation von Negativstrang-RNA-Virusgenomen unter Verwendung von RSV als Beispiel, um die Anwendbarkeit der erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung von chimären Viren für die Zwecke einer heterologen Genexpression, zur Erzeugung von infektiösen viralen Partikeln und attenuierten viralen Partikeln für Impfzwecke zu zeigen.
6. Gewinnung von infektiösem respiratorischem Syncytialvirus (RSV) unter Verwendung von RNA, die von spezifischen rekombinanten DNAs stammt
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren für die Gewinnung von infektiösem respiratorischem Syncytialvirus (RSV) aus rekombinanter cDNA, die das gesamte RSV-RNA-Genom codiert, als stabiler und infektiöser RSV, wie in Abschnitt 5 oben erwähnt wird. Dieses Verfahren kann bei der Herstellung von chimären RSV-Viren verwendet werden, die heterologe G- und F-Gene exprimieren können. Ein anderer beispielhafter Weg, um die Produktion von chimärem RSV zu erreichen, ist mit einer Modifikation von vorhandenen nativen RSV-Genen verbunden, wie zuvor beschrieben wird. Entsprechend beschreibt dieses Beispiel auch den Nutzen dieses Verfahrens bei der gezielten Attenuierung der RSV-Pathogenität, was die Produktion eines Impfstoffs mit definierten, veränderten biologischen Eigenschaften für die Verwendung beim Menschen ergibt.
Der erste Schritt des Gewinnungsverfahrens, umfassend das gesamte RSV-RNA-Genom, erfordert die Synthese einer Volllängenkopie des Genoms des RSV-Stamms A2 mit 15 Kilobasen (kb). Dies wird erreicht durch die Verbindung von subgenomischen doppelsträngigen cDNAs (unter Verwendung von Standardverfahren für die genetische Manipulation) im Größenbereich von 1 kb bis 3,5 kb, um die vollständige genomische cDNA zu bilden. Die Bestimmung der Nukleotidsequenz der genomischen cDNA ermöglicht die Erkennung von Fehlern, die während des Zusammenbauprozesses eingebracht wurden; Fehler können mittels ortsgerichteter Mutagenese oder durch Substitution der fehlerhaften Region mit einem Stück einer chemisch synthetisierten doppelsträngigen DNA korrigiert werden. Nach dem Zusammenbau wird die genomische cDNA neben einen Transkriptionspromotor (z.B. dem T7-Promotor) an einem Ende und einer DNA-Sequenz, welche die Termination der Transkription ermöglicht, z.B. eine spezifische Endonuklease oder ein Ribozym, am anderen Ende positioniert, um die Synthese einer Plus- oder Minusstrang-RNA-Kopie des vollständigen Virusgenoms in vitro oder in kultivierten Zellen zu ermöglichen. Falls erwünscht, können die Leader- oder Trailer-Sequenzen weitere Sequenzen enthalten, wie etwa flankierende Ribozyme und Tandem-T7-Transkriptionsterminatoren. Das Ribozym kann ein Hepatitis-delta-Virusribozym oder ein Hammerkopfribozym sein und arbeitet so, dass ein exaktes 3'-Ende erhalten wird, frei von nicht viralen Nukleotiden.
In Übereinstimmung mit diesem Aspekt der Erfindung können Mutationen, Substitutionen oder Deletionen in die native RSV-Genomsequenz eingebracht werden, was zu einem Anstieg der RSV-Promotoraktivität führt. Die Anmelder haben gezeigt, dass sogar ein Anstieg der RSV-Promotoraktivität die Effizienz der RSV-Gewinnung stark verbessert, was die Gewinnung von infektiösen RSV-Partikeln aus einer Volllängen-RSV-cDNA mit der Mutation ermöglicht. Insbesondere ergibt eine Punktmutation an Position 4 des Genoms (C nach G) einen mehrfachen Anstieg der Promotoraktivität und der Gewinnung der infektiösen viralen Partikel aus einem Volllängen-RSV-cDNA-Klon, der die Mutation trägt.
Im Gewinnungsverfahren wird die Interaktion der genomischen Volllängen-RNA des RSV-Stamms A2, welche von der konstruierten cDNA transkribiert wird, mit Proteinen des Helfer-RSV-Virus des Subtyps B in den kultivierten Zellen genutzt. Dies kann auf eine Vielzahl von Arten erreicht werden. Beispielsweise kann genomische Volllängen-Virus-RNA des RSV-Stamms A2 in vitro transkribiert und in Zellen transfiziert werden, welche unter Verwendung von Standardprotokollen zur Infektion mit dem RSV-Stamm B9320 infiziert wurden, wie etwa in 293-Zellen. Außerdem kann in vitro transkribierte genomische RNA des RSV-Stamms A2 in eine Zelllinie transfiziert werden, welche die essenziellen Proteine des RSV-Stamms A2 (in Abwesenheit des Helfervirus) von stabil integrierten Virusgenen exprimiert.
Alternativ kann eine in vitro transkribierte genomische Virus-RNA (RSV-Stamm A2) auch in Zellen transfiziert werden, die mit einem heterologen Virus (z.B. insbesondere Vacciniavirus) infiziert wurden, der die essenziellen Proteine des RSV-Helferstamms A2 exprimiert, insbesondere die Proteine N, P, L und/oder M2-ORF1. Außerdem kann die in vitro transkribierte genomische RNA in Zellen transfiziert werden, die mit einem heterologen Virus, z.B. mit Vacciniavirus infiziert wurden, das T7-Polymerase exprimiert, was die Expression von Helferproteinen von der transfizierten Plasmid-DNA ermöglicht, welche die Helfergene N, P und L enthält.
Als eine Alternative zur Transfektion von in vitro transkribierter genomischer DNA kann Plasmid-DNA mit dem gesamten RSV-DNA-Konstrukt in Zellen transfiziert werden, die mit einem heterologen Virus, z.B. Vacciniavirus, infiziert werden, welches die essenziellen Proteine des RSV-Helferstamms A2 und T7-Polymerase exprimiert, wobei die Transkription der gesamten genomischen RNA des RSV von der Plasmid-DNA mit dem RSV-cDNA-Konstrukt ermöglicht wird. Das Vacciniavirus braucht jedoch die Helferproteine nicht selbst bereitzustellen, sondern nur die T7-Polymerase, dann können die Helferproteine von transfizierten Plasmiden mit den RSV-Genen N, P und L exprimiert werden, die in geeigneter Weise neben ihren eigenen T7-Promotoren positioniert sind.
Wenn ein replizierendes Virus während der Gewinnungsexperimente die Helferfunktion ausfüllt, wird der RSV-Stamm B9320 verwendet, was eine Differenzierung der erhaltenen Nachkommen im Hinblick auf RSV B9320, ermöglicht. Der gewonnene RSV-Stamm A2 wird sicher identifiziert durch das Vorhandensein von speziellen "Marker"-Nukleotidsequenzen, die vor der Gewinnung in die cDNA-Kopie des RSV-Genoms insertiert werden.
Die Etablierung eines Systems zur Gewinnung des nativen, d.h. des "Wildtyp"-RSV-Stamms A2 ermöglicht das Einfügen von Modifikationen in die cDNA-Kopie des RSV-Genoms, um ein chimäres RSV mit Sequenzen herzustellen, die auf gewisse Art und Weise mit denjenigen des nativen RSV heterolog sind, sodass das resultierende gewonnene Virus bezüglich der Pathogenität attenuiert werden kann, um einen sicheren und wirksamen humanen Impfstoff bereitzustellen, wie in Abschnitt 5.4 oben erläutert wird.
Neben einer Veränderung (Veränderungen) (einschließlich einer Veränderung durch eine Translokation) des genetischen RSV-Materials zur Bereitstellung einer heterologen Sequenz ermöglicht dieses Verfahren die Insertion von "fremden" Genen (d.h. nicht native RSV-Gene) oder genetischen Bestandteilen davon, welche eine biologische Funktion oder Antigenität aufweisen, so dass diese genetischen Elemente exprimiert werden; auf diese Art kann das modifizierte chimäre RSV als Expressionssystem für andere heterologe Proteine oder genetische Elemente, wie etwa Ribozyme, Antisense-RNA, spezifische Oligoribonukleotide mit prophylaktischem oder therapeutischem Potenzial oder für andere virale Proteine für Impfzwecke fungieren.
6.1. Gewinnung der Leader- und Trailer-Sequenzen des RSV-Stamms A2 unter Verwendung des RSV-Stamms B9320 als Helfervirus
6.1.1.Viren und Zellen
Obwohl in diesem Beispiel der RSV-Stamm A2 verwendet wurde, ist dies beispielhaft. Es liegt innerhalb des Fachwissens, entsprechend der Lehre dieses Beispiels andere Stämme des RSV-Subtyps A zu verwenden. Verfahren, bei welchen solche anderen Stämme verwendet werden, werden von der Erfindung umfasst.
Der RSV-Stamm A2 und der RSV-Stamm 9320 wurden in Hep-2-Zellen bzw. Vero-Zellen angezogen, und während der Experimente zur Transfektion/Gewinnung wurden 293-Zellen als Wirt verwendet. Alle drei Zelllinien wurden von der ATCC (Rockville, Maryland) erhalten.
6.1.2. Konstruktion und funktionelle Analyse der Reporterplasmide
Das Plasmid pRSVA2CAT (1) wurde wie unten beschrieben konstruiert.
Die cDNA-Bestandteile des Leaders mit 44 Nukleotiden und des Trailers mit 155 Nukleotiden vom RSV-Stamm A2 (siehe Mink et al., Virology 185: 615-624 (1991); Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 9663-9667 (1991)), wobei der Trailer-Bestandteil auch die Promotorkonsensussequenz der Bakteriophagen T7-Polymerase enthält, wurden einzeln durch kontrollierte Hybridisierung von Oligonukleotiden mit teilweise überlappender Komplementarität zusammengebaut (siehe 1). Die in dieser Hybridisierung verwendeten Oligonukleotide wurden auf einem DNA-Syntheseapparat von Applied Biosystems (Foster City, CA) synthetisiert. Die einzelnen Oligonukleotide und ihre relativen Positionen in der Leader- und Trailer-Sequenz werden in 1 angegeben. Die zur Konstruktion des Leaders verwendeten Oligonukleotide waren:

1. 5'CGA CGC ATA PTA CGC GAA AAA ATG CGT ACA ACA AAC TTG CAT AAA C
2. 5'CAA AAA AAT GGG GCA AAT AAG AAT TTG ATA AGT ACC ACT TAA ATT TAA CT
3. 5'CTA GAG TTA AAT TTA AGT GGT ACT
4. 5'TAT CAA ATT CTT ATT TGC CCC ATT TTT TTG GTT TAT CA AGT TTG TTG TA
5. 5'CGC ATT TTT TCG CGT AAT ATG CGT CGG TAC

Die zur Konstruktion des Trailers verwendeten Oligonukleotide waren:

1. 5'GTA TTC AAT TAT AGT TAT TAA AAA TTA AAA ATC ATA TAA TTT TTT AAA TA
2. 5'ACT TTT AGT GAA CTA ATC CTA AAG TTA TCA TTT TAA TOT TGG AGG AAT AA
3. 5'ATT TAA ACC CTA ATC TAA TTG GTT TAT ATG TGT ATT AAC TAA ATT ACG AG
4. 5'ATA TTA GTT TTT GAC ACT TTT TTT CTC GTT ATA GTG AGT CGT ATT A
5. 5'AGC TTA ATA CGA CTC ACT ATA ACG A
6. 5'GAA AAA AAG TGT CAA AAA CTA ATA TOT CGT AAT TTA GTT AAT ACA CAT AT
7. 5'AAA CCA ATT AGA PTA GGG TTT AAA TTT ATT CCT CCA AGA TTA AAA TGA TA
8. 5'ACT TTA GGA TTA GTT CAC TAA AAG TTA TTT AAA AAA TTA TAT GAT TTT TA
9. 5'ATT TTT AAT AAC TAT AAT TGA ATA CTG CA

