ES2289782T3 - Clon infeccioso para el virus parainfluenza de tipo 3 humano. - Google Patents
Clon infeccioso para el virus parainfluenza de tipo 3 humano. Download PDFInfo
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Abstract
Clon recombinante de HPIV, que comprende: a) una secuencia de nucleótidos que codifica un antigenoma de sentido positivo del virus parainfluenza de tipo 3 humano (HPIV-3), y b) un promotor de ARN polimerasa ligado funcionalmente a dicha secuencia de nucleótidos.
Description
Clon infeccioso para el virus parainfluenza de
tipo 3 humano.
El presente trabajo ha recibido el apoyo de la
subvención National Institutes of Health nº 32027 del Institute of
Allergy and Infectious Diseases. El gobierno podría poseer derechos
sobre la presente invención.
Los virus parainfluenza humanos (HPIV),
identificados como causa de infección respiratoria en el ser humano
desde 1956, se cree que suponen el 4 a 22 por ciento de las
enfermedades respiratorias en niños, sólo por detrás del virus
sincitial respiratorio en este aspecto. Los HPIV son causas
importantes de enfermedades del tracto respiratorio inferior tales
como neumonía y bronquiolitis, y son la causa más común de crup en
niños pequeños. De los cuatro serotipos de HPIV, el virus de tipo 3
(HPIV-3) aparentemente es el más virulento,
causando con frecuencia bronquiolitis y neumonía durante el primer
mes de vida.
Por desgracia, en la actualidad no se dispone de
vacunas o terapias antivíricas eficaces que puedan utilizarse para
prevenir o tratar las infecciones inducidas por HPIV. Los
procedimientos estándares que se utilizan para producir virus
inactivos, tales como la inactivación por calor o el tratamiento
químico de los virus, no han tenido éxito con todas las cepas y
serotipos de HPIV, incluyendo HPIV-3. Además, los
procedimientos estándares para producir virus atenuados producen
mutaciones en sitios aleatorios y no permiten modificar el genoma de
HPIV en sitios específicos o controlar el número de mutaciones que
se introducen en el genoma.
Los virus parainfluenza humanos son virus de ARN
monocatenario de sentido negativo con cubierta pertenecientes al
género paramixovirus dentro de la familia Paramyxoviridae. La
replicación del genoma del virus parainfluenza humano (ARNv) es
similar a la de otros elementos de la familia
Paramyxoviridae. Tras la infección de una célula, la
transcripción es el suceso principal de síntesis de ARN, resultando
en la producción de los ARNm víricos a partir del genoma de sentido
negativo, es decir, el ARNv. Posteriormente durante la infección, se
produce una transición a replicación del ARN, resultando en la
síntesis de un ARN de sentido positivo antigenómico de longitud
completa, que sirve como molde para la síntesis de ARN genómico de
sentido negativo adicional. La transcripción y replicación del ARN
genómico depende de la formación de un complejo de
ribonucleoproteína (RNP) que consiste del ARN genómico de 15.462
nucleótidos encapsidado por la proteína de nucleocápside (NP) y la
fosfoproteína (P) y proteína polimerasa (L) de gran tamaño. También
se encuentran implicados varios factores de la célula huésped en el
ciclo replicativo del HPIV.
El requisito para un RNP intacto para HPIV ha
dificultado el análisis de la transcripción y replicación del HPIV
en un sistema libre de células. Los esfuerzos para encapsidar el
ARNv del HPIV-3 in vitro han fracasado, y al
contrario que los virus ARN de sentido positivo, el ARNv del HPIV
desnudo no es infeccioso. Además, en la actualidad no se conocen
sistemas para preparar HPIV recombinantes, incluyendo
HPIV-3 infeccioso recombinante.
De acuerdo con lo expuesto anteriormente, existe
una necesidad de nuevos reactivos, sistemas y procedimientos que
permitan producir un HPIV recombinante, particularmente un
HPIV-3 infeccioso recombinante. Los sistemas
recombinantes que permiten la introducción de una o más mutaciones
sitio-específicas en el genoma del HPIV,
particularmente del HPIV-3, resultan deseables. Los
sistemas recombinantes que permiten caracterizar el efecto de
mutaciones sitio-específicas sobre la transcripción
o replicación de ARN de virus parainfluenza humano y para
identificar las mutaciones sitio-específicas que
conducen a la producción de HPIV atenuado resultan especialmente
deseables.
Según la presente invención, se proporciona un
sistema para generar virus parainfluenza humano de tipo 3
(HPIV-3) recombinante infeccioso. En una forma de
realización, el sistema comprende un clon que comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica un antigenoma de sentido
positivo y longitud completa de HPIV-3 y por lo
menos un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos
que codifica la proteína P de HPIV y la proteína L de HPIV. En otra
forma de realización, el sistema comprende además un clon de soporte
que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína
NP de HPIV. Preferentemente, cada uno de los clones en el sistema
comprende un promotor de ARN polimerasa que se encuentra ligado
funcionalmente a la secuencia de nucleótidos del HPIV respectivo
contenido dentro del clon.
Asimismo, la presente invención proporciona un
clon que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el
antigenoma de sentido positivo de longitud completa de
HPIV-3. El clon comprende asimismo un promotor de
ARN polimerasa funcionalmente ligado a la secuencia codificante de
antigenoma de HPIV-3. En una forma de realización
preferida, el clon comprende además una secuencia de nucleótidos que
codifica un ribozima inmediatamente cadena abajo de la secuencia
codificante del antigenoma de HPIV-3.
La presente invención se refiere asimismo a un
procedimiento de preparación de virus HPIV-3
recombinante que presenta mutaciones
sitio-específicas en el genoma de
HPIV-3. El procedimiento comprende preparar un clon
que comprende una secuencia modificada codificante de antigenoma de
HPIV-3, introducir el clon de HPIV-3
modificado y clones de soporte que comprenden secuencias de
nucleótidos codificantes de una proteína P de HPIV, una proteína L
de HPIV-3 y, preferentemente, una proteína NP de
HPIV-3 en células huésped, y cultivar las células
huésped bajo condiciones que permiten la síntesis del antigenoma
modificado de HPIV-3 y las proteínas L, P y NP de
HPIV-3.
La capacidad de producción del virus
HPIV-3 recombinante manipulados genéticamente para
contener mutaciones sitio-específicas dentro de
genes de HPIV-3 y elementos que actúan en cis
acelera el estudio de todos los aspectos del ciclo de replicación
del virus. Además, un sistema que permita la producción de HPIV
recombinante que se manipule genéticamente para que contenga
mutaciones sitio-específicas dentro del genoma de
HPIV-3 resulta útil para identificar genotipos de
parainfluenza atenuantes y para desarrollar una vacuna viva para el
virus parainfluenza humano.
La figura 1 ilustra la forma ADN de la secuencia
de nucleótidos del genoma de HPIV-3 y muestra la
localización de sitios de restricción, secuencia líder, secuencia
remolque y regiones codificantes de proteína del genoma.
