KR100585946B1 - 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3에 대한 감염성 클론 - Google Patents
인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3에 대한 감염성 클론 Download PDFInfo
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Abstract
재조합 인간 파라인플루엔자 바이러스, 특히 감염성 재조합 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3 (HPIV-3)을 생성하기 위한 시스템이 제공된다. 일양태에서, 시스템은 HPIV의 표준형 포지티브 센스 안티-게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론과 HPIV P 단백질과 HPIV L 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 지지체 클론을 포함한다. 다른 양태에서, 시스템은 HPIV NP 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 지지체 클론을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 HPIV-3의 표준형 포지티브 센스 안티 게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론을 제공한다. 클론은 또한 HPIV-3 안티게놈 암호화 서열에 작동적으로 연결된 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함한다. 바람직한 양태에서, 클론은 HPIV-3 안티-게놈을 암호화하는 서열로부터 다운스트림에 즉시 리보자임을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 본 발명은 또한 HPIV-3 게놈에 부위-특이성 돌연변이를 갖는 재조합 HPIV-3 바이러스의 제조 방법에 관한 것이다. 방법은 HPIV-3 안티게놈 암호화 서열을 포함하는 클론을 제조하고; HPIV-3 P 단백질, HPIV-3 L 단백질 및 바람직하게는 HPIV-3 NP 단백질을 포함하는 변형된 HPIV-3 클론 및 지지체 클론을 숙주 세포로 도입한 다음; 숙주 세포를 변형된 HPIV-3 안티게놈 및 HPIV-3의 L, P 및 NP 단백질의 합성을 허용하는 조건 하에서 배양시킴을 포함한다.
파라인플루엔자, 감염성, 클론
Description
본 발명은 알러지 및 감염성 질환 협회로부터 국립보건원 승인번호 제32027호에 의해 부분적으로 지원받았다. 정부는 본 발명에 권리를 향유할 수 있다. 본 발명은 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3에 대한 감염성 클론에 관한 것이다.
1956년에 인간의 호흡 감염의 원인으로서 인식된 인간 파라인플루엔자 바이러스(HPIV)는 어린이 호흡 질환의 4 내지 22 %의 원인이 되는 것으로 믿어지며, 이러한 수치는 이에 관하여 호흡 합포체 바이러스 다음으로 첫번째이다. HPIV는 하부 호흡기 질환, 예를 들면, 폐렴 및 기관지염의 중요한 원인이고 영아 크루프의 가장 보편적인 원인이다. 4 가지 HPIV 혈청형 1 내지 4 중에서, 유형 3 바이러스(HPIV-3)가 가장 악성이고 태어난 첫 달 동안 자주 기관지염과 폐렴을 유발시킨다.
불행하게도, HPIV-유도 감염을 예방하거나 치료하기 위해서 사용될 수 있는 효과적인 백신 또는 항바이러스 요법이 현재 입수되지 않았다. 불활성 바이러스를 생성하기 위해서 사용되는 표준 방법, 예를 들면, 바이러스의 열 불활성화 또는 화학 처리는 HPIV-3을 포함하여 모든 HPIV 균주 및 혈청형에 성공적이지 못했다. 또한, 약독화된 바이러스를 생성하기 위한 표준 방법은 임의 부위에서 돌연변이를 생성하고 HPIV 게놈을 특정 부위에서 변형시키거나 게놈으로 도입된 돌연변이의 수를 조절하도록 하지 못한다.
인간 파라인플루엔자 바이러스는 파라마익소비리대(Paramyxoviridae) 과 내의 파라마익소비루스(paramyxovirus) 속의 멤버인 엔벨롭핑된 일본쇄 네가티브 센스 RNA 바이러스이다. 인간 파라인플루엔자 바이러스 게놈(vRNA)의 복제는 파라마익소비리대 과의 다른 멤버의 복제와 유사하다. 세포 감염시, 전사는 네가티브-센스 게놈, 즉, vRNA로부터 바이러스 mRNA의 생성을 유발하는 주요 RNA 합성 사건이다. 이후 감염시 RNA 복제로의 전이가 일어나고, 이는 추가의 네가티브-센스 게놈 RNA의 합성을 위한 주형 역할을 하는 표준형 안티게놈 포지티브-센스 RNA의 합성을 유발시킨다. 게놈 RNA의 전사 및 복제는 뉴클레오캡시드 단백질(NP) 및 밀접하게 관련된 인단백질(P) 및 거대(L) 폴리머라제 단백질에 의해서 캡시드화된 15462 개의 뉴클레오티드 게놈 RNA로 이루어진 리보뉴클레오프로테인 복합체(RNP)의 형성에 의존한다. 여러 숙주 세포 인자가 또한 HPIV의 복제 사이클에 포함된다.
HPIV을 위한 온전한 RNP의 요구는 무세포 시스템에서의 HPIV 전사 및 복제의 분석을 방해한다. 시험관내 HPIV-3 vRNA를 캡시드화하려는 노력은 실패하였고 포지티브 센스 RNA 바이러스와 달리 네이키드 HPIV vRNA는 감염성이 아니다. 또한, 재조합 감염성 HPIV-3을 포함하여 재조합 HPIV의 제조 시스템은 현재 알려져 있지 않다.
따라서, 재조합 HPIV, 특히 재조합 감염성 HPIV-3를 생성할 수 있게 하는 신규한 시약, 시스템 및 방법이 필요하다. 하나 이상의 부위-특이성 돌연변이를 HPIV, 특히 HPIV-3으로 도입하도록 허용하는 재조합 시스템이 바람직하다. 부위-특이성 돌연변이의 인간 파라인플루엔자 바이러스 RNA의 전사 또는 복제에 대한 효과의 특징을 규명하고 약독화된 HPIV의 생성을 초래하는 부위 특이성 돌연변이를 동정하도록 하는 재조합 시스템이 특히 바람직하다.
본 발명에 따라서, 재조합 인간 파라인플루엔자 바이러스, 특히 감염성 재조합 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3(HIV-3)을 생성하기 위한 시스템이 제공된다. 일양태에서, 시스템은 HPIV의 표준형 포지티브 센스 안티-게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론과 HPIV P 단백질과 HPIV L 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 지지체 클론을 포함한다. 다른 양태에서, 시스템은 HPIV NP 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 지지체 클론을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 시스템의 각각의 클론은 클론 내에 함유된 각각의 HPIV 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함한다.
본 발명은 또한 HPIV-3의 표준형 포지티브 센스 안티-게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론을 제공한다. 클론은 또한 HPIV-3 안티게놈-암호화 서열에 작동적으로 연결된 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함한다. 바람직한 양태에서, 클론은 HPIV-3 안티-게놈을 암호화하는 서열로부터 바로 다운스트림에 리보자임을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 HPIV-3 게놈에 부위-특이성 돌연변이를 갖는 재조합 HPIV-3 바이러스의 제조방법에 관한 것이다. 방법은 변형된 HPIV-3 안티게놈 암호화 서열을 포함하는 클론을 제조하고; 변형된 HPIV-3 클론과 HPIV-3 P 단백질, HPIV-3 L 단백질 및 바람직하게는 HPIV-3 NP 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 지지체 클론을 숙주 세포로 도입한 다음; 숙주 세포를 변형된 HPIV-3 안티게놈과 HPIV-3의 L, P 및 NP 단백질의 합성을 허용하는 조건 하에서 배양함을 포함한다.
HPIV-3 유전자 및 시스-작용 요소 내에 부위-특이성 돌연변이를 함유하도록 유전 공학 처리된 재조합 HPIV-3 바이러스를 생성하는 능력은 모든 양태의 바이러스 복제 사이클에 대한 연구를 진척시킨다. 또한, HPIV-3 게놈 내에 부위-특이성 돌연변이를 함유하도록 유전 공학 처리된 재조합 HPIV의 생성을 허용하는 시스템은 약독화 파라인플루엔자 유전자형의 동정 및 인간 파라인플루엔자 바이러스에 대한 생 백신의 개발에 유용하다.
도 1은 HPIV-3 게놈의 뉴클레오티드 서열의 DNA 형태를 도시하고 제한 부위, 리더 서열, 트레일러 서열 및 게놈의 단백질 암호화 영역의 위치를 예시한다.
도 2는 pOCUS-2TM 벡터의 제한 지도이다.
도 3은 리더 서열, 루시페라제 암호화 영역 및 T7 프로모터 및 종결자의 위 치를 예시하는 pMG(+)의 제한 지도이다.
도 4는 HPIV-3의 리더 서열 및 단백질 암호화 영역의 위치를 예시하는 pHPIV-3의 제한 지도이다.
도 5는 표준형 감염성 클론인 pHPIV-3의 개략도이다. VVΦ, 백시니아 바이러스 폴리머라제 종결 시그널(TTTTTNT); T7, T7 RNA 폴리머라제 프로모터; le, HPIV-3 리더 서열; NP, P, M, F, HN 및 L은 HPIV-3 단백질 암호화 영역; tr, HPIV-3 트레일러 서열; Rz, 헤파티티스 델타 바이러스 안티게놈 리보자임; T7Φ, T7 RNA 폴리머라제 종결자 시그널. 치환 돌연변이를 함유하는 영역은 확장되고 표시된 특정 변화와 함께 상기에 예시되어 있다. 바이러스 염기 94에서의 A의 G로의 변화는 Sacl 부위를 생성하고 바이러스 염기 15389에서의 A의 G로의 변화는 Stul 부위를 생성한다.
본 발명에 따라서 재조합 인간 파라인플루엔자 바이러스를 생성하기 위한 시스템이 제공된다. 바람직한 양태에서, 시스템은 재조합 HPIV-3을 생성하기 위해서 사용된다. 시스템은 이후 본원에서 "HPIV 클론"이라고 언급되는 HPIV의 표준형 포지티브 센스 안티-게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 이본쇄 DNA 서열을 포함하는 클론과 HPIV P 단백질과 HPIV L 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 지지체 클론을 포함한다. HPIV P 단백질과 HPIV L 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 동일한 클론 내에 존재할 수 있다. 그러나, 조작의 용이성을 위해서, HPIV P 단백질과 HPIV L 단백질을 암호 화하는 뉴클레오티드 서열은 개별 클론 상에 존재함이 바람직하다. 바람직하게는 HPIV 클론은 HPIV-3 안티게놈을 암호화하는 서열을 포함한다. 바람직하게는 지지체 클론(들)은 HPIV-3의 P 단백질과 L 단백질을 암호화한다. 또다른 양태에서 시스템은 HPIV NP 단백질, 바람직하게는 HPIV-3 NP 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 지지체 클론을 추가로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "클론"은 세포로 도입되어 발현될 수 있는 이본쇄 NDA를 의미한다. 클론은 바이러스 벡터, 예를 들면, 백시니아 바이러스 벡터의 형태, 바람직하게는 플라스미드 형태일 수 있다. 바람직하게는, HPIV 클론 및 지지체 클론은 각각 RNA 폴리머라제 프로모터, 바람직하게는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함한다. 각각의 RNA 폴리머라제 프로모터는 클론내 상응하는 HPIV 암호화 서열에 작동적으로 연결되어 있다. 따라서, HPIV 클론 상의 RNA 폴리머라제는 HPIV 서열에 작동적으로 연결되어 있고 지지체 클론 상의 RNA 폴리머라제는 각각의 HPIV 단백질을 암호화하는 서열(들)에 작동적으로 연결되어 있다. 바람직하게는, 클론을 포함하는 플라스미드는 또한 복제 기원, 바람직하게는 복제의 세균성 기원을 포함한다.
본 발명은 또한 이후 본원에서 "HPIV-3 클론"이라고 언급되는, HPIV-3의 안티-게놈 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론을 제공한다. 바람직하게는, HPIV-3 클론은 HPIV-3의 표준형 안티게놈 서열을 암호화한다. 본원에 사용된 바와 같이, "표준형"은 안티-게놈 서열이 리더 서열의 3' 뉴클레오티드로부터 HPIV-3 게놈의 트레일러 서열의 5' 뉴클레오티드에 걸쳐 뻗어 있는 HPIV-3 의 전체 네가티브 센스 게놈 서열에 상보적임을 의미한다. HPIV-3의 표준형 게놈 서열의 DNA 형태인 서열번호 1이 도 1에 예시되어 있다. 리더 및 트레일러 서열 외에도, HPIV-3 클론은 HPIV-3 단백질, N, P, M, F, HN 및 L, 및 시스-작용 요소를 암호화하는 서열을 함유한다. HPIV-3 클론은 야생형 HPIV-3 안티게놈 서열 또는 이에 함유된 하나 이상의 돌연변이를 갖는 변형된 HPIV-3 안티게놈을 암호화할 수 있다. 돌연변이는 HPIV-3 안티게놈-암호화 서열로 삽입된 이종 유전자의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이는 HPIV-3 안티게놈-암호화 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 6 개 내지 12 개의 뉴클레오티드의 결실 또는 6 개 내지 12 개의 뉴클레오티드의 첨가이다. 좀더 바람직하게는, 변형된 HPIV-3 클론은 유전자 또는 시스-작용 요소에 또는 HPIV-3 안티게놈 암호화 서열 모두에 치환을 함유한다.
바람직하게는, HPIV-3 클론은 HPIV 안티게놈-암호화 서열로부터 바로 다운스트림에, 리보자임, 좀더 바람직하게는 헤파티티스 델타 바이러스 안티게놈 리보자임을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 플라스미드이다. 클론의 전사에 이어서, 리보자임은 안티게놈에 복제 능력이 있는 3' 말단을 제공하기 위해서 리보자임을 HPIV 안티게놈으로부터 분할한다. 좀더 바람직하게는, HPIV-3 클론은 또한 리보자임 서열에 이어서 RNA 폴리머라제 종결자를 포함한다. 일양태에서, HPIV-3 클론은 도 5에 도시된 플라스미드 pHPIV-3이다.
본 발명은 또한 상기의 시스템을 사용하여 재조합 HPIV, 특히 HPIV-3를 제조하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 HPIV 클론과 HPIV P 단백질 및 HPIV L 단백질을 암호화하는 지지체 클론을 숙주 세포, 바람직하게는 인간 세포로 도입하고; 숙주 세포를 HPIV 안티-게놈 전사체의 형성, HPIV 게놈 (vRNA) 및 HPVI 단백질 L, P 및 NP의 합성 및 재조합 HPIV의 형성을 허용하는 조건 하에서 배양한 다음; 재조합 HPIV를 배양물로부터 회수함을 포함한다. 바람직하게는 HPIV 클론 및 지지체 클론으로 형질감염된 숙주 세포는 HPIV 클론 및 지지체 클론의 HPIV 서열에 작동적으로 연결된 RNA 폴리머라제 프로모터에 상응하는 RNA 폴리머라제를 함유한다. 바람직한 양태에서, RNA 폴리머라제 프로모터에 작동적으로 연결된 HPIV-NP 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 지지체 클론이 또한 세포로 도입된다. 바람직하게는, 숙주 세포는 HPIV 클론 및 지지체 클론(들)으로의 형질감염 전에 또는 이와 병행하여 RNA 폴리머라제, 좀더 바람직하게는 T7 RNA 폴리머라제를 발현시키는 바이러스 재조합체, 바람직하게는 백시니아 바이러스 재조합체로 감염된다. 이러한 세포가 백시니아 바이러스 재조합체로 감염되는 경우, HPIV-3 클론은 또한 T7 RNA 폴리머라제 종결자의 업스트림에 백시니아 바이러스 RNA 폴리머라제 종결자와 T7 RNA 폴리머라제 종결자의 다운스트림에 백시니아 바이러스 RNA 폴리머라제 종결자를 포함한다.
본 발명은 또한 부위-특이성 돌연변이를 재조합 HPIV-3의 게놈으로 도입하는 방법에 관한 것이다. 방법은 HPIV-3 안티-게놈을 암호화하는 서열에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 변형된 HPIV-3 클론을 제조하고; 변형된 HPIV-3 클론과 HPIV- 3 P 단백질 및 HPIV-3 L 단백질, 바람직하게는 HPIV-3 NP 단백질을 암호화하는 지지체 클론을 세포로 도입한 다음; 변형된 HPIV-3 안티게놈 전사체의 형성 및 HPIV-3 L, P, 및 NP 단백질의 합성을 허용하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양함을 포함한다. 변형된 HPIV-3 클론 및 지지체 클론은 HPIV-3 단백질 암호화 서열에 작동적으로 연결된 RNA 폴리머라제 프로모터를 함유한다. 숙주 세포는 이의 세포질 내에 변형된 HPIV-3 클론 및 지지체 클론 상의 RNA 폴리머라제 프로모터에 상응하는 RNA 폴리머라제를 함유한다.
바람직하게는, 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 변형된 HPIV-3 클론은 HPIV-3 클론을 주형으로서 사용하는 통상적인 PCR 기술에 의해서 제조된다. 돌연변이는 HPIV-3 서열의 시스-작용 요소에서 또는 HPIV-3 단백질 암호화 서열에서 생성된다. 바람직하게는 돌연변이는 L 단백질-암호화 서열에서 생성된다. 돌연변이가 HPIV-3 클론의 HPIV-3 단백질 암호화 서열에서 생성되는 경우, 유사한 유형의 돌연변이가 상응하는 지지체 클론의 단백질 암호화 서열의 동일한 부위에서 생성되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 돌연변이가 HPIV-3 클론의 L 단백질 암호화 서열의 특정 부위에서 생성되는 경우, 동일한 돌연변이가 L 단백질 암호화 지지체 클론의 L 단백질 암호화 서열의 동일한 부위에서 생성되는 것이 바람직하다. 이러한 방법은 바이러스 입자의 합성을 억제하거나 비-감염성 또는 비-바이러스성 HPIV-3의 생성을 초래하는 돌연변이를 동정하는 데에 유용하다.
상기의 방법에 의해서 생성된 돌연변이 바이러스가 비-바이러스성, 즉, 약독화성인지를 측정하기 위해서, 돌연변이 바이러스를 먼저 돌연변이가 더 느린 생장 표현형을 유발시키는지, 즉, 돌연변이 바이러스가 야생형 바이러스 보다 조직 배양물에서 더 느리게 생장하는지 측정하기 위해서 시험관내에서 시험한다. 이러한 표현형을 나타내는 돌연변이 바이러스를 생체내에서 동물, 예를 들면, 파라인플루엔자 바이러스에 대한 양호한 실험 모델인 코튼 래트로의 주입에 의해서 시험한다. 이어서 감염된 동물을 이들이 HPIV-3에 대한 항체를 생성하는지를 측정하기 위해서 및 야생형 바이러스로 감염된 동물에 비해 심각한 증상에 있어 감소가 있는지를 측정하기 위해서 조사한다.
HPIV-3 유전자 및 시스-작용 요소 내에 특이적 변형을 함유하도록 유전 공학 처리된 재조합 HPIV-3 바이러스를 생성하는 능력은 모든 양태의 바이러스 복제 사이클에 대한 연구를 진척시킨다. 또한, HPIV-3 유전자 내에 특이적 변형을 함유하도록 유전공학 처리된 재조합 HPIV의 생성을 허용하는 시스템은 약독화 파라인플루엔자 유전자형의 동정 및 인간 파라인플루엔자 바이러스에 대한 생 백신 개발에 유용하다.
HPIV-3의 표준형 cDNA 클론의 제조방법 및 변형되고 돌연변이된 감염성 재조합 HPIV-3의 제조방법의 하기의 실시예는 설명을 목적으로 하는 것이고 본 발명의 범위를 제한하고자 하지 않는다.
실시예 1. HPIV-3의 표준형 cDNA 클론의 작제
특정 부위에 돌연변이를 함유하는 HPIV-3의 표준형 감염성 클론의 작제는 2 단계 공정에 의해서 달성된다. 초기 단계는 HPIV-3의 포지티브 센스 리더 부분 영역 및 트레일러 영역을 함유하는 미니레플리콘의 생성이다. 제 2 단계는 HPIV-3 게놈 RNA로부터 유도된 RT-PCR 단편의 미니레플리콘으로의 삽입을 수반한다. 포지티브 센스 미니레플리콘은 하기를 함유한다: 2 개의 비-바이러스 G 잔기의 합성을 지시하는 A T7 프로모터에 이어 HPIV-3의 포지티브-센스 리더 영역, NP 5'UTR의 부분(바이러스 염기 97로), 루시페라제 유전자, L 3'UTR의 부분(바이러스 염기 15387에서 시작) 및 HPIV-3의 트레일러 서열. HPIV-3 게놈의 표준형 뉴클레오티드 서열 및 리더 서열, 트레일러 서열 및 단백질 암호화 서열의 위치가 도 1에 도시되어 있다. 헤파티티스 델타 바이러스 안티게놈 리보자임이 3 개의 종결 HPIV-3 특정 염기 후 정확한 분할을 수행하기 위해서 이어진다. T7 RNA 폴리머라제 종결자를 또한 리보자임 서열이 이어지는 레플리콘으로 혼입한다. 또한, 백시니아 바이러스 폴리머라제 종결 시그널을 상술된 서열의 바로 업스트림 및 다운스트림에 삽입한다. 작제 도중, 시그널 염기 변화가 NP 5' UTR 및 L 3 UTR을 암호화하는 영역에서 생성된다. 바이러스 염기 94에서의 A의 G로의 변화 및 염기 15389에서 A의 G로의 변화는 각각 재조합 기원의 존재로서 바이러스를 동정하기 위한 유전자 표지의 역할을 하는 SacI 및 Stul 부위를 생성한다.
벡터 pOCUS-2(Novagen)를 이의 작은 크기(1930 bp)로 인하여 레플리콘[pPIV3-MG(+)] 제조를 위한 출발 플라스미드로서 선택한다. 작은 출발 플라스미드의 사용이 표준형 클론의 안정성을 증가시킬 수 있는 것으로 신뢰된다.
미니-레플리콘을 T7 프로모터 및 헤파티티스 델타 바이러스 안티게놈 리보자임 각각에 의해서 플랭킹된 리더 및 트레일러 영역을 암호화하는 PCR 산물을 생성 함으로써 작제한다. T7 프로모터/리더 영역의 합성에 사용되는 프라이머는 5'-TAGTCGGCCCTAATACGACTCACTATAGGACCAAACAAGAGAAGAAACT-3'(서열번호 2) 및 5'-GAAATTATAGAGCTCCCTTTTCT-3'(서열번호 3)이다. 제 1 프라이머는 EagI 부위를 암호화하고 T7 프로모터(밑줄친 부분) 및 제 2 프라이머는 SacI 부위를 생성하는 NP mRNA의 5' 비해독 영역(UTR) 내에 바이러스 염기 94에서의 A의 G로의 염기 변화(진하게 표시)를 도입한다. pHPIV3-CAT을 위한 주형이 본원에 참조로 인용되는 문헌[참조: De, B.P. and A. K. Banerjee. (1993) Rescue of synthetic analogs of genome RNA of human parainfluenza virus type 3. vir. 196:344-348]에 기재되어 있다. 생성된 PCR 산물을 도 2에 도시된 pOCUS-2의 EagI 및 SacI 부위로 클로닝한다. 트레일러/리보자임 영역의 합성에 사용되는 프라이머는;
5'-TAAGGCCTAAAGATAGACAAAAAGTAAGAAAAACATGTAATATATATATACCAAACAGAGTTCTTCT CTTGTTTGGTGGGTCGGCATGGCATCTC-3'(서열번호 4) 및 5'-CTGGGTACCTCCCTTAGCCATCCGA GT-3'(서열번호 5)이다. 제 1 프라이머는 트레일러를 통하여 L mRNA의 3' UTR로부터의 서열을 함유하고 리보자임(밑줄친 부분)의 합성을 개시한다. 또한, L mRNA의 3'UTR 내에 Stul 부위를 생성하는 바이러스 염기 15389에서 A의 G로의 변화(진하게 표시)는 이러한 프라이머에 의해서 암호화된다. 제 2 프라이머는 리보자임(밑줄친 부분) 및 BglII 부위의 3' 말단을 암호화한다. PCR 반응을 위한 주형은 상술된 문헌[참조: Perrotta, A. T. and M. D. Been. 1991)의 리보자임 서열을 함유하는 플라스미드 pSA1이다. 슈도놋(Pseudoknot)형 구조는 헤파티티스 델타 바이러스 RNA의 효율적인 자가-분할을 요한다[참조문헌: Nature 350:434- 436]. 이 반응으로부터 유도된 PCR 산물을 pOCUS-2의 StuI 및 BgIII으로 클로닝한다. T7/리더 클론의 EagI/PstI 단편을 트레일러/리보자임 클론의 PacI/PstI 부위로 전달함으로써 리더 및 트레일러 영역을 단일 클론에 결합시킨다.
잠재 백시니아 바이러스 프로모터로부터의 전사에 의한 가능한 방해를 억제하기 위해서 백시니아 바이러스 폴리머라제 전사 종결 시그널(TTTTTNT)을 pOCUS-2 내 PvuII 및 SspI 부위 주위의 레플리콘의 업스트림 및 다운스트림에 삽입한다. T7 전사 종결 시그널을 BlpI 및 BspEI로의 분해에 의해서 pET-17b로부터 제거하고 pOCUS-2의 SspI 부위(T4 DNA 폴리머라제로 평활화됨)로 삽입한다. 이어서 루시페라제 리포터 유전자를 도 3에 개략적으로 도시된 pPIV3-MG(+)를 생성하기 위해서 SacI 및 StuI 부위로 삽입한다.
표준형 HPIV-3 클론을 생성하기 위해서, 5 개의 RT-PCR 산물을 HPIV-3 비리온 RNA로부터 생성하고 클로닝한다. 이들 단편을 후속적으로 pHPIV-3 표준형 클론을 생성하기 위해서 루시페라제 암호화 서열을 대신하여 pPIV3-MG(+)로 삽입한다. 5 개의 RT-PCR 산물을 국립보건원의 Rober Chanock으로부터 입수된 HPIV-3 균주 47885 비리온 RNA로부터 생성한다. HPIV-3 게놈의 나머지를 포함하는 이들 PCR 산물을 제한 효소 분석에 의해서 동정하고 pUC19 또는 pOCUS-2에서 클로닝한 다음 pPIV3-MG(+)로 삽입한다.
바이러스 염기 83 내지 2721을 함유하는 제 1 PCR 산물을 pUC19의 SmaI 부위로 삽입한다. 83/2721 클론을 SacI 및 XmnI로 분해하고, pPIV3-MG(+)의 SacI 및 SphI(T4 DNA 폴리머라제로 평활화됨)으로 삽입된 바이러스 염기 94 내지 553을 제 거한다. 이어서 83/2721 클론을 바이러스 염기 540 내지 2274를 함유하는 단편을 제거하기 위해서 PstI로 분해한 다음 94/554 단편을 함유하는 pPIV3-MG(+) 클론의 PstI 부위로 삽입한다. 바이러스 염기 13395 내지 15397을 포함하는 제 2 PCR 산물을 pUC19의 SmaI 부위로 클로닝한다. 이러한 13395/15397 클론을 Stul 및 PacI로 분해하고 바이러스 염기 13632 내지 15381을 함유하는 생성된 단편을 염기 2274까지의 바이러스 염기를 함유하는 pPIV3-MG(+) 클론의 Stul 및 PacI 부위로 삽입한다. 생성된 클론은 pPIV3-MG(+) 배경에서 바이러스 염기 1 내지 2274 및 13632 내지 15462를 함유한다.
바이러스 염기 7403 내지 11513을 함유하는 제 3 PCR 산물을 pOCUS-2의 XhoI 및 SspI 부위로 삽입된 염기 7437 내지 11444를 함유하는 단편을 생성하기 위해서 BspMI(T4 DNA 폴리머라제로 평활화됨) 및 XhoI로 분해시킨다. 바이러스 염기 10904에서 13773을 함유하는 제 4 PCR 단편을 PvuII 및 BamHI(바이러스 염기 10918 내지 13733)로 분해시키고 pUC19의 EcoRI(T4 DNA 폴리머라제로 평활화됨) 및 BamHI 부위로 삽입한다. 2 개의 바이러스 단편을 7437/11444 클론을 SacI(T4 DNA 폴리머라제로 평활화됨) 및 EcoNI로 분해시키고 EcoRI(T4 DNA 폴리머라제로 평활화됨) 및 EcoNI로 분해된 10918/13733으로 삽입함으로써 결합시킨다. 생성된 클론은 pUC19 배경에서 바이러스 염기 7437 내지 13733을 함유한다. 바이러스 서열의 나머지는 XmnI 및 XhoI(바이러스 염기 553 내지 7437)로 분해된 바이러스 염기 83 내지 7457을 함유하는 제 5 PCR 산물로부터 유도하고 pOCUS-2의 StuI 및 XhoI로 클로닝한다. 7437/13733 클론을 T4 DNA 폴리머라제로 평활화된 BamHI로 분해하고 EagI(T4 DNA 폴리머라제로 평활화됨) 및 XhoI 분해 553/7437 클론으로 삽입되는 단편을 방출시키기 위해서 XhoI로 분해한다. 생성된 클론은 바이러스 염기 553 내지 13733을 함유한다. 이어서 이러한 클론을 PshAI 및 PacI로 분해하고 바이러스 염기 2143 내지 13632를 함유하는 생성된 단편을 바이러스 1 내지 2274 및 13632 내지 15462를 함유하는 pPIV3-MG(+)의 동일한 부위로 삽입한다. 이는 도 4에 개략적으로 도시된 감염성 클론인 pHPIV-3을 생성한다.
P 유전자를 pGEM-4로 삽입하기 위해서, P 서열을 XbaI(T4 DNA 폴리머라제로 평활화됨) BamHI로 분해함으로써 P-lac-융합 클론으로부터 전달하고(본원에 참조로 인용되는 문헌 38에 기재됨), pGEM4의 Kpnl(T4 DNA 폴리머라제로 평활화됨) 및 BamHI 부위로 삽입한다. 본원에 참조로 인용된 문헌 15, 16에 기재된 pPIV3-NP 및 pPIV3-L 클론은 pGEM-4 배경이다. pPIV3-L 클론을 또한 변형시킨다. 천연 L mRNA 서열에서 전사체 5' 말단으로부터의 비-개시 AUG 11 뉴클레오티드는 존재하지 않는다. 이것은 바이러스 염기 8636 및 8637을 AT로부터 TA로 변화시키는 돌연변이 PCR에 의해서 pPIV3-L로부터 제거된다.
실시예 2. 재조합 HPIV-3의 제조
6-웰 플레이트의 HeLa 세포의 융합성 단층을 2번의 중복 감염으로 재조합 백시니아 바이러스 vTF7-3으로 감염시킨다. vTF7-3은 본원에 참조로 인용되는 문헌[참조: Fuerst, T. R., P. L. Earl, and B. Moss. 1987. "Use of a hybrid vaccinia virus-T7 RNA polymerase system for expression of target genes" Mol. Cell. Biol. 7:2538-2544, and Fuerst, T. R., E. G. Niles, F. W. Studier, and B. Moss. 1986. "Eukaryotic transient-expression system based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase." Proc. Natl. Acad. Sci. 83:8122-8126]에 기재된 바와 같이 T7 RNA 폴리머라제를 발현시킨다. 37 ℃에서 1 시간 후, pPIV3-NP, pPIV3-P, pPIV3-L 및 pHPIV3을 제조 지시에 따라 리포펙틴(BRL)을 사용하여 형질감염시킨다. 3 시간 후 형질감염 배지를 제거하고 1.5 ml Dulbecco의 변형된 Eagle's 배지(DMEM)/5 % 태송아지 혈청으로 대체한다. 40 내지 48 시간 후, 플레이트를 동결시키고, 해빙한 다음 긁어낸다. 분리된 배지 상등액(250 μl)을 6-웰 플레이트의 미사용 HeLa 세포 단층을 감염시키기 위해서 사용한다. 백시니아 바이러스 복제를 억제하기 위한 25 μg/ml I-B-D-아라비노퓨라노실시토신(araC)을 함유하는 DMEM(1.5 ml)을 1 시간 후 첨가한다. 40 시간 후 플레이트를 동결시키고 해동시킨 다음 긁어낸다. 분리된 배지 상등액을 AraC의 존재하에 HPIV-3에 대해 적정한다. 적정 도중, 분리된 플라크를 아가 플러그로서 취한다. 아가 플러그를 4 ℃에서 4 시간 동안 500 ml opti-MEM에 배치한다. 250 μl를 40 시간 동안의 플라크 분리물의 증폭을 위해 미사용 HeLa 세포 단층을 감염시키는 데에 사용한다.
바람직한 양태에서 형질감염 조건은 1 μg pHIV-3, 2 μg pPIV3-NP, 4 μg pPIV3-P 및 0.1 μg pPIV3-L이다. 이러한 조건을 사용하여 6 x 105 세포당 약 1000 pfu를 초기 형질감염 동안 수득하고 6 x 105 세포당 약 106 pfu를 증폭 후 수득한다.
개별 플라스미드가 형질감염 단계로부터 생략되는 경우, pHIV-3, pPIV3-P 및 pPIV3-L 플라스미드가 바이러스 회수를 위해 요구되지만, 놀랍게도 표 1에 예시된 바와 같이 pPIV3-NP에는 요구되지 않음이 관찰된다.
| 감염된 플라스미드 | ||||
| HPIV-3 | NP | P | L | 바이러스 회수 |
| + | + | + | + | 14/15a |
| _ | + | + | + | 0/2 |
| + | - | + | + | 3/3b |
| + | + | _ | + | 0/3 |
| + | + | + | _ | 0/2 |
| HeLa 세포 단층을 vTF7-3으로 감염시키고 표시된 플라스미드로 형질감염시킨다. 40 시간 후 세포를 용해시키고 상등액을 vTF7-3 복제를 억제하기 위해서 araC의 존재하에 미사용 HeLa 세포 단층에 첨가한다. 이어서 이러한 단층을 용해시키고 상등액을 HPIV-3에 대해 분석한다. 시도당 HPIV-3이 회수되는 실험의 수가 바이러스 회수 하에 표시된다. A HPIV-3을 수득하지 않는 단일 실험은 P 플라스미드 0.1 ug를 사용한다. B NP 플라스미드의 생략은 HPIV-3의 3 내지 5 배 더 낮은 적정을 초래한다. | ||||
회수된 바이러스의 특징규명
회수된 바이러스의 특징을 규명하고 HPIV-3을 vTF7-3으로부터 정제하기 위해서, HPIV-3이라고 생각되는 HPIV-3 분리된 플라크의 것보다 약간만 더 작은 플라크를 취하여 HeLa 세포에서 증폭시킨다. 플라크 정제되고 증폭된 바이러스 분리물과 적합한 대조군을 영양화 분석으로 분석한다. 바이러스(분리물 #3 및 #5)를 5 ul 토끼 예비-면역 혈청, 5 ul 토끼 폴리클론 항-HPIV-3 항혈청으로 예비배양하거나(얼음에서 30 분) 25 ug/ml araC의 존재하에 분석한다. 혈청을 표준 플라크 분석 전에 바이러스와 함께 얼음에서 30 분 동안 배양한다. 최대 플라크 생성을 위해서, 플레이트를 크리스탈 바이올렛으로 염색하기 전에 37 ℃에서 66 시간 동안 배양한다. 분석 결과는 플라크 정제된 바이러스가 항-HPIV-3 항혈청에 의해서 완전히 억제되고 vTF7-3은 억제되지 않음을 나타낸다. 대조적으로, HPIV-3 분리물은 AraC에 의해서 억제되지 않고, 반면에 vTF7-3은 완전히 억제된다. 흥미롭게도, 8 개의 재조합 HPIV-3 분리물 중에서 4 개는 모 HPIV-3 스톡과 동일한 플라크 크기를 갖지만 4 개는 약간 더 크다. 분리물 #3의 플라크 크기는 분리물 #5 및 야생형 HPIV-3 바이러스 보다 약간 더 크다.
pPIV3-MG(+)에서 루시페라제와 동일한 위치를 공유하는 pHPIV-3의 NP 암호화 서열이 pHPIV-3으로부터 발현되는지를 측정하기 위해서, pHPIV-3 및 pPIV3-NP를 vTF7-3 감염된 HeLa 세포로 개별적으로 형질감염시키고 48 시간 후 세포 목록을 작성한다. 이어서 용해물을 항-HPIV-3RNP 항혈청을 사용하여 웨스턴 블로팅에 의해서 분석한다. 이러한 항혈청은 주로 NP를 인식하고 P와 불량하게 반응한다.
구체적으로, 추출물(6 x 104 세포 당량)을 SDS-10% PAGE에 러닝하고 니트로셀룰로스 막으로 전달한다. 1차 항체는 1:1000으로 희석된 토끼 폴리클론 항-RNP 항혈청이다. 2차 항체는 호스래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 염소 항-토끼 항체의 1:1000 희석물이다. 화학발광물질(ECL kit, Amersham)을 통하여 가시화된다. 웨스턴 블롯에 의해서 예시되는 바와 같이, HPIV-3 RNP는 pPIV-NP 및 pHPIV-3 형질감염 세포 추출물로부터의 NP 및 정제된 HPIV-3 RNP로부터의 NP를 인식한다. 어떠한 단백질도 가짜-형질감염된 HeLa 추출물에서 인식되지 않는다. 따라서, NP는 아마도 T7-지향 안티게놈 RNA 전사체로부터 해독된 pHPIV-3로부터 발현되는 것으로 보인다.
회수된 재조합 바이러스가 게놈에 특이적인 돌연변이를 지니는지를 측정하기 위해서, RNA를 야생형 및 플라크 분리 바이러스로부터 추출하고 치환 돌연변이를 플랭킹하는 프라이머를 사용하여 RT-PCR 분석에 사용한다. 바이러스 RNA를 플라크 정제 바이러스 분리물 #3, 5, 7 및 9 또는 wt HPIV-3 균주 47885의 약 2 x 107 플라크 형성 단위(pfu)로부터 분리한다. 역전사를 Superscript II 역 트랜스크립타제 (BMB)를 44 ℃에서 1 시간 동안 사용하여 23 또는 15100에서 개시하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행한다. PCR을 바이러스 염기 23 내지 303, 또는 15100 내지 15440의 증폭을 유발하는 제 2 프라이머를 사용하여 Expand Long 폴리머라제(BMB)로 수행한다.
바이러스 염기 1 내지 324 및 15080 내지 15462를 포함하는 PCR 산물을 각각 SacI 및 StuI으로 분해된 표시된 분리물로부터 생성하고 1.4 % 아가로스 겔에서 분석한다. 예상된 크기의 PCR 산물을 PCR 산물이 오염 플라스미드 DNA 보다 RNA로부터 유도됨을 나타내는 RT-의존 방식으로 생성한다.
아가로스 겔에서 예시된 바와 같이, 1 내지 324 및 15080 내지 15462 PCR 산물의 크기는 증폭 프라이머의 제한 효소 부위의 포함으로 인하여 바이러스 특이적 영역 길이에 걸쳐서 각각 21 및 22 염기쌍씩 증가된다. SacI로의 분해는 염기 94에서의 돌연변이가 야생형 바이러스에 존재하지 않지만, 플라크 분리 바이러스에 존재함을 예시하고 이들이 재조합 기원임을 나타낸다. 유사하게도, 야생형 HPIV- 3의 바이러스 염기 15389를 포함하는 영역으로부터 유도된 PCR 산물은 StuI에 의해서 분할되지 않는다. 그러나, 8 개의 플라크 분리 바이러스 중 4 개만이 StuI 부위를 생성하는 돌연변이를 함유한다. PCR 산물의 직접 서열화가 이러한 결과를 확실하게 한다.
HPIV-3 게놈, pHPIV-3의 표준형 플라스미드 클론을 작제한다. pHPIV-3 및 바이러스 NP, P 및 L 단백질을 암호화하는 플라스미드의 vTF7-3 감염 HeLa 세포로의 형질감염시 유전자 마커를 생성하는 재조합 HPIV-3이 효율적으로 제거된다. 이러한 시스템의 여러 흥미로운 특성이 주지된다. 첫째, 바이러스 NP 단백질은 감염 클론으로부터 발현될 수 있고, 이러한 발현은 NP 지지체 플라스미드의 필요를 제거한다. NP 단백질은 백시니아 바이러스 캡핑 유전자에 의해서 캡핑된 후 1차 안티게놈 전사체로부터 직접 합성된다.
둘째, 개별 유전자형 및 표현형을 갖는 두 재조합 바이러스가 RNA 복제 도중 역위가 일어날 가능성을 배제할 수 없지만 아마도 pHPIV-3 및 pPIV3-L 플라스미드간 재조합으로 인하여 생성된다. pPIV3-L은 전체 L 3'UTR과 염기 15437까지 뻗어있는 테일러 영역 일부 및 StuI 부위를 넘어 48 쌍의 중첩부를 함유한다. 이는 백시니아 바이러스 감염 세포에서 수월하게 일어나는 플라스미드간 재조합을 위한 충분한 공간이다.
이러한 결과로부터, HPIV-3 시스템에서 선택이 일어나는 것으로 보인다. 모든 거대 플라크 바이러스 분리물은 염기 94에 변화를 보유하면서 염기 15389에서 야생형 서열로 복귀된다. A94G이 모 바이러스로부터 이러한 바이러스에서 공지된 유일한 변형이다. 두 돌연변이 모두를 보유한 분리물은 모(야생형) 바이러스의 플라크 크기와 동일한 플라크 크기를 지니지만, 15389 돌연변이가 손실될 경우, 플라크 크기가 증가한 것으로 보이며, 이는 15389에서의 돌연변이가 A94G 돌연변이 배경에서 유해함을 나타낸다. pHPIV-3 및 지지체 플라스미드 사이에 하나의 다른 공지된 변화가 존재한다. 비-개시 AUG가 천연 L 단백질 메세지에 존재한다. 이러한 AUG가 L mRNA의 5' 말단으로부터 및 불량한 해독 개시 배경에서 단지 11 개 뉴클레오티드이므로, 이는 L mRNA 해독에 많은 방해를 초래할 수 없다. 그러나, 지지체 플라스미드 pPIV3-L에서 이러한 비-개시 AUG는 이것이 리보좀에 의해서 더 잘 인식되는 것으로 보이는 전사체의 5' 말단으로부터 훨씬 더 멀다. 이러한 AUG는 염기 8636 및 8637을 AT로부터 TA로 변화시키고 SphI 부위를 파괴한 다음 NheI 부위를 생성함으로써 pPIV3-L로부터 제거된다. 이러한 변화가 재조합 바이러스에 존재하고 거대 플라크 표현형을 책임지는지를 조사하기 위해서, RT-PCR 반응을 수행한다. 이러한 부위를 포함하고 야생형 및 플라크 분리 바이러스로부터 유도된 PCR 산물은 야생형 서열을 보유하고, 이는 재조합이 이러한 영역에 대해서 일어나지 않고 이러한 변화가 플라크 크기의 변화를 설명할 수 없음을 나타낸다.
재조합이 형질감염된 플라스미드 사이에서 일어날 수 있다는 발견은 돌연변이를 파라마익소바이러스 또는 랍도바이러스 감염성 클론 시스템으로 도입할 경우 주의를 기울여야 함을 나타낸다. NP, P 또는 L 서열 내에 도입된 돌연변이는 바람직하게는 지지체 플라스미드와 감염성 클론에 의해서 운반된다. 또한, 생성된 바이러스는 원하는 돌연변이를 운반할 수 없다. 이에 대해 가능한 유일한 예외는 HPIV-3 감염성 클론이 발현되고 NP 지지체 플라스미드에 대한 필요성을 제거하는 HPIV-3 시스템이다. 또한, 지지체 NP 플라스미드가 형질감염에 포함되는 경우 상당히 더 큰 수율의 HPIV-3이 수득되므로 HPIV-3 NP 지지체 플라스미드가 시스템에 포함되는 것이 바람직하다.
HPIV-3에 대한 감염성 클론은 HPIV-3에 대한 분자 생물학을 이해하고 이러한 중요한 병원체에 대한 백신을 개발하는 데에 유용하다. HPIV-3 내에 특정한 돌연변이를 생성하는 능력은 모든 양태의 HPIV-3 복제를 연구될 수 있게 한다. 다른 문맥에서 미리 연구된 것들을 포함하는 임의의 돌연변이가 이러한 시스템으로 조사될 수 있다. 특정 돌연변이를 도입하는 능력은 또한 복귀돌연변이체 분석을 가능하게 하고 단백질-단백질 또는 단백질-RNA 상호작용의 이해를 명백히 할 수 있다.
감염성 클론은 또한 바이러스를 약독화시키는 돌연변이를 동정하는 데에 유용하다. 이러한 바이러스는 HPIV-3의 새로운 백신을 개발하는 데에 유용하다. 또한, HPIV-3의 현재 후보 백신 균주에 존재하는 돌연변이가 pHPIV-3으로 삽입될 수 있다. 다수의 유해한 돌연변이의 동정을 통하여, 바이러스 생활환의 다양한 단계에 영향을 미치는 여러 돌연변이를 HPIV-3 균주로 공학처리함이 가능해져야 한다. 이러한 바이러스는 매우 약독화되고 쉽게 복귀될 수 없어야 한다.
본 발명은 약간 특별하게 기재되었지만, 청구의 범위에 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 개조 및 변형이 제조될 수 있다.
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- a. i. 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3(HPIV-3)의 포지티브 센스 안티게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론(HPIV-3 클론); 및ii. 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3의 L 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론(L 클론),인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3의 NP 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론(NP 클론), 및인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3의 P 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론(P 클론)으로 구성되는, 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3의 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 클론의 세트를 포함하고, 상기에서 P 단백질, NP 단백질 및 L 단백질을 암호화하는 서열이 동일한 클론 또는 서로다른 클론 상에 존재할 수 있는 재조합 시스템을 제공하는 단계;b. 단계 a의 재조합 시스템을 숙주 세포로 도입하는 단계;c. 단계 b의 숙주 세포를 숙주 세포의 형질감염과 재조합 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 배양하는 단계;d. 재조합 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3을 형질감염된 숙주 세포의 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는 재조합 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3의 제조방법.
- 제 10 항에 있어서, HPIV-3 클론의 안티게놈 암호화 서열이 RNA 폴리머라제 프로모터에 작동적으로 연결되고;P 클론의 P 단백질 암호화 서열이 RNA 폴리머라제 프로모터에 작동적으로 연결되며;L 클론의 L 단백질 암호화 서열이 RNA 폴리머라제 프로모터에 작동적으로 연결되며;NP 클론의 NP 단백질 암호화 서열이 RNA 폴리머라제 프로모터에 작동적으로 연결되며;숙주 세포가 상기 HPIV-3 클론 및 상기 P 단백질, NP 단백질 및 L 단백질 암호화 서열을 포함하는 클론들의 RNA 폴리머라제 프로모터에 상응하는 RNA 폴리머라제를 포함하는 방법.
- 제 11 항에 있어서, 숙주 세포가 재조합 시스템의 숙주 세포로의 도입 전에 또는 이와 병행하여 RNA 폴리머라제를 발현시킬 수 있는 바이러스 재조합체에 의해 감염되는 방법.
- a. 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3의 포지티브 센스 안티게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 HPIV-3 클론;b. 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3의 L 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론; 및c. 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3의 P 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론을 포함하고, 상기에서 P 단백질 및 L 단백질을 암호화하는 서열이 동일한 클론 또는 서로다른 클론 상에 존재할 수 있는, 재조합 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3의 생성을 위한 숙주 세포.
- 제 13 항에 있어서, 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3 NP 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론을 추가로 포함하는 숙주 세포.
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- 제 14 항에 있어서, 상기 HPIV-3 클론이 HPIV-3 안티게놈 서열에 작동적으로 연결된 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하고, 상기 (b) 및 (c)의 클론들 각각이 이들 클론들의 HPIV-3 단백질-암호화 서열에 작동적으로 연결된 RNA 폴리머라제 프로모터를 포함하는 숙주 세포.
- a. 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 3 내지 12개의 뉴클레오티드의 결실, 및 3 내지 12개의 뉴클레오티드의 첨가로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나의 부위 특이성 돌연변이를 갖는 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3(HPIV-3) 안티게놈을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론을 제조하는 단계,상기에서 돌연변이는 상기 HPIV-3 안티게놈을 암호화하는 서열의 시스 작용 요소 또는 단백질 암호화 서열에 존재한다;b. 단계 a의 클론 및 하기 클론들로 숙주세포를 공-형질감염시키는 단계,i) HPIV-3 L 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론,ii) HPIV-3 NP 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론, 및iii) HPIV-3 P 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 클론,상기에서 P 단백질, NP 단백질 및 L 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 동일한 클론 또는 서로다른 클론 상에 존재할 수 있으며, HPIV-3 안티게놈을 함유하는 클론내 부위 특이성 돌연변이가 P 단백질 암호화 서열, NP 단백질 암호화 서열 또는 L 단백질 암호화 서열 각각에 존재하는 경우, P 단백질, NP 단백질 및 L 단백질을 암호화하는 서열이 동일한 부위 특이성 돌연변이를 포함한다;c. 부위 특이성 돌연변이를 함유하는 재조합 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 형질감염된 숙주 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 부위-특이성 돌연변이를 재조합 인간 파라인플루엔자 바이러스의 게놈으로 도입하는 방법.
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- 제 18 항에 있어서, 단계 a의 클론이 폴리머라제 연쇄 반응 기술을 사용하여 제조되는, 부위-특이성 돌연변이를 재조합 인간 파라인플루엔자 바이러스의 게놈으로 도입하는 방법.
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