Dann wurden die vollständigen Leader- und Trailer-cDNAs unter Bildung eines linearen 1 kb langen RSV/CAT-cDNA-Konstrukts in die XbaI- bzw. PstI-Stellen des Reportergens Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT) ligiert. Dieses cDNA -Konstrukt wurde dann in die Kpn I- und Hind II-Stellen von pUC19 ligiert. Die Integrität des finalen pRSVA2CAP-Konstrukts wurde durch Gelanalyse hinsichtlich der Größe der Produkte eines Xba I/Pst I- und Kpn I/Hind II-Verdaus untersucht. Die vollständigen Leader- und Trailer-cDNAs wurden auch unter Verwendung von geeigneten Restriktionsenzmystellen unter Bildung eines linearen cDNA-Konstrukts in das GFP (Green Fluorescent Protein)-Gen ligiert. Das resultierende RSV-GFP-CAT ist ein bicistronisches Reporterkonstrukt, das sowohl CAT als auch GFP exprimiert.
Die in vitro-Transkription des mit Hga I linearisierten pRSVA2CAT mit Bakteriophagen T7-Polymerase wurde in Übereinstimmung mit dem Protokoll des T7-Lieferanten (Promega Corporation, Madison, Wisconsin) durchgeführt. Konfluente 293-Zellen in Sechs-Well-Platten (–1 × 10⁶ Zellen pro Well) wurden mit dem RSV-Stamm B9320 mit 1 plaquebildenden Einheit (p.f.u. „plaque forming unit") pro Zelle infiziert und eine Stunde später mit 5-10 μg der in vitro transkribierten RNA vom pRSVA2CAT-Konstrukt transfiziert. Im Transfektionsverfahren wurde das Transfektionsverfahren von Collins et al., Virology 195: 252-256 (1993) befolgt und die Reagenzien Transect/ATC^TM und Opti-MEM wurden in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers (Gibco, BRL, Bethesda, Maryland) verwendet. 24 Stunden nach der Infektion wurden die 293-Zellen unter Verwendung eines Standardprotokolls (Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Kapitel 9.6.2; Gorman et al., 1982), Mol. Cell Biol. 2:1044-1051) im Hinblick auf die CAT-Aktivität untersucht. Der Nachweis eines hohen CAT-Aktivitätslevels zeigte, dass die in vitro transkribierte Negativstrang-RNA mit den 'Leader'- und 'Trailer'-Regionen des Genoms des RSV A2-Stamms und dem CAT-Gen verkapselt, repliziert und unter Verwendung der durch den RSV-Stamm B9320 bereitgestellten Proteine exprimiert werden kann (siehe 2). Das in diesen Experimenten beobachtete Level der CAT-Aktivität war mindestens so hoch wie das Level, das in ähnlichen Gewinnungsexperimenten beobachtet wurde, worin der homologe RSV-Stamm A2 als Helfervirus verwendet wurde. Über die Fähigkeit des bezüglich der Antigene unterschiedlichen RSV-Stamms B9320 des Subtyps B zur Unterstützung der Verkapselung, Replikation und Transkription der RNA eines RSV-Stamms A2 des Subtyps A wurde unseres Wissens bislang offiziell noch nichts berichtet.
6.2. Konstruktion einer cDNA, die das vollständige RSV-Genom repräsentiert
Um ein Templat für die cDNA-Synthese zu erhalten, wurde genomische RSV-RNA, umfassend 15 222 Nukleotide, nach dem von Ward et al., J. Gen. Virol. 64: 167-1876 (1983) beschriebenen Verfahren aus infizierten Hep-2-Zellen gereinigt. Basierend auf der publizierten RSV-Nukleotidsequenz wurden Oligonukleotide unter Verwendung eines DNA-Syntheseapparats von Applied Biosystems (Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisiert, um als Primer für die cDNA-Synthese des ersten und zweiten Strangs vom genomischen RNA-Templat zu fungieren. Die Nukleotidsequenzen und die relativen Positionen der cDNA-Primer und die entscheidenden Endonukleasestellen innerhalb des RSV-Genoms werden in 3 angegeben. Die Produktion von cDNAs aus genomischer Virus-RNA wurde nach dem Protokoll für die reverse Transkription/Polymerasekettenreaktion (RT/PCR) der Perkin Elmer Corporation, Norwalk, Connecticut durchgeführt (siehe auch Wang et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 9717-9721), die amplifizierten cDNAs wurden durch Elektroelution aus der entsprechenden DNA-Bande aus den Agarosegelen gereinigt. Die gereinigte DNA wurde direkt in den Plasmidvektor pCRII (Invitrogen Corp., San Diego) ligiert und entweder in "One Shot" E.coli-Zellen (Invitrogen) oder "SURF" E.coli-Zellen (Stratagene, San Diego) transformiert. Die erhaltenen klonierten virusspezifischen cDNAs wurden durch Standardklonierungsverfahren (Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press (Gold Spring Harbor, NY, 1989)) unter Bildung einer cDNA zusammengebaut, die das gesamte RSV-Genom umfasst. Das gesamte cDNA-Genom wurde sequenziert und unrichtige Sequenzen wurden entweder durch eine ortsgerichtete Mutagenese oder durch chemisch synthetisierte DNA ersetzt. An den Basen 7291 und 7294 (wobei sich die Base Nummer 1 am Beginn des genomischen RNA-3'-Endes befindet) im "F"-Gen wurden Nukleotidsubstitutionen eingefügt, um eine neue Stu I-Endonukleasestelle zu erzeugen, und an den Positionen 7423, 7424 und 7425 (auch im F-Gen), um eine neue Pme I-Stelle zu erzeugen. Diese Veränderungen wurden so gestaltet, dass sie als im Fall von positiven Ereignissen als maßgebliche Marker dienen. Die Bakteriophagen T7-Polymerase und die Hga I-Endonukleasestelle wurden an gegenüberliegenden Enden der Virusgenom-cDNA platziert, sodass in vitro entweder eine Virusgenom-RNA in negativer oder in positiver Orientierung synthetisiert werden kann. Die cDNAs, die die T7-Polymerasepromotorsequenz und die Erkennungssequenz für Hga I darstellen, wurden mit einem DNA-Syntheseapparat von Applied Biosystems synthetisiert und wurden einzeln an die Enden der Virusgenom-cDNA ligiert, oder wurden als ein integraler Bestandteil der PCR-Primer während der Amplifikation des terminalen Anteils der genomischen cDNA angefügt, so wie es zweckmäßig war, wobei das letztere Verfahren verwendet wurde, wenn nahe bei den cDNA-Genomenden geeignete Endonukleasestellen fehlten, um eine direkte Ligation der chemisch synthetisierten cDNA für T7-Promotor/Hga I-Stelle mit der genomischen cDNA zu verhindern. Dieses vollständige Konstrukt (Genom-cDNA und flankierende T7-Promotor/Hga I-Erkennungssequenz) wurde dann in die Kpn I/Not I-Stellen des Bluescript II SK-Phagemids (Stratagene, San Diego) kloniert, aus welchem der endogene T7-Promotor durch ortsgerichtete Mutagenese entfernt worden war. Die aus diesem vollständigen Genomkonstrukt transkribierte RNA kann unter Verwendung eines RSV-Helfervirus des Subtyps B erhalten werden, um gemäß Beispiel 6.1. infektiösen RSV zu erhalten. Dieses grundlegende System zur Gewinnung vollständiger, nativer, d.h. vom "Wildtyp"-RSV A2-Stamm, genomischer RNA kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Modifikationen in die cDNA-Kopie des Genoms einzufügen, was den Einbau von heterologen Sequenzen in das Genom ergibt. Solche Veränderungen können so gestaltet werden, dass die virale Pathogenität verringert wird, ohne die Virusreplikation bis zu einem Punkt einzuschränken, bei welchem die Gewinnung unmöglich wird, oder die Virusgenexpression nicht ausreicht, um eine ausreichende Immunität zu stimulieren.
Für die Herstellungder Ribozym/T7-Terminatorsequenzwurden die folgenden Oligonukleotide verwendet:
Es wurde ein cDNA-Klon mit dem vollständigen Genom des RSV, einem T7-Promotor, einem Hepatitis-delta-Virusribozym und einem T7-Terminator erzeugt. Dieses Konstrukt kann verwendet werden, um in vivo in Anwesenheit einer T7-Polymerase Antigenom-RNA oder RSV zu erzeugen. Eine Sequenzanalyse zeigte, dass das Plasmid im RSV-Genom nur wenige Mutationen enthielt.
6.2.1. Modifikationen des RSV-Genoms
Die F- und G-Gene des humanen RSV-Subtyps B konnten beispielsweise in ein Genom insertiert werden, das ansonsten zum RSV-Stamm A gehörte (anstelle oder zusätzlich zu den F- und G-Genen des RSV-Stamms A).
Diese Modifikationen umfassen zusätzlich eine Deletion des offenen Leserahmens M2-2.
6.3. Gewinnung einer cDNA, die das vollständige RSV-Genom repräsentiert
6.3.1. Konstruktion und funktionelle Analyse der Expressionsplasmide
Die RSV-Gene N, P und L codieren die virale RSV-Polymerase. Die Funktion des M-Gens von RSV ist unbekannt. Die Eignung der RSV-N-, -P-, -M- und -L-Expressionsplasmide, die Funktion von Helferprotienen des RSV-Stamms A2 zu bedienen, wurde wie unten beschrieben beurteilt. Die RSV-Gene N, P, L und M2-1 wurden in den modifizierten PCITE 2a(+)-Vektor (Novagen, Madison, WI) unter die Kontrolle des T7-Promotors kloniert, und am 3'-Ende durch einen T7-Terminator flankiert. PCITE-2a(+) wurde durch Insertion einer T7-Terminatorsequenz aus PCITE-3a(+) in die Alwn I- und BgI II-Stellen von PCITE-2a(+) modifiziert. Die Funktionalität der N-, P- und L-Expressionsplasmide wurde durch ihre Fähigkeit bestimmt, das transfizierte pRSVA2CAT zu replizieren. Bei ungefähr 80%iger Konfluenz wurden Hep-2-Zellen in Sechs-Well-Platten mit MVA mit einer moi von 5 infiziert. Nach einer Stunde wurden die infizierten Zellen unter Verwendung von Lipofec TACE (Life Technologies, Gaithersburg, M.D.) mit pRSVA₂CAT (0,5 mg) und mit Plasmiden transfiziert, welche das N-Gen (0,4 mg), das P-Gen (0,4 mg) und das L-Gen (0,2 mg) codieren. Die Transfektion wurde für 5 Stunden oder über Nacht weitergeführt und dann wurde das Transfektionsmedium mit frischem MEM mit 2% FBS (fötales Rinderserum) ersetzt. Zwei Tage nach der Infektion wurden die Zellen lysiert und die Lysate wurden unter Verwendung des CAT-ELISA-Kits von Boehringer Mannheim im Hinblick auf die CAT-Aktivität untersucht. In Zellen, die mit N-, P- und L-Plasmiden zusammen mit pRSVA₂CAT transfiziert worden waren, wurde CAT-Aktivität nachgewiesen. Jedoch wurde keine CAT-Aktivität nachgewiesen, wenn ein beliebiges der Expressionsplasmide weggelassen wurde. Weiterhin ergab eine Cotransfektion von RSV-GFP-CAT mit den N-, P- und L-Expressionsplasmiden die Expression sowohl des GFP- als auch des CAT-Proteins. Die Verhältnisse der unterschiedlichen Expressionsplasmide und die moi des rekombinanten Vacciniavirus wurden in dem Reportergenexpressionssystem optimiert.
6.3.2. Gewinnung von infektiösem RSV aus der vollständigen RSV-cDNA
Hep-2-Zellen wurden mit MVA (rekombinantes Vacciniavirus, das die T7-Polymerase exprimiert) mit einer moi von 1 infiziert. Fünfzig Minuten später wurde das Transfektionsgemisch auf die Zellen gegeben. Das Transfektionsgemisch bestand aus 2 μg N-Expressionsvektor, 2 μg P-Expressionsvektor, 1 μg L-Expressionsvektor, 1,25 μg M2/ORF1-Expressionsvektor, 2 μg RSV-Genomklon mit verstärktem Promotor, 50 μl Lipofec TACE (Life Technologies, Gaithersburg, M.D.) und 1 ml OPTI-MEM. Einen Tag später wurde das Transfektionsgemisch durch MEM mit 2% FBS ersetzt. Die Zellen wurden bei 37°C für 2 Tage inkubiert. Der Transfektionsüberstand wurde geerntet und mit 40 μg/ml AraC (Wirkstoff gegen das Vacciniavirus) für die Infektion von frischen Hep-2-Zellen verwendet. Die infizierten Hep-2-Zellen wurden für 7 Tage inkubiert. Nach dem Ernten des P1-Überstands wurden die Zellen unter Verwendung von Antikörpern gegen das F-Protein des RSV-Stamms A2 für eine Immunfärbung verwendet. Es wurden sechs positiv gefärbte Stellen mit sichtbarer Zell-Zell-Fusion (typisch für eine RSV-Infektion) identifiziert. Die RNA wurde aus dem P1-Überstand extrahiert und als Templat für eine RT-PCR-Analyse verwendet. Es wurden PCR-Produkte erzeugt, die der F- und M2-Region entsprachen. Beide Produkte enthielten die eingefügten Marker. In der Kontrolle enthielten die PCR-Produkte, die von natürlichem RSV-Virus stammten, keine Marker.
An Position 4 der Leader-Sequenz des RSV-Genomklons wurde eine Punktmutation (C-Rest nach G) erzeugt, und dieser Genomklon wurde als pRSVC4GLwt bezeichnet. Es wurde gezeigt, dass bei diesem Klon im Umfeld eines Reportergens die Promotoraktivität im Vergleich mit dem Wildtyp um ein Mehrfaches erhöht ist. Nach dem Einfügen dieser Mutation in das Volllängengenom wurde von dem cDNA-Klon infektiöses Virus gewonnen. Das gewonnene rekombinante RSV-Virus bildete kleinere Plaques als das Wildtyp-RSV-Virus (8).
Dieses System ermöglicht die Gewinnung von mutiertem RSV. Folglich kann es ein ausgezeichnetes Werkzeug darstellen bei der Konstruktion von lebendattenuierten Impfstoffen gegen RSV und für die Verwendung eines RSV-Vektors und von Viren, um eine heterologe Genexpression zu erhalten. Es kann möglich sein, das G-Protein des RSV-Typs B vor dem Hintergrund des Typs A zu exprimieren, sodass der Impfstoff sowohl vor einer Infektion des RSV-Typs A als auch des RSV-Typs B schützen kann. Es kann auch möglich sein, durch Veränderung der Reihenfolge der Gene oder durch eine ortsgerichtete Mutagenese des L-Proteins eine Attenuierung und temperaturempfindliche Mutationen im RSV-Genom zu erhalten.
6.4. Verwendung von monoklonalen Antikörpern zur Unterscheidung zwischen dem gewonnenen Virus vom Helfervirus
Um den RSV-Helfervirus-Stamm B9320 zu neutralisieren und die Identifizierung des gewonnenen RSV-Stamms A2 zu erleichtern, wurden wie folgt monoklonale Antikörper gegen den RSV-Stamm B9320 hergestellt.
Sechs weibliche BALG/c-Mäuse wurden intranasal (i.n.) mit 10⁵ plaquebildenden Einheiten (p.f.u.) RSV B9320 infiziert, gefolgt von einer intraperitonealen (i.p.) Inokulation mit 10⁶-10⁷ pfu RSV B9320 in einem Gemisch mit 50% komplettem Freud-Adjuvans fünf Wochen später. Zwei Wochen nach der intraperitonealen Inokulation wurde unter Verwendung eines Standardneutralisationsassays von jeder Maus eine Blutprobe im Hinblick auf das Vorliegen eines RSV-spezifischen Antikörpers untersucht (Beeler und Coelingh, J. Virol. 63: 2941-2950 (1988)). Die Mäuse, welche die höchsten Mengen an neutralisierendem Antikörper erzeugten, wurden dann weiterhin zum zweiten Mal mit 10⁶ p.f.u. des RSV-Stamms B9320 in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) inokuliert, die intravenös an der Schwanzwurzel injiziert wurde. Drei Tage später wurden die Mäuse getötet und ihre Milz als Quelle der B-Zellen, die den monoklonalen Antikörper produzieren, gesammelt. Splenozyten (einschließlich B-Zellen) wurden in 5 ml DME (Dubecco's Modified Eagle's Medium) durch Einschnitte in die Milzkapsel aus der Milz der Mäuse herausgeholt. Zellklumpen konnten sich absetzen und die verbleibenden suspendierten Zellen wurden durch Zentrifugation bei 2000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur einzeln gesammelt. Diese Zellpellets wurden in 15 ml 0,83 (W/V) NH4Cl resuspendiert und für 5 Minuten zur Lyse der roten Blutzellen stehengelassen. Dann wurden die Splenozyten durch Zentrifugation wie zuvor durch ein 10 ml Kissen von fötalem Kälberserum gesammelt. Die Splenozyten wurden dann in DME gespült, erneut pelletiert und schließlich in 20 ml frischem DMA resuspendiert. Diese Splenozyten wurden dann mit Sp2/0 Zellen (Mausmyelom-Zelllinie, die als Fusionspartner für die Immortalisierung von Splenozyten verwendet wird) in einem Verhältnis 10 : 1 von Milzzellen : Sp2/0-Zellen gemischt. Die Sp2/0-Zellen wurden von der ATCC erhalten und in DME gehalten, das mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt war. Das Zellgemisch wurde dann für 8 Minuten bei 2000 × g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 1 ml 50% Polyethylenglykol 1000 mol wt (PEG 1000) resuspendiert, gefolgt von der Zugabe von gleichen Volumina DME in 1 Minuten-Intervallen, bis ein Endvolumen von 25 ml erhalten wurde. Die fusionierten Zellen wurden dann wie zuvor pelletiert und mit 3,5 × 10⁶ Milzzellen pro ml in Wachstumsmedium resuspendiert (50% konditioniertes Medium von Sp2/0-Zellen, 50% HA-Medium mit 100 ml RPMI 25 ml F.C.S., 100 μg/ml Gentamycin, 4 ml 50 × Hypoxanthin, Thymidin, Aminopterin (HAT)-Medium, das als gebrauchsfertiges Gemisch von Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) bezogen wurde). Die Zellsuspension wurde über Well-Platten (20 μl/Well) verteilt und bei 37°C, 95% Luftfeuchtigkeit und 5% CO₂ inkubiert. Kolonien der Hybridomzellen (fusionierte Splenozyten und Sp2/0-Zellen) wurden dann in 24 Well-Platten subkultiviert und nahezu bis zur Konfluenz angezogen, dann wurde der Überstand des Wachstumsmediums unter Verwendung eines Standardneutralisierungsassays im Hinblick auf neutralisierenden monoklonalen Antikörper gegen den RSV-Stamm B9320 untersucht (Beeler und Coelingh, J. Virol. 63: 2941-50 (1988)). Hybridomzellen von Wells mit einer neutralisierenden Aktivität wurden in Wachstumsmedium resuspendiert und so verdünnt, dass eine Zelldichte von 0,5 Zellen/100 μl erhalten wurde, und mit 200 μl/Well in 96 Well-Platten ausplattiert. Dieses Verfahren stellte die Produktion von Monoklonen (d.h. aus einer einzelnen Zelle hervorgegangene Hybridomzelllinien) sicher, welche dann erneut im Hinblick auf die Produktion von neutralisierendem monoklonalem Antikörper untersucht wurden. Diejenigen Hybridomzelllinien, welche monoklonalen Antikörper erzeugten, der den RSV-Stamm B9320, jedoch nicht den RSV-Stamm A2 neutralisieren konnte, wurden anschließend i.p. in Mäuse (10⁶ Zellen pro Maus) injiziert. Zwei Wochen nach der intraperitonealen Injektion wurde der Maus mit einer 19er Nadel Ascitesflüssigkeit, die den neutralisierenden monoklonalen Antikörper gegen den RSV-Stamm B9320 enthielt, entnommen und bei –20°C gelagert.
Dieser monoklonale Antikörper wurde verwendet, um das RSV-Stamm B9320-Helfervirus nach der in Abschnitt 9.1. beschriebenen Gewinnung des RSV-Stamms A2 zu neutralisieren. Dies wurde durchgeführt durch Verdünnen des neutralisierenden monoklonalen Antikörpers 1 in 50 geschmolzenem 0,4% (w/v) Agar in MEM (Eagle's Minimal Essential Medium) mit 1% F.C.S. Dieses Gemisch wurde dann zu Hep-2-Zellmonolayer gegeben, die mit den Nachkommen der Gewinnungsexperimente mit einer m.o.i. von 0,1-0,01 p.f.u. pro Zelle infiziert worden waren. Der monoklonale Antikörper in der Agarschicht hemmte das Wachstum des RSV-Stamms B9320, ermöglichte jedoch das Wachstum des RSV-Stamms A2, was eine Plaquebildung durch den A2-Stamm ergab. Diese Plaques wurden unter Verwendung einer Pasteur-Pipette herausgeholt, um einen Agarpfropfen oberhalb des Plaques und die infizierten Zellen in dem Plaque zu entfernen, die Zellen und der Agarpfropfen wurden in 2 ml EMEM, 1% FBS resuspendiert und freigesetztes Virus wurde erneut in Gegenwart des monoklonalen Antikörpers auf einem frischen Hep-2-Zellmonolayer einem Plaqueassay unterzogen, um eine weitere Aufreinigung vom Helfervirus durchzuführen. Der zweimal einem Plaqueassays unterzogene Virus wurde dann verwendet, um Hep-2-Zellen in 24 Well-Platten zu infizieren, und die Nachkommen hiervon wurden verwendet, um 6 Well-Platten mit einer m.o.i. von 0,1 p.f.u. pro Zelle zu infizieren. Schließlich wurde die Gesamt-RNA der infizierten Zellen von einem Well einer Six-Well-Platte in einer RT/PCR-Reaktion eingesetzt, unter Verwendung von Primern für den ersten Strang und zweiten Strang an jeder Seite der "Markersequenzen" (welche in das Genom des RSV-Stamms A2 ein gefügt wurden, um als Mittel zur Erkennung von positiven Ereignissen zu dienen), wie in Abschnitt 6.2. oben beschrieben wird. Die in der RT/PCR-Reaktion erzeugte DNA wurde anschließend mit Stu I und Pme I verdaut, um die "Markersequenzen", die in die cDNA des RSV-Stamms A2 eingefügt wurden, positiv zu identifizieren und somit die Validität des Gewinnungsverfahrens zu etablieren.
B. Beispiel: Expression der G- und F-Proteine des RSV-Subtyps B durch den RSV-Stamm A2
Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um einen chimären RSV zu erzeugen, der die Antigenpolypeptide von mehr als einem RSV-Stamm exprimiert. Zwei wichtige Antigensubtypen (A und B) des respiratorischen Syncytialvirus (RSV) verursachen humane Erkrankungen. Die Glykoproteine F und G sind die zwei wichtigsten Antigendeterminanten des RSV. Die F-Glykoproteine der Viren der Subtypen A und B sind schätzungsweise zu 50% verwandt, während die Verwandtschaft der G-Glykoproteine erheblich geringer ist, etwa 1 bis 5%. Eine Infektion mit einem RSV-Subtyp A induziert entweder eine partielle oder keine Resistenz gegen die Replikation eines Stamms des Subtyps B und umgekehrt. Um vor einer RSV-Infektion zu schützen, werden sowohl Impfstoffe für den Subtyp A als auch den Subtyp B benötigt.