La figura 2 es un mapa de restricción del vector
pOCUS-2^{TM}.
La figura 3 es un mapa de restricción de pMG(+)
que muestra la localización de la secuencia líder, la región
codificante de luciferasa y el promotor y terminador de T7.
La figura 4 es un mapa de restricción de
pHPIV-3 que muestra la localización de la secuencia
líder y las regiones codificantes de proteína de
HPIV-3.
La figura 5 es una descripción esquemática del
clon infeccioso de longitud completa pHPIV-3;
VV\Phi, señal de parada de polimerasa de virus vaccinia (TTTTTNT);
T7, promotor de la ARN polimerasa de T7; le, secuencia líder de
HPIV-3; NP, P, M, F, HN y L son las regiones
codificantes de la proteína de HPIV-3; tr, secuencia
remolque de HPIV-3; Rz, el ribozima antigenómico del
virus de la hepatitis delta; T7\Phi, señal de terminador de la ARN
polimerasa de T7. Las regiones que contienen mutaciones por
sustitución se han expandido y se muestran en la parte superior,
indicando los cambios específicos. El cambio de A por G en la base
94 vírica crea un sitio SacI y el cambio de A por G en la
base 15.389 vírica crea un sitio StuI.
Según la presente invención, se proporciona un
sistema para generar HPIV-3 recombinante. El sistema
comprende un clon que comprende una secuencia de nucleótidos,
preferentemente una secuencia de ADN bicatenario, que codifica un
antigenoma de sentido positivo de longitud completa de HPIV en
adelante denominado "clon de HPIV", y uno o más clones de
soporte que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una
proteína P de HPIV y una proteína L de HPIV. Las secuencias de
nucleótidos que codifican la proteína P de HPIV y la proteína L de
HPIV pueden encontrarse dentro del mismo clon. Sin embargo, para
facilitar la manipulación, resulta preferido que las secuencias de
nucleótidos que codifican la proteína P de HPIV y la proteína L de
HPIV se encuentren en clones separados. Preferentemente el clon de
HPIV comprende una secuencia codificante de un antigenoma de
HPIV-3. Preferentemente el clon o clones de soporte
codifican una proteína P y una proteína L de
HPIV-3. En otra forma de realización, el sistema
comprende además un clon de soporte que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína NP de HPIV, preferentemente la
proteína NP de HPIV-3.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "clon" se refiere a ADN bicatenario que puede
introducirse en una célula y expresarse. El clon puede encontrarse
en la forma de un vector vírico, tal como, por ejemplo, un vector
vírico vaccinia, o preferentemente, en la forma de un plásmido.
Preferentemente, el clon de HPIV y los clones de soporte comprenden
cada uno de ellos un promotor de ARN polimerasa, más preferentemente
un promotor de ARN polimerasa de T7. Cada uno de los promotores de
la ARN polimerasa se encuentra funcionalmente ligado a la secuencia
codificante de HPIV correspondiente en el clon. De esta manera, el
promotor de ARN polimerasa en el clon de HPIV se encuentra
funcionalmente ligado a la secuencia de HPIV y la ARN polimerasa en
los clones de soporte se encuentran funcionalmente ligadas a la
secuencia o secuencias codificantes de la proteína de HPIV
respectiva. Preferentemente, los plásmidos que comprenden el clon
también comprenden un origen de replicación, particularmente un
origen de replicación bacteriano.
La presente invención también proporciona un
clon que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la
secuencia antigenómica de HPIV-3, en adelante
denominada "clon de HPIV-3". Preferentemente,
el clon de HPIV-3 codifica una secuencia
antigenómica de longitud completa de HPIV-3. Tal
como se utiliza en la presente memoria, "de longitud completa"
se refiere a que la secuencia antigenómica es complementaria a la
totalidad de la secuencia genómica de sentido negativo de
HPIV-3 que se extiende desde el nucleótido 3' de la
secuencia líder hasta el nucleótido 5' de la secuencia remolque el
genoma de HPIV-3. La forma ADN de la secuencia
genómica de longitud completa de HPIV-3, SEC ID nº
1 se muestra en la fig. 1. Además de las secuencias líder y
remolque, el clon de HPIV-3 contiene secuencias
codificantes de las proteínas N, P, M, F, HN y L de
HPIV-3, así como los elementos que actúan en cis.
El clon de HPIV-3 puede codificar una secuencia
antigenoma de HPIV-3 de tipo salvaje o un
antigenoma de HPIV-3 modificado que presente una o
más mutaciones contenidas en el mismo. La mutación puede
encontrarse en la forma de un gen foráneo que se inserta en la
secuencia codificante del antigenoma de HPIV-3.
Preferentemente, las mutaciones son sustituciones de uno o más
nucleótidos, deleciones de 6 a 12 nucleótidos, o adiciones de 6 a
12 nucleótidos en la secuencia codificante de antigenoma de
HPIV-3. Más preferentemente, el clon de
HPIV-3 modificado contiene sustituciones en los
genes o en los elementos que actúan en cis, o en ambos, de la
secuencia codificante de antigenoma de HPIV-3.
Preferentemente, el clon de
HPIV-3 es un plásmido que comprende una secuencia de
nucleótidos que codifica un ribozima, más preferentemente el
ribozima antigenómico del virus de la hepatitis delta, situado
inmediatamente cadena abajo de la secuencia codificante del
antigenoma de HPIV. Tras la transcripción del gen, el ribozima
corta el ribozima del antigenoma de HPIV proporcionando un extremo
3' en el antigenoma de replicación competente. Más preferentemente,
el clon de HPIV-3 también comprende un terminador de
ARN polimerasa tras la secuencia del ribozima. En una forma de
realización, el clon de HPIV-3 es el plásmido
pHPIV-3 ilustrado en la fig. 5, que ha sido
depositado en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn
Drive, Rockwille, MD 20852, USA, mayo de 1998 y presenta un número
de acceso PTA-722.
Asimismo, la presente invención se refiere a un
procedimiento de preparación de HPIV recombinante, particularmente
HPIV-3, utilizando el sistema descrito
anteriormente. El procedimiento comprende introducir un clon de HPIV
y los clones de soporte que codifican la proteína P de HPIV y la
proteína L de HPIV, en células huésped, preferentemente células
humanas; cultivar las células huésped bajo condiciones que permiten
la formación de un transcrito antigenómico de HPIV, sintetizar el
genoma de HPIV (ARNv) y las proteínas L, P y NP de HPIV, y formación
de un HPIV recombinante; y recuperar el HPIV recombinante a partir
del cultivo. Preferentemente las células huésped que se transfectan
con el clon de HPIV y los clones de soporte, contienen una ARN
polimerasa que corresponde al promotor de la ARN polimerasa que se
encuentra funcionalmente ligado a las secuencias de HPIV en el clon
de HPIV y en los clones de soporte. En una forma de realización
preferida, un clon de soporte que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína NP de HPIV funcionalmente
ligada a un promotor de ARN polimerasa también se introduce en las
células. Preferentemente, las células huésped se infectan con un
recombinante vírico, preferentemente un virus vaccinia
recombinante, que expresa la ARN polimerasa, más preferentemente la
ARN polimerasa de T7, previamente o en combinación con la
transfección con el clon de HPIV y el clon o clones de soporte.
