DE69838097T2

DE69838097T2 - Infektiöser klon für menschlichen parainfluenzavirus-typ

Info

Publication number: DE69838097T2
Application number: DE69838097T
Authority: DE
Inventors: Amiya K. Moreland Hills BANERJEE; Michael A. Shaker Heights HOFFMAN
Original assignee: Cleveland Clinic Foundation
Current assignee: Cleveland Clinic Foundation
Priority date: 1997-05-07
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2008-04-10
Anticipated expiration: 2018-05-07
Also published as: DK0981537T3; US6248578B1; WO1998050405A1; EP0981537B1; PT981537E; CY1107730T1; BR9809240A; AU7473198A; ES2289782T3; CA2289776C; CN1208340C; CN1255140A; KR100585946B1; JP2002512519A; DE69838097D1; EP0981537A1; KR20060014461A; HK1025973A1; KR20010012294A; AU736586B2

Description

Diese Arbeit wurde zum Teil durch die von den National Institutes of Health erteilte Genehmigung Nr. 32027 des Institute of Allergy and Infectious Diseases [Instituts für Allergie und Infektionskrankheiten] unterstützt. Die Regierung kann Rechte an dieser Erfindung geltend machen.
HINTERGRUND
Man nimmt an, dass die im Jahr 1956 als eine Ursache der Atemwegsinfektion beim Menschen erkannten humanen Parainfluenza-Viren (HPIV) 4 bis 22 Prozent der Atemwegserkrankungen bei Kindern erklären, betrachtet man diesbezüglich allein das RS-Virus. Die HPIV sind bedeutende Erreger von Krankheiten der unteren Atemwege wie der Pneumonie und Bronchiolitis und stellen die häufigste Ursache des Krupphustens bei Kleinkindern dar. Von den vier HPIV-Serotypen 1 bis 4 erweist sich das Typ-3-Virus (HPIV-3) als das virulenteste, das häufig zu Bronchiolitis und Pneumonie während des ersten Lebensmonats führt.
Unglücklicherweise stehen effektive Impfstoffe oder antivirale Therapien, die zur Verhütung oder Behandlung von HPIV-induzierten Infektionen eingesetzt werden können, gegenwärtig nicht zur Verfügung. Standardmethoden, die angewandt werden, um inaktive Viren zu produzieren, wie die Inaktivierung durch Hitze oder chemische Behandlung des Virus, scheiterten bisher bei allen HPIV- Stämmen und Serotypen, einschließlich des HPIV-3. Zudem erzeugen Standardmethoden zur Herstellung attenuierter Viren Mutationen an beliebigen Stellen und ermöglichen es nicht, das HPIV-Genom an spezifischen Stellen zu modifizieren oder die in das Genom eingeführte Anzahl der Mutationen zu kontrollieren.
Humane Parainfluenza Viren sind umhüllte, einzelsträngige, negativ orientierte RNA-Viren, die Mitglieder der Paramyxovirus-Gattung innerhalb der Familie der Paramyxoviridae sind. Die Replikation des humanen Parainfluenzaviralen Genoms (vRNA) ähnelt derjenigen anderer Mitglieder der Paramyxoviridae-Familie. Nach Infektion einer Zelle ist die Transkription das Hauptereignis der RNA-Synthese, das zur Produktion viraler mRNAs aus dem negativ orientierten Genom, d. h. dem vRNA, führt. Zu einem späteren Zeitpunkt der Infektion kommt es zu einem Übergang zur RNA-Replikation, die zur Synthese der vollständigen, antigenomischen, positiv orientierten RNA führt, die als Matrize für die Synthese zusätzlicher negativ orientierter, genomischer RNA dient. Die Transkription und Replikation der genomischen RNA sind abhängig von der Bildung eines Ribonucleoprotein-Komplexes (RNP), der aus der genomischen RNA des 15462 Nucleotids besteht, die durch das Nucleocapsidprotein (NP) und das damit eng verbundene Phosphoprotein (P) und das große (L) Polymeraseprotein umhüllt ist. Auch sind mehrere Wirtszellenfaktoren im Replikationszyklus des HPIV involviert.
Das Erfordernis eines intakten RNP für das HPIV verhindert die Analyse der HPIV-Transkription und -Replikation in einem zellfreien System. Bemühungen, das HPIV-3-vRNA in vitro zu umhüllen, scheiterten, und im Unterschied zu den positiv orientierten RNA-Viren sind nackte HPIV-vRNA nicht infektiös. Darüber hinaus gibt es gegenwärtig keine bekannten Systeme zur Herstellung des rekombinanten HPIV, einschließlich des rekombinanten infektiösen HPIV-3.
Dementsprechend besteht ein Bedarf an neuen Reagenzien, Systemen und Methoden, die es ermöglichen, ein rekombinantes HPIV, insbesondere ein rekombinantes, infektiöses HPIV-3 zu produzieren. Rekombinante Systeme, die es ermöglichen, eine stellenspezifische Mutation oder mehrere stellenspezifische Mutationen in das Genom des HPIV, insbesondere des HPIV-3, einzuführen, sind wünschenswert. Rekombinante Systeme, die es ermöglichen, die Wirkung stellenspezifischer Mutationen auf die Transkription oder Replikation der humanen Parainfluenza-viralen RNA zu charakterisieren und die stellenspezifischen Mutationen, die zur Produktion des attenuierten HPIV führen, zu identifizieren, sind besonders wünschenswert.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG.
Gemäß der Erfindung wird ein System zur Generierung eines infektiösen, rekombinanten humanen Parainfluenza-Virus-Typ-3 (HPIV-3) vorgeschlagen. Bei einer Ausführung umfasst das System einen Klon, der eine Nucleotidsequenz, die ein vollständiges, positiv orientiertes Antigenom des HPIV-3 kodiert, und wenigstens einen Trägerklon umfasst, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die das HPIV-P-Protein und das HPIV-L-Protein kodiert. Bei einer anderen Ausführung umfasst das System ferner einen Trägerklon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die das HPIV-NP-Protein kodiert. Vorzugsweise umfasst ein jeder der Klone in dem System einen RNA-Polymerasepromoter, der an die im Klon enthaltene entsprechende HPIV-Nucleotidsequenz operativ gebunden ist.
Vorliegende Erfindung schlägt auch einen Klon vor, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die das vollständige, positiv orientierte Antigenom des HPIV-3 kodiert. Der Klon umfasst auch einen RNA-Polymerasepromoter, der an die das HPIV-3 Antigenom kodierende Sequenz operativ gebunden ist. Bei einer bevorzugten Ausführung umfasst der Klon ferner eine Nucleotidsequenz, die ein Ribozym unmittelbar stromabwärts von der das HPIV-3 Antigenom kodierenden Sequenz kodiert.
Vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten HPIV-3-Virus, das stellenspezifische Mutationen im HPIV-3-Genom aufweist. Das Verfahren umfasst folgende Schritte: Herstellung eines Klons, der eine ein modifiziertes HPIV-3-Antigenom kodierende Sequenz umfasst, Einführung des modifizierten HPIV-3-Klons und von Trägerklonen, die Nucleotidsequenzen umfassen, die ein HPIV-3-P-Protein, ein HPIV-3-L-Protein und vorzugsweise ein HPIV-3-NP-Protein kodieren, in Wirtszellen und Züchtung der Wirtszellen unter Bedingungen, die die Synthese des modifizierten HPIV-3- Antigenoms und der L-, P- und NP-Proteine des HPIV-3 ermöglichen.
Die Fähigkeit, ein rekombinantes HPIV-3-Virus zu produzieren, das gentechnisch derart konstruiert ist, dass es stellenspezifische Mutationen innerhalb der HPIV-3-Gene und cis-wirkende Elemente enthält, treibt das Studium sämtlicher Aspekte des Virusreplikationszyklus voran. Außerdem ist ein System, das die Produktion eines rekombinanten HPIV ermöglicht, das gentechnisch so konstruiert ist, dass es stellenspezifische Mutationen innerhalb des HPIV-3-Genoms enthält, brauchbar für die Identifikation attenuierter Parainfluenza-Genotypen und für die Entwicklung eines lebenden Impfstoffs für das humane Parainfluenza-Virus.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 stellt die DNA-Form für die Nucleotidsequenz des HPIV-3-Genoms dar und zeigt die Lokalisierung der Restriktionsstellen, der Leader-Sequenz, der Trailer-Sequenz und der proteinkodierenden Regionen des Genoms.
2 ist eine Restriktionskarte des pOCUS-2^TM Vektors.
3 ist eine Restriktionskarte des pMG(+), die die Lokalisierung der Leader-Sequenz, der luziferasekodierenden Region und des T7 Promoters und Terminators zeigt.
4 ist eine Restriktionskarte des pHPIV-3, die die Lokalisierung der Leader-Sequenz und der proteinkodierenden Regionen des HPIV-3 zeigt.
5 ist eine schematische Darstellung des vollständigen infektiösen Klons, des pHPIV-3. VVΦ, Vaccinia-Virus-Polymerase-Stopsignal (TTTTTNT), T7, T7 RNA-Polymerasepromoter, Ie, HPIV-3-Leadersequenz, NP, P, M, F, HN und L sind die HPIV-3-Protein kodierenden Regionen; tr, HPIV-3 die Trailersequenz; Rz das Hepatitis-Delta-Virus antigenomische Ribozym; T7Φ, T7 das RNA-Polymeraseterminatorsignal. Regionen, die Substitutionsmutationen enthalten, sind erweitert und oben mit den angegebenen spezifischen Änderungen angezeigt. Die Änderung von A nach G an der viralen Base 94 kreiert eine SacI-Stelle und die Änderung von A nach G an der viralen Base 15389 kreiert eine StuI-Stelle.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß vorliegender Erfindung wird ein System zur Erzeugung eines rekombinanten HPIV-3 vorgeschlagen. Das System umfasst einen Klon, der eine Nucleotidsequenz, vorzugsweise eine doppelsträngige DNA-Sequenz umfasst, die ein vollständiges, positiv orientiertes Antigenom des HPIV kodiert, nachstehend mit „HPIV-Klon" bezeichnet, und einen Trägerklon oder mehrere Trägerklone, die Nucleotidsequenzen umfassen, die ein HPIV-P-Protein und ein HPIV-L-Protein kodieren. Die Nucleotidsequenzen, die das HPIV-P-Protein und das HPIV-L-Protein kodieren, können sich innerhalb desselben Klons befinden. Zur leichten Handhabung wird jedoch bevorzugt, dass die Nucleotidsequenzen, die das HPIV-P-Protein und das HPIV-L-Protein kodieren, sich auf getrennten Klonen befinden. Vorzugsweise umfasst der HPIV-Klon eine Sequenz, die ein HPIV-3-Antigenom kodiert. Vorzugsweise kodieren der Trägerklon oder die Trägerklone ein P-Protein und ein L-Protein des HPIV-3. Bei einer anderen Ausführung umfasst das System ferner einen Trägerklon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die das HPIV-NP-Protein, vorzugsweise das HPIV-3-NP-Protein, kodiert.
Wie er hier verwendet wird bedeutet der Begriff „Klon" eine doppelsträngige DNA, die in eine Zelle eingeführt und exprimiert werden kann. Der Klon kann in Form eines viralen Vektors, wie zum Beispiel eines Vacciniaviralen Vektors oder bevorzugt in Form eines Plasmids, vorliegen. Bevorzugt umfassen der HPIV-Klon und die Trägerklone ein jeder einen RNA-Polymerasepromoter, bevorzugter einen T7 RNA-Polymerasepromoter. Jeder der RNA-Polymerasepromoter ist an die entsprechende, das HPIV kodierende Sequenz im Klon operativ gebunden. Somit ist der RNA-Polymerasepromoter auf dem HPIV-Klon an die HPIV-Sequenz operativ gebunden und die RNA-Polymerase auf den Trägerklonen an die das entsprechende HPIV-Protein kodierende Sequenz oder Sequenzen operativ gebunden. Vorzugsweise enthalten die den Klon umfassenden Plasmide auch einen Replikationsursprung, insbesondere einen bakteriellen Replikationsursprung.
Vorliegende Erfindung schlägt auch einen Klon vor, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die die antigenomische Sequenz des HPIV-3 kodiert, nachstehend als der „HPIV-3 Klon" bezeichnet. Vorzugsweise kodiert der HPIV-3-Klon eine vollständige antigenomische Sequenz des HPIV-3. Wie er hier verwendet wird bedeutet der Begriff „vollständig", dass die antigenomische Sequenz zur ganzen negativ orientierten genomischen Sequenz des HPIV-3, die sich vom 3'-Nucleotid der Leadersequenz bis zum 5'-Nucleotid der Trailersequenz des HPIV-3-Genoms erstreckt, komplementär ist. Die DNA-Form der vollständigen, genomischen Sequenz des HPIV-3, SEQ ID-Nr.: 1, ist in 1 dargestellt. Zusätzlich zu den Leader- und Trailersequenzen enthält der HPIV-3-Klon Sequenzen, die die HPIV-3-Proteine N, P, M, F, HN und L kodieren, sowie die cis-wirkenden Elemente. Der HPIV-3-Klon kann eine Wildtyp-HPIV-3-Antigenomsequenz oder ein modifiziertes HPIV-3-Antigenom kodieren, das eine Mutation oder mehrere Mutationen in ihm enthalten aufweisen. Die Mutation kann in Form eines fremden Gens vorliegen, das in die das HPIV-3 Antigenom kodierende Sequenz eingeführt wird. Vorzugsweise sind Mutationen Substitutionen eines Nucleotids oder mehrerer Nucleotide, Deletionen von 6 bis 12 Nucleotiden in der das HPIV-3-Antigenom kodierenden Sequenz oder Zufügungen von 6 bis 12 Nucleotiden zu dieser. Bevorzugter enthält der modifizierte HPIV-3-Klon Substitutionen entweder in den Genen oder den cis-wirkenden Elementen der das HPIV-3-Antigenom kodierenden Sequenz oder beiden.
Vorzugsweise ist der HPIV-3-Klon ein Plasmid, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein Ribozym, bevorzugter das antigenomische Ribozym des Hepatitis-Delta-Virus, unmittelbar stromabwärts von der das HPIV-Antigenom kodierenden Sequenz kodiert. Nach Transkription des Klons spaltet das Ribozym das Ribozym vom HPIV-Antigenom, um ein replikationskompetentes 3'-Ende auf dem Antigenom zu erzeugen. Bevorzugter umfasst der HPIV-3-Klon auch einen RNA-Polymeraseterminator nach der Ribozymsequenz. Bei einer Ausführung ist der HPIV-3-Klon das Plasmid pHPIV-3, das in 5 dargestellt ist, das bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklaven Drive, Rockville, MD 20852, USA, am __ Mai 1998 hinterlegt wurde und die Zugangsnummer PTA – 722 besitzt.
Vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung des rekombinanten HPIV, insbesondere des HPIV-3, unter Anwendung des oben beschriebenen Systems. Das Verfahren umfasst die Schritte der Einführung eines HPIV-Klons und der Trägerklone, die das HPIV-P-Protein und HPIV-L-Protein kodieren, in Wirtszellen, vorzugsweise in humane Zellen, der Züchtung der Wirtszellen unter Bedingungen, die die Bildung eines HPIV-antigenomischen Transkripts, die Synthese des HPIV-Genoms (vRNA) und der HPIV-Proteine L, P, und NP sowie die Bildung eines rekombinanten HPIV erlauben, und der Rückgewinnung des rekombinanten HPIV aus der Kultur. Vorzugsweise enthalten die Wirtszellen, die mit dem HPIV-Klon und den Trägerklonen transfiziert werden, eine RNA-Polymerase, die dem RNA-Polymerasepromoter entspricht, der an die HPIV-Sequenzen im HPIV-Klon und die Trägerklonen operativ gebunden ist. In einer bevorzugten Ausführung wird ein Trägerklon, der die Nucleotidsequenz umfasst, die das an einen RNA-Polymerasepromoter operativ gebundene HPIV-NP-Protein kodiert, ebenfalls in die Zellen eingeführt. Vorzugsweise werden die Wirtszellen mit einem viralen Rekombinanten, vorzugsweise einem Vaccinia-Virus-Rekombinanten, der die RNA-Polymerase, bevorzugter die T7 RNA-Polymerase exprimiert, vor oder in Kombination mit der Transfektion mit dem HPIV-Klon und dem Trägerklon oder den Trägerklonen infiziert. Werden solche Zellen mit dem Vaccinia-Virus-Rekombinanten infiziert, ist es bevorzugt, dass der HPIV-3-Klon auch einen Vaccinia-Virus-RNA-Polymeraseterminator stromaufwärts von der T7 RNA-Polymerase und einen Vaccinia-Virus-RNA-Polymeraseterminator stromabwärts vom T7 RNA-Polymeraseterminator umfasst.
Vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren für die Einführung stellenspezifischer Mutationen in das Genom eines rekombinanten HPIV-3. Das Verfahren umfasst die Herstellung eines modifizierten HPIV-3-Klons, der eine Mutation oder mehrere Mutationen in der das HPIV-3-Antigenom kodierenden Sequenz umfasst; die Einführung des modifizierten HPIV-3-Klons und von Trägerklonen, die das HPIV-3-P-Protein und HPIV-3-L-Protein und vorzugsweise das HPIV-3-NP-Protein kodierende Sequenzen umfassen, in Wirtszellen; und die Züchtung der Wirtszellen unter Bedingungen, die die Bildung eines modifizierten HPIV-3-antigenomischen Transkripts und die Synthese der HPIV-3-L-, -P- und -NP-Proteine erlauben. Der modifizierte HPIV-3-Klon und die Trägerklone enthalten einen RNA-Polymerasepromoter, der an die das HPIV-3-Protein kodierenden Sequenzen operativ gebunden ist. Die Wirtszellen enthalten innerhalb ihres Zytoplasmas eine RNA-Polymerase, die dem RNA-Polymerasepromoter auf dem modifizierten HPIV-3-Klon und den Trägerklonen entspricht.
Vorzugsweise wird der modifizierte HPIV-3-Klon, der eine Mutation oder mehrere Mutationen in sich enthält, durch herkömmliche PCR-Techniken unter Verwendung eines HPIV-3-Klons als Matrize hergestellt. Die Mutationen werden in den cis-wirkenden Elementen der HPIV-3-Sequenz oder in einer ein HPIV-3-Protein kodierenden Sequenz erzeugt. Vorzugsweise wird die Mutation in der das L-Protein kodierenden Sequenz erzeugt. Werden Mutationen in den das HPIV-3-Protein kodierenden Sequenzen des HPIV-3-Klons erzeugt, ist es bevorzugt, dass ein ähnlicher Typ Mutation an derselben Stelle in der das Protein kodierenden Sequenz des entsprechenden Trägerklons hergestellt wird. Zum Beispiel wird bevorzugt, wenn eine Mutation an einer spezifischen Stelle in der das L-Protein kodierenden Sequenz des HPIV-3-Klons hergestellt wird, dass dieselbe Mutation an derselben Stelle in der das L-Protein kodierenden Sequenz des das L-Protein kodierenden Trägerklons hergestellt wird. Eine solche Methode ist brauchbar zur Identifikation von Mutationen, die die Synthese von viralen Partikeln blockieren oder zur Produktion eines nicht infektiösen oder nicht virulenten HPIV-3 führen.
Um zu bestimmen, ob die durch die oben beschriebene Methode hergestellten mutierten Viren nicht virulent, d.h. attenuiert sind, werden die mutierten Viren zuerst in vitro getestet, um zu bestimmen, ob die Mutation zu einem langsamer wachsenden Phänotyp geführt hat, d.h. ob das mutierte Virus in einer Gewebekultur langsamer wächst als das Wildtyp-Virus. Die mutierten Viren, die diesen Phänotyp darstellen, werden dann durch Injektion in ein Tier, wie die Baumwollratte, die ein gutes Versuchsmodell für das Parainfluenza Virus darstellt, in vivo untersucht. Die infizierten Tiere werden dann untersucht, um zu bestimmen, ob sie Antikörper gegen das HPIV-3 produzieren, und um zu bestimmen, ob eine Reduzierung der Schwere der Symptome vorliegt verglichen mit Tieren, die mit dem Wildtyp-Virus infiziert wurden.
Die Fähigkeit, das rekombinante HPIV-3-Virus zu produzieren, das gentechnisch derart konstruiert ist, dass es spezifische Veränderungen innerhalb der HPIV-3-Gene und cis-wirkende Elemente enthält, treibt die Studie aller Aspekte des Virusreplikationszyklus voran. Hinzu kommt, dass ein System, das die Produktion des rekombinanten HPIV ermöglicht, das derart gentechnisch konstruiert ist, dass es spezifische Veränderungen innerhalb der HPIV-3-Gene enthält, brauchbar ist zur Identifikation attenuierender Parainfluenza Genotypen und zur Entwicklung eines lebenden Impfstoffs für das humane Parainfluenza-Virus.
Die folgenden Beispiele für Verfahren zur Herstellung eines vollständigen cDNA-Klons des HPIV-3 und Verfahren zur Herstellung eines modifizierten oder mutierten, infektiösen, rekombinanten HPIV-3 dienen der Veranschaulichung und sollen nicht den Umfang der Erfindung einschränken.
Beispiel 1. Konstruktion eines vollständigen cDNA-Klons des HPIV-3.
Die Konstruktion eines vollständigen infektiösen Klons des HPIV-3, der Mutationen an spezifischen Stellen enthält, wurde durch ein Zweischritteverfahren erreicht. Der anfängliche Schritt bestand in der Generierung eines Minireplicons, das die Region des positiv orientierten Leaderabschnitts und die Trailerregionen des HPIV-3 enthielt. Der zweite Schritt involvierte die Insertion von der HPIV-3-genomischen RNA abgeleiteter RT-PCR-Fragmente in das Minireplicon. Das positiv orientierte Minireplicon enthielt Folgendes: Einen T7 Promoter, der die Synthese von zwei nicht viralen G-Resten steuerte, gefolgt von der positiv orientierten Leader-Region des HPIV-3, einen Abschnitt der NP-5'-UTR (an der viralen Base 97), das Luciferase-Gen, einen Abschnitt der L-3'-UTR (beginnend an der viralen Base 15387) und Trailer-Sequenzen des HPIV-3. Die vollständige Nucleotidsequenz des HPIV-3-Genoms und die Lokalisierung der Leader-Sequenz, Trailer-Sequenz und Protein kodierenden Regionen sind in 1 dargestellt. Das Hepatitis-Delta-Virus antigenomische Ribozym folgte, um die präzise Spaltung nach der 3-terminalen HPIV-3-spezifischen Base zu bewirken. Ein T7 RNA-Polymeraseterminator wurde ebenfalls in das Replicon nach der Ribozymsequenz eingebaut. Außerdem wurden Vaccinia-Virus-Polymerase-Terminationssignale unmittelbar stromaufwärts und stromabwärts von den oben erwähnten Sequenzen eingefügt. Während der Konstruktion wurden Einzelbasenänderungen in den Regionen, die die NP-5'-UTR und die L-3'-UTR kodieren, kreiert. Eine Änderung von A nach G an der viralen Base 94 und von A nach G an der Base 15389 kreierte jeweils SacI- und StuI-Stellen, die als genetische Tags dienten, um den rekombinanten Ursprung des Virus zu identifizieren.
Der Vektor pOCUS-2 (Novagen) wurde als Ausgangsplasmid für die Herstellung des Minireplicons [pPIV3-MG(+)] wegen seiner kleinen Größe (1930 bp) gewählt. Man nimmt an, dass die Verwendung eines kleinen Ausgangsplasmids die Stabilität des vollständigen Klons erhöhen kann.
Das Minireplicon wurde konstruiert durch Erzeugung von PCR-Produkten, die die Leader- und Trailer-Regionen, flankiert jeweils von einem T7 Promoter und einem Hepatitis-Delta-Virus antigenomischen Ribozym, kodieren. Die für die Synthese der T7 Promoter-/Leader-Region verwendeten Primer waren: 5'-TAGTCGGCCCTAATACGACTCACTATAGGACCAAACAAGAGAAGAA ACT-3', SEQ ID-Nr.: 2, und 5'-GAAATTATAGAGCTCCCTTTTCT-3', SEQ ID-Nr.: 3. Der erste Primer kodiert eine EagI-Stelle und den T7 Promoter (unterstrichen) und der zweite Primer führte eine Basenänderung von A nach G an der viralen Base 94 (fett) innerhalb der 5'-unübersetzten Region (UTR) der NP-mRNA, die eine SacI-Stelle kreiert, ein. Die Matrize für diese Reaktion pHPIV3-CAT ist beschrieben worden von De B. P. und A. K. Banerjee (1993) in: Rescue of synthetic analogs of genome RNA of human Parainfluenza virus type 3 [Rettung synthetischer Analoge der Genom-RNA des humanen Parainfluenza-Virus Typ 3], Vir. 196: 344-348. Das resultierende PCR-Produkt wurde in die EagI- und SacI-Stellen des pOCUS-2 geklont, wie es in 2 dargestellt ist. Die Primer, die für die Synthese der Trailer-/Ribozym-Region verwendet wurden, waren: 5'-TAAGGCCTAAAGATAGACAAAAAGTAAGAAAAACATGTAATATATATATACCAAACAGAGTTCTTCTCTTGTTTGGTGGGTCGGCATGGCATCTC-3', SEQ ID-Nr.: 5, und 5'-CTGGGTACCTCCCTTAGCCATCCGAGT-3', SEQ ID-Nr.: 5. Der erste Primer enthält die Sequenz von der 3'-UTR der L-mRNA bis zum Trailer und regt die Synthese des Ribozyms (unterstrichen) an. Auch wird eine Änderung von A nach G an der viralen Base 15389 (fett), die eine StuI-Stelle innerhalb der 3'-UTR der L-mRNA erzeugt, durch diesen Primer kodiert. Der zweite Primer kodiert das 3'-Ende des Ribozyms (unterstrichen) und eine BglII-Stelle. Die Matrize für diese PCR-Reaktion war pSA1, ein Plasmid, das die Ribozymsequenz enthält, wie es früher bei Perrotta A. T. und M. D. Been, 1991, beschrieben ist. Die Pseudoknoten ähnelnde Struktur ist erforderlich für eine effiziente Selbstspaltung der Hepatitis-Delta-Virus-RNA, Nature 350: 434-436. Das von dieser Reaktion abgeleitete PCR-Produkt wurde in die StuI- und BglII-Stellen des pOCUS-2 geklont. Die Leader- und Trailer-Regionen wurden zu einem einzigen Klon vereinigt durch Übertragung des EagI-/PstI-Fragments des T7/Leader-Klons in die PacI-/PstI-Stellen des Trailer-/Ribozym-Klons.
Um eine mögliche Störung durch die Transkription von den kryptischen Vaccinia-Viruspromotern zu vermeiden, wurden Vaccinia-Virus-Polymerase-Transkriptions-Stopsignale (TTTTTNT) stromaufwärts und stromabwärts vom Replicon nahe den PvuII- und SspI-Stellen innerhalb des pOCUS-2 eingefügt. Ein T7 Transkriptions-Terminationssignal wurde vom pET-17b durch Verdauung mit BlpI und BspEI entfernt und in die SspI-Stelle (abgestumpft mit T4 DNA-Polymerase) des pOCUS-2 eingefügt. Ein Luciferase-Reportergen wurde dann in die SacI- und StuI-Stellen eingefügt, um das pPIV3-MG(+) zu kreieren, das in 3 schematisch dargestellt ist.
Um den vollständigen HPIV-3-Klon zu generieren, wurden fünf RT-PCR-Produkte aus der HPIV-3-Virion-RNA generiert und geklont. Diese Fragmente wurden nacheinander in das pPIV3-MG(+) eingefügt, wobei die die Luciferase kodierenden Sequenzen ersetzt wurden, um pHPIV-3 als den vollständigen Klon zu erzeugen. Die fünf RT-PCR-Produkte wurden aus der Virion-RNA des HPIV-3-Stamms 47885 generiert, der von Robert Chanock der National Institutes of Health bezogen wurde. Diese PCR-Produkte, die das verbleibende HPIV-3-Genom umfassen, wurden identifiziert durch Restriktionsenzymanalyse und geklont, entweder im pUC19 oder pOCUS-2, und dann in das pPIV3-MG(+) eingefügt.
Das erste PCR-Produkt, das die viralen Basen 83 bis 2721 enthielt, wurde in die SmaI-Stelle des pUC19 eingefügt. Der 83/2721 Klon wurde dann mit SacI und XmnI verdaut unter Entfernung der viralen Basen 94 bis 553, die in die SacI und SphI (abgestumpft mit T4 DNA-Polymerase) des pPIV3-MG(+) eingefügt wurden. Der 83/2721 Klon wurde dann mit PstI verdaut, um ein Fragment zu entfernen, das die viralen Basen 540 to 2274 enthielt, das dann in die PstI-Stelle des pPIV3-MG(+)-Klons eingefügt wurde, der das 94/554 Fragment enthielt. Das zweite PCR-Produkt, das die viralen Basen 13395 bis 15397 umfasste, wurde in die SmaI-Stelle des pUC19 geklont. Dieser 13395/15397 Klon wurde dann mit StuI and PacI verdaut und das resultierende Fragment, das die viralen Basen 13632 bis 15381 enthielt, wurde in die StuI- und PacI-Stellen des pPIV3-MG(+) Klons eingefügt, der die virale Sequenz bis zur Base 2274 enthielt. Der resultierende Klon enthielt die viralen Basen 1 bis 2274 und 13632 bis 15462 im pPIV3-MG(+)-Kontext.
Das dritte PCR-Produkt, das die viralen Basen 7403 bis 11513 enthielt, wurde mit BspMI (abgestumpft mit T4 DNA-Polymerase) und XhoI verdaut, um ein Fragment zu produzieren, das die Basen 7437 bis 11444 enthielt und in die XhoI- und SspI-Stellen des pOCUS-2 eingefügt wurde. Das vierte PCR-Fragment, das die viralen Basen 10904 bis 13773 enthielt, wurde mit PvuII and BamHI (virale Basen 10918 bis 13733) verdaut und in die EcoRI- (abgestumpft mit T4 DNA-Polymerase) und BamHI-Stellen des pUC19 eingefügt. Die beiden viralen Segmente wurden vereint durch Verdauung des 7437/11444 Klons mit SacI (abgestumpft mit T4 DNA-Polymerase) und EcoNI und Einfügung in den 10918/13733 Klon, der mit EcoRI (abgestumpft mit T4 DNA-Polymerase) und EcoNI verdaut worden war. Der resultierende Klon enthielt die viralen Basen 7437 bis 13733 auf einem pUC19 Hintergrund. Die restliche virale Sequenz wurde von einem fünften PCR-Produkt abgeleitet, das die viralen Basen 83 bis 7457 umfasste, die mit XmnI und XhoI (virale Basen 553 bis 7437) verdaut und in die StuI- und XhoI-Stellen des pOCUS-2 geklont worden waren. Der 7437/13733 Klon wurde dann mit BamHI, abgestumpft mit T4 DNA-Polymerase, und mit XhoI verdaut, um ein Fragment freizusetzen, das in den EagI- (abgestumpft mit T4 DNA-Polymerase) und XhoI-verdauten 553/7437 Klon eingefügt wurde. Der resultierende Klon enthielt die viralen Basen 553 bis 13733. Dieser Klon wurde dann mit PshAI und PacI verdaut und das resultierende Fragment, das die viralen Basen 2143 bis 13632 enthielt, wurde in dieselben Stellen des pPIV3-MG(+)-Klons eingefügt, der die viralen Basen 1 bis 2274 und 13632 bis 15462 enthielt. Dies generierte pHPIV-3, den infektiösen Klon, der in 4 schematisch dargestellt ist.
Um das P-Gen in den pGEM-4 einzufügen, wurden P-Sequenzen von einem P-lac-Fusionsklon transferiert, (beschrieben in 38, hiermit durch den Verweis einbezogen) durch Verdauung mit XbaI (abgestumpft mit T4 DNA-Polymerase) und BamHI, und eingefügt in KpnI- (abgestumpft mit T4 DNA-Polymerase) und BamHI-Stellen des pGEM4. Die pPIV3-NP- und pPIV3-L-Klone waren wie in 15 und 16 beschrieben (hiermit durch den Verweis einbezogen) vor einem pGEM-4 Hintergrund. Der pPIV3-L-Klon wurde ebenfalls modifiziert. In der natürlichen L-mRNA-Sequenz befindet sich ein nicht-initiierender AUG, 11 Nucleotide vom 5'-Ende des Transkripts entfernt. Dieser wurde vom pPIV3-L durch veränderliche PCR entfernt, wobei die viralen Basen 8636 und 8637 von AT nach TA verändert wurden.
Beispiel 2. Herstellung des rekombinanten HPIV-3.
Konfluente Monolagen der HeLa-Zellen in 6-Well-Platten wurden mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus vTF7-3 mit einer Infektionsmultiplizität von 2 infiziert. Das vTF7-3 exprimiert die T7 RNA-Polymerase wie von Fuerst T. R., P. L. Earl und B. Moss, 1987, in „Use of a hybrid vaccinia virus-T7 RNA polymerase system for expression of target genes" [Verwendung eines hybriden Vaccinia-Virus-T7 RNA-Polymerasesystems für die Expression von Targetgenen], Mol. Cell. Biol. 7: 2538-2544, und von Fuerst T. R., E. G. Niles, F. W. Studier und B. Moss, 1986, in "Eukaryotic transient-expression System based an rekombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase" [Eukaryotisches Transientexpressionssystem basierend auf dem rekombinanten Vaccinia-Virus, das die Bakteriophag-T7 RNA-Polymerase synthetisiert] Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 8122-8126 beschrieben, die durch den Verweis hiermit einbezogen werden. Nach 1 Stunde bei 37°C wurden pPIV3-NP, pPIV3-P, pPIV3-L und pHPIV- 3 transfiziert unter Verwendung von Lipofectin (BRL) nach den Anweisungen des Herstellers. Nach drei Stunden wurde das Transfektionsmedium entfernt und durch 1,5 ml Dulbecco's modifiziertes Eagle's Medium (DMEM)/5% fetales Rinderserum ersetzt. Nach 40 bis 48 Stunden wurden die Platten eingefroren, aufgetaut und abgeschabt. Der geklärte Mediumüberstand (250 μl) wurde dann benutzt, um frische HeLa-Zellen-Monolagen in 6-Well-Platten zu infizieren. DMEM (1,5 ml), das 25 μg/ml 1-B-D-Arabinofuranosylcytosin (AraC) enthielt, um die Replikation des Vaccinia-Virus zu hemmen, wurde nach 1 Stunde Anheftung zugefügt. Nach vierzig Stunden wurden die Platten eingefroren, aufgetaut und abgeschabt. Der geklärte Mediumüberstand wurde dann auf HPIV-3 hin in Gegenwart von AraC titriert. Während des Titrierens wurden isolierte Plaques als Agar-Plugs herausgepickt. Die Agar-flugs wurden bei 4°C für 4 Stunden in 500 ml opti-MEM gelegt. 250 μl wurden dann verwendet, um frische HeLa-Zellen-Monolagen zur Vermehrung der Plaque-Isolate für 40 Stunden zu infizieren.
Bei einer bevorzugten Ausführung waren die Transfektionsbedingungen 1 μg pHPIV-3, 2 μg pPIV3-NP, 4 μg pPIV3-P und 0,1 μg pPIV3-L. Unter diesen Bedingungen wurden annähernd 1000 pfu pro 6 × 10⁵ Zellen während der anfänglichen Transfektion und 10⁶ pfu pro 6 × 10⁵ Zellen nach der Amplifikation erhalten.
Wurden individuelle Plasmide aus dem Transfektionsschritt herausgehalten, wurde beobachtet, dass die pHPIV-3-, pPIV3-P- und pPIV3-L-Plasmide für die Gewinnung des Virus erforderlich waren, nicht aber überraschenderweise das pPIV3-NP, wie es in Tabelle 1 unten dargestellt ist. Tabelle 1

Transfizierte Plasmide

HPIV-3 NP P L Virusgewinnung

+ + + + 14/15^A

– + + + 0/2

+ – + + 3/3^B

+ + – + 0/3

+ + + – 0/2
Tabelle 1. Gewinnung des HPIV-3 aus dem pHPIV-3. HeLa-Zellen-Monolagen wurden mit vTF7-3 infiziert und mit den angegebenen Plasmiden transfiziert. Nach 40 Stunden wurden die Zellen lysiert und die Überstände zu frischen HeLa-Zellen-Monolagen in Gegenwart von AraC hinzugefügt, um die vTF7-3-Replikation zu hemmen. Diese Monolagen wurden dann lysiert und die Überstände auf HPIV-3 hin untersucht. Die Anzahl der Experimente, in denen HPIV-3 pro Versuche gewonnen wurde, ist in der Spalte „Virusgewinnung" angegeben.

^A Das einzige Experiment, das kein HPIV-3 lieferte, verwendete 0,1 μg des P-Plasmids.
^B Die Weglassung des NP-Plasmids resultierte in um 3- bis 5-fach niedrigere Titer des HPIV-3.

Charakterisierung des gewonnenen Virus
Um das gewonnene Virus zu charakterisieren und um den HPIV-3 vom vTF7-3 zu reinigen, dessen Plaques nur wenig kleiner als die des HPIV-3 sind, wurden isolierte Plaques, von denen man vermutete, dass sie HPIV-3 waren, herausgepickt und in HeLa-Zellen amplifiziert. Die Plaque-gereinigten und amplifizierten Virus-Isolate und geeignete Kontrollen wurden dann in Neutralisationsassays analysiert. Das Virus (Isolate #3 und #5) wurde (30 Minuten auf Eis) mit 5 μl präimmunes Kaninchenserum, 5 μl polyklonalen anti-HPIV-3-Kaninchen-Antisera präinkubiert oder in Gegenwart von 25 μg/ml AraC untersucht. Die Sera wurden auf Eis für 30 Minuten mit Virus inkubiert vor einem Standard-Plaque-Assay. Um eine maximale Plaque-Entwicklung zu ermöglichen, wurden die Platten dann bei 37°C für 66 Stunden vor der Färbung mit Kristallviolett inkubiert. Die Resultate des Assay wiesen darauf hin, dass das Plaque-gereinigte Virus durch die Anti-HPIV-3-Antisera vollständig gehemmt wurde, während vTF7-3 nicht gehemmt wurde. Im Gegensatz dazu wurden die HPIV-3-Isolate nicht durch AraC gehemmt, während das vTF7-3-Virus komplett gehemmt wurde. Interessanterweise hatten von den acht rekombinanten HPIV-3-Isolaten vier eine Plaque-Größe, die identisch war mit dem elterlichen HPIV-3-Vorrat, während vier etwas größer waren. Die Plaque-Größe des Isolats #3 war etwas größer als die des Isolats #5 und des Wildtyp-HPIV-3-Virus.
Um zu bestimmen, ob die NP-Kodierungssequenz des pHPIV-3, die dieselbe Position wie die Luciferase im pPIV3-MG(+) teilt, vom pHPIV-3 exprimiert wurde, wurden pHPIV-3 und pPIV3-NP getrennt transfiziert in vTF7-3-infizierte HeLa-Zellen und Zell-Listen nach 48 Stunden aufgestellt. Die Lysate wurden dann durch Western-Blotting analysiert unter Verwendung von Anti-HPIV-3-RNP-Antisera. Diese Antisera erkennen primär NP und reagieren schwach mit P.
Insbesondere wurden Extrakte (äquivalent mit 6 × 10⁴ Zellen) der SDS-10% PAGE unterzogen und auf Nitrocellulosemembranen übertragen. Der primäre Antikörper war ein polyklonales Anti-RNP-Kaninchen-Antiserum, das 1:1000 verdünnt war. Der sekundäre Antikörper war eine 1:1000 Verdünnung eines Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörpers, der mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert war. Die Visualisierung erfolgte durch Chemilumineszenz (ECL-Kit, Amersham). Wie es sich durch Western-Blot zeigte, erkannte der HPIV-3-RNP das NP aus den mit pPIV3-NP und pHPIV-3 transfizierten Zellextrakten und aus dem gereinigten HPIV-3-RNP. Keine Proteine wurden erkannt in einem mock-transfizierten HeLa-Extrakt. So erweist es sich, dass NP aus dem pHPIV-3 exprimiert wird, wobei es wahrscheinlich aus dem T7-gerichteten, antigenomischen RNA-Transkript übersetzt wird.
Um zu bestimmen, ob das gewonnene rekombinante Virus spezifische Mutationen in seinem Genom aufwies, wurde die RNA aus den Wildtyp- und Plaque-isolierten Viren extrahiert und für die RT-PCR-Analyse verwendet unter Einsatz von die Substitutionsmutationen flankierenden Primern. Die virale RNA wurde isoliert aus annähernd 2 × 10 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) der Plaquegereinigten Virusisolate #3, 5, 7 und 9, oder des Wildtyp-HPIV-3-Stamms 47885/. Die Reverse Transkription wurde mit Hilfe der Superskript-II-Reverse-Transcriptase (BMB) bei 44°C für 1 Stunde unter Verwendung von Oligonucleotiden durchgeführt, die an der viralen Base 23 oder 15100 starteten. Die PCR wurde ausgeführt mit der Expand Long Polymerase (BMB) unter Verwendung von sekundären Primern, die zur Vermehrung der viralen Basen 23 bis 303 oder 15100 bis 15440 führen.
Die PCR-Produkte, die die viralen Basen 1 bis 324 und 15080 bis 15462 umfassen, wurden aus den angegebenen Isolaten generiert, jeweils mit SacI und StuI verdaut und auf einem 1,4% Agarose-Gel analysiert. PCR-Produkte der erwarteten Größe wurden auf RT-abhängige Weise generiert, die anzeigt, dass die PCR-Produkte eher von der RNA als von der kontaminierenden Plasmid-DNA abgeleitet sind.
Wie es sich auf dem Agarose-Gel erwies, wird die Größe der PCR-Produkte 1 bis 324 und 15080 bis 15462 durch jeweils 21 und 22 Basenpaare über die Länge der viralen spezifischen Regionen dank des Einschlusses von Restriktionsenzymstellen in die Vermehrungsprimer vergrößert. Die Verdauung mit SacI zeigte, dass die Mutation an der Base 94 im Wildtyp-Virus nicht vorlag, wohl aber in den Plaque-isolierten Viren, was darauf hinweist, dass sie rekombinanten Ursprungs sind. Desgleichen war das PCR-Produkt, das von der Region abgeleitet war, die die virale Base 15389 des Wildtyp-HPIV-3 umschloss, durch StuI nicht gespalten worden. Jedoch enthielten nur vier der acht Plaqueisolierten Viren die Mutation, die die StuI-Stelle kreiert. Direkte Sequenzierung der PCR-Produkte bestätigte diese Resultate.
ERÖRTERUNG
Ein vollständiger Plasmidklon des HPIV-3-Genoms, der pHPIV-3, wurde konstruiert. Nach Transfektion des pHPIV-3 und von Plasmiden, die die viralen NP-, P- und L-Proteine kodieren, in vTF7-3-infizierten HeLa-Zellen, wurden rekombinante HPIV-3 tragende genetische Marker auf effiziente Weise gewonnen. Dabei wurden mehrere interessante Merkmale dieses Systems festgestellt. Zum Ersten konnte das virale NP-Protein aus dem infektiösen Klon exprimiert werden, und diese Expression umging die Notwendigkeit eines NP-Trägerplasmids. Man nimmt an, dass das NP-Protein direkt aus dem primären antigenomischen Transkript synthetisiert wird, nachdem es durch das das Vaccinia-Virus bedeckende Enzym bedeckt worden ist.
Zum Zweiten wurden zwei rekombinante Viren mit unterschiedlichen Genotypen und Phänotypen produziert, wahrscheinlich dank der Rekombination zwischen pHPIV-3- und pPIV3-L-Plasmiden, obwohl die Möglichkeit, dass die Reversion während der RNA-Replikation eintritt, nicht ausgeschlossen werden kann. Das pPIV3-L enthält die gesamte L-3'-UTR und einen Teil der Trailerregion, die sich bis zur Base 15437 erstreckt, was einem Überlappen von 48 Basenpaaren über die StuI-Stelle hinaus gleichkommt. Dies bietet breiten Raum, damit die Rekombination zwischen Plasmiden in mit dem Vaccinia-Virus infizierten Zellen leicht eintreten kann.
Aus diesen Resultaten ergibt sich, dass eine Selektion im HPIV-3-System stattfindet. Alle großen Plaque-Virusisolate hatten sich zu einer Wildtypsequenz an der Base 15389 umgekehrt, während die Änderung an der Base 94 beibehalten wurde. Da A94G die einzige bekannte Änderung dieser Viren aus dem Elternvirus ist, zeigt es sich, dass die Isolate, die beide Mutationen beibehielten, eine Plaque-Größe aufwiesen, die identisch war mit derjenigen des elterlichen (Wildtyp) Virus; gingen jedoch die 15389 Mutationen verloren, nahm die Plaque-Größe zu, was darauf hinwies, dass die Mutation an der Base 15389 im Zusammenhang mit der A94G Mutation schädlich war. Es gab eine andere bekannte Änderung zwischen dem pHPIV-3 und den Trägerplasmiden. In der natürlichen L-Proteinbotschaft gibt es ein nicht-initiierendes AUG. Da dieses AUG nur 11 Nucleotide vom 5'-Ende der L-mRNA entfernt ist und sich in einem schwachen Translationsinitiationskontext befindet, kann es keine große Störung der L-mRNA-Translation verursachen. Jedoch ist dieses nicht-initiierende AUG im Trägerplasmid pPIV3-L viel weiter vom 5'-Ende des Transkripts entfernt, wo es wahrscheinlicher ist, durch Ribosome erkannt zu werden. Dieses AUG wurde vom pPIV3-L entfernt durch Änderung der Basen 8636 und 8637 von AT nach TA, wobei eine SphI-Stelle zerstört und eine NheI-Stelle kreiert wurde. Um Zu untersuchen, ob diese Änderung im rekombinanten Virus vorhanden war und verantwortlich sein konnte für den großen Plaque-Phänotyp, wurde die RT-PCR-Analyse durchgeführt. PCR-Produkte, die diese Stelle umfassten und sowohl von den Wildtyp-Viren als auch von den Plaque-isolierten Viren abgeleitet waren, behielten eine Wildtypsequenz bei, was darauf hinwies, dass die Rekombination über dieser Region nicht erfolgte und dass diese Änderungen nicht irgendeine Veränderlichkeit der Plaque-Größe erklären konnten.
Das Ergebnis, dass die Rekombination zwischen transfizierten Plasmiden eintreten kann, weist darauf hin, dass Sorgfalt anzuwenden ist bei der Einführung von Mutationen in die infektiösen Klonsysteme des Paramyxovirus oder Rhabdovirus. Mutationen, die in die NP-, P- oder L-Sequenzen eingeführt werden, erfolgen vorzugsweise sowohl durch die Trägerplasmide als auch den infektiösen Klon. Andemfalls kann es möglich sein, dass das resultierende Virus die gewünschte Mutation nicht trägt. Die einzige mögliche Ausnahme hierzu ist das HPIV-3-System, bei dem der HPIV-3-infektiöse Klon das NP exprimiert, unter Umgehung der Notwendigkeit des NP-Trägerplasmids. Ferner wird bevorzugt, dass das HPIV-3-NP-Trägerplasmid in das System einbezogen wird, da signifikant größere Ausbeuten des HPIV-3 erzielt wurden, wenn das Träger-NP-Plasmid in der Transfektion enthalten war.
Ein infektiöser Klon für HPIV-3 ist brauchbar für das Verständnis der Molekularbiologie des HPIV-3 und für die Entwicklung eines Impfstoffs für dieses bedeutende Pathogen. Die Fähigkeit, spezifische Mutationen innerhalb des HPIV-3 zu generieren, macht alle Aspekte der HPIV-3-Replikation für das Studium zugänglich. Jede Mutation, einschließlich solcher, die früher in anderen Kontexten studiert wurden, kann jetzt mit diesem System untersucht werden. Die Fähigkeit, spezifische Mutationen einzuführen, erlaubt auch die Möglichkeit der Umkehranalyse, die unser Verständnis der Protein-Protein- oder Protein-RNA-Wechselbeziehungen vertieft.
Der infektiöse Klon ist auch von Nutzen für die Identifizierung von Mutationen, die das Virus attenuieren. Ein solches Virus ist nützlich für die Entwicklung neuer Impfstoffstämme des HPIV-3. Hinzukommt, dass Mutationen, die in einem gebräuchlichen Impfstoffstammkandidaten des HPIV-3 vorhanden sind, in den pHPIV-3 eingefügt werden können. Durch die Identifizierung multipler schädlicher Mutationen müsste es möglich sein, mehrere Mutationen, die unterschiedliche Schritte im Viruslebenszyklus beeinflussen, in einem einzigen HPIV-3-Stamm zu konstruieren. Ein solches Virus müsste stark attenuiert und nicht leicht umzukehren sein.
Während die Erfindung in gewisser Weise anhand einer besonderen Ausführung beschrieben wurde, können unterschiedliche Anpassungen und Modifikationen erfolgen, ohne vom Umfang der Erfindung, wie er in den Ansprüchen beansprucht wird, abzuweichen. SEQUENZLISTE

Claims

Rekombinanter HPIV-Klon, der umfasst: a) eine Nucleotidsequenz, die ein positiv orientiertes Antigenom des humanen Parainfluenza-Virus Typ 3(HPIV-3) kodiert und b) einen RNA-Polymerasepromoter, der an diese Nucleotidsequenz operativ gebunden ist.
Klon nach Anspruch 1, wobei dieser Klon weiter eine Ribozymsequenz stromabwärts von dieser das Antigenom kodierenden Sequenz umfasst.
Klon nach Anspruch 1, wobei der RNA-Polymerasepromoter der T7 RNA-Polymerasepromoter ist.
Klon nach Anspruch 2, wobei das Ribozym ein antigenomisches Ribozym ist.
Klon nach Anspruch 2, der weiter einen RNA-Polymeraseterminator stromabwärts der Ribozymsequenz umfasst.
Klon nach Anspruch 1, wobei die Nucleotidsequenz ein modifiziertes Antigenom des HPIV-3 kodiert.
Klon nach Anspruch 6, wobei die das modifizierte HPIV-3-Antigenom kodierende Sequenz eine Mutation umfasst, die aus der aus einer Substitution eines Nucleotids oder mehrerer Nucleotide, einer Deletion von 3 bis 12 Nucleotiden und einer Hinzufügung von 3 bis 12 Nucleotiden bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren zur Zubereitung eines rekombinanten humanen Parainfluenza- Virus Typ 3 umfassend: a) Herstellen eines rekombinanten Systems, das umfasst: i) einen HPIV-Klon, der eine ein positiv orientiertes Antigenom des humanen Parainfluenza-Virus Typ 3 kodierende Nucleotidsequenz umfasst, ii) einen Trägerklon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein humanes Parainfluenza-Virus Typ 3 L-Protein kodiert, und iii) einen Trägerklon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein humanes Parainfluenza-Virus Typ 3 P-Protein kodiert, wobei die das P-Protein und das L-Protein kodierende Nucleotidsequenz sich auf demselben Trägerklon oder auf getrennten Trägerklonen befinden kann; b) Einführen des rekombinanten Systems des Schritts (a) in Wirtszellen; c) Züchten der Wirtszellen des Schritts (b) während eines Zeitraums, der ausreicht, um die Transfektion der Wirtszellen und die Bildung des rekombinanten humanen Parainfluenza-Virus Typ 3 zu ermöglichen, und d) Rückgewinnung des rekombinanten humanen Parainfluenza-Virus Typ 3 aus der Kultur der transfizierten Wirtszellen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die das Antigenom kodierende Sequenz des HPIV-3-Klons an einen RNA-Polymerasepromoter operativ gebunden ist, wobei die das P-Protein kodierenden Sequenzen der P-Trägerklone an einen RNA-Polymerasepromoter operativ gebunden sind, wobei die das L-Protein kodierenden Sequenzen der L-Trägerklone an einen RNA-Polymerasepromoter operativ gebunden sind, und wobei die Wirtszellen eine RNA-Polymerase umfassen, die dem RNA-Polymerasepromoter dieses HPIV-3-Klons und dieser Trägerklonen entspricht.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Wirtszellen mit einem viralen rekombinanten System infiziert werden, das fähig ist, die RNA-Polymerase vor oder in Kombination mit dem Einführen des rekombinanten Systems in die Wirtszellen zu exprimieren.
Wirtszelle zur Erzeugung eines rekombinanten humanen Parainfluenza-Virus Typ 3, wobei diese Wirtszelle umfasst: a) einen HPIV-3-Klon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein positiv orientiertes Antigenom des humanen Parainfluenza-Virus Typ 3 kodiert, b) einen Trägerklon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein humanes Parainfluenza-Virus Typ 3 L-Protein kodiert, und c) einen Trägerklon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein humanes Parainfluenza-Virus Typ 3 P-Protein kodiert, wobei die das P-Protein und das L-Protein kodierende Nucleotidsequenz sich auf demselben Trägerklon oder auf getrennten Trägerklonen befinden kann.
Wirtszelle nach Anspruch 11, die weiter einen Trägerklon umfasst, der eine ein humanes Parainfluenza-Virus Typ 3 NP-Protein kodierende Nucleotidsequenz aufweist.
Wirtszelle zur Erzeugung eines rekombinanten humanen Parainfluenza-Virus Typ 3, wobei diese Wirtszelle umfasst: a) einen HPIV-Klon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein positiv orientiertes Antigenom des humanen Parainfluenza-Virus Typ 3 kodiert, wobei diese Antigenomsequenz eine stellenspezifische Mutation aufweist, b) einen Trägerklon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein humanes Parainfluenza-Virus Typ 3 L-Protein kodiert, und c) einen Trägerklon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein humanes Parainfluenza-Virus Typ 3 P-Protein kodiert, wobei die das P-Protein und das L-Protein kodierenden Nucleotidsequenzen sich auf demselben Trägerklon oder auf getrennten Trägerklonen befinden.
Wirtszelle nach Anspruch 12, wobei der HPIV-3-Klon weiter einen RNA- Polymerasepromoter umfasst, der an die HPIV-3-antigenomische Sequenz operativ gebunden ist, und wobei jeder der Trägerklone einen RNA-Polymerasepromoter umfasst, der an die das HPIV-3-Protein kodierende Sequenz dieses Trägers operativ gebunden ist.
Verfahren zum Einführen einer stellenspezifischen Mutation in das Genom eines rekombinanten humanen Parainfluenza-Virus Typ 3, das die folgenden Schritte umfasst: a) Herstellen eines Klons, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein humanes Antigenom des Parainfluenza-viralen Typs 3 kodiert, das eine Mutation an einer spezifischen Stelle aufweist; b) Co-Transfektion von Wirtszellen mit dem Klon des Schritts (a), einem Trägerklon, der eine ein HPIV-3 L-Protein kodierende Nucleotidsequenz umfasst, und einem Trägerklon, der eine ein HPIV-3 P-Protein kodierende Nucleotidsequenz umfasst, wobei die das P-Protein und L-Protein kodierende Nucleotidsequenz auf demselben Trägerklon oder auf getrennten Trägerklonen sein kann, und c) Züchten der transfizierten Wirtszellen während eines Zeitraums, der ausreicht, um die Bildung eines rekombinanten humanen Parainfluenza-Virus Typ 3 zu ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 15, das weiter den Schritt der Transfektion der Wirtszellen mit einem Trägerklon umfasst, der eine ein HPIV-3-NP-Protein kodierende Nucleotidsequenz aufweist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Klon des Schritts (a) hergestellt wird unter Anwendung von Polymerase-Kettenreaktions-Techniken und eines Klons, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein humanes Parainfluenza-Virus Typ 3 Antigenom als Matrize kodiert, wobei der das Antigenom kodierenden Nucleotidsequenz dieses Matrizenklons die stellenspezifische Mutation fehlt.
Klon nach Anspruch 6, wobei die modifizierte Antigenomsequenz eine Mutation oder mehrere Mutationen in einem cis-wirkenden Element oder in einer Proteinkodierungsregion aufweist.
Klon nach Anspruch 6, wobei sich die Mutation in der das P-Protein kodierenden Region oder in der das L-Protein kodierenden Region befindet.
Wirtszelle zur Herstellung eines rekombinanten humanen Parainfluenza-Virus Typ 3, wobei diese Wirtszelle umfasst: a) einen HPIV-Klon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein positiv orientiertes Antigenom des humanen Parainfluenza-Virus Typ 3 kodiert, wobei diese Antigenomsequenz eine stellenspezifische Mutation aufweist, b) einen Trägerklon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein humanes Parainfluenza-Virus Typ 3 L-Protein kodiert, und c) einen Trägerklon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein humanes Parainfluenza-Virus Typ 3 P-Protein kodiert, wobei die das P-Protein und das L-Protein kodierenden Nucleotidsequenzen sich auf demselben Trägerklon oder auf getrennten Trägerklonen befinden und wobei die Mutation sich in der L-Proteinkodierungsregion der das Antigenom kodierenden Sequenz des HPIV-Klons befindet und wobei der Trägerklon, der die das L-Protein kodierende Sequenz umfasst, eine entsprechende Mutation darin aufweist.
Wirtszelle zur Herstellung eines rekombinanten humanen Parainfluenza-Virus Typ 3, wobei diese Wirtszelle umfasst: a) einen HPIV-3-Klon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein positiv orientiertes Antigenom des humanen Parainfluenza-Virus Typ 3 kodiert, wobei diese Antigenomsequenz eine stellenspezifische Mutation aufweist, b) einen Trägerklon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein humanes Parainfluenza-Virus Typ 3 L-Protein kodiert, und c) einen Trägerklon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein humanes Parainfluenza-Virus Typ 3 P-Protein kodiert, wobei die das P-Protein und das L-Protein kodierenden Nucleotidsequenzen sich auf demselben Trägerklon oder auf getrennten Trägerklonen befinden, und wobei die Mutation sich in der P-Proteinkodierungsregion der das Antigenom kodierenden Sequenz des HPIV-Klons befindet und wobei der Trägerklon, der die das P-Protein kodierende Sequenz umfasst, eine entsprechende Mutation darin aufweist.
Wirtszelle zur Herstellung eines rekombinanten humanen Parainfluenza-Virus Typ 3, wobei diese Wirtszelle umfasst: a) einen HPIV-3-Klon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein positiv orientiertes Antigenom des humanen Parainfluenza-Virus Typ 3 kodiert, wobei diese Antigenomsequenz eine stellenspezifische Mutation aufweist, b) einen Trägerklon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein humanes Parainfluenza-Virus Typ 3 L-Protein kodiert, c) einen Trägerklon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein humanes Parainfluenza-Virus Typ 3 P-Protein kodiert, und d) einen Trägerklon, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein humanes Parainfluenza-Virus Typ 3 NP-Protein kodiert, wobei die das P-Protein, L-Protein und NP-Protein kodierenden Nucleotidsequenzen sich auf demselben Trägerklon oder auf getrennten Trägerklonen befinden, und wobei die Mutation sich in der NP-Proteinkodierungsregion der das Antigenom kodierenden Sequenz des HPIV-Klons befindet und wobei der Trägerklon, der die das NP-Protein kodierende Sequenz umfasst, eine entsprechende Mutation darin aufweist.