CN115942955A - 重组轮状病毒表达系统和重组轮状病毒 - Google Patents

Abstract

本文的实施方案提供轮状病毒构建体及其免疫原性组合物的组合物、方法、用途和制造规程。一些实施方案涉及组合物，其包含但不限于在针对受试者的轮状病毒感染以及冠状病毒感染的免疫原性组合物中使用的嵌合轮状病毒。在某些实施方案中，可以生成和使用本文使用的构建体，其中轮状病毒表达系统进一步包括编码冠状病毒的一种或多种多肽的一种或多种核酸分子。

Description

重组轮状病毒表达系统和重组轮状病毒

优先权声明

本申请要求2020年4月20日提交的美国临时专利申请号63/012,870的权益，该临时申请通过引用其整体并入本文。

政府权利声明

本发明是在美国国立卫生研究院(NIH)授予的资助AI144881的政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。

序列表

本申请含有下表中提供的序列表：

序列表

背景技术

轮状病毒是全世界儿童胃肠炎的主要原因之一，并且对儿童发病率和死亡率具有重大影响。轮状病毒疫苗已显示出非常好的安全性和有效性概况，并且它们的使用显著降低了发达国家和发展中国家急性轮状病毒胃肠炎的死亡人数。

冠状病毒是一组大的、有包膜的、正义的、单链RNA病毒。起源于蝙蝠的动物源性冠状病毒已在人中存在至少500-800年，并且通常是普通感冒的原因。在特征在于不同抗原交叉反应性和基因构成的四个冠状病毒属(α、β、γ和δ)中，只有α和β冠状病毒属包括对人致病的株。

在2019年12月之前已知的冠状病毒种中，只有六种已知导致人疾病：HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸道病毒冠状病毒(MERS-CoV)。HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1在局部流行，并且主要与轻度自限性疾病有关，而SARS-CoV和MERS-CoV可以引起严重疾病。SARS-CoV和MERS-CoV是β冠状病毒，并且属于世界卫生组织高优先级威胁清单中包括的病原体。

冠状病毒因其表面的冠状刺突而得名，并且具有两种主要的包膜蛋白。S糖蛋白是负责受体结合和细胞融合的主要抗原。跨膜糖蛋白(M)参与出芽和包膜形成。一些冠状病毒种具有第三种糖蛋白，即血凝素酯酶(HE)。冠状病毒基因组是约26-32kb的不分区段的正单链RNA，使其成为已知最长的RNA病毒基因组，包括7至10个开放阅读框。冠状病毒能够通过体内基因重组和突变过程快速适应新宿主。

SARS-CoV-2经测序并鉴定为属于sarbecovirus的β冠状病毒，与SARS-CoV的基因序列具有75-80％的相似度。SARS-CoV-2的动物宿主被推测为蝙蝠，尽管也可能涉及中间宿主。尽管最初的病例是动物源性传播的结果，但很快就在医疗环境和家庭集群中记录了人与人之间的传播。

经过2-14天的潜伏后，SARC-CoV-2感染表现为称为COVID-19(冠状病毒病2019)的呼吸道疾病，其中症状包括发烧、咳嗽和呼吸困难。对41例临床病例的早期描述将患者描述为患有严重的、有时是致命性的肺炎，其中临床表现与SARS-CoV非常相似。具有最严重病情的患者出现了急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，需要入住ICU并接受氧气治疗。

跟据世界卫生组织，截至2020年4月9日，全球已报告超过160万例COVID-19确诊病例和95,000例死亡，其中病例报告发生在212个不同的国家、地区或领土。尽管早期的病死率似乎很低，但病毒的快速播散和传播的容易性(甚至通过无症状的个体)已经引起了全球的警觉；如果病毒很容易传播，其就会在群体层面构成重大风险。世界卫生组织于2020年3月11日宣布SARS-CoV-2感染为大流行病。

截至2020年4月，已有5种SARS-CoV-2疫苗开始了I期临床试验，并且有近20种另外的疫苗候选物处于临床前开发阶段。似乎没有探索新生儿疫苗的可能性。

发明概述

在第一个实例(“实例1”)中，本文提供了重组轮状病毒，其包含基因区段，该基因区段包括编码轮状病毒非结构蛋白3(NSP3)的第一核苷酸序列和编码选自以下的冠状病毒S蛋白片段的第二核苷酸序列：S1 N端域；具有信号序列的S1 N端域；没有信号序列的S1亚基；S蛋白受体结合域；扩展的S蛋白受体结合域；S2核心域；以及没有跨膜锚定域的S2亚基，其中NSP3和冠状病毒S蛋白片段由单个开放阅读框编码，由自切割蛋白酶域分隔。

在另一个实例(“实例2”)中，在实例1之上进一步，冠状病毒是SARS-CoV-2并且：S1N端域与SEQ ID NO:3至少95％相同；具有信号序列的S1 N端域与SEQ ID NO:4至少95％相同；S蛋白受体结合域与SEQ ID NO：5至少95％相同；延伸的S蛋白受体结合域与SEQ ID NO:9至少95％相同；S2核心域为SEQ ID NO:10的至少95％；并且没有跨膜锚定域的S2亚基与SEQ ID N:11至少95％相同。

在另一个实例(“实例3”)中，在实例1或实例2之上进一步，进一步包含编码选自以下的第二冠状病毒S蛋白片段的第三核苷酸序列：S1 N端域；具有信号序列的S1 N端域；没有信号序列的S1亚基；S蛋白受体结合域；延伸的S蛋白受体结合域；S2核心域；以及没有跨膜锚定域的S2亚基，其中NSP3冠状病毒S蛋白片段和第二冠状病毒S蛋白片段由单个开放阅读框编码，其中NSP3和冠状病毒S蛋白片段由自切割蛋白酶域分隔，并且冠状病毒S蛋白片段和第二冠状病毒片段由分子铰链分隔。

在另一个实例(“实例4”)中，在实例1-3中的任一个之上进一步，自切割蛋白酶域是2A切割元件。

在另一个实例(“实例5”)中，在实例1-4中的任一个之上进一步，自切割蛋白酶域是tesco猪病毒2A(P2A)元件。

在另一个实例(“实例6”)中，在实例1-5中的任一个之上进一步，自切割蛋白酶域是具有与SEQ ID NO:1(SKFQIDKILISGDIELNPGP)有至少80％的序列同一性的序列的P2A元件。

在另一个实例(“实例7”)中，在实例1-7中的任一个之上进一步，编码冠状病毒S蛋白片段的核苷酸序列衍生自选自以下的冠状病毒：SARS-CoV；MERS-CoV；SARS-CoV-2；HCoV-299E；HCoV-OC43；HCoV-HKU1；和HCoV-NL63。

在另一个实例(“实例8”)中，在实例3-7中的任一个之上进一步，编码第二冠状病毒S蛋白片段的第三核苷酸序列衍生自相同或不同的冠状病毒种。

在另一个实例(“实例9”)中，在实例1-8中的任一个之上进一步，重组轮状病毒在施用于受试者时在受试者中诱导针对轮状病毒和冠状病毒的免疫应答。

在另一个实例(“实例10”)中，在实例1-9中的任一个之上进一步，重组轮状病毒基于株G1P[8]。

在另一个实例(“实例11”)中，在实例1-10中的任一个之上进一步，重组轮状病毒是减毒的。

在另一个实例(“实例12”)中，本文提供了包含实例1-11中任一个的重组轮状病毒的免疫原性组合物。

在另一个实例(“实例13”)中，在实例12之上进一步，免疫原性组合物包括药学上可接受的赋形剂。

在另一个实例(“实例14”)中，在实例11或实例12之上进一步，免疫原性组合物被配制用于经口、皮下或肌肉内施用。

在另一个实例(“实例15”)中，本文提供了用于在受试者中诱导针对轮状病毒和冠状病毒的保护性免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用有效量的实例12-14中任一个的免疫原性组合物。

在另一个实例(“实例16”)中，本文提供了包含以下的重组轮状病毒表达系统：非结构蛋白3(NSP3)表达载体，其包含编码轮状病毒(NSP3)的核苷酸序列和编码选自以下的冠状病毒S蛋白片段的核苷酸序列：S1 N端域；具有信号序列的S1 N端域；没有信号序列的S1亚基；S蛋白受体结合域；延伸的S蛋白受体结合域；S2核心域；以及没有跨膜锚定域的S2亚基，其中NSP3和冠状病毒S蛋白片段由单个开放阅读框编码，由自切割蛋白酶域分隔；VP1表达载体；VP2表达载体；VP3表达载体；VP4表达载体；VP5表达载体；VP6表达载体；VP7表达载体；NSP1表达载体；NSP2表达载体；NSP4表达载体；NSP5/6表达载体；和非洲猪瘟病毒NP868R RNA加帽酶表达载体。

在另一个实例(“实例17”)中，在实例16之上进一步，冠状病毒是SARS-CoV-2并且：S1 N端域与SEQ ID NO:3至少95％相同；具有信号序列的S1 N端域与SEQ ID NO:4至少95％相同；S蛋白受体结合域与SEQ ID NO：5至少95％相同；延伸的S蛋白受体结合域与SEQ IDNO:9至少95％相同；S2核心域为SEQ ID NO:10的至少95％；并且没有跨膜锚定域的S2亚基与SEQ ID N:11至少95％相同。

在另一个实例(“实例18”)中，在实例16或实例17之上进一步，重组轮状病毒表达系统包括编码选自以下的第二冠状病毒S蛋白片段的第三核苷酸序列：S1 N端域；具有信号序列的S1 N端域；没有信号序列的S1亚基；S蛋白受体结合域；延伸的S蛋白受体结合域；S2核心域；以及没有跨膜锚定域的S2亚基，其中NSP3冠状病毒S蛋白片段和第二冠状病毒S蛋白片段由单个开放阅读框编码，其中NSP3和冠状病毒S蛋白片段由自切割蛋白酶域分隔，并且冠状病毒S蛋白片段和第二冠状病毒片段由分子铰链分隔。

在另一个实例(“实例19”)中，在实例16-18中的任一个之上进一步，NSP3表达载体、VP1表达载体、VP2表达载体、VP3表达载体、VP4表达载体、VP5表达载体中、VP6表达载体、VP7表达载体、NSP1表达载体、NSP2表达载体、NSP4表达载体、和NSP5/6表达载体中的每一个均为T7表达载体。

在另一个实例(“实例20”)中，在实例16-19中的任一个之上进一步，自切割蛋白酶域是2A切割元件。

在另一个实例(“实例21”)中，在实例16-20中的任一个之上进一步，自切割蛋白酶域是tesco猪病毒2A(P2A)元件。

在另一个实例(“实例22”)中，在实例16-21中的任一个之上进一步，自切割蛋白酶域具有与SEQ ID NO:1(SKFQIDKILISGDIELNPGP)有至少80％的序列同一性的序列。

在另一个实例(“实例23”)中，在实例16-22中的任一个之上进一步，编码冠状病毒S蛋白片段的核苷酸序列衍生自选自以下的冠状病毒：SARS-CoV；MERS-CoV；SARS-CoV-2；HCoV-299E；HCoV-OC43；HCoV-HKU1；和HCoV-NL63。

