PT981537E - ''clone infeccioso para o vírus parainfluenza humano de tipo 3'' - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"CLONE INFECCIOSO PARA O VÍRUS PARAINFLUENZA HUMANO DE TIPO 3"

Este trabalho foi apoiado em parte por National Institutes of Health Projecto N° 32027 do Institute of Allergy and Infectious Diseases. O governo pode ter alguns direitos neste invento.

ANTECEDENTES DO INVENTO

Reconhecido em 1956 como uma causa de infecção respiratória no homem, crê-se que os vírus parainfluenza (HPIV) contribuam para 4 a 22 porcento das doenças respiratórias nas crianças, seguindo-se apenas ao vírus sincicial respiratório neste aspecto. Os HPIV são uma importante causa das doenças do tracto respiratório inferior tais como pneumonia e bronquiolite e são a causa mais comum de garrotilho em crianças pequenas. Dos quatro serotipos de HPIV, 1-4, o vírus de tipo 3 (HPIV-3), parece ser o mais virulento, causando frequentemente bronquiolite e pneumonia durante o primeiro mês de vida.

Infelizmente, não estão presentemente disponíveis vacinas eficazes nem terapias antivirais, que possam ser utilizadas para prevenir ou tratar infecções induzidas por HPIV. -2- ΡΕ981537

Os métodos padrão que são utilizados para produzir vírus inactivos, tais como inactivação térmica ou tratamento químico do vírus, não tiveram sucesso com todas as estirpes e serotipos de HPIV, incluindo HPIV-3. Para além disso, os métodos padrão para a produção de vírus atenuados produzem mutações em locais aleatórios e não permitem modificar o genoma de HPIV em locais específicos nem controlar o número de mutações que são introduzidas no genoma.

Os vírus parainfluenza humanos são vírus de ARN de sentido negativo, de cadeia simples e envelopados que são membros do género dos paramixovírus dentro da família Paramyxoviridae. A replicação do genoma virai (ARNv) de parainfluenza humano é semelhante à de outros membros da família Paramyxoviridae. Após a infecção de uma célula, a transcrição é o principal acontecimento sintético de ARN, resultando na produção dos ARNms virais a partir do genoma de sentido negativo, i.e., o ARNv. Mais tarde na infecção ocorre uma transição na replicação do ARN, resultando na síntese de um ARN inteiro de sentido positivo, antigenómico que serve como molde para a síntese de ARN genómico adicional de sentido negativo. A transcrição e replicação do ARN genómico estão dependentes da formação de um complexo de ribonucleoproteínas (RNP) consistindo no ARN genómico de 15462 nucleótidos encapsidado pela proteína da nucleocápside (NP) e pela fosfoproteína intimamente associada (P) e pela proteína polimerase grande (L). Vários factores da célula hospedeira estão também envolvidos no -3- ΡΕ981537 ciclo replicativo dos HPIV. 0 requisito de um RNP intacto para HPIV impediu a análise de transcrição e replicação de HPIV num sistema livre de células. Os esforços para encapsidar o ARNv de HPIV-3 in vitro falharam, e ao contrário dos virus de ARN de sentido positivo, o ARNv nu de HPIV nu não é infeccioso. Para além disso, não existem actualmente sistemas conhecidos para a preparação de HPIV recombinante, incluindo HPIV-3 infeccioso recombinante.

Concordantemente, existe a necessidade de novos reagentes, sistemas e métodos que permitam produzir um HPIV recombinante, particularmente um HPIV-3 recombinante infeccioso. São desejáveis sistemas recombinantes que permitam introduzir uma ou mais mutações especificas do local no genoma de HPIV, particularmente HPIV-3. Sistemas recombinantes que permitam caracterizar o efeito de mutações especificas do local na transcrição ou replicação de ARN virai de parainfluenza humano e identificar as mutações especificas do local que conduzem à produção de HPIV atenuado são especialmente preferidos.

SUMÁRIO DO INVENTO

De acordo com o presente invento é proporcionado um sistema para a criação de um virus parainfluenza humano de tipo 3 (HPIV-3) recombinante infeccioso. Numa concretização, o sistema compreende um clone compreendendo -4- ΡΕ981537 uma sequência nucleotídica que codifica um antigenoma de HPIV-3 inteiro de sentido positivo e pelo menos um clone de suporte compreendendo uma sequência nucleotídica que codifica a proteína P de HPIV e a proteína L de HPIV. Noutra concretização, o sistema compreende ainda um clone de suporte que compreende uma sequência nucleotídica que codifica a proteína NP de HPIV. De preferência, cada um dos clones no sistema compreende um promotor de ARN-polimerase que está operativamente ligado à respectiva sequência nucleotídica de HPIV contida dentro do clone. 0 presente invento proporciona também um clone que compreende uma sequência nucleotídica codificando o antigenoma de HPIV-3 inteiro de sentido positivo. 0 clone compreende também um promotor de ARN-polimerase operativamente ligado à sequência codificando o antigenoma de HPIV-3. Numa concretização preferida, o clone compreende ainda uma sequência nucleotídica que codifica uma ribozima imediatamente a jusante da sequência codificando o antigenoma de HPIV-3. 0 presente invento refere-se também a um método de preparação do vírus HPIV-3 recombinante possuindo mutações específicas do local no genoma de HPIV-3. 0 método compreende a preparação de um clone compreendendo uma sequência codificando o antigenoma de HPIV-3 modificado; a introdução do clone de HPIV modificado e dos clones de suporte que compreendem sequências nucleotídicas codificando uma proteína P de HPIV-3, uma proteína L de -5- ΡΕ981537 HPIV-3 e, de preferência, uma proteína NP de HPIV-3 em células hospedeiras; e a cultura das células hospedeiras sob condições que permitam a síntese do antigenoma de HPIV-3 modificado e das proteínas L, P e NP de HPIV-3. A capacidade para produzir vírus HPIV-3 recombinantes geneticamente modificados para conterem mutações específicas do local dentro dos genes de HPIV-3 e elementos de acção em eis acelera o estudo de todos os aspectos do ciclo de replicação do vírus. Adicionalmente, um sistema que permita a produção de HPIV recombinante que seja geneticamente modificado para conter mutações específicas do local dentro do genoma de HPIV-3 é útil para a identificação de genótipos de parainfluenza atenuantes e para o desenvolvimento de uma vacina viva para o vírus parainfluenza humano.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 representa a forma de ADN da sequência nucleotídica do genoma de HPIV-3 e mostra a localização dos locais de restrição, da sequência líder, da sequência "trailer" e das regiões de codificação de proteínas do genoma. A Figura 2 é um mapa de restrição do vector pOCUS-2". A Figura 3 é um mapa de restrição de pMG( + ) -6- ΡΕ981537 mostrando a localização da sequência lider, da região de codificação da luciferase e do promotor e terminador T7. A Figura 4 é um mapa de restrição de pHPIV-3 mostrando a localização da sequência lider e das regiões de codificação de proteínas de HPIV-3. A Figura 5 é uma representação esquemática do clone inteiro infeccioso, pHPIV-3: \Λ/Φ, sinal stop da polimerase do vírus vacínia (TTTTTNT); T7, promotor da ARN-polimerase T7; le, sequência líder de HPIV-3; NP, P, M, F, HN e L são as regiões de codificação de proteínas de HPIV-3; tr, sequência "trailer" de HPIV-3; Rz, ribozima antigenómica do vírus delta da hepatite; Τ7Φ, sinal terminador da ARN-polimerase T7. As regiões contendo mutações de substituição estão expandidas e são mostradas acima com as alterações específicas indicadas. A mudança de A para G na base virai 94 cria um local Saci e a mudança de A para G na base virai 15389 cria um local Stul.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