Der erste hierin beschriebene Ansatz ist die Herstellung eines infektiösen chimären RSV-cDNA-Klons, der die Antigene des Subtyps B exprimiert, durch einen Austausch der G- und F-Region des vorliegenden infektiösen RSV A2 cDNA-Klons durch die G- und F-Gene des Subtyps B. Der chimäre RSV wäre spezifisch für die Antigene des Subtyps B. Der zweite hierin beschriebene Ansatz ist die Insertion des G-Gens des Subtyps B in den vorliegenden A2-cDNA-Klon, sodass ein Virus die spezifischen Antigene sowohl des Subtyps A als auch B exprimiert.
8.1. Austausch der A2-Gene G und F durch die G- und F-Gene von B9320
Die G- und F-Gene des RSV-Stamms B9320 des Subtyps B wurden mittels RT/PCR aus B9320 vRNA amplifiziert und für eine Bestimmung der Sequenz in den Vektor pCRII kloniert. In den für die RT/PCR verwendeten Oligonukleotidprimern wurde eine BamH I-Stelle geschaffen, um die G- und F-Gene aus dem Stamm B9320 in die Antigenom-A2-cDNA zu klonieren (4A). Zuerst wurde ein cDNA-Fragment von Nukleotid 4326 bis Nukleotid 9387, das die G- und F-Gene des A2- Stamms enthielt, in pUC19 (pUCR/H) subkloniert. An den Positionen 4630 (Verbindung von SH/G) bzw. 7554 (Verbindung von F/M2) wurden mit dem Quickchange-Kit für die ortsgerichtete Mutagenese (Stratagene, La Jolla, CA) BgI II-Stellen erzeugt. Die cDNA von B9320-G- und F, die in den pCR.II-Vektor insertiert wurde, wurde mit dem Restriktionsenzym BamH I verdaut und dann in den mit BgI II verdauten pUCR/H subkloniert, bei welchem die Gene A2-G- und F entfernt worden waren. Der cDNA-Klon mit den durch die B9320-G- und F-Gene ersetzten A2-G- und F-Genen wurde verwendet, um die Region der Volllängen-Antigenom-A2-cDNA von Xho I bis Msc I zu ersetzen. Der erhaltene Antigenom-cDNA-Klon wurde als pRSVB-GF bezeichnet und wurde verwendet, um Hep-2-Zellen zu transfizieren, um infektiöses RSV-GF-Virus zuerzeugen.
Die Erzeugung des chimären RSVB-GF-Virus wurde wie folgt durchgeführt, pRSVB-GF wurde zusammen mit Plasmiden, welche die Proteine N, P und L codieren, in Hep-2-Zellen transfiziert, welche mit MVA, einem rekombinanten Vacciniavirus, das die T7-RNA-Polymerase exprimiert, infiziert worden waren. Die Hep-2-Zellen wurden einen Tag vor der Transfektion in Sechs-Well-Platten aufgeteilt. Monolager der Hep-2-Zellen mit einer 60%igen bis 70%igen Konfluenz wurden mit MVA mit einer m.o.i. von 5 infiziert und bei 35°C für 60 Minuten inkubiert. Dann wurden die Zellen einmal mit OPTI-MEM (Life Technologies, Gaithersburg, MD) gewaschen. Bei jeder Platte wurde 1 ml OPTI-MEM ersetzt und es wurde 0,2 ml Transfektionsmedium zugegeben. Das Transfektionsmedium wurde hergestellt durch Mischen der fünf Plasmide in einem Endvolumen von 0,1 ml OPTI-MEM-Medium, nämlich 0,6 μg RSV-Antigenom-pRSVB-GF, 0,4 μg N-Plasmid, 0,4 μg P-Plasmid und 0,2 μg L-Plasmid. Dies wurde mit 0,1 ml OPTI-MEM mit 10 μl Lipofec TACE (Life Technologies, Gaithersburg, MD USA) kombiniert. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde DNA/Lipofec TACE zu den Zellen zugegeben und das Medium wurde einen Tag später durch MEM mit 2% FBS ersetzt. Die Kulturen wurden weiter für 3 Tage bei 35°C inkubiert und die Überstände wurden geerntet. Aliquots der Kulturüberstände wurden dann für die Infektion von frischen Hep-2-Zellen verwendet. Nach einer Inkubation für 6 Tage bei 35°C wurde der Überstand geerntet und die Zellen wurden fixiert und gefärbt durch ein indirektes Meerrettich-Peroxidase-Verfahren unter Verwendung eines Ziege-Anti-RSV-Antikörpers (Biogenesis, Sandown, NH), gefolgt von einem mit Meerrettich-Peroxidase verbundenen Kaninchen-Anti-Ziege-Antikörper. Die mit Virus infizierten Zellen wurden dann durch Zugabe des Substrats Chromogen (DAKO, Carpinteria, CA, USA) nach den Anleitungen des Herstellers nachgewiesen. RSV-ähnliche Plaques wurden in den Zellen nachgewiesen, die mit den Überständen von mit RSVB-GF transfizierten Zellen infiziert worden waren. Das Virus wurde weiter zweimal plaquegereinigt und in Hep-2-Zellen amplifiziert.
Das rekombinante RSVB-GF-Virus wurde durch RT/PCR unter Verwendung von Primern charakterisiert, die für den RSV-Subtyp B spezifisch waren. Zwei unabhängig voneinander aufgereinigte rekombinante RSVB-GF-Virusisolate wurden mit einem RNA-Extraktionskit (Tel-Test, Friendswood, TX) extrahiert und die RNA wurde durch Isopropanol präzipitiert. Die RNAs der Virionen wurden mit einem Primer verbunden, der die RSV-Region von Nukleotid 4468 bis 4492 umfasst, und für 1 Stunde unter Standard-RT-Bedingungen (10 μl Reaktionen) unter Verwendung der reversen Transkriptase Superscript (Life Technologies, Gaithersburg, MD) inkubiert. Aliquots jeder Reaktion wurden unter Verwendung von Primern, die für die G-Region des Subtyps B spezifisch sind (CACCACCTACCTTACTCAAGT und TTTGTTTGTGGGTTTGATGGTTGG) einer PCR unterzogen (30 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 27°C für 2 Minuten). Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese auf einem 1 %igen Agarosegel analysiert und durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Wie in 5 gezeigt wird, wurde in den RT/PCR-Reaktionen unter Verwendung des RSV A2-Stamms als Templat kein DNA-Produkt erzeugt. Jedoch wurde in den RT/PCR-Reaktionen unter Verwendung von RSVB-GF-RNA oder mit dem PCR-Kontrollplasmid pRSVB-GB-DNA als Templat das erwartete Produkt mit 254 bp nachgewiesen, was zeigt, dass das erhaltene Virus die vom B9320-Virus stammenden G- und F-Gene enthielt.
8.2. Expression von B9320G durch das RSV A2-Virus
Das G-Gen des RSV-Stamms G9320 vom Subtyp B wurde durch RT/PCR aus B9320 vRNA amplifiziert und für eine Sequenzbestimmung in den Vektor pCRII kloniert. In die PCR-Primer (GATATCAAGATCTACAATAACATTGGGGCAAATGC und GCTAAGAGATCTTTTTGAATAACTAAGCATG), die auch Genstart- und Genend-Signale enthielten, wurden zwei BgI II-Stellen eingefügt. Das B9320G-cDNA-Insert wurde mit BgI II verdaut und in die Verbindung zwischen SH/G (Nukleotid 4630) oder F/M2 (Nukleotid 7552) eines A2-cDNA-Subklons kloniert (4B und 4C). Das Fragment von Xho 1 bis Msc 1 mit der B9320G-Insertion entweder in der Region zwischen den Genen SH/G oder F/M2 wurde verwendet, um die entsprechende Region von Xho I bis Msc I der Antigenom-A2-cDNA zu ersetzen. Der resultierende RSV-Antigenom-cDNA-Klon wurde als pRSVB9320G-SH/G oder pRSVB9320G-F/M2 bezeichnet.
Die Erzeugung eines RSV A2-Virus, bei dem das B9320G-Gen an der Region zwischen den Genen F/M2 insertiert war, wurde ähnlich durchgeführt wie bei der Erzeugung des RSVB-GF-Virus beschrieben wurde. In Kürze, pRSVB9320G-F/M2 wurde zusammen mit Plasmiden, welche die Proteine N, P und L codieren, in Hep-2-Zellen transfiziert, die mit einer MVA-Vacciniavirusrekombinante infiziert waren, welche die T7-RNA-Polymerase exprimiert (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Das Medium der transfizierten Zellen wurde einen Tag nach der Transfektion durch MEM mit 2% fötalem Rinderserum (FBS) ersetzt und weiter für 3 Tage bei 35°C inkubiert. Dann wurden Aliquots der Kulturüberstände (PO) für die Infektion von frischen Hep-2-Zellen verwendet. Nach einer Inkubation für 6 Tage bei 35°C wurde der Überstand geerntet und die Zellen wurden fixiert und durch ein indirektes Meerrettich-Peroxidase-Verfahren gefärbt, unter Verwendung eines Ziege-Anti-RSV-Antikörpers (Biogenesis) gefolgt von einem Kaninchen-Anti-Ziege-Antikörper, der mit Meerrettich-Peroxidase verbunden war. Die mit Virus infizierten Zellen wurden dann durch Zugabe des Substrats Chromogen (Dako) nachgewiesen. In den Zellen, die mit den Überständen aus Zellen infiziert wurden, die mit pRSVB9320G/F/M2 transfiziert worden waren, wurden RSV-ähnliche Plaques nachgewiesen.
Die Charakterisierung des pRSVB9320G-F/M2-Virus wurde durch RT/PCR unter Verwendung von B9320G-spezifischen Primern durchgeführt. Ein erwartetes PCR-Produkt mit 410 bp war in der RT/PCR-Probe sichtbar, bei der pRSVB9320G-F/M2-RNA als Templat verwendet wurde, was zeigt, dass das gewonnene Virus das von B9320 stammende G-Gen enthielt (6).
Die Expression des insertierten RSV B9320-G-Gens wurde durch Northern Blotting unter Verwendung eines ³²P-markierten Oligonukleotids analysiert, das für die mRNA von A2-G oder B-G spezifisch war. Aus Hep-2-Zellen wurde 48 Stunden nach einer Infektion mit Wildtyp-RSVB9320, mit rRSVA2 oder mit rRSVB9320G-F/M2 unter Verwendung eines RNA-Extraktionskits (RNA Stat-60, Tel-Test) zelluläre Gesamt-RNA extrahiert. Die RNA wurde auf einem 1,2%igen Agarosegel mit Formaldehyd einer Elektrophorese unterzogen und auf eine Nylonmembran (Amersham) übertragen. Ein für das G-Gen des A2-Stamms spezifisches Oligonukleotid (5'TCTTGACTGTTGTGGATTGCAGGGTTGACTTGACTCCGATCGATCC-3') und ein für das G-Gen von B9320 spezifisches Oligonukleotid (5'CTTGTGTTGTTGTTGTATGGTGTGTTTOTGATTTTGTATTGATCGATCC-3') wurden durch eine in Fachkreisen bekannte Kinasereaktion mit ³²P-ATP markiert. Die Hybridisierung der Membran mit einem der ³²P-markierten für das G-Gen spezifischen Oligonukleotide wurde bei 65°C durchgeführt und es wurde gemäß Standardverfahren gewaschen. In den mit rRSVB9320G-F/M2 infizierten Hep-2-Zellen wurde sowohl A2-G- als auch B9320-G-spezifische RNA nachgewiesen. (6B) Diese Ergebnisse zeigen die Subtyp-spezifische RNA-Expression.
Die Proteinexpression des chimären rRSVA2(B-G) wurde mittels Immunpräzipitation von ³⁵S-markierten Lysaten von infizierten Hep-2-Zellen mit der Proteinexpression von RSV B9320 und rRSV verglichen. Kurz, die mit Virus infizierten Zellen wurden 14 bis 18 Stunden nach der Infektion gemäß einem im Fachgebiet bekannten Protokoll mit einem ³⁵S-Promix (100 μCi/ml ³⁵S-Cys und ³⁵S-Met, Amersham, Arlington Heights, IL) markiert. Die Zellmonolayer wurden mit RIPA-Puffer lysiert und die Polypeptide wurden entweder mit einem polyklonalen Antiserum aus Ziegen gegen das durch Detergenz zerstörte RSV A2-Virus (7, Spuren 1-4) oder mit einem Antiserum aus Mäusen gegen nicht zerstörte B9320-Virionen (7, Spuren 5-8) immunpräzipitiert. Die radiomarkierten immunpräzipitierten Polypeptide wurden auf 10%igen Polyacrylamidgelen mit 0,1% SDS einer Elektrophorese unterzogen und durch Autoradiographie nachgewiesen. Durch das Anti-RSV A2-Serum wurden die wesentlichen Polypeptide des RSV A2-Stamms immunpräzipitiert, wohingegen das Anti-B9320-Serum hauptsächlich mit dem G-Protein des RSV B9320 und dem konservierten F-Protein sowohl vom Subtyp A als auch vom Subtyp B reagierte. Wie in 7 gezeigt wird, wurde aus den mit rRSV A2 (B-G) infizierten Zellen (Spur 4) durch Verwendung eines Antiserums gegen RSV A2 ein Protein immunpräzipitiert, das mit dem A2-G-Protein identisch ist (Spur 3). Das G-Protein des RSV B9320-Stamms wurde durch das Anti-A2-Antiserum nicht erkannt. Sowohl aus den mit B9320 (Spur 6) als auch den mit rRSVA2 (B-G) (Spur 9) infizierten Zellen wurde unter Verwendung des Anti serums aus Mäusen gegen B9320-Virionen eine Proteinspezies immunpräzipitiert, die kleiner war als das A2-G-Protein. Dieses Polypeptid war in den nicht infizierten und in den mit RSV A2 infizierten Zellen nicht vorhanden und es ist wahrscheinlich, dass es sich um das für den RSV B9320-Stamm spezifische G-Protein handelt. Ein Aminosäuresequenzvergleich der G-Proteine sowohl von RSV A2 als auch von RSV B9320 zeigte, dass im RSV A2G-Protein zwei zusätzliche potentielle N-Glykosylierungsstellen (N-X-S/t) vorliegen, welche unter den verwendeten Bedingungen zu einer langsameren Migration des A2 G-Proteins beitragen können. Das F-Protein von RSV B9320 migrierte etwas schneller als das F-Protein von RSV A2. Auch die P- und M-Proteine zeigten zwischen den zwei Subtypen des Virus Unterschiede in der Mobilität. Die Identität des Polypeptids nahe des oberen Teils des Proteingels, das in den mit RSV B9320 und rRSVA2(B-G) infizierten Zellen vorhanden ist, ist nicht bekannt. Antiseren aus Mäusen gegen die RSV B9320-Virionen, welche die N-, P- und M-Proteine nur schlecht erkannten, werden mit dem Ziegen-Antiserum gegen den RSV A2-Stamm verglichen. Die oben beschriebenen Daten zeigen deutlich, dass das chimäre rRSV A2(B-G) sowohl die für RSV A2 als auch für RSV B9320 spezifischen G-Proteine exprimiert.
8.2.1. Replikation von rekombinantem RSV in Gewebekultur
Rekombinante RS-Viren wurden dreimal plaquegereinigt und in Hep-2-Zellen amplifiziert. Die Plaqueassays wurden in Hep-2-Zellen in 12-Well-Platten unter Verwendung einer Schicht von 1% Methylcellulose und 1 × L15-Medium mit 2% fötalem Rinderserum (FBS) durchgeführt. Nach einer Inkubation bei 35°C für 6 Tage wurden die Monolager mit Methanol fixiert und die Plaques wurden durch Immunfärbung identifiziert. Die Größe und Morphologie der rRSV-Plaques waren sehr ähnlich wie beim Wildtyp-RSV A2 (8). Jedoch waren die durch rRSVC4G gebildeten Plaques kleiner als die des rRSV und des Wildtyp A2-Virus. Der einzige genetische Unterschied zwischen rRSV und rRSVC4 war eine einzelne Nukleotidsubstitution in der RSV-Leader-Region. Deshalb war die geringere Plaquegröße von rRSV A2(B-G) nicht von der von rRSVC4G unterscheidbar.
Die Wachstumskurven von rRSV, rRSVC4G und rRSV A2(B-G) wurden mit Wachstumskurven des biologisch erhaltenen Wildtyp A2-Virus verglichen. Hep-2-Zellen wurden in T25-Kulturflaschen angezogen und mit rRSV, rRSVC4G, rRSVA2(B-G) oder mit dem Wildtyp RSV-Stamm A2 mit einer moi von 0,5 infiziert.
Nach einer 1stündigen Adsorption bei 37°C wurden die Zellen dreimal mit MEM mit 2% FBS gewaschen und bei 37°C in 5% CO₂ inkubiert. In 4-ständigen Intervallen nach der Infektion wurden 250 μl des Kulturüberstands gesammelt und bis zur Virustitration bei –70°C gelagert. Jedes entnommene Aliquot wurde durch eine gleiche Menge frisches Medium ersetzt. Der Titer jedes Virus wurde durch einen Plaqueassay auf Hep-2-Zellen bestimmt und durch Immunfärbung sichtbar gemacht (siehe oben). Wie in 9 gezeigt wird, ist die Wachstumskinetik des rRSV der Wachstumskinetik des Wildtyp A2-Virus sehr ähnlich. Die maximalen Virustiter wurden bei allen Viren zwischen 48 und 72 Stunden erreicht. Der Virustiter von rRSVC4G war etwa um das 2,4-fache (bei 48 Stunden) und das 6,6-fache (bei 72 Stunden) geringer als der Virustiter von rRSV und vom Wildtyp A2 RSV. Das schlechte Wachstum des rRSVC4G kann aufgrund der einzelnen Nukleotidveränderung in der Leader-Region auftreten. Das chimäre rRSV A2(B-G) zeigte eine langsamere Kinetik und einen geringeren Peaktiter (9).
Erzeuqung eines respiratorischen Syncytialvirus (RSV)-Impfstoffkandidaten durch Deletion des viralen SH- und M2-ORF2-Gens
10.1. M2-2-Deletionsmutante
Um die M2-2-Gene zu deletieren, wurden in einen cDNA-Subklon pET(S/B), der ein RSV-Restriktionsfragment von 4478 bis 8505 enthielt, an den RSV-Nukleotiden 8196 bzw. 8430 zwei Hind III-Restriktionsenzymstellen eingefügt. Das RSV-Restriktionsfragment wurde zuvor durch eine ortsgerichtete Mutagenese mit Quickchange (Stratagene, La Jolla, CA) hergestellt. Der Verdau von pET(S/B) mit dem Restriktionsenzym Hind III entfernte eine Sequenz mit 234 Nukleotiden, welche den Hauptteil des offenen Leserahmens M2-2 enthielt. Die Nukleotide, welche die ersten 13 Aminosäuren am N-Terminus des M2-2-Genprodukts codierten, wurden nicht entfernt, da diese Sequenz mit M2-1 überlappt. Das cDNA-Fragment, das die M2-2-Gendeletion enthielt, wurde mit Sac I und BamHI verdaut und wieder in einen Volllängen-RSV-cDNA-Klon mit der Bezeichnung pRSVΔM2-2 kloniert.
Infektiöses RSV mit dieser M2-2-Deletion wurde erzeugt durch Transfektion des pRSVΔM2-2-Plasmids in mit MVA infizierte Hep-2-Zellen, welche die N-, P- und L-Gene exprimierten. Kurz gesagt, pRSVΔM2-2 wurde zusammen mit den Plasmiden, welche die Proteine N, P und L codieren, in Hep-2-Zellen transfiziert, die mit einem rekombinanten Vacciniavirus (MVA) infiziert worden waren, der die T7-RNA-Polymerase exprimiert. Die Transfektion und Gewinnung des rekombinanten RSV wurde wie folgt durchgeführt. Die Hep-2-Zellen wurden fünf Stunden oder einen Tag vor der Transfektion in Sechs-Well-Schalen aufgeteilt. Monolager der Hep-2-Zellen mit einer 70%igen bis 80%igen Konfluenz wurden mit MVA mit einer moi („multiplicity of infektion”) von 5 infiziert und bei 35°C für 60 Minuten inkubiert. Dann wurden die Zellen einmal mit OPTI-MEM (Life Technologies, Gaithersburg, M.D.) gewaschen. Jede Schale wurde durch 1 ml OPTI-MEM ersetzt und es wurden 0,2 ml Transfektionsmedium zugegeben. Das Transfektionsmedium wurde durch Mischen von 0,5-0,6 μg des RSV-Antigenoms, 0,4 μg des N-Plasmids, 0,4 μg des P-Plasmids und 0,2 μg des L-Plasmids in einem Endvolumen von 0,1 ml OPTI-MEM-Medium hergestellt. Dies wurde mit 0,1 ml OPTI-MEM mit 10 μl LipofecTACE (Life Technologies) kombiniert. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurde das DNA/LipofecTACE-Gemisch zu den Zellen zugegeben. Das Medium wurde einen Tag später mit MEM mit 2% FCS ersetzt. Die Kulturen wurden weiter bei 35°C für 3 Tage inkubiert und die Überstände wurden geerntet. Drei Tage nach der Infektion wurde 0,3-0,4 ml Kulturüberstand auf frische Hep-2-Zellen passagiert und mit MEM mit 2% FBS inkubiert. Nach einer Inkubation für sechs Tage wurde der Überstand gesammelt und die Zellen wurden fixiert und durch ein indirektes Meerrettich-Peroxidase-Verfahren unter Verwendung eines Ziege-Anti-RSV-Antikörpers (Biogenesis) gefolgt von einem mit Meerrettich-Peroxidase verknüpften Kaninchen-Anti-Ziege-Antikörper gefärbt. Die mit Virus infizierten Zellen wurden dann durch Zugabe des Substrats Chromogen (DAKO) gemäß den Anweisungen des Herstellers nachgewiesen. Das rekombinante RSV, das die M2-2-Gendeletion enthielt, wurde aus den transfizierten Zellen gewonnen. Die Identifizierung des rRSVΔM2-2 wurde unter Verwendung von Primern, welche die deletierte Region flankieren, mittels RT/PCR durchgeführt. Wie in 12A gezeigt wird, wurde in den mit rRSVΔM2-2 infizierten Zellen ein cDNA-Fragment nachgewiesen, das 234 Nukleotide kürzer ist als das Fragment des Wildtyp-RSV. In der RT/PCR-Reaktion, die keine Reverse Transkriptase in der RT-Reaktion enthielt, wurde keine cDNA nachgewiesen. Dies zeigte, dass das DNA-Produkt von viraler RNA stammte und nicht von einer Kontamination. Die Eigenschaften des RSV mit der M2-2-Deletion werden momentan untersucht.
10.3. Erzeugung einer SH- und M2-2-Deletionsmutante
Aus dem Volllängen-RSV-cDNA-Konstrukt wurden durch cDNA-Subklonierung sowohl das SH- als auch das M2-2-Gen deletiert. Ein Fragment von Sac I bis Bam HI mit der M2-2-Deletion, das aus dem cDNA-Subklon pET(S/B)ΔM2-2RSV entfernt wurde, wurde in den pRSVΔSH-cDNA-Klon kloniert. Das Plasmid pRSVΔSHΔM2-2 mit der doppelten Gendeletion wurde durch Restriktionsenzym-Mapping überprüft. Wie in 12B gezeigt wird, ist die SH/M2-2-Doppeldeletionsmutante kürzer als die Wildtyp-pRSV-cDNA. Die Gewinnung von infektiösem RSV mit der SH- und der M2-2-Deletion wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Das infektiöse Virus, bei dem sowohl SH als auch M2-2 deletiert war, wurde aus transfizierten Hep-2-Zellen erhalten.
11. Beispiel: Erzeugung eines humanen respiratorischen Syncytialvirus (RSV)-Impfstoffkandidaten durch Deletion eines einzelnen viralen akzessorischen Gens bzw. einer Kombination viraler akzessorischer Gene
Grundprinzip:
Das humane respiratorische Syncytialvirus ist bei Säuglingen im Alter von unter einem Jahr die Hauptursache für Pneumonie und Bronchiolitis. Das RSV ist für mehr als eine von fünf stationären Aufnahmen in die Pädiatrie aufgrund einer Atemwegserkrankung verantwortlich und verursacht alleine in den USA 4 500 Todesfälle jährlich. Trotz jahrzehntelanger Forschung zur Entwicklung eines wirksamen Impfstoffs gegen RSV wurde kein sicherer und wirksamer Impfstoffs erhalten, der die schwere Morbidität und signifikante Mortalität verhindert, die mit einer RSV-Infektion verbunden ist. Es wurden verschiedene Ansätze verwendet, um RSV-Impfstoffkandidaten zu entwickeln: mit Formalin inaktiviertes Virus, ein Impfstoff aus rekombinanten Untereinheiten von exprimierten RSV-Glykoproteinen und lebend-attenuiertes Virus. Vor kurzem hat man sich auf die Erzeugung von lebendattenuierten RSV-Mutanten für die RSV-Impfstoffentwicklung konzentriert. In der Vergangenheit konnte die Erzeugung einer lebend-attenuierten RSV-Mutante nur durch eine in vitro-Passage und/oder chemische Mutagenese erreicht werden. Das Virus war entweder zu wenig attenuiert oder zu stark attenuiert und es war genetisch nicht stabil. Die vorliegende Untersuchung stellt einen unmittelbaren Ansatz zur Erzeugung von genetisch stabilen, lebend-attenuierten RSV-Impfstoffen durch Deletion eines einzelnen akzessorischen Gens bzw. einer Kombination akzessorischer Gene bereit. Gendeletionen werden als eine sehr mächtige Strategie zur Attenuierung des RSV betrachtet, da solche Deletionen keine Reversion durchlaufen und somit erwartet wird, dass die rekombinanten RSV-Deletionsmutanten genetisch sehr stabil sind.
Das RSV ist aufgrund seiner Genorganisation unter den Paramyxoviren einzigartig. Neben den N-, P-, L-, M-, G- und F-Genen, die alle Paramyxoviren gemeinsam haben, enthält das RSV vier zusätzliche Gene, welche die fünf Proteine NS1, NS2, SH, M2-1 und M2-2 codieren. M2-1 und M2-2 werden aus zwei offenen Leserahmen translatiert, welche in der Mitte der M2-mRNA überlappen. M2-1 verstärkt das mRNA-Transkriptionsprocessing und fungiert durch Erhöhung des Transkriptionsdurchsatzes an den Verbindungen der Gene auch als Faktor gegen eine Termination (Collins, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 81-85 (1996); Hardy R.W. et al., J. Virol. 72, 520-526 (1998)). Jedoch wurde gefunden, dass das M2-2-Protein die RSV-RNA-Transkription und Replikation in vitro inhibiert (Collins, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 81-85 (1996)). Es wurde berichtet, dass das akzessorische Protein NS1 ein wirksamer Transkriptionsinhibitor ist (Atreya, P.L. te al., J. Virol. 72, 1452-1461 (1998)). Es ist gezeigt worden, dass das SH-Gen für das RSV-Wachstum in Gewebekultur bei einem natürlich auftretenden Virus und einem rekombinanten RSV mit einer eingefügten SH-Deletion entbehrlich ist (Bukreyev, A. et al., J. Virol. 71(12), 8973-82 (1997); Karron, R.A. et al., J. Infect. Dis. 176, 1428-1436 (1997)). Das RSV ohne SH repliziert in vitro ebenso gut wie das Wildtyp-RSV. Kürzlich wurde berichtet, dass auch das NS2-Gen deletiert werden kann (Teng, M.N. et al., J. Virol 73(1), 466-73 (1999); Buchholz, U.J. et al., J. Virol. 73(1), 251-9 (1999)). Über eine Deletion von M2-1, M2-2 und NS1 wurde nichts berichtet, ebenso wenig wurde über eine Deletion von mehr als zwei nicht essenziellen Genen berichtet.
Traditionell wurden lebend-attenuierte Virusmutanten durch mehrmalige Passage des RSV bei einer niedrigen Temperatur und/oder durch eine Mutagenese mit chemischen Reagenzien erzeugt. Die Mutationen werden zufällig eingefügt und es ist schwierig, den Virusphänotyp zu erhalten, da sich Revertanten entwickeln können. Die Möglichkeit, Virus aus einer infektiösen cDNA herzustellen, macht die Deletion eines Gens oder mehrerer Gene, die mit der Viruspathogenese in Verbindung stehen, möglich. Eine Deletion eines einzigens Gens oder eine Deletion in Kombination mit Mutationen in den anderen viralen Genen (G, F, M, N, P und L) kann einen stabilen attenuierten RSV- Impfstoff ergeben, der wirksam vor einer RSV-Infektion schützt.
11.1. Erzeugung eines humanen respiratorischen Syncytialvirus (RSV)-Impfstoffkandidaten durch Deletion des viralen M2-2-Gens
Dieses Beispiel beschreibt die Erzeugung eines rekombinanten RSV, in welchem durch Entnahme einer Polynukleotidsequenz, welche das M2-2-Gen codiert, und des codierten Proteins die M2-2-Gen-Expression entfernt wurde. Das RSV-M2-2-Gen wird durch das M2-2-Gen codiert und der offene Leserahmen überlappt teilweise über 12 Aminosäuren mit dem 5'-proximalen offenen Leserahmen von M2-1 (Collins, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 81-85 (1996)). Das erwartete M2-2-Polypeptid enthält 90 Aminosäuren, jedoch wurde das M2-2-Protein bisher noch nicht intrazellulär identifiziert. Das M2-2-Protein reguliert die RNA-Transkription und -Replikation des RSV in einem Minigenommodellsystem herunter (Collins, P.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11563-11567 (1995)). Die Bedeutung dieses negativen Effekts auf die RNA-Transkription und -Replikation des RSV im viralen Replikationszyklus ist nicht bekannt.
11.1.1. Gewinnung eines rekombinanten RSV ohne das M2-2-Gen
Um einen rekombinanten RSV herzustellen, welcher das M2-2-Protein nicht mehr exprimiert, wurde das M2-2-Gen aus dem elterlichen RSV-cDNA-Klon deletiert (Jin, H. et al., Virology 251, 206-214 (1998)). Der Antigenom-cDNA-Klon codiert eine vollständige Antigenom-RNA des RSV-Stamms A2, die erfolgreich verwendet wurde, um rekombinantes RSV zu gewinnen. Diese Antigenom-cDNA enthält an Position 4 in der Leaderregion im Antigenom-Strang einen einzigen Nukleotidaustausch von C nach G. Die Konstruktion des Plasmids pA2ΔM2-2 bezieht ein zweistufiges Klonierungsverfahren ein. Zwei Hind III-Restriktionsenzymstellen wurden an Nukleotid 8196 bzw. 8430 der RSV-Sequenz in einen cDNA-Subklon (pET-S/B), welcher das RSV- cDNA-Fragment von Sac I (Nukleotid 4477) bis BamHI (Nukleotid 8504) enthielt, unter Verwendung des Mutagenese-Kits Quickchange (Stratagene) eingefügt. Der Verdau dieses cDNA-Klons mit dem Restriktionsenzym Hind III entfernte das Hind III-cDNA-Fragment mit 234 Nukeotiden, welches das M2-2-Gen enthielt. Das verbleibende Fragment von Sac I- bis BamHI, welches das M2-2-Gen nicht enthielt, wurde dann in eine Antigenom- RSV-cDNA pRSVC4G kloniert. Das resultierende Plasmid wurde pA2ΔM2-2 bezeichnet.
Um einen rekombinanten RSV mit einem deletierten offenen Leserahmen M2-2 zu gewinnen, wurde pA2ΔM2-2 zusammen mit den Plasmiden, welche die RSV N-, P- und L-Proteine unter der Kontrolle des T7-Promotors codieren, in Hep-2-Zellen transfiziert, welche zuvor mit einem modifizierten Vacciniavirus infiziert wurden, das die T7-RNA-Polymerase codiert (MVA-T7). Nach einer 5-stündigen Inkubation der transfizierten Hep-2-Zellen bei 35°C wurde das Medium durch MEM mit 2% FBS ersetzt und die Zellen wurden weiter für 3 Tage bei 35°C inkubiert. Die Kulturüberstände der transfizierten Hep-2-Zellen wurden verwendet, um frische Hep-2- oder Vero-Zellen zu infizieren, um den gewonnenen Virus zu amplifizieren. Die Gewinnung von rA2ΔM2-2 wurde angezeigt durch Syncytien-Bildung und wurde durch die positive Färbung der infizierten Zellen unter Verwendung eines polyklonalen Anti-RSV A2-Serums bestätigt. Gewonnener rA2ΔM2-2 wurde dreimal plaquegereinigt und in Vero-Zellen amplifiziert. Um zu bestätigen, dass rA2ΔM2-2 die M2-2-Gendeletion enthielt, wurde virale RNA aus dem Virus extrahiert und unter Verwendung eines Primerpaars, welches das M2-2-Gen umfasst, einer RT/PCR unterzogen. Die virale RNA wurde mit einem RNA-Extraktionskit (RNA STAT-50, Tel-Test, Friendswood, TX) aus dem Kulturüberstand von mit rA2ΔM2-2 und rA2-infizierten Zellen extrahiert. Die virale RNA wurde mit Reverser Transkriptase unter Verwendung eines Primers revers transkribiert, der zum viralen Genom von Nukleotid 7430 bis Nukleotid 7449 komplementär war. Das cDNA-Fragment, das das M2-2-Gen umfasst, wurde durch eine PCR mit dem Primer V1948 (Nukleotid 7486 bis Nukleotid 7515 im Positivstrang) und dem Primer V1581 (Nukleotid 8544 bis Nukleotid 8525 im Negativstrang) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde auf einem 1,2%igen Agarosegel analysiert und durch Ethidiumbromidfärbung sichtbar gemacht. Wie in 13B gezeigt wird, ergab das Wildtyp-rA2 ein PCR-DNA-Produkt, das dem erwarteten Fragment mit 1029 Nukleotiden entsprach, wohingegen das rA2ΔM2-2 ein PCR-Produkt mit 795 Nukleotiden ergab, also 234 Nukleotide kürzer. Die Erzeugung des RT/PCR-Produkts war vom RT-Schritt abhängig, was zeigt, dass es von RNA und nicht von einer DNA-Kontamination stammt.
11.1.2. RNA-Synthese von Ra2ΔM2-2
Die mRNA-Expression von mit rA2ΔM-2 oder rA2 infizierten Zellen wurde durch Northern Blotting-Hybridisierungsanalysen untersucht. Von den mit rA2ΔM2-2 oder rA2 infizierten Zellen wurde die zelluläre Gesamt-RNA mittels eines RNA-Extrationskits (RNA STAT-60, Tel-Test, Friendswood, TX) extrahiert. Die RNA wurde auf einem 1,2%igen Ararosegel mit Formaldehyd einer Elektrophorese unterzogen und auf eine Nylonmembran (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) übertragen. Die Membran wurde mit einer RSV-Gen-spezifischen Ribosonde, die mit Digoxigenin (Dig) markiert war, hybiridisert. Die hybridisierten RNA-Banden wurden unter Verwendung eines Dig-Luminescent Nachweis-Kits für Nukleinsäuren (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) sichtbar gemacht. Die Hybridisierung der Membranen mit Ribosonden wurde bei 65°C durchgeführt, das Waschen der Membran und der Nachweis des Signals wurden gemäß Standardverfahren durchgeführt. Um die RNA-Synthese aus rA2ΔM2-2 und rA2 zu untersuchen, wurde die Akkumulierung der M2-mRNA und der anderen viralen mRNA-Produkte in infizierten Vero-Zellen durch Northern Blotting-Hybridisierung untersucht. Die Hybridisierung des Blots mit einer Probe, die für den offenen Leserahmen M2-2 spezifisch war, zeigt in den mit rA2ΔM2-2 infizierten Zellen kein Signal. Stattdessen wurde in den mit rA2ΔM2-2 infizierten Zellen unter Verwendung einer Ribosonde, die für das M2-1-Gen spezifisch war, eine kürzere M2-mRNA nachgewiesen (14A). Diese Beobachtungen bestätigten, dass das M2-2-Gen aus rA2ΔM2-2 deletiert war. Die Akkumulation der neun anderen mRNA-Transkripte des RSV wurde auch untersucht und man hat gefunden, dass die Mengen von jeder mRNA zwischen den mit rA2ΔM2-2 und rA2 infizierten Zellen vergleichbar waren. Beispiele von Northern Blots, die mit N, SH, G und F sondiert wurden, werden auch in 14A gezeigt. Aufgrund der Deletion der M2-2-Region war auch eine etwas schnellere Migration der bicistronischen F-M2 mRNA erkennbar.
Es wurde zuvor berichtet, dass M2-2-Protein in einem Minigenomreplikationsassay ein wirksamer negativer Transkriptionsregulator ist. Jedoch schien die Deletion des M2-2-Gens aus dem Virus die virale mRNA-Produktion in den infizierten Zellen nicht zu beeinflussen. Um zu bestimmen, ob die Mengen der viralen Antigenom- und Genom-RNA von rA2ΔM2-2 ebenso mit rA2 ähnlich sind, wurde die Menge der in infizierten Vero- und Hep-2-Zellen erzeugten viralen Genom- und Antigenom-RNA durch Northern-Hybridisierung untersucht. Die Hybridisierung der infizierten zellulären Gesamt-RNA mit einer ³²P-markierten F- Gen-Ribosonde, die für die Negativstrang-Genom-RNA spezifisch war, zeigte, dass in Zellen, die mit rA2ΔM2-2 infiziert wurden, im Vergleich mit rA2 viel weniger Genom-RNA produziert wurde (146). Eine zweite Membran wurde mit einer ³²P-markierten F-Gen-Ribosonde hybridisiert, die für die Positivstrang-RNA spezifisch war. In den mit rA2ΔM2-2 infizierten Zellen wurde sehr wenig Antigenom-RNA nachgewiesen, obwohl die Menge der F-mRNA in den mit rA2ΔM2-2 infizierten Zellen vergleichbar war mit der Menge der F-mRNA in mit rA2 infizierten Zellen. Deshalb scheint die Synthese des RSV-Genoms und -Antigenoms aufgrund der Deletion des M2-2-Gens herunterreguliert zu sein. Diese Herunterregulation war sowohl in Vero- als auch in Hep-2-Zellen zu sehen, und war somit nicht zelltypabhängig.
11.1.3. Proteinsynthese von rA2ΔM2-2
Da das mutmaßliche M2-2-Protein zuvor in mit RSV infizierten Zellen nicht identifiziert worden war, war es somit notwendig zu zeigen, dass das M2-2-Protein in der Tat durch RSV codiert und in den infizierten Zellen produziert wird. Es wurde ein polyklonales Antiserum gegen das M2-2-Fusionsprotein erzeugt, das in einem bakteriellen Expressionssystem exprimiert wurde. Um ein Antiserum gegen das M2-2-Protein des RSV zu erzeugen, wurde ein cDNA-Fragment, das den offenen Leserahmen M2-2 von Nukleotid 8155 bis Nukleotid 8430 codierte, durch PCR amplifiziert und in den pRSETA-Vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA) kloniert. pRSETA/M2-2 wurde in BL21-Gold(DE3)plyS-Zellen (Stratagene, La Jolla, CA) transformiert und die Expression des His-markierten M2-2-Proteins wurde durch IPTG induziert. Das M2-2-Fusionsprotein wurde durch HiTrap-Affinitätssäulen (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) gereinigt und wurde zur Immunisierung von Kaninchen verwendet. Zwei Wochen nach einer Auffrischungsimmunisierung wurde den Kaninchen Blut entnommen und das Serum gesammelt.
Die spezifischen, von den infizierten Zellen produzierten viralen Proteine wurden durch Immunpräzipitation der Extrakte von infizierten Zellen oder durch Western Blotting analysiert. Für eine Immunpräzipitationsanalyse wurden die infizierten Vero-Zellen 14 bis 18 Stunden nach der Infektion mit einem ³⁵5-Promix (100 μCi/ml ³⁵S-Cys und ³⁵S-Met, Amersham, Arlington Heights, IL) markiert. Die markierten Zellmonolayer wurden mit RIPA-Puffer lysiert und die Polypeptide wurden mit einem polyklonalen Anti-RSV A2-Serum (Biogenesis, Sandown, NH) oder einem Anti-M2-2-Serum immunpräzipitiert. Die Immunpräzipitation der mit rA2 infizierten Vero-Zelllysate mit einem Anti-M-2-2-Antikörper erzeugte eine Proteinbande mit ungefähr 10 kDa, was die vorhergesagte Größe des M2-2-Polypeptids ist. Dieses Polypeptid wurde in den mit rA2ΔM2-2 infizierten Zellen nicht nachgewiesen (15A), was bestätigt, dass M2-2 ein durch das RSV erzeugtes Proteinprodukt ist und seine Expression aus rA2ΔM2-2 entfernt wurde. Das Muster der gesamten Polypeptide von rA2ΔM2-2 war vom Polypeptidmuster von rA2 nicht unterscheidbar. Jedoch wurde mittels Immunpräzipitation bemerkt, dass in den mit rA2ΔM2-2 infizierten Vero-Zellen etwas mehr P- und SH-Protein produziert wurde. Nichtsdestotrotz wurde mittels Western Blotting-Analyse eine vergleichbare Menge SH in den Zellen produziert, die mit rA2ΔM2-2 oder rA2 infiziert wurden (15B).
Die immunpräzipitierten Polypeptide wurden auf 17,5%igen Polyacrylamidgelen mit 0,1% SDS und 4 M Harnstoff einer Elektrophorese unterzogen und durch Autoradiographie nachgewiesen. Für die Western Blotting-Analyse wurden Hep-2- und Vero-Zellen mit rA2ΔM2-2 oder rA2 infiziert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion wurden die mit Virus infizierten Zellen in Proteinlysepuffer lysiert und die Zelllysate wurden auf 17,5%igen Polyacrylamidgelen mit 0,1 SDS und 4 M Harnstoff einer Elektrophorese unterzogen. Die Proteine wurden auf eine Nylonmembran übertragen. Das Immunblotting wurde unter Verwendung eines polyklonalen Antiserums gegen M2-1, NS1 oder SH durchgeführt, wie von Jin et al. beschrieben (Jin, H. et al., Embo J. 16 (6), 1236-47 (1997)).
Zur Bestimmung der Kinetik der Proteinsynthese von rA2ΔM2-2 sowohl in Vero- als auch in Hep-2-Zelllinien wurde ein Western Blotting verwendet. Die Hop-2- oder Vero-Zellen wurden mit rA2ΔM2-2 oder rA2 mit einer moi von 0,5 infiziert und die Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion geerntet und die Polypeptide auf einem 17,5%igen Polyacrylamidgel mit 4 M Harnstoff aufgetrennt. Die Proteine wurden auf eine Nylonmembran übertragen und mit einem polyklonalen Antiserum gegen die drei akzessorischen Proteine M2-1, NS1 und SH sondiert. Die Kinetik der Proteinexpression aller drei viralen Proteine war sowohl in Hep-2- als auch in Vero-Zellen für rA2ΔM2-2 und rA2 sehr ähnlich (15B). Die Synthese des NS1-Proteins wurde 10 Stunden nach der Infektion nachgewiesen, was etwas früher war als M2-1 und SH, da das NS1-Protein das erste translatierte Gen ist und in infizierten Zellen ein sehr häufig vorkommendes Proteinprodukt ist.
Eine ähnliche Kinetik der Proteinsynthese wurde auch beobachtet, wenn die Membran mit einem polyklonalen Antiserum gegen RSV sondiert wurde (Daten nicht gezeigt). Vergleichbares M2-1 wurde in den mit rA2ΔM2-2 infizierten Zellen nachgewiesen, was zeigt, dass die Deletion des offenen Leserahmens M2-2 die Menge des M2-1-Proteins, das durch die gleiche M2-mRNA translatiert wird, nicht beeinflusst.
11.1.4. Wachstumsanalyse von rekombinantem RSV in Gewebekultur
Um die Plaquemorphologie von rA2ΔM2-2 mit rA2 zu vergleichen, wurden Hep-2- oder Vero-Zellen mit jedem Virus infiziert und mit einem halbfesten Medium aus 1% Methylcellulose und 1 × L15-Medium mit 2% FCS beschichtet. Fünf Tage nach der Infektion wurden die infizierten Zellen mit einem Antiserum gegen den RSV A2-Stamm immungefärbt. Die Plaquegröße wurde durch Messen der Plaques in fotografierten Mikroskopbildern bestimmt. Die Plaquebildung von rA2ΔM2-2 in Hep-2- und Vero-Zellen wurde mit der Plaquebildung von rA2 verglichen. Wie in 16 gezeigt wird, bildete rA2ΔM2-2 in Hep-2-Zellen stecknadelkopfgroße Plaques, wobei bei rA2ΔM2-2 im Vergleich mit rA2 eine etwa 5-fache Verringerung der Größe der Virusplaques beobachtet wurde. Jedoch war in den mit rA2ΔM2-2 infizierten Vero-Zellen nur eine leichte Verringerung der Plaquegröße (30%) zu sehen.
Sowohl in Hep-2- als auch in Vero-Zellen wurde eine Untersuchung der Wachstumskinetik von rA2ΔM2-2 im Vergleich mit rA2 durchgeführt. In 6 cm großen Schalen angezogene Zellen wurden mit rA2 oder rA2ΔM2-2 mit einer moi von 0,5 infiziert. Nach einer Stunde Adsorption bei Raumtemperatur wurden die infizierten Zellen dreimal mit PBS gewaschen, das Medium wurde durch 4 ml OPTI-MEM ersetzt und in einem Inkubator bei 35°C mit 5% CO₂ inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion wurde 200 μl Kulturüberstand gesammelt und bei –70°C bis zur Virustitration gelagert. Jedes entnommene Aliquot wurde durch die gleiche Menge an frischem Medium ersetzt. Der Virustiter wurde durch einen Plaqueassay in Vero-Zellen auf 12-Well-Platten unter Verwendung einer Schicht von 1% Methylcellulose und 1 × L15-Medium mit 2% FBS bestimmt. Wie in 17 zu sehen ist, zeigte rA2ΔM2-2 eine sehr langesame Wachstumskinetik und der Peaktiter von rA2ΔM2-2 war in Hep-2-Zellen um etwa 2,5-3 log niedriger als der von rA2. In Vero-Zellen erreichte rA2ΔM2-2 einen Peaktiter, der ähnlich war wie bei rA2. Um die Virusreplikation in unterschiedlichen Wirtszellen zu untersuchen, wurde jede in 6-Well-Platten angezogene Zelllinie mit rA2ΔM2-2 oder rA2 mit einer moi von 0,2 infiziert. Drei Tage nach der Infektion wurden die Kulturüberstände gesammelt und das Virus wurde durch einen Plaqueassay quantifiziert. rA2ΔM2-2 wurde hinsichtlich der Wachstumseigenschaften in verschiedenen Zelllinien untersucht, die von unterschiedlichen Wirten stammten, wobei die Herkunft der Gewebe unterschiedlich war (Tabelle 3). In infizierten Hep-2-, MRC-5- und Hela-Zellen, alle humanen Ursprungs, wurde eine wesentlich verringerte Replikation des rA2ΔM2-2 beobachtet, zwei Größenordnungen geringer als bei rA2. Jedoch war die Replikation von rA2ΔM2-2 in MDBK- und LLC-MK2-Zellen, die von Rinder- bzw.

