CN117904197A - 一种羊轮状病毒感染性克隆质粒和构建方法、羊轮状病毒的反向遗传病毒拯救系统及其应用 - Google Patents
一种羊轮状病毒感染性克隆质粒和构建方法、羊轮状病毒的反向遗传病毒拯救系统及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种羊轮状病毒感染性克隆质粒和构建方法、羊轮状病毒的反向遗传病毒拯救系统及其应用，并将羊轮状病毒作为载体用于表达其他抗原或蛋白的疫苗或药物开发，属于分子生物学和生物医学领域。本发明构建了5个感染性克隆质粒，并将其应用到羊轮状病毒的反向遗传病毒拯救系统中，成功拯救出有或没有分子标签的rLLR、rLLR/NSP3‑2A‑CoV2/RBD和rLLR/NSP3‑2A‑NLuc等重组病毒；初步验证了上述拯救病毒(含重组病毒)的病原学特征以及rLLR/NSP3‑2A‑CoV2/RBD重组病毒在小鼠体内的免疫原性。本发明为基于羊轮状病毒的疫苗或药物等研发提供了新的技术手段和体系基础。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和生物医学领域，尤其涉及一种羊轮状病毒感染性克隆质粒和构建方法、羊轮状病毒的反向遗传病毒拯救系统及其应用；羊轮状病毒作为载体开发联合疫苗或肠道药物递送系统等。
背景技术
轮状病毒(Rotavirus，RV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)，在电子显微镜下，可以观察到完整的感染性病毒颗粒也被称为三层颗粒(Triple-layer-particles，TLPs)，其中，结构蛋白VP1、VP2、VP3构成病毒的核心衣壳，包裹着病毒的遗传物质，VP6则构成病毒的内层衣壳，VP7与刺突蛋白VP4共同构成病毒外层衣壳，表面光滑，外层可见刺突状突起。轮状病毒属于双链(ds)RNA病毒，其基因组由11条分节段的dsRNA组成，各节段大小介于667bp(第11节段)和3302bp(第1节段)之间，被病毒核心衣壳所包裹。利用dsRNA-PAGE对病毒基因组进行电泳分离，根据各片段分子量的大小呈现出不同的11种条带，共分为4组：Ⅰ组由VP1～VP4组成，Ⅱ组由NSP1和VP6组成，Ⅲ组由NSP2、NSP3、VP7组成，Ⅳ组为NSP4和NSP5，呈典型的4-2-3-2带型。
2017年，Kanai等首次成功建立了完全基于质粒的轮状病毒反向遗传学系统。该系统将SA11(G3P)11个基因cDNA的5'端连接T7启动子，3'端连接丁型肝炎病毒HDV核酶，以此获得准确表达病毒基因组全长的序列，共转染稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK-T7细胞。准确克隆的基因组对于反向遗传学系统的开发至关重要。特别是，分节段病毒基因组的5'和3'端非翻译区含有顺式作用元件，在基因组的转录、翻译和病毒包装中发挥重要作用。位于轮状病毒ssRNAs 3'端的七个高度保守的核苷酸(UGUGACC或UGUGGCU)被认为与RNA聚合酶的特异性作用有关。此外，保守的核苷酸序列与ATP5B(线粒体ATP合酶的核心亚单位)相互作用对于调节病毒复制至关重要。因此，ssRNA两端正确的5'和3'端核苷酸序列对于确保轮状病毒反向遗传学的成功非常重要。
FAST蛋白是由正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)和水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus,AQRV)成员编码的一种诱导细胞间膜融合的蛋白质。编码FAST-p10(95～98aa)的基因来源于正呼肠病毒属的禽呼肠孤病毒(ARV)和内尔森海湾病毒(Nelson Bay，NBV)，这些融合蛋白可以增加呼肠孤病毒科中不编码FAST蛋白的非融合病毒(例如，哺乳动物正呼肠孤病毒和轮状病毒)的复制。因此，将编码内尔森海湾病毒FAST-p10的表达质粒与轮状病毒基因组的11个表达质粒共转染BHK-T7细胞，可以提高病毒拯救的效率。但是，转染质粒的数量太多会明显影响病毒的拯救效率。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种羊轮状病毒感染性克隆质粒和构建方法、羊轮状病毒的反向遗传病毒拯救系统及其应用，达到通过减少转染质粒数量提高病毒拯救效率的目的，为轮状病毒等分节段病毒的反向遗传学系统优化提供了新的思路。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种羊轮状病毒感染性克隆质粒，所述感染性克隆质粒为pT7-VP1+VP6/LLR、pT7-VP2+muNSP1/LLR、pT7-VP3+muNSP3/LLR、pT7-VP4+VP7+muNSP4/LLR和pT7-NSP2+muNSP5/LLR；
或pT7-VP1+VP6/LLR、pT7-VP2+NSP1/LLR、pT7-VP3+NSP3/LLR、pT7-VP4+VP7+NSP4/LLR和pT7-NSP2+NSP5/LLR；
所述pT7-VP1+VP6/LLR的序列如SEQ ID NO:122所示；所述pT7-VP2+muNSP1/LLR的序列如SEQ ID NO:123所示；所述pT7-VP3+muNSP3/LLR的序列如SEQ ID NO:124所示；所述pT7-VP4+VP7+muNSP4/LLR的序列如SEQ ID NO:125所示；所述pT7-NSP2+muNSP5/LLR的序列如SEQ ID NO:126所示；所述pT7-VP2+NSP1/LLR的序列如SEQ ID NO:127所示；所述pT7-VP3+NSP3/LLR的序列如SEQ ID NO:128所示；所述pT7-VP4+VP7+NSP4/LLR的序列如SEQ ID NO:129所示；所述pT7-NSP2+NSP5/LLR的序列如SEQ ID NO:130所示。
本发明还提供了一种所述的羊轮状病毒感染性克隆质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
通过5'/3'RACE和RT-PCR扩增相结合的方法，获得LLRV的11条准确的基因组片段序列，在每条基因组片段序列的5'末端连接T7启动子，3'末端连接HDV核酶，然后构建得到11个质粒；
对LLRV中的4个基因组片段序列进行同义突变，获得具有分子标签的NSP1，NSP3，NSP4和NSP5的序列；以具有分子标签的NSP1，NSP3，NSP4和NSP5的序列替换对应质粒中的NSP1，NSP3，NSP4和NSP5后获得4个突变质粒pT7-muNSP1/LLRV、pT7-muNSP3/LLRV、pT7-muNSP4/LLRV和pT7-muNSP5/LLRV；
以11个质粒中未进行片段突变的剩余7个质粒和4个突变质粒为模板，扩增获得对应的基因组片段序列，将11条准确的基因组片段序列中的VP6片段以同源重组的方法克隆入pT7-VP1/LLR质粒载体中，构建得到所述的pT7-VP1+VP6/LLR；
将具有分子标签的NSP1片段或11条准确的基因组片段序列中的NSP1片段以同源重组的方法克隆入pT7-VP2/LLR质粒载体中，构建得到权利要求1所述的pT7-VP2+muNSP1/LLR或pT7-VP2+NSP1/LLR；
将具有分子标签的NSP3片段或11条准确的基因组片段序列中的NSP3片段以同源重组的方法克隆入pT7-VP3/LLR质粒载体中，构建得到权利要求1所述的pT7-VP3+muNSP3/LLR或pT7-VP3+NSP3/LLR；
将11条准确的基因组片段序列中的VP7片段和具有分子标签的NSP4片段或11条准确的基因组片段序列中的NSP4片段以同源重组的方法克隆入pT7-VP4/LLR质粒载体中，构建得到权利要求1所述的pT7-VP4+VP7+muNSP4/LLR或pT7-VP4+VP7+NSP4/LLR；
将具有分子标签的NSP5片段或11条准确的基因组片段序列中的NSP5片段以同源重组的方法克隆入pT7-NSP2/LLR质粒载体中，构建得到权利要求1所述的pT7-NSP2+muNSP5/LLR或pT7-NSP2+NSP5/LLR。
本发明还提供了一种羊轮状病毒的反向遗传病毒拯救系统，包括所述的感染性克隆质粒、辅助质粒pCMV-868CP、MA104细胞或MA104N*V工程细胞株和BHK-T7/9细胞。
优选的，所述辅助质粒pCMV-868CP以CMV为启动子，以(G4S)4为连接肽，融合表达非洲猪瘟病毒加帽酶NP868R和T7 RNAP。
优选的，所述MA104 N*V工程细胞株为MA104细胞株基因组整合有BVDV的N蛋白和PIV5的V蛋白。
本发明还提供了一种所述的羊轮状病毒的反向遗传病毒拯救系统拯救病毒的方法，包括以下步骤：
将所述的感染性克隆质粒、辅助质粒pCMV-868CP和Opti-MEM混合，然后与TransIT-LT1转染试剂混合静置后转染至BHK-T7/9细胞中；培养、清洗后将MA104 N*V工程细胞株与转染的BHK-T7/9细胞混合共培养，拯救得到羊轮状病毒重组病毒株。
优选的，所述感染性克隆质粒、辅助质粒pCMV-868CP和Opti-MEM混合比例为10～14μg：1～2μg：200～300μL；
所述TransIT-LT1转染试剂、感染性克隆质粒、辅助质粒pCMV-868CP的比例为20～35μL：10～14μg：1～2μg；所述混合静置的时间为20～40min；
所述培养使用DMEM完全培养基，所述清洗使用DMEM不完全培养基，所述培养的时间为42～54h；所述共培养的时间为2～5天。
本发明还提供了一种所述的羊轮状病毒感染性克隆质粒或所述羊轮状病毒的反向遗传病毒拯救系统在构建表达外源蛋白的重组病毒中的应用。
优选的，将所述表达外源蛋白的基因片段连接到所述的感染性克隆质粒上。
本发明还提供了一种所述的羊轮状病毒感染性克隆质粒或所述羊轮状病毒的反向遗传病毒拯救系统在制备预防和/或治疗性的疫苗和/或药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明成功拯救了基于5质粒感染性克隆的rLLR重组病毒，rLLR(5+1质粒系统)显示出了与野毒株wtLLR极为相似的体外复制特性；相比于11+1质粒系统大大提高了拯救效率。
本发明共构建了5种不同2A肽融合的NSP3/LLR ORF和SARS-CoV2/RBD表达框，将单个质粒转染BHK-T7/9细胞时，挑选RBD表达量最高的2A肽融合质粒用于重组病毒的拯救。最终，以P2A为核糖体跳跃元件，将SARS-CoV2 RBD融合入NSP3/LLR ORF的C端，在5+1质粒系统中成功拯救出表达SARS-CoV2 RBD蛋白的重组病毒rLLR/NSP3-CoV2/RBD，该病毒具备的复制动力学略低于LLR，该拯救病毒能够在P10稳定表达RBD，并且口服该轮状病毒后，能够产生RBD的抗体。
本发明在5质粒羊轮状病毒的反向遗传病毒拯救系统中成功拯救出了重组病毒rLLR/NSP3-NLuc，该拯救病毒能够稳定表达NLuc。
本发明以我国广泛使用的轮状病毒疫苗株(兰州生物制品研究所生产的罗特威疫苗LLRV)为骨架，构建和改造轮状病毒，其安全性和有效性得以充分保障。
附图说明
图1是LLRV基因组感染性克隆质粒构建示意图(注：11个LLRV基因组片段的全长cDNA位于含有pT7启动子的质粒内，上游与T7启动子连接，下游与HDV核酶连接，确保LLRV(+)RNA全长具有真实的5'和3'末端)；
图2是5质粒感染性克隆系统组成及构建示意图；
图3是pCMV-868CP辅助质粒构建的示意图；
图4是plvx-BVDV-N-PIV5-V质粒构建的示意图；
图5是pT7-VP3+NSP3-P2A-NLuc/LLR和pT7-VP3+NSP3-P2A-RBD/LLR质粒的示意图；
图6是5种2A肽重组质粒RBD表达量的比较(注：GFP：pT7-LIET-GFP质粒；P2A：pT7-NSP3-P2A-RBD/LLR质粒；T2A：pT7-NSP3-T2A-RBD/LLR质粒；E2A：pT7-NSP3-E2A-RBD/LLR质粒；EB2A：pT7-NSP3-EB2A-RBD/LLR质粒；F2A：pT7-NSP3-EB2A-RBD/LLR质粒)；
图7是(5+1)质粒系统和(11+1)质粒系统中rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD重组病毒感染MA104细胞的形态(10×)；
图8是P1～P5代rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD的dsRNA-PAGE硝酸银染色鉴定结果；
图9是rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD NSP3/LLR基因的RT-PCR扩增结果；
图10是P1～P5代rLLR/NSP3-NLuc中荧光素酶活性测定结果；
图11 P1～P5代rLLR/NSP3-CoV2/RBD中CoV2/RBD蛋白的westernblot检测结果；
图12 rLLR/NSP3-CoV2/RBD中LLR/VP6和CoV2/RBD蛋白的间接免疫荧光(60×)；
图13是(5+1)质粒系统和(11+1)质粒系统中rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD与亲本株rLLR稀释10-4后的间接免疫荧光(10×)；
图14是(5+1)质粒系统和(11+1)质粒系统中rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD与亲本株rLLR按照MOI 0.01PFU/cell接种MA104细胞的生长动力学特性(注：A.滴度；B.基因组拷贝数)；
图15是重组病毒rLLR/NSP3-CoV2/RBD免疫5日龄Balb/c乳鼠的动物实验过程图；
图16是rLLR和rLLR/NSP3-CoV2/RBD感染Balb/c乳鼠后的腹泻率和体外排毒情况；
图17是rLLR和rLLR/NSP3-CoV2/RBD感染Balb/c乳鼠后IgG特异性抗体检测结果；
图18是rLLR和rLLR/NSP3-CoV2/RBD感染Balb/c乳鼠后IgA特异性抗体检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
LLRV是我国兰州生物制品研究所研制的婴幼儿用于预防轮状病毒感染所致急性胃肠炎的轮状病毒减毒疫苗。该疫苗株来源于羊轮状病毒在细胞上连续传代后获得的减毒株。
细胞培养：MA104细胞在添加10％胎牛血清和1％青链霉素溶液的DMEM培养基中传代培养；HEK-293T细胞在添加10％胎牛血清和1％青链霉素溶液的DMEM培养基中传代培养；BHK-T7/9细胞在添加10％胎牛血清，10％胰蛋白示磷酸盐肉汤(Tryptose PhosphateBroth，TPB)，1％非必需氨基酸溶液(Non-Essential Amino Acids，NEAA)和1％L-谷氨酰胺(L-glutamine，L-Gln)的DMEM培养基中传代培养，并每隔一代加入600μg/mL潮霉素B传代培养。
质粒pUC-CoV2-Spike(奥密克戎变异株)由中国疾病预防控制中心病毒性腹泻室保存。
实施例1轮状病毒传代培养
1.病毒激活：胰蛋白酶水解轮状病毒刺突蛋白VP4后形成VP5*和VP8*，有利于病毒吸附和入胞，并增强病毒的感染力。因此，将在-80℃冰箱保存的羊源LLRV病毒液融化后，加入终浓度为10μg/mL的胰蛋白酶，37℃激活1h。
2.病毒吸附：将已长成致密单层的MA104细胞用PBS缓冲液轻洗3次，而后将激活的病毒液接种到单层MA104细胞上，5％CO2培养箱中吸附2h，期间每15min混匀一次。
3.维持培养：吸附2h后，吸弃培养瓶中的吸附液，用PBS缓冲液清洗2次，并加入胰蛋白酶终浓度为2μg/mL的DMEM维持液培养7～9d，逐日观察，待细胞病变达80％以上时收获病毒，反复冻融3次，分装成小管于-80℃冰箱保存备用。
实施例2轮状病毒全基因组扩增
对于LLRV的全基因组扩增，首先，采用5'/3'RACE对每条基因组的5'/3'末端进行确认。其次，再根据5'/3'RACE结果，设计LLRV特异性引物进行基因组全长扩增，对于片段较长的VP1(3302bp)、VP2(2687bp)和VP3(2592bp)片段，分别采用4对、4对和3对引物进行RT-PCR扩增，其余8个片段均采用1对引物进行RT-PCR扩增。
1.病毒RNA的提取
将LLRV病毒液置于冰上完全溶解，4℃，3000rpm，离心10min去除细胞碎片，参照病毒RNA提取试剂盒说明书提取LLRV的基因组，置于-20℃保存。
2.解链
将步骤1中提取的LLRV dsRNA置于PCR仪中，98℃5min，解链后ssRNA不稳定，需立即置于冰上。
3.ssRNA 3'末端加Poly(A)尾，反应体系如下：
表1 ssRNA 3'末端加Poly(A)尾的反应体系
| 组分 | 用量(μL) | 终浓度 |
| 10×Poly(A)Polymerase | 6 | 1× |
| E.coli Poly(A)Polymerase(5U/μL) | 6 | 0.05-0.5U/μL |
| ATP(10mM) | 3 | 0.5mM |
| ssRNA | 60 | 500ng/μL |
置于PCR仪中，37℃反应30min。
4.磁性分离法从总RNA中分离poly(A)+RNA
参照VAHTS mRNA Capture Beads说明书对poly(A)+RNA进行筛选，具体步骤如下：
向RNase-free离心管中加入200μL加A尾的mRNA，加入500μL Buffer VL，涡旋混匀15～30sec，将混合液瞬时离心收集至管底。
将FastPure RNA Columns置于Collection Tubes 2mL中，转移上述混合液至FastPure RNA Columns中，12，000rpm离1min，弃滤液。
向FastPure RNA Columns中加入600μL Buffer RW，12，000rpm离心30sec；弃滤液。
重复步骤3。
空柱12,000rpm离心2min。
小心将FastPureRNA Columns转移至新的1.5mL RNase-free Collection Tubes中，向膜中央悬空加入30μL的RNase-free ddH2O，室温放置1min，12，000rpm离心1min。
弃去FastPure RNA Columns，将poly(A)+RNA置于-20℃保存备用。
5.5'/3'RACE
参考兰州生物制品研究所上传至GenBank的LLRV基因组序列(登录号：JQ013502～JQ013504，JQ013506，JQ031150，HM800948，JQ031145～JQ031148，JQ031151)，使用诺唯赞生物5'/3'RACE GSP引物在线设计软件Primer design(appbi.vazyme.com:8085)，对每个基因片段的5'/3'末端随机设计1～2条特异性引物，分别命名为LLRV-片段名称-51(52)/31(32)，引物序列见表2，交由擎科生物合成。
表2 LLRV 5'/3'末端序列扩增引物
(1)预变性反应体系如下:RNA100ng，5'GSP Primer(5'RACE)和3'CDS Primer(3'RACE)2μL，dNTP Mix2μL，RNase-free ddH2O补足至13μL。
置于PCR仪中，70℃反应3min，立即置于冰上。
(2)反转录反应体系如下表3：
表3反转录反应体系
置于PCR仪中，42℃反应90min，70℃反应15min，立即置于冰上。
(3)PCR扩增反应体系如下：5'RACE-Ready cDNA2.5μL，5'GSP(10μM)1μL，10×Universal Primer Mix5μL，2×PCR Mix25μL，ddH2O16.5μL，Total 50μL。
PCR扩增反应条件如下：预变性(98℃，1min)，变性(98℃，10s)，退火(68℃，15s)，延伸(72℃，3min)，循环次数25次，总延伸(72℃，5min)。
(4)巢式PCR(Nested PCR)扩增
取5μL步骤(3)中的扩增产物为模板，使用试剂盒中自带的Nested Primer进行巢式PCR扩增，反应体系如下：步骤(3)中的扩增产物5μL，5'/3'GSP(10μM)1μL，NestedPrimer1μL，2×PCR Mix25μL，ddH2O18μL，Total50μL.
PCR扩增反应条件同步骤(3)。
(5)琼脂糖凝胶电泳及扩增产物胶回收
按照5μL PCR产物+1μL 6×Loading buffer的比例混匀后，将50μL PCR产物和2μLDNA Marker一起点样于1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳，120V电压电泳30min，在凝胶成像仪中照胶、观察结果，对阳性产物切胶并进行凝胶回收纯化。
(6)连接反应
将上述纯化产物，按照[0.05×片段碱基对数]ng的最适使用量，连接pCE2-TA/Blunt-Zero载体，配置体系如下：5×TA/Blunt-Zero Cloning Mix1μL，胶回收产物1～4μL，ddH2O补足至5μL
轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体于0.2mL离心管底，置于PCR仪25℃，5min。
(7)细胞转化
①从-80℃冰箱取出的Trelief TM 5α感受态细胞，放置冰上解冻；
②向Trelief TM 5α感受态细胞中加入5μL步骤2.2.5的连接产物，放入冰里，静置5min；
③42℃金属浴45s后迅速放入冰浴中，静置2min；
④加入500μL未加抗生素的LB液体培养基，混匀得到复苏液，取部分转化产物涂于kan+LB培养基平板上，用L型细胞涂抹棒均匀涂布，液体晾干后，将培养皿倒置放37℃温箱过夜。
(8)挑取克隆、质粒小提和测序
次日分别挑选长势良好的克隆菌落至1mL kan+液体LB培养基中，于37℃恒温摇床，180rpm震荡培养7h，参照质粒小提试剂盒说明书对菌液进行质粒小提，送擎科生物测序。
6.RT-PCR扩增
根据5'/3'末端RACE扩增的结果，使用Snapgene软件设计LLRV基因组全长扩增引物，引物序列见表4，由擎科生物合成，利用步骤1提取的LLRV RNA进行RT-PCR扩增。
表4 LLRV全基因组RT-PCR扩增引物
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(1)解链变性反应体系如下：Forward Primer(10μM)0.5μL，Reverse Primer(10μM)0.5μL，ddH2O 2μL，RNA模板4μL，Total 7μL。
置于PCR仪中，98℃5min，迅速放置于冰上备用。
(2)一步法RT-PCR反应体系如下：5×Buffer 6μL，10μM dNTPS1μL，Enzyme Mix1μL，变性产物7μL，ddH2O15μL，Total 30μL。
(3)RT-PCR反应程序：
表5RT-PCR反应程序
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参照实施例2中5.5'/3'RACE的操作，对RT-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、胶回收、连接、转化、挑菌、摇菌和质粒小提，送擎科生物测序。对测序正确的阳性克隆质粒pCE2 TA/Blunt-VP4/LLRV、pCE2 TA/Blunt-VP6/LLRV、pCE2 TA/Blunt-VP7/LLRV、pCE2 TA/Blunt-NSP1/LLRV、pCE2 TA/Blunt-NSP2/LLRV、pCE2 TA/Blunt-NSP3/LLRV、pCE2 TA/Blunt-NSP4/LLRV和pCE2 TA/Blunt-NSP5/LLRV，-20℃保存。
(7)序列结果分析
利用Snapgene软件将每个片段5'/3'RACE测序结果和RT-PCR扩增测序结果进行拼接，共得到11条完整、5'/3'末端准确的LLRV基因组测序结果。
实验结果：以LLR dsRNA基因组为模板，将11个原始片段进行5'/3'RACE和RT-PCR扩增克隆测序后的结果进行拼接，经SnapGene软件比对分析发现，本研究获得的LLR的全基因组序列与兰州生物制品研究所上传至GenBank(登录号：JQ013502～JQ013504，JQ013506，JQ031150，HM800948，JQ031145～JQ031148，JQ031151)的LLR全基因组序列共有20个核苷酸位点不同，分别位于片段VP2，VP3，NSP3和NSP5的5'末端和片段VP1，VP4，VP7和NSP1的3'末端，ORF区序列没有差异，具体不同位点的序列信息见表6。本研究获得的LLR的全基因组序列已上传至GenBank，登录号为：OQ603388-OQ603398。
表6 LLR毒株5'/3'末端不同核苷酸位点序列
实施例3 LLRV 11个感染性克隆质粒的构建
为了保证LLRV的感染性克隆质粒在转录时能产生精确的5'和3'末端，在LLRV每条基因组的5'末端连接T7启动子，3'末端连接HDV核酶，质粒构建示意图见图1。
1.引物设计
首先，以pT7-VP1/SA11质粒为载体片段PCR扩增的模版，设计载体扩增引物ZT-pT7-SA11-F/R。其次，对于插入片段较长的VP1(3302bp)、VP2(2687bp)和VP3(2592bp)，由金唯智科技有限公司合成目的基因质粒pUC-VP1/LLRV、pUC-VP2/LLRV、pUC-VP3/LLRV为模版。其余8个片段，均以实施例2中6.RT-PCR扩增中制备的pCE2 TA/Blunt-VP4/LLRV、pCE2 TA/Blunt-VP6/LLRV、pCE2 TA/Blunt-VP7/LLRV、pCE2 TA/Blunt-NSP1/LLRV、pCE2 TA/Blunt-NSP2/LLRV、pCE2 TA/Blunt-NSP3/LLRV、pCE2 TA/Blunt-NSP4/LLRV和pCE2 TA/Blunt-NSP5/LLRV质粒为模板，设计插入片段的PCR扩增引物，分别命名为CR-LLRV-片段名称-F/R，引物序列见表7(小写序列为5'端添加的重组序列)，交由擎科生物合成。
表7 11个LLRV感染性克隆质粒构建的PCR扩增引物
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2.PCR反应体系如下：2×Phanta Max Master Mixs 25μL，F(10μM)1μL，R(10μM)1μL，质粒DNA 1μL，ddH2O 22μL，Total 50μL。
扩增条件：95℃3min；95℃15s，55℃15s，72℃1min/kb；共35个循环；72℃5min。参照实施例2中5.(5)操作步骤进行琼脂糖凝胶和胶回收纯化。
3.同源重组
将线性化载体和插入片段分别按照0.03pmol和0.06pmol的最佳比例，于冰上配置反应体系：线性化载体0.03pmol，插入片段0.06pmol，5×CE Buffer4μL，ExnaseⅡ2μL，ddH2O补足至20μL。
使用移液器轻轻吸打混匀，为防止片段断裂，切勿震荡混匀，置于PCR仪中，37℃反应30min，立即置于冰上冷却。
4.转化、摇菌和菌液PCR扩增
利用Trelief TM 5α感受态细胞对同源重组产物进行转化，每个转化产物随机挑取5个菌落进行摇菌，并用载体通用引物T7-F和T7ter-R进行菌液PCR快速扩增，反应体系如下：2×Rapid Taq Master Mix10μL，T7-F(10μM)1μL，T7ter-R(10μM)1μL，菌液1μL，ddH2O 7μL。
95℃3min，(95℃15sec，55℃30sec，72℃15sec/kb)×35，72℃5min；将琼脂糖凝胶电泳中位置正确的阳性菌液，用50％甘油与菌液按照1:1的比例保菌，剩余菌液质粒小提后送擎科生物测序。
5.质粒大提
对于测序鉴定正确的阳性质粒，用步骤4中对应编号的保存菌液按照1：1000的比例接种300mL Amp+的LB液体培养基，230rpm过夜震荡培养。次日，用QIAGEN去内毒素质粒提取试剂盒进行质粒大提，具体操作步骤如下：
①实验准备：将RNaseA和lyseBlue加到Buffer P1中颠倒混匀并储存于2～8℃；在4℃预冷Buffer P3；制备含70％乙醇的去内毒素无菌水。
②将300mL过夜培养的菌液倒入广口离心瓶中配平，4℃，6000rpm离心30min，将菌体沉淀至瓶底，弃上清，倒置于吸水纸上。
③吸8mL Buffer P1加入离心瓶中，用10mL移液管将菌体沉淀吹打混匀，并移入50mL离心管中，再加2mL Buffer P1吹洗瓶身，移入50mL离心管中，此时菌体应变得粘稠。
④向离心管中加入10mL Buffer P2，温和上下翻转混匀，此时菌体应为蓝色，室温静置5min。
⑤向离心管中加入10mL预冷的Buffer P3，温和上下翻转混匀，此时菌体应为白色絮状，室温静置10min使菌体充分裂解，4℃，8000rpm离心10min。将上清倒入过滤装置中，用活塞将上清打入新的50mL离心管中。
⑥去内毒素：向50mL离心管中加入2.5mL Buffer ER，上下颠倒混匀，冰上静置30min。
⑦柱平衡：加l0mL Buffer QBT于QIAGEN-tip吸附柱中，平衡柱子。
⑧DNA吸附：将步骤7中的液体倒入平衡后的QIAGEN-tip吸附柱中，静流。
⑨洗涤：将30mL，Buffer QC加入QIAGEN-tip吸附柱中，洗2次。
⑩洗脱：将QIAGEN-tip吸附柱移入新的50mL离心管中，加15mL Buffer QN，静流洗脱质粒DNA。
DNA沉淀：加10.5mL异丙醇到洗脱下来的液体中，颠倒混匀，4℃，9000rpm离心45min。
DNA溶解：在生物安全柜中风干质粒DNA，加入400μL Buffer TE，室温静置2h溶解质粒。
使用NanoDrop测定质粒浓度，用Buffer TE将提取质粒的浓度调整至1μg/μL，此时，260/280吸光度比≈1.8，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳验证应主要为超螺旋结构，将验证正确的质粒分装为20μL每管，-20℃保存备用。
实验结果：得到11个感染性克隆质粒pT7-VP1/LLR、pT7-VP2/LLR、pT7-VP3/LLR、pT7-VP4/LLR、pT7-VP6/LLR、pT7-VP7/LLR、pT7-NSP1/LLR、pT7-NSP3/LLR、pT7-NSP4/LLR，pT7-NSP2/LLR和pT7-NSP5/LLR。
实施例4 LLRV感染性克隆质粒定点突变
1.引物设计
使用SnapGene软件分析LLRVNSP1，NSP3，NSP4和NSP5片段的同义、单点突变、单一性酶切位点，根据突变位点所在的位置，分别在每个片段上设计1对定点突变PCR扩增，引物序列见表8(小写序列为同义突变位点；下划线为突变后单一性酶切位点)，交由擎科生物合成。
表8 LLRV感染性克隆质粒定点突变引物
2.目的质粒扩增
以实施例3构建得到的感染性克隆质粒pT7-NSP1/LLR，pT7-NSP3/LLR，pT7-NSP4/LLR和pT7-NSP5/LLR为定点突变PCR扩增的模版，为了防止假阳性克隆过多，在能够正常扩增的前提下，应尽量减少质粒模板的投入量，PCR反应体系如下：2×Max Buffer 25μL，dNTPMix(10mM each)1μL，F(10μM)1μL，R(10μM)1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase 1μL，质粒DNA 1～3ng，ddH2O补足至50μL。
扩增条件：95℃30s；95℃15s，60℃15s，72℃30～60s/kb；共30个循环；72℃5min；利用琼脂糖凝胶电泳鉴定，对阳性产物切胶回收。
3.扩增产物DpnⅠ消化
由于扩增产物中包含原始质粒，为防止其在转化后形成假阳性转化子，必须在进行重组环化之前进行DpnⅠ消化，去除甲基化模板质粒，反应体系为DpnⅠ1μL，扩增产物50μL。
轻轻吸打混匀后，短暂离心后收集至0.2mL PCR管底，置于PCR仪中，37℃反应2h。
4.重组反应
用NanoDrop测定DpnⅠ消化产物的浓度，以0.03pmol为最佳模板投入量进行重组反应，反应体系如下：DpnⅠ消化产物0.03pmol，5×CE MultiS Buffer 4μL，ExnaseⅡMultiS 2μL，ddH2O补足至20μL
置于PCR仪中，37℃反应30min，立即置于冰上冷却。利用Trelief TM 5α感受态细胞对重组产物进行转化、摇菌、质粒小提、测序鉴定和质粒大提，具体操作步骤参考实施例3。
实验结果：得到4个突变质粒pT7-muNSP1/LLRV、pT7-muNSP3/LLRV、pT7-muNSP4/LLRV和pT7-muNSP5/LLRV。
实施例55个感染性克隆质粒的构建
以实施例3和实施例4构建的目的质粒为模版，将LLR基因组的2～3个片段组合插入同一载体中，构建LLR的5个感染性克隆质粒。首先，分别以pT7-VP1/LLR，pT7-VP2/LLR，pT7-VP3/LLR，pT7-VP4/LLR和pT7-NSP2/LLR为载体片段的PCR扩增模板设计引物，命名为LLR-ZT-F/R。其次，分别以pT7-VP6/LLR，pT7-muNSP1/LLR或pT7-NSP1/LLR，pT7-muNSP3/LLR或pT7-NSP3/LLR，pT7-VP7/LLR，pT7-muNSP5/LLR或pT7-NSP5/LLR和pT7-muNSP4/LLR或pT7-NSP4/LLR为插入片段1和插入片段2的PCR扩增模板设计引物，分别命名为LLR-CR1-F/R和LLR-CR2-F/R，引物序列见表9(小写序列为5'端添加的重组序列)，交由擎科生物合成。质粒构建示意图见图2，通过PCR扩增、凝胶回收、同源重组、小提质粒鉴定和质粒大提步骤完成，具体操作步骤见实施例3 LLR 11个感染性克隆质粒的构建。
表9 LLR 5个感染性克隆质粒构建PCR扩增引物
实验结果：得到5个感染性克隆质粒：pT7-VP1+VP6/LLR、pT7-VP2+muNSP1/LLR、pT7-VP3+muNSP3/LLR、pT7-VP4+VP7+muNSP4/LLR和pT7-NSP2+muNSP5/LLR，
或pT7-VP1+VP6/LLR、pT7-VP2+NSP1/LLR、pT7-VP3+NSP3/LLR、pT7-VP4+VP7+NSP4/LLR和pT7-NSP2+NSP5/LLR；序列如表10。
表105个感染性克隆质粒序列
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实施例6 pCMV-868CP辅助质粒的构建
1.T7 RNA聚合酶基因的扩增
根据NCBI GenBank中T7 RNAP基因序列(GenBank登录号：FJ881694)，设计T7 RNAP的编码区扩增引物，扩增片段大小为2652bp，引物序列见表11，交由擎科生物合成。
表11 T7 RNAP基因编码区PCR扩增引物
取一支E.coli BL21(DE3)感受态在冰上融化，加入500μL无抗性LB液体培养基，在37℃摇床上以180rpm培养8h，3000rpm离心1min弃上清，加入10μL ddH2O将菌体重新悬起，置于PCR仪中，98℃变性5min，立即置于冰上。以E.coli BL21(DE3)基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系如下：2×Phanta Max Master Mixs 12.5μL，T7 RNAP-F(10μM)1μL，T7RNAP-R(10μM)1μL，E.coli BL21(DE3)基因组1μL，ddH2O 9.5μL，Total 25μL。
扩增条件：95℃3min；95℃15s，55℃15s，72℃2min 30s；共35个循环；72℃5min；利用琼脂糖凝胶电泳鉴定，对阳性产物切胶回收，送擎科生物测序。
2.质粒无缝克隆
pCMV-868CP质粒是以CMV为启动子，以(G4S)4为连接肽，融合表达非洲猪瘟病毒加帽酶NP868R和T7 RNAP的质粒(见图3)。首先，以pCMV/NP868R质粒为载体片段PCR扩增的模板设计引物，命名为pCMV/NP868R-F/R。其次，以T7 RNAP胶回收产物为插入片段PCR扩增的模板，通过2轮PCR扩增在5'端添加(G4S)4连接肽序列设计引物，命名为T7 RNAP-F1(2)/R，引物序列见表12(小写序列为5'端添加的重组序列)，交由擎科生物合成。通过PCR扩增→琼脂糖凝胶电泳→胶回收→同源重组→小提质粒鉴定→质粒大提步骤完成，具体操作步骤见实施例3 LLRV 11个感染性克隆质粒的构建。
表12 pCMV-868CP质粒构建的PCR扩增引物
构建得到融合表达非洲猪瘟病毒加帽酶NP868R和T7 RNAP的pCMV-868CP质粒。
实施例7 MA104 N*V工程细胞株的构建
1.plvx-BVDV-N-PIV5-V质粒的构建
pUC-BVDV-N-PIV5-V质粒由苏州金唯智生物科技有限公司合成，将plvx-IRES-Puro载体与pUC-BVDV-N-PIV5-V质粒同时用限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，37℃金属浴1h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，并对相关片段进行凝胶回收，采用T4 DNA快速连接酶在25℃金属浴连接1h，将连接产物转化到Trelief TM 5α感受态细胞，接种至Amp+LB平板培养基中过夜培养。从平板培养基中挑取单个菌落，180rpm摇床过夜，提取质粒。双酶切验证正确的质粒由北京擎科生物科技有限公司进行测序，plvx-BVDV-N-PIV5-V质粒构建示意图如图4。
2.慢病毒的包装
取293T细胞，消化后调整细胞密度为1×106/mL，接种到35mm平皿中；约18-24h后，待细胞汇合度达到90％以上进行转染，将PMD2.G:psPAX2:plvx-BVDV-N-PIV5-V三种包装质粒按照摩尔比2:1:1的比例，参照LipofectamineTM3000转染试剂的操作说明书进行转染，转染后放置37℃，5％CO2培养箱中；36h和60h后收集上清，3000rpm，离心10min去除细胞碎片；用Amicon Ultra-0.5mL 10K超滤离心管浓缩病毒，保存于-80℃。
3.慢病毒感染MA104细胞
取MA104细胞，消化后调整细胞密度为4×105/mL，每孔2mL，均匀铺入6孔板中，37℃，5％CO2培养；18～24h，待细胞汇合度至40％～50％进行感染，吸弃6孔板中的培养基，更换新的培养基，加入100μL浓缩的慢病毒液，并加入终浓度为10μg/mL的聚凝胺(polybrene)，37℃，5％CO2培养12h；将感染慢病毒的MA104细胞(实验组)和正常MA104细胞(对照组)同时消化后铺入新的6孔板中，待其完全长满后，用含10μg/μL嘌呤霉素的无血清培养基进行换液，37℃孵育48h；期间，观察细胞生长状况，当对照组全部死亡后，收集实验组，接种至T25细胞培养瓶中增殖，并将其命名为MA104N*V细胞。
实施例8 rLLRV野毒株的拯救
1.质粒转染
(1)转染前一天，将7～8×105BHK-T7/9细胞铺入六孔板中，培养18～24h，此时此时细胞的汇合度达80％～90％。
(2)分别利用5个感染性克隆质粒和11个重组质粒拯救携带分子标签的rLLRV，将以下各质粒按照所需质量添加到250μL Opti-MEM中，实施例5中的5个感染性克隆质粒：pT7-VP1+VP6/LLR、pT7-VP2+muNSP1/LLR、pT7-VP3+muNSP3/LLR和pT7-VP4+VP7+muNSP4/LLR(各0.8μg)，pT7-NSP2+muNSP5/LLR(2.4μg)，辅助质粒pCMV-868CP(1.6μg)；
或pT7-VP1+VP6/LLR、pT7-VP2+NSP1/LLR、pT7-VP3+NSP3/LLR、pT7-VP4+VP7+NSP4/LLR(各0.8μg)，pT7-NSP2+NSP5/LLR(2.4μg)，辅助质粒pCMV-868CP(1.6μg)；
实施例3和实施例4得到的11个重组质粒：pT7-VP1/LLRV、pT7-VP2/LLRV、pT7-VP3/LLRV、pT7-VP4/LLRV、pT7-VP6/LLRV、pT7-VP7/LLRV、pT7-muNSP1/LLRV、pT7-muNSP3/LLRV、pT7-muNSP4/LLRV(各0.8μg)，pT7-NSP2/LLRV和pT7-muNSP5/LLRV(各2.4μg)，辅助质粒pCMV-868CP(1.6μg)；
或pT7-VP1/LLRV、pT7-VP2/LLRV、pT7-VP3/LLRV、pT7-VP4/LLRV、pT7-VP6/LLRV、pT7-VP7/LLRV、pT7-NSP1/LLRV、pT7-NSP3/LLRV、pT7-NSP4/LLRV(各0.8μg)，pT7-NSP2/LLRV和pT7-NSP5/LLRV(各2.4μg)，辅助质粒pCMV-868CP(1.6μg)。
按照2μL/μg的比例添加TransIT-LT1转染试剂，将质粒与转染试剂复合物在室温下混合静置30min后，均匀逐滴添加到BHK-T7/9细胞中。
(3)24h后，用3mL DMEM清洗个孔2次，并添加1.5mL DMEM不完全培养基(无血清，含10％TPB，1％NEAA和1％L-Gln)至各孔中。48h后，将1×105MA104 N*V细胞添加到转染的BHK-T7/9细胞中，并调整各孔的胰酶浓度为0.5μg/mL。
(4)BHK-T7/9和MA104 N*V细胞共培养3d后，将转染的6孔板在室温和-80℃反复冻融3次，细胞在-80℃冷冻至少4h，并储存于-80℃，准备接毒备用。
2.转管接毒
将消化好的MA104 N*V细胞铺入转管，待其长成致密单层准备接毒备用，取600μL冻融3次的病毒液，加入终浓度为5μg/mL的胰蛋白酶，37℃温箱激活lh。弃去6孔板中MA104N*V细胞培养基，用PBS液清洗3次，接种激活的病毒液，37℃，5％CO2培养箱中吸附2h，期间每15min混匀一次。2h后，吸弃转管中的吸附液，用PBS液清洗2次，并加入胰蛋白酶终浓度为2μg/mL的DMEM维持液(胰蛋白酶水解VP4后形成VP5*和VP8*，有利于病毒进入细胞，并增强病毒的感染力)在37℃，5％CO2培养箱的转管架中慢速旋转培养7～9d，或者观察到CPE。
实施例9重组病毒rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD的构建和拯救
1.pT7-VP3+NSP3-NLuc/LLR重组质粒的构建：
分别以pCRISPaint-NanoLuc质粒为插入片段PCR扩增的模板，以pT7-VP3+NSP3/LLR质粒为载体PCR扩增的模板，使用SnapGene软件设计同源重组引物，引物序列见表13(小写序列为5'端添加的重组序列)，交由北京擎科生物有限公司合成。
pT7-VP3+NSP3-P2A-RBD/LLR重组质粒的构建：
以pUC-CoV2-Spike质粒为模板，经过2轮PCR扩增，分别将tPA和Foldon序列加在SARS-CoV2/RBD序列的5'和3'端，构建pUC-tPA+CoV2/RBD+Foldon质粒。分别以pCRISPaint-NanoLuc和pUC-tPA+CoV2/RBD+Foldon质粒为插入片段PCR扩增的模板，以pT7-VP3+NSP3/LLR质粒为载体PCR扩增的模板，使用SnapGene软件设计同源重组引物，引物序列见表13(小写序列为5'端添加的重组序列)，交由北京擎科生物有限公司合成。pT7-VP3+NSP3-NLuc/LLR和pT7-VP3+NSP3-RBD/LLR质粒的示意图见图5。
表13 pT7-VP3+NSP3-NLuc/LLR和pT7-VP3+NSP3-RBD/LLR质粒构建的PCR扩增引物
所述pT7-VP3+NSP3-NLuc/LLR的序列为CGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGGGGGATATCGATCCCGGGTTAATACGACTCACTATAGGCTATTAAAGCAGTACCAGTTTTGTGTTTTACCTCTGATGGTGTAAACATGAAAGTATTAGCTTTAAGACATAGTGTGGCTCGGGTATATGCAGACACTCAAGTGTACACACATGATGACTCTAAAGACGACTACGAAAATGCTTTTTTAATTTCTAATCTCACTACGCATAATATATTATATCTAAATTATAGTATAAAAACATTGCAAATACTAAATAAATCTGGTATAGCTGCAATAGAGATACAGAAAATGGATGAGCTATTTACATTAATTAGATGCAATTTTACATATGATTACATTGACGATATTGTCTATTTGCATGACTATTCATACTATACTAATAATGAGATACGGACCGATCAGCACTGGGTAACCAAGACAAATATAGAGGATTATCTATTACCAGGATGGAAATTGACGTACGTTGGATACAATGGGAGTGGTACAAGAGGACATTATAACTTTTCATTTAAATGTCAGAATGCAGCTACAGATGATGATGCGATAATAGAATACATTTATTCGGATGAATTAGACTTCCAAAATTTTATACTTAAAAAGATTAAAGAAAGAATGACAACATCGCTGCCAATAGCAAGACTTTCAAATCGTGTGTTTAGAGATAAATTATTTAAAATATTACTAGTGAATCATAATAAAGTAATTAATGTTGGACCTAGAAATGAATCTATGTTTACTTTTTTAGATTATCCATCAATAAAGCAATTTTCAAATGGACCATATCTAGTTAAAGATACAATTAAACTTAAACAAGAAAGATGGCTTGGTAAGAGATTGTCACAGTTTGATATTGGTCAATACAAGAATATGCTGAATGTATTAACAACATTGTATCAATATTATGATATGTATCACGACAAACCAATTATATATATGGTAGGATCAGCGCCTTCATACTGGATATATGATGTTAAGCAATATTCTAACTTAAAGTTTGAGACGTGGGACCCATTGGACACACCATATTCTGATCTGCATCATAAGGAGTTATTTTACATCAATGATGTGCTTAAACTTAAAGATAATTCAATATTATATGTAGATATAAGAACGGATAGAGAAAATATGAATTGGAAGGAATGGAGAAAAGTAGTGGAAGAACAAACCATTAGCAATTTAAACATCGCATATAAATATTTATCTACGGGGAAAGCTAAGATATGTTGTGTTAAAATGACTGCTATGGATTTAGAATTGCCAATATCTGCAAAATTATTACATCATCCAACTACAGAAATCAGATCAGAATTTTATTTGATAATGGATATATGGGATTCTAGAAATATTAAAAGATTTATACCGAAAGGTGTATTATATTCATATGTAAATAACATAATTACTGAAAACGTATTCATACAGCAACCATTTAAGTTGAAAACATTGAAAAATGAGTACATAGTGGCATTGTATGCTTTGTCTAATGACTTCAATAATAGAGAAAATGTAATAAAGTTAATTAATAATCAGAAAAAAGCGTTGATAACAGTGAGAATTAATAATACGTTTAAAGATGAACCAAAGGTAGGATTTAAAAATATTTATGACTGGACTTTTTTGCCAACAGATTTCGAAACAAACGAATCAATAGTTACTTCATATGATGGATGTCTAGGTGTTTTTGGTTTATCAATATCATTGGCTTCGAAGCCAACTGGTAACAATCATTTATTTATTTTAAGCGGCACAGATAAATATTTTAAATTGGATCAATTCGCAAATCATATGAGCATATCACGACGATCACATCAGATACGATTTTCAGAGTCAGCTACTTCGTACTCAGGATATATTTTTAGAGACTTGTCTAATAATAATTTTAATTTAATAGGCACGAATGTAGAGAACTCAGTATCAGGACATGTATATAATGCATTAATTTATTATAGGTATAATTATTCATTTGATCTTAAGCGATGGATATATTTACATTCAACAGGTAAAGCTAGTATTGAAGGTGGCAGATATTATGAACACGCTCCAATAGAATTAATGTATGCATGCAGATCAGCAAGAGAATTTGCGAAACTGCAAGATGATTTAACAGTATTAAGATATTCAAATGAGATAGAAGACTATATTAATAAAGTGTATAGTATAACATACGCTGATGATCCCAACTATTTTATTGGAATCAAATTTAAAAGCATTCCTTATAAATATGATGTTAAAGTACCGCATCTTACATTCGGCGTGTTAAACGTTTCTGAACCGATACTACCAGATGTAATAGCAATTTTAAAGAAATTTAAAAATGAATTATTCAAGATGGATATAACAACGAGTTATACGTATATGTTATCTGACGAAGTGTATGTAGCGAATGTTAGTGGCGTGCTGTCAACATATTTTAAAATTTATAATGCGTTTTACAAAGAGCAAATCGCATTTGGGCAGTCAAGGATGTTTATTCCTCATATAACATTGAGTTTTAATAATGAAAAAACGGTGAGAATAGATACTACAAAATTAAATATAGATTCCATTTATTTAAGGAAAATAAAGGGTGACACGGTGTTTGATATGACTGAGTGAGCTAAAAACTTAACACACTGGTCACGATGTGACCGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGTCGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGAGCTCAAAAAAAAGGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATCGAGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTACATGTTCTTTC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ID NO:148)；
所述pT7-VP3+NSP3-P2A-RBD/LLR的序列为CGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGGGGGATATCGATCCCGGGTTAATACGACTCACTATAGGCTATTAAAGCAGTACCAGTTTTGTGTTTTACCTCTGATGGTGTAAACATGAAAGTATTAGCTTTAAGACATAGTGTGGCTCGGGTATATGCAGACACTCAAGTGTACACACATGATGACTCTAAAGACGACTACGAAAATGCTTTTTTAATTTCTAATCTCACTACGCATAATATATTATATCTAAATTATAGTATAAAAACATTGCAAATACTAAATAAATCTGGTATAGCTGCAATAGAGATACAGAAAATGGATGAGCTATTTACATTAATTAGATGCAATTTTACATATGATTACATTGACGATATTGTCTATTTGCATGACTATTCATACTATACTAATAATGAGATACGGACCGATCAGCACTGGGTAACCAAGACAAATATAGAGGATTATCTATTACCAGGATGGAAATTGACGTACGTTGGATACAATGGGAGTGGTACAAGAGGACATTATAACTTTTCATTTAAATGTCAGAATGCAGCTACAGATGATGATGCGATAATAGAATACATTTATTCGGATGAATTAGACTTCCAAAATTTTATACTTAAAAAGATTAAAGAAAGAATGACAACATCGCTGCCAATAGCAAGACTTTCAAATCGTGTGTTTAGAGATAAATTATTTAAAATATTACTAGTGAATCATAATAAAGTAATTAATGTTGGACCTAGAAATGAATCTATGTTTACTTTTTTAGATTATCCATCAATAAAGCAATTTTCAAATGGACCATATCTAGTTAAAGATACAATTAAACTTAAACAAGAAAGATGGCTTGGTAAGAGATTGTCACAGTTTGATATTGGTCAATACAAGAATATGCTGAATGTATTAACAACATTGTATCAATATTATGATATGTATCACGACAAACCAATTATATATATGGTAGGATCAGCGCCTTCATACTGGATATATGATGTTAAGCAATATTCTAACTTAAAGTTTGAGACGTGGGACCCATTGGACACACCATATTCTGATCTGCATCATAAGGAGTTATTTTACATCAATGATGTGCTTAAACTTAAAGATAATTCAATATTATATGTAGATATAAGAACGGATAGAGAAAATATGAATTGGAAGGAATGGAGAAAAGTAGTGGAAGAACAAACCATTAGCAATTTAAACATCGCATATAAATATTTATCTACGGGGAAAGCTAAGATATGTTGTGTTAAAATGACTGCTATGGATTTAGAATTGCCAATATCTGCAAAATTATTACATCATCCAACTACAGAAATCAGATCAGAATTTTATTTGATAATGGATATATGGGATTCTAGAAATATTAAAAGATTTATACCGAAAGGTGTATTATATTCATATGTAAATAACATAATTACTGAAAACGTATTCATACAGCAACCATTTAAGTTGAAAACATTGAAAAATGAGTACATAGTGGCATTGTATGCTTTGTCTAATGACTTCAATAATAGAGAAAATGTAATAAAGTTAATTAATAATCAGAAAAAAGCGTTGATAACAGTGAGAATTAATAATACGTTTAAAGATGAACCAAAGGTAGGATTTAAAAATATTTATGACTGGACTTTTTTGCCAACAGATTTCGAAACAAACGAATCAATAGTTACTTCATATGATGGATGTCTAGGTGTTTTTGGTTTATCAATATCATTGGCTTCGAAGCCAACTGGTAACAATCATTTATTTATTTTAAGCGGCACAGATAAATATTTTAAATTGGATCAATTCGCAAATCATATGAGCATATCACGACGATCACATCAGATACGATTTTCAGAGTCAGCTACTTCGTACTCAGGATATATTTTTAGAGACTTGTCTAATAATAATTTTAATTTAATAGGCACGAATGTAGAGAACTCAGTATCAGGACATGTATATAATGCATTAATTTATTATAGGTATAATTATTCATTTGATCTTAAGCGATGGATATATTTACATTCAACAGGTAAAGCTAGTATTGAAGGTGGCAGATATTATGAACACGCTCCAATAGAATTAATGTATGCATGCAGATCAGCAAGAGAATTTGCGAAACTGCAAGATGATTTAACAGTATTAAGATATTCAAATGAGATAGAAGACTATATTAATAAAGTGTATAGTATAACATACGCTGATGATCCCAACTATTTTATTGGAATCAAATTTAAAAGCATTCCTTATAAATATGATGTTAAAGTACCGCATCTTACATTCGGCGTGTTAAACGTTTCTGAACCGATACTACCAGATGTAATAGCAATTTTAAAGAAATTTAAAAATGAATTATTCAAGATGGATATAACAACGAGTTATACGTATATGTTATCTGACGAAGTGTATGTAGCGAATGTTAGTGGCGTGCTGTCAACATATTTTAAAATTTATAATGCGTTTTACAAAGAGCAAATCGCATTTGGGCAGTCAAGGATGTTTATTCCTCATATAACATTGAGTTTTAATAATGAAAAAACGGTGAGAATAGATACTACAAAATTAAATATAGATTCCATTTATTTAAGGAAAATAAAGGGTGACACGGTGTTTGATATGACTGAGTGAGCTAAAAACTTAACACACTGGTCACGATGTGACCGGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGTCGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGAGCTCAAAAAAAAGGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATCGAGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTACATGTTCT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ID NO:149)。
2.不同2A肽SARS-CoV2 RBD重组质粒的构建
为了比较不同2A肽对SARS-CoV2 RBD切割效率的影响，以pT7-VP3+NSP3-P2A-RBD/LLR质粒为PCR扩增模板，使用SnapGene软件按照定点突变的方法，设计T2A，E2A，EB2A和F2A突变引物，引物序列见表14(小写序列为5'端添加的重组序列)，交由北京擎科生物有限公司合成。PCR扩增、同源重组和质粒提取步骤参考实施例3，最终构建4个目的质粒pT7-VP3+NSP3-T2A-RBD/LLR，pT7-VP3+NSP3-E2A-RBD/LLR，pT7-VP3+NSP3-EB2A-RBD/LLR和pT7-VP3+NSP3-F2A-RBD/LLR。
表14不同2A肽质粒构建的PCR扩增引物
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ELISA法检测重组质粒SARS-CoV2 RBD蛋白的表达量
(1)转染前一天，取对数生长期的BHK-T7/9细胞，将7～8×105BHK-T7/9细胞铺入六孔板中，培养18～24h，此时细胞的汇合度达80～90％。
(2)将TransIT-LT1试剂预热至室温，使用前轻轻涡旋。将250μL Opti-MEM减血清培养基置于1.5mL无菌EP管中，加入2.5μg重组质粒DNA(和2.5μg pCMV-868CP质粒DNA)，向稀释的DNA混合物中加入7.5μL(或15μL)TransIT-LT1转染试剂(避免转染试剂与EP管壁的任何接触)，用枪头轻吸至完全混合。室温孵育15～30min。将TransIT-LT1试剂和DNA复合物缓慢、均匀滴入六孔板的不同区域。前后左右轻轻摇动六孔板，使其均匀分布，置于37℃，5％CO2培养箱孵育48h。
(3)用3mL PBS缓冲液漂洗各孔2次，在每孔中加入100μLRIPA细胞裂解液，吹打混匀，放于冰上裂解1～2min，13，000g离心5min，取上清，-20℃保存备用。
(4)制作标准曲线：在972μL 1×稀释缓冲液中加入28μL标准储备溶液，制备1000μL 5000pg/mL最高浓度标准品。使用500μL 1×稀释缓冲液作为稀释剂，在6个单独的试管中对5000pg/mL最高浓度标准品进行六次两倍系列稀释：在混合5000pg/mL最高浓度标准品后，将500μL移液器移入下一个试管中，以此类推。1×稀释缓冲液用作零标准(0pg/mL)。确保每个测定都有一条标准曲线。
参照新冠病毒Omicron(B.1.1.529)variant Spike酶联免疫试剂盒说明书，准备酶标板→标准品和样品一起孵育→二抗孵育→底物孵育→终止反应→读取吸光度值，计算每个标准品和样品的平均吸光度，减去空白对照平均标准光密度。采用四参数曲线拟合算法计算结果。
实验结果：如图6所示。从RBD蛋白的ELISA检测结果可以看出，与Mock组和pT7-LIET-GFP质粒对照组比较，在转染48h后5个重组质粒组RBD蛋白均有表达。其中，P2A质粒组RBD蛋白的表达量最高。因此，SARS-CoV2 RBD重组质粒的构建过程中选择P2A。
3.重组病毒的拯救
分别用编码NSP3基因的重组质粒pT7-VP3+NSP3-P2A-NLuc/LLR和pT7-VP3+NSP3-P2A-RBD/LLR替换实施例8(5+1未突变质粒)系统中的pT7-VP3+NSP3/LLR质粒和实施例8(11+1未突变质粒)系统中的pT7-NSP3/LLRV质粒，进行转染→换液→添加MA104 N*V细胞和胰酶共培养→收获P0代病毒液→P1代转管接毒，具体操作步骤请参考实施例8rLLR野毒株的拯救。在MA104 N*V细胞耐受的前提下，可适当提高共培养和接毒时胰蛋白酶的浓度。如果P1代观察不到CPE，对病毒液盲传3代培养。
实验结果：如图7所示。由图7可知，rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD重组病毒在(5+1质粒)系统和(11+1质粒)系统中均出现典型的CPE，细胞界限变模糊、细胞融合聚集，出现明显的拉长，拉丝，皱缩，变圆，甚至脱落。阴性对照组细胞形态正常或由于添加2μg/mL胰酶而出现轻微皱缩。
4.重组病毒的鉴定
(1)dsRNA-PAGE和硝酸银染色
以实施例8提取的rLLR dsRNA为对照，对成功拯救的重组病毒rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD，参照病毒RNA提取试剂盒说明书提取基因组，并进行dsRNA-PAGE和硝酸银染色，具体操作步骤如下。
参照实施例2的方法，分别提取LLR和rLLR(5+1质粒系统)的基因组，使用NanoDrop测定RNA浓度，并调整至10ng/μL左右。严格按照表15中的比例在50mL离心管中配制分离胶和积层胶。
表15聚丙烯凝胶电泳配方(单位:mL)
| 组分 | 积层胶(3.5％) | 分离胶(10％) |
| 30％丙烯酰胺 | 0.58 | 1.67 |
| 去离子水 | 3.4 | 2.3 |
| 5×TBE | 1 | 1 |
| 10％APs | 0.035 | 0.035 |
| TEMED | 0.0035 | 0.0034 |
待胶凝固后加入1×TBE电泳缓冲液。将18μL病毒RNA与3μL 6×Loading buffer混匀上样，80v恒压电泳6h。电泳结束后，关闭电源，取出胶体，小心将浓缩胶丢弃，利用核酸快速银染试剂盒进行染色，具体步骤如下：漂洗：将凝胶放入100mL超纯水，水平摇床上清洗2次，每次2min。银染：弃水，加入100mL即用型染色液(超纯水79mL，核酸银染染色增敏液(10×)10mL，核酸银染染色加速液(10×)10mL，核酸银染银溶液(100×)1mL)，水平摇床上结合5min。
弃原有溶液，加入100mL超纯水，水平摇床上清洗15s(注意：水洗涤的时间不能超过20s，否则会导致过多的银离子被洗去，导致检测灵敏度下降)。
显色：弃水，加入100mL银染显色液(超纯水89.8mL，核酸银染基本显色液(10×)10mL，核酸银染显色加速液(500×)0.2mL)，摇床上水平摇动3～10min，直到出现比较理想的预期核酸条带。注意：核酸银染显色加速液有刺激性气味，需要在通风厨内操作；银染显色液配制后需在20min内使用完毕。
终止：弃银染显色液，加入100mL超纯水，水平摇床上常温摇动3～5min。
成像：利用Tanon 4800凝胶成像系统白光成像，观察条带。
实验结果：如图8中的A和B所示，由图8中的A可知，dsRNA-PAGE和硝酸银染色的结果显示P1～P5代rLLR/NSP3-NLuc的NSP3基因迁移速度明显比亲本株rLLR慢，出现在NSP1条带稍高的位置；由图8中的B可知，dsRNA-PAGE和硝酸银染色的结果显示P1～P5代rLLR/NSP3-CoV2/RBD的NSP3基因迁移速度比亲本株rLLR明显减慢，出现在VP4条带稍低的位置。
(2)RT-PCR检测NLuc和RBD基因的插入
以本实施例2提取的病毒核酸为模板，用NSP3基因全长引物进行RT-PCR扩增。引物序列及PCR反应体系请参考实施例2LLR全基因组的扩增。
实验结果：如图9中的A和B所示，由图9中的A可知，RT-PCR扩增NSP3/LLR基因的结果显示rLLR在1074bp左右出现目的条带，P1～P5代rLLR/NSP3-NLuc均在1653bp左右出现目的条带，片段大小均符合预期长度，且测序结果与目的基因序列完全一致；由图9中的B可知，RT-PCR扩增NSP3/LLR基因的结果显示rLLR在1074bp左右出现目的条带，P1～P5代rLLR/NSP3-CoV2/RBD在1956bp左右出现目的条带，片段大小均符合预期长度，且测序结果与目的基因序列完全一致。
(3)重组病毒的噬斑纯化
对鉴定正确的重组病毒液rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD进行激活和吸附，将激活好的病毒液10倍等比稀释，稀释度为10-3～10-7，吸附2h后，6孔板每孔铺入2mL第一层琼脂覆盖物，配制如下：2×MEM培养液中加入等体积1％琼脂，并分别加入终浓度为1μg/mL的胰蛋白酶、100μg/mL的葡聚糖和2mmol/L的L-Gln，边加边振荡，使吸附液和覆盖物混合均匀。待完全凝固后，置于37℃，5％CO2培养箱倒置培养。3d后，铺第二层琼脂覆盖物，除了等体积的2×MEM和1％琼脂外，还额外加入终浓度为120μg/mL的中性红，待完全凝固后置于37℃，5％CO2培养箱倒置培养，观察蚀斑的出现，待病毒蚀斑形成后，将六孔板置于倒置荧光显微镜下，用记号笔标记有细胞病变的部位，用枪头吸取噬斑形成部位至含有1mLDMEM培养基的离心管中。将离心管中的病毒液反复冻融3次，再次进行噬斑纯化，重复以上操作3次，即获得纯化后的重配病毒，并对纯化后的重配病毒连续传代至P5代。
(4)rLLR/NSP3-NLuc重组病毒的荧光素酶活性分析
取对数生长期的MA104细胞接种于96孔板中，每孔50μL。次日，待细胞密度达80％～90％，以rLLR为对照，分别将rLLR和rLLR/NSP3-NLuc以10倍梯度稀释接毒，每个稀释度做5个重复，之后将96孔板置于37℃5％CO2细胞培养箱中培养。48h后，96孔板在室温和-80℃反复冻融2次，按照NLuc萤光素酶检测试剂盒(Promega)说明书配制Nano-Glo萤光素酶检测试剂，每孔50μL分装，并加入50μL病毒液轻轻吹打混匀，放到荧光素酶检测仪器中，设置好程序，读取样品中NLuc萤光素酶信号，记录到计算机中。
实验结果：如图10所示，由图10可知，NLuc萤光素酶活性检测结果显示，除P1代荧光素酶信号稍低外，其余各代次无明显差异。在10倍梯度稀释下，NLuc萤光素酶的表达量和稀释度呈线性相关关系，NLuc荧光素酶的表达量没有随着时间的推移而损失，即使在10-7稀释度下，仍然能检测到荧光素酶信号。
(5)Westernblot检测外源蛋白的表达
对于rLLR/NSP3-CoV2/RBD重组病毒中RBD蛋白表达的鉴定，感染24h，首先，收集2mL上清并将其浓缩为100μL，具体操作步骤如下：将细胞上清、预冷甲醇、预冷氯仿按4:4:1的比例加入到1.5mL EP管中，涡旋混匀，4℃5000g离心10min，吸去上层液体，留中间蛋白层和下层；加入5倍氯仿体积的甲醇，4℃5000g离心10min洗去氯仿，弃上清；向蛋白沉淀中加入2mL无水乙醇，涡旋混匀，4℃5000g离心10min，吸净上清，晾干5min；加入100μL含终浓度为1mM PMSF的RIPA细胞裂解液，吹打混匀，放于冰上裂解1～2min，13,000g离心5min，取上清。其次，收集沉淀，用3mL PBS缓冲液漂洗各孔2次，在每孔中加入100μL RIPA细胞裂解液，吹打混匀，放于冰上裂解1～2min，13,000g离心5min，取上清。在收集的上清和沉淀样本中，加入5×Loading buffer，煮沸5～10min，立即-20℃冰置5min，-20℃保存。将样品稍微离心后，以SARS-CoV-2 Spike Protein RBD(His-Tag)为阳性对照，各取20μL，分别以VP6和GAPDH作为内参基因对照进行westernblot检测，具体操作步骤请参考实施例8 MA104 N*V细胞的蛋白表达鉴定。
实验结果：如图11所示，Westernblot检测的结果显示，在RBD(His-Tag)阳性对照和P1～P5代rLLR/NSP3-CoV2/RBD沉淀中均可检测到RBD蛋白条带，大小约为35kDa，而Mock组、rLLR对照组和P3代上清中均无条带；rLLR、P1～P5代rLLR/NSP3-CoV2/RBD沉淀和P3代上清中均可检测到VP6蛋白条带，大小约为45kDa，而Mock组无条带。Western blot检测以GAPDH(36kDa)作为内参，在蛋白量一致的情况下，可以观察到，P1～P5代rLLR/NSP3-CoV2/RBD感染细胞沉淀中的RBD蛋白表达水平无明显差异。
(6)间接免疫荧光鉴定RBD蛋白的表达
对于rLLR/NSP3-CoV2/RBD重组病毒中RBD蛋白表达的间接免疫荧光鉴定，按照MOI0.01PFU/cell感染MA104细胞24h后，按照如下步骤操作：
固定：用PBS清洗1次，加入4℃预冷的4％组织固定液，放置于4℃冰箱中静置10～15min，弃4％组织固定液，放置于通风口处晾干；
细胞破膜：爬片稍甩干后用组化笔在盖玻片中间细胞分布均匀的位置画圈(防止抗体流走)，加50～100μL破膜工作液，室温孵育20min，PBS洗3次，每次5min；
血清封闭:在圈内滴加用3％BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min；
加一抗：轻轻甩掉封闭液，在细胞孔板里滴加按1:1000和1:500比例配好的VP6和RBD一抗，细胞培养板平放于湿盒内4℃孵育过夜；
加二抗：细胞孔板置于脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。加对应二抗，室温孵育50min；
DAPI复染细胞核：爬片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min；
封片：爬片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。玻片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
采集图像：DAPI激发波长330～380nm，发射波长420nm；488激发波长465～495nm，发射波长515-555nm；CY3激发波长510～560nm，发射波长590nm。
结果判读：DAPI通道细胞核为蓝色，488通道阳性为绿色，CY3通道阳性为红色。
实验结果：如图12所示，FITC标记的绿色荧光为病毒VP6蛋白所在的位置，CY3标记的红色荧光为SARS-CoV2 RBD蛋白所在的位置，蓝色荧光为DAPI染色的MA104细胞核的具体位置。间接免疫荧光的结果显示，接毒24h后，在感染rLLR/NSP3-CoV2/RBD重组病毒的MA104细胞中，可观察到病毒围绕细胞核弥散分布于细胞质中，SARS-CoV2 RBD蛋白主要定位于细胞膜上。rLLR仅在细胞质中有VP6蛋白表达，没有感染病毒的Mock对照细胞中，未检测到绿色或红色荧光信号。
5.5+1和11+1质粒系统拯救效率比较
在实施例8的5+1和11+1突变的质粒系统中拯救得到rLLR，在步骤3.重组病毒的拯救中的5+1和11+1未突变质粒系统中分别拯救得到rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD。每个转染分别做6次重复实验，转染7天后收获P0代病毒液，将P0代病毒液在室温和-80℃反复冻融3次，在MA104细胞上传代并观察CPE，将出现CPE的拯救病毒进行dsRNA-PAGE和硝酸银染色和RT-PCR扩增测序，将阳性结果进行统计，并对2种质粒不同系统的拯救效率进行比较，结果见下表16。
表16 11+1和5+1质粒系统中3株LLR重组病毒的拯救效率比较
由表16可知，5+1质粒系统相比于11+1质粒系统拯救效率大大提高。
6.重组病毒的生长动力学特性研究
(1)以rLLR为对照，分别将rLLR、rLLR/NSP3-NLuc、rLLR/NSP3-2A-CoV2/RBD进行10倍梯度稀释至合适浓度，每孔50μL稀释病毒液(每个稀释度做3个重复，取平均值)，在96孔板中感染MA104细胞，用间接免疫荧光法测定重配病毒的滴度，具体操作步骤如下：
铺板：提前一天将对数生长期的MA104细胞制成0.5～1×105个/mL的细胞悬液，100μL/孔加入96孔板中，置于5％CO2培养箱中37℃培养2d；
激活、稀释和吸附：将200μL wtLLR、rLLR(11+1质粒系统)和rLLR(5+1质粒系统)加入终浓度为5μg/mL的胰蛋白酶，37℃温箱激活lh。用终浓度为0.5μg/mL的胰蛋白酶进行10倍梯度稀释至合适浓度，每孔50μL稀释病毒液，每个稀释度做3个重复，置于5％CO2培养箱中37℃吸附2h；
加维持液：弃掉96孔板中的吸附液，每孔加入100μL胰蛋白酶终浓度为0.5μg/mL的DMEM维持液，置于5％CO2培养箱中37℃培养18～20h；
固定细胞：弃96孔板中的维持液，用PBS清洗1次，200μL/孔。向96孔板中加入4℃预冷的4％组织固定液，150μL/孔，放置于4℃冰箱中静置10～15min，弃4％组织固定液，放置于通风口处晾干；
封闭：用5％牛血清白蛋白(Bovin serum alburmin，BSA)37℃封闭1h，200μL/孔，用PBST清洗3次；
孵育一抗：用1％BSA将VP6抗体按照1:1500稀释度进行稀释，50μL/孔，于37℃孵育2h，用PBST清洗3次；
孵育二抗：用PBS将FITC标记的山羊抗兔的二抗按照1:150的稀释度进行稀释，50μL/孔，于37℃培养箱孵育1h，避光保存；
镜检：用PBST清洗细胞3次，加PBS溶液，150μL/孔，置于荧光显微镜上选取合适的激发光统计具有细胞形态且亮度一致的荧光数；
计算病毒滴度：同一个稀释度的两孔荧光数均在10～100的判定孔为最佳判定孔。
按下列公式进行计算：
病毒滴度(lgPFU/mL)＝lg(最佳判定孔的荧光数平均值×稀释倍数/接毒量)
实验结果：如图13所示，加入荧光二抗后，在显微镜下观察rLLR/NSP3-NLuc(11+1质粒)、rLLR/NSP3-NLuc(5+1质粒)、rLLR/NSP3-CoV2/RBD(11+1质粒)和rLLR/NSP3-CoV2/RBD(5+1质粒)的荧光灶形成单位，结果显示稀释倍数为10-4孔平均分别有19个、23个、13个和18个荧光灶。
(2)以rLLR为对照，将rLLR、rLLR/NSP3-NLuc(11+1和5+1质粒)、rLLR/NSP3-2A-CoV2/RBD(11+1和5+1质粒)按照MOI 0.01PFU/cell分别接种MA104细胞，收取感染后24h、48h、72h、96h的病毒液(每个时间点做3个重复，取平均值)，参照实施例2的方法提取基因组和解链，使用基于LLRVNSP3基因的实时荧光定量RT-PCR检测方法，按照HiScript IIOneStep qRT-PCR Probe Kit说明书进行扩增，反应条件：50℃5min，1循环；95℃20s，1循环；95℃3s，60℃30s(荧光收集)，40循环。计算病毒在不同时间点的GCEs，并绘制复制动力曲线。计算重配病毒在不同时间点的GCEs，并绘制复制动力曲线。
实验结果：如图14中的A所示，带入公式计算，rLLR/NSP3-NLuc(11+1质粒)、rLLR/NSP3-NLuc(5+1质粒)、rLLR/NSP3-CoV2/RBD(11+1质粒)和rLLR/NSP3-CoV2/RBD(5+1质粒)的滴度分别为3.79×106PFU/mL、4.57×106PFU/mL、2.60×106PFU/mL和3.63×106PFU/mL，虽然4株重组病毒的滴度均低于亲本株rLLR(7.08×107PFU/mL)，但2株5+1质粒系统拯救的重组病毒滴度却略高于2株11+1质粒系统拯救的重组病毒滴度。
如图14中的B所示，rLLR/NSP3-NLuc(11+1质粒)、rLLR/NSP3-NLuc(5+1质粒)、rLLR/NSP3-CoV2/RBD(11+1质粒)和rLLR/NSP3-CoV2/RBD(5+1质粒)与亲本株rLLR(MOI0.01PFU/cell)在不同时间点的GCEs计算结果显示：在感染后48h，5株病毒的复制均进入了平台期，但4株重组病毒在感染后48h、72h和96h的基因组拷贝数略低于亲本株rLLR。
实施例10 rLLR/NSP3-CoV2/RBD的动物实验
1.动物免疫及标本采集
将3只Balb/c孕鼠在产仔前单独一笼饲养，保证充足的食物和水，保证适当的温湿度、光照和噪音等环境条件。待母鼠产仔后，取出新生乳鼠称量体重，剔除体重差异较大的个体，控制每笼乳鼠只数为6-10只。为了保证实验的准确性，将3窝Balb/c孕雌鼠和乳鼠随机分组，分别为：rLLR/NSP3-CoV2/RBD实验组、LLR对照组和PBS完全阴性对照组。
待乳鼠生长至5日龄时，将乳鼠与母鼠分开，在恒温灯下饥饿处理1小时后进行口服灌胃:左手轻轻抓起乳鼠颈部，使其头部仰起，尽量保持食管的直畅，右手持带有自制灌胃针的一次性1mL注射器沿幼鼠口腔右侧压住舌根轻轻试探插入，当针头进入咽喉无阻碍感时，将病毒平缓推进胃部，用消毒棉球擦拭幼鼠嘴觜部，并将其放回。纯化后病毒液和PBS的注射体积控制为200μL。
乳鼠口服灌胃后，连续10天每隔24h观察其腹泻情况并收集粪便检测排毒率，腹泻情况主要通过观察其应激排出的粪便的形态进行判断，腹泻的评分标准具体如下：严重腹泻的粪便形态是水样便，腹泻分数是3；普通腹泻的粪便形态是黄色软粪便，腹泻分数是2；不腹泻的粪便形态是正常固体粪便，腹泻分数是1。
待乳鼠长至3周龄时，为防止其交配按照雌雄进行分笼。
待乳鼠长至4周龄的第1天进行腹腔注射加强免疫，并于4、6、8和10周的第7天连续4次脸颊采血和按摩腹部取粪便(见图15)。
血清样本：主要用于IgG抗体检测。采集的血液样本室温静置2h，3000g，离心30min，取上清(避免取到血细胞)，分装后-80℃保存，避免反复冻融。
粪便样本：主要用于SIgA检测。采集的粪便样本按照10％(W/V)加入无菌PBS，涡旋，4℃，13000g，离心10min，取粪便上清。置于56℃作用30min，分装后-80℃保存。
2.双抗体夹心ELISA法检测乳鼠排毒
(1)抗体包被:将抗体用PH 7.4缓冲液稀释后包被，每孔加100μL，37℃孵育2h，去除包被的液体并使用PBST洗涤一次后，每孔加入200μL封闭液，37℃孵育2h后去除封闭液抽干备用；
(2)将待检的样品用样品稀释液进行梯度稀释，加入到相应的检测板中，每孔100μL，用封板膜密封后放置在37℃恒温箱中孵育1h；
(3)反应完成后将96孔板用PBST洗涤5次，再将检测板离心甩干后，每孔加入100μL用酶稀释液稀释好的标记了HRP的二抗，置于37℃恒温箱孵育30min；
(4)孵育完成后将96孔板用PBST洗涤5次，再将检测板离心甩干后，每孔加入100μL显色液37℃反应15min；
(5)显色完成后加入50μL终止液，终止反应后立即用酶标仪读板。
实验结果：5日龄乳鼠在rLLR和rLLR/NSP3-CoV2/RBD灌胃后均会发生腹泻的情况，腹泻潜伏期一般为0-24h，持续时间为5-6天；严重腹泻时间可持续1-2天，一般发生在灌胃后1-3天；此后症状逐渐减轻，直至腹泻情况消失。对照组所有乳鼠均无腹泻情况发生。
乳鼠口服灌胃rLLR和rLLR/NSP3-CoV2/RBD后，连续10天收集粪便样本，对乳鼠腹泻后收集的粪便进行称重，用PBS稀释制成10％的粪悬液，然后13000rpm离心10min取上清进行检测。利用qRT-PCR方法检测粪便样本中的RV排毒率(如图16)，结果表明rLLR和rLLR/NSP3-CoV2/RBD在感染乳鼠后可在乳鼠体内形成有效复制，并产生持续性的排毒过程，可长达10天左右。
3.间接ELISA法检测小鼠RBD特异性IgG和IgA抗体
将纯化的RBD重组蛋白加入ELISA板中，100ng/孔，4℃包被过夜。0.1％PBST洗涤3次后，每次5min，用2％BSA于37℃封闭2h后，加入起始稀释倍数为1:50，加入3倍系列稀释的待测血清和粪便悬液，同时以免疫前小鼠血清和粪便悬液样本作为阴性对照，进行同比例稀释，37℃孵育1h。再次洗板后，加入HRP标记的山羊抗鼠IgG和IgA，37℃作用1h。TMB室温避光显色10min，最后加入1mol/L磷酸终止反应，于酶标仪450nm波长处测定吸光度值。
4.间接ELISA法检测小鼠RV特异性IgG和IgA抗体
用经过初步纯化的rLLR作为抗原包被ELISA板，100μL每孔，4℃过夜包被。其余检测步骤同3.间接ELISA法检测小鼠RBD特异性IgG和IgA抗体。
5.统计学分析
重配病毒的IgG抗体滴度取对数后进行统计学分析，所有数据均使用GraphpPrism 9.0软件的One-way ANOVA进行统计学分析，P<0.05被认为有统计学差异。
实验结果：IgG特异性抗体的检测结果显示，rLLR和rLLR/NSP3-CoV2/RBD感染Balb/c小鼠均产生了针对RV的特异性IgG抗体的滴度，且随着时间的增加而呈现逐渐升高的趋势，与PBS对照组之间统计学差异显著(如图17中的A)；rLLR/NSP3-CoV2/RBD感染Balb/c小鼠均产生了针对SARS-CoV-2的特异性IgG抗体的滴度，随着时间的增加而呈现逐渐升高的趋势，与rLLR对照组和PBS对照组之间统计学差异显著(如图17中的B)。
抗体效价值取对数后进行统计学分析。IgA特异性抗体的检测结果显示，rLLR和rLLR/NSP3-CoV2/RBD感染Balb/c小鼠均产生了针对RV的特异性IgA抗体的滴度，且随着时间的增加而呈现逐渐升高的趋势，与PBS对照组之间统计学差异显著(如图18中的A)；rLLR/NSP3-CoV2/RBD感染Balb/c小鼠均产生了针对SARS-CoV-2的特异性IgA抗体的滴度，随着时间的增加而呈现逐渐升高的趋势，与rLLR对照组和PBS对照组之间统计学差异显著(如图18中的B)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种羊轮状病毒感染性克隆质粒，其特征在于，所述感染性克隆质粒为pT7-VP1+VP6/LLR、pT7-VP2+muNSP1/LLR、pT7-VP3+muNSP3/LLR、pT7-VP4+VP7+muNSP4/LLR和pT7-NSP2+muNSP5/LLR；
或pT7-VP1+VP6/LLR、pT7-VP2+NSP1/LLR、pT7-VP3+NSP3/LLR、pT7-VP4+VP7+NSP4/LLR和pT7-NSP2+NSP5/LLR；
所述pT7-VP1+VP6/LLR的序列如SEQ ID NO:122所示；所述pT7-VP2+muNSP1/LLR的序列如SEQ ID NO:123所示；所述pT7-VP3+muNSP3/LLR的序列如SEQ ID NO:124所示；所述pT7-VP4+VP7+muNSP4/LLR的序列如SEQ ID NO:125所示；所述pT7-NSP2+muNSP5/LLR的序列如SEQ ID NO:126所示；所述pT7-VP2+NSP1/LLR的序列如SEQ ID NO:127所示；所述pT7-VP3+NSP3/LLR的序列如SEQ ID NO:128所示；所述pT7-VP4+VP7+NSP4/LLR的序列如SEQ ID NO:129所示；所述pT7-NSP2+NSP5/LLR的序列如SEQ ID NO:130所示。
2.权利要求1所述的羊轮状病毒感染性克隆质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
通过5'/3'RACE和RT-PCR扩增相结合的方法，获得LLRV的11条准确的基因组片段序列，在每条基因组片段序列的5'末端连接T7启动子，3'末端连接HDV核酶，然后构建得到11个质粒；
对LLRV中的4个基因组片段序列进行同义突变，获得具有分子标签的NSP1，NSP3，NSP4和NSP5的序列；以具有分子标签的NSP1，NSP3，NSP4和NSP5的序列替换对应质粒中的NSP1，NSP3，NSP4和NSP5后获得4个突变质粒pT7-muNSP1/LLRV、pT7-muNSP3/LLRV、pT7-muNSP4/LLRV和pT7-muNSP5/LLRV；
以11个质粒和4个突变质粒为模板，扩增获得对应的基因组片段序列，将11条准确的基因组片段序列中的VP6片段以同源重组的方法克隆入pT7-VP1/LLR质粒载体中，构建得到权利要求1所述的pT7-VP1+VP6/LLR；
将具有分子标签的NSP1片段或11条准确的基因组片段序列中的NSP1片段以同源重组的方法克隆入pT7-VP2/LLR质粒载体中，构建得到权利要求1所述的pT7-VP2+muNSP1/LLR或pT7-VP2+NSP1/LLR；
将具有分子标签的NSP3片段或11条准确的基因组片段序列中的NSP3片段以同源重组的方法克隆入pT7-VP3/LLR质粒载体中，构建得到权利要求1所述的pT7-VP3+muNSP3/LLR或pT7-VP3+NSP3/LLR；
将11条准确的基因组片段序列中的VP7片段和具有分子标签的NSP4片段或11条准确的基因组片段序列中的NSP4片段以同源重组的方法克隆入pT7-VP4/LLR质粒载体中，构建得到权利要求1所述的pT7-VP4+VP7+muNSP4/LLR或pT7-VP4+VP7+NSP4/LLR；
将具有分子标签的NSP5片段或11条准确的基因组片段序列中的NSP5片段以同源重组的方法克隆入pT7-NSP2/LLR质粒载体中，构建得到权利要求1所述的pT7-NSP2+muNSP5/LLR或pT7-NSP2+NSP5/LLR。
3.一种羊轮状病毒的反向遗传病毒拯救系统，其特征在于，包括权利要求1所述的感染性克隆质粒、辅助质粒pCMV-868CP、MA104细胞或MA104 N*V工程细胞株和BHK-T7/9细胞。
4.根据权利要求3所述的羊轮状病毒的反向遗传病毒拯救系统，其特征在于，所述辅助质粒pCMV-868CP以CMV为启动子，以(G4S)4为连接肽，融合表达非洲猪瘟病毒加帽酶NP868R和T7 RNAP。
5.根据权利要求3所述的羊轮状病毒的反向遗传病毒拯救系统，其特征在于，所述MA104 N*V工程细胞株为MA104细胞株基因组整合有BVDV的N蛋白和PIV5的V蛋白。
6.权利要求3所述的羊轮状病毒的反向遗传病毒拯救系统拯救病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求1所述的感染性克隆质粒、辅助质粒pCMV-868CP和Opti-MEM混合，然后与TransIT-LT1转染试剂混合静置后转染至BHK-T7/9细胞中；培养、清洗后将MA104 N*V工程细胞株与转染的BHK-T7/9细胞混合共培养，拯救得到羊轮状病毒重组病毒株。
7.根据权利要求3所述的羊轮状病毒的反向遗传病毒拯救系统拯救病毒的方法，其特征在于，所述感染性克隆质粒、辅助质粒pCMV-868CP和Opti-MEM混合比例为10～14μg：1～2μg：200～300μL；
所述TransIT-LT1转染试剂、感染性克隆质粒、辅助质粒pCMV-868CP的比例为20～35μL：10～14μg：1～2μg；所述混合静置的时间为20～40min；
所述培养使用DMEM完全培养基，所述清洗使用DMEM不完全培养基，所述培养的时间为42～54h；所述共培养的时间为2～5天。
8.权利要求1所述的羊轮状病毒感染性克隆质粒或权利要求3所述羊轮状病毒的反向遗传病毒拯救系统在构建表达外源蛋白的重组病毒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述表达外源蛋白的基因片段连接到权利要求1所述的感染性克隆质粒上。
10.权利要求1所述的羊轮状病毒感染性克隆质粒或权利要求3所述羊轮状病毒的反向遗传病毒拯救系统在制备预防和/或治疗性的疫苗和/或药物中的应用。
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