De acordo com o presente invento é proporcionado um sistema para criação de HPIV-3 recombinante. 0 sistema compreende um clone compreendendo uma sequência nucleotídica, de preferência uma sequência de ADN de cadeia dupla, que codifica um antigenoma inteiro de HPIV de sentido positivo daqui em diante referido como o "clone de HPIV" e um ou mais clones de suporte que compreendem -7- ΡΕ981537 sequências nucleotídicas que codificam uma proteína P de HPIV e uma proteína L de HPIV. As sequências nucleotídicas que codificam a proteína P de HPIV e a proteína L de HPIV podem estar dentro do mesmo clone. No entanto, para facilidade de manipulação, é preferível que as sequências nucleotídicas que codificam a proteína P de HPIV e a proteína L de HPIV estejam em clone separados. De preferência, o clone de HPIV compreende uma sequência codificando um antigenoma de HPIV-3. De preferência, o clone ou clones de suporte codificam uma proteína P e uma proteína L de HPIV-3. Noutra concretização o sistema compreende ainda um clone de suporte que compreende uma sequência nucleotídica que codifica a proteína NP de HPIV, de preferência a proteína NP de HPIV-3.

Tal como aqui se utiliza, "clone" refere-se a ADN de cadeia dupla que pode ser introduzido numa célula e expresso. 0 clone pode estar na forma de um vector virai tal como, por exemplo, um vector virai de vacínia ou, de preferência, na forma de um plasmídeo. De preferência, o clone de HPIV e os clones de suporte compreendem, cada um, um promotor de ARN-polimerase, de maior preferência um promotor da ARN-polimerase T7. Cada um dos promotores de ARN-polimerase está operativamente ligado à sequência de codificação de HPIV correspondente no clone. Assim, o promotor da ARN-polimerase no clone de HPIV está operativamente ligado à sequência de HPIV e a ARN-polimerase nos clones de suporte está operativamente ligada à sequência ou sequências codificando a respectiva proteína -8- ΡΕ981537 de HPIV. De preferência, os plasmídeos compreendendo o clone compreendem também uma origem de replicação, particularmente uma origem de replicação bacteriana. 0 presente invento proporciona também um clone que compreende uma sequência nucleotidica codificando a sequência antigenómica de HPIV-3, daqui em diante referida como "clone de HPIV-3". De preferência, o clone de HPIV-3 codifica uma sequência antigenómica inteira de HPIV-3. Tal como aqui se utiliza, "inteira" significa que a sequência antigenómica é complementar a toda a sequência genómica de sentido negativo de HPIV-3 que se estende do nucleótido 3' da sequência líder até ao nucleótido 5' da sequência "trailer" do genoma de HPIV-3. A forma do ADN da sequência genómica inteira de HPIV-3, SEQ ID NO: 1, é mostrada na Fig. 1. Para além das sequências líder e "trailer", o clone de HPIV-3 contém sequências codificando as proteínas de HPIV-3 N, P, M, F, HN, e L, bem como os elementos de acção em eis. O clone de HPIV-3 pode codificar uma sequência do antigenoma de HPIV-3 de tipo selvagem ou um antigenoma de HPIV-3 modificado possuindo uma ou mais mutações aí contidas. A mutação pode estar na forma de um gene estranho que está inserido na sequência codificando o antigenoma de HPIV-3. De preferência, as mutações são substituições de um ou mais nucleótidos, deleções de 6 a 12 nucleótidos ou adições de 6 a 12 nucleótidos na sequência codificado o antigenoma de HPIV-3. De maior preferência, o clone de HPIV-3 modificado contém substituições nos genes ou nos elementos de acção em cis ou em ambos da sequência -9- ΡΕ981537 codificando o antigenoma de HPIV-3.

De preferência, o clone de HPIV-3 é um plasmídeo que compreende uma sequência nucleotidica que codifica uma ribozima, de maior preferência a ribozima antigenómica do vírus delta da hepatite, imediatamente a jusante da sequência de codificação do antigenoma de HPIV. Após transcrição do clone, a ribozima cliva a ribozima do antigenoma de HPIV para proporcionar uma extremidade 3' competente para replicação no antigenoma. De maior preferência, o clone de HPIV-3 compreende também um terminador de ARN-polimerase a seguir à sequência da ribozima. Numa concretização, o clone de HPIV-3 é o plasmideo pHPIV-3 representado na Fig. 5, que foi depositado na American Type Culture Collection, 12301

Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA, a _ de Maio de 1998 e tem o Número de Acesso PTA-722. O presente invento refere-se também a um método de preparação de HPIV recombinante, particularmente HPIV-3, utilizando o sistema acima descrito. O método compreende a introdução de um clone de HPIV e dos clones de suporte que codificam a proteína P de HPIV e a proteína L de HPIV, em células hospedeiras, de preferência células humanas; a cultura das células hospedeiras sob condições que permitam a formação de um transcrito antigenómico de HPIV, síntese do genoma de HPIV (ARNv) e das proteínas L, P e NP de HPIV e formação de um HPIV recombinante; e a recuperação do HPIV recombinante a partir da cultura. De preferência, as -10- ΡΕ981537 células hospedeiras que são transfectadas com o clone de HPIV e os clones de suporte, contêm uma ARN-polimerase que corresponde ao promotor da ARN-polimerase que está operativamente ligado às sequências de HPIV no clone de HPIV e nos clones de suporte. Numa concretização preferida, é também introduzido nas células um clone de suporte compreendendo a sequência nucleotidica que codifica a proteína NP de HPIV operativamente ligada a um promotor de ARN-polimerase. De preferência, as células hospedeiras são infectadas com um recombinante virai, de preferência um recombinante de vírus vacínia, que expresse a ARN-polimerase, de preferência a ARN-polimerase T7, antes ou em combinação com a transfecção com o clone de HPIV e o clone ou clones de suporte. Quando tais células são infectadas com o recombinante do vírus vacínia, é preferível que o clone de HPIV-3 compreenda também um terminador da ARN-polimerase do vírus vacínia a montante da ARN-polimerase T7 e um terminador da ARN-polimerase do vírus vacínia a jusante do terminador da ARN-polimerase T7. O presente invento refere-se também a um método de introdução de mutações específicas do local no genoma de um HPIV-3 recombinante. O método compreende a preparação de um clone de HPIV-3 modificado compreendendo uma ou mais mutações na sequência que codifica o antigenoma de HPIV-3; a introdução do clone de HPIV-3 modificado e dos clones de suporte compreendendo sequências que codificam a proteína P de HPIV-3 e a proteína L de HPIV-3 e, de preferência, a proteína NP de HPIV-3 em células hospedeiras; e a cultura - li ΡΕ981537 das células hospedeiras sob condições que permitam a formação de um transcrito antigenómico de HPIV-3 modificado e a síntese das proteínas L, P e NP de HPIV-3. 0 clone de HPIV-3 modificado e os clones de suporte contêm um promotor de ARN-polimerase que está operativamente ligado às sequências de codificação de proteínas de HPIV-3. As células hospedeiras contêm no seu citoplasma uma ARN-polimerase que corresponde ao promotor de ARN-polimerase no clone de HPIV-3 modificado e nos clones de suporte.

De preferência, o clone de HPIV-3 modificado, contendo nele uma ou mais mutações, é produzido através de técnicas convencionais de PCR utilizando um clone de HPIV-3 como molde. As mutações são feitas nos elementos de acçâo em cis da sequência de HPIV-3 ou numa sequência codificando uma proteína de HPIV-3. De preferência, a mutação é feita na sequência codificando a proteína L. Se forem feitas mutações nas sequências codificando proteínas de HPIV-3 do clone de HPIV-3, é preferível que seja feito um tipo semelhante de mutação no mesmo local na sequência de codificação da proteína do clone de suporte correspondente. Por exemplo, se for feita uma mutação num local específico da sequência de codificação da proteína L do clone de HPIV-3, é preferível que seja feita a mesma mutação no mesmo local na sequência de codificação da proteína L do clone de suporte codificando a proteína L. Tal método é útil para a identificação de mutações que bloqueiem a síntese de partículas virais ou resultem na produção de HPIV-3 não infeccioso ou não virulento. -12- ΡΕ981537

Para determinar se os vírus mutados produzidos através do método acima descrito são não virulentos, i.e., atenuados, os vírus mutados são primeiro testados in vitro para determinar se a mutação resultou num fenótipo de crescimento mais lento, i.e., o vírus mutado cresce mais lentamente em cultura de tecidos que o vírus de tipo selvagem. Os vírus mutados que exibem este fenótipo são então examinados in vivo, através de injecção num animal, tal como o rato do algodão, que é um bom modelo experimental para o vírus parainfluenza. Os animais infectados são então examinados para determinar se estão a produzir anticorpos para HPIV-3 e para determinar se existe uma redução na gravidade dos sintomas em comparação com os animais infectados com vírus de tipo selvagem. A capacidade para produzir vírus HPIV-3 recombinantes geneticamente modificados para conterem alterações específicas dentro dos genes de HPIV-3 e dos elementos de acção em cis acelera o estudo de todos os aspectos do ciclo de replicação do vírus. Adicionalmente, um sistema que permita a produção de HPIV recombinante que seja geneticamente modificado para conter alterações específicas dentro dos genes de HPIV-3 é útil para identificar genótipos de parainfluenza atenuados e para desenvolver uma vacina viva para o vírus parainfluenza humano.

Os seguintes exemplos de métodos de preparação de um clone de ADNc inteiro de HPIV-3 e de métodos de -13- ΡΕ981537 preparação de um HPIV-3 recombinante, infeccioso, modificado ou mutado são para fins de ilustração e não se pretende que limitem o âmbito do invento.

Exemplo 1: Construção de um Clone de ADNc de HPIV-3 Inteiro A construção de um clone de HPIV-3 inteiro infeccioso contendo mutações em locais específicos foi alcançada através de um processo de dois passos. 0 passo inicial foi a criação de um mini-replicão que continha a região da porção líder de sentido positivo e as regiões "trailer" de HPIV-3. 0 segundo passo envolveu a inserção de fragmentos de RT-PCR derivados de ARN genómico de HPIV-3 no mini-replicão. 0 mini-replicão de sentido positivo continha o seguinte: Um promotor T7 que dirigiu a síntese de dois resíduos G não virais, seguido da região líder de sentido positivo de HPIV-3, uma porção da UTR 5' de NP (até à base virai 97), o gene da luciferase, uma parte da UTR 3' de L (a começar na base virai 15387) e as sequências "trailer" de HPIV-3. A sequência nucleotídica inteira do genoma de HPIV-3 e a localização da sequência líder, da sequência "trailer" e das regiões de codificação de proteínas são mostradas na Figura 1. Seguiu-se a ribozima antigenómica do vírus delta da hepatite para efectuar uma clivagem exacta a seguir à base específica do terminal 3' de HPIV-3. Foi também incorporado no replicão um terminador da ARN-polimerase T7 seguido da sequência da ribozima. Adicionalmente, foram inseridos sinais de terminação da polimerase do vírus vacínia imediatamente a montante e a -14- ΡΕ981537 jusante das sequências acima mencionadas. Durante a construção, foram criadas mudanças de bases únicas nas regiões codificando a UTR 5' de NP e a UTR 3' de L. Uma mudança de A para G na base virai 94 e a mudança de A para G na base 15389 criaram os locais Saci e StuI, respectivamente, que serviram como marcadores genéticos para identificar o virus como sendo de origem recombinante. 0 vector pOCUS-2 (Novagen) foi escolhido como plasmideo de partida para a preparação do mini-replicão [pPIV3-MG( + )], devido ao seu pequeno tamanho (1930 pb) . Crê-se que a utilização de um plasmideo de partida pequeno pode aumentar a estabilidade do clone inteiro.

