ES2289782T3 - Clon infeccioso para el virus parainfluenza de tipo 3 humano. - Google Patents

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Abstract

Clon recombinante de HPIV, que comprende: a) una secuencia de nucleótidos que codifica un antigenoma de sentido positivo del virus parainfluenza de tipo 3 humano (HPIV-3), y b) un promotor de ARN polimerasa ligado funcionalmente a dicha secuencia de nucleótidos.

Description

Clon infeccioso para el virus parainfluenza de tipo 3 humano.
El presente trabajo ha recibido el apoyo de la subvención National Institutes of Health nº 32027 del Institute of Allergy and Infectious Diseases. El gobierno podría poseer derechos sobre la presente invención.
Antecedentes
Los virus parainfluenza humanos (HPIV), identificados como causa de infección respiratoria en el ser humano desde 1956, se cree que suponen el 4 a 22 por ciento de las enfermedades respiratorias en niños, sólo por detrás del virus sincitial respiratorio en este aspecto. Los HPIV son causas importantes de enfermedades del tracto respiratorio inferior tales como neumonía y bronquiolitis, y son la causa más común de crup en niños pequeños. De los cuatro serotipos de HPIV, el virus de tipo 3 (HPIV-3) aparentemente es el más virulento, causando con frecuencia bronquiolitis y neumonía durante el primer mes de vida.
Por desgracia, en la actualidad no se dispone de vacunas o terapias antivíricas eficaces que puedan utilizarse para prevenir o tratar las infecciones inducidas por HPIV. Los procedimientos estándares que se utilizan para producir virus inactivos, tales como la inactivación por calor o el tratamiento químico de los virus, no han tenido éxito con todas las cepas y serotipos de HPIV, incluyendo HPIV-3. Además, los procedimientos estándares para producir virus atenuados producen mutaciones en sitios aleatorios y no permiten modificar el genoma de HPIV en sitios específicos o controlar el número de mutaciones que se introducen en el genoma.
Los virus parainfluenza humanos son virus de ARN monocatenario de sentido negativo con cubierta pertenecientes al género paramixovirus dentro de la familia Paramyxoviridae. La replicación del genoma del virus parainfluenza humano (ARNv) es similar a la de otros elementos de la familia Paramyxoviridae. Tras la infección de una célula, la transcripción es el suceso principal de síntesis de ARN, resultando en la producción de los ARNm víricos a partir del genoma de sentido negativo, es decir, el ARNv. Posteriormente durante la infección, se produce una transición a replicación del ARN, resultando en la síntesis de un ARN de sentido positivo antigenómico de longitud completa, que sirve como molde para la síntesis de ARN genómico de sentido negativo adicional. La transcripción y replicación del ARN genómico depende de la formación de un complejo de ribonucleoproteína (RNP) que consiste del ARN genómico de 15.462 nucleótidos encapsidado por la proteína de nucleocápside (NP) y la fosfoproteína (P) y proteína polimerasa (L) de gran tamaño. También se encuentran implicados varios factores de la célula huésped en el ciclo replicativo del HPIV.
El requisito para un RNP intacto para HPIV ha dificultado el análisis de la transcripción y replicación del HPIV en un sistema libre de células. Los esfuerzos para encapsidar el ARNv del HPIV-3 in vitro han fracasado, y al contrario que los virus ARN de sentido positivo, el ARNv del HPIV desnudo no es infeccioso. Además, en la actualidad no se conocen sistemas para preparar HPIV recombinantes, incluyendo HPIV-3 infeccioso recombinante.
De acuerdo con lo expuesto anteriormente, existe una necesidad de nuevos reactivos, sistemas y procedimientos que permitan producir un HPIV recombinante, particularmente un HPIV-3 infeccioso recombinante. Los sistemas recombinantes que permiten la introducción de una o más mutaciones sitio-específicas en el genoma del HPIV, particularmente del HPIV-3, resultan deseables. Los sistemas recombinantes que permiten caracterizar el efecto de mutaciones sitio-específicas sobre la transcripción o replicación de ARN de virus parainfluenza humano y para identificar las mutaciones sitio-específicas que conducen a la producción de HPIV atenuado resultan especialmente deseables.
Sumario de la invención
Según la presente invención, se proporciona un sistema para generar virus parainfluenza humano de tipo 3 (HPIV-3) recombinante infeccioso. En una forma de realización, el sistema comprende un clon que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antigenoma de sentido positivo y longitud completa de HPIV-3 y por lo menos un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína P de HPIV y la proteína L de HPIV. En otra forma de realización, el sistema comprende además un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína NP de HPIV. Preferentemente, cada uno de los clones en el sistema comprende un promotor de ARN polimerasa que se encuentra ligado funcionalmente a la secuencia de nucleótidos del HPIV respectivo contenido dentro del clon.
Asimismo, la presente invención proporciona un clon que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el antigenoma de sentido positivo de longitud completa de HPIV-3. El clon comprende asimismo un promotor de ARN polimerasa funcionalmente ligado a la secuencia codificante de antigenoma de HPIV-3. En una forma de realización preferida, el clon comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un ribozima inmediatamente cadena abajo de la secuencia codificante del antigenoma de HPIV-3.
La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento de preparación de virus HPIV-3 recombinante que presenta mutaciones sitio-específicas en el genoma de HPIV-3. El procedimiento comprende preparar un clon que comprende una secuencia modificada codificante de antigenoma de HPIV-3, introducir el clon de HPIV-3 modificado y clones de soporte que comprenden secuencias de nucleótidos codificantes de una proteína P de HPIV, una proteína L de HPIV-3 y, preferentemente, una proteína NP de HPIV-3 en células huésped, y cultivar las células huésped bajo condiciones que permiten la síntesis del antigenoma modificado de HPIV-3 y las proteínas L, P y NP de HPIV-3.
La capacidad de producción del virus HPIV-3 recombinante manipulados genéticamente para contener mutaciones sitio-específicas dentro de genes de HPIV-3 y elementos que actúan en cis acelera el estudio de todos los aspectos del ciclo de replicación del virus. Además, un sistema que permita la producción de HPIV recombinante que se manipule genéticamente para que contenga mutaciones sitio-específicas dentro del genoma de HPIV-3 resulta útil para identificar genotipos de parainfluenza atenuantes y para desarrollar una vacuna viva para el virus parainfluenza humano.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 ilustra la forma ADN de la secuencia de nucleótidos del genoma de HPIV-3 y muestra la localización de sitios de restricción, secuencia líder, secuencia remolque y regiones codificantes de proteína del genoma.
La figura 2 es un mapa de restricción del vector pOCUS-2^{TM}.
La figura 3 es un mapa de restricción de pMG(+) que muestra la localización de la secuencia líder, la región codificante de luciferasa y el promotor y terminador de T7.
La figura 4 es un mapa de restricción de pHPIV-3 que muestra la localización de la secuencia líder y las regiones codificantes de proteína de HPIV-3.
La figura 5 es una descripción esquemática del clon infeccioso de longitud completa pHPIV-3; VV\Phi, señal de parada de polimerasa de virus vaccinia (TTTTTNT); T7, promotor de la ARN polimerasa de T7; le, secuencia líder de HPIV-3; NP, P, M, F, HN y L son las regiones codificantes de la proteína de HPIV-3; tr, secuencia remolque de HPIV-3; Rz, el ribozima antigenómico del virus de la hepatitis delta; T7\Phi, señal de terminador de la ARN polimerasa de T7. Las regiones que contienen mutaciones por sustitución se han expandido y se muestran en la parte superior, indicando los cambios específicos. El cambio de A por G en la base 94 vírica crea un sitio SacI y el cambio de A por G en la base 15.389 vírica crea un sitio StuI.
Descripción detallada de la invención
Según la presente invención, se proporciona un sistema para generar HPIV-3 recombinante. El sistema comprende un clon que comprende una secuencia de nucleótidos, preferentemente una secuencia de ADN bicatenario, que codifica un antigenoma de sentido positivo de longitud completa de HPIV en adelante denominado "clon de HPIV", y uno o más clones de soporte que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una proteína P de HPIV y una proteína L de HPIV. Las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína P de HPIV y la proteína L de HPIV pueden encontrarse dentro del mismo clon. Sin embargo, para facilitar la manipulación, resulta preferido que las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína P de HPIV y la proteína L de HPIV se encuentren en clones separados. Preferentemente el clon de HPIV comprende una secuencia codificante de un antigenoma de HPIV-3. Preferentemente el clon o clones de soporte codifican una proteína P y una proteína L de HPIV-3. En otra forma de realización, el sistema comprende además un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína NP de HPIV, preferentemente la proteína NP de HPIV-3.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "clon" se refiere a ADN bicatenario que puede introducirse en una célula y expresarse. El clon puede encontrarse en la forma de un vector vírico, tal como, por ejemplo, un vector vírico vaccinia, o preferentemente, en la forma de un plásmido. Preferentemente, el clon de HPIV y los clones de soporte comprenden cada uno de ellos un promotor de ARN polimerasa, más preferentemente un promotor de ARN polimerasa de T7. Cada uno de los promotores de la ARN polimerasa se encuentra funcionalmente ligado a la secuencia codificante de HPIV correspondiente en el clon. De esta manera, el promotor de ARN polimerasa en el clon de HPIV se encuentra funcionalmente ligado a la secuencia de HPIV y la ARN polimerasa en los clones de soporte se encuentran funcionalmente ligadas a la secuencia o secuencias codificantes de la proteína de HPIV respectiva. Preferentemente, los plásmidos que comprenden el clon también comprenden un origen de replicación, particularmente un origen de replicación bacteriano.
La presente invención también proporciona un clon que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia antigenómica de HPIV-3, en adelante denominada "clon de HPIV-3". Preferentemente, el clon de HPIV-3 codifica una secuencia antigenómica de longitud completa de HPIV-3. Tal como se utiliza en la presente memoria, "de longitud completa" se refiere a que la secuencia antigenómica es complementaria a la totalidad de la secuencia genómica de sentido negativo de HPIV-3 que se extiende desde el nucleótido 3' de la secuencia líder hasta el nucleótido 5' de la secuencia remolque el genoma de HPIV-3. La forma ADN de la secuencia genómica de longitud completa de HPIV-3, SEC ID nº 1 se muestra en la fig. 1. Además de las secuencias líder y remolque, el clon de HPIV-3 contiene secuencias codificantes de las proteínas N, P, M, F, HN y L de HPIV-3, así como los elementos que actúan en cis. El clon de HPIV-3 puede codificar una secuencia antigenoma de HPIV-3 de tipo salvaje o un antigenoma de HPIV-3 modificado que presente una o más mutaciones contenidas en el mismo. La mutación puede encontrarse en la forma de un gen foráneo que se inserta en la secuencia codificante del antigenoma de HPIV-3. Preferentemente, las mutaciones son sustituciones de uno o más nucleótidos, deleciones de 6 a 12 nucleótidos, o adiciones de 6 a 12 nucleótidos en la secuencia codificante de antigenoma de HPIV-3. Más preferentemente, el clon de HPIV-3 modificado contiene sustituciones en los genes o en los elementos que actúan en cis, o en ambos, de la secuencia codificante de antigenoma de HPIV-3.
Preferentemente, el clon de HPIV-3 es un plásmido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ribozima, más preferentemente el ribozima antigenómico del virus de la hepatitis delta, situado inmediatamente cadena abajo de la secuencia codificante del antigenoma de HPIV. Tras la transcripción del gen, el ribozima corta el ribozima del antigenoma de HPIV proporcionando un extremo 3' en el antigenoma de replicación competente. Más preferentemente, el clon de HPIV-3 también comprende un terminador de ARN polimerasa tras la secuencia del ribozima. En una forma de realización, el clon de HPIV-3 es el plásmido pHPIV-3 ilustrado en la fig. 5, que ha sido depositado en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockwille, MD 20852, USA, mayo de 1998 y presenta un número de acceso PTA-722.
Asimismo, la presente invención se refiere a un procedimiento de preparación de HPIV recombinante, particularmente HPIV-3, utilizando el sistema descrito anteriormente. El procedimiento comprende introducir un clon de HPIV y los clones de soporte que codifican la proteína P de HPIV y la proteína L de HPIV, en células huésped, preferentemente células humanas; cultivar las células huésped bajo condiciones que permiten la formación de un transcrito antigenómico de HPIV, sintetizar el genoma de HPIV (ARNv) y las proteínas L, P y NP de HPIV, y formación de un HPIV recombinante; y recuperar el HPIV recombinante a partir del cultivo. Preferentemente las células huésped que se transfectan con el clon de HPIV y los clones de soporte, contienen una ARN polimerasa que corresponde al promotor de la ARN polimerasa que se encuentra funcionalmente ligado a las secuencias de HPIV en el clon de HPIV y en los clones de soporte. En una forma de realización preferida, un clon de soporte que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína NP de HPIV funcionalmente ligada a un promotor de ARN polimerasa también se introduce en las células. Preferentemente, las células huésped se infectan con un recombinante vírico, preferentemente un virus vaccinia recombinante, que expresa la ARN polimerasa, más preferentemente la ARN polimerasa de T7, previamente o en combinación con la transfección con el clon de HPIV y el clon o clones de soporte. Cuando estas células se infectan con el virus vaccinia recombinante, resulta preferido que el clon de HPIV-3 comprenda también un terminador de ARN polimerasa de virus vaccinia cadena arriba de la ARN polimerasa de T7 y un terminador de ARN polimerasa de virus vaccinia cadena abajo del terminador de la ARN polimerasa de T7.
Asimismo, la presente invención se refiere a un procedimiento de introducción de mutaciones sitio-específicas en el genoma de un HPIV-3 recombinante. El procedimiento comprende preparar un clon de HPIV-3 modificado que comprende una o más mutaciones en la secuencia que codifica el antigenoma de HPIV-3; introducir el clon de HPIV-3 modificado y clones de soporte que comprenden secuencias que codifican la proteína P de HPIV-3 y la proteína L de HPIV-3, y preferentemente, la proteína NP de HPIV-3 en células huésped; y cultivar las células huésped bajo condiciones que permite la formación de un transcrito antigenómico de HPIV-3 modificado y sintetizar las proteína L, P y NP de HPIV-3. El clon de HPIV-3 modificado y los clones de soporte contienen un promotor de ARN polimerasa que se encuentra funcionalmente ligado a las secuencias codificantes de la proteína de HPIV-3. Las células huésped que contienen dentro del citoplasma de las mismas una ARN polimerasa que corresponde al promotor de ARN polimerasa en el clon de HPIV-3 modificado y en los clones de soporte.
Preferentemente, el clon de HPIV-3 modificado, que contiene una o más mutaciones en el mismo, se construye mediante técnicas de PCR convencionales utilizando un clon de HPIV-3 como molde. Las mutaciones se introducen en los elementos que actúan en cis de la secuencia de HPIV-3 o en una secuencia codificante de proteína de HPIV-3. Preferentemente la mutación se introduce en la secuencia codificante de la proteína L. Si se introducen mutaciones en las secuencias codificantes de la proteína de HPIV-3 del clon de HPIV-3, resulta preferido introducir un tipo similar de mutación en el mismo sitio en la secuencia codificante de la proteína del clon de soporte correspondiente. Por ejemplo, si se introduce una mutación en un sitio específico en la secuencia codificante de la proteína L del clon de HPIV-3, resulta preferido que se introduzca la misma mutación en el mismo sitio en la secuencia codificante de la proteína L del clon de soporte codificante de proteína L. Este procedimiento resulta útil para identificar mutaciones que bloquean la síntesis de partículas víricas o resultan en la producción dHPIV-3 no infeccioso o no virulento.
Con el fin de determinar si los virus mutados producidos mediante el procedimiento indicado anteriormente son no virulentos, es decir atenuados en primer lugar los virus mutados se someten a ensayo in vitro para determinar si la mutación ha resultado en un fenotipo de crecimiento más lento, es decir, el virus mutado crece más lentamente en cultivo de tejidos que el virus del tipo salvaje. Los virus mutados que muestran dicho fenotipo se examinan a continuación in vivo mediante inyección en un animal, tal como la rata algodonera, que es un buen modelo experimental para el virus parainfluenza. A continuación, los animales infectados se examinan para determinar si están produciendo anticuerpos contra HPIV-3 y para determinar si se produce una reducción de la severidad de los síntomas en comparación con animales infectados por el virus de tipo salvaje.
La capacidad de producir virus HPIV-3 recombinante manipulado genéticamente para que contenga alteraciones específicas dentro de los genes de HPIV-3 y elementos que actúan en cis, acelera el estudio de todos los aspectos del ciclo de replicación del virus. Además, un sistema que permite la producción de HPIV recombinante que se manipula genéticamente para que contenga alteraciones específicas dentro de los genes de HPIV-3 resulta útil para identificar genotipos de parainfluenza atenuantes y para desarrollar una vacuna viva para el virus parainfluenza humano.
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Los ejemplos siguientes de procedimientos de preparación de un clon de ADNc de longitud completa de HPIV-3 y procedimientos de preparación de un HPIV-3 recombinante infeccioso mutado se proporcionan a título ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención.
Ejemplo 1 Construcción de un clon de ADNc de longitud completa de HPIV-3
La construcción de un clon infeccioso de longitud completa de HPIV-3 que contiene mutaciones en sitios específicos se consiguió mediante un procedimiento en dos etapas. La etapa inicial fue la generación de un minirreplicón que contenía la región de parte líder de sentido positivo y las regiones remolque de HPIV-3. La segunda etapa implicó la inserción de fragmentos de PCR-RT derivados de ARN genómico de HPIV-3 en el minirreplicón. El minirreplicón de sentido positivo contenía lo siguiente: un promotor de T7 que dirigía la síntesis de dos residuos G no víricos, seguido de la región líder de sentido positivo de HPIV-3, una parte del UTR 5' de NP (hasta la base vírica nº 97), el gen de luciferasa, una parte del UTR 3' de L (partiendo de la base vírica nº 15.387) y las secuencias remolque de HPIV-3. La secuencia de nucleótidos de longitud completa del genoma de HPIV-3 y la localización de la secuencia líder, secuencia remolque y regiones codificantes de proteína se muestran en la figura 1. A continuación, el ribozima antigenómico del virus de la hepatitis delta realizó un corte preciso tras la base específica 3' terminal de HPIV-3. También se incorporó un terminador de ARN polimerasa de T7 en el replicón, seguido de la secuencia de ribozima. Además, se insertaron señales de terminación de la polimerasa del virus vaccinia inmediatamente cadena arriba y abajo de las secuencias anteriormente indicadas. Durante la construcción, se crearon cambios de una sola base en las regiones codificantes del UTR 5' de NP y el UTR 3' de L. Un cambio de A por G en la base vírica nº 94 y el cambio A por G en la base nº 15.389 crearon los sitios SacI y StuI, respectivamente, que sirvieron como etiquetas genéticas para identificar los virus de origen recombinante.
Se seleccionó el vector pOCUS-2(Novagen) como el plásmido de partida para preparar el minirreplicón [pPIV3-MG(+)] debido a su tamaño reducido (1.930 pb). Se cree que la utilización de un plásmido de partida de tamaño reducido podría incrementar la estabilidad del clon de longitud completa.
Se construyó el minirreplicón generando productos de PCR codificantes de las regiones líder y remolque flanqueadas por un promotor de T7 y ribozima antigenómico de virus de la hepatitis delta, respectivamente. Los cebadores utilizados para la síntesis de la región de promotor/líder de T7 eran:
5'-TAGTCGGCCCTAATACGACTCACTATAGGACCAAACAAGAGAAGAAACT-3', SEC ID nº 2, y 5'-GAAA
TTATAGAGCTCCCTTTTCT-3', SEC ID nº 3. El primer cebador codifica un sitio EagI y el promotor de T7 (subrayado), y el segundo cebador introdujo un cambio de A por G en la base vírica nº 94 (negrita) dentro de la región 5' no traducida (UTR) del ARNm de NP, que crea un sitio SacI. El molde para esta región, pHPIV3-CAT, se describe en: De, B.P. y A.K. Banerjee, 1993, Rescue of synthetic analogs of genome RNA of human parainfluenza virus type 3, Vir. 196:344-348. El producto de PCR resultante se clonó en los sitios EagI y SacI de pOCUS-2, que se ilustra en la figura 2. Los cebadores utilizados para la síntesis de la región de remolque/ribozima eran:
5'-TAAGGCCTAAAGATAGACAAAAAGTAAGAAAAACATGTAATATATATATACCAAACAGAGTTCTTCT
CTTGTTTGGTGGGTCGGCATGGCATCTC-3', SEC ID nº 4, y 5'-CTGGGTACCTCCCTTAGCCATCCGAGT-3', SEC ID nº 5. El primer cebador contiene secuencias desde UTR 3' del ARNm de L, hasta el remolque, y ceba la síntesis del ribozima (subrayado). Además, un cambio de A por G en la base vírica nº 15.389 (negrita), que crea un sitio StuI dentro de UTR 3' del ARNm de L, se encuentra codificado por este cebador. El segundo cebador codifica el extremo 3' del ribozima (subrayado) y un sitio BgIII. El molde para esta reacción de PCR era pSA1, un plásmido que contiene la secuencia de ribozima, tal como ha sido descrito anteriormente por Perrotta, A.T. y M.D. Been, 1991, The pseudoknot-like structure required for efficient self-cleavage of hepatitis delta virus RNA, Nature 350:434-436. El producto de PCR derivado de esta reacción se clonó en los sitios StuI y BgIII de pOCUS-2. Las regiones líder y remolque se combinaron en un solo clon mediante la transferencia del fragmento EagI/PstI del clon de T7/líder en los sitios PacI/PstI del clon de remolque/ribozima.
Con el fin de impedir posibles interferencias por transcripción a partir de los promotores crípticos del virus vaccinia, se insertaron señales de parada de transcripción de la polimerasa del virus vaccinia (TTTTTNT) cadena arriba y abajo del replicón próximo a los sitios PvuII y SspI dentro de pOCUS-2. Se eliminó una señal de terminación de transcripción de T7 de pET-17b mediante digestión con BlpI y BspEI, y se insertaron en el sitio SspI (creación de extremo romo con ADN polimerasa de T4) de pOCUS-2. A continuación, se insertó un gen informador de luciferasa en los sitios SacI y StuI para crear pPIV3-MG(+), que se ilustra esquemáticamente en la figura 3.
Con el fin de generar el clon de HPIV-3 de longitud completa, se generaron cinco productos de PCR-RT a partir de ARN de virión HPIV-3 y se clonaron. Estos fragmentos se insertaron posteriormente en pPIV-3-MG(+), sustituyendo las secuencias codificantes de luciferasa, creando pHPIV-3, el clon de longitud completa. Se generaron los cinco productos de PCR-RT a partir de ARN de virión de la cepa 47885 de HPIV-3, que se obtuvo de Robert Chanock en el National Institutes of Health. Estos productos de PCR, que comprenden el resto del genoma de HPIV-3, se identificaron mediante análisis de enzimas de restricción y se clonaron, en pUC19 o pOCUS-2, y después se insertaron en pPIV3-MG(+).
El primer producto de PCR que contenía las bases víricas nº 83 a nº 2.721 se insertó en el sitio SmaI de pUC19. A continuación, el clon 83/2721 se digirió con SacI y XmnI, eliminando las bases víricas nº 94 a nº 553, que se insertaron en SacI y SphI (con extremo romo creado con ADN polimerasa de T4) de pPIV3-MG(+). A continuación, se digirió el clon 83/2721 con PstI para eliminar un fragmento que contenía las bases víricas nº 540 a nº 2.274, que se insertó a continuación en el sitio PstI del clon pPIV3-MG(+) que contenía el fragmento 94/554. El segundo producto de PCR que comprendía las bases víricas nº 13.395 a nº 15.397 se clonó en el sitio SmaI de pUC19. Este clon 13395/15397 se digirió a continuación con StuI y PacI, y el fragmento resultante que contenía las bases víricas nº 13.632 a nº 15.381, se insertó en los sitios StuI y PacI del clon pPIV3-MG(+) que contenía la secuencia vírica hasta la base nº 2.274. El clon resultante contenía las bases víricas nº 1 a nº 2.274 y nº 13.632 a nº 15.462 en el contexto de pPIV3-MG(+).
El tercer producto de PCR que contenía las bases víricas nº 7.403 a nº 11.513 se digirió con BspMI (con extremo romo creado con ADN polimerasa de T4) y XhoI para producir un fragmento que contenía las bases nº 7.437 a nº 11.444 que se insertó en los sitios XhoI y SspI de pOCUS-2. EL cuarto fragmento de PCR que contenía las bases víricas nº 10.904 a nº 13.773 se digirió con PvuII y BamHI (bases víricas nº 10.918 a nº 13.733) y se insertó en EcoRI (con extremo romo creado con ADN polimerasa de T4) y sitios BamHI de pUC19. Los dos segmentos víricos se combinaron mediante la digestión del clon 7437/11444 con SacI (con extremo romo creado con ADN polimerasa de T4) y EcoNI y se insertó en el clon 10918/13733 digerido con EcoRI (con extremo romo creado con ADN polimerasa de T4) y EcoNI. El clon resultante contenía las bases víricas nº 7.437 a nº 13.733 en un esqueleto de pUC19. El resto de la secuencia vírica se derivó a partir de un quinto producto de PCR que comprendía las bases víricas nº 83 a nº 7.457 que había sido digerido con XmnI y XhoI (bases víricas nº 553 a nº 7.437) y se clonó en los sitios StuI y XhoI de pOCUS-2. A continuación, el clon 7437/13733 se digirió con BamHI, se crearon extremos romos con ADN polimerasa de T4, y se digirió con XhoI para liberar un fragmento que se insertó en EagI (con extremo romo creado con ADN polimerasa de T4) y clon 553/7.437 digerido con XhoI. El clon resultante contenía las bases víricas nº 553 a nº 13.733. Este clon a continuación se digirió con PshAI y PacI, y el fragmento resultante, que contenía las bases víricas nº 2.143 a nº 13.632, se insertó en los mismos sitios del clon pPIV3-MG(+) que contenía las bases víricas nº 1 a nº 2.274 y nº 13.632 a nº 15.462. Lo anterior generó pHPIV-3, el clon infeccioso, que se ilustra esquemáticamente en la figura 4.
Con el fin de insertar el gen de P en pGEM-4, se transfirieron secuencias de P procedentes de un clon de fusión de P-lac (descrito en 38, que se incorpora a la presente memoria como referencia) mediante la digestión con XbaI (creación de extremo romo con ADN polimerasa de T4), BamHI y se insertaron en KpnI (creación de extremo romo con ADN polimerasa de T4) y sitios BamHI de pGEM4. Los clones pPIV3-NP y pPIV3-L, tal como se describe en 15, 16, que se incorporan a la presente memoria como referencia, se encontraban en un esqueleto de pGEM-4. También se modificó el clon pPIV3-L. En la secuencia natural de ARNm de L existe un AUG no iniciador situado a 11 nucleótidos del extremo 5' del transcrito. Éste se eliminó de pPIV3-L mediante PCR mutacional, cambiando las bases víricas nº 8.636 y nº 8.637 de AT a TA.
Ejemplo 2 Preparación de HPIV-3 recombinante
Se infectaron monocapas confluyentes de células HeLa en placas de 6 pocillos con virus vaccinia recombinante vTF7-3 a una multiplicidad de infección de 2. vTF7-3 expresa la ARN polimerasa de T7 tal como se describe en: Fuerst, T.R., P.L. Earl y B. Moss, 1987, Use of a hybrid vaccinia virus-T7 RNA polymerase system for expression of target genes, Mol. Cell Biol. 7:2538-2544, y Fuerst, T.R., E.G. Niles, F.W. Studier y B. Moss, 1986, Eukaryotic transient-expression system based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase, Proc. Natl. Acad. Sci. 83:8122-8126, que se incorporan a la presente memoria como referencia. Tras 1 hora a 37ºC, se transfectaron pPIV3-NP, pPIV3-P, pPIV3-L y pHPIV-3 utilizando lipofectina (BRL) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras tres horas, se separó el medio de transfección y se sustituyó por 1,5 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)/suero de feto bovino al 5%. Tras 40 a 48 horas, se congelaron las placas, se descongelaron y se rasparon. El sobrenadante del medio clarificado (250 \mul) se utilizó a continuación para infectar monocapas de células HeLa frescas en placas de 6 pocillos. Se añadió DMEM (1,5 ml) que contenía 25 \mug/ml de 1-B-D-arabinofuranosil-citosina (araC) para inhibir la replicación del virus vaccinia tras una hora de unión. Tras cuarenta horas, las placas se congelaron, se descongelaron y se rasparon. A continuación, el sobrenadante del medio clarificado se tituló para HPIV-3 en presencia de AraC. Durante la titulación, se recogieron placas aisladas en forma de tapones de agar. Los tapones de agar se introdujeron en 500 ml de opti-MEM a 4ºC durante 4 horas. Se utilizaron a continuación 250 \mul para infectar monocapas de células HeLa frescas para la amplificación durante 40 horas de las placas aisladas.
En una forma de realización preferida, las condiciones eran: 1 \mug de pHPIV-3, 2 \mug de pPIV3-NP, 4 \mug de pPIV3-P y 0,1 \mug de pPIV3-L. Bajo estas condiciones, se obtuvieron aproximadamente 1.000 pfu por cada 6 x 10^{5} células durante la transfección inicial y 10^{6} pfu por cada 6 x 10^{5} células tras la amplificación.
Al omitir plásmidos individuales de la etapa de transfección, se observó que resultaban necesarios los plásmidos pHPIV-3, pPIV3-P y pPIV3-L para la recuperación de virus aunque, inesperadamente, tal como se muestra en la Tabla 1 a continuación, pPIV3-NP no lo era.
TABLA 1
Plásmidos transfectados
HPIV-3 NP P L Recuperación de virus
+ + + + 14/15ª
- + + + 0/2
+ - + + 3/3^{b}
+ + - + 0/3
+ + + - 0/2
Tabla 1. Recuperación de HPIV-3 a partir de pHPIV-3. Se infectaron monocapas de células HeLa con vTF7-3 y se transfectaron con los plásmidos indicados. Tras 40 horas, las células se lisaron y los sobrenadantes se añadieron a monocapas de células HeLa frescas en presencia de araC para inhibir la replicación de vTF7-3. A continuación, estas monocapas se lisaron y los sobrenadantes se sometieron a ensayo para HPIV-3. El número de experimentos para el que se recuperó HPIV-3 por intento se muestra en la columna "Recuperación de virus".
^{A}El único experimento que no rindió HPIV-3 hizo uso de 0,1 \mug del plásmido de P.
^{B}La omisión del plásmido de NP resultó en títulos 3 a 5 veces inferiores de HPIV-3.
\vskip1.000000\baselineskip
Caracterización del virus recuperado
Con el fin de caracterizar el virus recuperado y purificar HPIV-3 a partir de vTF7-3, las placas del cual sólo eran ligeramente más pequeñas que las de HPIV-3, se recogieron placas aisladas que se sospechaba que eran HPIV-3 y se amplificaron en células HeLa. Los aislados de virus purificados y amplificados a partir de placas y los controles apropiados se analizaron a continuación en ensayos de neutralización. Se preincubaron virus (aislados nº 3 y nº 5) (30 minutos en hielo) con 5 \mul de suero preinmunológico de conejo, 5 \mul de antisuero anti-HPIV-3 policlonal de conejo o se sometieron a ensayo en presencia de 25 \mug/ml de araC. Los sueros se incubaron con virus sobre hielo durante 30 minutos previamente a un ensayo estándar de placas. Con el fin de permitir el máximo desarrollo de placas, las placas se incubaron a continuación a 37ºC durante 66 horas previamente a la tinción con cristal violeta. Los resultados del ensayo indicaron que el virus purificado a partir de placa resultaba completamente inhibido por los antisueros anti-HPIV-3, mientras que vTF7-3 no. Por el contrario, los aislados de HPIV-3 no resultaron inhibidos por AraC, mientras que el virus vTF7-3 resultó completamente inhibido. Resulta interesante que de los ocho aislados recombinantes de HPIV-3, cuatro presentaban tamaños de placa idénticos al stock parental de HPIV-3, mientras que cuatro eran ligeramente de mayor tamaño. El tamaño de placa del aislado nº 3 era ligeramente mayor al del aislado nº 5 y al del virus HPIV-3 de tipo salvaje.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Para determinar si la secuencia codificante de NP de pHIPV3, que comparte la misma posición que la luciferasa en pPIV3-MG(+), se estaba expresando desde pHPIV-3, se transfectaron separadamente pHPIV-3 y pPIV3-NP en células HeLa infectadas por vTF7-3 y se prepararon listas celulares tras 48 horas. A continuación, los lisados se analizaron mediante transferencia western utilizando un antisuero anti-HPIV-3RNP. Este antisuero reconoce principalmente NP y reacciona pobremente con P.
Específicamente, se corrieron extractos (equivalentes a 6 x 10^{4} células) en PAGE-SDS al 10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. El anticuerpo primario era un antisuero anti-RNP policlonal de conejo diluido 1:1.000. El anticuerpo secundario era una dilución 1:1.000 de un anticuerpo anticonejo de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante. La visualización se realizó mediante quimioluminiscencia (kit ECL, Amersham). Tal como se mostró mediante transferencia western, RNP de HPIV-3 reconoció NP procedente de extractos celulares transfectados con pPIV3-NP y pHPIV-3 y de RNP de HPIV-3 purificado. No se identificaron proteínas en un extracto HeLa transfectado con el plásmido vacío. De esta manera, aparentemente NP es expresado por pHPIV-3, traduciéndose presumiblemente a partir del transcrito de ARN antigenómico dirigido por T7.
Para determinar si el virus recombinante recuperado presentaba mutaciones específicas en su genoma, se extrajo ARN de los virus de tipo salvaje y aislados a partir de placas, y se utilizaron para análisis de PCR-RT utilizando cebadores flanqueantes de las mutaciones por sustitución. Se aisló ARN vírico a partir de aproximadamente 2 x 10^{7} unidades formadoras de placa (pfu) de los aislados nº 3, 5, 7 y 9 de virus purificado a partir de placa o de la cepa 47885/ de HPIV-3 wt. Se llevó a cabo la transcripción inversa utilizando la transcriptasa inversa Superscript II (BMB) a 44ºC durante 1 hora utilizando oligonucleótidos que cebaban en la base vírica nº 23 o nº 15.100. Se llevó a cabo PCR con polimerasa Expand Long (BMB) utilizando segundos cebadores que resultan en la amplificación de las bases víricas nº 23 a nº 303, o nº 15.100 a nº 15.440.
Los productos de PCR que comprendían las bases víricas nº 1 a nº 324 y nº 15.080 a nº 15.462 se generaron a partir de los aislados indicados, se digirieron con SacI y StuI, respectivamente, y se analizaron en un gel de agarosa al 1,4%. Se generaron productos de PCR de los tamaños esperados de una manera dependiente de RT, indicando que los productos de PCR se habían derivado de ARN y no de ADN de plásmido contaminante.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Tal como se muestra en el gel de agarosa, los tamaños de los productos de PCR 1 a 324 y 15.080 a 15.462 se incrementaron en 21 y 22 pares de bases, respectivamente, respecto a la longitud de las regiones específicas de virus debido a la inclusión de sitios de enzima de restricción en los cebadores de amplificación. La digestión con SacI mostró que la mutación en la base 94 no se encontraba presente en el virus de tipo salvaje aunque se encontraba presente en los virus aislados a partir de placa, indicando que eran de origen recombinante. De manera similar, el producto de PCR derivado de la región que comprendía la base vírica nº 15.389 del HPIV-3 de tipo salvaje no resultó cortado por StuI. Sin embargo, únicamente cuatro de los virus aislados de placa contenían la mutación que crea el sitio StuI. La secuenciación directa de los productos de PCR confirmó estos resultados.
Exposición
Se construyó un clon plásmido de longitud completa del genoma de HPIV-3, pHPIV-3. Tras la transfección de pHPIV-3 y plásmidos codificantes de las proteínas NP, P y L víricos en células HeLa infectadas por vTF7-3, se recuperó eficientemente HPIV-3 recombinante que portaba marcadores genéticos. Se observaron varios rasgos interesantes de este sistema. En primer lugar, la proteína NP vírica podía expresarse a partir del clon infeccioso, y esta expresión evitaba la necesidad de un plásmido de soporte de NP. Se cree que la proteína NP resulta sintetizada directamente por el transcrito antigenómico primario tras la adición de caperuza por el enzima de adición de caperuza del virus vaccinia.
En segundo lugar, se produjeron dos virus recombinantes con genotipos y fenotipos diferentes, probablemente debido a la recombinación entre los plásmidos pHPIV-3 y pPIV3-L, aunque no puede excluirse la posibilidad de que se produzca la reversión durante la replicación del ARN. pPIV3-L contiene el UTR 3' de L y parte de la región remolque, extendiéndose hasta la base nº 15.437, un solapamiento de 48 pares de bases más allá del sitio StuI. Esto representa espacio más que suficiente para que se produzca fácilmente la recombinación entre los plásmidos en células infectadas por el virus vaccinia.
A partir de dichos resultados, aparentemente se produce selección en el sistema HPIV-3. Todos los aislados de virus de placas grandes habían revertido a una secuencia de tipo salvaje en la base nº 15.389, aunque conservaban el cambio en la base nº 94. Debido a que A94G es la única alteración conocida en estos virus respecto al virus parental, aparentemente los aislados que conservaban ambas mutaciones presentaban un tamaño de placa idéntico al del virus parental (de tipo salvaje), aunque al perder las mutaciones de 15.389, se incrementaba el tamaño de placa, indicando que la mutación en la base nº 15.389 resultaba perjudicial en el contexto de la mutación A94G. Se identificó otro cambio conocido entre pHPIV-3 y los plásmidos de soporte. Existe un AUG no iniciador en el mensaje de la proteína L natural. Debido a que dicho AUG se encuentra a sólo 11 nucleótidos del extremo 5' del ARNm de L y en un contexto de inicio de traducción pobre, podría no causar mucha interferencia con la traducción del ARNm de L. Sin embargo, en el plásmido de soporte pPIV3-L, dicho AUG no iniciador se encuentra situado mucho más alejado del extremo 5' del transcrito, en el que resulta más probable que sea reconocido por los ribosomas. Dicho AUG fue eliminado de pPIV3-L mediante el cambio de las bases nº 8.636 y nº 8.637 de AT a TA, destruyendo un sitio SphI y creando un sitio NheI. Con el fin de investigar si este cambio se encontraba presente en el virus recombinante y podía ser responsable del fenotipo de placa grande, se realizó un análisis de PCR-RT. Los productos de PCR que comprendían dicho sitio y derivados de virus tanto de tipo salvaje como aislados de placa, conservaron una secuencia de tipo salvaje, indicando que no se había producido recombinación en esta región y que estos cambios no podían explicar ninguna variación de tamaño de placa.
El resultado de que pueda producirse recombinación entre plásmidos transfectados indica que debe tenerse cuidado al introducir mutaciones en los sistemas de clon infeccioso de paramixovirus o rabdovirus. Las mutaciones introducidas en las secuencias de NP, P o L preferentemente las llevan a cabo plásmidos de soporte y el clon infeccioso. De lo contrario, el virus resultante podría no llevar la mutación deseada. La única posible excepción a lo anterior es el sistema HPIV-3, en el que el clon infeccioso HPIV-3 expresa NP, evitando la necesidad del plásmido de de NP soporte. Sin embargo, resulta preferido que el plásmido de soporte de NP HPIV-3 se incluya en el sistema, debido a que obtuvieron rendimientos significativamente superiores de HPIV-3 al incluir en la transfección el plásmido de NP de soporte.
Un clon infeccioso de HPIV-3 resulta útil para entender la biología molecular de HPIV-3 y para desarrollar una vacuna para este importante patógeno. La capacidad de generar mutaciones específicas dentro de HPIV-3 permite estudiar todos los aspectos de la replicación de HPIV-3. Ahora puede examinarse con este sistema cualquier mutación, incluyendo las estudiadas anteriormente en otros contextos. La capacidad de introducir mutaciones específicas también permite la posibilidad de análisis de revertientes, que podría mejorar nuestra comprensión de las interacciones proteína-proteína o proteína-ARN.
El clon infeccioso también resulta útil para identificar mutaciones que atenúan el virus. Estos virus resultan útiles para desarrollar nuevas cepas de vacuna de HPIV-3. Además, pueden insertarse mutaciones presentes en una cepa candidata de vacuna actual de HPIV-3 en pHPIV-3. Mediante la identificación de múltiples mutaciones deletéreas probablemente resultará posible introducir varias mutaciones que afectan a diversas etapas del ciclo vital vírico en una sola cepa de HPIV-3. Este tipo de virus probablemente se encontraría altamente atenuado y no sería capaz de revertir con facilidad.
Aunque la invención se ha descrito hasta cierto grado de particularidad, pueden introducirse diversas adaptaciones y modificaciones sin apartarse del alcance de la invención según se define en las reivindicaciones adjuntas.
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\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: The Cleveland Clinic Foundation
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Clon infeccioso para el virus parainfluenza de tipo 3 humano
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DIRECCIÓN/DESTINATARIO Wyeth Laboratories
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Huntercombe Lane South
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Taplow, Maidenhead
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PAÍS: UK
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
CP: SL6 0PH
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
DATOS DE ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Walters, Philip B.W.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO/ETIQUETA: ACY-33557
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: +66 1628 413873
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FAX: +66 1628 799098
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15462 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAGTCGGCCC TAATACGACT CACTATAGGA CCAAACAAGA GAAGAAACT
\hfill
49
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAAATTATAG AGCTCCCTTT TCT
\hfill
23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 95 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TAAGGCCTAA AGATAGACAA AAACTAAGAA AAACATGTAA TATATATATA CCAAACAGAG
\hfill
60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGGGTACCT CCCTTAGCCA TCCGAGT
\hfill
27

Claims (22)

1. Clon recombinante de HPIV, que comprende:
a)
una secuencia de nucleótidos que codifica un antigenoma de sentido positivo del virus parainfluenza de tipo 3 humano (HPIV-3), y
b)
un promotor de ARN polimerasa ligado funcionalmente a dicha secuencia de nucleótidos.
2. Clon según la reivindicación 1, en el que dicho clon comprende además una secuencia de ribozima situada corriente abajo de dicha secuencia codificante de antigenoma.
3. Clon según la reivindicación 1, en el que el promotor de ARN polimerasa es el promotor de la ARN polimerasa de T7.
4. Clon según la reivindicación 2, en el que el ribozima es un ribozima antigenómico.
5. Clon según la reivindicación 2, que comprende además un terminador de ARN polimerasa situado corriente abajo de la secuencia de ribozima.
6. Clon según la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos codifica un antigenoma modificado de HPIV-3.
7. Clon según la reivindicación 6, en el que la secuencia codificante de antigenoma de HPIV-3 comprende una mutación seleccionada de entre el grupo constituido por una sustitución de uno o más nucleótidos, una deleción de 3 a 12 nucleótidos, y una adición de 3 a 12 nucleótidos.
8. Procedimiento para preparar un virus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, que comprende:
a)
proporcionar un sistema recombinante que comprende:
i)
un clon de HPIV que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un antigenoma de sentido positivo de virus parainfluenza de tipo 3 humano;
ii)
un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína L de virus parainfluenza de tipo 3 humano; y
iii)
un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína P de virus parainfluenza de tipo 3 humano;
en el que la secuencia de nucleótidos codificante de la proteína P y de la proteína L puede encontrarse en el mismo clon de soporte o en clones de soporte separados;
b)
introducir el sistema recombinante de la etapa (a) en las células huésped,
c)
cultivar las células huésped de la etapa (b) durante un tiempo suficiente para permitir la transfección de las células huésped y la formación del virus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, y
d)
recuperar el virus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante a partir del cultivo de las células huésped transfectadas.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que la secuencia codificante de antigenoma del clon de HPIV-3 se encuentra ligada funcionalmente a un promotor de ARN polimerasa,
en el que las secuencias codificantes de proteína P de los clones de soporte de P se encuentran ligadas funcionalmente a un promotor de ARN polimerasa,
en el que las secuencias codificantes de proteína L de los clones de soporte de L se encuentran ligadas funcionalmente a un promotor de ARN polimerasa, y
en el que las células huésped comprenden una ARN polimerasa correspondiente al promotor de ARN polimerasa de dicho clon de HPIV-3 y de dichos clones de soporte.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, el que las células huésped se infectan con un recombinante vírico capaz de expresar la ARN polimerasa previamente a o en combinación con la introducción del sistema recombinante en las células huésped.
11. Célula huésped para producir un virus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, comprendiendo dicha célula huésped:
a)
un clon HPIV-3 que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un antigenoma de sentido positivo de virus parainfluenza de tipo 3 humano;
b)
un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína L de virus parainfluenza de tipo 3 humano; y
c)
un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína P de virus parainfluenza de tipo 3 humano;
en la que la secuencia de nucleótidos codificante de la proteína P y de la proteína L puede encontrarse en el mismo clon de soporte o en clones de soporte separados.
12. Célula huésped según la reivindicación 11, que comprende además un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína NP de virus parainfluenza de tipo 3 humano.
13. Célula huésped para producir un virus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, comprendiendo dicha célula huésped:
a)
un clon HPIV que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un antigenoma de sentido positivo de virus parainfluenza de tipo 3 humano, en el que dicha secuencia de antigenoma comprende una mutación sitio-específica;
b)
un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína L de virus parainfluenza de tipo 3 humano; y
c)
un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína P de virus parainfluenza de tipo 3 humano;
en la que las secuencias de nucleótidos codificantes de la proteína P y de la proteína L se encuentran en el mismo clon de soporte o en clones de soporte separados.
14. Célula huésped según la reivindicación 12, en la que el clon HPIV-3 comprende además un promotor de ARN polimerasa ligado funcionalmente a la secuencia antigenómica de HPIV-3 y en la que cada uno de los clones de soporte comprende un promotor de ARN polimerasa ligado funcionalmente a la secuencia codificante de proteína de HPIV-3 de dicho soporte.
15. Procedimiento de introducción de una mutación sitio-específica en el genoma de un virus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, que comprende las etapas siguientes:
a)
preparar un clon que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antigenoma de virus parainfluenza de tipo 3 humano que presenta una mutación en un sitio específico;
b)
cotransfectar las células huésped con el clon de la etapa (a), un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína L de HPIV-3, y un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína P de HPIV-3;
en el que la secuencia de nucleótidos codificante de la proteína P y de la proteína L puede encontrarse en el mismo clon de soporte o en clones de soporte separados; y
c)
cultivar las células huésped transfectadas durante un tiempo suficiente para permitir la formación de un virus parainfluenza humano recombinante de tipo 3.
16. Procedimiento según la reivindicación 15, que comprende además la etapa que consiste en transfectar las células huésped con un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína NP de HPIV-3.
17. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el clon de la etapa (a) se prepara utilizando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa y un clon que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un antigenoma de virus parainfluenza de tipo 3 humano como molde, en el que la secuencia de nucleótidos codificante de anti-goma de dicho clon molde carece de la mutación sitio-específica.
18. Clon según la reivindicación 6, en el que la secuencia de antigenoma modificada presenta una o más mutaciones en un elemento que actúa en cis o en una región codificante de proteína.
\newpage
19. Clon según la reivindicación 6, en el que la mutación se encuentra en la región codificante de la proteína P o en la región codificante de la proteína L.
20. Célula huésped para producir un virus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, comprendiendo dicha célula huésped:
a)
un clon HPIV que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un antigenoma de sentido positivo de virus parainfluenza de tipo 3 humano, en el que dicha secuencia antigenoma comprende una mutación sitio-específica;
b)
un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína P de virus parainfluenza de tipo 3 humano; y
c)
un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína P de virus parainfluenza de tipo 3 humano;
en la que las secuencias de nucleótidos codificantes de la proteína P y de la proteína L se encuentran en el mismo clon de soporte o en clones de soporte separados; y
en la que la mutación se encuentra en la región codificante de proteína L de la secuencia codificante de antigenoma del clon HPIV, y en la que el clon de soporte que comprende la secuencia codificante de proteína L presenta una mutación correspondiente en la misma.
21. Célula huésped para producir un virus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, comprendiendo dicha célula huésped:
a)
un clon HPIV-3 que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un antigenoma de sentido positivo de virus parainfluenza de tipo 3 humano, en el que dicha secuencia de antigenoma comprende una mutación sitio-específica;
b)
un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína L de virus parainfluenza de tipo 3 humano; y
c)
un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína P de virus parainfluenza de tipo 3 humano;
en la que las secuencias de nucleótidos codificantes de la proteína P y de la proteína L se encuentran en el mismo clon de soporte o en clones de soporte separados; y
en la que la mutación se encuentra en la región codificante de la proteína P de la secuencia codificante de antigenoma del clon HPIV, y en la que el clon de soporte que comprende la secuencia codificante de la proteína P presenta una mutación correspondiente en la misma.
22. Célula huésped para producir un virus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, comprendiendo dicha célula huésped:
a)
un clon HPIV-3 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antigenoma de sentido positivo de virus parainfluenza de tipo 3 humano, en el que dicha secuencia de antigenoma comprende una mutación sitio-específica;
b)
un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína L de virus parainfluenza de tipo 3 humano;
c)
un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína P de virus parainfluenza de tipo 3 humano; y
d)
un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína NP de virus parainfluenza de tipo 3 humano;
en la que las secuencias de nucleótidos codificantes de las proteína P, proteína L y proteína NP se encuentran en el mismo clon de soporte o en clones de soporte separados, y
en la que la mutación se encuentra en la región codificante de proteína NP de la secuencia codificante de antigenoma del clon HPIV, y en la que el clon de soporte que comprende la secuencia codificante de proteína NP presenta una mutación correspondiente en la misma.
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