Resusaffen-Nierenzellen stammen, nur leicht verringert. Tabelle 3. Replikationsniveau von rA2 M2-2 und rA2 in verschiedenen Zelllinien

Zellinien	Wirt	Herkunft des Gewebes	Virustiter [log₁₀(pfu/ml)]
Zellinien	Wirt	Herkunft des Gewebes	rA2	rA2 M2-2
Vero	Affe	Niere	6,1	6,1
Hep-2	Mensch	Larynx	6,2	4,3
MDBK	Rind	Niere	6,1	5,5
MRC-5	Mensch	Lunge	5,5	3,0
Hela	Mensch	Zervix	6,6	4,5
LLC-MK2	Affe	Niere	6,7	6,1

11.1.5. Replikation von rA2ΔM2-2 in Mäusen und Baumwollratten
Die in vivo-Virusreplikation wurde in 12 Wochen alten Balb/c-Mäusen (Simonsen Lab., Gilroy, CA) und in Baumwollratten S. Hispidus (Virion Systems, Rockville, MD) bestimmt, die keine respiratorischen Pathogene aufwiesen. Mause oder Baumwollratten wurden in Gruppen von 6 Tieren intranasal unter einer leichten Methoxyfluorananästhesie mit 10⁶ pfu pro Tier in einem 0,1 ml Inokulum mit rA2 oder rA2ΔM2-2 inokuliert. An Tag 4 nach der Inokulation wurden die Tiere durch Erstickung mit CO₂ getötet und ihre Nasenmuscheln und Lungen wurden getrennt entnommen. Die Gewebe wurden homogenisiert und die Virustiter wurden durch einen Plaqueassay in Vero-Zellen bestimmt. Um die Immunogenität und die Schutzwirkung zu beurteilen, wurden drei Gruppen von Mäusen an Tag 0 intranasal mit rA2, rA2ΔM2-2 oder nur mit Medium inokuliert. Drei Wochen später wurden die Mäuse anästhesiert, es wurden Serumproben entnommen und es wurde eine Inokulation mit einem Erreger mit 10⁶ pfu des biologisch erhaltenen Wildtyp-RSV-Stamms A2 intranasal verabreicht. Vier Tage nach der Herausforderung wurden die Tiere getötet und sowohl Nasenmuscheln als auch Lungen wurden entnommen und der Virustiter wurde durch einen Plaqueassay bestimmt. Die Serumantikörper gegen den RSV A2-Stamm wurden durch einen 60%-Plaquereduktionsassay (Coates, H.V. et al., AM. J. Epid. 84: 299-313 (1965)) und durch Immunfärbung der mit RSV infizierten Zellen bestimmt. Tabelle 4. Replikation von rA2ΔM2-2 und rA2 in Baumwollratten

Virus Virustiter (Mittelwert log₁₀ pfu/g Gewebe_SE)^a

Nasenmuscheln Lunge

rA2 4,0_0,33 5,5_0,12

rA2ΔM2-2 < 1,4 < 1,4

^a Gruppen von sechs Baumwollratten wurden an Tag 0 intranasal mit 10⁶ pfu des angegebenen Virus immunisiert. Es wurde das Ausmaß der infizierten Virusreplikation an Tag 4 durch einen Plaqueassay in den angegebenen Proben bestimmt, und es wurde der Mittelwert log₁₀ Titer_Standardfehler (SE) pro Gramm Gewebe bestimmt.

Um das Ausmaß der Attenuierung und die Immunogenität von rA2ΔM2-2 zu bewerten, wurde die Replikation von rA2ΔM2-2 in den oberen und unteren Atemwegen von Mäusen und Baumwollratten untersucht. Gruppen von 6 Baumwollratten wurden mit 10⁶ pfu rA2ΔM2-2 oder rA2 intranasal inokuliert. Die Tiere wurden 4 Tage nach Inokulation getötet, ihre Nasenmuscheln und Lungengewebe wurden entnommen, homogenisiert und das Ausmaß der Virusreplikation in diesen Geweben wurde durch einen Plaqueassay bestimmt. rA2ΔM2-2 zeigte eine Verringerung der Replikation sowohl in den Nasenmuscheln als auch in den Lungen der infizierten Baumwollratten von mindestens 2 log (siehe Tabelle 4). In Baumwollratten, die mit rA2ΔM2-2 infiziert wurden, wurde keine Virusreplikation nachgewiesen, wohingegen sowohl in den oberen als auch unteren Atemwegen der Baumwollratten ein hohes Ausmaß an Wildtyp rA2-Virusreplikation nachgewiesen wurde. Die Attenuierung von rA2ΔM2-2 wurde auch in Mäusen beobachtet. Der geometrische durchschnittliche Titer der Virusreplikation und der Standardfehler, der von den zwei Experimenten erhalten wurde, wird in Tabelle 5 gezeigt. Eine rA2ΔM2-2-Replikation wurde nur bei einer oder zwei von 12 infizierten Mäusen nachgewiesen. Die Replikation war begrenzt, bei einer Verdünnung von 10^–1 der Gewebehomogenste wurden nur wenige Plaques beobachtet. Trotz der eingeschränkten Replikation in Mäusen induzierte rA2ΔM2-2 eine signifikante Resistenz gegenüber einer Herausforderung mit Wildtyp-A2-RSV (Tabelle 5). Wenn Mäuse, die zuvor mit rA2ΔM2-2 oder rA2 inokuliert wurden, intranasal mit einer Dosis von 10⁶ pfu Wildtyp-A2-Stamm inokuliert wurden, war in den oberen und unteren Atemwegen der Mäuse keine Wildtyp A2-Virusreplikation nachzuweisen. Somit war rA2ΔM2-2 gegen eine Herausforderung mit Wildtyp-A2-Virus völlig protektiv.

Ebenso wurde die Immunogenität von rA2ΔM2-2 untersucht. Zwei Gruppen von Mäusen wurden mit rA2ΔM2-2 oder rA2 infiziert, und drei Wochen später wurden Serumproben gesammelt. Der Serumneutralisationstiter wurde durch einen 50%-Plaquereduktionstiter bestimmt. Der Neutralisationstiter bei den mit rA2ΔM2-2 infizierten Mäusen war vergleichbar mit dem Neutralisationstiter bei rA2, beide besaßen bei einer 1:16 Verdünnung einen 60%-Plaquereduktionstiter. Das von den mit rA2ΔM2-2 infizierten Mäusen erhaltene Serum konnte auch RSV-Plaques immunfärben, was bestätigt, dass in den mit rA2ΔM2-2 infizierten Mäusen RSV-spezifische Antikörper gebildet wurden. Tabelle 5. Replikation von rA2ΔM2-2 und rA2 in Mäusen und Schutz gegen eine Herausforderung mit Wildtyp-RSV A2

Immunisierung	Virusreplikation^a			RSV A2-Replikation nach Herausforderung^b
Virus	(Mittelwert log₁₀ pfu/g Gewebe_SE)			(Mittelwert log₁₀ pfu/g Gewebe_SE)
	Nasenmuscheln	Lunge	Nasenmuscheln	Lunge
rA2	3,72_0,33	4,0_0,13	< 1,4	< 1,4
rA2ΔM2-2	< 1,4	< 1,4	< 1,4	< 1,4
Kontrolle	< 1,4	< 1,4	3,53_0,17	4,10_0,13

^a Gruppen von 12 Balb/c-Mäusen wurden an Tag 0 intranasal mit 10⁶ pfu des angegebenen Virus immunisiert. Das Ausmaß an infiziertem Virus in den angegebenen Geweben wurde durch einen Plaqueassay an Tag 4 bestimmt, und es wurde der Mittelwert log₁₀ Titer_Standardfehler (SE) pro Gramm Gewebe bestimmt.
^b Gruppen von 6 Balb/c-Mäusen wurden an Tag 21 intranasal mit 10⁶ pfu RSV A2 verabreicht, und 4 Tage später getötet. Die Replikation von Wildtyp-RSV A2 in den angegebenen Geweben wurde durch einen Plaqueassay bestimmt, und es wurde der Mittelwert log₁₀ Titer_Standardfehler (SE) pro Gramm Gewebe bestimmt.

