CN1208340C - 3型人副流感病毒的感染性克隆 - Google Patents
3型人副流感病毒的感染性克隆 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了用于生产重组人副流感病毒、尤其是感染性重组人副流感病毒3型(HPIV-3)的系统。在一个实例中,该系统包含一个克隆,该克隆包含的核苷酸序列编码HPIV的全长正义反基因组;以及至少一个支持克隆,该克隆包含编码HPIV P蛋白和HPIV L蛋白的核苷酸序列。在另一个实例中,该系统还包含一个支持克隆,该克隆包含编码HPIV NP蛋白的核苷酸序列。本发明还提供了一个克隆,该克隆包含编码HPIV-3全长正义反基因组的核苷酸序列。该克隆还包含RNA聚合酶启动子与HPIV-3反基因组编码序列操作性相连。在一个较佳的实例中,克隆还包含编码紧靠HPIV-3反基因组编码序列下游的核酶的核苷酸序列。本发明还涉及一种制备HPIV-3基因组中具有定点突变的重组HPIV-3病毒的方法。该方法包括:制备含有修饰的HPIV-3反基因组编码序列的克隆;将修饰的HPIV-3克隆、包含编码HPIV-3 P蛋白和HPIV-3 L蛋白以及较佳的包含编码HPIV-3 NP蛋白的核苷酸序列的支持克隆导入宿主细胞;和在一定条件下培养宿主细胞,该条件允许合成修饰的HPIV-3反基因组和HPIV-3的L、P和NP蛋白。
Description
本项研究工作得到国立卫生研究院过敏和传染性疾病研究所第32027号补助金的部分资助。政府享有本发明的一些权利。
背景
人副流感病毒(HPIV)于1956年被认为是人呼吸道感染的病因,据信它占儿童呼吸道疾病的4-22%,在此方面仅次于呼吸道合胞病毒。HPIV是下呼吸道疾病(如肺炎和细支气管炎)的重要病因,并且是幼儿哮吼的最常见病因。HPIV的四种血清型中3型病毒(HPIV-3)表现出最具毒性,通常在生命的第一个月内引起细支气管炎和肺炎。
不幸的是,目前还没有有效的疫苗或抗病毒治疗可用来预防或治疗HPIV诱导的感染。用来产生灭活病毒的标准方法(如热灭活或化学处理病毒)对于所有HPIV病毒株和血清型(包括HPIV-3型)并不成功。另外,产生减毒病毒的标准方法是在随机位点上产生突变,并且不允许在特定位点修饰HPIV基因组或控制导入基因组的突变数目。
人副流感病毒是有包膜的单链负义RNA病毒,它是副粘病毒科家族副粘病毒属的成员。人副流感病毒基因组(vRNA)的复制与副粘病毒家族的其它成员类似。在感染细胞时,转录是主要的RNA合成行为,结果导致从负义基因组产生病毒mRNA,即vRNA。感染后期,转换到RNA的复制,导致合成全长反基因组正义RNA,作为其它负义基因组RNA合成的模板。基因组RNA的转录和复制依赖于核糖核蛋白复合物(RNP)的形成,该复合物由被核衣壳蛋白(NP)包裹的15462个核苷酸的基因组RNA、和紧密相联的磷蛋白(P)和大的(L)聚合酶蛋白组成。一些宿主细胞因子也参与了HPIV的复制周期。
HPIV需要完整的RNP因而阻碍了元细胞系统中分析HPIV的转录和复制。体外给HPIV-3 vRNA包衣壳的尝试已经失败,与正义RNA病毒不同,裸HPIVvRNA没有感染性。而且,目前没有已知的系统可用来制备重组HPIV,包括重组感染性HPIV-3。
因此,需要有新的试剂、系统和方法使我们得以产生重组HPIV,尤其是重组的有感染性的HPIV-3。允许将一个或多个定点突变导入HPIV(尤其是HPIV-3)基因组中的重组系统是需要的。允许鉴定人副流感病毒RNA转录或复制中定点突变的效果和鉴定导致产生减毒HPIV的定点突变的重组体系统是尤其需要的。
发明概述
本发明提供了用于生产重组人副流感病毒、尤其是感染性重组人副流感病毒3型(HPIV-3)的系统。在一个实例中,该系统包含一个克隆,该克隆包含的核苷酸序列编码HPIV的全长正义反基因组;以及至少一个支持克隆(support clone),该克隆包含编码HPIV P蛋白和HPIV L蛋白的核苷酸序列。在另一个实例中,该系统还包含一个支持克隆,该克隆包含编码HPIV NP蛋白的核苷酸序列。较佳的是,该系统中的每个克隆包含一个RNA聚合酶启动子,它与克隆内所含各个HPIV核苷酸序列操作性相连。
本发明还提供了一个克隆,该克隆包含编码HPIV-3的全长正义反基因组的核苷酸序列。该克隆还包含的RNA聚合酶启动子与HPIV-3反基因组编码序列操作性相连。在一个较佳的实例中,该克隆还包含编码核酶的核苷酸序列,该序列紧靠编码HPIV-3反基因组的序列的下游。
本发明还涉及一种制备重组HPIV-3病毒的方法,在HPIV-3基因组内具有定点突变。该方法包括:制备一个包含修饰的HPIV-3反基因组编码序列的克隆;将修饰的HPIV-3克隆和支持克隆导入宿主细胞,所述支持克隆包含的核苷酸序列编码HPIV-3 P蛋白、HPIV-3 L蛋白,以及较佳的编码HPIV-3 NP蛋白;在允许修饰的HPIV-3反基因组以及HPIV-3的L、P和NP蛋白合成的条件下培养宿主细胞。
产生经基因工程改造而在HPIV-3基因和顺式作用元件内含有定点突变的重组HPIV-3病毒的能力,加快了病毒复制周期的各个方面的研究。另外,能生产经基因工程改造而在HPIV-3基因组内含有定点突变的重组HPIV的系统可用于鉴定减毒副流感病毒基因型和用来开发人副流感病毒活疫苗。
附图简述
图1显示了HPIV-3基因组的核苷酸序列的DNA形式,并显示了限制性位点、前导序列、尾随序列、和基因组的蛋白编码区的位置。
图2是pOCU-2TM载体的限制性图谱。
图3是pMG(+)的限制性图谱,显示了前导序列、萤光素酶编码区和T7启动子和终止子的位置。
图4是pHPIV-3的限制性图谱,其显示了前导序列和HPIV-3蛋白编码区的位置。
图5是全长感染性克隆pHPIV-3的示意图。VVφ,牛痘病毒聚合酶终止信号(TTTTTNT);T7,T7 RNA聚合酶启动子;le,HPIV-3前导序列;NP、P、M、F、HN和L是HPIV-3蛋白编码区;tr,HPIV-3尾随序列;Rz,丁型肝炎病毒反基因组核酶;T7φ,T7 RNA聚合酶终止信号。扩展了含有替代突变的区域并在上方标出了具体的改变。病毒碱基94的A变为G产生一个SacI位点,病毒碱基15389的A变为G产生了一个StuI位点。
发明详述
本发明提供了产生重组人副流感病毒的系统。在一个较佳的实例中,该系统用来产生重组HPIV-3。该系统包含:一个克隆,该克隆包含编码HPIV的全长正义反基因组的核苷酸序列,较佳的是双链DNA序列(后称HPIV克隆);和一个或多个支持克隆,克隆包含编码HPIV P蛋白和HPIV L蛋白的核苷酸序列。编码HPIV P蛋白和HPIV L蛋白的核苷酸序列可在同一克隆内。然而,为了便于操作,编码HPIV P蛋白和HPIV L蛋白的核苷酸序列宜在不同的克隆中。较佳的是,HPIV克隆包含编码HPIV-3反基因组的序列。较佳的是,一个或数个支持克隆编码HPIV-3的P蛋白和L蛋白。在另一个实例中,该系统还包含一个支持克隆,该克隆包含编码HPIV NP蛋白(较佳的是HPIV-3 NP蛋白)的核苷酸序列。
本文所用的术语“克隆”指可以导入细胞并表达的双链DNA。克隆可以是病毒载体形式,例如牛痘病毒载体或较佳的是质粒形式。较佳的,HPIV克隆和支持克隆各包含RNA聚合酶启动子,更佳的是T7 RNA聚合酶启动子。每个RNA聚合酶启动子与克隆中对应的HPIV编码序列操作性相连。因此,HPIV克隆上的RNA聚合酶启动子与HPIV序列操作性相连,支持克隆上的RNA聚合酶启动子与编码各自HPIV蛋白的一个或数个序列操作性相连。较佳的是,包含克隆的质粒还包含复制起始区、特别是细菌复制起始区。
本发明还提供了一个克隆,该克隆包含编码HPIV-3反基因组序列的核苷酸序列,后称“HPIV-3克隆”。较佳的是,HPIV-3克隆编码HPIV-3的全长反基因组序列。本文所用的术语“全长”指反基因组序列与HPIV-3的整个负义基因组序列互补,其从前导序列的3′核苷酸延伸通过HPIV-3基因组的尾随序列的5′核苷酸。图1显示了HPIV-3的全长基因组序列的DNA形式(SEQ ID NO:1).除了前导和尾随序列外,HPIV-3克隆还含有编码HPIV-3的N、P、M、F、HN和L蛋白以及顺式作用元件的序列。HPIV-3克隆可编码野生型HPIV-3反基因组序列或其中含有一个或多个突变的修饰的HPIV-3反基因组。突变可以是外来基因的形式插入HPIV-3反基因组编码序列。较佳的,突变是HPIV-3反基因组编码序列中一个或多个核苷酸的替代、6至12个核苷酸的缺失、或加入6至12个核苷酸。更佳的是,修饰的HPIV-3克隆在基因或顺式作用元件中或HPIV-3反基因组编码序列的这两者中含有替代。
较佳的,HPIV-3克隆是一个质粒,它包含的核苷酸序列编码一个核酶,更佳的是编码紧靠HPIV反基因组编码序列下游的丁型肝炎病毒反基因组核酶。在克隆转录后,核酶将核酶从HPIV反基因组中断裂下来,以在反基因组上提供有复制能力的3′端。更佳的是,HPIV-3克隆还可在核酶序列后包含一个RNA聚合酶终止子。在一个实例中,HPIV-3克隆是图5所示的质粒pHPIV-3,该质粒保藏在美国典型培养物保藏中心(12301 Parklawn Drive,Rockville,MD 20852,USA),保藏日为1998年5月_日,保藏号为___。
本发明还涉及用上述系统制备重组HPIV、尤其是HPIV-3的方法。该方法包括:将HPIV克隆以及编码HPIV P蛋白和HPIV L蛋白的支持克隆导入宿主细胞、尤其是人细胞内;在允许形成HPIV反基因组转录物、合成HPIV基因组(vRNA)和HPIV的L、P和NP蛋白、以及形成重组HPIV的条件下,培养该宿主细胞;和从培养回收重组HPIV。较佳的是,用HPIV克隆和支持克隆转染的宿主细胞宜含有对应于HPIV克隆和支持克隆中与HPIV克隆操作性相连的RNA聚合酶启动子的RNA聚合酶。在一个较佳的实例中,还将一个支持克隆导入细胞内,该克隆含有的核苷酸序列编码与RNA聚合酶启动子操作性相连的HPIV NP蛋白。较佳的是,在用HPIV克隆和一个或数个支持克隆转染之前或联合转染时,用一个病毒重组体(较佳的是表达RNA聚合酶(更佳的是T7 RNA聚合酶)的牛痘病毒重组体)感染宿主细胞。当用牛痘病毒重组体感染这些细胞时,HPIV-3克隆宜还包含在T7 RNA聚合酶上游的牛痘病毒RNA聚合酶终止子和在T7 RNA聚合酶终止子下游的牛痘病毒RNA聚合酶终止子。
本发明还涉及将定点突变导入重组HPIV-3基因组的方法。该方法包括:制备一个修饰的HPIV-3克隆,该克隆在编码HPIV-3反基因组的序列内包含一个或多个突变;将修饰的HPIV-3克隆和支持克隆导入宿主细胞内,所述支持克隆包含编码HPIV-3 P蛋白和HPIV-3 L蛋白、较佳的还包含编码HPIV-3 NP蛋白的序列;在允许形成修饰的HPIV-3反基因组转录物和合成HPIV-3的L、P和NP蛋白的条件下培养宿主细胞。修饰的HPIV-3克隆和支持克隆含有与HPIV-3蛋白编码区操作性相连的RNA聚合酶启动子。宿主细胞的细胞质内含有对应于修饰的HPIV-3克隆和支持克隆上的RNA聚合酶启动子的RNA聚合酶。
较佳的是,用HPIV-3克隆作为模板,用常规的PCR技术制得其中含有一个或多个突变的修饰的HPIV-3克隆。在HPIV-3序列的顺式作用元件或HPIV-3蛋白编码序列内获得突变。较佳的是,在L蛋白编码序列内形成突变。如果在HPIV-3克隆的HPIV-3蛋白编码序列内形成突变,则较佳的是应在对应的支持克隆的蛋白编码序列中相同位点上形成相似类型的突变。例如,如果在HPIV-3克隆的L蛋白编码序列特定位点形成突变,则较佳的是在L蛋白编码支持克隆的L蛋白编码序列相同位点上形成相同的突变。该方法可用来鉴定阻断病毒颗粒合成的突变,或导致产生无感染性或无毒性的HPIV-3。
为了确定上述方法产生的突变病毒是否无毒性(即减毒),首先在体外测试突变病毒以确定该突变是否导致生长较慢的表型(即突变病毒在组织培养中的生长比野生型病毒更慢)。然后在体内检查表现出该表型的突变病毒,将其注射到动物如棉鼠(一种适用于副流感病毒的很好的实验模型)内。然后检查受感染的动物,确定是否产生了抗HPIV-3的抗体,并确定症状严重程度与受野生型病毒感染的动物相比是否有减少。
产生经基因工程改造而在HPIV-3基因和顺式作用元件内含有特异性改变的重组HPIV-3病毒的能力加快了该病毒复制周期的各个方面的研究。另外,能生产经基因工程改造而在HPIV-3基因内含有特定改变的重组HPIV的系统可用于鉴定减毒副流感病毒基因型和用来开发人副流感病毒活疫苗。
制备HPIV-3全长cDNA颗粒的方法以及制备经修饰的或突变的感染性重组HPIV-3的方法的下列实施例目的只是用于描述,并不意味着限制了本发明的范围。
实施例1:HPIV-3全长cDNA克隆的构建
通过两个步骤来构建含有定点突变的HPIV-3全长感染性克隆。第一步是产生微小复制子,其含有HPIV-3的正义前导区和尾随区。第二步涉及将自HPIV-3基因组RNA衍生的RT-PCR片段插入微小复制子中。正义微小复制子含有下列元件:指导两个非病毒G残基合成的T7启动子,随后是HPIV-3的正义前导区,NP 5′UTR的一部分(至病毒碱基97)、萤光素酶基因、L 3′UTR的一部分(从病毒碱基15387开始)和HPIV-3的尾随序列。图1显示了HPIV-3基因组的全长核苷酸序列以及前导序列。尾随序列和蛋白编码区的位置。其后是丁型肝炎病毒反基因组核酶,以实现在3′末端HPIV-3特定碱基后的精确断裂。在复制子中核酶序列后还插入T7 RNA聚合酶终止子。另外在紧靠前述序列的上游和下游插入牛痘病毒聚合酶终止信号。在构建时,在NP 5′UTR和L 3 UTR的编码区内产生了单碱基变化。病毒碱基94 A变为G以及碱基15389的A变为G分别产生了SacI和StuI位点,作为遗传标记以鉴定病毒是否是重组来源。
选择载体pOCUS-2(Novagen)作为制备微小复制子[pPIV3-MG(+)]的起始质粒,因为它很小(1930bp)。据信采用小的起始质粒可能会增加全长克隆的稳定性。
微小复制子的构建如下:产生编码前导和尾随区的PCR产物,分别侧接有T7启动子和丁型肝炎病毒反基因组核酶。用来合成T7启动子/前导区的引物是:5′-TAGTCG GCCC
TAATAC GACTCA CTATAGG ACCAAA CAAGA GAAGAAACT-3′,SEQ ID NO:2,和5′-GAAATT ATAGAGC TCCCTT TTCT-3′,SEQ ID NO:3。第一个引物编码EagI位点和T7启动子(下划线),第二个引物在NP mRNA的5′非翻译区(UTP)内病毒碱基94(粗体)处导入A变为G的碱基改变,从而产生了SacI位点。用于该反应的模板pHPIV3-CAT在De,B.P.和A.K.Banerjee(1993)“人副流感病毒3型的基因组RNA的合成类似物的挽救”Vir.196:344-348中有所描述,该文纳入本文作参考。将所得PCR产物克隆到pOCUS-2的EagI和SacI位点(如图2所示)中。用来合成尾随/核酶区的引物为:5′-TAAGGCCTAAAGATAGA CAAAAA GTAAGA AAAACA TGTAAT ATATATATACCAAA CAGAGT TCTTCTC TTGTTTG GTGGGT CGGCAT GGCATCTC-3′,SEQ ID NO:4和5′-CTGGGTAC
CTCCCTT AGCCAT CCGAGT-3′,SEQ ID NO:5。第一引物含有L mRNA的3′UTR的序列,通过尾随区,和核酶的引物合成(下划线)。另外,该引物编码了病毒碱基15389处A至G的变化(粗体),产生了LmRNA内3′UTR内的StuI位点。第二个引物编码了核酶3′端(下划线)和BglII位点。用于该PCR反应的模板是pSA1,一种含有核酶序列的质粒,如以前Perrotta,A.T.和M.D.Been,1991年所述。假结样结构为丁型肝炎病毒RNA的有效自身断裂所需。Nature350:434-436纳入本文作参考。将从该反应衍生获得的PCR产物克隆到pOCUS-2的StuI和BglII位点内。通过将T7/引导克隆的EagI/PstI片段转移到尾随/核酶克隆的PacI/PstI位点内,将前导和尾随区结合到单个克隆内。
为了防止隐藏的牛痘病毒启动子可能的转录干扰,在pOCUS-2中靠近PvuII和SspI位点的复制子上游和下游插入牛痘病毒聚合酶转录终止信号(TTTTTNT)。通过用BlpI和BspEI消化从pET-17b中取出T7转录终止信号,并将其插入pOCUS-2的SspI位点(用T4 DNA聚合酶变成平头)内。然后将萤光素酶报道基因插入ScaI和StuI位点,产生pPIV3-MG(+),如图3所示。
为了产生全长HPIV-3克隆,从HPIV-3毒粒RNA产生5个RT-PCR产物并克隆,随后将这些片段插入pPIV3-MG(+)内,代替萤光素酶编码序列,产生pHPIV-3全长克隆。5个RT-PCR产物从HPIV-3病毒株47885毒粒RNA产生,该病毒株从国立卫生研究院Robert Chanock的获得。用限制性酶分析鉴定这些PCR产物(包括其余的HPIV-3基因组),并克隆到pUC19或pOCUS-2中,然后插入pPIV3-MG(+)中。
将含有病毒碱基83-2721的第一PCR产物插入pUC19的SmaI位点内。然后用SacI和XmnI消化83/2721克隆,取出病毒碱基94至553,将其插入pPIV3-MG(+)的SacI和SphI(用T4 DNA聚合酶变成平头)内。然后用PstI消化83/2721克隆,取出含有病毒碱基540-2274的片段,然后将其插入含有94/554片段的pPIV3-MG(+)克隆的PstI位点内。将包含病毒碱基13395至15397的第二PCR产物克隆到pUC19的SmaI位点内。然后用StuI和PacI消化该13395/15397克隆,将含有病毒碱基13632-15381的所得片段插入含有病毒序列至碱基2274的pPIV3-MG(+)克隆的StuI和PacI位点内。所得克隆在pPIV3-MG(+)内含有病毒碱基1-2274和13632-15462。
用BspMI(用T4 DNA聚合酶变成平头)和XhoI消化含有病毒碱基7403-11513的第三个PCR产物,产生含有碱基7437-11444的片段,插入pOCUS-2的XhoI和SspI位点内。用PvuII和BamHI消化含有病毒碱基10904至13773的第四个PCR片段(病毒碱基10918至13733)并插入pUC19的EcoRI(用T4DNA聚合酶变成平头)和BamHI位点内。用SacI(用T4 DNA聚合酶变成平头)和EcoNI消化7437/11444克隆并插入经EcoRI(用T4 DNA聚合酶变成平头)和EcoNI消化的10918/13733克隆中,组合两个病毒节段。所得克隆在pUC19背景中含有病毒碱基7437-13733。其余病毒序列从第5个PCR产物获得,其包含碱基83-7457,已经用XmnI和XhoI(病毒碱基553-7437)消化并克隆到pOCUS-2的StuI和XhoI位点内。然后用BamHI消化7437/13733克隆,用T4 DNA聚合酶变成平头,用XhoI消化,以所释放片段插入到EagI(用T4 DNA聚合酶变成平头)和XhoI消化的553/7437克隆中。所得克隆含有病毒碱基553-13733。然后用PshAI和PacI消化该克隆,将含有病毒碱基2143-13632的所得片段插入含有病毒碱基1-2274和13632-15462的pPIV3-MG(+)克隆的相同位点中。这产生了感染性克隆pHPIV-3(如图4所示意的)。
为了将P基因插入pGEM-4中,用XbaI(用T4 DNA聚合酶变成平头)和BamHI消化从而从P-lac融合克隆(在38中有所描述,纳入本文作参考)转移出P序列,并插入pGEM4的KpnI(用T4 DNA聚合酶变成平头)和BamHI位点中。15和16(纳入本文作参考)中所述的pPIV3-NP和pPIV3-L克隆是以pGEM-4为背景。对pPIV3-L克隆也作了修饰。在天然L mRNA序列中,转录物的5′末端有非起始性AUG 11核苷酸。它通过突变性PCR将病毒碱基8636和8637从AT变为TA而从pPIV3-L中除去。
实施例2:重组HPIV-3的制备
6孔板中铺满单层的HeLa细胞用重组牛痘病毒vTF7-3感染,感染复数为2。vTF7-3表达T7 RNA聚合酶(如Fuerst,T.R.,P.L.Earl和B.Moss.1987年″用杂交牛痘病毒T7RNA聚合酶系统来表达靶基因″Mol.Cell.Biol.7:2538-2544,和Fuerst,T.R.,E.G.Niles,F.W.Studier和B.Moss,1986年″以合成噬菌体T7RNA聚合酶的重组牛痘病毒为基础的真核瞬时表达系统″Proc.Natl.Acad.Sci.83:8122-8126,纳入本文作参考)。37℃1小时后,根据生产商说明书用脂质转染剂(BRL)转染pPIV3-NP,pPIV3-P,pPIV3-L和pHPIV-3。3小时后,除去转染培养基,用1.5毫升Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/5%胎牛血清代替。40至80小时后,将孔板冷冻,融化并刮擦。然后用澄清的上清液(250μl)感染6孔板中新鲜的HeLa细胞单层。附着1小时后加入含有25μg/ml 1-B-D-阿拉伯糖呋喃糖胞嘧啶(araC)的DEME 1.5ml抑制牛痘病毒复制。40小时后,将孔板冷冻、融化和刮擦。然后在AraC存在下滴定澄清上清液的HPIV-3。在滴定时,挑取分离的噬斑作为琼脂插入物(plug)。将琼脂插入物置于500毫升最适MEM中4℃4小时。然后用250μl感染HeLa新鲜细胞单层以扩增噬斑分离物40小时。
在一个较佳的实例中,转染条件为1微克pHPIV-3,2微克pPIV3-NP,4微克pPIV3-P和0.1微克pPIV3-L。在这些条件下,在最初感染时获得每6×105个细胞约1000pfu,在扩增后每6×105个细胞为106pfu。
当将各个质粒从转染步骤中删除后,发现pHPIV-3,pPIV3-P和pPIV3-L质粒是回收病毒所需的,但是令人惊奇的是,如下表1所示,pPIV3-NP却不需要。
表1
转染的质粒
HPIV-3 NP P L 病毒回收
+ + + + 14/15a
- + + + 0/2
+ - + + 3/3b
+ + - + 0/3
+ + + - 0/2
表1从pHPIV-3回收HPIV-3。用vTF7-3感染HeLa细胞单层并用指定质粒转染。40小时后,裂解细胞,在抑制vTF7-3复制的araC的存在下将上清液加入新鲜HeLa细胞单层。然后裂解这些单层,测定上清液的HPIV-3。每次尝试回收HPIV-3的试验数目显示在病毒回收栏下。
A不产生HPIV-3的单个试验采用0.1微克质粒。
B删除NP质粒导致HPIV-3滴度降低3至5倍。
回收病毒的特性分析
为了鉴定回收的病毒并从vTF7-3(其噬斑仅稍稍小于HPIV-3的噬斑)纯化HPIV-3,挑取怀疑是HPIV-3的分离的噬斑,并在HeLa细胞内扩增。然后在中和试验中分析噬斑纯化的和扩增的病毒分离物和合适的对照。病毒(分离物#3和#5)预先和5微升家兔预免疫血清、5微升家兔多克隆抗HPIV-3抗血清一起培育,或在25微克/毫升araC存在下进行测定。血清在标准噬斑试验前和病毒一起置于冰上30分钟。为了产生最大的噬斑,然后在结晶紫染色前使平板37℃培育66小时。试验结果表明噬斑纯化的病毒完全被抗HPIV-3抗血清抑制,而vTF7-3却没有。相反,HPIV-3分离物没有被AraC抑制,而vTF7-3病毒被完全抑制。令人感兴趣的是,在8个重组HPIV-3分离物中,四个的噬斑大小与亲代HPIV-3原种相同,而另四个则稍大。分离物#3的噬斑大小稍稍大于分离物#5和野生型HPIV-3病毒。
为了确定pHIPV-3的NP编码序列(具有与pPIV3-MG(+)中萤光素酶的相同部分)是否由pHPIV-3表达,将pHPIV-3和pPIV3-NP分别转染到vTF7-3感染的HeLa细胞中,48小时后获得细胞清单(list)。然后用抗HPIV-3 RNP抗血清通过Western印迹分析裂解物。该抗血清主要识别NP并且与P的反应很弱。
具体地说,使抽提物(等价于6×104个细胞)在SDS-10%PAGE上跑电泳,并转移到硝基纤维素膜上。第一抗体是家兔多克隆抗-RNP抗血清(以1∶1000稀释)。第二抗体是偶联了辣根过氧化物酶的山羊抗家兔抗体(稀释度为1∶1000)。通过化学发光显影(ECL试剂盒,Amersham)。如Western印迹所示,HPIV-3 RNP识别pPIV3-NP和pHPIV-3转染的细胞抽提物以及纯化的HPIV-3 RNP的NP。模拟转染的HeLa抽提物中没有蛋白被识别。因此,看来NP由pHPIV-3表达,推测其翻译来自T7指导的反基因组RNA转录物。
为了确定回收的重组病毒其基因组中是否有特定突变,从野生型和噬斑分离的病毒中抽提出RNA并用侧接了替代突变的引物来进行RT-PCR分析。从噬斑纯化的病毒分离物#3、5、7和9或野生型HPIV-3病毒株47885的约2×107噬斑形成单位(pfu)分离出病毒RNA。用Superscript II逆转录酶(BMB)于44℃进行逆转录1小时,采用在病毒碱基23或1500引导的寡核苷酸。用Expand Long聚合酶(BMB)进行PCR,采用导致病毒碱基23-303或15100-15440扩增的第二引物。
从指定的分离物产生包含病毒碱基1-324和15080-15462的PCR产物,分别用SacI和StuI消化,并在1.4%琼脂糖凝胶上分析。有预计大小的PCR产物以RT依赖型方式产生,这表明PCR产物从RNA衍生获得而不是从污染性质粒DNA获得。
如琼脂糖凝胶所示,由于扩增引物中包括了限制性酶位点,大小为1-324和15080-15462的PCR产物的长度分别比病毒特异性区域增加21和22个碱基对。SacI的消化显示,碱基94的突变不存在于野生型病毒中,而是存在于噬斑分离的病毒中,这表明它们的来源是重组体。类似地,从包含野生型HPIV-3病毒碱基15389的区域衍生获得的PCR产物不被StuI断裂。然而,8个噬斑分离的病毒中只有四个含有产生StuI位点的突变。对PCR产物直接测序确认了这些结果。
讨论
构建了HPIV-3基因组的全长质粒克隆pHPIV-3。在将pHPIV-3和编码病毒NP、P和L蛋白的质粒转染到vTF7-3感染的HeLa细胞中时,有效地回收了携带遗传标记的重组HPIV-3。注意到该系统有几个令人惊奇的特征。首先,病毒NP蛋白可以由感染性克隆表达,且这种表达避免了NP支持质粒的需要。据信,NP蛋白在其被牛痘病毒加帽酶加帽后直接由原代反基因组转录物合成。
第二,产生了有不同基因型和表型的两种重组病毒,这可能是由于pHPIV-3和pPIV3-L质粒之间重组引起,但是不能排除在RNA复制时发生回复的可能性。pPIV3-L含有完整的L 3′UTR和尾随区的一部分,延伸至碱基15437,超过StuI位点重叠的48个碱基对。这为质粒间重组提供了充足的空间,在牛痘病毒感染的细胞内很容易发生。
从这些结果可以看出,HPIV-3系统中有选择。所有大的噬斑病毒分离物在碱基15389回复成野生型序列,而保留了碱基94的变化。由于A94G是这些病毒不同于亲代病毒的仅有的已知变化,看来保留了两个突变的分离物具有与亲代(野生型)病毒相同的噬斑大小,而当15389突变丧失时,噬斑增大,这表明碱基15389处的突变对A94G突变不利。pHPIV-3和支持质粒之间还有另一个已知的变化。在天然L蛋白信使中存在非起始性AUG。由于该AUG距离L mRNA 5′端只有11个核苷酸,并且位于翻译起动弱的序列中,它不会对L mRNA翻译有很大的干扰。然而,在支持质粒pPIV3-L中,该非起始性AUG距离转录物的5′端远得多,在该处它更可能被核糖体识别。通过将碱基8636和8637从AT变为TA、破坏SphI位点并产生NheI位点,从而将该AUG从pPIV3-L中除去。为了研究该变化是否在重组病毒中并是造成大噬斑表型的原因,进行了RT-PCR分析。包含该位点并从野生型和噬斑分离的病毒衍生获得的PCR产物保留了野生型序列,这表明该区域没有发生重组,这些变化不能说明噬斑大小变化的原因。
转染的质粒之间可能发生重组的发现提示,在将突变导入副粘病毒或弹状病毒感染性克隆系统时必须小心。导入NP、P或L序列中的突变最好由支持质粒和感染性克隆两者来携带。另外,所得病毒可能不携带所需突变。此情况的唯一可能例外是HPIV-3系统,其中HPIV-3感染性克隆表达NP,从而不需要用NP支持质粒。但是,较佳的是仍希望HPIV-3 NP载体质粒包括在该系统内,因为当转染中包括支持质粒NP时,获得了明显高得多的HPIV-3产量。
JPIV-3感染性克隆可用来了解HPIV-3的分子生物学,并可用来开发该重要病原体的疫苗。在HPIV-3内产生特定突变的能力使得HPIV-3复制的所有方面更容易研究。现在,任何突变(包括以前在其它文章中研究的那些突变)可用该系统来检查。导入特定突变的能力也使我们有可能分析回复体,这能使我们更明确地了解蛋白-蛋白或蛋白-RNA之间的相互作用。
该感染性克隆还可用来鉴定使病毒减毒的突变。这些病毒可用来开发HPIV-3的新疫苗株。另外,目前候选HPIV-3疫苗株内存在的突变可插入pHPIV-3中。通过鉴定多个有害突变,就可能改造出一些突变引入单个HPIV-3株中来影响病毒生命周期中不同阶段。
尽管本发明的描述具体到一定程度,但是不脱离所附权利要求确定的本发明范围内仍可作各种修饰和改动。
Claims (22)
1.一个重组HPIV克隆,该克隆包含:
a.编码人副流感病毒3型病毒HPIV-3的正义反基因组的核苷酸序列;和
b.与所述核苷酸序列操作性相连的RNA聚合酶启动子。
2.根据权利要求1所述的克隆,其中所述克隆还包含位于所述反基因组编码序列下游的核酶序列。
3.根据权利要求1所述的克隆,其中RNA聚合酶启动子是T7 RNA聚合酶启动子。
4.根据权利要求2所述的克隆,其中核酶是反基因组核酶。
5.根据权利要求2所述的克隆,它还进一步包含在核酶序列下游的RNA聚合酶终止子。
6.一个重组HPIV克隆,该克隆包含:
a.编码含有一个或多个突变的HPIV-3正义反基因组的核苷酸序列;和
b.与所述核苷酸序列操作性相连的RNA聚合酶启动子,其中所述克隆用于制备感染性HPIV-3。
7.根据权利要求6所述的克隆,其中所述一个或多个突变选自一个或多个核苷酸的替代、3至12个核苷酸的缺失、以及3至12个核苷酸的增加。
8.根据权利要求6所述的克隆,其中含有一个或多个突变的反基因组在顺式作用元件、蛋白编码区域、或顺式作用元件以及蛋白编码区域两者中有突变。
9.根据权利要求6所述的克隆,其中突变在编码P蛋白的区域内或在编码L蛋白的区域内。
10.一种制备重组人副流感病毒3型病毒的方法,该方法包括:
a.提供一个重组体系统,该系统包含:
i.一个克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒正义反基因组的核苷酸序列;
ii.一个支持克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒L蛋白的核苷酸序列;和
iii.一个支持克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒P蛋白的核苷酸序列,
其中编码P蛋白和L蛋白的核苷酸序列可以在同一支持克隆中或在不同的支持克隆中;
b.将步骤(a)的重组系统导入宿主细胞;
c.培养步骤(b)的宿主细胞足够长时间,以转染宿主细胞并形成重组人副流感病毒3型病毒;和
d.从转染的宿主细胞培养物回收重组人副流感病毒3型病毒。
11.根据权利要求10所述的方法,其中HPIV-3克隆的反基因组编码序列与RNA聚合酶启动子操作性相连;
其中支持克隆的P蛋白编码序列与RNA聚合酶启动子操作性相连;
其中支持克隆的L蛋白编码序列与RNA聚合酶启动子操作性相连;和
其中宿主细胞包含对应于所述HPIV-3克隆和所述支持克隆的RNA聚合酶启动子的RNA聚合酶。
12.根据权利要求10所述的方法,其中用能在重组系统导入宿主细胞之前或在与其结合时表达RNA聚合酶的病毒重组体来感染宿主细胞。
13.一种用来生产重组人副流感病毒3型病毒的宿主细胞,所述宿主细胞包含:
a.一个HPIV-3克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒正义反基因组的核苷酸序列;
b.一个支持克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒L蛋白的核苷酸序列;和
c.一个支持克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒P蛋白的核苷酸序列;
其中编码P蛋白和L蛋白的核苷酸序列可以在同一支持克隆中,或在不同的支持克隆中。
14.根据权利要求10所述的宿主细胞,它还包含一个支持克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒NP蛋白的核苷酸序列。
15.一种用来生产重组人副流感病毒的宿主细胞,所述宿主细胞包含:
a.一个HPIV克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒正义反基因组的核苷酸序列,其中所述反基因组包含定点突变;
b.一个支持克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒L蛋白的核苷酸序列;和
c.一个支持克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒P蛋白的核苷酸序列;
其中编码P蛋白和L蛋白的核苷酸序列可以在同一支持克隆中,或在不同的支持克隆中。
16.根据权利要求14所述的宿主细胞,其中HPIV-3克隆还包含的RNA聚合酶启动子与HPIV-3反基因组序列操作性相连,且其中各个支持克隆包含的RNA聚合酶启动子与所述支持克隆的HPIV-3蛋白编码序列操作性相连。
17.一种将定点突变导入重组人副流感病毒基因组的方法,该方法包括下列步骤:
a.制备一个克隆,该克隆包含的核苷酸序列编码了特定位点具有突变的人副流感病毒3型病毒反基因组;
b.使包含编码HPIV-3 L蛋白的核苷酸序列的支持克隆、包含编码HPIV-3 P蛋白的核苷酸序列的支持克隆和步骤(a)的克隆一同转染宿主细胞;
其中编码P蛋白和L蛋白的核苷酸序列可以在同一支持克隆中,或在不同的支持克隆中;和
c.培养转染的宿主细胞足够长时间,以形成重组人副流感病毒3型病毒。
18.根据权利要求17所述的方法,它还包括用含有编码HPIV-3 NP蛋白的核苷酸序列的支持克隆转染宿主细胞。
19.根据权利要求17所述的方法,其中步骤(a)的克隆用聚合酶链反应技术制得。
20.一种用来生产重组人副流感病毒的宿主细胞,所述宿主细胞包含:
a.一个HPIV克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒正义反基因组的核苷酸序列,其中所述反基因组包含定点突变;
b.一个支持克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒L蛋白的核苷酸序列;和
c.一个支持克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒P蛋白的核苷酸序列;
其中编码P蛋白和L蛋白的核苷酸序列在同一支持克隆中,或在不同的支持克隆中;且
其中突变在编码HPIV克隆序列的反基因组的L蛋白编码区中,且包含L蛋白编码序列的支持克隆具有相同的突变。
21.一种用来生产重组人副流感病毒的宿主细胞,所述宿主细胞包含:
a.一个HPIV-3克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒正义反基因组的核苷酸序列,其中所述反基因组包含定点突变;
b.一个支持克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒L蛋白的核苷酸序列;和
c.一个支持克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒P蛋白的核苷酸序列;
其中编码P蛋白和L蛋白的核苷酸序列在同一支持克隆中,或在不同的支持克隆中;且
其中突变在编码HPIV克隆序列的反基因组的P蛋白编码区中,且包含P蛋白编码序列的支持克隆具有相同的突变。
22.一种用来生产重组人副流感病毒的宿主细胞,所述宿主细胞包含:
a.一个HPIV-3克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒正义反基因组的核苷酸序列,其中所述反基因组包含定点突变;
b.一个支持克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒L蛋白的核苷酸序列;
c.一个支持克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒P蛋白的核苷酸序列;和
d.一个支持克隆,该克隆包含编码人副流感病毒3型病毒NP蛋白的核苷酸序列;
其中编码P蛋白、L蛋白和NP蛋白的核苷酸序列在同一支持克隆中,或在不同的支持克隆中;且
其中突变在编码HPIV克隆序列的反基因组的NP蛋白编码区中,且包含NP蛋白编码序列的支持克隆具有相同的突变。
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