在另一个实例(“实例24”)中，在实例18-23中的任一个之上进一步，编码第二冠状病毒S蛋白片段的第三核苷酸序列衍生自相同或不同的冠状病毒种。

在另一个实例(“实例25”)中，在实例16-24中的任一个之上进一步，重组轮状病毒表达系统是基于轮状病毒株G1P[8]。

在另一个实例(“实例26”)中，本文提供了用于生产重组轮状病毒的方法，包括用实例16-25中任一个的重组轮状病毒表达系统转染BHK-T7细胞；用MA104细胞过量接种转染的BHK-T7细胞；制备澄清的细胞裂解物；分离重组轮状病毒。

在另一个实例(“实例27”)中，在实例26之上进一步，通过噬斑纯化分离重组轮状病毒。

在另一个实例(“实例28”)中，在实例26或实例27之上进一步，重组轮状病毒是减毒的。

附图说明

下列附图构成本说明书的一部分并且被包括以进一步说明某些实施方案。通过单独参考这些附图中的一个或多个或结合所呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解一些实施方案。

图1轮状病毒种系统发育树的图示。RVA是人轮状病毒疾病的主要原因。

图2具有标记的结构蛋白(左)和显示蛋白质产物的dsRNA基因组区段(右)的轮状病毒衣壳的图示。

图3说明用轮状病毒(+)RNA的载体、ASFV NP868R的CMV载体和p10FAST的pCAG载体转染BHK-T7细胞的示意图。简而言之，转染后三天，BHK-T7细胞在含胰蛋白酶的培养基中用MA104细胞进行过量接种。转染后6天收获组合的BHK-T7/MA104培养物，并通过在MA104细胞中传代扩增重组病毒。

图4A说明由Genewiz合成并插入到CMV启动子下游的pCMV质粒中的ASFV NP868R基因的图；

图4B说明SA11(+)RNA(Addgene)的pCMV-NP868R质粒和pT7质粒的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，SA11(+)RNA(Addgene)用于RG系统以生成重组SA11轮状病毒(rSA11)。

图4C说明与表达牛痘病毒加帽D1R/D12L酶的RG实验相比，在表达ASFV NP868R加帽酶的RG实验中回收的病毒水平的倍数增加的柱形图。

图5说明野生型SA11-4F和具有基因7重排(g7re)的姐妹株的电泳分型的PAGE凝胶的照片。

图6A组(RVA)轮状病毒基因7(NSP3seg)和C组(RVC)轮状病毒基因6(NSP3-dsRBPseg)的蛋白质编码区的图示。RVC 2A中的自切割位点经标记。

图7根据某些实施方案掺入各种SARS-CoV-2S蛋白片段的pT7/NSP3质粒设计的图示。

图8A SARS-CoV-2刺突(S)基因的结构的示意图。

图8B根据某些实施方案可以掺入重组轮状病毒的SARS-CoV-2S蛋白片段的描述。N端域(NTD)；受体结合域(RBD)；信号序列(SS)；跨膜锚定域(TM)。

图8C SARS-CoV-2S蛋白单体的两个3-D渲染图。

图9A根据一个实施方案的轮状病毒反向遗传学系统的示意性表现物。

图9B根据某些实施方案掺入各种诺如病毒VP1的pT7/NSP3质粒设计的图示。

图9C显示编码含有2.9kB区段7RNA而非野生型1.1kB区段7RNA的NSP3-2A-NoV VP1的rRV的基因组的凝胶的照片。

图9D显示含有2.9kB的区段RNA的rRV在感染细胞中产生的VP1二聚体的免疫印迹的照片。

图9E显示编码NSP1和星状病毒VP90蛋白的区段7RNA的凝胶的照片。rRV含有3.6kB区段7RNA，揭示了轮状病毒基因组的显著灵活性及其容纳额外RNA的能力。

图10A rSA11表达的SARS-CoV-2S蛋白的域的示意图。S蛋白三聚体在S1/S2连接处被弗林转化酶原切割，并且在S2’位点被TMPRSS2丝氨酸蛋白酶切割。S1片段含有信号序列(SS)、N端域(NTD)、受体结合域(RBD)、受体结合基序(RBM)、卷曲螺旋(CC)和两个七肽重复(HR1、HR2)。S2片段含有三聚体核心区、跨膜锚定(TM)和融合域。

图10B显示由重组轮状病毒表达的S蛋白的部分的示意图。

图10C三聚体S蛋白(PDB 6VXX)闭合构象的带状表现物，显示RBD(品红色)、延伸的RBD(ExRBD，青色)、NTD(蓝色)、核心(CR，金色)域和S1切割产物(绿色)的位置。

图11具有修饰区段7(NSP3)cDNA的质粒的示意图，该质粒用于生成表达SARS-CoV-2S蛋白区域的rSA11病毒。图示指示NSP3、猪捷申病毒2A元件、3xFLAG(FL)和完整的S1或S1蛋白部分(NTD、ExRBD和RBD)和S2蛋白部分(CR)的编码序列的核苷酸位置。红色箭头表示2A翻译停止重启位点的位置，并且星号表示ORF的末端。编码的NSP3和S产物的大小(aa)在括号中。T7(T7 RNA聚合酶启动子序列)、Rz(丁型肝炎病毒核酶)、UTR(非翻译区)。

图12A显示表达SARS-CoV-2S蛋白区域的rSA11/NSP3-CoV2/S病毒的特性的凝胶的照片。rSA11/NSP3-fS1的双链RNA在MA104细胞中连续传代两次(P1和P2)。

图12B显示表达SARS-CoV-2S蛋白区域的rSA11/NSP3-CoV2/S病毒特性的凝胶的照片。从感染有噬斑纯化的rSA11分离株的MA104细胞中回收dsRNA，通过凝胶电泳解析，并通过溴化乙锭染色检测。rSA11/wt的RNA区段标记为1至11。指示了rSA11分离株的区段7RNA(黑色箭头)的大小(kbp)。

图12C使用MA104细胞进行的并通过结晶紫染色检测的噬斑测定的照片。

图12D显示通过噬斑测定确定的rSA11分离株达到的滴度的图。条表示从三个独立的测定中计算出的标准偏差。

图13A显示rSA11病毒的SARS-CoV-2S产物表达的凝胶的照片。从感染有rSA11病毒的细胞制备整个细胞裂解物(WCL)，并使用FLAG抗体通过免疫印迹测定进行检验，以检测S产物(NTD、ExRBD、RBD、CR、S1和2A通读产物)和对轮状病毒NSP3和VP6和增殖细胞核抗原(PCNA)特异性的抗体。红色星号标识2A通读产物，蓝色星号标识2A切割产物。

图13B显示rSA11病毒的SARS-CoV-2S产物表达的凝胶的照片。从感染有rSA11wt、rSA11/NSP3-fRBD和rSA11/NSP3-fExRBD的MA104细胞制备的裂解物使用对RBD(ProSci9087)、轮状病毒VP6和PCNA特异性的抗体通过免疫印迹法进行检验。

图13C使用SARS-CoV-2S1特异性单克隆抗体(GeneTex CR3022)通过免疫沉淀测定检验的由感染有rSA11/wt、rSA11/NSP3-fRBD和rSA11/NSP3-fExRBD病毒的MA104细胞制备的裂解物的凝胶的照片。还使用NSP2特异性多克隆抗体分析裂解物。使用IgA/G珠回收抗原-抗体复合物，通过凝胶电泳解析，印迹到硝酸纤维素膜上，并用FLAG(fRBD和fExRBD)和NSP2抗体进行探测。指示了分子量标志物(kDa)。红色箭头指示fRBD和fExRBD。fRBD在Ig轻链(Ig/L)附近共迁移。Ig重链，Ig/H)。

图14显示在感染期间rSA11病毒的RBD和ExRBD产生的凝胶的照片。模拟感染或用rSA11/wt、rSA11/NSP3-fRBD或rSA11/NSP3-fExRBD(MOI为5)感染MA104细胞。在0、4、8或12hp.i.从细胞制备裂解物并使用FLAG、NSP3、VP6和PCNA特异性抗体通过免疫印迹测定进行分析。红色星号标识2A通读产物。指示了分子量标志物的位置(kDa)。

图15A显示基因组大小对轮状病毒颗粒密度的影响的凝胶。用rSA11/wt、rSA11/NSP3-fExRBD或rSA11/NSP3-fS1病毒以5的MOI感染MA104细胞。在12h p.i.，回收细胞，通过使用非离子去污剂的处理裂解，并用EDTA处理以将轮状病毒病毒体转化为DLP。通过CsCl梯度离心对DLP进行条带化，并使用折射计测定密度(g/cm³)。

图15B用rSA11/wt、rSA11/NSP3-fExRBD或rSA11/NSP3-fS1病毒以5的MOI感染的MA104细胞的凝胶。在12h p.i.，回收细胞，通过使用非离子去污剂的处理裂解，并用EDTA处理以将轮状病毒病毒体转化为DLP。通过CsCl梯度离心对DLP进行条带化，并使用折射计测定密度(g/cm³)。

图15C合并来自rSA11/wt和rSA11/NSP3-fS1感染细胞的裂解物的凝胶，并通过在CsCl梯度中离心将它们的DLP组分条带化。

图15D从CsCl梯度回收的DLP的dsRNA基因组的电泳谱的照片。RNA衍生自图A中的DLP。rSA11/wt的RNA区段标记为1至11。区段7RNA的位置用红色箭头表示。

图15E从CsCl梯度回收的DLP的dsRNA基因组的电泳谱的照片。RNA衍生自图B和C中的DLP。rSA11/wt的RNA区段标记为1至11。区段7RNA的位置用红色箭头表示。

图16A显示表达SARS-CoV-2S域的rSA11株的遗传稳定性的凝胶的照片。rSA11株在MA104细胞中连续传代5至6次(P1至P5或P6)。从感染细胞的裂解物中回收基因组RNA，并通过凝胶电泳进行分析。标记了病毒基因组区段的位置。引入rSA11株中的修饰区段7(NSP3)dsRNA的位置用黑色箭头表示。rSA11/NSP3-fS1的修饰区段7(NSP3)dsRNA的遗传不稳定性在连续传代期间产生R1-R4 RNA。

图16B显示从P6 rSA11/NSP3-fS1的大(L1-L4)和小(S1-S4)噬斑分离株制备的基因组RNA的凝胶的照片。区段7RNA被鉴定为R1-R3，如(A)中所示。

图16C显示通过对L1、S1和S3噬斑分离株的区段7RNA测序确定的R1-R3序列的组织的示意图。序列缺失用虚线表示。不再由R1-R3区段7RNA编码的S1 ORF区域由绿色-白色斜线框表示。

图17重组tRV/NSP-3-2A-CoV2株的特性的汇总。

图18用于产生pT7/NSP3-2A-CoV2质粒的引物的汇总。

定义

如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数引用，除非另有说明。

除非另有明确说明或暗示，否则本文使用的术语“治疗”包括向人或动物患者施用至少一剂药物配制剂。“治疗”还指降低至少一种疾病的可能性和/或严重性以及限制疾病的长度/持续时间或疾病的严重性，或诱导保护性免疫应答。治疗患者可以或可以不导致疾病或病症的治愈。术语“治疗”是指对特定疾病、病症或病况的一种或多种症状或诱因的部分或完全减轻、改善、延迟发作、改善、抑制发生或进展、减轻和/或降低发生率。该术语还指抑制患者的感染。可以对未表现出疾病、病症和/或病况的体征的受试者和/或仅表现出疾病、病症和/或病况(包括感染)的早期体征的受试者施用治疗，以用于降低发生与疾病、病症和/或病况相关的病理学的风险的目的。

如本文所用，除非另有明确说明或明确暗示，术语“治疗有效剂量”、“治疗有效量”、“有效剂量”等是指重组轮状病毒的任何量，其对人或其他动物的健康和福祉具有净积极效果。治疗效果可以包括寿命、生活质量等的改善，并且还可以包括降低对发展疾病、病症和/或病况的易感性，或者减缓或防止健康或福祉的恶化。治疗效果可以在单次剂量和/或治疗后实现，或者它们可以在一系列剂量和/或治疗后实现。“治疗有效量”或“有效量”一般是指当施用于受试者或动物以治疗疾病或在受试者或动物中引发免疫应答时，以适用于医学治疗的合理收益/风险比，足以影响疾病、病症和/或病况的期望治疗程度，或引发保护性免疫应答的任何量。任何特定受试者的具体治疗有效剂量可以取决于多种因素，包括所治疗的特定疾病、病症和/或病况；所用具体重组轮状病毒的毒力；所用具体药物组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间和施用途径；治疗的持续时间；以及医学领域众所周知的类似因素。

本文所述的药物配制剂可适用于经口、胃肠外(包括皮下、皮内、肌肉内和静脉内)和/或直肠施用。配制剂可以以单位剂型存在并且可以通过药学领域众所周知的任何方法制备。所有方法都包括使活性成分(即本公开的重组轮状病毒)与载剂缔合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载剂或细碎的固体载剂或两者均匀且紧密地缔合，然后如果需要，使缔合的混合物形成期望的剂型来制备配制剂。

适用于经口施用的本公开的药物配制剂可以呈现为离散单元，如胶囊剂、扁囊剂、片剂或锭剂，每个含有预定量的活性成分；作为粉末或颗粒；作为在水性液体或非水性液体如糖浆、酏剂或饮剂中的溶液或混悬液，或作为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂。配制剂也可以是丸剂、药糖剂或糊剂。

适用于胃肠外施用的本公开的药物配制剂可以包括水性和非水性无菌注射溶液，并且还可以包括佐剂、抗氧化剂；缓冲剂；抑菌剂；使组合物与接受者的血液等渗的溶液；可以含有例如助悬剂和增稠剂的水性和非水性无菌混悬液。配制剂可以存在于单个单位剂量或多剂量容器中，并且可以在冻干条件下储存，在使用前需要添加无菌液体载剂。

除非另有说明或暗示，否则术语“药学上可接受的载剂或赋形剂”可以在本文中用于描述除可以包括在配制剂中的活性组分之外的任何成分(例如，载剂和佐剂)。载剂和/或佐剂的选择在很大程度上取决于如特定施用方式、载剂对溶解度和稳定性的影响以及剂型的性质等因素。

除非另有明确说明或明确暗示，术语“免疫原性组合物”可用于指在引入受试者时在受试者中诱导免疫应答的组合物(例如，药物配制剂)；例如疫苗。

发明详述

本文的实施方案提供重组轮状病毒及其免疫原性组合物的组合物、方法、用途和制造规程。一些实施方案涉及组合物，其包含但不限于在针对受试者的轮状病毒感染和冠状病毒感染的免疫原性组合物中使用的嵌合轮状病毒。在某些实施方案中，使用包括编码轮状病毒NSP3和一个或多个冠状病毒刺突(S)蛋白片段的表达载体的轮状病毒反向遗传学系统生成重组轮状病毒。

图1描绘了轮状病毒种的系统发育树。RVA是人轮状病毒疾病的主要原因。现在参考图2，轮状病毒具有无包膜的二十面体衣壳，其包裹由双链(ds)RNA的11个区段组成的基因组。轮状病毒分离株的G和P基因型分别由外衣壳蛋白VP7(糖蛋白)和VP4(蛋白酶敏感的附着蛋白)定义。轮状病毒基因组区段大部分是单顺反子，含有编码结构蛋白(VP1-VP4、VP6-VP7)或非结构蛋白(NSP1-NSP6)的单个开放阅读框(ORF)。非结构蛋白中的两种，即干扰素拮抗剂NSP1和翻译调节剂NSP3，对于细胞培养中的病毒复制不是必需的；然而，这些蛋白质可能影响后代产率。在轮状病毒基因组复制过程中，病毒(+)RNA不仅指导蛋白质合成，而且还充当dsRNA合成的模板。区段5编码干扰素拮抗剂NSP1，即一种非必需病毒蛋白。其他人已使用RG系统生成具有修饰的区段5RNA的重组轮状病毒，其表达截短的NSP1和GFP以及UnaG报告蛋白。使用该系统，已经制备了重组SA11病毒，其中segNSP1的ORF已部分缺失并替换为外来报告蛋白(eGFP或mCherry)。然而，没有报道过重组轮状病毒在不牺牲其中一个病毒ORF的编码潜力的情况下表达外来蛋白。

在第一方面，本文提供了重组轮状病毒表达系统轮状病毒。在某些实施方案中，重组轮状病毒表达系统包含轮状病毒非结构蛋白3(NSP3)表达载体，其包括编码轮状病毒(NSP3)的核苷酸序列和编码冠状病毒S蛋白片段的核苷酸序列。在此类实施方案中，NSP3和冠状病毒S蛋白片段由单个开放阅读框编码，由自切割蛋白酶域分隔。重组轮状病毒表达系统进一步包括VP1表达载体；VP2表达载体；VP3表达载体；VP4表达载体；VP5表达载体；VP6表达载体；VP7表达载体；NSP1表达载体；NSP2表达载体；NSP4表达载体；NSP5/6表达载体；和非洲猪瘟病毒(ASFV)NP868R RNA加帽酶表达载体。与依赖区段5的修饰的以往重组轮状病毒表达系统不同，区段7的修饰(如在本系统中所做的那样)不会导致区段ORF任何部分的中断或缺失。重组轮状病毒表达系统允许将最多达2.5kB的外来(即非轮状病毒)序列添加到轮状病毒基因组中。

用于表达VP1-VP7、NSP1-NSP5/6和ASFV NP868R RNA加帽酶的表达载体可以是能够在选定细胞系中表达的任何合适的表达载体。在一些实例中，BHK-T7细胞用重组轮状病毒表达系统转染，因此用于表达VP1-VP7、NSP1-NSP5/6的表达载体为T7表达载体。在一些实施方案中，用于表达ASFV NP868R RNA加帽酶的表达载体是CMV表达载体。

在NSP3多肽与冠状病毒S蛋白片段之间提供自切割蛋白酶域，使NSP3与冠状病毒S蛋白片段在翻译过程中自动分离。也就是说，自切割蛋白酶域将NSP3与非轮状病毒多肽分隔。

在某些实施方案中，自切割蛋白酶域是2A切割元件。许多病毒使用2A“自切割”元件从单个ORF生成不止一种蛋白质。2A元件的长度为约20个氨基酸，并以保守的Pro-Gly-Pro基序结尾。在2A元件的翻译过程中，核糖体无法在Gly-Pro残基之间形成肽键，从而将残基上游合成的蛋白质产物与残基下游合成的任何蛋白质产物断开。2A元件的存在导致上游蛋白质以一些额外的2A衍生残基结束，而下游多肽以Pro残基开始。在特定实施方案中，自切割蛋白酶是tesco猪病毒2A(P2A)元件。P2A元件具有序列SKFQIDKILISGDIELNPGP(SEQ IDNO：1)。在一些实施方案中，2A元件具有与SEQ ID NO：1有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的序列。

在一些实施方案中，编码冠状病毒S蛋白片段的核苷酸序列衍生自冠状病毒，例如但不限于SARS-CoV；MERS-CoV；SARS-CoV-2；HCoV-299E；HCoV-OC43；HCoV-HKU1；和HCoV-NL63。

HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1在局部流行，并且主要与轻度自限性疾病(例如，普通感冒)有关。SARS-CoV引起严重急性呼吸系统综合征(SARS)，其中2003年2月在亚洲首次报告病例。该病毒传播到二十多个国家，其中全球有约8,000人患上SARS。2003年SARS疫情得到遏制，并且自2004年以来没有报告SARS病例。MERS-CoV同样会导致严重的急性呼吸道疾病(中东呼吸综合征，或MERS)。MERS-CoV于2012年在沙特阿拉伯首次发现，其不容易在人与人之间传播；人与人之间的传播主要发生在医疗机构。SARS-CoV-2经测序鉴定为属于sarbecovirus的β冠状病毒，与SARS-CoV具有75-80％的基因序列相似度。

与其他冠状病毒一样，SARS-CoV-2是包膜病毒，其特征在于存在由病毒刺突(S)蛋白的三聚体形成的大刺突。除介导病毒进入之外，S蛋白还是宿主免疫应答的主要诱导物。冠状病毒S蛋白包括大的胞外域、单次跨膜锚定域和短的细胞内尾。胞外域包括受体结合亚基S1和膜融合亚基S2。S蛋白已被证明在感染期间由宿主细胞蛋白酶在S1/S2切割位点切割。在病毒进入期间，S1与宿主细胞上的受体结合导致病毒附着，而S2融合宿主和病毒膜，使病毒基因组进入宿主细胞。受体结合和膜融合是冠状病毒感染周期的早期和必要条件。

SARS-CoV S1亚基包括保守的受体结合域(RBD)，其识别血管紧张素转化酶2(ACE2)。SARS-CoV S1亚基的14aa域已被证明与ACE2复合。其中八个残基在SARS-CoV-2中严格保守，表明ACE2是SARS-CoV-2的受体。这种受体结合基序(RBM)指导与ACE2的特异性结合。S1亚基还包括信号序列(SS)。S2域负责S蛋白同源三聚化并且包括核心和跨膜锚定域，它们充当融合域，经由病毒包膜与宿主细胞膜的融合促进病毒进入。

在某些实施方案中，冠状病毒S蛋白片段是以下之一：S1亚基N端域；具有信号序列的S1亚基N端域；S1受体结合域；受体结合域的延伸形式；缺少信号序列的S1亚基；S2核心域；或缺少跨膜锚定域的S2亚基。

在特定的实施方案中，冠状S蛋白片段是SARS-CoV-2S蛋白片段。图8A描绘了SARS-CoV-2刺突基因。如图所示，S1和S2亚基由弗林蛋白酶裂解产生。S1片段包括信号序列(SS)、N端域(NTD)、受体结合域(RBD)和受体结合基序(RBM)。S2亚基包括三聚体核心区域和跨膜(TM)锚定域。图8B提供了可以由本文所述的重组轮状病毒表达系统表达的SARS-CoV-2S蛋白S1和S2亚基的那些域。图8B提供了大小和位置信息，其中位置信息是参考SARS-CoV-2S蛋白的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：2)提供的。图8C提供了SARS-CoV-2S蛋白单体的3维图示，确定了RBD、延伸RBD、NTD和核心域的位置。

在其中S蛋白片段是SARS-CoV-2S蛋白片段的那些实施方案中：全长S蛋白与SEQID NO:2共享至少95％的氨基酸序列同一性；S1 N端域具有与SEQ ID NO：2的氨基酸15-294(SEQ ID NO：3)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；具有信号序列的S1 N端域具有与SEQ ID NO:2的氨基酸1-294(SEQ ID NO:4)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；没有信号序列的S1亚基具有与SEQ ID NO：2的氨基酸15-685共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；S蛋白受体结合域具有与SEQ ID NO:2的氨基酸335-523(SEQ ID NO:5)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；延伸的S蛋白受体结合域具有与SEQ ID NO:2的氨基酸311-599(SEQ ID NO:9)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；S2核心域具有与SEQ ID NO:2的氨基酸711-1077(SEQ ID NO:10)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且没有跨膜锚定域的S2亚基具有与SEQ ID NO：2的氨基酸686-1194(SEQ ID NO：11)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。NSP3-P2A-冠状病毒S蛋白片段的图示在图7中提供。

在其他实施方案中，S蛋白片段衍生自SARS-CoV-2以外的冠状病毒，例如SARS-CoV；MERS-CoV；HCoV-299E；HCoV-OC43；HCoV-HKU1；和HCoV-NL63。

在其中S蛋白片段是SARS-CoV S蛋白片段的那些实施方案中：全长S蛋白与SEQ IDNO:12共享至少95％的氨基酸序列同一性；S1 N端域具有与SEQ ID NO:12的氨基酸16-281(SEQ ID NO:13)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；具有信号序列的S1 N端域具有与SEQ ID NO:12的氨基酸1-281(SEQ ID NO:14)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；没有信号序列的S1亚基具有与SEQ ID NO:12的氨基酸16-685共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；S蛋白受体结合域具有与SEQ ID NO:12的氨基酸322-509(SEQ ID NO:15)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；延伸的S蛋白受体结合域具有与SEQ ID NO:12的氨基酸298-585(SEQ ID NO:17)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；S2核心域具有与SEQ ID NO:12的氨基酸693-1059(SEQ ID NO:18)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且没有跨膜锚定域的S2亚基具有与SEQ IDNO：12的氨基酸686-1194(SEQ ID NO：19)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在其中S蛋白片段是MERS-CoV S蛋白片段的那些实施方案中：全长S蛋白与SEQ IDNO:20共享至少95％的氨基酸序列同一性；S1 N端域具有与SEQ ID NO:20的氨基酸26-342(SEQ ID NO:21)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；具有信号序列的S1 N端域具有与SEQ ID NO:20的氨基酸1-342(SEQ ID NO:22)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；没有信号序列的S1亚基具有与SEQ ID NO:20的氨基酸26-768共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；S蛋白受体结合域具有与SEQ ID NO:20的氨基酸383-579(SEQ ID NO:23)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；延伸的S蛋白受体结合域具有与SEQ ID NO:20的氨基酸359-663(SEQ ID NO:24)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；S2核心域具有与SEQ ID NO:20的氨基酸776-1151(SEQ ID NO:25)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且没有跨膜锚定域的S2亚基具有与SEQ IDNO：20的氨基酸769-1277(SEQ ID NO：26)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在其中S蛋白片段是HCoV-299E S蛋白片段的那些实施方案中：全长S蛋白与SEQID NO:27共享至少95％的氨基酸序列同一性；S1 N端域具有与SEQ ID NO:27的氨基酸8-151(SEQ ID NO:28)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；具有信号序列的S1N端域具有与SEQ ID NO:27的氨基酸1-293(SEQ ID NO:29)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；没有信号序列的S1亚基具有与SEQ ID NO:27的氨基酸8-581共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；S蛋白受体结合域具有与SEQ ID NO:27的氨基酸192-424(SEQ ID NO:30)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；延伸的S蛋白受体结合域具有与SEQ ID NO:27的氨基酸167-5065(SEQ ID NO:31)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；S2核心域具有与SEQ ID NO:27的氨基酸582-962(SEQ ID NO:32)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且没有跨膜锚定域的S2亚基具有与SEQ ID NO：27的氨基酸582-1096(SEQ ID NO：33)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在其中S蛋白片段是HCoV-OC43 S蛋白片段的那些实施方案中：全长S蛋白与SEQID NO:34共享至少95％的氨基酸序列同一性；S1 N端域具有与SEQ ID NO:34的氨基酸21-293(SEQ ID NO:35)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；具有信号序列的S1N端域具有与SEQ ID NO:34的氨基酸1-293(SEQ ID NO:36)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；没有信号序列的S1亚基具有与SEQ ID NO:34的氨基酸21-772共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；S蛋白受体结合域具有与SEQ ID NO:34的氨基酸335-599(SEQ ID NO:37)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；延伸的S蛋白受体结合域具有与SEQ ID NO:34的氨基酸310-683(SEQ ID NO:38)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；S2核心域具有与SEQ ID NO:34的氨基酸780-1161(SEQ ID NO:39)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且没有跨膜锚定域的S2亚基具有与SEQ ID NO：34的氨基酸773-1278(SEQ ID NO：40)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在其中S蛋白片段是HCoV-HKU1 S蛋白片段的那些实施方案中：全长S蛋白与SEQID NO:41共享至少95％的氨基酸序列同一性；S1 N端域具有与SEQ ID NO:41的氨基酸20-285(SEQ ID NO:42)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；具有信号序列的S1N端域具有与SEQ ID NO:41的氨基酸1-285(SEQ ID NO:43)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；没有信号序列的S1亚基具有与SEQ ID NO:41的氨基酸20-774共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；S蛋白受体结合域具有与SEQ ID NO:41的氨基酸327-599(SEQ ID NO:44)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；延伸的S蛋白受体结合域具有与SEQ ID NO:41的氨基酸302-683(SEQ ID NO:45)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；S2核心域具有与SEQ ID NO:41的氨基酸782-1162(SEQ ID NO:46)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且没有跨膜锚定域的S2亚基具有与SEQ ID NO：41的氨基酸775-1281(SEQ ID NO：47)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在其中S蛋白片段是HCoV-NL63 S蛋白片段的那些实施方案中：全长S蛋白与SEQID NO:48共享至少95％的氨基酸序列同一性；S1 N端域具有与SEQ ID NO:48的氨基酸32-334(SEQ ID NO:49)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；具有信号序列的S1N端域具有与SEQ ID NO:48的氨基酸1-334(SEQ ID NO:50)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；没有信号序列的S1亚基具有与SEQ ID NO:48的氨基酸32-762共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；S蛋白受体结合域具有与SEQ ID NO:48的氨基酸375-605(SEQ ID NO:51)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；延伸的S蛋白受体结合域具有与SEQ ID NO:48的氨基酸350-687(SEQ ID NO:52)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；S2核心域具有与SEQ ID NO:48的氨基酸763-1143(SEQ ID NO:53)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且没有跨膜锚定域的S2亚基具有与SEQ ID NO：48的氨基酸763-1277(SEQ ID NO：54)共享至少95％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，单个开放阅读框编码轮状病毒NSP3和两个冠状病毒S蛋白片段。两个冠状病毒S蛋白片段可以是相同的S蛋白片段、来自相同冠状病毒种的两个不同的S蛋白片段、来自两个不同冠状病毒种的直系同源S蛋白片段、或者来自两个不同冠状病毒种的非直系同源S蛋白片段。在某些实施方案中，两个冠状病毒S蛋白片段串联，由分子铰链分隔。合适的分子铰链是本领域已知的，并且包括例如GGSGGS(SEQ ID NO：55)。

例如，单个轮状病毒ORF可以编码轮状病毒NSP3和两个拷贝的SARS-CoV-2受体结合域(RBD)(即两个拷贝的SEQ ID NO:5)。当通过接头GGSGGS(SEQ ID NO：55)分隔时，2xSARS-CoV-2S1 RBD肽具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列。进一步的实例包括但不限于SARS-CoV-2/SARS-CoV S1 RBD(SEQ ID NO：7)、SARS-CoV/SARS-CoV-2S1 RBD(SEQ ID NO：8)和2xSARS-CoV RBD(SEQ ID NO：16)。还考虑了包括非RBD域以及来自其他冠状病毒种的S蛋白片段的其他组合。

在某些实施方案中，2A元件与荧光报告蛋白融合以允许构建体表达的可视化。

在特定的实施方案中，冠状病毒S蛋白片段能够诱导针对其起源的冠状病毒的免疫应答。在此类实施方案中，所得重组轮状病毒表达轮状病毒多肽和冠状病毒S蛋白片段，允许重组轮状病毒用作双重疫苗，引发针对轮状病毒和冠状病毒的保护性免疫应答。在来自两个不同冠状病毒种的S蛋白片段由单个NSP3 ORF编码的实施方案中，重组轮状病毒表达轮状病毒NSP3和每个冠状病毒种的S蛋白片段，允许重组轮状病毒用作三价疫苗，引发对轮状病毒和两个冠状病毒种的保护性免疫应答。

在一些实施方案中，重组轮状病毒表达系统基于轮状病毒株G1P[8]。也就是说，一个或多个轮状病毒基因区段(即VP1-VP7区段以及NSP1-NSP5/6区段)源自株G1P[8]。在一些实施方案中，重组轮状病毒表达系统包括来自两种或更多种病毒轮状病毒株的基因区段，产生重配病毒。例如，在一些实施方案中，至少一个基因区段是人G1P[8]株基因区段，并且至少一个基因区段是猿猴SA11株基因区段。在其他实施方案中，重组轮状病毒表达系统的所有轮状病毒基因区段均为G1P[8]株基因区段。

在一些实施方案中，重组轮状病毒表达系统和表达的重组轮状病毒可以定制以用于例如人、家畜或家禽。使用特定的轮状病毒株作为表达系统或重组病毒的基础，或者使用两个或更多种轮状病毒株来产生重配病毒，重组轮状病毒表达系统和所得重组轮状病毒可以加尾以用于期望的物种。

在另一方面，本文提供可以从本文所述的重组轮状病毒表达系统获得的重组轮状病毒。在一些实施方案中，可以从本文所述的重组轮状病毒表达系统获得的重组轮状病毒以整体表达除冠状病毒S蛋白片段之外的全部轮状病毒蛋白。如上所述，在一些实施方案中，冠状病毒S蛋白片段可以诱导针对除轮状病毒之外的一个或多个冠状病毒种的免疫应答。就此而言，重组轮状病毒可以同时赋予对两种不同病毒的双重免疫，或同时赋予对三种不同病毒的三价免疫。

由于重组轮状病毒是从所述重组轮状病毒表达系统获得的，因此其必然包括编码轮状病毒非结构蛋白3(NSP3)的核苷酸序列和编码冠状病毒S蛋白片段(或串联的两个冠状病毒S蛋白片段)的核苷酸序列，其中NSP3和冠状病毒S蛋白片段由单个开放阅读框编码，由自切割蛋白酶域分隔。上文提供了关于重组轮状病毒表达系统的这些元件的细节。

在一些实施方案中，重组轮状病毒是减毒的。减毒的轮状病毒株是已知的，如减毒的G1P[8]。因此，在一些实施方案中，重组轮状病毒表达系统和所得重组轮状病毒可以基于减毒株。

在另一方面，本文提供包含本文所述的重组轮状病毒的免疫原性组合物。免疫原性组合物可以进一步包含例如药学上可接受的赋形剂。可以配制免疫原性组合物用于向受试者施用以经口、皮下、肌肉内、皮内、鼻内、局部、透皮、胃肠外、胃肠道、经支气管、经肺泡或经粘膜递送。在一些实施方案中，免疫原性组合物被配制用于经口、皮下或肌肉内施用。

在另一方面，本文提供了在受试者中诱导针对轮状病毒和第二种病毒的保护性免疫应答的方法。在一些实施方案中，此类方法包括向受试者施用有效量的上述免疫原性组合物。

在另一方面，本文提供了用于产生重组轮状病毒的方法。在某些实施方案中，此类方法包括用本文所述的重组轮状病毒表达系统转染BHK-T7细胞；用MA104细胞过量接种转染的BHK-T7细胞；制备澄清的细胞裂解物；以及分离重组轮状病毒。在一些实施方案中，用于转染BHK-T7细胞的质粒混合物包括1x水平的编码VP1-VP7、NSP1、NSP3和NSP4的质粒载体，以及约3x水平或更高水平的编码NSP2和NSP5的质粒载体。转染的BHK-T7细胞用MA104细胞过量接种以促进重组轮状病毒的扩增。与这些实施方案一致，该方法可以进一步包括冻融BHK-T7/MA104细胞培养物的步骤。例如，在BHK-T7/MA104细胞中扩增重组轮状病毒后，可以将细胞冻融三次。在一些实施方案中，细胞以低速离心以去除大碎片。在某些实施方案中，细胞裂解物中的重组病毒通过在MA104细胞中传代而扩增、分离噬斑并在MA104细胞中再次扩增。

在一些实施方案中，重组轮状病毒通过噬斑纯化分离。在某些实施方案中，产生的重组轮状病毒是减毒的。在一些实施方案中，反向遗传学用于生成重组轮状病毒，其表达作为单独的产物的SARS-CoV-2S蛋白的部分，包括其免疫显性RBD。这些实施方案可以包括COVID-19组合疫苗，该疫苗可以诱导针对轮状病毒和SARS-CoV-2的免疫保护应答。在一些实施方案中，这种组合疫苗用于婴儿和幼儿。这些实施方案中的一些允许通过搭载在美国和许多其他发达国家和发展中国家使用的当前轮状病毒免疫项目来广泛分发和施用靶向COVID-19的疫苗。

一些实施方案包括18.6kbp的轮状病毒dsRNA，其包含多达2.2-kbp的外来序列，足以编码SARS-CoV-2S1蛋白。1.0-1.5kbp的额外序列提供的编码能力足以产生编码SARS-CoV-2NTD、RBD或S2核心的重组轮状病毒，以及可以促进S产物与抗原呈递细胞和幼稚B淋巴细胞接合的运输信号。

实施例

Kanai等人,Entirely plasmid-based reverse genetics system forrotaviruses,PROC NATL ACAD SCI USA 2017；114(9):2349-2354开发了基于质粒的反向遗传学(RG)系统，允许对猿猴轮状病毒SA11的11个dsRNA基因组区段中的任何一个进行遗传修饰。RG系统包括十一个SA11 T7转录载体和三个CMV支持载体——两个表达牛痘病毒D1R和D12L RNA加帽酶，并且一个表达呼肠孤病毒p10FAST融合蛋白。

为了增强通过RG系统的重组病毒的回收，合成了非洲猪瘟病毒(ASFV)NP868R的加帽酶基因，一种具有三磷酸酶、尿苷转移酶(guanylyltransferase)和甲基转移酶活性的蛋白质。然后，将表达牛痘病毒D1R/D12L的两个支持载体替换为表达非洲猪瘟病毒(ASFV)NP868R RNA加帽酶的单个载体。因此，修饰后的RG系统含有表达SA11(+)RNA的十一个(pT7)T7启动子质粒，表达AFSV NP868R加帽酶的CMV启动子质粒，以及表达p10FAST融合蛋白的pCAG载体。现在参考图3，在这个修饰的轮状病毒RG系统中，表达T7聚合酶的幼仓鼠肾细胞(BHK-T7)由用于轮状病毒(+)RNA的T7载体、用于ASFV NP868R的CMV载体和用于p10FAST的pCAG载体转染。转染后三天，BHK-T7细胞在含胰蛋白酶的培养基中用MA104细胞过量接种。转染后六天收获组合的BHK-T7/MA104培养物，并通过在MA104细胞中传代扩增重组病毒。

现在参考图4，实验表明用NP868R表达载体替换D1R/D12L支持载体增强了从轮状病毒RG系统的重组病毒的回收。相比牛痘病毒加帽D1R/D12L酶，在表达ASFV NP868R加帽酶的RG实验中回收的重组病毒多约10倍。(图4C)。修改的RG系统使用单个支持质粒(NP868R)替换最初描述的两个支持质粒(牛痘病毒D1R和D12L)以生成加帽活性。与牛痘病毒D1R和D12L加帽酶相比，ASFV NP868R加帽酶促进重组病毒更大的回收。

11个轮状病毒基因组区段的总大小为约18.5kB。然而，已经回收了许多天然存在的轮状病毒变体，具有显著更大的基因组，在一些情况下接近20kB。增加的大小通常是由于基因组区段内序列重复的引入，产生在凝胶电泳时显示异常基因组谱的病毒变体(图5)。最常表征的轮状病毒变体在segNSP1和segNSP3 dsRNA中具有序列重复。迄今为止描述的最长的segNSP1重复为约1.2kB。最长的segNSP3重复为约0.9kB，产生具有约2.0kB的大小的非典型基因组区段而非其约1.1kB大小的野生型。值得注意的是，这些轮状病毒变体在遗传上是稳定的，并且通常与野生型病毒一样生长。也可能使用RG系统来创建遗传稳定的重组轮状病毒，以保持序列重复。因此，轮状病毒携带大于1kB的额外遗传信息的能力表明，有可能重新工程化改造病毒以产生大小超过300个氨基酸的外来蛋白质。

许多病毒使用2A“自切割”元件从单个ORF生成超过一种蛋白质。2A元件的长度为约20个氨基酸，并以保守的Pro-Gly-Pro基序结尾。在2A元件的翻译过程中，核糖体无法在Gly-Pro残基之间形成肽键，从而将残基上游合成的蛋白质产物与残基下游合成的任何蛋白质产物断开。2A元件的存在导致上游蛋白质以一些额外的2A衍生的残基结束，而下游多肽以Pro残基起始。虽然A组轮状病毒与配制轮状病毒疫苗的那些轮状病毒一样，不使用2A元件以产生病毒蛋白，但C组轮状病毒可以。特别是，C组病毒的segNSP3dsRNA含有ORF，该ORF编码功能和结构上与RVA NSP3相似的NSP3蛋白，但由于下游2A元件，还产生第二种蛋白(dsRBP)-抑制蛋白激酶R(PKR)激活的双链RNA结合蛋白(参见图6)。基于C组segNSP3 dsRNA的特性，可以创建具有类似segNSP3 dsRNA的A组轮状病毒(即表达功能性NSP3蛋白，并通过下游放置2A元件表达第二种外来蛋白的轮状病毒)。优先使用2A元件来驱动呼肠孤病毒科的其他成员的额外蛋白质表达。例如，已经生成了具有指导HIV gag蛋白和鳗鱼epi荧光绿蛋白(UnaG)表达的2A元件的重组哺乳动物呼肠孤病毒。最近，已经描述了含有重新工程化改造的segNSP1dsRNA的重组轮状病毒，其中NSP1 ORF已大部分替换为融合至荧光报告蛋白的2A元件。在本公开中，2A自切割元件用于产生重组SA11轮状病毒，其表达所有12种病毒蛋白以及另外的单独外来蛋白。

修改的反向遗传学系统。由Kanai等人开发的基于质粒的轮状病毒RG系统依赖于用三种质粒共转染BHK-T7细胞：(1)指导11种轮状病毒(+)RNA表达的十一个T7转录(pT7)载体；(2)指导牛痘病毒D1R和D12L RNA加帽酶表达的两个CMV-pol II质粒；(3)指导禽呼肠孤病毒p10FAST融合蛋白表达的CMV-pol II质粒。该系统效率低下，导致发明人做出改变，将重组病毒的回收率提高至少10倍(图4)。使用修改的系统，已经生成了在若干基因组区段(例如，NSP1、NSP2、NSP3和/或VP3)中具有突变的重组SA11病毒。对RG系统所做的主要改变是用编码非洲猪瘟病毒(ASFV)NP868R加帽酶的单个质粒替换牛痘病毒加帽酶复合物的两个质粒，并停止使用p10FAST质粒。这些结果表明，表达p10FAST的载体不再是本文公开的修改反向遗传学系统所必需的。

这种修改的反向遗传学系统及其表达外来蛋白的能力描述于Philip等人,JVirol 2019Nov 26；93(24).pii:e01616-19；Philip等人,Microbiol Resour Announc2019Jul 3；8(27).pii:e00523-19；以及Philip等人,J Vis Exp 2020,e61039(印刷中)，其中每篇文章均通过引用整体明确并入。发现重组轮状病毒生长良好，遗传稳定，并高效表达外来蛋白。生成的重组轮状病毒包括表达人诺如病毒(NoV；CP1、P或P2)、戊型肝炎病毒(HEV；VP1)；和人星状病毒(HAstrV；VP34、VP70或VP90)的全部或部分衣壳蛋白的那些。表达各种荧光报告蛋白的重组轮状病毒也已成功生成，并在本文中得到考虑。

图9突出了发明人回收表达外来抗原的重组轮状病毒(rRV)的能力。图9A说明了用于用编码NSP3和外来抗原(NoV VP1)作为单独蛋白质的类似区段替代轮状病毒区段7(NSP3)RNA的反向遗传学。图9B说明了用于将来自区段7的NSP3和NoV VP1作为单独的蛋白质表达的质粒设计，其由插入的2A自切割元件驱动。编码NSP3-2A-NoV VP1的rRV基因组含有2.9kB区段7RNA而非野生型1.1kB区段7RNA(参见图9C)。含有2.9kB区段RNA的rRV在感染细胞中产生VP1二聚体(参见图9D)。类似的方法用于生成具有编码NSP1和星状病毒VP90蛋白的区段7RNA的rRV。rRV含有3.6kB区段7RNA，揭示了轮状病毒基因组的显著灵活性及其容纳额外RNA的能力(参见图9E)。

为了生成表达外来蛋白质的重组轮状病毒，使用基于T7转录载体的反向遗传学系统来用编码与外来蛋白质融合的NSP3的ORF替换轮状病毒区段7dsRNA的NSP3 ORF。插入融合连接处的是经设计以指导NSP3和外来蛋白的单独表达的猪捷申病毒2A样翻译停止重启(自切割)元件。在一些情况下，3xFLAG和6xHis标签被放置在外来ORF序列的末端，以促进外来蛋白质的检测。通过区段7的工程化，发明人确定可以将多达2.5kB的外来序列添加到轮状病毒基因组中，并且可以生成表达大尺寸外来蛋白的重组轮状病毒，大尺寸外来蛋白包括56kDa的NoV VP1蛋白，以及分别为70和90kDa的HAstrV VP70和VP90蛋白。

用于生成重组病毒的方法。Kanai等人(2017)报告的基于质粒的反向遗传学系统的修改用于生成rRV。第0天：在不含G418的Glasgow/FBS+培养基中将BHK-T7细胞接种到12孔板(约2x 10⁵个细胞/孔)中。第1天：制备含有0.8μg的11种SA11轮状病毒pT7质粒中的每一种和0.8μg的pCMV-NP868R的质粒混合物。将质粒组合添加到100μl预热(37℃)Opti-MEM(Gibco，31985-070)中，并通过轻轻上下移液混合。然后，添加25μl TransIT-LTI转染试剂(Mirus，MIR2305)，并将转染混合物轻轻涡旋并在室温下温育20分钟。在温育期间，将12孔板中的BHK-T7细胞用Glasgow/FBS-完全培养基清洗一次，并用1ml SMEM完全培养基[MEMEagle Joklik(Lonza 04-719Q)、10％胰蛋白胨-肽肉汤、2％ NEAA、1％青霉素-链霉素、1％谷氨酰胺)覆盖细胞。将转染混合物逐滴添加到12孔板中的SMEM完全培养基中，然后将板放回37℃、5％ CO₂培养箱中。第3天：将0.25ml不含M199/FBS的完全培养基中的2x10⁵ MA104细胞与最终浓度为0.5μg/ml的胰蛋白酶一起添加到板孔中。第6天：将板中的细胞冻融3次并将裂解物置于1.5ml微量离心管中。以500x g离心10分钟(4℃)后，将300μl澄清的裂解物转移到含有2ml不含M199/FBS的完全培养基和0.5μg/ml胰蛋白酶的6孔板中的MA104单层上。将板在37℃、5％ CO₂培养箱中温育7天或直至观察到完全细胞病变效应(CPE)。通常，对于含有rRV的孔，完全CPE发生在4-6天。重组病毒经过噬斑纯化并通过测序进行分析。

含有SARS-CoV-2S序列的修饰的区段7(NSP3)表达载体。为了检验使用轮状病毒作为SARS-CoV-2S蛋白区域的表达平台的可能性，将pT7/NSP3SA11转录载体中的NSP3 ORF替换为包含NSP3 ORF(猪捷申病毒2A元件)和S蛋白的编码序列的盒(图11)。该盒包括NSP3的编码序列和2A元件之间的柔性GAG铰链，以及2A元件和S区的编码序列之间的3x FLAG(f)标签。该方法用于生成含有以下的编码序列的一组载体(统称为pT7/NSP3-CoV2/S载体)：SARS-CoV-2S1(pT7/NSP3-2A-fS1)、NTD(pT7/NSP3 -2A-fNTD)、RBD(pT7/NSP3-2A-fRBD)、RBD的延伸形式(ExRBD)(pT7/NSP3-2A-fExRBD)和包括其融合域(pT7/NSP3-2A-fCR)的S2核心区(CR)(图10)。将S序列插入pT7/NSP3SA11载体中与之前在表达FP的重组SA11(rSA11)轮状病毒的产生中使用的相同的位点。

具有含有S序列的区段7dsRNA rSA11轮状病毒的回收。为了生成rSA11病毒，用一整套pT7/SA11表达载体(除了pT7/NSP3SA11被pT7/NSP3-CoV2/S载体替换)以及编码非洲猪瘟病毒加帽酶的CMV表达质粒(pCMV-NP868R)转染BHK-T7单层。在转染混合物中，所包括的编码轮状病毒NSP2(pT7/NSP2SA11)和NSP5(pT7/NSP5SA11)的质粒以比其他pT7/SA11载体高三倍的水平被包括。转染后两天，用MA104细胞过量接种BHK-T7细胞。BHK-T7/MA104细胞混合物在三天后冻融，并且rSA11病毒通过噬斑分离回收，并在表征之前在MA104细胞中通过1或2个生长周期进行扩增。rSA11病毒的特性汇总在图18中。

基于凝胶电泳，用pT7/NSP3-S载体生成的rSA11病毒(统称为rSA11/NSP3-CoV2/S病毒)含有比野生型rSA11(rSA11/wt)病毒大得多的区段7dsRNA(图12)。序列分析证实，rSA11/NSP3-CoV2/S病毒的区段7dsRNA与pT7/NSP3-CoV2/S载体中存在的区段7序列相匹配(数据未显示)。病毒分离株rSA11/NSP3-fS1的重新工程化改造的区段7dsRNA具有3.3kbp的长度，解释了其在长度同样为3.3kbp的最大轮状病毒基因组区段(区段1)附近的电泳迁移(图18，图12A)。rSA11/NSP3-fS1的区段7dsRNA含有2.2-kbp的外来序列插入，这是引入到区段7dsRNA或任何轮状病毒基因组区段中的最长外来序列。先前工程化改造到rSA11中的最长7dsRNA是rSA11/NSP3-fmRuby-P2A-fUnaG的2.4-kbp区段7dsRNA，其含有编码三种蛋白质(NSP3、UnaG、mRuby)的盒。rSA11/NSP3-fS1的总基因组大小为20.8kbp，比rSA11/wt大12％。这是已知存在于轮状病毒分离物中的最大基因组，证明了轮状病毒复制和包装大量外源序列的能力。

病毒分离株rSA11/NSP3-fNTD、-fRBD、-fExRBD和-fCR的区段7dsRNA经测定分别具有2.1、1.8、2.1和2.3kbp的长度(图18)，并且正如从它们的大小所预期的那样，在轮状病毒基因组区段3(2.6kbp)和5(1.6kbp)之间的RNA凝胶上迁移(图12B)。rSA11/NSP3-fNTD、-fRBD、-fExRBD和-fCR分离株的区段7dsRNA分别含有1.0、0.7、1.0和1.2kbp的外来序列插入，显著小于rSA11/NSP3-fS1的2.1-kbp的外来序列插入。rSA11/NSP3-fNTD、-fRBD、-fExRBD和-fCR的区段7RNA中含有的较小大小的外来序列插入片段可以提供重新工程化改造这些病毒的S蛋白产物所需的额外遗传空间，以包括能够增强免疫细胞识别和加工抗原的路由和定位标签。特别有价值的可以是包括促进S蛋白产物与抗体重链(Fc)受体(例如，FcRn)相互作用的标签，使产物能够聚集或多价呈递，或提高产物的合成或分泌效率。

与先前检验表达FPs的rSA11分离株表型的研究一致(18-19)，由rSA11/NSP3-CoV2/S病毒形成的噬斑的大小小于由rSA11/wt形成的噬斑(图12C)。类似地，含有S蛋白编码序列的rSA11病毒生长至最大滴度，其比rSA11/wt低最多达0.5-1log(图12D)。rSA11/NSP3-CoV2/S病毒噬斑更小和滴度更低的原因尚不清楚，但可能反映了病毒RNA聚合酶在病毒复制过程中转录其区段7dsRNA所需的延长时间可能更长。替代性地，其可能反映了翻译含有S蛋白编码序列的区段7(+)RNA所需的时间更长。

rSA11轮状病毒对S编码序列的表达。为了确定rSA11/NSP3-CoV2/S病毒是否表达其S序列的产物，使用FLAG和RBD特异性抗体通过免疫印迹测定检验从感染这些病毒的MA104细胞制备的裂解物(图4A、B)。用FLAG抗体探测的免疫印迹显示rSA11/NSP3-fNTD、-fExRBD、-fRBD和-fCR病毒生成S产物，并且它们的大小如区段7ORF中活性2A元件所预期：fNTD(34.8kDa)、fExRBD(35.2kDa)、fRBD(24.3kDa)和fCR(42.9kDa)(图18)。免疫印迹测定表明，rSA11/NSP3-fExRBD产生的S产物水平高于任何其他rSA11/NSP3-CoV2/S病毒。更高水平的fExRBD产物的基础尚不清楚，但与其他病毒产物(如NSP3和VP6)的表达水平增加无关。尽管如此，rSA11/NSP3-fExRBD的高水平ExRBD表达表明，此类病毒可能最适合用于开发组合轮状病毒/COVID疫苗。

FLAG抗体在感染有rSA11/NSP3-fS1的细胞中没有检测到预期的79.6kDa fS1产物(图13A)。对此的解释尚不清楚，可能与S蛋白在其合成过程中的修饰有关。值得注意的是，区段7ORF中的S1编码序列包括N端信号序列，该N端信号序列在SARS-CoV-2感染的细胞中，在内质网(ER)上合成期间从S1蛋白中切割下来。信号序列的切割可能已经从S1产物中去除了上游3x FLAG标签，从而防止S1产物被FLAG抗体检测到。替代性地，由于膜锚定域位于SARS-CoV-2S蛋白的C端，S1产物可能是从rSA11/NSP3-fS1感染的细胞中分泌的并且因此丢失。ER相关蛋白酶对79.6kDa-S1产物的糖基化和/或降解也可能防止了蛋白质的检测。最后，由于轮状病毒侵占并可能重塑ER以支持糖蛋白(NSP4和VP7)合成，病毒形态发生可能扰乱ER与S信号序列的相互作用，从而阻止S1合成。

有趣的是，所有rSA11/NSP3-CoV2/S病毒包括rSA11/NSP3-fS1，都生成了可使用FLAG抗体检测的2A通读产物(图13A)。因此，rSA11/NSP3-2A-CoV2/S病毒中的2A停止启动元件并未完全激活，这与先前分析细胞内2A元件功能的报告一致。然而，除了rSA11/NSP3-fS1之外，所有病毒都生成了比通读产物更多的2A切割S产物。2A元件内部和周围残基的突变，包括柔性接头序列的纳入，可以降低通读的相对频率。

来自感染有rSA11/wt、rSA11/NSP3-fRBD和rSA11/NSP3-fExRBD的MA104细胞的裂解物也用针对RBD域C端末端的肽图制备的RBD特异性多克隆抗体(ProSci 9087)进行探测。RBD抗体识别rSA11/NSP3-fExRBD病毒的fExRBD产物，但不识别rSA11/NSP3-fRBD的fRBD产物(图13B)，可能是因为后一种产物缺少用于生成ProSci RBD抗体的肽序列。为了深入了解fRBD和fExRBD产物是否折叠成模仿SARS-CoV-2S蛋白中存在的结构的天然结构，使用抗RBD构象依赖性中和单克隆抗体(GeneTex CR3022)通过下拉(pulldown)测定探测感染rSA11/NSP3-fRBD和rSA11/NSP3-fExRBD的MA104细胞制备的裂解物。如图13C所示，CR3022免疫沉淀物包括fExRBD，表明该产物包括在真正的SARS-CoV-2S蛋白中发现的中和表位。因此，rSA11/NSP3-fExRBD的至少一些RBD产物可能已经折叠成能够诱导保护性抗体应答的构象。与使用CR3022抗体对ExRBD的成功下拉不同，尚不清楚抗体是否同样免疫沉淀rSA11/NSP3-fRBD的fRBD产物。这种不确定性源于CR3022抗体的轻链在免疫印迹测定中掩盖了电泳紧密迁移的fRBD产物(图13C)。

轮状病毒感染期间rSA11表达ExRBD和RBD产物。为了深入了解病毒复制过程中的fExRBD和fRBD表达，用rSA11/wt、rSA11/NSP3-fExRBD或rSA11/NSP3-fRBD感染MA104细胞，然后在0到12hr p.i.之间的间隔处收获。通过免疫印迹测定对感染细胞裂解物的分析表明，fExRBD和fRBD很容易在4h p.i.检测到，与轮状病毒蛋白NSP3和VP6的表达相当(图14)。fExRBD和fRBD的水平增加出现在8和12h p.i.，没有较小大小的带FLAG标签产物的明显积累。因此，fExRBD和fRBD产物似乎相对稳定。

含有S序列的rSA11病毒颗粒的密度。将S序列引入rSA11/NSP3-CoV2/S病毒后，其病毒基因组的大小比SA11/wt的病毒基因组的大小增加了1.0至2.5kbp。假设rSA11/NSP3-CoV2/S病毒被有效包装并含有11个基因组区段的完整集群，rSA11/NSP3-CoV2/S颗粒核心内dsRNA含量的增加应该导致它们的密度大于SA11/wt颗粒的密度。为了探索这种可能性，rSA11/wt(18.6kbp基因组)、rSA11/NSP3-fExRBD(19.5kbp)和rSA11/NSP3-fS1(20.8kbp)在MA104细胞中扩增。然后用EDTA处理受感染的细胞裂解物，将轮状病毒病毒体(三层颗粒)转化为双层颗粒(DLP)。将颗粒离心以在CsCl梯度上达到平衡，并通过折射法确定DLP条带的密度(图15)。分析表明，rSA11/NSP3-fExRBD DLP的密度(1.386g/cm³)大于SA11/wt DLP(1.381g/cm³)(小图A)，同样，rSA11/NSP3-fS1 DLP的密度(1.387g/cm³)大于SA11/wt DLP(1.38g/cm³)(小图B)。通过凝胶电泳的带状DLP分析证实它们含有预期的十一个基因组区段集群。为了确认rSA11/NSP3-fS1 DLP的密度与rSA11/wt DLP不同，将含有每种病毒的感染细胞裂解物合并，用EDTA处理，合并样品中的病毒DLP通过CsCl梯度离心进行条带化(图15E)。梯度分析显示存在两条颗粒带，表明rSA11/NSP3-fSA11-fS1和rSA11/wt DLP具有不同的密度。组合DLP条带的凝胶电泳显示，正如预期的那样，rSA11/NSP3-fSA11-fS1和rSA11/wt均存在。综上所述，这些结果表明rSA11/NSP3-CoV-2/S病毒体含有完整的基因组集群，尽管它们的基因组大小明显大于野生型SA11病毒的基因组大小。实际上，20.8-kbprSA11/NSP3-fS1基因组的大小比18.6-kbp rSA11/wt基因组大12％(图18)。因此，轮状病毒核心具有容纳大量额外的外来序列的空间。核心内的dsRNA如何重新分布以容纳大量额外序列尚不清楚，但很明显，尽管有额外序列，核心仍然是具有转录活性的纳米机器。其他基因组区段是否可以与rSA11/NSP3-fS1的区段7类似地工程改造以包括2kb的额外序列仍有待确定。核心的最大包装容量也有待确定。

含有S序列的rSA11轮状病毒的遗传稳定性。rSA11/NSP3-CoV2/S病毒的遗传稳定性通过连续传代进行评估，其中每轮新鲜单层MA104细胞用细胞裂解物的1:1000稀释物感染。从感染rSA11/NSP3-fNTD、-fRBD、-ExRBD或-ExCR的细胞中回收的dsRNA的电泳分析表明，在5轮传代(P1-P5)中，包括区段7在内的11个基因组区段中的任何一个的大小都没有变化，表明这些病毒在遗传上是稳定的(图16A)。相反，rSA11/NSP3-S1的连续传代显示出不稳定的迹象(图16A)。到第三轮传代时，出现了比3.3-kbp区段7RNA更小的新基因组区段。随着连续传代，四个新的区段(R1到R4)变得突出，并且3.3kbp区段7RNA不再能检测到，这表明高传代病毒池(P3-P6)由含有通过内部序列缺失衍生自3.3kb区段7RNA的区段7RNA的变体填充。为了评估这种可能性，通过噬斑分离从P6病毒池中回收了8个变体，其中4个具有大(L)噬斑表型，4个具有小(S)噬斑表型。变体基因组的电泳分析表明，没有一个含有3.3kbp区段7RNA(图16B)。相反，6个变体(L1、L2、L3、L4、S2和S4)含有R3区段，并且另外两个变体含有R1(S1)或R2(R2)区段。没有发现含有新的R4区段的变体。

测序表明R1、R2和R3区段实际上是3.3-kbp区段7RNA的衍生物(图16C)。R1、R2和R3RNA都保留了区段7的完整5’-和3’-UTR和NSP3 ORF，但含有S1编码序列的1.0(R1)、1.5(R2)或1.8(R3)kbp的序列缺失。通过噬斑测定分离的8个变体中有6个含有R3区段这一事实表明，具有这种RNA的变体可能比具有R1、R2或R4 RNA的变体具有生长优势。尽管遗传不稳定导致rSA11/NSP3-fS1变体缺少S1 ORF的部分，但没有发现缺少NSP3ORF的部分。这表明NSP3可能对病毒复制至关重要，这可以解释我们先前通过在NSP3 ORF中插入终止密码子来恢复编码截短形式的NSP3的活性rSA11的努力的失败(数据未显示)。为了更好地了解在连续传代期间引入区段7(NSP3-fS1)RNA的缺失的多样性，正在通过直接RNA测序检验高传代病毒池中的病毒RNA总数。

细胞培养。胚胎猴肾细胞(MA104)在含有5％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素的培养基199(M199)中生长。表达T7 RNA聚合酶(BHK-T7)的幼仓鼠肾细胞由Dr.UllaBuchholz,Laboratory of Infectious Diseases,NIAID,NIH(Bethesda,Maryland,USA)提供，并在含有5％热灭活胎牛血清(FBS)、10％胰蛋白胨-肽肉汤、1％青霉素-链霉素、2％非必需氨基酸和1％谷氨酰胺的Glasgow最低必需培养基(GMEM)中增殖(41)。BHK-T7细胞每隔一代在补充有2％遗传霉素(Invitrogen)的培养基中培养一次。

质粒构建。使用从Addgene质粒库[https://www.addgene.org/Takeshi_Kobayashi/]获得的质粒(pT7/VP1SA11、pT7/VP2SA11、pT7/VP3SA11、pT7/VP4SA11、pT7/VP6SA11、pT7/VP7SA11、pT7/NSP1SA11、pT7/NSP2SA11、pT7/NSP3SA11、pT7/NSP4SA11、pT7/NSP3SA11、pT7/NSP4SA11和pT7/NSP5SA11)和pCMV-NP868R(Y.Kanai等人，Proc.Natl AcadSci USA 114:2349-2354)制备重组SA11轮状病毒。如其他地方所述，质粒pT7/NSP3-P2A-fUnaG是通过将含有P2A-3xFL-UnaG的ORF的DNA片段融合到pT7/NSP3SA11中NSP3 ORF的3’末端而产生的。含有SARS-CoV-2S基因全长cDNA(GenBank MN908947.3)的质粒(pTWIST/COVID19刺突)购自Twist Bioscience。质粒pT7/NSP3-2A-fNTD、pT7/NSP3-2A-fExRBD、pT7/NSP3-2A-fRBD、pT7/NSP3-2A-fCR和pT7/NSP3-2A-S1是通过分别用SARS-CoV-2S蛋白的NTD、ExRBD、RBD、CR和S1区的ORF通过In-Fusion克隆替换pT7/NSP3-2A-fUnaG中的UnaG ORF制备的。分别使用引物对NTD_For和NTD_Rev、ExRBD_For和ExRBD_Rev、RBD_For和RBD_Rev、CR_For和CR_Rev，以及S1_For和S1_Rev，从pTWIST/COVID19刺突扩增含有NTD、ExRBD、RBD、CR和S1编码序列的DNA片段(图17)。转染质量质粒是商业制备的(www.plasmid.com)或使用Qiagen质粒纯化试剂盒。引物由EuroFins Scientific提供，并且序列由EuroFinsScientific测定。

重组病毒。先前详细描述了用于生成重组轮状病毒的反向遗传学方案。总之，使用Mirus TransIT-LT1转染试剂，用SA11 pT7质粒和pCMV-NP868R转染BHK-T7细胞。两天后，将转染的细胞用MA104细胞过量接种，并将生长培养基(无血清)调整至终浓度为0.5μg/ml的猪胰蛋白酶(IX型，Sigma Aldrich)。三天后，将BHK-T7/MA104细胞混合物冻融3次，裂解物通过低速离心澄清。澄清裂解物中的重组病毒通过在MA104细胞中传代1到2轮而扩增，该MA104细胞维持在含有0.5μg/ml胰蛋白酶的无血清培养基中。通过噬斑纯化获得单个病毒分离株，并通常在分析前在MA104细胞中扩增1或2轮。通过Trizol提取从感染细胞裂解物中回收病毒dsRNA，通过在Tris-甘氨酸缓冲液中的Novex 8％聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上电泳解析，并通过溴化乙锭染色检测。使用BioRad ChemiDoc MP成像系统使凝胶中的病毒dsRNA可视化。如前所述，通过连续传代评估噬斑分离的rSA11的遗传稳定性。

免疫印迹分析。模拟感染或用每个细胞5PFU的重组病毒感染MA104细胞，并在8hp.i收获。用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗细胞，通过低速离心沉淀，并通过重悬于裂解缓冲液[300mM NaCl、100mM Tris-HCl、pH 7.4、2％Triton X-100和1x无EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Roche cOmplete)]中裂解。对于免疫印迹测定，裂解物通过在Novex线性8-16％聚丙烯酰胺凝胶上电泳解析并转移到硝酸纤维素膜上。用含有5％脱脂干乳的磷酸盐缓冲盐水封闭后，用豚鼠多克隆NSP3(批号55068，1：2000)或VP6(批号53963，1：2000)抗血清、小鼠单克隆FLAG M2(Sigma F1804,1:2000)、兔单克隆PCNA[13110S，Cell Signaling Technology(CST)，1:1000]抗体或兔抗RBD(ProSci 9087；1:200)抗体对印迹进行探测。一抗使用如下辣根过氧化物酶(HRP)缀合二抗的1:10,000稀释物检测：马抗小鼠IgG(CST)、抗豚鼠IgG(KPL)或山羊抗兔IgG(CST)。使用Clarity Western ECL Substrate(Bio-Rad)显影信号，并使用Bio-Rad ChemiDoc成像系统检测信号。

免疫沉淀测定。如上制备模拟感染和感染的细胞裂解物。裂解物与SARS-CoV-2S1特异性单克隆抗体(GeneTex CR3022，1:150稀释)或NSP2单克隆抗体(#171，1:200)混合。在4℃下轻轻摇动温育18小时后，使用Pierce磁性IgA/IgG珠(ThermoFisher Scientific)回收抗原抗体复合物，通过凝胶电泳解析，并印迹到硝酸纤维素膜上。用FLAG抗体(1:2000)探测印迹以检测fRBD和fExRBD以及NSP2抗体(1:2000)。

CsCl梯度离心。10cm细胞培养板中的MA104细胞单层用rSA11病毒以5的MOI感染，并在12h p.i收获。通过将培养基调整至0.5％ Triton X100(Sigma)并在冰上温育5分钟来裂解细胞。然后通过在4℃下以500x g离心6分钟澄清裂解物。将澄清的裂解物调整至10mMEDTA，并在37℃下温育1小时，以引起轮状病毒TLP向DLP的转化(36)。将CsCl添加到样品中至1.367g/cm³的密度，并在8℃下使用Beckman SW55Ti转子以110,000x g离心22小时。使用微量移液器回收含有病毒条带的级分，并使用折射计测定级分密度。

rSA11病毒的遗传稳定性。病毒使用在无血清M199培养基和0.5μg/ml胰蛋白酶中制备的感染细胞裂解物的1:1000稀释物，在MA104单层细胞上连续传代。当细胞病变效应达到完全(4-5天)时，将细胞在其培养基中冻融两次，并通过低速离心澄清裂解物。为了回收dsRNA，用Trizol(ThermoFisher Scientific)提取澄清的裂解物(600μl)。通过在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳来解析RNA样品，并通过溴化乙锭染色检测dsRNA条带。

GenBank登录号。rSA11病毒中的区段7序列已保藏在Genbank中：wt(LC178572)、NSP3-P2A-fNTD(MW059024)、NSP3-P2A-fRBD(MT655947)、NSP3-P2A-ExRBD(MT655946)、NSP3-P2A-fCR(MW059025)、NSP3-P2A-S1(MW059026)、NSP3-P2A-S1/R1(MW353715)、NSP3-P2A-S1/R2(MW353716)和NSP3-P2A-S1/R3(MW353717)。另见图18。

我们已经表明，反向遗传学可以用于生成重组轮状病毒，这些重组轮状病毒表达作为单独的产物的SARS-CoV-2S蛋白的部分，包括其免疫显性RBD。这些结果表明，有可能开发轮状病毒作为疫苗表达载体，为生成能够诱导针对轮状病毒和SARS-CoV-2的免疫保护应答的口服活减毒轮状病毒-COVID-19联合疫苗提供了途径。此类联合疫苗将设计用于婴儿和幼儿，并且允许通过搭载美国和许多其他发达国家和发展中国家当前使用的轮状病毒免疫项目来广泛分发和施用靶向COVID-19的疫苗。此外，我们的研究结果提出了一种可能性，即通过使用轮状病毒作为疫苗表达平台，可以制备针对其他肠道病毒(包括诺如病毒、星状病毒和戊型肝炎病毒)的基于轮状病毒的联合疫苗。

已经确定18.6kbp的轮状病毒dsRNA可以容纳足以编码SARS-CoV-2S1蛋白的多达2.2kbp的外来序列。然而，在我们手中，编码S1的rSA11遗传上不稳定并且无法表达合适的S1产物，原因尚不明确但仍在进一步研究中。携带大量外来序列的轮状病毒具有遗传不稳定的特征(本研究和数据未显示)，但那些具有小于1.0-1.5-kbp的外来序列的轮状病毒在低MOI下的连续传代5-10轮中是稳定的，因此可以开发成疫苗候选物。1.0-1.5kbp额外序列提供的编码能力足以产生编码SARS-CoV-2NTD、RBD或S2核心的重组轮状病毒，以及可以促进S产物与抗原呈递细胞和幼稚B淋巴细胞接合的运输信号。当前正在进行的工作是了解表达SARS-CoV-2产物的轮状病毒如何成功地在免疫动物中诱导中和抗体。

虽然所公开的主题可以进行各种修改和替代形式，但本文详细描述了具体实施方案。然而，目的并不在于将本公开内容限制为所描述的特定实施方案。本公开旨在涵盖落入如所附权利要求所限定的本公开的范围内的所有修改、等同物和替代。

类似地，尽管本文可能描述了说明性方法，但是方法的描述不应被解释为暗示本文公开的各种步骤的任何要求或其中或之间的特定顺序。然而，某些实施方案可能需要某些步骤和/或某些步骤之间的某些顺序，如可以在本文中明确描述的和/或可以从步骤本身的性质理解的(例如，一些步骤的执行可能取决于上一步的结果)。此外，项(例如，输入、算法、数据值等)的“集”、“子集”或“组”可以包括一个或多个项，并且类似地，项的子集或子组可以包括一个或多个项。“多个”意味着不止一个。

由于术语在本文中相对于范围使用，“约”和“大约”可以互换使用，以指代包括所述测量值并且还包括合理接近所述测量值但可能存在相当小数量的差异的任何测量值，相当小数量的差异如相关领域的普通技术人员将理解并容易确定的，可归因于测量误差、测量差异和/或制备设备校准、读取和/或设置测量值时的人为错误、鉴于与其他组件相关的测量值的差异，为优化性能和/或结构参数而进行的调整、特定的实施方案、人或机器对物体的不精确调整和/或操纵和/或等等。

Claims (29)

1.重组轮状病毒，其包含基因区段，所述基因区段包括编码轮状病毒非结构蛋白3(NSP3)的第一核苷酸序列和编码选自以下的冠状病毒S蛋白片段的第二核苷酸序列：

S1 N端域；

具有信号序列的S1 N端域；

没有信号序列的S1亚基；

S蛋白受体结合域；

延伸的S蛋白受体结合域；

S2核心域；和

没有跨膜锚定域的S2亚基，

其中所述NSP3和所述冠状病毒S蛋白片段由单个开放阅读框编码，由自切割蛋白酶域分隔。

2.权利要求1的重组轮状病毒，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2并且：

所述S1 N端域与SEQ ID NO:3至少95％相同；

所述具有信号序列的S1 N端域与SEQ ID NO:4至少95％相同；

所述S蛋白受体结合域与SEQ ID NO:5至少95％相同；

所述延伸的S蛋白受体结合域与SEQ ID NO:9至少95％相同；

所述S2核心域为SEQ ID NO:10的至少95％；和

所述没有跨膜锚定域的S2亚基与SEQ ID N:11至少95％相同。

3.权利要求1的重组轮状病毒，其进一步包含编码选自以下的第二冠状病毒S蛋白片段的第三核苷酸序列：

S1 N端域；

具有信号序列的S1 N端域；

没有信号序列的S1亚基；

S蛋白受体结合域；

延伸的S蛋白受体结合域；

S2核心域；和

没有跨膜锚定域的S2亚基，

其中所述NSP3、所述冠状病毒S蛋白片段和所述第二冠状病毒S蛋白片段由单个开放阅读框编码，其中所述NSP3和所述冠状病毒S蛋白片段由自切割蛋白酶域分隔，并且所述冠状病毒S蛋白片段和所述第二冠状病毒片段由分子铰链分隔。

4.权利要求1的重组轮状病毒，其中所述自切割蛋白酶域是2A切割元件。

5.权利要求1的重组轮状病毒，其中所述自切割蛋白酶域是tesco猪病毒2A(P2A)元件。

6.权利要求5的重组轮状病毒，其中所述P2A元件具有与SEQ ID NO:1(SKFQIDKILISGDIELNPGP)具有至少80％序列同一性的序列。

7.权利要求1的重组轮状病毒，其中编码所述冠状病毒S蛋白片段的所述核苷酸序列衍生自选自以下的冠状病毒：SARS-CoV；MERS-CoV；SARS-CoV-2；HCoV-299E；HCoV-OC43；HCoV-HKU1；和HCoV-NL63。

8.权利要求3的重组轮状病毒，其中编码所述第二冠状病毒S蛋白片段的所述第三核苷酸序列衍生自相同或不同的冠状病毒种。

9.权利要求1的重组轮状病毒，其中所述重组轮状病毒在施用于受试者时在所述受试者中诱导针对轮状病毒和冠状病毒的免疫应答。

10.权利要求1的重组轮状病毒，其中所述重组轮状病毒基于株G1P[8]。

11.权利要求1的重组轮状病毒，其中所述重组轮状病毒是减毒的。

12.免疫原性组合物，其包含权利要求1-11中任一项的重组轮状病毒。

13.权利要求12的免疫原性组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂。

14.权利要求13的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物被配制用于经口、皮下或肌肉内施用。

15.用于在受试者中诱导针对轮状病毒和冠状病毒的保护性免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求12的免疫原性组合物。

16.权利要求15的方法，其中所述免疫原性组合物包含药学上可接受的赋形剂并且被配制用于经口、皮下或肌肉内施用。

17.重组轮状病毒表达系统，其包含：

非结构蛋白3(NSP3)表达载体，其包含编码轮状病毒(NSP3)的核苷酸序列和编码选自以下的冠状病毒S蛋白片段的核苷酸序列：

S1 N端域；

具有信号序列的S1 N端域；

没有信号序列的S1亚基；

S蛋白受体结合域；

延伸的S蛋白受体结合域；

S2核心域；和

没有跨膜锚定域的S2亚基，

其中所述NSP3和所述冠状病毒S蛋白片段由单个开放阅读框编码，由自切割蛋白酶域分隔；

VP1表达载体；

VP2表达载体；

VP3表达载体；

VP4表达载体；

VP5表达载体；

VP6表达载体；

VP7表达载体；

NSP1表达载体；

NSP2表达载体；

NSP4表达载体；

NSP5/6表达载体；和

非洲猪瘟病毒NP868R RNA加帽酶表达载体。

18.权利要求17的重组轮状病毒表达系统，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2并且：

所述S1 N端域与SEQ ID NO:3至少95％相同；

所述具有信号序列的S1 N端域与SEQ ID NO:4至少95％相同；

所述S蛋白受体结合域与SEQ ID NO:5至少95％相同；

所述延伸的S蛋白受体结合域与SEQ ID NO:9至少95％相同；

所述S2核心域为SEQ ID NO:10的至少95％；和

所述没有跨膜锚定域的S2亚基与SEQ ID N:11至少95％相同。

19.权利要求17的重组轮状病毒表达系统，其进一步包括编码选自以下的第二冠状病毒S蛋白片段的第三核苷酸序列：

S1 N端域；

具有信号序列的S1 N端域；

没有信号序列的S1亚基；

S蛋白受体结合域；

延伸的S蛋白受体结合域；

S2核心域；和

没有跨膜锚定域的S2亚基，

其中所述NSP3、所述冠状病毒S蛋白片段和所述第二冠状病毒S蛋白片段由单个开放阅读框编码，其中所述NSP3和所述冠状病毒S蛋白片段由自切割蛋白酶域分隔，并且所述冠状病毒S蛋白片段和所述第二冠状病毒片段由分子铰链分隔。

20.权利要求17的重组轮状病毒表达系统，其中所述NSP3表达载体、VP1表达载体、VP2表达载体、VP3表达载体、VP4表达载体、VP5表达载体、VP6表达载体、VP7表达载体、NSP1表达载体、NSP2表达载体、NSP4表达载体、NSP5/6表达载体中的每一个均为T7表达载体。

21.权利要求17的重组轮状病毒表达系统，其中所述自切割蛋白酶域是2A切割元件。

22.权利要求17的重组轮状病毒表达系统，其中所述自切割蛋白酶域是tesco猪病毒2A(P2A)元件。

23.权利要求21的重组轮状病毒表达系统，其中所述2A元件具有与SEQ ID NO:1(SKFQIDKILISGDIELNPGP)具有至少80％序列同一性的序列。

24.权利要求17的重组轮状病毒表达系统，其中编码所述冠状病毒S蛋白片段的所述核苷酸序列衍生自选自以下的冠状病毒：SARS-CoV；MERS-CoV；SARS-CoV-2；HCoV-299E；HCoV-OC43；HCoV-HKU1；和HCoV-NL63。

25.权利要求17的重组轮状病毒表达系统，其中编码所述第二冠状病毒S蛋白片段的所述第三核苷酸序列衍生自相同或不同的冠状病毒种。

26.权利要求23的重组轮状病毒表达系统，其中所述重组轮状病毒表达系统基于轮状病毒株G1P[8]。

27.用于生产重组轮状病毒的方法，所述方法包括：

用权利要求17-26中任一项的重组轮状病毒表达系统转染BHK-T7细胞；

用MA104细胞过量接种所述转染的BHK-T7细胞；

制备澄清的细胞裂解物；和

分离重组轮状病毒。

28.权利要求27的方法，其中重组轮状病毒通过噬斑纯化分离。

29.如权利要求27的方法，其中所述重组轮状病毒是减毒的。

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