Die zwei Antigen-Subtypen A und B des RSV zeigen bezüglich des M2-2-Proteins ein hohes Maß an Konservierung, was auf eine funktionelle Bedeutung des M2-2-Proteins hinweist. Eine Transkriptionsanalyse von rA2 und rA2ΔM2-2 ergab im Rahmen des vorliegenden Beispiels wichtige Befunde. Obwohl die Transkriptionsniveaus der Gesamt-mRNA für beide Viren im Wesentlichen gleich waren, ergab eine Northern Blotting-Analyse bei rA2ΔM2-2 im Vergleich mit Widltyp-rA2 eine dramatische Verringerung der Virusgenom- und Antigenom-RNA. Dieser Befund steht im Gegensatz zu dem, was bezüglich der negativen Transkriptionsregulation des M2-2-Proteins in einem Minigenomsystem berichtet wurde. Es scheint somit, dass die funktionale Rolle von M2-2 im Lebenszyklus des Virus komplizierter ist als zuvor gedacht. Nichtsdestotrotz schien die Verringerung der Menge von Genom und Antigenom des rA2ΔM2-2 die Virusausbeuten in infizierten Vero-Zellen nicht zu beeinflussen.
Der Befund, dass rA2ΔM2-2 in unterschiedlichen Zelllinien eine hinsichtlich des Wirtsspektrums beschränkte Replikation aufwies, gab einen guten Hinweis darauf, dass eine Deletion eines nicht essenziellen Gens ein gutes Mittel ist, um eine Mutante für ein bestimmtes Wirtsspektrum zu erzeugen, was für Impfstämme ein sehr wichtiges Merkmal sein kann. rA2ΔM2-2 replizierte in mehreren Zelllinien humanen Ursprungs nicht gut, aus diesen Zelllinien wurde eine geringere Virusausbeute erzeugt. Jedoch war das Ausmaß der Proteinsynthese in Hep-2-Zellen ähnlich wie in Vero-Zellen, die große Mengen des rA2ΔM2-2 erzeugten. Dies zeigt, dass der Mangel bezüglich der Virusfreisetzung wahrscheinlich wegen einem Defekt in einem späteren Stadium auftrat, wahrscheinlich während des Viruszusammenbaus.
Der Befund, dass das Virus ohne M2-2 in Vero-Zellen gut wächst und in den oberen und unteren Atemwegen von Mäusen und Baumwollratten eine Attenuierung aufweist, stellt neue Vorteile für eine Impfstoffentwicklung dar. Die in den Atemwegen von Nagern verringerte Replikation beeinflusste die Immunogenität und den Schutz gegen eine Herausforderung mit einer Wildtyp-Virusreplikation nicht, was zeigt, dass das Virus ohne M2-2 als guter Impfstoff für eine Verwendung beim Menschen dienen kann. Die Natur der M2-2-Deletionsmutation, welche eine Deletion von 234 Nukleotiden betrifft, stellt eine Art der Mutation dar, die gegenüber einer Reversion höchst unempfindlich ist.
11.5. Erzeugung eines humanen respiratorischen Syncytialvirus (RSV) Impfstoffkandidaten durch Deletion der viralen M2-2 und SH-Gene
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines rekombinanten RSV, in dem die Expression der zwei RSV-Gene M2-2 und SH durch Entnahme der Polynukleotidsequenzen, welche die M2-2- und SH-Gene codieren, und ihre codierten Proteine entfernt wurde. Wie zuvor beschrieben wurde, ist das M2-2- oder SH-Gen für die RSV-Replikation in vitro entbehrlich. Es ist möglich, dass die Deletion von zwei akzessorischen Genen ein rekombinantes RSV mit einem anderen attenuierten Phänotyp erzeugt. Das Ausmaß der Attenuierung durch die Deletion von zwei Genen kann erhöht oder verringert sein.
Das SH- und das M2-2-Gen wurde aus dem Volllängen-RSV-cDNA-Konstrukt durch cDNA-Klonierung deletiert. Ein Fragment von Sac I bis BamH I, das die M2-2-Deletion in dem pET(S/B)-Subklon enthielt, wie zuvor beschrieben, wurde durch Verdau mit den Restriktionsenzymen Sac I und BamH I entfernt und wurde in den Volllängen-Antigenom-RSV-cDNA-Klon kloniert, der die SH-Gendeletion enthielt (pA2ΔSH). Das resultierende Plasmid, das die Deletion von SH und M2-2 enthielt, wurde als pA2ΔSHΔM2-2 bezeichnet. Die Deletion von SH und M2-2 im Plasmid pA2ΔSHΔM2-2 wurde durch Restriktionsenzym-Mapping bestätigt.
Die Erzeugung einer rA2ΔSHΔM2-2-Mutante wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben wurde (siehe Abschnitt 7). Das rekombinante RSV, das die Deletion des SH- und des M2-2-Gens enthielt (rA2ΔSHΔM2-2), wurde aus mit MVA infizierten Zellen gewonnen, die mit pAΔSHΔM2-2 zusammen mit drei Plasmiden, die das N-, P- bzw. L-Protein exprimierten, cotranfiziert wurden. Die Gewinnung einer infektiösen RSV-Deletionsmutante wurde durch Syncytien-Bildung angezeigt und durch Immunfärbung mit einem Antikörper gegen RSV bestätigt.
Die Deletion der SH- und M2-2-Gene im rA2ΔSHΔM2-2 wurde durch RT/PCR unter Verwendung von zwei Sätzen von Primern bestätigt, die das SH-Gen bzw. das M2-2-Gen flankieren. Die mRNA-Expression aus Zellen, die mit rA2ΔSHΔM2-2 oder rA2 infiziert wurden, wurde wie zuvor beschrieben durch Northern Blotting-Hybridisierungsanalysen untersucht. Sowohl die SH- als auch die M2-2-mRNA wurde in den Zellen, die mit rA2ΔSHΔM2-2 infiziert wurden, unter Verwendung einer Probe, die für das SH-Gen oder das M2-2-Gen spezifisch war, nicht nachgewiesen.
Die Tatsache, dass zwei RSV-Gene (SH und M2-2) aus dem RSV deletiert werden können, zeigt dass das SH- und das M2-2-Protein für die RSV-Replikation entbehrlich sind. Im Gegensatz zu rA2ΔSHΔM2-2, das in Hep-2-Zellen sehr kleine Plaques bildete, wies rA2ΔSHΔM2-2 eine größere Plaquegröße als rA2ΔM2-2 auf (19).
In Vero-Zellen wurde eine Untersuchung der Wachstumskinetik von rA2ΔSHΔM2-2 im Vergleich mit rA2 durchgeführt. Die in 6 cm großen Schalen angezogenen Zellen wurden mit rA2 oder rA2ΔSHΔM2-2 mit einer moi von 0,2 infiziert. Wie in 22 zu sehen ist, zeigte rA2ΔSHΔM2-2 eine langsamere Wachstumskinetik und der Peaktiter war um etwa 1,5 log niedriger als der Peaktiter von rA2. Dies zeigte, dass rA2ΔSHΔM2-2 in Gewebekultur attenuiert ist.
Um das Ausmaß der Attenuierung von rA2ΔSHΔM2-2 zu bewerten, wurde die Replikation von rA2ΔSHΔM2-2 in den unteren Atemwegen von Mäusen untersucht.
Gruppen von 6 Mäusen wurden mit 10⁶ pfu rA2ΔSHΔM2-2 oder rA2 intranasal inokuliert. Die Tiere wurden 4 Tage nach der Inokulation getötet, ihre Nasenmuscheln und Lungengewebe wurden entnommen, homogenisiert und das Ausmaß der Virusreplikation in diesen Geweben wurde durch einen Plaqueassay bestimmt. rA2ΔSHΔM2-2 zeigte in den Lungen der infizierten Mäuse eine um etwa 2 log verringerte Replikation (Tabelle 11). Diese Daten zeigen, dass rA2ΔSHΔM2-2 in Mäusen attenuiert ist, obwohl das Ausmaß der Attenuierung nicht so signifikant ist wie bei rA2ΔM2-2. Tabelle 11. Replikation von rA2ΔSHΔM2-2 und rA2 in Mäusen

Virus Virustiter in der Lunge (Mittelwert log₁₀ pfu/g Gewebe_SE)

rA2 4,2_0,08

rA2ΔSHΔM2-2 2,4_1,2

^a Gruppen von sechs Mäusen wurden an Tag 0 intranasal mit 10⁶ pfu des angegebenen Virus immunisiert. Das Ausmaß der infizierten Virusreplikation an Tag 4 wurde durch einen Plaqueassay auf den angegebenen Geweben bestimmt und es wurde der Mittelwert log₁₀ Titer_Standardfehler (SE) pro Gramm Gewebe bestimmt.

11.6. Erzeugung eines humanen respiratorischen Syncytialvirus (RSV)- Impfstoffkandidaten durch Deletion der viralen M2-2- und NS1-Gene
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines rekombinanten RSV, in dem die Expression der beiden anderen RSV-Gene NS1 und M2-2 durch Entnahme der Polynukleotidsequenzen, die das NS1- und M2-2-Gen codieren, und ihre codierten Proteine entfernt wurde. Wie zuvor beschrieben, ist das NS1- und das M2-2-Gen alleine für die RSV-Replikation in vitro entbehrlich. Dieses Beispiel bietet ein anderes Verfahren zur Attenuierung durch Deletion von zwei akzessorischen Genen aus dem RSV.
Das NS1- und das M2-2-Gen wurde durch cDNA-Klonierung aus dem Volllängen-RSV-DNA-Konstrukt entfernt. Ein Fragment von Xma I bis Avr II, das die NS1-Deletion im pET(X/A)-Subklon enthielt, wurde durch einen Verdau mit den Restriktionsenzymen Xma I und Avr II entfernt und in den Volllängen-RSV-Antigenom-cDNA-Klon kloniert, der die M2-2-Gendeletion enthielt (pA2ΔM2-2). Das resultierende Plasmid, das sowohl die Deletion von NS1 als auch von M2-2 enthielt, wurde pA2ΔNS1ΔM2-2 bezeichnet. Die Deletion von NS1 und M2-2 im Plasmid pA2ΔNS1ΔM2-2 wurde durch Restriktionsenzym-Mapping bestätigt.
Die Erzeugung einer rA2ΔNS1ΔM2-2-Mutante wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (siehe Abschnitt 11.2). Ein rekombinantes RSV mit der Deletion der beiden Gene NS1 und M2-2 wurde aus mit MVA infizierten Zellen gewonnen, die mit pA2ΔNS1ΔM2-2 zusammen mit drei Plasmiden, die das N-, P- bzw. 1-Protein codieren, cotransfiziert worden waren. Die Gewinnung eines infektiösem RSV wurde durch Syncytien-Bildung angezeigt und durch Immunfärbung mit einem Antikörper gegen RSV bestätigt. Die Identifizierung des gewonnenen rA2ΔNS1ΔM2-2 wurde durch RT/PCR unter Verwendung eines Primerpaars, das das NS1-Gen und das M2-2-Gen flankiert, bestätigt.
Die Replikation von rA2ΔNS1ΔM2-2 in Gewebekultur in Zelllinien und in kleinen Tiermodellen wird untersucht. Vorläufige in vitro-Daten zeigten, dass rA2ΔNS1ΔM2-2 in Gewebekulturzellen stark attenuiert ist, und dass rekombinantes RSV mit der Deletion des NS1- und des M2-2-Gene stärker attenuiert ist als rA2ΔSHΔM2-2.
11.7. Erzeugung eines humanen respiratorischen Syncytialvirus (RSV)- Impfstoffkandidaten durch Deletion der viralen NS2- und M2-2-Gene
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines rekombinanten RSV, in dem die Expression der beiden anderen RSV-Gene NS2 und M2-2 durch Entnahme der Polynukleotidsequenzen, die das NS2- und das M2-2-Gen codieren, und ihrer codierten Proteine entfernt wurde. Wie zuvor beschrieben, ist das NS2- oder das M2-2-Gen für die RSV-Replikation in vitro entbehrlich. Es ist möglich, dass die Deletion von zwei akzessorischen Genen des RSV ein rekombinantes RSV mit einem anders attenuierten Phänotyp erzeugt.
Das NS2- und das M2-2-Gen wurde aus dem Volllängen-RSV-cDNA-Konstrukt durch cDNA-Klonierung deletiert. Ein Fragment von Xma I bis Avr II, das die NS2-Deletion im pET(X/A)-Subklon enthielt, wurde durch einen Verdau mit den Restriktionsenzymen Xma I und Avr II entfernt und in den Volllängen-RSV-Antigenom-cDNA-Klon kloniert, der die M2-2-Gendeletion enthielt (pA2ΔM2-2). Das resultierende Plasmid, das sowohl die Deletion von NS2 als auch von M2-2 enthielt, wurde pA2ΔNS2ΔM2-2 bezeichnet. Die Deletion von NS2 und M2-2 im Plasmid pA2ΔNS2ΔM2-2 wurde durch Restriktionsenzym-Mapping bestätigt.
Die Erzeugung einer rA2ΔNS2ΔM2-2-Mutante wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (siehe Abschnitt 7). Rekombinantes RSV, das die Deletion der NS2- und M2-2-Gene enthielt (rA2ΔNS2ΔM2-2) wurde aus mit MVA infizierten Zellen gewonnen, die mit pA2ΔNS2ΔM2-2 zusammen mit drei Plasmiden, die das N-, P- bzw. 1-Protein exprimierten, cotransfiziert wurden. Die Gewinnung von infektiösem RSV wurde durch Syncytien-Bildung angezeigt und durch Immunfärbung mit einem Antikörper gegen RSV bestätigt. Die Identifizierung des gewonnenen rA2ΔNS2ΔM2-2 wurde durch RT/PCR unter Verwendung von zwei Primerpaaren, die das NS2- bzw. M2-2-Gen flankieren, bestätigt.
Die mRNA-Expression von Zellen, die mit rA2ΔNS2ΔM2-2 oder rA2 infiziert wurden, wurde durch Northern Blotting-Hybridisierungsanalysen untersucht. Wie in 23 gezeigt wird, wurde unter Verwendung einer Sonde, die spezifisch für das NS2-Gen oder das M2-2-Gen war, in den Zellen, die mit rA2ΔNS2ΔM2-2 infiziert wurden, weder NS2- noch M2-2-mRNA nachgewiesen. Ein vergleichbares Expressionslevel der NS1- und SH-mRNA wurde in den Zellen beobachtet, die mit rA2ΔNS2ΔM2-2 infiziert wurden. Northern Blotting-Daten bestätigten, dass die Expression sowohl von NS2 als auch von M2-2 in rA2ΔNS2ΔM2-2 entfernt wurde.
In Vero-Zellen wurde eine Untersuchung der Wachstumskinetik von rA2ΔNS2ΔM2-2 im Vergleich mit rA2 durchgeführt. Die in 6 cm großen Schalen angezogenen Zellen wurden mit rA2 oder rA2ΔNS2ΔM2-2 mit einer moi von 0,2 infiziert. Wie in 24 zu sehen ist, zeigte rA2ΔNS2ΔM2-2 eine sehr langsame Wachstumskinetik und der Peaktiter war etwa 10-fach geringer als der von rA2. Um die Virusreplikation in verschiedenen Wirtszellen zu analysieren, wurde jede in 6-Well-Platten angezogene Zelllinie mit rA2ΔNS2ΔM2-2 oder rA2 mit einer moi von 0,2 infiziert. Drei Tage nach der Infektion wurden die Kulturüberstände gesammelt und das Virus wurde durch einen Plaqueassay quantifiziert. rA2ΔNS2ΔM2-2 wies im Vergleich mit rA2 in Vero-Zellen eine mehrfache Verringerung des Virustiters auf. Aber in Hep-2, MDBK-, Hela-, MRC5- und LLC-MK2-Zellen wurde eine Verringerung des Virustiters um etwa 2-3 log beobachtet (Tabelle 12). Deshalb weist die Replikation von rA2ΔNS2ΔM2-2 einen wesentlichen Effekt des Wirtsspektrums auf, was ein Zeichen für eine Attenuierung ist. Tabelle 12. Wachstumsvergleich von rA2ΔNS2/M2-2 und rA2 in verschiedenen Zelllinien

Virustiter [log₁₀ pfu/ml]

Zellinien rA2 rA2ΔNS2/M2-2

Vero 6,4 5,7

Hep-2 6,7 3,5

MDBK 6,7 3,7

MRC-5 5,9 2,0

Hela 6,5 2,9

LLC-MK2 6,7 4,8
Die in vivo-Replikation von rA2ΔNS2ΔM2-2 wurde in 4 Wochen alten Baumwollratten bestimmt, die kein respiratorisches Pathogen aufwiesen. Gruppen von 5 Baumwollratten wurden intranasal unter einer leichten Methoxyfluorananästhesie mit 10⁵ pfu pro Tier in einem 0,1 ml Inokulum mit rA2 oder rA2ΔNS2ΔM2-2 inokuliert. An Tag 4 nach der Inokulation wurden die Tiere durch CO₂-Erstickung getötet und ihre Nasenmuscheln und Lungen wurden einzeln entnommen. Die Gewebe wurden homogenisiert und die Virustiter wurden durch einen Plaqueassay in Vero-Zellen bestimmt. Wie in Tabelle 13 gezeigt wird, wurde in den oberen und unteren Atemwegen der Baumwollratten, die mit rA2ΔNS2ΔM2-2 infiziert wurden, keine Virusreplikation nachgewiesen. Dies zeigte, dass die Deletion des NS2- und des M2-2-Gens das RSV schwerwiegend attenuierte. Somit könnte dieses rekombinante RSV mit der NS2- und M2-2-Deletion als guter Impfstoffkandidat für die Verwendung beim Menschen dienen. Tabelle 13. Replikation von rA2ΔNS2/M2-2 und rA2 in Baumwollratten

Virus Virustiter (Mittelwert log₁₀ pfu/g Gewebe_SE)^a

Nasenmuscheln Lunge

rA2 2,30_0,26 4,23_0,10

rA2ΔM2-2 < 1,4 < 1,4

^a Gruppen von fünf Baumwollratten wurden an Tag 0 intranasal mit 10⁵ pfu des angegebenen Virus immunisiert. Das Ausmaß der infizierten Virusreplikation an Tag 4 wurde durch einen Plaqueassay auf den angegebenen Proben bestimmt, und es wurde der Mittelwert log₁₀ Titer_Standardfehler (SE) pro Gramm Gewebe bestimmt.

Insgesamt wurden 11 unterschiedliche Gendeletionsmutanten (nicht alle in Übereinstimmung mit der Erfindung) erhalten, wie in Tabelle 17 zusammengefasst wird. Vier akzessorische RSV-Gene sind entweder einzeln oder in Kombination deletiert worden. Diese verschiedenen Deletionsmutanten zeigen eine unterschiedliche Plaquebildung und unterschiedliche Wachstumseigenschaften. Es wurde eine gute Übereinstimmung zwischen der Plaquegröße in vitro und der Attenuierung in vivo gezeigt. Diese verschiedenen RSV-Deletionsmutanten stellen eine breite Auswahl für eine Verwendung als mögliche RSV- Impfstoffkandidaten zur Verfügung. Tabelle 17. Zusammenfassung der RSV-Gendeletionsmutanten

Virus Zurückgewonnen

ΔM2-2 Ja

ΔSH Ja

ΔNS1 Ja

ΔNS2 Ja

ΔM2-2ΔSH Ja

ΔM2-2ΔNS1 ND^a

ΔM2-2ΔNS2 Ja

ΔNS1ΔNS2 Ja

ΔSHΔNS1 Ja

ΔSHΔNS2 Ja

ΔSHΔNS1ΔNS2 Ja

^aND Nicht bestimmt. Die Replikation von ΔM2-2ΔNS1 wurde in Gewebekultur nicht nachgewiesen.