Cuando estas células se infectan con el virus vaccinia recombinante,
resulta preferido que el clon de HPIV-3 comprenda
también un terminador de ARN polimerasa de virus vaccinia cadena
arriba de la ARN polimerasa de T7 y un terminador de ARN polimerasa
de virus vaccinia cadena abajo del terminador de la ARN polimerasa
de T7.
Asimismo, la presente invención se refiere a un
procedimiento de introducción de mutaciones
sitio-específicas en el genoma de un
HPIV-3 recombinante. El procedimiento comprende
preparar un clon de HPIV-3 modificado que comprende
una o más mutaciones en la secuencia que codifica el antigenoma de
HPIV-3; introducir el clon de
HPIV-3 modificado y clones de soporte que comprenden
secuencias que codifican la proteína P de HPIV-3 y
la proteína L de HPIV-3, y preferentemente, la
proteína NP de HPIV-3 en células huésped; y cultivar
las células huésped bajo condiciones que permite la formación de un
transcrito antigenómico de HPIV-3 modificado y
sintetizar las proteína L, P y NP de HPIV-3. El
clon de HPIV-3 modificado y los clones de soporte
contienen un promotor de ARN polimerasa que se encuentra
funcionalmente ligado a las secuencias codificantes de la proteína
de HPIV-3. Las células huésped que contienen dentro
del citoplasma de las mismas una ARN polimerasa que corresponde al
promotor de ARN polimerasa en el clon de HPIV-3
modificado y en los clones de soporte.
Preferentemente, el clon de
HPIV-3 modificado, que contiene una o más mutaciones
en el mismo, se construye mediante técnicas de PCR convencionales
utilizando un clon de HPIV-3 como molde. Las
mutaciones se introducen en los elementos que actúan en cis de la
secuencia de HPIV-3 o en una secuencia codificante
de proteína de HPIV-3. Preferentemente la mutación
se introduce en la secuencia codificante de la proteína L. Si se
introducen mutaciones en las secuencias codificantes de la proteína
de HPIV-3 del clon de HPIV-3,
resulta preferido introducir un tipo similar de mutación en el
mismo sitio en la secuencia codificante de la proteína del clon de
soporte correspondiente. Por ejemplo, si se introduce una mutación
en un sitio específico en la secuencia codificante de la proteína L
del clon de HPIV-3, resulta preferido que se
introduzca la misma mutación en el mismo sitio en la secuencia
codificante de la proteína L del clon de soporte codificante de
proteína L. Este procedimiento resulta útil para identificar
mutaciones que bloquean la síntesis de partículas víricas o resultan
en la producción dHPIV-3 no infeccioso o no
virulento.
Con el fin de determinar si los virus mutados
producidos mediante el procedimiento indicado anteriormente son no
virulentos, es decir atenuados en primer lugar los virus mutados se
someten a ensayo in vitro para determinar si la mutación ha
resultado en un fenotipo de crecimiento más lento, es decir, el
virus mutado crece más lentamente en cultivo de tejidos que el
virus del tipo salvaje. Los virus mutados que muestran dicho
fenotipo se examinan a continuación in vivo mediante
inyección en un animal, tal como la rata algodonera, que es un buen
modelo experimental para el virus parainfluenza. A continuación, los
animales infectados se examinan para determinar si están
produciendo anticuerpos contra HPIV-3 y para
determinar si se produce una reducción de la severidad de los
síntomas en comparación con animales infectados por el virus de tipo
salvaje.
La capacidad de producir virus
HPIV-3 recombinante manipulado genéticamente para
que contenga alteraciones específicas dentro de los genes de
HPIV-3 y elementos que actúan en cis, acelera el
estudio de todos los aspectos del ciclo de replicación del virus.
Además, un sistema que permite la producción de HPIV recombinante
que se manipula genéticamente para que contenga alteraciones
específicas dentro de los genes de HPIV-3 resulta
útil para identificar genotipos de parainfluenza atenuantes y para
desarrollar una vacuna viva para el virus parainfluenza humano.
\newpage
Los ejemplos siguientes de procedimientos de
preparación de un clon de ADNc de longitud completa de
HPIV-3 y procedimientos de preparación de un
HPIV-3 recombinante infeccioso mutado se
proporcionan a título ilustrativo y no limitativo del alcance de la
invención.
La construcción de un clon infeccioso de
longitud completa de HPIV-3 que contiene mutaciones
en sitios específicos se consiguió mediante un procedimiento en dos
etapas. La etapa inicial fue la generación de un minirreplicón que
contenía la región de parte líder de sentido positivo y las regiones
remolque de HPIV-3. La segunda etapa implicó la
inserción de fragmentos de PCR-RT derivados de ARN
genómico de HPIV-3 en el minirreplicón. El
minirreplicón de sentido positivo contenía lo siguiente: un
promotor de T7 que dirigía la síntesis de dos residuos G no
víricos, seguido de la región líder de sentido positivo de
HPIV-3, una parte del UTR 5' de NP (hasta la base
vírica nº 97), el gen de luciferasa, una parte del UTR 3' de L
(partiendo de la base vírica nº 15.387) y las secuencias remolque
de HPIV-3. La secuencia de nucleótidos de longitud
completa del genoma de HPIV-3 y la localización de
la secuencia líder, secuencia remolque y regiones codificantes de
proteína se muestran en la figura 1. A continuación, el ribozima
antigenómico del virus de la hepatitis delta realizó un corte
preciso tras la base específica 3' terminal de
HPIV-3. También se incorporó un terminador de ARN
polimerasa de T7 en el replicón, seguido de la secuencia de
ribozima. Además, se insertaron señales de terminación de la
polimerasa del virus vaccinia inmediatamente cadena arriba y abajo
de las secuencias anteriormente indicadas. Durante la construcción,
se crearon cambios de una sola base en las regiones codificantes del
UTR 5' de NP y el UTR 3' de L. Un cambio de A por G en la base
vírica nº 94 y el cambio A por G en la base nº 15.389 crearon los
sitios SacI y StuI, respectivamente, que sirvieron como etiquetas
genéticas para identificar los virus de origen recombinante.
Se seleccionó el vector
pOCUS-2(Novagen) como el plásmido de partida
para preparar el minirreplicón [pPIV3-MG(+)] debido
a su tamaño reducido (1.930 pb). Se cree que la utilización de un
plásmido de partida de tamaño reducido podría incrementar la
estabilidad del clon de longitud completa.