O mini-replicão foi construído através da criação de produtos de PCR codificando as regiões líder e "trailer" flanqueadas por um promotor T7 e pela ribozima antigenómica do vírus delta da hepatite, respectivamente. Os iniciadores utilizados para a síntese da região promotor T7/líder foram: 5'-TAGTCGGCCCTAATACGACTCACTATAGGACCAAACA AGAGAAGAAACT-3', SEQ ID NO: 2 e 5'-GAAATTATAGAGCTCCCTTTTCT-3', SEQ ID NO: 3. O primeiro iniciador codifica um local EagI e o promotor T7 (sublinhado) e o segundo iniciador introduziu uma mudança de bases de A para G na base virai 94 (a cheio) dentro da região não traduzida (UTR) 5' do ARNm de NP, que cria um local Saci. O molde para esta reacção ρΗΡΐν-3-CAT, descrito em De, B.P. e A.K. Banerjee, "Rescue of synthetic analogs of genome RNA of human parainfluenza virus type 3", Vir. 196: 344-348, 1993. O -15- ΡΕ981537 produto de PCR resultante foi clonado nos locais EagI e Saci de pOCUS-2, que estão representados na Figura 2. Os iniciadores utilizados para sintese da região "trailer"/ribozima foram: 5'-TAAGGCCTAAAGATAGACAAAAAGTAAGAAAAACATGTAATATATATATACCAAACAGA GTTCTTCTCTTGTTTGGTGGGTCGGCATGGCATCTC-3' , SEQ ID NO: 4, e 5'-CTGGGTACCTCCCTTAGCCATCCGAGT-3', SEQ ID NO: 5. O primeiro iniciador contém a sequência da UTR 3' do ARNm de L, ao longo do "trailer" e inicia a sintese da ribozima (sublinhado). É também codificado por este iniciador uma mudança de A para G na base virai 15389 (a cheio), que cria um local StuI dentro da UTR 3' do ARNm de L. 0 segundo iniciador codifica a extremidade 3' da ribozima (sublinhado) e um local SglII. O molde para esta reacçâo de PCR foi pSAl, um plasmideo contendo a sequência da ribozima, tal como anteriormente descrito em Perrota, A.T. e M.D. Been, "The pseudoknot-like structure required for efficient self-cleavage of hepatitis delta vírus RNA", Nature 350: 434-436, 1991. O produto de PCR derivado desta reacção foi clonado nos locais StuI e BglII de pOCUS-2. As regiões líder e "trailer" foram combinadas num único clone através da transferência do fragmento EagI/PstI do clone T7/líder para os locais PacI/PstI do clone "trailer"/ribozima.

Para prevenir a possível interferência por transcrição dos promotores crípticos do vírus vacínia, foram inseridos sinais stop da transcrição da polimerase do vírus vacínia (TTTTTNT) a montante e a jusante do replicão -16- ΡΕ981537 próximo dos locais PvuII e SspI dentro de pOCUS-2. Um sinal de terminação da transcrição T7 foi removido de pET-17b através de digestão com BlpI e BspEI e inserido no local SspI (tornado de extremidades cegas com a ADN-polimerase T4) de pOCUS-2. Um gene repórter de luciferase foi então inserido nos locais Saci e StuI para criar pPIV3-MG(+), que é representado esquematicamente na Figura 3.

Para criar o clone de HPIV-3 inteiro, foram gerados cinco produtos de RT-PCR a partir do ARN do virião de HPIV-3 e clonados. Estes fragmentos foram subsequentemente inseridos em pPTV3-MG(+), substituindo as sequências de codificação de luciferase, para gerar pHPIV-3, o clone inteiro. Os cinco produtos de RT-PCR foram gerados a partir do ARN do virião da estirpe 47885 de HPIV-3 que foi obtido de Robert Chanock, no National Institutes of Health. Estes produtos de PCR, englobando o restante do genoma de HPIV-3, foram identificados através de análise com enzimas de restrição e clonados, em pUC19 ou pOCUS-2 e depois inseridos em pPIV3-MG(+). 0 primeiro produto de PCR contendo as bases virais 83 a 2721 foi inserido no local Smal de pUC19. 0 clone 83/2721 foi então digerido com Saci e Xmnl, removendo as bases virais 94 a 553 que foram inseridas no Saci e Sphl (tornado de extremidades cegas com ADN-polimerase T4) de pPIV3-MG(+). 0 clone 83/2721 foi então digerido com PstI para remover um fragmento contendo as bases virais 540 a 2274, que foi então inserido no local PstI do clone pPIV3- -17- ΡΕ981537 MG(+) contendo o fragmento 94/554. 0 segundo produto de PCR englobando as bases virais 13395 a 15397 foi clonado no local Smal de pUC19. Este clone 13395/15397 foi então digerido com StuI e PacI e o fragmento resultante contendo as bases virais 13632 a 15381 foi inserido nos locais StuI e PacI do clone pPIV3-MG(+) contendo a sequência virai até à base 2274. 0 clone resultante continha as bases virais 1 a 2274 e 13632 a 15462 no contexto de pPIV3-MG(+). 0 terceiro produto de PCR contendo as bases virais 7403 a 11513 foi digerido com SspMI (tornado de extremidades cegas com ADN-polimerase T4) e Xhol para produzir um fragmento contendo as bases 7437 a 11444 que foi inserido nos locais Xhol e SspI de pOCUS-2. O quarto fragmento de PCR contendo as bases virais 10904 a 13773 foi digerido com PvuII e BamRI (bases virais 10918 a 13733) e inserido nos locais PcoRI (tornado de extremidades cegas com ADN-polimerase T4) e BamRI de pUC19. Os dois segmentos virais foram combinados através de digestão do clone 7437/11444 com Saci (tornado de extremidades cegas com ADN-polimerase T4) e EcoNI e de inserção no clone 10918/13733 digerido com PcoRJ (tornado de extremidades cegas com ADN-polimerase T4) e PcoNI. O clone resultante continha as bases virais 7437 a 13733 num fundo de pUC19. O restante da sequência virai foi derivado de um quinto produto de PCR englobando as bases virais 83 a 7457 que tinha sido digerido com Xmnl e xhol (bases virais 553 a 7437) e clonado nos locais StuI e Xhol de pOCUS-2. O clone 7437/13733 foi então digerido com BamRI, tornado de -18- ΡΕ981537 extremidades cegas com ADN-polimerase T4 e digerido com Xhol para libertar um fragmento que foi inserido no clone 553/7437 digerido com EagI (tornado de extremidades cegas com ADN-polimerase T4) e Xhol. 0 clone resultante continha as bases virais 553 a 13733. Este clone foi então digerido com PshAI e PacI e o fragmento resultante contendo as bases virais 2143 a 13632 foi inserido nos mesmos locais do clone pPIV3-MG(+) contendo as bases virais 1 a 2274 e 13632 a 15462. Isto gerou pHPIV-3, o clone infeccioso, que está esquematicamente representado na Figura 4.

Para inserir o gene de P em pGEM-4, as sequências de P foram transferidas para um clone da fusão P-lac (descrito em 38, que é aqui incorporado por referência) através da digestão com Xbal (tornado de extremidades cegas com ADN-polimerase T4) e BamEI e inserido nos locais Kpnl (tornado de extremidades cegas com ADN-polimerase T4) e BamRI de pGEM4. Os clones pPIV3-NP e pPIV3-L, tal como descrito em 15 e 16, que são aqui incorporados por referência, estavam num fundo de pGEM-4. 0 clone pPIV3-L foi também modificado. Na sequência natural do ARNm de L existem 11 nucleótidos de AUG não iniciadores da extremidade 5' do transcrito. Estes foram removidos de pPIV3-L através de PCR mutacional, mudando as bases virais 8636 e 8637 de AT para TA.

Exemplo 2. Preparação de HPIV-3 Recombinante

Monocamadas confluentes de células HeLa em placas -19- ΡΕ981537 de 6 poços foram infectadas com vírus vacínia recombinante vTF7-3 a uma multiplicidade de infecção de 2. vTF7-3 expressa ARN-polimerase T7 tal como descrito em Fuerst, T.R., Earl, P.L. e Moss, B., "Use of a hybrid vaccinia virus-T7 RN A polymerase system for expression of target genes", Mol. Cell Biol. 7: 2538-2544, 1987, e Fuerst, T.R., Niles, E.G., Studier F.W. e Moss, B., "Eukariotic transient-expression system based on recombinat vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 8122-8126, 1986, que são aqui incorporados por referência. Após 1 hora a 37°C, pPIV3-NP, pPIV3-P, pPIV3-L e pHPIV-3 foram transfectados utilizando Lipofectina (BRL) de acordo com as instruções do fabricante. Após três horas o meio de transfecçâo foi removido e substituído por 1,5 ml de Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM)/soro fetal bovino a 5%. Após 40 a 48 horas as placas foram congeladas, descongeladas e raspadas. O sobrenadante do meio clarificado (250 μΐ) foi então utilizado para infectar monocamadas de células HeLa frescas em placas de 6 poços. Após 1 hora de adesão foi adicionado DMEM (1,5 ml) contendo 25 yg/ml de 1-B-D-arabinofuranosilcitosina (araC) para inibir a replicação do vírus vacínia. Após quarenta horas as placas foram congeladas, descongeladas e raspadas. O sobrenadante do meio clarificado foi então titulado quanto a HPIV-3 na presença de AraC. Durante a titulação, as placas fágicas isoladas foram apanhadas como tampões de agar. Os tampões de agar foram colocados em 500 ml de opti-MEM a 4°C durante 4 h. Foram então utilizados 250 μΐ para infectar -20- ΡΕ981537 monocamadas de células HeLa frescas para amplificação dos isolados de placas fágicas durante 40 h.

Numa concretização preferida as condições de transfecção foram 1 pg de HPIV-3, 2 pg de pPIV3-NP, 4 pg de pPIV3-P e 0,1 pg de pPIV3-L. Sob estas condições obtiveram-se aproximadamente 1000 pfu por 6 χ105 células durante a transfecção inicial e 106 pfu por 6><105 células após a amplificação.

Quando se omitiram os plasmideos individuais do passo de transfecção foi observado que os plasmideos pHPIV-3, pPIV3-P e pPIV3-L eram necessários para a recuperação do virus mas, surpreendentemente, tal como mostrado na Tabela 1 abaixo, pPIV-3 não.

Tabela 1

Plasmideos Transfectados HPIV-3 NP P L Recuperação do vírus -1- + + + 14/15a - + + + 0/2 + - + + 3/3b + + - + 0/3 + + + - 0/2 -21- ΡΕ981537

Tabela 1. Recuperação de HPIV-3 a partir de pHPIV-3. Monocamadas de células HeLa foram infectadas com vTF7-3 e transfectadas com os plasmideos indicados. Após 40 h as células foram lisadas e os sobrenadantes adicionados a monocamadas de células HeLa frescas na presença de araC para inibir a replicação de vTF7-3. Estas monocamadas foram então lisadas e os sobrenadantes ensaiados quanto a HPIV-3. O número de experiências para as quais HPIV-3 foi recuperado por tentativas é mostrado sob recuperação do virus. aA única experiência que não produziu HPIV-3 utilizou 0,1 yg do plasmideo de P. bA omissão do plasmideo de NP resultou em títulos de HPIV-3 3 a 5 vezes inferiores.

Caracterização do Vírus Recuperado

Para caracterizar o vírus recuperado e para purificar HPIV-3 a partir de vTF7-3, cujas placas fágicas são apenas ligeiramente mais pequenas que as de HPIV-3, as placas fágicas isoladas suspeitas de serem HPIV-3 foram apanhadas e amplificadas em células HeLa. Os isolados de vírus purificados e amplificados de placas fágicas e os controlos apropriados foram então analisados em ensaios de neutralização. Os vírus (isolados #3 e #5) foram pré-incubados (30 min. em gelo) com 5 μΐ de soro pré-imune de coelho, 5 μΐ de anti-soro policlonal de coelho anti-HPIV-3 ou ensaiados na presença de 25 pg/ml de araC. Os soros -22- ΡΕ981537 foram incubados com vírus em gelo durante 30 minutos antes de um ensaio padrão de placas fágicas. Para permitir o desenvolvimento máximo de placas fágicas, as placas foram então incubadas a 37°C durante 66 h antes da coloração com violeta cristal. Os resultados do ensaio indicaram que o vírus purificado de placas fágicas foi completamente inibido pelo anti-soro anti-HPIV-3, enquanto que vTF7-3 não foi. Em contraste, os isolados de HPIV-3 não foram inibidos por AraC, enquanto que o vírus vTF7-3 foi completamente inibido. Interessantemente, dos oito isolados de HPIV-3 recombinante, quatro tinham um tamanho de placas fágicas idêntico ao da reserva parental de HPIV-3 enquanto que quatro eram ligeiramente maiores. O tamanho das placas fágicas do isolado #3 foi ligeiramente maior que o do isolado #5 e do vírus HPIV-3 de tipo selvagem.

Para determinar se a sequência de codificação de NP de pHPIV-3, que partilha a mesma posição que a luciferase em pPIV3-MG(+) estava a ser expressa a partir de pHPIV-3, pHPIV-3 e pPIV3-NP foram separadamente transfectados para células HeLa infectadas com vTF7-3 e lisados celulares preparados após 48 h. Os lisados foram então analisados através de "Western blotting" utilizando um anti-soro anti-HPIV-3RNP. Este anti-soro reconhece primeiramente NP e reage fracamente com P.

Especificamente, os extractos (equivalentes a 6χ104 células) foram corridos em SDS-PAGE a 10% e transfectados para membranas de nitrocelulose. O anticorpo -23- ΡΕ981537 primário foi um anti-soro policlonal de coelho anti-RNP diluído 1:1000. O anticorpo secundário foi uma diluição 1:1000 de um anticorpo de cabra anti-coelho conjugado com peroxidase de rábano. A visualização foi feita através de quimioluminescência (estojo ECL, Amersham). Tal como mostrado através do "Western blot", RNP de HPIV-3 reconheceu NP dos extractos de células transfectadas com PPIV3-NP e pHPIV-3 e de RNP de HPIV-3 purificado. Não foram reconhecidas proteínas num extracto de HeLa falsamente transfectadas. Assim, parece que NP é expressa a partir de pHPIV-3, sendo presumivelmente traduzida a partir do transcrito de ARN anti-genómico dirigido por T7.

Para determinar se o vírus recombinante recuperado tinha mutações específicas no seu genoma, o ARN foi extraído de vírus de tipo selvagem e isolado em placas fágicas e utilizado para análise de RT-PCR utilizando iniciadores flanqueando as mutações de substituição. O ARN virai foi isolado de aproximadamente 2><107 unidades formadoras de placas fágicas (pfu) dos isolados de vírus purificados de placas fágicas #3, 5, 7 e 9 ou da estirpe 47885 de HPIV-3 de tipo selvagem. A transcrição reversa foi realizada utilizando a transcritase reversa Superscript II (BMB) a 44°C durante 1 h utilizando oligonucleótidos que iniciaram na base virai 23 ou 15100. A PCR foi realizada com a polimerase Expand Long (BMB) utilizando segundos iniciadores que resultam na amplificação das bases virais 23 a 303, ou 15100 a 15440. -24- ΡΕ981537

Os produtos de PCR englobando as bases virais 1 a 324 e 15080 a 15462 foram gerados a partir dos isolados indicados, digeridos com Saci e StuI, respectivamente, e analisados num gel de agarose a 1,4%. Os produtos de PCR do tamanho esperado foram gerados de um modo dependente da RT, indicando que os produtos de PCR eram derivados de ARN em vez de ADN plasmidico contaminante.

Tal como mostrado no gel de agarose, o tamanho dos produtos de PCR de 1 a 324 e de 15080 a 15462 são aumentados em 21 e 22 pares de bases, respectivamente, ao longo do comprimento das regiões virais especificas devido à inclusão de locais de enzimas de restrição nos iniciadores de amplificação. A digestão com Saci mostrou que a mutação na base 94 não estava presente no virus de tipo selvagem mas estava presente nos virus isolados de placas fágicas, indicando que são de origem recombinante. De modo semelhante, o produto de PCR derivado da região que engloba a base virai 15389 de HPIV-3 de tipo selvagem não foi clivado por StuI. No entanto, apenas quatros dos oito virus isolados de placas fágicas continham a mutação que cria o local StuI. A sequenciação directa dos produtos de PCR confirmou estes resultados.

DISCUSSÃO

Foi construído um clone plasmidico inteiro do genoma de HPIV-3, pHPIV-3. Após transfecção de pHPIV-3 e dos plasmídeos codificando as proteínas virais NP, P e L em -25- ΡΕ981537 células HeLa infectadas com vTF7-3, HPIV-3 recombinante possuindo marcadores genéticos foi eficientemente recuperado. Foram notadas várias caracteristicas interessantes deste sistema. Primeiro, a proteína virai NP podia ser expressa a partir do clone infeccioso e esta expressão obviava a necessidade de um plasmídeo de suporte de NP. Crê-se que a proteína NP seja sintetizada directamente a partir do transcrito antigenómico primário após este ser protegido pela enzima de protecção do vírus vacínia.

Segundo, foram produzidos dois vírus recombinantes com genótipos e fenótipos distintos, provavelmente devido à recombinação entre os plasmídeos pHPIV-3 e pPIV3-L, embora não possa ser excluída a possibilidade de que a reversão surja durante a replicação do ARN. pPIV3-L contém a UTR 3' de L inteira e parte da região "trailer", prolongando-se até à base 15437, uma sobreposição de 48 pares de bases para além do local Stul. Este é um amplo espaço para que facilmente ocorra recombinação entre os plasmídeos nas células infectadas pelo vírus vacínia. A partir destes resultados, parece haver selecção no sistema de HPIV-3. Todos os isolados de vírus de placas fágicas grandes reverteram para uma sequência de tipo selvagem na base 15389, ao mesmo tempo que mantinham a mudança na base 94. Uma vez que A94G é a única alteração conhecida nestes vírus em relação aos vírus parentais, -26- ΡΕ981537 parecia que os isolados que mantinham ambas as mutações tinham um tamanho de placa fágica idêntico ao do vírus parental (de tipo selvagem), mas quando as mutações de 15389 se perdiam, o tamanho da placa fágica aumentava, indicando que a mutação na base 15389 era prejudicial no contexto da mutação A94G. Houve mais uma alteração conhecida entre pHPIV-3 e os plasmídeos de suporte. Existe um AUG não iniciador na mensagem da proteína L natural. Uma vez que este AUG está apenas a 11 nucleótidos da extremidade 5' do ARNm de L e num contexto de fraco início da tradução, pode não causar muita interferência com a tradução do ARNm de L. No entanto, no plasmídeo de suporte pPIV3-L este AUG não iniciador está muito mais para lá da extremidade 5' do transcrito onde é mais provável que seja reconhecido por ribozimas. Este AUG foi removido de pPIV3-L através de alteração das bases 8636 e 8637 de AT para TA, destruindo um local Sphl e criando um local NheI. Para investigar se esta mudança estava presente no vírus recombinante e podia ser responsável pelo fenótipo de placas fágicas grandes, foi feita análise de RT-PCR. Os produtos de PCR englobando este local e derivados tanto dos vírus de tipo selvagem como dos isolados de placas fágicas mantiveram uma sequência de tipo selvagem, indicando que a recombinação não ocorreu nesta região e que estas alterações não podiam contribuir para qualquer variância no tamanho das placas. A descoberta de que pode ocorrer recombinação entre os plasmídeos transfectados indica que se tem de ter -27- ΡΕ981537 cuidado ao introduzir mutações nos sistemas de clones infecciosos de paramixovírus ou rabdovírus. As mutações introduzidas dentro das sequências de NP, P ou L são de preferência transportadas tanto pelos plasmideos de suporte como pelo clone infeccioso. De outro modo, o virus resultante pode não possuir a mutação desejada. A única excepção possível a isto é o sistema HPIV-3, no qual o clone infeccioso de HPIV-3 expressa NP, evitando a necessidade do plasmídeo de suporte de NP. Contudo, é preferível que o plasmídeo de suporte de NP de HPIV-3 seja incluído no sistema, uma vez que foram obtidos rendimentos significativamente maiores de HPIV-3 quando o plasmídeo de suporte de NP foi incluído na transfecção.

Um clone infeccioso para HPIV-3 é útil para a compreensão da biologia molecular de HPIV-3 e para o desenvolvimento de uma vacina para este importante patogénio. A capacidade para gerar mutações específicas dentro de HPIV-3 torna todos os aspectos da replicação de HPIV-3 passíveis de estudo. Qualquer mutação, incluindo as estudadas anteriormente noutros contextos, podem agora ser examinadas com este sistema. A capacidade para introduzir mutações específicas permite também a possibilidade de analisar revertentes, o que podia refinar a nossa compreensão das interacções proteína-proteína ou proteína-ARN. 0 clone infeccioso é também útil para a identificação de mutações que atenuam o vírus. Tal vírus é -28- ΡΕ981537 útil para o desenvolvimento de novas estirpes de vacina de HPIV-3. Adicionalmente, as mutações presentes numa estirpe de HPIV-3 de vacina candidata actual podem ser inseridas em pHPIV-3. Através da identificação de múltiplas mutações deletérias, deve ser possível desenhar várias mutações afectando vários passos no ciclo de vida do vírus numa única estirpe de HPIV-3. Um tal vírus deve ser altamente atenuado e não deve ser facilmente capaz de reverter.

Embora o invento tenha sido descrito até um certo grau de particularidade, várias adaptações e modificações podem ser feitas sem sair do âmbito do invento tal como definido nas reivindicações anexas. LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS como Anexo (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: The Cleveland Clinic Foundation (ii) TÍTULO DO INVENTO: Clone Infeccioso para o Vírus Parainfluenza de Tipo 3 Humano (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 5 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Wyeth Laboratories (B) RUA: Huntercombe Lane South (C) CIDADE: Taplow, Maidenhead

(D) PAÍS: UK -29- ΡΕ981537 (E) CÓDIGO POSTAL: SL6 ΟΡΗ (v) FORMATO LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SUPORTE LÓGICO: Patentln Release #1.0,

Versão #1.30 (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE PROCURADOR/AGENTE: (A) NOME: Walters, Philip B.W. (B) NÚMERO DE REGISTO: (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/RECIBO: ACY-33557 (ix) INFORMAÇÃO SOBRE TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: +66 1628 413873 (B) TELECÓPIA: +66 1628 799098 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15462 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla ΡΕ981537 -30- (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1 -31- ΡΕ981537

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(iii)HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: TAGTCGGCCC TAATACGACT CACTATAGGA CCAAACAAGA GAAGAAACT 49 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: 23

GAAATTATAG AGCTCCCTTT TCT -41- ΡΕ981537 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 95 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4: TAAGGCCTAA AGATAGACAA AAACTAAGAA AAACATGTAA TATATATATA CCAAACAGAG 60 TTCTTCTCTT GTTTGGTGGG TCGGCATGGC ATCTC 95 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc -42- ΡΕ981537

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5

CTGGGTACCT CCCTTAGCCA TCCGAGT

Lisboa, 3 de Outubro de 2007

Claims (22)

1. ΡΕ981537 -1- REIVINDICAÇÕES 1. Clone de HPIV recombinante compreendendo: a) uma sequência nucleotídica codificando um antigenoma do virus parainfluenza de tipo 3 humano (HPIV-3) de sentido positivo; e b) um promotor de ARN-polimerase operativamente ligado à referida sequência nucleotídica.
2. 2. Clone da reivindicação 1 em que o referido clone compreende ainda uma sequência de ribozima a jusante da referida sequência codificando o antigenoma.
3. 3. Clone da reivindicação 1 em que o promotor da ARN-polimerase é o promotor da ARN-polimerase T7.
4. 4. Clone da reivindicação 2 em que a ribozima é uma ribozima antigenómica.
5. 5. Clone da reivindicação 2 compreendendo ainda um terminador da ARN-polimerase a jusante da sequência da ribozima.
6. 6. Clone da reivindicação 1 em que a sequência nucleotídica codifica um antigenoma de HPIV-3 modificado.
7. 7. Clone da reivindicação 6 em que a sequência codificando o antigenoma de HPIV-3 compreende uma mutação -2- ΡΕ981537 seleccionada a partir do grupo que consiste numa substituição de um ou mais nucleótidos, uma deleção de 3 a 12 nucleótidos e uma adição de 3 a 12 nucleótidos.
8. 8. Método para preparação de um virus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante compreendendo: a) proporcionar um sistema recombinante que compreende: i) um clone de HPIV compreendendo uma sequência nucleotídica codificando um antigenoma de sentido positivo de um vírus parainfluenza de tipo 3 humano; ii) um clone de suporte compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína L do vírus parainfluenza de tipo 3 humano; e iii) um clone de suporte compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína P do vírus parainfluenza de tipo 3 humano; em que as sequências nucleotídicas codificando a proteína P e a proteína L podem estar no mesmo clone de suporte ou em clones de suporte separados; b) introduzir o sistema recombinante do passo (a) em células hospedeiras; c) cultivar as células hospedeiras do passo (b) durante um tempo suficiente para permitir a transfecção das células hospedeiras e a formação de vírus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante; e d) recuperar o vírus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante a partir da cultura de células hospedeiras transfectadas. -3- ΡΕ981537
9. 9. Método da reivindicação 8 em que a sequência codificando o antigenoma do clone de HPIV-3 está operativamente ligada a um promotor de uma ARN-polimerase; em que as sequências codificando a proteína P dos clones de suporte de P estão operativamente ligadas a um promotor da ARN-polimerase; em que as sequências codificando a proteína L dos clones de suporte de L estão operativamente ligadas a um promotor da ARN-polimerase; em que as células hospedeiras compreendem uma ARN-polimerase correspondendo ao promotor da ARN-polimerase do referido clone de HPIV-3 e dos referidos clones de suporte.
10. 10. Método da reivindicação 9, em que as células hospedeiras são infectadas com um recombinante virai capaz de expressar a ARN-polimerase antes ou em combinação com a introdução do sistema recombinante nas células hospedeiras.
11. 11. Célula hospedeira para produção de um vírus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, compreendendo a referida célula hospedeira: a) um clone de HPIV compreendendo uma sequência nucleotídica codificando um antigenoma de um vírus parainfluenza de tipo 3 humano de sentido positivo; b) um clone de suporte compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína L do vírus parainfluenza de tipo 3 humano; e c) um clone de suporte compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína P do vírus -4- ΡΕ981537 parainfluenza de tipo 3 humano; em que as sequências nucleotídicas codificando a proteína P e a proteína L podem estar no mesmo clone de suporte ou em clones de suporte separados.
12. 12. Célula hospedeira da reivindicação 11 compreendendo ainda um clone de suporte compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína NP do vírus parainfluenza de tipo 3 humano.
13. 13. Célula hospedeira para produção de um vírus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, compreendendo a referida célula hospedeira: a) um clone de HPIV compreendendo uma sequência nucleotídica codificando um antigenoma de um vírus parainfluenza de tipo 3 humano de sentido positivo; em que o referido antigenoma compreende uma mutação específica do local; b) um clone de suporte compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína L do vírus parainfluenza de tipo 3 humano; e c) um clone de suporte compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína P do vírus parainfluenza de tipo 3 humano; em que as sequências nucleotídicas codificando a proteína P e a proteína L estão no mesmo clone de suporte ou em clones de suporte separados.
14. 14. Célula hospedeira da reivindicação 12 em que -5- ΡΕ981537 o clone de HPIV-3 compreende ainda um promotor de uma ARN-polimerase operativamente ligado à sequência antigenómica de HPIV-3 e em que cada um dos clones de suporte compreende um promotor de ARN-polimerase operativamente ligado à sequência codificando a proteína de HPIV-3 do referido suporte.
15. 15. Método de introdução de uma mutação específica do local no genoma de um vírus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, compreendendo os seguintes passos: a) preparação de um clone compreendendo uma sequência nucleotídica codificando um antigenoma virai parainfluenza de tipo 3 humano possuindo uma mutação num local específico. b) co-transfecção de células hospedeiras com o clone do passo (a) , um clone de suporte compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína L de HPIV-3 e um clone de suporte compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína P de HPIV-3; em que a sequência nucleotídica codificando a proteína P e a proteína L podem estar no mesmo clone de suporte ou em clones de suporte separados; e c) cultura das células hospedeiras transfectadas durante um tempo suficiente para permitir a formação de um vírus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante.
16. 16. Método da reivindicação 15 compreendendo ainda o passo de transfecção das células hospedeiras com um -6- ΡΕ981537 clone de suporte compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína NP de HPIV-3.
17. 17. Método da reivindicação 15 em que o clone do passo (a) é preparado utilizando técnicas de reacção em cadeia da polimerase e um clone compreendendo uma sequência nucleotídica codificando um antigenoma de um vírus parainfluenza de tipo 3 humano como molde, em que a sequência nucleotídica codificando o antigenoma do referido clone de molde não tem a mutação específica do local.
18. 18. Clone da reivindicação 6, em que a sequência do antigenoma modificada possui uma ou mais mutações num elemento de acção em eis ou uma região de codificação de proteína.
19. 19. Clone da reivindicação 6, em que a mutação está na região codificando a proteína P ou na região codificando a proteína L.
20. 20. Célula hospedeira para produção de um vírus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, compreendendo a referida célula hospedeira: a) um clone de HPIV compreendendo uma sequência nucleotídica codificando um antigenoma de um vírus parainfluenza de tipo 3 humano de sentido positivo; em que a referida sequência do antigenoma compreende uma mutação específica do local; b) um clone de suporte compreendendo uma -7- ΡΕ981537 sequência nucleotídica codificando uma proteína L do vírus parainfluenza de tipo 3 humano; e c) um clone de suporte compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína P do vírus parainfluenza de tipo 3 humano; em que as sequências nucleotídicas codificando a proteína P e a proteína L estão no mesmo clone de suporte ou em clones de suporte separados; e em que a mutação está na região de codificação da proteína L da sequência codificando o antiqenoma do clone de HPIV, e em que o clone de suporte que compreende a sequência de codificação da proteína L possui aí uma mutação correspondente.
21. 21. Célula hospedeira para produção de um vírus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, compreendendo a referida célula hospedeira: a) um clone de HPIV-3 compreendendo uma sequência nucleotídica codificando um antigenoma de um vírus parainfluenza de tipo 3 humano de sentido positivo, em que a referida sequência compreende uma mutação específica do local; b) um clone de suporte compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína L do vírus parainfluenza de tipo 3 humano; e c) um clone de suporte compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína P do vírus parainfluenza de tipo 3 humano; em que as sequências nucleotídicas codificando a proteína P -8- ΡΕ981537 e a proteína L estão no mesmo clone de suporte ou em clones de suporte separados; e em que a mutação está na região de codificação da proteína P da sequência codificando o antigenoma do clone de HPIV, e em que o clone de suporte que compreende a sequência de codificação da proteína P possui aí uma mutação correspondente.
22. 22. Célula hospedeira para produção de um vírus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, compreendendo a referida célula hospedeira: a) um clone de HPIV-3 compreendendo uma sequência nucleotídica codificando um antigenoma de um vírus parainfluenza de tipo 3 humano de sentido positivo, em que a referida sequência compreende uma mutação específica do local; b) um clone de suporte compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína L do vírus parainfluenza de tipo 3 humano; c) um clone de suporte compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína P do vírus parainfluenza de tipo 3 humano; e d) um clone de suporte compreendendo uma sequência nucleotídica codificando uma proteína NP do vírus parainfluenza de tipo 3 humano; em que as sequências nucleotídicas codificando a proteína P, a proteína L e a proteína NP estão no mesmo clone de suporte ou em clones de suporte separados; e em que a mutação está na região de codificação da proteína -9- ΡΕ981537 NP da sequência codificando o antigenoma do clone de HPIV, e em que o clone de suporte que compreende a sequência de codificação da proteina NP possui ai uma mutação correspondente. Lisboa, 3 de Outubro de 2007