13. Beispiel: Das chimäre respiratorische Syncytialvirus (RSV) des Subtyps A mit den Glykoproteinen des Subtyps B und das RSV ohne M2-2-Gen sind in Grünen Meerkatzen attenuiert
13.1. Einleitung
In dieser Untersuchung wurde rA2ΔM2-2 hinsichtlich seiner Attenuierung, Immunogenität und Schutzwirkung gegen eine nachfolgende Herausforderung mit Wildtyp-RSV in Afrikanischen Grünen Meerkatzen bewertet. Die Replikation von rA2ΔM2-2 war sowohl in den oberen als auch unteren Atemwegen der infizierten Meerkatzen mehr als 1000fach eingeschränkt und induzierte Serumtiter eines neutralisierenden Anti-RSV-Antikörper, die etwas niedriger waren als die Titer, die durch Wildtyp-rA2 induziert wurden. Wenn mit rA2ΔM2-2 infizierte Meerkatzen mit dem Wildtyp-A2-Virus herausgefordert wurden, war die Replikation des herausfordernden Virus in den oberen Atemwegen ungefähr 100-fach und in den unteren Atemwegen ungefähr 45 000-fach verringert. Um das rA-G_BF_B weiter zu attenuieren, wurde der offene Leserahmen M2-2 aus dem rA-G_BF_B entfernt. Wie in Hinblick auf rA2ΔM2-2 beschrieben wurde, war rA-G_BF_BΔM2-2 auf ein Wachstum in Hep-2-Zellen begrenzt und war in Baumwollratten attenuiert. rA2 und rA-G_BF_B, die eine Deletion des M2-2-Gens aufweisen, könnten eine bivalente RSV-Impfstoff zusammensetzung für einen Schutz gegen mehrere Stämme der zwei RSV-Subtypen darstellen.
Afrikanische Grüne Meerkatzen (AGM, „African Green Monkey") wurden als nicht humanes Primatenmodell zur Bewertung der Attenuierung, Immunogenität und Schutzwirkung von RSV- Impfstoffkandidaten bewertet. Wir zeigten, dass das rA2 sowohl in den oberen als auch unteren Atemwegen von Grünen Meerkatzen mit hohen Titern replizierten, wohingehen rA2ΔM2-2 und rA-G_BF_B in den Atemwegen der Meerkatzen kaum replizierten. Sowohl rA2ΔM2-2 als auch rA-G_BF_B induzierten neutralisierende Antikörper, welche die Tiere vor einer experimentellen Herausforderung schützten.
13.2. Material und Methoden
Zellen und Viren
Monolayerkulturen von Hep-2- und Vero-Zellen (erhalten von der American Type Culture Collection, ATCC) wurden in MEM („Minimal Essential Medium") mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) gehalten. Die Wildtyp-RSV-Stämme A2 und B9320 wurden von der ATCC erhalten und in Vero-Zellen angezogen. Das modifizierte Vacciniavirus Ankara (MVA-T7), das die Bakteriophagen T7-RNA-Polymerase exprimiert, wurde in CEK-Zellen angezogen.
Konstruktion eines chimären cDNA-Klons
Das Wildtyp-RSV B9320 wurde in Vero-Zellen angezogen und die virale RNA wurde aus dem Kulturüberstand der infizierten Zellen extrahiert. Ein cDNA-Fragment mit den G- und F-Genen des RSV B9320 wurde durch RT/PCR unter Verwendung der folgenden Primer ATCAGGATCCACAATAACATTGGGGCAAATGCAACC und CTGGCATTCGGATCCGTTTTATGTAACTATGAGTTG erhalten (die für die Klonierung gestalteten BamH 1-Stellen sind kursiv und die 69320-spezfiischen Sequenzen sind unterstrichen). Die Restriktionsenzymstellen für BamH I wurden stromaufwärts der Genstart-Sequenz von G und stromabwärts der Genend-Sequenz von F eingebaut. Das PCR-Produkt wurde zuerst in den T/A-Klonierungsvektor (Invitrogen) eingefügt und die Sequenzen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Das BamH I-Restriktionsfragment mit der G- und F-Genkassette von B9320 wurde dann durch die eingefügten BgI II-Stellen bei Nukleotid 4655 (stromaufwärts des Genstartsignals von G) und bei bei Nukleotid 7552 (stromabwärts des Genendsignals von F) in einen RSV-cDNA-Subklon pRSV(R/H) übertragen, der die RSV-Sequenzen von Nukleotid 3426 bis Nukleotid 9721 enthielt. Das Einfügen dieser zwei BgI II-Stellen wurde durch eine PCR-Mutagenese unter Verwendung des Quickchange Mutagenese-Kits (Stratagene, La Jolla, CA) durchgeführt. Die Restriktionsenzyme BamH I und BgI II besitzen kompatible Enden, eine Ligation zerstört jedoch beide Restriktionsstellen. Das Restriktionsfragment von Xho I (Nukleotid 4477) bis BamH I (Nukleotid 8498) mit dem G- und F-Gen von B9320 wurde dann in den infektiösen RSV-Antigenom-cDNA-Klon pRSVC4G (Jin et al., 1998) befördert. Die chimäre Antigenom-cDNA wurde mit pRSV-G_BF_B bezeichnet. Um das M2-2-Gen aus pRSV-G_BF_B zu entfernen, wurde das Fragment von Msc I (Nukleotid 7692) bis BamH I (Nukleotid 8498) aus rA2ΔM2-2 mit der M2-2-Deletion (Jin et al., 2000a) in pRSV-G_BF_B eingefügt. Der chimäre cDNA-Klon ohne M2-2-Gen wurde pRSV-G_BF_BΔM2-2 genannt.
Gewinnung von rekombinantem RSV
Die Gewinnung von rekombinantem RSV aus cDNA wird hierin beschrieben. Kurz gesagt, Hep-2-Zellenin 6-Well-Platten mit einer Konfluenz von 80% wurden mit MVA mit einer moi von 5 pfu/Zellen für 1 Stunde infiziert und dann wurden Volllängen-Antigenom-Plasmide (pRSV-G_BF_B oder pRSV-G_BF_BΔM2-2) zusammen mit Plasmiden, welche die RSV-Proteine N, P und L exprimieren, unter Verwendung des LipofecTACE-Reagenz (Life Technologies, Gaithersburg, MD) transfiziert. Nach einer Inkubation der transfizierten Zellen bei 35°C für 3 Tage wurden die Kulturüberstände für 6 Tage in Vero-Zellen passagiert, um das gewonnene Virus zu amplifizieren. Die gewonnenen rekombinanten Viren wurden durch drei aufeinanderfolgende Plaquereinigungen biologisch kloniert und weiter in Vero-Zellen amplifiziert. Das aus den mit pRSV-G_BF_B transfizierten Zellen gewonnene Virus wurde rA-G_BF_B bezeichnet und das aus den mit pRSV-G_BF_BΔM2-2 transfizierten Zellen wurde mit rA-G_BF_BΔM2-2 bezeichnet. Der Virustiter wurde durch einen Plaqueassay bestimmt und die Plaques wurden durch Immunfärbung unter Verwendung eines polyklonalen Anti-RSV A2-Serums (Biogenesis, Sandown, NH) sichtbar gemacht.
Charakterisierung des Virus
Die Expression der viralen RNA von jedem gewonnenen chimären RSV wurde durch Northern Blotting analysiert. Aus den mit Virus infizierten Zellen wurde 48 Stunden nach der Infektion die gesamte zelluläre RNA extrahiert. Der RNA-Blot wurde mit einer mit γ³²P-ATP-markierten Oligonukleotidsonde, die für das F-Gen von B9320 spezifisch ist (GAGGTGAGGTACAATGCATTAATAGCAAGATGGAGGAAGA), oder mit einer γ-³²P-ATP-markierten Sonde, die für das F-Gen von A2 spezifisch ist (CAGAAGCAAAACAAAATGTGACTGCAGTGAGGATTGTGGT), hybridisiert. Um die G-mRNA der chimären Viren nachzuweisen, wurden die RNA-Blots mit einer 190 Nukleotide langen Ribosonde, die für das G-Gen von B9320 spezifisch ist, oder einer 130 Nukleotide langen Ribosonde, die für das G-Gen von A2 spezifisch ist, hybridisiert. Beide Ribosonden wurden mit α-³²P-CTP markiert. Die Hybridisierung wurde bei 65°C in Express Hyb-Lösung (Clontech, Palo Alto, CA) über Nacht durchgeführt. Die Membranen wurden bei 65°C unter stringenten Bedingungen gewaschen und gegenüber einem Film exponiert.
Spezifische virale Proteine aus den infizierten Zellen wurden durch Immunpräzipitation der Extrakte der infizierten Zellen oder durch Western Blotting analysiert. Um die viralen Proteine einer Immunpräzipitation zu unterziehen, wurden Vero-Zellen mit Virus mit einer moi von 1,0 infiziert und von 14 Stunden bis 18 Stunden nach der Infektion mit einem ³⁵S-Promix (100 μCi/ml ³⁵S-Cys und ³⁵S-Met, Amersham, Arlington Heigths, IL) markiert. Die markierten Zellmonolayer wurden mit RIPA-Puffer lysiert und die Polypeptide wurden durch ein polyklonales Ziege-Anti-RSV A2-Serum (Biogenesis, Sandown, NH) oder durch einen polyklonalen Antikörper gegen das M2-2-Protein immunpräzipitiert. Die immunpräzipitierten Polypeptide wurden auf einem SDS-PAGE einer Elektrophorese unterzogen und durch Autoradiographie nachgewiesen. Für die Western Blotting-Analyse wurden die mit Virus infizierten Vero-Zellen in Proteinlysepuffer lysiert und die Proteine wurden auf einem 12%igen SDS-PAGE aufgetrennt. Die Proteine wurden auf eine Nylonmembran übertragen und es wurde ein Immunblotting durchgeführt, wie hierin beschrieben, unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen das G-Protein von B9320 oder eines monoklonalen Antikörpers gegen das G-Protein von A2 (Sorch und Park, 1987, J. Med. Virol. 22: 345-356).
Das Wachstum des chimären RSV in vitro wurde mit dem Wachstum der Wildtyp-Rekombinante A2 (rA2) und von rA2ΔM2-2 verglichen. Eine Analyse des Wachstumszyklus wurde sowohl in Hep-2-Zellen als auch in Vero-Zellen durch geführt. Die in 6 cm großen Schalen angezogenen Zellen wurden mit jedem Virus mit einer moi von 0,01 oder 0,1 infiziert. Nach 1 Stunde Adsorption bei Raumtemperatur wurden die infizierten Zellmonolayer dreimal mit PBS gewaschen und mit 4 ml Opti-MEM bei 35°C in einem Inkubator mit 5% CO₂ inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion wurden 200 μl des Kulturüberstands gesammelt und bei –70°C für die Virustitration gelagert. Jedes entfernte Aliquot wurde durch eine gleiche Menge frisches Medium ersetzt. Der Virustiter wurde durch einen Plaqueassay in Vero-Zellen auf 12 Well-Platten unter Verwendung einer Schicht von 1% Methylcellulose und 1 × L15-Medium mit 2% FBS bestimmt.
Virusreplikation in Baumwollratten
Die Virusreplikation in vivo wurde in Baumwollratten S. Hispidus bestimmt, die keine respiratorischen Pathogene aufwiesen. Gruppen von 12 Baumwollratten wurden intranasal unter einer leichten Methoxyfluorananästhesie mit 10^5,5 pfu Virus pro Tier in einem 0,1 ml Inokulum inokuliert. An Tag 4 nach der Inokulation wurden sechs Tiere durch eine CO₂-Erstickung getötet und ihre Nasenmuscheln und Lungen wurden getrennt entnommen. Die Gewebe wurden homogenisiert und die Virustiter wurden durch einen Plaqueassay in Vero-Zellen bestimmt. Drei Wochen später wurden die verbleibenden 6 Tiere anästhesiert, ihre Serumproben wurden gesammelt und es wurde intranasal als Herausforderung eine Inokulation von 106 pfu des biologisch erhaltenen Wildtyp-RSV-Stamms A2 oder B9320 verabreicht. Vier Tage nach der Herausforderung wurden die Tiere getötet und es wurden sowohl die Nasenmuscheln als auch die Lungen entnommen, homogenisiert und der Virustiter durch einen Plaqueassay bestimmt. Die neutralisierenden Serumantikörper gegen den RSV-Stamm A2 oder B9320 wurden durch einen 50%-Plaquereduktionsassay bestimmt (Coates et al., 1966, Am. J. Epidemiol. 83(2): 299-313).
Virusreplikation in Afrikanischen Grünen Meerkatzen („African green monkey")
Der rekombinante RSV wurde im Hinblick auf die Replikation, Immunogenität und Schutzwirkung in Afrikanischen Grünen Meerkatzen (Cercopithecus aethiops) bewertet. Die Meerkatzen mit einem durchschnittlichen Alter von 4,2 Jahren und einem Körpergewicht im Bereich von 2,2 bis 4,3 kg, die von St. Kitts erhalten wurden, wurden in der ersten Untersuchung (Untersuchung A) verwendet, um die Replikation von rA2 mit Wildtyp-A2 zu vergleichen. In der zweiten Untersuchung (Untersuchung B) wurden Afrikanische Grüne Meerkatzen mit einem Alter im Bereich von 5,3 bis 8,4 Jahren und einem durchschnittlichen Körpergewicht von 4,15 kg verwendet. Keine der Meerkatzen besaß nachweisbare neutralisierende Serumantikörper gegen RSV B9320 oder A2 (Titer < 1:10). Gruppen von 4 Meerkatzen wurden entweder mit Wildtyp-A2, rA2, rA2ΔM2-2, Wildtyp 9320 oder rA-G_BF_B sowohl durch den intranasalen als auch intratrachealen Weg mit einer Dosis von 10^5,5 pfu in einem 1,0 ml Inokulum an jeder Stelle inokuliert. Nach der Inokulation wurden täglich für 12 Tage von jeder Meerkatze unter einer Telazol-Anästhesie Nasopharyngeal (NP)-Tupfer gesammelt, und an den Tagen 3, 5, 7 und 10 nach der Infektion wurde eine Trachealspülung (BAL) gesammelt (Kakuk et al., 1993, J. Infect. Dis. 167(3): 553-561). An Tag 28 nach der Infektion wurden von jeder infizierten Meerkatze Serumproben gesammelt, und die Meerkatzen wurden entweder mit Wildtyp-A2 oder B9320 sowohl an den intranasalen als auch intratrachealen Stellen mit einer Dosis von 10^5,5 pfu in einem 1,0 ml Inokulum herausgefordert. Die Replikation des herausfordernden Virus in den oberen und unteren Atemwegen der Meerkatzen wurde durch Quantifizierung des Virus bestimmt, der in die Proben der NP und der Trachealspülung abgegeben wurde. Die NP-Proben wurden täglich für 10 Tage und die BAL-Proben wurden an den Tagen 3, 5, 7 und 10 nach der Herausforderung gesammelt. Vierzehn Tage nach der Herausforderung mit dem Wildtypvirus wurden Serumproben für die Messung der neutralisierenden RSV-Antikörper durch den 50%-Plaquereduktionsassay unter Verwendung von Wildtyp-A2 oder B9320-Viren gesammelt. Die in die NP- und BAL-Proben abgegebenen Viren wurden durch einen Plaqueassay unter Verwendung von Vero-Zellen quantifiziert.
13.3. Ergebnisse
Konstruktion von cDNA und Gewinnung eines chimären RSV A/B-Virus
Zuvor stellten wir eine infektiöse Antigenom-cDNA her, die den Wildtyp-RSV-Stamm A2 codiert und das Derivat davon, das eine Deletion des M2-2-Gens trägt. Hier werden diese cDNAs durch Ersetzen des G- und des F-Gens des A2-Stamms mit denjenigen von B9320 modifiziert, um chimäre Viren zu erzeugen, welche die Antigene des RSV-Subtyps B exprimieren. Die Genstart- und Genend-Sequenzen sind zwischen den zwei RSV-Subtypen hochkonserviert. Deshalb umfassen die vollständigen G- und das F-Gene von B9320 ihre eigenen Genstart- und Genend- Signale und wurden in das A2-cDNA-Gerüst übertragen (26). Die für das G- und F-Gen von B9320 codierende cDNA wurde durch RT/PCR erhalten und durch Sequenzanalyse bestätigt. Die konstruierte chimäre cDNA wurde mit pRSVA-G_BF_B bezeichnet. pRSVA-G_BF_BΔM2-2 wurde durch Deletion des M2-2-Gens aus pRSVA-G_BF_B konstruiert. Das M2-Gen mit der Deletion des offenen Leserahmens M2-2 von rA2ΔM2-2 wurde durch die einzigen Msc I- und BamH I-Restriktionsenzymstellen in pRSVA-G_BF_B eingefügt. Beide chimären Viren (rA-G_BF_B und rA-G_BF_BΔM2-2) wurden aus cDNA unter Verwendung des zuvor beschriebenen Gewinnungssystems erhalten. Die gewonnenen rekombinanten Viren wurden plaquegereinigt und in Vero-Zellen amplifiziert.
Charakterisierung der rekombinanten chimären Viren in vitro
Die Expression der Subtyp-spezifischen Proteine durch die chimären Viren wurde durch Northern Blotting und Western Blotting analysiert. Unter Verwendung von Stamm-spezifischen Sonden wurden B9320-spezifische G- und F-mRNAs in den Zellen nachgewiesen, die mit rA-G_BF_B und rA-G_BF_BΔM2-2 infiziert wurden ( 27A). Das M2-2-Gen wurde in den mit rA-G_BF_BΔM2-2 infizierten Zellen nicht nachgewiesen, was bestätigt, dass das M2-2-Gen aus diesem chimären Virus deletiert war. Die Expression der für den Stamm B9320 spezifischen Proteine der zwei chimären Viren wurde auch mit der Expression von rA, rA2ΔM2-2 und Wildtyp B9320 verglichen (27B). Das F1-Protein von rA-G_BF_B und rA-G_BF_BΔM2-2 zeigte die gleiche Rate der Migrationsmobilität wie B9320, beide wanderten schneller als das F1-Protein von A2. Eine Western Blotting-Analyse unter Verwendung von Stamm-spezifischen monoklonalen Antikörpern bestätigte, dass das G-Protein des Subtyps B durch rA-B_BF_B und rA-G_BF_BΔM2-2 exprimiert wurde (27B). Ein Western Blotting unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers, der für das M2-2-Protein spezifisch war, bestätigte weiter die Entfernung des M2-2-Gens in rAΔM2-2 und rA-G_BF_BΔM2-2.
Die Replikation der chimären Viren rA-G_BF_B und rA-G_BF_BΔM2-2 wurde sowohl in Hep-2- als auch in Vero-Zellen mit der Replikation von rA2 und rA2ΔM2-2 verglichen (28). In Vero-Zellen, die mit einer moi von 0,1 infiziert waren, erreichten sowohl rA-G_BF_B als auch rA-G_BF_BΔM2-2 ähnliche Peaktiter wie die Titer, die beim Wildtyp-rA2 bzw. rA2ΔM2-2 zu sehen waren. Bei einer niedrigeren moi von 0,01 war der Peaktiter von rA-G_BF_B im Vergleich mit rA2 leicht verringert, das Ausmaß der Replikation von rA-G_BF_BΔM2-2 war im Vergleich mit rA-G_BF_B etwa 10-fach niedriger. In Hep-2- zeigte rA-G_BF_B Zellen bei einer moi von 0,1 im Vergleich mit Wildtyp-A2 einen etwas geringeren Peaktiter, wohingegen die Replikation von rA-G_BF_BΔM2-2 etwa 100-fach niedriger war. Bei einer moi von 0,01 war der Peaktiter von rA-G_BF_B im Vergleich mit rA2 etwa 10-fach niedriger und der Peaktiter von rA-G_BF_BΔM2-2 war 100-fach niedriger. Deshalb zeigte rA-G_BF_BΔM2-2 auch in Hep-2-Zellen eine beschränkte Replikation, ähnlich wie bei rA2ΔM2-2 beobachtet wurde, wohingegen die Replikation in Vero-Zellen weniger beeinträchtigt war.
Replikation von chimärem RSV in Baumwollratten
Baumwollratten sind sowohl für eine Infektion des Subtyps A als auch des Subtyps B des RSV anfällig. Es wurden die Replikationsniveaus von rA-G_BF_B und rA-G_BF_BΔM2-2 in den Nasenmuscheln und Lungen von Baumwollratten mit rA2, rA2ΔM2-2 und Wildtyp-B9320 verglichen (Tabelle 21). Die Replikation von rA-G_BF_B war in den Nasenmuscheln unterhalb der Nachweisgrenze durch einen Plaqueassay, die Replikation im Lungengewebe war im Vergleich mit dem Wildtyp B9320 um etwa 3,6 log₁₀ und im Vergleich mit rA2 um etwa 2,0 log₁₀ verringert. Die Replikation von rA2ΔM2-2 wurde in den Nasenmuscheln nicht nachgewiesen und war in der Lunge im Vergleich mit rA2 um 1,6 log niedriger. Die Entferung von M2-2 aus rA-G_BF_B attenuierte das chimäre Virus weiter. Weder in den Nasenmuscheln noch in den Lungen von Baumwollratten, die mit rA-G_BF_BΔM2-2 infiziert wurden, wurde eine Virusreplikation nachgewiesen.
Obwohl rA-G_BF_B und rA-G_BF_BΔM2-2 in Baumwollratten attenuiert waren, induzierten beide chimären Viren eine Immunität gegenüber RSV, die ausreichte, um die Tiere vor einer Herausforderung zu schützen (Tabelle 21). Der Serumspiegel der neutralisierendem Anti-RSV-Antikörper, der durch rA-G_BF_B induziert wurde, war bezogen auf den durch den Wildtyp B9320 induzierten Serumspiegel 2,85-fach niedriger. Die durch rA-G_BF_BΔM2-2 im Serum induzierten neutralisierenden Anti-RSV-Antikörper waren im Vergleich mit den durch B9320 induzierten Antikörpern ungefähr 4 mal niedriger und 1,5 mal niedriger als die durch rA-G_BF_B induzierten Antikörper. Der Serumspiegel der neutralisierenden Anti-RSV-Antikörper, die durch rA2ΔM2-2 induziert wurden, war im Vergleich mit rA2 ebenso ungefähr 2-fach niedriger.
Replikation von Wildtyp-RSV und rA2ΔM2-2 in Afrikanischen Grünen Meerkatzen (AGM)
Um die RSV-Attenuierung und Immunogenität bei Primaten zu untersuchen, wurde die Replikation von rekombinantem RSV weiter in Afrikanischen Grünen Meerkatzen untersucht. In der Untersuchung A wurde die Replikation von rekombinantem A2 und Wildtyp-A2-Virus in den Atemwegen von Grünen Meerkatzen untersucht. Meerkatzen, die bezüglich RSV Serum-negativ waren, wurden mit 5,5 log₁₀ pfu rA2 oder Wildtyp-A2 intranasal und intratracheal infiziert und die Virusabgabe wurde sowohl in den oberen als auch unteren Atemwegen über einen Zeitraum von 12 Tagen überwacht. Wie in Tabelle 22 gezeigt wird, replizierte rA2 sowohl in den oberen als auch unteren Atemwegen der Meerkatzen gut. rA2 erreichte einen Peaktiter von 4,18 bzw. 4,28 log₁₀ pfu/ml an jeder Stelle, und das Virus wurde über den gleichen Zeitraum abgegeben wie das Wildtyp-A2-Virus (Tabelle 22, Untersuchung A), obwohl der Peaktiter von rA2 in den Atemwegen der Meerkatzen etwas geringer war als derjenige, der bei Wildtyp-A2-Virus erhalten wurde. Nachdem das hohe Replikationsniveau von rA2 in Meerkatzen bestätigt war, wurde rA2ΔM2-2 im Hinblick auf seine Attenuierung, Immunogenität und Schutzwirkung in Meerkatzen bewertet. In einer separaten Untersuchung (Untersuchung B, Tabelle 22) zeigte rA2ΔM2-2 im Vergleich mit rA2 sowohl im Nasen-Rachen-Raum als auch in der Luftröhre ein stark verringertes Replikationsniveau. Der Peaktiter im Nasen-Rachen-Raum wies eine Verringerung von 3,1 log₁₀ auf, während der Peaktiter in der Luftröhre um 3,25 log₁₀ verringert war. Trotz des viel geringeren Replikationsniveaus in den Atemwegen induzierte rA2ΔM2-2 eine wesentliche Menge an neutralisierenden Anti-RSV-Antikörpern im Serum. Der durch rA2ΔM2-2 induzierte Antikörpertiter war 3 Wochen nach der Infektion etwa 4-fach niedriger als der durch rA2 induzierte Titer (Tabelle 23). Wenn eine Herausforderung mit einem Wildtyp-A2-Virus durchgeführt wurde, bot rA2ΔM2-2 in den oberen Atemwegen einen teilweisen Schutz, und in den unteren Atemwegen von immunisierten Meerkatzen einen nahezu vollständigen Schutz gegen die Wildtyp-RSV-Replikation. Die mit rA2 inokulierten Meerkatzen waren sowohl in den oberen als auch unteren Atemwegen vollständig geschützt (Tabelle 23). Obwohl rA2ΔM2-2 in den Atemwegen von immunisierten Meerkatzen keinen vollständigen Schutz bot, verringerte er die Virusabgabe um 5 Tage. Zwei Wochen nach der Herausforderung näherte sich der Serumspiegel der neutralisierenden Anti-RSV-Antikörper der mit rA2ΔM2-2 infizierten Meerkatzen dem durch rA2 induzierten Spiegel an.
Replikation von chimärem rA-G_BF_B und Wildtyp B9320 in Afrikanischen Grünen Meerkatzen (AGM)
Das Replikationsniveau des chimären rA-G_BF_B wurde mit dem Replikationsniveau des Wildtyps B9320 verglichen. Meerkatzen, die bezüglich RSV Serumnegativ waren, wurden durch eine intranasale und intratracheale Tropfinfusion mit 5,5 log₁₀ pfu rA-G_BF_B oder B9320 inokuliert. Die Proben des Rachenabstrichs und der Trachealspülung wurden über 12 Tage für die Quantifizierung des Virus gesammelt. B9320 replizierte mit einem Ausmaß, das ähnlich war wie das Ausmaß des Wildtyp A2-Virus (Tabelle 22). Der Peaktiter von rA-G_BF_B war in den Atemwegen der infizierten Meerkatzen im Vergleich mit dem Peaktiter von B9320 etwa 1000-fach verringert. Die mit rA-G_BF_B infizierten Tiere gaben Virus für einen kürzeren Zeitraum ab als diejenigen, die mit B9320 infiziert wurden. Trotz der wesentlich attenuierten Replikation stellte rA-G_BF_B bei einer Herausforderung mit Wildtyp B9320 einen vollständigen Schutz bereit. Weder in den oberen noch den unteren Atemwegen der Meerkatzen, die zuvor mit rA-G_BF_B immunisiert worden waren, wurde ein herausfordernder bzw. Wildtyp-Virus nachgewiesen. (Tabelle 23). In Übereinstimmung mit dem Ausmaß des Schutzes, der in den mit rA-G_BF_B immunisierten Meerkatzen zu sehen war, war der Serumspiegel der neutralisierenden Anti-RSV-Antikörper bei diesen Meerkatzen im Vergleich mit dem bei den mit Wildtyp B9320 infizierten Tieren beobachteten Serumspiegel nur geringfügig verringert (ungefähr 2-fach). Der Serumspiegel der neutralisierenden Anti-RSV-Antikörper, induziert durch rA-G_BF_B, wurde durch nachfolgende Infektionen mit Wildtyp-RSV erhöht.
13.4. Diskussion
Um die Impfstoffentwicklung für den RSV-Subtyp B voranzutreiben, wurde ein rekombinanter A2-Virus als Vektor verwendet, um die RSV-Oberflächenantigene des Subtyps B zu exprimieren. Das chimäre Virus sollte eine ausgewogene Immunreaktion auslösen und einen Schutz gegen eine Infektion mit einem RSV des Subtyps B bereitstellen. Als ein Ansatz zur Exprimierung von Antigenen des RSV-Subtyps B konstruierten wir unterschiedliche chimäre Viren, in welchen die G- und F-Gene des A2-Stamms vollständig durch die G- und F-Gene des B9320-Stamms ersetzt waren. Das chimäre RSV wurde dann weiter attenuiert unter Verwendung einer Strategie, die zur Attenuierung des A2-Virus entwickelt wurde.
Das gewonnene chimäre RSV (rA-G_BF_B) replizierte in Vero-Zellen effizient, jedoch war das Wachstum in Hep-2-Zellen im Vergleich mit rA2 5- bis 10-fach verringert. rA-G_BF_B war sowohl in den oberen als auch unteren Atemwegen von Baumwollratten attenuiert. Um zu bestimmen, ob die Attenuierung von rA-G_BF_B wirtsspezifisch war, wurde dieses chimäre Virus weiter in Afrikanischen Grünen Meerkatzen bewertet, die genetisch enger mit dem Menschen verwandt sind als Nager. Eine RSV-Infektion in Meerkatzen ist weniger gut charakterisiert und der beschriebene Peaktiter liegt in einem breiten Bereich (Crowe et al., 1996, J. Infect. Dis. 173: 829-839); (Kakuk et al., 1993, J. Infect.Dis. 167: 553-561). Deswegen wurde die RSV-Infektion bei den Meerkatzen zuerst unter Verwendung von Wildtypviren untersucht. Es wurde gezeigt, dass Subtyp A und Subtyp B des RSV in Afrikanischen Grünen Meerkatzen beide gleich gut replizieren und dass die Virustiter, die von den oberen und unteren Atemwegen der Meerkatzen erhalten wurden, vergleichbar sind mit Virustitern, die bei infizierten Schimpansen beobachtet wurden (Crowe et al., 1994, Vaccine 12: 783-790). Wenn rA-G_BF_B in Meerkatzen bewertet wurde, zeigte es eine durchschnittliche Verringerung des Peaktiters von 3,0 log₁₀ in den oberen Atemwegen und eine Verringerung von 2,59 log₁₀ in den unteren Atemwegen.
Das Ausmaß der Attenuierung von rA-G_BF_B in Meerkatzen stimmte mit den in Baumwollratten beobachteten Ausmaßen überein. Jedoch unterscheidet sich dieses Ergebnis etwas von dem Ergebnis, das bezüglich eines kürzlich beschriebenen chimären RSV berichtet wurde, in welchem die G- und F-Gene von A2 durch die Gene des RSV B1-Stamms ersetzt wurden (rAB1, Whitehead et al., 1999, J. Virol. 73: 9773-80). Obwohl rAB1 und rA-G_BF_B in Baumwollratten ähnlich attenuiert sind, war rAB1 in Schimpansen nicht attenuiert. Im Gegensatz zu rA-G_BF_B replizierte rAB1 sowohl in den oberen als auch unteren Atemwegen von Schimpansen besser als Wildtyp-RSV B1 (Whitehead et al., 1999, J. Virol. 73: 9773-80). Ein Teil dieser Diskrepanz kann durch die Halbtoleranz von Schimpansen gegenüber einer RSV-Infektion mit Wildtyp des Subtyps B erklärt werden. Es besteht aber die Möglichkeit, dass rA-G_BF_B aufgrund der Unterschiede in den Oberflächenantigenen des Subtyp B-Stamms oder durch Konstellationseffekte, wenn diese Antigene in einen A2-Hintergrund eingefügt werden, stärker attenuiert ist als rAB1. Deshalb scheint die Chimärisierung von eng verwandten unterschiedlichen heterologen Proteinen unterschiedliche Phänotypen ergeben zu können. Über mehrere Paramyxoviren ist berichtet worden, dass die Chimärisierung von Oberflächenantigenen ein attenuiertes Virus ergibt. Ein chimäres Masernvirus, worin die HN- und F-Proteine durch das G-Protein des VSV ersetzt wurden, war bezüglich der Replikation in vitro höchst eingeschränkt (Spielhofer et al., 1998, J. Virol. 72: 2150-2159). Ein chimäres Rinderpest-Virus, worin die F- und H-Proteine durch die heterologen Oberflächenproteine eines nahe verwandten Virus („pestedes-petits-ruminants") ersetzt wurden, war in vitro attenuiert, was durch langsames Viruswachstum und eine geringe Virusausbeute gezeigt wurde (Das et al., 2000, J. Virol. 74: 9030-9047). Erst kürzlich wurde berichtet, dass das chimäre Virus PIV3-PIV2, worin die F- und HN-Gene von PIV3 durch diejenigen von PIV2 ersetzt wurden, in vitro nicht attenuiert war, jedoch in Hamstern, Afrikanischen Grünen Meerkatzen und Schimpansen schwerwiegend attenuiert war (Tao et al., 2000, J. Virol. 74: 6448-6458). Andererseits war das chimäre PIV3-PIV1 in vivo nicht attenuiert (Tao et al., 1998, J. Virol. 72: 2955-2961; Tao et al., 1999, Vaccine 17: 1100-1108). rA-G_BF_B induzierte wesentliche Mengen von neutralisierendem Anti-RSV-Antikörper und stellte einen vollständigen Schutz gegen eine nachfolgende Herausforderung mit Wildtyp-RSV Subtyp B bereit, obwohl es in Meerkatzen attenuiert war.
In dieser Untersuchung wurde rA2ΔM2-2 bei Meerkatzen hinsichtlich der Attenuierung, Immunogenität und dem Schutz gegenüber einer Herausforderung mit Wildtyp-RSV bewertet. Es wurde gezeigt, dass rA2ΔM2-2 in den Atemwegen von Afrikanischen Grünen Meerkatzen attenuiert ist und nach einer Herausforderung eine starke Verringerung der Replikation des Wildtyp-RSV bei den Tieren zu beobachten war, die zuvor mit rA2ΔM2-2 infiziert worden waren. Das Ausmaß der Replikation und des Schutzes, das mit rA2ΔM2-2 bei Meerkatzen beobachtet wurde, ist sehr ähnlich wie das Ausmaß, über das in einer Untersuchung mit Schimpansen bezüglich eines ähnlichen rekombinanten RSV berichtet wurde, bei welchem die M2-2-Proteinexpression stillgelegt wurde (Bermingham und Collins, 1999, pNAS USA 96:11259-1126; Ten et al., 2000, J. Virol. 74: 9317-9321). Es kann sich herausstellen, dass rA2ΔM2-2 beim Menschen stärker attenuiert ist als der zuvor untersuchte Impfstoffkandidat cpts248/404 (Teng et al., 2000, J. Virol. 74: 9317-9321). Cpts248/404 war bei naiven Kleinkindern weder ausreichend attenuiert noch genetisch stabil (Crowe et al., 1994, Vaccine 12: 783-790; Wright et al., 2000, J. Infect. Dis. 182: 1331-1342). Der Serumtiter der neutralisierenden Anti-RSV-Antikörper, die durch rA2ΔM2-2 induziert wurden, war etwas geringer als der Titer, welcher durch die Wildtyp-RSV-Infektion induziert wurde. Jedoch deutet die Erhöhung des Titers der neutralisierenden Antikörper nach der Herausforderung darauf hin, dass die Immunogenität von rA2ΔM2-2 durch wiederholte Verabreichungen verstärkt werden kann.
Da rA2ΔM2-2 viele der für einen lebend-attenuierten Impfstoff wünschenswerten Merkmale aufweist, wurde die Deletion des M2-2-Gens als ein geeigneter Weg betrachtet, den chimären rA-G_BF_B weiter zu attenuieren. Eine in vitro-Untersuchung zeigte, dass rA-G_BF_BΔM2-2 ein ähnliches Ausmaß der Attenuierung besaß wie rA2ΔM2-2, wobei eine erhöhte Syncytien-Bildung, ein verringertes Wachstum in Hep-2-Zellen und ein unausgeglichenes Verhältnis von RNA-Transkription zu Replikation zu sehen war. Da das chimäre rA-G_BF_B-Virus sowohl in Baumwollratten als auch Meerkatzen attenuiert ist, wird erwartet, dass rA-G_BF_BΔM2-2 stärker attenuiert ist als rA2ΔM2-2. Jedoch zeigten die Untersuchungen mit Baumwollratten, dass rA-G_BF_BΔM2-2 noch immer in der Lage war, einen Serumspiegel von neutralisierendem RSV-Antikörper zu induzieren, welcher sich dem annähert, der durch rA-G_BF_B induziert wird, und gegenüber einer nachfolgenden experimentellen Herausforderung einen vollständigen Schutz bereitstellte. Deshalb kann rA-G_BF_BΔM2-2 einen geeigneten Impfstoffkandidaten zum Schutz gegen eine RSV-Infektion des Subtyps B darstellen.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf den Umfang der speziellen beschriebenen Ausführungsformen beschränkt, welche nur als Illustration von einzelnen Erfindungsaspekten dienen sollen, und alle Konstrukte, Viren oder Enzyme, die funktionell äquivalent sind, liegen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung. In der Tat werden für einen Fachmann anhand der vorangehenden Beschreibung und der begleitenden Zeichnungen neben den hierin gezeigten und beschriebenen Modifikationen zahlreiche weitere Modifikationen der Erfindung offensichtlich. Solche Modifikationen sollen in den Bereich der angefügten Ansprüche fallen.
Sequenzprotokoll