Se construyó el minirreplicón generando
productos de PCR codificantes de las regiones líder y remolque
flanqueadas por un promotor de T7 y ribozima antigenómico de virus
de la hepatitis delta, respectivamente. Los cebadores utilizados
para la síntesis de la región de promotor/líder de T7 eran:
5'-TAGTCGGCCCTAATACGACTCACTATAGGACCAAACAAGAGAAGAAACT-3',
SEC ID nº 2, y
5'-GAAA
TTATAGAGCTCCCTTTTCT-3', SEC ID nº 3. El primer cebador codifica un sitio EagI y el promotor de T7 (subrayado), y el segundo cebador introdujo un cambio de A por G en la base vírica nº 94 (negrita) dentro de la región 5' no traducida (UTR) del ARNm de NP, que crea un sitio SacI. El molde para esta región, pHPIV3-CAT, se describe en: De, B.P. y A.K. Banerjee, 1993, Rescue of synthetic analogs of genome RNA of human parainfluenza virus type 3, Vir. 196:344-348. El producto de PCR resultante se clonó en los sitios EagI y SacI de pOCUS-2, que se ilustra en la figura 2. Los cebadores utilizados para la síntesis de la región de remolque/ribozima eran:
TTATAGAGCTCCCTTTTCT-3', SEC ID nº 3. El primer cebador codifica un sitio EagI y el promotor de T7 (subrayado), y el segundo cebador introdujo un cambio de A por G en la base vírica nº 94 (negrita) dentro de la región 5' no traducida (UTR) del ARNm de NP, que crea un sitio SacI. El molde para esta región, pHPIV3-CAT, se describe en: De, B.P. y A.K. Banerjee, 1993, Rescue of synthetic analogs of genome RNA of human parainfluenza virus type 3, Vir. 196:344-348. El producto de PCR resultante se clonó en los sitios EagI y SacI de pOCUS-2, que se ilustra en la figura 2. Los cebadores utilizados para la síntesis de la región de remolque/ribozima eran:
5'-TAAGGCCTAAAGATAGACAAAAAGTAAGAAAAACATGTAATATATATATACCAAACAGAGTTCTTCT
CTTGTTTGGTGGGTCGGCATGGCATCTC-3', SEC ID nº 4, y 5'-CTGGGTACCTCCCTTAGCCATCCGAGT-3', SEC ID nº 5. El primer cebador contiene secuencias desde UTR 3' del ARNm de L, hasta el remolque, y ceba la síntesis del ribozima (subrayado). Además, un cambio de A por G en la base vírica nº 15.389 (negrita), que crea un sitio StuI dentro de UTR 3' del ARNm de L, se encuentra codificado por este cebador. El segundo cebador codifica el extremo 3' del ribozima (subrayado) y un sitio BgIII. El molde para esta reacción de PCR era pSA1, un plásmido que contiene la secuencia de ribozima, tal como ha sido descrito anteriormente por Perrotta, A.T. y M.D. Been, 1991, The pseudoknot-like structure required for efficient self-cleavage of hepatitis delta virus RNA, Nature 350:434-436. El producto de PCR derivado de esta reacción se clonó en los sitios StuI y BgIII de pOCUS-2. Las regiones líder y remolque se combinaron en un solo clon mediante la transferencia del fragmento EagI/PstI del clon de T7/líder en los sitios PacI/PstI del clon de remolque/ribozima.
CTTGTTTGGTGGGTCGGCATGGCATCTC-3', SEC ID nº 4, y 5'-CTGGGTACCTCCCTTAGCCATCCGAGT-3', SEC ID nº 5. El primer cebador contiene secuencias desde UTR 3' del ARNm de L, hasta el remolque, y ceba la síntesis del ribozima (subrayado). Además, un cambio de A por G en la base vírica nº 15.389 (negrita), que crea un sitio StuI dentro de UTR 3' del ARNm de L, se encuentra codificado por este cebador. El segundo cebador codifica el extremo 3' del ribozima (subrayado) y un sitio BgIII. El molde para esta reacción de PCR era pSA1, un plásmido que contiene la secuencia de ribozima, tal como ha sido descrito anteriormente por Perrotta, A.T. y M.D. Been, 1991, The pseudoknot-like structure required for efficient self-cleavage of hepatitis delta virus RNA, Nature 350:434-436. El producto de PCR derivado de esta reacción se clonó en los sitios StuI y BgIII de pOCUS-2. Las regiones líder y remolque se combinaron en un solo clon mediante la transferencia del fragmento EagI/PstI del clon de T7/líder en los sitios PacI/PstI del clon de remolque/ribozima.
Con el fin de impedir posibles interferencias
por transcripción a partir de los promotores crípticos del virus
vaccinia, se insertaron señales de parada de transcripción de la
polimerasa del virus vaccinia (TTTTTNT) cadena arriba y abajo del
replicón próximo a los sitios PvuII y SspI dentro de
pOCUS-2. Se eliminó una señal de terminación de
transcripción de T7 de pET-17b mediante digestión
con BlpI y BspEI, y se insertaron en el sitio SspI (creación de
extremo romo con ADN polimerasa de T4) de pOCUS-2. A
continuación, se insertó un gen informador de luciferasa en los
sitios SacI y StuI para crear pPIV3-MG(+), que se
ilustra esquemáticamente en la figura 3.
Con el fin de generar el clon de
HPIV-3 de longitud completa, se generaron cinco
productos de PCR-RT a partir de ARN de virión
HPIV-3 y se clonaron. Estos fragmentos se insertaron
posteriormente en pPIV-3-MG(+),
sustituyendo las secuencias codificantes de luciferasa, creando
pHPIV-3, el clon de longitud completa. Se generaron
los cinco productos de PCR-RT a partir de ARN de
virión de la cepa 47885 de HPIV-3, que se obtuvo de
Robert Chanock en el National Institutes of Health. Estos productos
de PCR, que comprenden el resto del genoma de
HPIV-3, se identificaron mediante análisis de
enzimas de restricción y se clonaron, en pUC19 o
pOCUS-2, y después se insertaron en
pPIV3-MG(+).
El primer producto de PCR que contenía las bases
víricas nº 83 a nº 2.721 se insertó en el sitio SmaI de pUC19. A
continuación, el clon 83/2721 se digirió con SacI y XmnI, eliminando
las bases víricas nº 94 a nº 553, que se insertaron en SacI y SphI
(con extremo romo creado con ADN polimerasa de T4) de
pPIV3-MG(+). A continuación, se digirió el clon
83/2721 con PstI para eliminar un fragmento que contenía las bases
víricas nº 540 a nº 2.274, que se insertó a continuación en el
sitio PstI del clon pPIV3-MG(+) que contenía el
fragmento 94/554. El segundo producto de PCR que comprendía las
bases víricas nº 13.395 a nº 15.397 se clonó en el sitio SmaI de
pUC19. Este clon 13395/15397 se digirió a continuación con StuI y
PacI, y el fragmento resultante que contenía las bases víricas nº
13.632 a nº 15.381, se insertó en los sitios StuI y PacI del clon
pPIV3-MG(+) que contenía la secuencia vírica hasta
la base nº 2.274. El clon resultante contenía las bases víricas nº 1
a nº 2.274 y nº 13.632 a nº 15.462 en el contexto de
pPIV3-MG(+).
El tercer producto de PCR que contenía las bases
víricas nº 7.403 a nº 11.513 se digirió con BspMI (con extremo romo
creado con ADN polimerasa de T4) y XhoI para producir un fragmento
que contenía las bases nº 7.437 a nº 11.444 que se insertó en los
sitios XhoI y SspI de pOCUS-2. EL cuarto fragmento
de PCR que contenía las bases víricas nº 10.904 a nº 13.773 se
digirió con PvuII y BamHI (bases víricas nº 10.918 a nº 13.733) y
se insertó en EcoRI (con extremo romo creado con ADN polimerasa de
T4) y sitios BamHI de pUC19. Los dos segmentos víricos se
combinaron mediante la digestión del clon 7437/11444 con SacI (con
extremo romo creado con ADN polimerasa de T4) y EcoNI y se insertó
en el clon 10918/13733 digerido con EcoRI (con extremo romo creado
con ADN polimerasa de T4) y EcoNI. El clon resultante contenía las
bases víricas nº 7.437 a nº 13.733 en un esqueleto de pUC19. El
resto de la secuencia vírica se derivó a partir de un quinto
producto de PCR que comprendía las bases víricas nº 83 a nº 7.457
que había sido digerido con XmnI y XhoI (bases víricas nº 553 a nº
7.437) y se clonó en los sitios StuI y XhoI de
pOCUS-2. A continuación, el clon 7437/13733 se
digirió con BamHI, se crearon extremos romos con ADN polimerasa de
T4, y se digirió con XhoI para liberar un fragmento que se insertó
en EagI (con extremo romo creado con ADN polimerasa de T4) y clon
553/7.437 digerido con XhoI. El clon resultante contenía las bases
víricas nº 553 a nº 13.733. Este clon a continuación se digirió con
PshAI y PacI, y el fragmento resultante, que contenía las bases
víricas nº 2.143 a nº 13.632, se insertó en los mismos sitios del
clon pPIV3-MG(+) que contenía las bases víricas nº 1
a nº 2.274 y nº 13.632 a nº 15.462. Lo anterior generó
pHPIV-3, el clon infeccioso, que se ilustra
esquemáticamente en la figura 4.
Con el fin de insertar el gen de P en
pGEM-4, se transfirieron secuencias de P procedentes
de un clon de fusión de P-lac (descrito en 38, que
se incorpora a la presente memoria como referencia) mediante la
digestión con XbaI (creación de extremo romo con ADN polimerasa de
T4), BamHI y se insertaron en KpnI (creación de extremo romo con
ADN polimerasa de T4) y sitios BamHI de pGEM4. Los clones
pPIV3-NP y pPIV3-L, tal como se
describe en 15, 16, que se incorporan a la presente memoria como
referencia, se encontraban en un esqueleto de
pGEM-4. También se modificó el clon
pPIV3-L. En la secuencia natural de ARNm de L existe
un AUG no iniciador situado a 11 nucleótidos del extremo 5' del
transcrito. Éste se eliminó de pPIV3-L mediante PCR
mutacional, cambiando las bases víricas nº 8.636 y nº 8.637 de AT a
TA.
Se infectaron monocapas confluyentes de células
HeLa en placas de 6 pocillos con virus vaccinia recombinante
vTF7-3 a una multiplicidad de infección de 2.
vTF7-3 expresa la ARN polimerasa de T7 tal como se
describe en: Fuerst, T.R., P.L. Earl y B. Moss, 1987, Use of a
hybrid vaccinia virus-T7 RNA polymerase system for
expression of target genes, Mol. Cell Biol.
7:2538-2544, y Fuerst, T.R., E.G. Niles, F.W.
Studier y B. Moss, 1986, Eukaryotic
transient-expression system based on recombinant
vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase,
Proc. Natl. Acad. Sci. 83:8122-8126, que se
incorporan a la presente memoria como referencia. Tras 1 hora a
37ºC, se transfectaron pPIV3-NP,
pPIV3-P, pPIV3-L y
pHPIV-3 utilizando lipofectina (BRL) siguiendo las
instrucciones del fabricante. Tras tres horas, se separó el medio
de transfección y se sustituyó por 1,5 ml de medio de Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM)/suero de feto bovino al 5%. Tras 40 a
48 horas, se congelaron las placas, se descongelaron y se rasparon.
El sobrenadante del medio clarificado (250 \mul) se utilizó a
continuación para infectar monocapas de células HeLa frescas en
placas de 6 pocillos. Se añadió DMEM (1,5 ml) que contenía 25
\mug/ml de
1-B-D-arabinofuranosil-citosina
(araC) para inhibir la replicación del virus vaccinia tras una hora
de unión. Tras cuarenta horas, las placas se congelaron, se
descongelaron y se rasparon. A continuación, el sobrenadante del
medio clarificado se tituló para HPIV-3 en presencia
de AraC. Durante la titulación, se recogieron placas aisladas en
forma de tapones de agar. Los tapones de agar se introdujeron en 500
ml de opti-MEM a 4ºC durante 4 horas. Se utilizaron
a continuación 250 \mul para infectar monocapas de células HeLa
frescas para la amplificación durante 40 horas de las placas
aisladas.
En una forma de realización preferida, las
condiciones eran: 1 \mug de pHPIV-3, 2 \mug de
pPIV3-NP, 4 \mug de pPIV3-P y 0,1
\mug de pPIV3-L. Bajo estas condiciones, se
obtuvieron aproximadamente 1.000 pfu por cada 6 x 10^{5} células
durante la transfección inicial y 10^{6} pfu por cada 6 x 10^{5}
células tras la amplificación.
Al omitir plásmidos individuales de la etapa de
transfección, se observó que resultaban necesarios los plásmidos
pHPIV-3, pPIV3-P y
pPIV3-L para la recuperación de virus aunque,
inesperadamente, tal como se muestra en la Tabla 1 a continuación,
pPIV3-NP no lo era.
Plásmidos transfectados | ||||
HPIV-3 | NP | P | L | Recuperación de virus |
+ | + | + | + | 14/15ª |
- | + | + | + | 0/2 |
+ | - | + | + | 3/3^{b} |
+ | + | - | + | 0/3 |
+ | + | + | - | 0/2 |
Tabla 1. Recuperación de HPIV-3
a partir de pHPIV-3. Se infectaron monocapas de
células HeLa con vTF7-3 y se transfectaron con los
plásmidos indicados. Tras 40 horas, las células se lisaron y los
sobrenadantes se añadieron a monocapas de células HeLa frescas en
presencia de araC para inhibir la replicación de
vTF7-3. A continuación, estas monocapas se lisaron
y los sobrenadantes se sometieron a ensayo para
HPIV-3. El número de experimentos para el que se
recuperó HPIV-3 por intento se muestra en la columna
"Recuperación de virus".
^{A}El único experimento que no rindió
HPIV-3 hizo uso de 0,1 \mug del plásmido de P.
^{B}La omisión del plásmido de NP resultó en
títulos 3 a 5 veces inferiores de HPIV-3.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de caracterizar el virus recuperado y
purificar HPIV-3 a partir de vTF7-3,
las placas del cual sólo eran ligeramente más pequeñas que las de
HPIV-3, se recogieron placas aisladas que se
sospechaba que eran HPIV-3 y se amplificaron en
células HeLa. Los aislados de virus purificados y amplificados a
partir de placas y los controles apropiados se analizaron a
continuación en ensayos de neutralización. Se preincubaron virus
(aislados nº 3 y nº 5) (30 minutos en hielo) con 5 \mul de suero
preinmunológico de conejo, 5 \mul de antisuero
anti-HPIV-3 policlonal de conejo o
se sometieron a ensayo en presencia de 25 \mug/ml de araC. Los
sueros se incubaron con virus sobre hielo durante 30 minutos
previamente a un ensayo estándar de placas. Con el fin de permitir
el máximo desarrollo de placas, las placas se incubaron a
continuación a 37ºC durante 66 horas previamente a la tinción con
cristal violeta. Los resultados del ensayo indicaron que el virus
purificado a partir de placa resultaba completamente inhibido por
los antisueros anti-HPIV-3, mientras
que vTF7-3 no. Por el contrario, los aislados de
HPIV-3 no resultaron inhibidos por AraC, mientras
que el virus vTF7-3 resultó completamente inhibido.
Resulta interesante que de los ocho aislados recombinantes de
HPIV-3, cuatro presentaban tamaños de placa
idénticos al stock parental de HPIV-3, mientras que
cuatro eran ligeramente de mayor tamaño. El tamaño de placa del
aislado nº 3 era ligeramente mayor al del aislado nº 5 y al del
virus HPIV-3 de tipo salvaje.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Para determinar si la secuencia codificante de
NP de pHIPV3, que comparte la misma posición que la luciferasa en
pPIV3-MG(+), se estaba expresando desde
pHPIV-3, se transfectaron separadamente
pHPIV-3 y pPIV3-NP en células HeLa
infectadas por vTF7-3 y se prepararon listas
celulares tras 48 horas. A continuación, los lisados se analizaron
mediante transferencia western utilizando un antisuero
anti-HPIV-3RNP. Este antisuero
reconoce principalmente NP y reacciona pobremente con P.
Específicamente, se corrieron extractos
(equivalentes a 6 x 10^{4} células) en PAGE-SDS al
10% y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. El anticuerpo
primario era un antisuero anti-RNP policlonal de
conejo diluido 1:1.000. El anticuerpo secundario era una dilución
1:1.000 de un anticuerpo anticonejo de cabra conjugado con
peroxidasa de rábano picante. La visualización se realizó mediante
quimioluminiscencia (kit ECL, Amersham). Tal como se mostró
mediante transferencia western, RNP de HPIV-3
reconoció NP procedente de extractos celulares transfectados con
pPIV3-NP y pHPIV-3 y de RNP de
HPIV-3 purificado. No se identificaron proteínas en
un extracto HeLa transfectado con el plásmido vacío. De esta
manera, aparentemente NP es expresado por pHPIV-3,
traduciéndose presumiblemente a partir del transcrito de ARN
antigenómico dirigido por T7.
Para determinar si el virus recombinante
recuperado presentaba mutaciones específicas en su genoma, se
extrajo ARN de los virus de tipo salvaje y aislados a partir de
placas, y se utilizaron para análisis de PCR-RT
utilizando cebadores flanqueantes de las mutaciones por
sustitución. Se aisló ARN vírico a partir de aproximadamente 2 x
10^{7} unidades formadoras de placa (pfu) de los aislados nº 3, 5,
7 y 9 de virus purificado a partir de placa o de la cepa 47885/ de
HPIV-3 wt. Se llevó a cabo la transcripción inversa
utilizando la transcriptasa inversa Superscript II (BMB) a 44ºC
durante 1 hora utilizando oligonucleótidos que cebaban en la base
vírica nº 23 o nº 15.100. Se llevó a cabo PCR con polimerasa Expand
Long (BMB) utilizando segundos cebadores que resultan en la
amplificación de las bases víricas nº 23 a nº 303, o nº 15.100 a nº
15.440.
Los productos de PCR que comprendían las bases
víricas nº 1 a nº 324 y nº 15.080 a nº 15.462 se generaron a partir
de los aislados indicados, se digirieron con SacI y StuI,
respectivamente, y se analizaron en un gel de agarosa al 1,4%. Se
generaron productos de PCR de los tamaños esperados de una manera
dependiente de RT, indicando que los productos de PCR se habían
derivado de ARN y no de ADN de plásmido contaminante.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Tal como se muestra en el gel de agarosa, los
tamaños de los productos de PCR 1 a 324 y 15.080 a 15.462 se
incrementaron en 21 y 22 pares de bases, respectivamente, respecto a
la longitud de las regiones específicas de virus debido a la
inclusión de sitios de enzima de restricción en los cebadores de
amplificación. La digestión con SacI mostró que la mutación en la
base 94 no se encontraba presente en el virus de tipo salvaje aunque
se encontraba presente en los virus aislados a partir de placa,
indicando que eran de origen recombinante. De manera similar, el
producto de PCR derivado de la región que comprendía la base vírica
nº 15.389 del HPIV-3 de tipo salvaje no resultó
cortado por StuI. Sin embargo, únicamente cuatro de los virus
aislados de placa contenían la mutación que crea el sitio StuI. La
secuenciación directa de los productos de PCR confirmó estos
resultados.
Se construyó un clon plásmido de longitud
completa del genoma de HPIV-3,
pHPIV-3. Tras la transfección de
pHPIV-3 y plásmidos codificantes de las proteínas
NP, P y L víricos en células HeLa infectadas por
vTF7-3, se recuperó eficientemente
HPIV-3 recombinante que portaba marcadores
genéticos. Se observaron varios rasgos interesantes de este
sistema. En primer lugar, la proteína NP vírica podía expresarse a
partir del clon infeccioso, y esta expresión evitaba la necesidad
de un plásmido de soporte de NP. Se cree que la proteína NP resulta
sintetizada directamente por el transcrito antigenómico primario
tras la adición de caperuza por el enzima de adición de caperuza del
virus vaccinia.
En segundo lugar, se produjeron dos virus
recombinantes con genotipos y fenotipos diferentes, probablemente
debido a la recombinación entre los plásmidos
pHPIV-3 y pPIV3-L, aunque no puede
excluirse la posibilidad de que se produzca la reversión durante la
replicación del ARN. pPIV3-L contiene el UTR 3' de L
y parte de la región remolque, extendiéndose hasta la base nº
15.437, un solapamiento de 48 pares de bases más allá del sitio
StuI. Esto representa espacio más que suficiente para que se
produzca fácilmente la recombinación entre los plásmidos en células
infectadas por el virus vaccinia.
A partir de dichos resultados, aparentemente se
produce selección en el sistema HPIV-3. Todos los
aislados de virus de placas grandes habían revertido a una
secuencia de tipo salvaje en la base nº 15.389, aunque conservaban
el cambio en la base nº 94. Debido a que A94G es la única alteración
conocida en estos virus respecto al virus parental, aparentemente
los aislados que conservaban ambas mutaciones presentaban un tamaño
de placa idéntico al del virus parental (de tipo salvaje), aunque
al perder las mutaciones de 15.389, se incrementaba el tamaño de
placa, indicando que la mutación en la base nº 15.389 resultaba
perjudicial en el contexto de la mutación A94G. Se identificó otro
cambio conocido entre pHPIV-3 y los plásmidos de
soporte. Existe un AUG no iniciador en el mensaje de la proteína L
natural. Debido a que dicho AUG se encuentra a sólo 11 nucleótidos
del extremo 5' del ARNm de L y en un contexto de inicio de
traducción pobre, podría no causar mucha interferencia con la
traducción del ARNm de L. Sin embargo, en el plásmido de soporte
pPIV3-L, dicho AUG no iniciador se encuentra
situado mucho más alejado del extremo 5' del transcrito, en el que
resulta más probable que sea reconocido por los ribosomas. Dicho
AUG fue eliminado de pPIV3-L mediante el cambio de
las bases nº 8.636 y nº 8.637 de AT a TA, destruyendo un sitio SphI
y creando un sitio NheI. Con el fin de investigar si este cambio se
encontraba presente en el virus recombinante y podía ser responsable
del fenotipo de placa grande, se realizó un análisis de
PCR-RT. Los productos de PCR que comprendían dicho
sitio y derivados de virus tanto de tipo salvaje como aislados de
placa, conservaron una secuencia de tipo salvaje, indicando que no
se había producido recombinación en esta región y que estos cambios
no podían explicar ninguna variación de tamaño de placa.
El resultado de que pueda producirse
recombinación entre plásmidos transfectados indica que debe tenerse
cuidado al introducir mutaciones en los sistemas de clon infeccioso
de paramixovirus o rabdovirus. Las mutaciones introducidas en las
secuencias de NP, P o L preferentemente las llevan a cabo plásmidos
de soporte y el clon infeccioso. De lo contrario, el virus
resultante podría no llevar la mutación deseada. La única posible
excepción a lo anterior es el sistema HPIV-3, en el
que el clon infeccioso HPIV-3 expresa NP, evitando
la necesidad del plásmido de de NP soporte. Sin embargo, resulta
preferido que el plásmido de soporte de NP HPIV-3 se
incluya en el sistema, debido a que obtuvieron rendimientos
significativamente superiores de HPIV-3 al incluir
en la transfección el plásmido de NP de soporte.
Un clon infeccioso de HPIV-3
resulta útil para entender la biología molecular de
HPIV-3 y para desarrollar una vacuna para este
importante patógeno. La capacidad de generar mutaciones específicas
dentro de HPIV-3 permite estudiar todos los
aspectos de la replicación de HPIV-3. Ahora puede
examinarse con este sistema cualquier mutación, incluyendo las
estudiadas anteriormente en otros contextos. La capacidad de
introducir mutaciones específicas también permite la posibilidad de
análisis de revertientes, que podría mejorar nuestra comprensión de
las interacciones proteína-proteína o
proteína-ARN.
El clon infeccioso también resulta útil para
identificar mutaciones que atenúan el virus. Estos virus resultan
útiles para desarrollar nuevas cepas de vacuna de
HPIV-3. Además, pueden insertarse mutaciones
presentes en una cepa candidata de vacuna actual de
HPIV-3 en pHPIV-3. Mediante la
identificación de múltiples mutaciones deletéreas probablemente
resultará posible introducir varias mutaciones que afectan a
diversas etapas del ciclo vital vírico en una sola cepa de
HPIV-3. Este tipo de virus probablemente se
encontraría altamente atenuado y no sería capaz de revertir con
facilidad.
Aunque la invención se ha descrito hasta cierto
grado de particularidad, pueden introducirse diversas adaptaciones y
modificaciones sin apartarse del alcance de la invención según se
define en las reivindicaciones adjuntas.
\global\parskip0.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: The Cleveland Clinic Foundation
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Clon infeccioso para el virus parainfluenza de tipo 3 humano
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN/DESTINATARIO Wyeth Laboratories
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Huntercombe Lane South
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Taplow, Maidenhead
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: UK
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CP: SL6 0PH
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- DATOS DE ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Walters, Philip B.W.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO/ETIQUETA: ACY-33557
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: +66 1628 413873
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: +66 1628 799098
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15462 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 1
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAGTCGGCCC TAATACGACT CACTATAGGA CCAAACAAGA GAAGAAACT
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAATTATAG AGCTCCCTTT TCT
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 95 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAAGGCCTAA AGATAGACAA AAACTAAGAA AAACATGTAA TATATATATA CCAAACAGAG
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGGGTACCT CCCTTAGCCA TCCGAGT
\hfill27
Claims (22)
1. Clon recombinante de HPIV, que comprende:
- a)
- una secuencia de nucleótidos que codifica un antigenoma de sentido positivo del virus parainfluenza de tipo 3 humano (HPIV-3), y
- b)
- un promotor de ARN polimerasa ligado funcionalmente a dicha secuencia de nucleótidos.
2. Clon según la reivindicación 1, en el que
dicho clon comprende además una secuencia de ribozima situada
corriente abajo de dicha secuencia codificante de antigenoma.
3. Clon según la reivindicación 1, en el que el
promotor de ARN polimerasa es el promotor de la ARN polimerasa de
T7.
4. Clon según la reivindicación 2, en el que el
ribozima es un ribozima antigenómico.
5. Clon según la reivindicación 2, que comprende
además un terminador de ARN polimerasa situado corriente abajo de la
secuencia de ribozima.
6. Clon según la reivindicación 1, en el que la
secuencia de nucleótidos codifica un antigenoma modificado de
HPIV-3.
7. Clon según la reivindicación 6, en el que la
secuencia codificante de antigenoma de HPIV-3
comprende una mutación seleccionada de entre el grupo constituido
por una sustitución de uno o más nucleótidos, una deleción de 3 a 12
nucleótidos, y una adición de 3 a 12 nucleótidos.
8. Procedimiento para preparar un virus
parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, que comprende:
- a)
- proporcionar un sistema recombinante que comprende:
- i)
- un clon de HPIV que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un antigenoma de sentido positivo de virus parainfluenza de tipo 3 humano;
- ii)
- un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína L de virus parainfluenza de tipo 3 humano; y
- iii)
- un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína P de virus parainfluenza de tipo 3 humano;
en el que la secuencia de nucleótidos
codificante de la proteína P y de la proteína L puede encontrarse en
el mismo clon de soporte o en clones de soporte separados;
- b)
- introducir el sistema recombinante de la etapa (a) en las células huésped,
- c)
- cultivar las células huésped de la etapa (b) durante un tiempo suficiente para permitir la transfección de las células huésped y la formación del virus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, y
- d)
- recuperar el virus parainfluenza de tipo 3 humano recombinante a partir del cultivo de las células huésped transfectadas.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que la secuencia codificante de antigenoma del clon de
HPIV-3 se encuentra ligada funcionalmente a un
promotor de ARN polimerasa,
en el que las secuencias codificantes de
proteína P de los clones de soporte de P se encuentran ligadas
funcionalmente a un promotor de ARN polimerasa,
en el que las secuencias codificantes de
proteína L de los clones de soporte de L se encuentran ligadas
funcionalmente a un promotor de ARN polimerasa, y
en el que las células huésped comprenden una ARN
polimerasa correspondiente al promotor de ARN polimerasa de dicho
clon de HPIV-3 y de dichos clones de soporte.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, el
que las células huésped se infectan con un recombinante vírico capaz
de expresar la ARN polimerasa previamente a o en combinación con la
introducción del sistema recombinante en las células huésped.
11. Célula huésped para producir un virus
parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, comprendiendo dicha
célula huésped:
- a)
- un clon HPIV-3 que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un antigenoma de sentido positivo de virus parainfluenza de tipo 3 humano;
- b)
- un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína L de virus parainfluenza de tipo 3 humano; y
- c)
- un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína P de virus parainfluenza de tipo 3 humano;
en la que la secuencia de nucleótidos
codificante de la proteína P y de la proteína L puede encontrarse en
el mismo clon de soporte o en clones de soporte separados.
12. Célula huésped según la reivindicación 11,
que comprende además un clon de soporte que comprende una secuencia
de nucleótidos codificante de una proteína NP de virus parainfluenza
de tipo 3 humano.
13. Célula huésped para producir un virus
parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, comprendiendo dicha
célula huésped:
- a)
- un clon HPIV que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un antigenoma de sentido positivo de virus parainfluenza de tipo 3 humano, en el que dicha secuencia de antigenoma comprende una mutación sitio-específica;
- b)
- un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína L de virus parainfluenza de tipo 3 humano; y
- c)
- un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína P de virus parainfluenza de tipo 3 humano;
en la que las secuencias de nucleótidos
codificantes de la proteína P y de la proteína L se encuentran en el
mismo clon de soporte o en clones de soporte separados.
14. Célula huésped según la reivindicación 12,
en la que el clon HPIV-3 comprende además un
promotor de ARN polimerasa ligado funcionalmente a la secuencia
antigenómica de HPIV-3 y en la que cada uno de los
clones de soporte comprende un promotor de ARN polimerasa ligado
funcionalmente a la secuencia codificante de proteína de
HPIV-3 de dicho soporte.
15. Procedimiento de introducción de una
mutación sitio-específica en el genoma de un virus
parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, que comprende las
etapas siguientes:
- a)
- preparar un clon que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antigenoma de virus parainfluenza de tipo 3 humano que presenta una mutación en un sitio específico;
- b)
- cotransfectar las células huésped con el clon de la etapa (a), un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína L de HPIV-3, y un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína P de HPIV-3;
en el que la secuencia de nucleótidos
codificante de la proteína P y de la proteína L puede encontrarse en
el mismo clon de soporte o en clones de soporte separados; y
- c)
- cultivar las células huésped transfectadas durante un tiempo suficiente para permitir la formación de un virus parainfluenza humano recombinante de tipo 3.
16. Procedimiento según la reivindicación 15,
que comprende además la etapa que consiste en transfectar las
células huésped con un clon de soporte que comprende una secuencia
de nucleótidos codificante de una proteína NP de
HPIV-3.
17. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que el clon de la etapa (a) se prepara utilizando técnicas de
reacción en cadena de la polimerasa y un clon que comprende una
secuencia de nucleótidos codificante de un antigenoma de virus
parainfluenza de tipo 3 humano como molde, en el que la secuencia de
nucleótidos codificante de anti-goma de dicho clon
molde carece de la mutación sitio-específica.
18. Clon según la reivindicación 6, en el que la
secuencia de antigenoma modificada presenta una o más mutaciones en
un elemento que actúa en cis o en una región codificante de
proteína.
\newpage
19. Clon según la reivindicación 6, en el que la
mutación se encuentra en la región codificante de la proteína P o en
la región codificante de la proteína L.
20. Célula huésped para producir un virus
parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, comprendiendo dicha
célula huésped:
- a)
- un clon HPIV que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un antigenoma de sentido positivo de virus parainfluenza de tipo 3 humano, en el que dicha secuencia antigenoma comprende una mutación sitio-específica;
- b)
- un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína P de virus parainfluenza de tipo 3 humano; y
- c)
- un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína P de virus parainfluenza de tipo 3 humano;
en la que las secuencias de nucleótidos
codificantes de la proteína P y de la proteína L se encuentran en el
mismo clon de soporte o en clones de soporte separados; y
en la que la mutación se encuentra en la región
codificante de proteína L de la secuencia codificante de antigenoma
del clon HPIV, y en la que el clon de soporte que comprende la
secuencia codificante de proteína L presenta una mutación
correspondiente en la misma.
21. Célula huésped para producir un virus
parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, comprendiendo dicha
célula huésped:
- a)
- un clon HPIV-3 que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un antigenoma de sentido positivo de virus parainfluenza de tipo 3 humano, en el que dicha secuencia de antigenoma comprende una mutación sitio-específica;
- b)
- un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína L de virus parainfluenza de tipo 3 humano; y
- c)
- un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína P de virus parainfluenza de tipo 3 humano;
en la que las secuencias de nucleótidos
codificantes de la proteína P y de la proteína L se encuentran en el
mismo clon de soporte o en clones de soporte separados; y
en la que la mutación se encuentra en la región
codificante de la proteína P de la secuencia codificante de
antigenoma del clon HPIV, y en la que el clon de soporte que
comprende la secuencia codificante de la proteína P presenta una
mutación correspondiente en la misma.
22. Célula huésped para producir un virus
parainfluenza de tipo 3 humano recombinante, comprendiendo dicha
célula huésped:
- a)
- un clon HPIV-3 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un antigenoma de sentido positivo de virus parainfluenza de tipo 3 humano, en el que dicha secuencia de antigenoma comprende una mutación sitio-específica;
- b)
- un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína L de virus parainfluenza de tipo 3 humano;
- c)
- un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína P de virus parainfluenza de tipo 3 humano; y
- d)
- un clon de soporte que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de una proteína NP de virus parainfluenza de tipo 3 humano;
en la que las secuencias de nucleótidos
codificantes de las proteína P, proteína L y proteína NP se
encuentran en el mismo clon de soporte o en clones de soporte
separados, y
en la que la mutación se encuentra en la región
codificante de proteína NP de la secuencia codificante de antigenoma
del clon HPIV, y en la que el clon de soporte que comprende la
secuencia codificante de proteína NP presenta una mutación
correspondiente en la misma.
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