Claims

Isolierter infektiöser RSV ("Respiratory Syncytial Virus")- Partikel, der einen attenuierten Phänotyp aufweist, umfassend ein RSV-Antigenom oder -Genom, wobei das Genom oder Antigenom Folgendes aufweist: (a) eine heterologe Sequenz, die für G- und F- Protein von dem RSV-Stamm B9320 codieren; und (b) eine Deletion des offenen Leserahmens M2-2.
Der isolierte infektiöse RSV-Partikel entsprechend Anspruch 1, wobei die heterologen G- und F- Gene die G- und F- Gene des Wirts-Virusgenoms ersetzen.
Der isolierte infektiöse RSV-Partikel nach Anspruch 1, wobei die heterologe Sequenz von einem anderen RSV-Stamm abgeleitet ist.
Isolierte cDNA, die für einen infektiösen RSV-Partikel codiert, der einen attenuierten Phänotyp aufweist, umfassend ein RSV-Antigenom oder -Genom, wobei das Genom oder Antigenom folgendes aufweist: (a) eine heterologe Sequenz, die für G- und F-Proteine von dem Stamm B9320 codieren; und (b) eine Deletion des offenen Leserahmens M2-2.
Die isolierte cDNA, die für einen RSV-Partikel codiert, nach Anspruch 4, wobei die heterologen G- und F-Gene die G- und F-Gene des Wirts-Virusgenoms ersetzen.
Ein Impfstoff bzw. Vakzin umfassend (a) den isolierten infektiösen RSV nach einem der Ansprüche 1 bis 3; und (b) einen pharmazeutischen annehmbaren Trägerstoff.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend (a) den isolierten infektiösen RSV nach einem der Ansprüche 1-3; und (b) einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff.