JP2002512519A - ヒトパラインフルエンザウイルス３型の感染性クローン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 組み換えヒトパラインフルエンザウイルス、特に感染性の組み換えヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ−３）を作製するための系が提供される。一つの態様として、系はＨＰＩＶの全長の正のセンスのアンチゲノムをコードするヌクレオチド配列を含んでなるクローン、並びにＨＰＩＶ Ｐタンパク質及びＨＰＩＶ Ｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる少なくとも１つの支持クローンを含んでなる。別の態様として、系はＨＰＩＶ ＮＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる支持クローンをさらに含んでなる。また、本発明はＨＰＩＶ−３の全長の正のセンスのアンチゲノムをコードするヌクレオチド配列を含んでなるクローンも提供する。そのクローンはＨＰＩＶ−３アンチゲノムをコードする配列に機能的に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターも含んでなる。好ましい態様として、クローンはＨＰＩＶ−３アンチゲノムをコードする配列からすぐ下流にリボザイムをコードするヌクレオチド配列をさらに含んでなる。また、本発明はＨＰＩＶ−３ゲノム中に部位特異的突然変異を有する組み換えＨＰＩＶ−３ウイルスの製造方法にも関する。その方法は改変されたＨＰＩＶ−３アンチゲノムをコードする配列を含んでなるクローンを調製し；改変されたＨＰＩＶ−３クローン並びにＨＰＩＶ−３ Ｐタンパク質、ＨＰＩＶ−３ Ｌタンパク質及び好ましくはＨＰＩＶ−３ ＮＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる支持クローンを宿主細胞中に導入し；そして改変されたＨＰＩＶ−３アンチゲノム並びにＨＰＩＶ−３のＬ、Ｐ及びＮＰタンパク質の合成を与える条件下で宿主細胞を培養することを含んでなる。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトパラインフルエンザウイルス３型の感染性クローン 本研究はアレルギー及び感染症研究所からの国立衛生研究所補助金番号３２０ ２７により部分的に援助された。政府は本発明における権利を有することができ る。 背景 ヒトにおける呼吸器感染の原因として１９５６年に認められたヒトパラインフ ルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）は、子供における呼吸器疾患の４〜２２％を占め ると考えられ、この点ではＲＳウイルスを除けば１番である。ＨＰＩＶは肺炎及 び気管支炎のような下部気道疾患の重要な原因であり、幼児におけるクループの 最も一般的な原因である。４種のＨＰＩＶ血清型１−４のうち３型ウイルス（Ｈ ＰＩＶ−３）が最高の毒力を示すものと思われ、生後１カ月の間に気管支炎及び 肺炎を頻繁に引き起こす。 残念なことに、ＨＰＩＶにより引き起こされる感染を防ぐかまたは処置するた めに用いることができる有効なワクチンまたは抗ウイルス治療は現在のところ入 手されていない。ウイルスの熱不活化または化学処理のような不活性ウイルスを 製造するために用いられる標準法は、ＨＰＩＶ−３を初めとする全てのＨＰＩＶ 株及び血清型でうまくいっていない。さらに、弱毒化ウイルスを製造するための 標準法は任意の部位で突然変異をもたらし、特定の部位でＨＰＩＶゲノムを改変 するかまたはゲノム中に導入される突然変異の数を制御することができない。 ヒトパラインフルエンザウイルスはパラミキソウイルス科ファミリー内のパラ ミキソウイルス属のメンバーであるエンベロープで囲まれた一 本鎖の負のセンスのＲＮＡウイルスである。ヒトパラインフルエンザウイルスゲ ノム（ｖＲＮＡ）の複製はパラミキソウイルス科ファミリーの他のメンバーのも のに類似している。細胞の感染時には、転写が主要なＲＮＡ合成事象であり、負 のセンスのゲノム、すなわちｖＲＮＡからウイルスｍＲＮＡの生産をもたらす。 感染の後で、ＲＮＡ複製への移行が起こり、全長アンチゲノムの正のセンスのＲ ＮＡの合成をもたらし、それはさらなる負のセンスのゲノムＲＮＡの合成の鋳型 として働く。ゲノムＲＮＡの転写及び複製はヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ Ｐ）によりキャプシドで包まれた１５４６２ヌクレオチドのゲノムＲＮＡ、並び に密接に会合したリンタンパク質（Ｐ）及びラージ（Ｌ）ポリメラーゼタンパク 質からなるリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の形成に依存している。また、い くつかの宿主細胞因子もＨＰＩＶの複製周期に関与している。 ＨＰＩＶの完全なＲＮＰの必要条件は無細胞系におけるＨＰＩＶ転写及び複製 の分析を妨げている。インビトロでＨＰＩＶ−３ ｖＲＮＡをキャプシドで包む 努力は失敗しており、正のセンスのＲＮＡウイルスと異なり、包まれていないＨ ＰＩＶ ｖＲＮＡは感染力がない。さらに、現在、組み換え感染性ＨＰＩＶ−３ を初めとする組み換えＨＰＩＶを製造するためのいかなる既知の系もない。 従って、組み換えＨＰＩＶ、特に組み換え感染性ＨＰＩＶ−３を製造すること ができる新規な試薬、系及び方法が必要とされている。ＨＰＩＶ、特にＨＰＩＶ −３のゲノム中に１つまたはそれ以上の部位特異的突然変異を導入することがで きる組み換え系が望ましい。ヒトパラインフルエンザウイルスＲＮＡの転写また は複製に対する部位特異的突然変異 の影響を特性化すること及び弱毒化されたＨＰＩＶの製造につながる部位特異的 突然変異を同定することができる組み換え系が特に望ましい。 発明の要約 本発明により、組み換えヒトパラインフルエンザウイルス、特に感染性の組み 換えヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ−３）を作製するための系 が提供される。一つの態様として、系はＨＰＩＶの全長の正のセンスのアンチゲ ノムをコードするヌクレオチド配列を含んでなるクローン、並びにＨＰＩＶ Ｐ タンパク質及びＨＰＩＶ Ｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んで なる少なくとも１つの支持クローン（ｓｕｐｐｏｒｔ ｃｌｏｎｅ）を含んでな る。別の態様として、系はＨＰＩＶ ＮＰタンパク質をコードするヌクレオチド 配列を含んでなる支持クローンをさらに含んでなる。好ましくは、系のクローン の各々はクローン内に含まれるそれぞれのＨＰＩＶヌクレオチド配列に機能的に 連結されているＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含んでなる。 また、本発明はＨＰＩＶ−３の全長の正のセンスのアンチゲノムをコードする ヌクレオチド配列を含んでなるクローンも提供する。クローンはＨＰＩＶ−３ア ンチゲノムをコードする配列に機能的に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモー ターも含んでなる。好ましい態様として、クローンはＨＰＩＶ−３アンチゲノム をコードする配列からすぐ下流にリボザイムをコードするヌクレオチド配列をさ らに含んでなる。 また、本発明はＨＰＩＶ−３ゲノム中に部位特異的突然変異を有する組み換え ＨＰＩＶ−３ウイルスの製造方法にも関する。その方法は改変されたＨＰＩＶ− ３アンチゲノムをコードする配列を含んでなるクローンを調製し；改変されたＨ ＰＩＶ−３クローン並びにＨＰＩＶ−３ Ｐ タンパク質、ＨＰＩＶ−３ Ｌタンパク質及び好ましくはＨＰＩＶ−３ＮＰタン パク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる支持クローンを宿主細胞中に 導入し；そして改変されたＨＰＩＶ−３アンチゲノム並びにＨＰＩＶ−３のＬ、 Ｐ及びＮＰタンパク質の合成を与える条件下で宿主細胞を培養することを含んで なる。 ＨＰＩＶ−３遺伝子及びシス作動性エレメント内に部位特異的突然変異を含有 するように遺伝子的に設計された組み換えＨＰＩＶ−３ウイルスを製造できるこ とにより、ウイルス複製周期の全ての面の研究が促進される。従って、ＨＰＩＶ −３ゲノム内に部位特異的突然変異を含有するように遺伝子的に設計されている 組み換えＨＰＩＶの製造を可能にする系は、弱毒化するパラインフルエンザ遺伝 子型を同定するため及びヒトパラインフルエンザウイルスの生ワクチンを開発す るために有用である。 図面の簡単な説明 図１はＨＰＩＶ−３ゲノムのヌクレオチド配列のＤＮＡ型を示し、ゲノムの制 限部位の位置、リーダー配列、トレーラー配列及びタンパク質をコードする領域 を示す。 図２はｐＯＣＵＳ−２^TM（商標）ベクターの制限地図である。 図３はリーダー配列、ルシフェラーゼをコードする領域並びにＴ７プロモータ ー及びターミネーターの位置を示すｐＭＧ（＋）の制限地図である。 図４はＨＰＩＶ−３のリーダー配列及びタンパク質をコードする領域の位置を 示すｐＨＰＩＶ−３の制限地図である。 図５は全長の感染性クローンｐＨＰＩＶ−３の図式的表現である。Ｖ Ｖφ、ワクシニアウイルスポリメラーゼ停止シグナル（ＴＴＴＴＴＮＴ）：Ｔ７ 、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；ｌｅ、ＨＰＩＶ−３リーダー配列；Ｎ Ｐ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ及びＬはＨＰＩＶ−３タンパク質コーディング領域であり ；ｔｒ、ＨＰＩＶ−３トレーラー配列；Ｒｚ、デルタ肝炎ウイルスアンチゲノム のリボザイム；Ｔ７φ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼターミネーターシグナル。置 換突然変異を含有する領域を拡大し、特定の変異を示して上に示す。ウイルス塩 基９２でのＡ→Ｇ変異はＳａｃＩ部位をもたらし、ウイルス塩基１５３８９での Ａ→Ｇ変異はＳｔｕＩ部位をもたらす。 発明の詳細な説明 本発明により組み換えヒトパラインフルエンザウイルスを作製するための系が 提供される。好ましい態様として、その系は組み換えＨＰＩＶ−３を作製するた めに用いられる。系は以下「ＨＰＩＶクローン」と呼ばれるＨＰＩＶの全長の正 のセンスのアンチゲノムをコードするヌクレオチド配列、好ましくは二本鎖ＤＮ Ａ配列を含んでなるクローン、並びにＨＰＩＶ Ｐタンパク質及びＨＰＩＶ Ｌタ ンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる１つまたはそれ以上の支持 クローンを含んでなる。ＨＰＩＶ Ｐタンパク質及びＨＰＩＶ Ｌタンパク質をコ ードするヌクレオチド配列は同じクローン内であってもよい。しかしながら、操 作を容易にするために、ＨＰＩＶ Ｐタンパク質及びＨＰＩＶ Ｌタンパク質をコ ードするヌクレオチド配列は別々のクローン上にあることが好ましい。好ましく は、ＨＰＩＶクローンはＨＰＩＶ−３アンチゲノムをコードする配列を含んでな る。好ましくは、支持クローンまたは複数のクローンはＨＰＩＶ−３のＰタンパ ク質及びＬタンパク質をコードする。 別の態様として、系はＨＰＩＶ ＮＰタンパク質、好ましくはＨＰＩＶ−３ ＮＰ タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる支持クローンをさらに含 んでなる。 本明細書に用いられる場合「クローン」は、細胞中に導入し、発現させること ができる二本鎖ＤＮＡをさす。クローンは例えばワクシニアウイルスベクターの ようなウイルスベクターの形態または好ましくはプラスミドの形態であってもよ い。好ましくは、ＨＰＩＶクローン及び支持クローンは各々ＲＮＡポリメラーゼ プロモーター、より好ましくはＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含んでな る。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの各々はクローン中の対応するＨＰＩＶを コードする配列に機能的に連結される。従って、ＨＰＩＶクローン上のＲＮＡポ リメラーゼプロモーターはＨＰＩＶ配列に機能的に連結され、支持クローン上の ＲＮＡポリメラーゼプロモーターはそれぞれのＨＰＩＶタンパク質をコードする 配列または複数の配列に機能的に連結される。好ましくはクローンを含んでなる プラスミドは複製起点、特にバクテリアの複製起点も含んでなる。 また、本発明は以下「ＨＰＩＶ−３クローン」と呼ばれるＨＰＩＶ−３のアン チゲノム配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるクローンも提供する。 好ましくは、ＨＰＩＶ−３クローンはＨＰＩＶ−３の全長のアンチゲノム配列を コードする。本明細書に用いられる場合「全長」は、アンチゲノム配列がＨＰＩ Ｖ−３ゲノムのリーダー配列の３’ヌクレオチドからトレーラー配列の５’ヌク レオチドまでに及ぶＨＰＩＶ−３の全体の負のセンスのゲノム配列に相補的であ ることを意味する。ＨＰＩＶ−３の全長ゲノム配列のＤＮＡ型、配列番号：１を 図１に示す。 リーダー及びトレーラー配列に加えて、ＨＰＩＶ−３クローンはＨＰＩＶ−３タ ンパク質Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ及びＬをコードする配列並びにシス作動性エレメ ントを含有する。ＨＰＩＶ−３クローンは野生型ＨＰＩＶ−３アンチゲノム配列 または１つもしくはそれ以上の突然変異が中に含まれる改変されたＨＰＩＶ−３ アンチゲノムをコードすることができる。突然変異はＨＰＩＶ−３アンチゲノム をコードする配列中に挿入される外来遺伝子の形態であってもよい。好ましくは 、突然変異はＨＰＩＶ−３アンチゲノムをコードする配列中の１ヌクレオチドも しくはそれ以上の置換、６〜１２ヌクレオチドの欠失または６〜１２ヌクレオチ ドの付加である。より好ましくは、改変されたＨＰＩＶ−３クローンはＨＰＩＶ −３アンチゲノムをコードする配列の遺伝子もしくはシス作動性エレメントのい ずれかまたは両方中に置換を含有する。 好ましくは、ＨＰＩＶ−３クローンはＨＰＩＶアンチゲノムをコードする配列 からすぐ下流にリボザイム、より好ましくはデルタ肝炎ウイルスアンチゲノムの リボザイムをコードするヌクレオチド配列を含んでなるプラスミドである。クロ ーンの転写後に、リボザイムはＨＰＩＶアンチゲノムからリボザイムを開裂し、 アンチゲノム上に複製能力のある３’末端をもたらす。より好ましくは、ＨＰＩ Ｖ−３はリボザイム配列の後にＲＮＡポリメラーゼターミネーターも含んでなる 。一つの態様として、ＨＰＩＶ−３クローンは図５に示されるプラスミドｐＨＰ ＩＶ−３であり、そのプラスミドは１９９８年５月＿日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔ ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗ ｎ Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ ２０８５２、ＵＳＡに寄託され、 受託番号＿を有する。 また、本発明は上記の系を用いる組み換えＨＰＩＶ、特にＨＰＩＶ−３の製造 方法にも関する。その方法はＨＰＩＶクローン並びにＨＰＩＶ Ｐタンパク質及 びＨＰＩＶ Ｌタンパク質をコードする支持クローンを宿主細胞、好ましくはヒ ト細胞中に導入し；ＨＰＩＶアンチゲノム転写産物の形成、ＨＰＩＶゲノム（ｖ ＲＮＡ）並びにＨＰＩＶタンパク質Ｌ、Ｐ及びＮＰの合成、並びに組み換えＨＰ ＩＶの形成を与える条件下で宿主細胞を培養し；そして培養物から組み換えＨＰ ＩＶを回収することを含んでなる。好ましくは、ＨＰＩＶクローン及び支持クロ ーンでトランスフェクトされる宿主細胞は、ＨＰＩＶクローン及び支持クローン 中のＨＰＩＶ配列に機能的に連結されているＲＮＡポリメラーゼプロモーターに 対応するＲＮＡポリメラーゼを含有する。好ましい態様として、ＲＮＡポリメラ ーゼプロモーターに機能的に連結されたＨＰＩＶ−ＮＰタンパク質をコードする ヌクレオチド配列を含んでなる支持クローンも細胞中に導入される。好ましくは 、ＨＰＩＶクローン及び支持クローンまたは複数のクローンでのトランスフェク ションより前にまたはそれと組み合わせて、ＲＮＡポリメラーゼ、より好ましく はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するウイルス組み換え体、好ましくはワクシ ニアウイルス組み換え体を宿主細胞に感染させる。そのような細胞にワクシニア ウイルス組み換え体を感染させる場合、ＨＰＩＶ−３クローンはＴ７ ＲＮＡポ リメラーゼの上流にワクシニアウイルスＲＮＡポリメラーゼターミネーター及び Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼターミネーターの下流にワクシニアウイルスＲＮＡポ リメラーゼターミネーターも含んでなることが好ましい。 また、本発明は組み換えＨＰＩＶ−３のゲノム中への部位特異的突然 変異の導入方法にも関する。その方法はＨＰＩＶ−３アンチゲノムをコードする 配列中に１つまたはそれ以上の突然変異を含んでなる改変されたＨＰＩＶ−３ク ローンを調製し；改変されたＨＰＩＶ−３クローン並びにＨＰＩＶ−３ Ｐタン パク質及びＨＰＩＶ−３ Ｌタンパク質及び好ましくはＨＰＩＶ−３ ＮＰタンパ ク質をコードする配列を含んでなる支持クローンを宿主細胞中に導入し；そして 改変されたＨＰＩＶ−３アンチゲノム転写産物の形成並びにＨＰＩＶ−３ Ｌ、 Ｐ及びＮＰタンパク質の合成を与える条件下で宿主細胞を培養することを含んで なる。改変されたＨＰＩＶ−３クローン及び支持クローンはＨＰＩＶ−３タンパ ク質をコードする配列に機能的に連結されているＲＮＡポリメラーゼプロモータ ーを含有する。宿主細胞は改変されたＨＰＩＶ−３クローン及び支持クローン上 のＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼをその細胞質 内に含有する。 好ましくは、ＨＰＩＶ−３クローンを鋳型として用いて通常のＰＣＲ技術によ り、１つまたはそれ以上の突然変異を中に含有する改変されたＨＰＩＶ−３クロ ーンを作製する。ＨＰＩＶ−３配列のシス作動性エレメント中またはＨＰＩＶ− ３タンパク質をコードする配列中に突然変異を作製する。好ましくは、Ｌタンパ ク質をコードする配列中に突然変異を作製する。ＨＰＩＶ−３クローンのＨＰＩ Ｖ−３タンパク質をコードする配列中に突然変異を作製する場合、対応する支持 クローンのタンパク質をコードする配列中の同じ部位に類似した型の突然変異を 作製することが好ましい。例えば、ＨＰＩＶ−３クローンのＬタンパク質をコー ドする配列中の特定の部位で特定変異を作製する場合、Ｌタンパク質をコードす る支持クローンのＬタンパク質をコードする配列中の同じ部位 で同じ突然変異を作製することが好ましい。そのような方法はウイルス粒子の合 成を妨げるかまたは非感染性もしくは非病原性のＨＰＩＶ−３の生産をもたらす 突然変異を同定するために有用である。 上記の方法により製造された突然変異ウイルスが非病原性、すなわち弱毒化さ れているかどうかを決定するために、突然変異ウイスルをまずインビトロで試験 して突然変異がよりゆっくり増殖する表現型をもたらしているかどうか、すなわ ち、突然変異ウイルスが組織培養において野生型ウイルスよりゆっくり増殖する かどうかを決定する。次に、パラインフルエンザウイルスの優れた実験モデルで ある綿尾ネズミのような動物への注入により、この表現型を示す突然変異ウイル スをインビボで調べる。次に、感染した動物を調べてそれらがＨＰＩＶ−３に対 する抗体を産生しているかどうかを決定し、そして野生型ウイルスに感染させた 動物に比較した場合に症状の重さの減少があるかどうかを決定する。 ＨＰＩＶ−３遺伝子及びシス作動性エレメント内に特定の改変を含有するよう に遺伝子的に設計された組み換えＨＰＩＶ−３ウイルスを製造できることにより 、ウイルス複製周期の全ての面の研究が促進される。従って、ＨＰＩＶ−３遺伝 子内に特定の改変を含有するように遺伝子的に設計されている組み換えＨＰＩＶ を製造できる系は、弱毒化するパラインフルエンザ遺伝子型を同定するため及び ヒトパラインフルエンザウイルスの生ワクチンを開発するために有用である。 ＨＰＩＶ−３の全長ｃＤＮＡクローンの調製方法及び改変されるかまたは突然 変異された感染性の組み換えＨＰＩＶ−３の製造方法の以下の実施例は例示の目 的のためであり、本発明の範囲を限定することを意図しない。実施例１．ＨＰＩＶ−３の全長ｃＤＮＡクローンの構築 特定の部位に突然変異を含有するＨＰＩＶ−３の全長の感染性クローンの構築 を２工程の方法により実施した。最初の工程はＨＰＩＶ−３の正のセンスのリー ダー部分領域及びトレーラー領域を含有するミニレプリコンの作製であった。第 二の工程はミニレプリコン中へのＨＰＩＶ−３ゲノムＲＮＡから得られたＲＴ− ＰＣＲフラグメントの挿入を含んだ。正のセンスのミニレプリコンは以下のもの ：２個の非ウイルスＧ残基及びそれに続くＨＰＩＶ−３の正のセンスのリーダー 領域、ＮＰ ５’ＵＴＲの一部（ウイルス塩基９７まで）、ルシフェラーゼ遺伝 子、Ｌ ３’ＵＴＲの一部（ウイルス塩基１５３８７で始まる）及びＨＰＩＶ− ３のトレーラー配列の合成を導くＴ７プロモーターを含有した。ＨＰＩＶ−３ゲ ノムの全長ヌクレオチド配列並びにリーダー配列、トレーラー配列及びタンパク 質をコードする領域の位置を図１に示す。３’末端のＨＰＩＶ−３特異的塩基の 後で適切な開裂をもたらすためにデルタ肝炎ウイルスアンチゲノムのリボザイム が続いた。また、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼターミネーターもリボザイム配列に 続いてレプリコン中に組み込まれた。さらに、ワクシニアウイルスポリメラーゼ 終結シグナルを上記の配列のすぐ上流及び下流に挿入した。構築中に、ＮＰ ５ ’ＵＴＲ及びＬ ３’ＵＴＲをコードする領域中に単一塩基変異を作製した。ウ イルス塩基９４でのＡ→Ｇ変異及び塩基１５３８９でのＡ→Ｇ変異はそれぞれＳ ａｃＩ及びＳｔｕＩ部位をもたらし、それらを組み換え体起源のものであるとウ イルスを同定するための遺伝子標識として用いた。 ベクターｐＯＣＵＳ−２（Ｎｏｖａｇｅｎ）をその小さい大きさ（１９３０ｂ ｐ）のためにミニレプリコン［ｐＰＩＶ３−ＭＧ（＋）］を調 製するための出発プラスミドとして選択した。小さい出発プラスミドの使用は全 長クローンの安定性を増すことができると考えられる。 Ｔ７プロモーター及びデルタ肝炎ウイルスアンチゲノムのリボザイムがそれぞ れ隣接するリーダー及びトレーラー領域をコードするＰＣＲ産物を作製すること によりミニレプリコンを構築した。Ｔ７プロモーター／リーダー領域の合成のた めに用いたプライマーは：５’−ＴＡＧＴＣＧＧＣＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣ ＡＣＴＡＴＡＧＧ ＡＣＣＡＡＡＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＣＴ−３’、配列番号 ：２及び５’−ＧＡＡＡＴＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＣＣＴＴＴＴＣＴ−３’、配列 番号：３であった。第一のプライマーはＥａｇＩ部位及びＴ７プロモーター（下 線を引いた）をコードし、第二のプライマーはＮＰ ｍＲＮＡの５’非翻訳領域 （ＵＴＲ）内のウイルス塩基９４（ボールド体）でＡ→Ｇ塩基変異を導入し、そ れはＳａｃＩ部位をもたらす。この反応の鋳型ｐＨＰＩＶ３−ＣＡＴは引用する ことにより本明細書に組み込まれるＤｅ、Ｂ．Ｐ．及びＡ．Ｋ．Ｂａｎｅｒｊｅ ｅ（１９９３）Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ａｎａｌｏｇｓ ｏ ｆ ｇｅｎｏｍｅ ＲＮＡ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ３．Ｖｉｒ．１９６：３４４−３４８中に記述されてい る。得られたＰＣＲ産物を図２に示されるｐＯＣＵＳ−２のＥａｇＩ及びＳａｃ Ｉ部位中にクローン化した。トレーラー／リボザイム領域の合成のために用いた プライマーは：５’−ＴＡＡＧＧＣＣＴＡＡＡＧＡＴＡＧＡＣＡＡＡＡＡＧＴＡ ＡＧＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＡＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＴＴ ＣＴＴＣＴＣＴＴＧＴＴＴＧＧＴＧＧＧＴＣＧＧＣＡＴＧＧＣＡＴＣＴＣ−３’ 、配列番号：４及び５’−ＣＴＧＧＧＴＡＣＣＴＣ ＣＣＴＴＡＧＣＣＡＴＣＣＧＡＧＴ −３’、配列番号：５であった。第一のプラ イマーはＬ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲからトレーラー配列までの配列を含有し、リ ボザイム（下線を引いた）の合成をプライミングする。 また、ＬｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内にＳｔｕＩ部位をもたらすウイルス塩基１５３ ８９（ボールド体）でのＡ→Ｇ変異もこのプライマーによりコードされる。第二 のプライマーはリボザイムの３’末端（下線を引いた）及びＢｇｌII部位をコー ドする。このＰＣＲ反応の鋳型は、引用することにより本明細書に組み込まれる Ｐｅｒｒｏｔｔａ、Ａ．Ｔ．及びＭ．Ｄ．Ｂｅｅｎ、１９９１．Ｔｈｅ ｐｓｅ ｕｄｏｋｎｏｔ−ｌｉｋｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｄｅｌｔａ ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ ３５０：４３４−４３６中 に以前に記述されたような、リボザイム配列を含有するプラスミドｐＳＡ１であ った。この反応から得られたＰＣＲ産物をｐＯＣＵＳ−２のＳｔｕＩ及びＢｇｌ II部位にクローン化した。Ｔ７／リーダークローンのＥａｇＩ／ＰｓｔＩフラグ メントをトレーラー／リボザイムクローンのＰａｃＩ／ＰｓｔＩ部位に移すこと によりリーダー及びトレーラー領域を単一クローン中に合わせた。 潜在性ワクシニアウイルスプロモーターからの転写により起こり得る干渉（ｉ ｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）を防ぐために、ワクシニアウイルスポリメラーゼ転写 停止シグナル（ＴＴＴＴＴＮＴ）をｐＯＣＵＳ−２内のＰｖｕII及びＳｓｐＩ部 位の近くでレプリコンの上流及び下流に挿入した。ＢｌｐＩ及びＢｓｐＥ１で消 化することによりＴ７転写終結シグナルをｐＥＴ−１７ｂから取り出し、ｐＯＣ ＵＳ−２のＳｓｐＩ部位（Ｔ ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した）に挿入した。次に、ルシフェラーゼレポ ーター遺伝子をＳａｃＩ及びＳｔｕＩ部位中に挿入して図３に図式的に示される ｐＰＩＶ３−ＭＧ（＋）をもたらした。 全長のＨＰＩＶ−３クローンを作製するために、５つのＲＴ−ＰＣＲ産物をＨ ＰＩＶ−３ビリオンＲＮＡから作製し、クローン化した。続いて、これらのフラ グメントをルシフェラーゼコーディング配列に置き換えてｐＰＩＶ３−ＭＧ（＋ ）中に挿入して、全長クローンｐＨＰＩＶ−３をもたらした。国立衛生研究所の Ｒｏｂｅｒｔ Ｃｈａｎｏｃｋから入手したＨＰＩＶ−３株４７８８５ビリオン ＲＮＡから５つのＲＴ−ＰＣＲ産物を作製した。ＨＰＩＶ−３ゲノムの残りの部 分を包含するこれらのＰＣＲ産物を制限酵素分析により同定し、ｐＵＣ１９また はｐＯＣＵＳ−２のいずれかにクローン化し、次に、ｐＰＩＶ３−ＭＧ（＋）中 に挿入した。 ウイルス塩基８３〜２７２１を含有する第一のＰＣＲ産物をｐＵＣ１９のＳｍ ａＩ部位に挿入した。次に、８３／２７２１クローンをＳａｃＩ及びＸｍｎＩで 消化し、ウイルス塩基９４〜５５３を取り出し、それをｐＰＩＶ３−ＭＧ（＋） のＳａｃＩ及びＳｐｈＩ（Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した）に挿入した 。次に、８３／２７２１クローンをＰｓｔＩで消化してウイルス塩基５４０〜２ ２７４を含有するフラグメントを取り出し、それを次に９４／５５４フラグメン トを含有するｐＰＩＶ３−ＭＧ（＋）クローンのＰｓｔＩ部位に挿入した。ウイ ルス塩基１３３９５〜１５３９７を包含する第二のＰＣＲ産物をｐＵＣ１９のＳ ｍａＩ部位にクローン化した。次に、この１３３９５／１５３９７クローンをＳ ｔｕＩ及びＰａｃＩで消化し、ウイルス塩基１３６３２〜１５ ３８１を含有する得られたフラグメントを塩基２２７４までのウイルス配列を含 有するｐＰＩＶ３−ＭＧ（＋）クローンのＳｔｕＩ及びＰａｃＩ部位に挿入した 。得られたクローンはｐＰＩＶ３−ＭＧ（＋）背景中にウイルス塩基１〜２２７ ４及び１３６３２〜１５４６２を含有した。 ウイルス塩基７４０３〜１１５１３を含有する第三のＰＣＲ産物をＢｓｐＭＩ（ Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した）及びＸｈｏＩで消化して塩基７４３７ 〜１１４４４を含有するフラグメントを生成し、それをｐＯＣＵＳ−２のＸｈｏ Ｉ及びＳｓｐＩ部位に挿入した。ウイルス塩基１０９０４〜１３７７３を含有す る第四のＰＣＲフラグメントをＰｖｕII及びＢａｍＨＩで消化し（ウイルス塩基 １０９１８〜１３７３３）、ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ（Ｔ４ ＤＮＡポリメラー ゼで平滑化した）及びＢａｍＨＩ部位に挿入した。７４３７／１１４４４クロー ンをＳａｃＩ（Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した）及びＥｃｏＮＩで消化 し、ＥｃｏＲＩ（Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した）及びＥｃｏＮＩで消 化した１０９１８／１３７３３クローン中に挿入することによりそれら２つのウ イルスセグメントを合わせた。得られたクローンはｐＵＣ１９背景中にウイルス 塩基７４３７〜１３７３３を含有した。ＸｍｎＩ及びＸｈｏＩで消化し（ウイル ス塩基５５３〜７４３７）、ｐＯＣＵＳ−２のＳｔｕＩ及びＸｈｏＩ部位にクロ ーン化されている、ウイルス塩基８３〜７４５７を包含する第五のＰＣＲ産物か らウイルス配列の残りの部分を得た。次に、７４３７／１３７３３クローンをＢ ａｍＨＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、そしてＸｈｏＩで消 化してフラグメントを遊離し、それをＥａｇＩ（Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平 滑化した）及びＸｈｏＩで消化した５５３／７４３７クローン 中に挿入した。得られたクローンはウイルス塩基５５３〜１３７３３を含有した 。次に、このクローンをＰｓｈＡＩ及びＰａｃＩで消化し、ウイルス塩基２１４ ３〜１３６３２を含有する得られたフラグメントをウイルス塩基１〜２２７４及 び１３６３２〜１５４６２を含有するｐＰＩＶ３−ＭＧ（＋）クローンの同じ部 位中に挿入した。これにより図４に図式的に示される感染性クローンｐＨＰＩＶ −３が作製された。 ｐＧＥＭ−４中にＰ遺伝子を挿入するために、Ｘｂａｌ（Ｔ４ ＤＮＡポリメ ラーゼで平滑化した）及びＢａｍＨＩで消化することによりＰ−ｌａｃ−融合ク ローン（引用することにより本明細書に組み込まれる３８中に記述される）から Ｐ配列を移しかえ、ｐＧＥＭ４のＫｐｎＩ（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し た）及びＢａｍＨＩ部位中に挿入した。引用することにより本明細書に組み込ま れる１５、１６中に記述されたようなｐＰＩＶ３−ＮＰ及びｐＰＩＶ３−Ｌクロ ーンはｐＧＥＭ−４背景であった。また、ｐＰＩＶ３−Ｌクローンも改変させた 。天然のＬ ｍＲＮＡ配列には転写産物の５’末端から１１ヌクレオチドに開始 しないＡＵＧがある。これを突然変異ＰＣＲによりｐＰＩＶ３−Ｌから取り除き 、ウイルス塩基８６３６及び８７３７をＡＴからＴＡに変えた。実施例２．組み換えＨＰＩＶ−３の製造 ６ウェルプレート中のＨｅＬａ細胞の融合した単層に組み換えワクシニアウイ ルスｖＴＦ７−３を２の感染多重度で感染させた。引用することにより本明細書 に組み込まれるＦｕｅｒｓｔ、Ｔ．Ｒ．、Ｐ．Ｌ．Ｅａｒｌ及びＢ．Ｍｏｓｓ． １９８７．”Ｕｓｅ ｏｆ ａ ｈｙｂｒｉｄ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ −Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇ ｅｔ ｇｅｎｅｓ．”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２５３８−２５４４並 びにＦｕｅｒｓｔ、Ｔ．Ｒ．、Ｅ．Ｇ．Ｎｉｌｅｓ、Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ及 びＢ．Ｍｏｓｓ．１９８６．”Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ−ｅ ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓ ｅｄ ｏｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａ ｎｔ ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｔｈａｔ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｓ ｂ ａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．”Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８３：８１２２−８１２６中に記述されるよう にｖＴＦ７−３はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する。３７℃で１時間後に、 製造業者の説明書に従ってリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（ＢＲＬ） を用いてｐＰＩＶ３−ＮＰ、ｐＰＩＶ３−Ｐ、ｐＰＩＶ３−Ｌ及びｐＨＰＩＶ− ３をトランスフェクトした。３時間後にトランスフェクション培地を取り除き、 １．５ｍｌのダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）５％ウシ胎仔血清で置 き換えた。４０〜４８時間後にプレートを凍結し、融解し、はがした。次に、清 澄にした培地上清（２５０μｌ）を用いて６ウェルプレート中の新しいＨｅＬａ 細胞単層に感染させた。１時間の付着後に、ワクシニアウイルス複製を阻害する ために２５μｇ／ｍｌの１−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ａｒａＣ） を含有するＤＭＥＭ（１．５ｍｌ）を添加した。４０時間後にプレートを凍結し 、融解し、はがした。次に、清澄にした培地上清をＡｒａＣの存在下でＨＰＩＶ −３に関して滴定した。滴定中、単離されたプラークを寒天プラグとして抜き取 った。寒天プラグを５００ｍｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ中に４℃で４時間置いた。次 に、２５０μｌを用いてプラーク単離物を４０時間増幅させるために新しいＨｅ Ｌａ細胞単層に感染させた。 好ましい態様として、トランスフェクション条件は１μｇのＨＰＩＶ−３、２ μｇのｐＰＩＶ３−ＮＰ、４μｇのｐＰＩＶ３−Ｐ及び０．１μｇのｐＰＩＶ３ −Ｌであった。これらの条件下で最初のトランスフェクション中に６ｘ１０⁵細 胞当たり約１０００ｐｆｕが、そして増幅後に６ｘ１０⁵細胞当たり１０⁶ｐｆｕ が得られた。 個々のプラスミドをトランスフェクション工程から省いた場合、ウイルスの回 収のためにｐＨＰＩＶ−３、ｐＰＩＶ３−Ｐ及びｐＰＩＶ３−Ｌプラスミドは必 要とされるが、意外にも、以下の表１に示されるようにｐＰＩＶ３−ＮＰはそう ではなかった。 表１ 表１．ｐＨＰＩＶ−３からのＨＰＩＶ−３の回収。ＨｅＬａ細胞単層にｖＴＦ７ −３を感染させ、示したプラスミドでトランスフェクトした。４０時間後に細胞 を溶解し、ｖＴＦ７−３複製を阻害するためにａｒａＣの存在下で上清を新しい ＨｅＬａ細胞単層に添加した。次に、これらの単層を溶解し、上清をＨＰＩＶ− ３に関してアッセイした。試み当たりのＨＰＩＶ−３が回収された実験の数をウ イルス回収の下に示す。^AＨＰＩＶ−３を生じなかった１つの実験は０．１μｇ のＰプラスミドを用いた。^B ＮＰプラスミドを省くとＨＰＩＶ−３の３〜５倍低い力価がもたらされた。回収されたウイルスの特性化 回収されたウイルスを特性化するため及びプラークがＨＰＩＶ−３のものより ほんのわずかに小さいｖＴＦ７−３からＨＰＩＶ−３を精製するために、ＨＰＩ Ｖ−３であると思われる単離されたプラークを選び取り、ＨｅＬａ細胞で増幅さ せた。プラーク精製され、増幅させたウイルス単離物及び適切なコントロールを 次に中和アッセイで分析した。ウイルス（単離物＃３及び＃５）を５μｌのウサ ギ免疫前血清、５μｌのウサギポリクローナル抗−ＨＰＩＶ−３抗血清とプレイ ンキュベート（氷上で３０分）するか、または２５μｇ／ｍｌのａｒａＣの存在 下でアッセイした。標準プラークアッセイの前に血清をウイルスと氷上で３０分 間インキュベートした。次に、プラークを最大限に発生させるために、ゲンチア ナ・バイオレットでの染色の前にプレートを３７℃で６６時間インキュベートし た。アッセイの結果から、プラーク精製されたウイルスは抗−ＨＰＩＶ−３抗血 清により完全に阻害されるが、一方、ｖＴＦ７−３はそうではないことが示され た。それに反して、ＨＰＩＶ−３単離物はＡｒａＣにより阻害されず、一方、ｖ ＴＦ７−３ウイルスは完全に阻害された。興味深いことに、８個の組み換えＨＰ ＩＶ−３単離物のうち４個が親のＨＰＩＶ−３ストックと同じプラークの大きさ であり、一方、４個はわずかに大きかった。単離物＃３のプラークの大きさは単 離物＃５及び野生型ＨＰＩＶ−３ウイルスよりわずかに大きかった。 ｐＰＩＶ３−ＭＧ（＋）中のルシフェラーゼと同じ位置を共有するｐＨＰＩＶ −３のＮＰコーディング配列がｐＨＰＩＶ−３から発現されて いるかどうかを決定するために、ｖＴＦ７−３に感染させたＨｅＬａ細胞中にｐ ＨＰＩＶ−３及びｐＰＩＶ３−ＮＰを別々にトランスフェクトし、４８時間後に 細胞ライセート（ｌｉｓｔｓ→ｌｙｓａｔｅｓ？）を調製した。次に、抗−ＨＰ ＩＶ−３ＲＮＰ抗血清を用いてウェスタンブロッティングによりライセートを分 析した。この抗血清は主にＮＰを認識し、Ｐとはあまり反応しない。 具体的には、（６ｘ１０⁴細胞に等しい）抽出物をＳＤＳ−１０％ＰＡＧＥで泳 動し、ニトロセルロース膜に移した。一次抗体は１：１０００に希釈したウサギ ポリクローナル抗−ＲＮＰ抗血清であった。二次抗体は西洋わさびペルオキシダ ーゼに連結したヤギ抗−ウサギ抗体の１：１０００希釈であった。視覚化は化学 発光（ＥＣＬキット、Ａｍｅｒｓｈａｍ）によった。ウェスタンブロットにより 示されるように、ＨＰＩＶ−３ＲＮＰはｐＰＩＶ３−ＮＰ及びｐＨＰＩＶ−３で トランスフェクトされた細胞抽出物から、そして精製されたＨＰＩＶ−３ＲＮＰ からＮＰを認識した。モックでトランスフェクトされたＨｅＬａ抽出物ではいか なるタンパク質も認識されなかった。従って、ＮＰは、おそらくＴ７により導か れるアンチゲノムＲＮＡ転写産物から翻訳されて、ｐＨＰＩＶ−３から発現され ると思われる。 回収された組み換えウイルスがそのゲノム中に特定の突然変異を有するかどう かを決定するために、野生型及びプラーク単離されたウイルスからＲＮＡを抽出 し、置換突然変異に隣接するプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ分析に用いた。 約２ｘ１０⁷プラーク形成単位（ｐｆｕ）のプラーク精製されたウイルス単離物 ＃３、５、７及び９またはｗｔＨＰＩＶ−３株４７８８５からウイルスＲＮＡを 単離した。ウイルス塩 基２３または１５１００でプライミングするオリゴヌクレオチドを用いて４４℃ で１時間Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ II逆転写酵素（ＢＭＢ）を用いて逆転写を実 施した。ウイルス塩基２３〜３０３または１５１００〜１５４４０の増幅をもた らす第二のプライマーを用いてＥｘｐａｎｄ Ｌｏｎｇポリメラーゼ（ＢＭＢ ）でＰＣＲを実施した。 ウイルス塩基１〜３２４及び１５０８０〜１５４６２を包含するＰＣＲ産物を 示した単離物から作製し、それぞれ、ＳａｃＩ及びＳｔｕＩで消化し、１．４％ アガロースゲルで分析した。予想される大きさのＰＣＲ産物はＲＴに依存して生 成され、ＰＣＲ産物が混入するプラスミドＤＮＡよりむしろＲＮＡから得られた ことを示す。 アガロースゲルで示されるように、１〜３２４及び１５０８０〜１５４６２の ＰＣＲ産物の大きさは、増幅プライマー中に制限酵素部位を含むことによりウイ ルスの特定領域の長さに対してそれぞれ２１及び２２塩基対増えている。Ｓａｃ Ｉでの消化により、塩基９４での突然変異が野生型ウイルスには存在しないが、 プラーク単離されたウイルスには存在することが示され、それらが組み換え体起 源のものであることを示す。同様に、野生型ＨＰＩＶ−３のウイルス塩基１５３ ８９を包含する領域から得られたＰＣＲ産物はＳｔｕＩにより切断されなかった 。しかしながら、８個のプラーク単離されたウイルスのうち４個のみがＳｔｕ部 位をもたらす突然変異を含有した。ＰＣＲ産物の直接シークエンシングによりこ れらの結果は裏付けられた。 説明 ＨＰＩＶ−３ゲノムの全長プラスミドクローン、ｐＨＰＩＶ−３を構築した。 ｖＴＦ７−３に感染させたＨｅＬａ細胞中へのｐＨＰＩＶ−３ 並びにウイルスのＮＰ、Ｐ及びＬタンパク質をコードするプラスミドのトランス フェクション時に、遺伝的マーカーを保有する組み換えＨＰＩＶ−３が効率よく 回収された。この系のいくつかの興味深い特徴が認められた。第一に、ウイルス ＮＰタンパク質を感染性クローンから発現させることができ、この発現はＮＰ支 持プラスミドの必要性を除く。ＮＰタンパク質はワクシニアウイルスキャップ形 成酵素によりキャップ形成された後に一次アンチゲノム転写産物から直接合成さ れると考えられる。 第二に、ＲＮＡ複製中に復帰が起こる可能性を除外できないが、おそらくｐＨ ＰＩＶ−３とｐＰＩＶ３−Ｌプラスミドの間の組み換えのために、異なる遺伝子 型及び表現型を有する２つの組み換えウイルスが製造された。ｐＰＩＶ３−Ｌは 塩基１５４３７までに及ぶ全部のＬ ３’ＵＴＲ及びトレーラー領域の一部、Ｓ ｔｕＩ部位を越えて４８塩基対の重複を含有する。これはワクシニアウイルス感 染細胞においてプラスミド間の組み換えが容易に起こるために十分な余地である 。 これらの結果から、ＨＰＩＶ−３系において選択があるようである。全ての大 きいプラークのウイルス単離物は塩基９４での変異を保持しながら塩基１５３８ ９で野生型配列に復帰していた。Ａ９４Ｇは親ウイルスからのこれらのウイルス における唯一の既知の改変であるので、両方の突然変異を保持する単離物は親（ 野生型）のウイルスのものと同じプラークの大きさであったが、１５３８９突然 変異が失われた場合にプラークの大きさが増加したことが明らかであり、塩基１ ５３８９での突然変異がＡ９４Ｇ突然変異に関連して有害であったことを示す。 ｐＨＰＩＶ−３と支持プラスミドの間に１つの他の既知の変異があった。天然の Ｌタンパク質メッセージ中に開始しないＡＵＧが存在する。このＡＵＧ はＬ ｍＲＮＡの５’末端からわずか１１ヌクレオチドであり、不十分な翻訳開 始背景にあるので、それはＬ ｍＲＮＡ翻訳の干渉をあまり引き起こさない可能 性がある。しかしながら、支持プラスミドｐＰＩＶ３−Ｌでは、この開始しない ＡＵＧは転写産物の５’末端からかなり離れており、その場合、それはよりリボ ソームに認識されると思われる。塩基８６３６及び８６３７をＡＴからＴＡに変 え、ＳｐｈＩ部位を壊し、ＮｈｅＩ部位をもたらすことによりこのＡＵＧをｐＰ ＩＶ３−Ｌから取り除いた。この変異が組み換えウイルス中に存在し、大きいプ ラークの表現型を招くことができたかどうかを調べるために、ＲＴ−ＰＣＲ分析 を実施した。この部位を包含し、野生型及びプラーク単離されたウイルスの両方 から得られたＰＣＲ産物は野生型配列を保持し、組み換えがこの領域で起こらな かったこと及びこれらの変異がプラークの大きさのいかなる変化も説明できない ことを示す。 組み換えがトランスフェクトしたプラスミド間で起こる可能性があるという結 果は、パラミキソウイルスまたはラブドウイルス感染性クローン系中に突然変異 を導入する場合に注意を払わなければならないを示す。ＮＰ、ＰまたはＬ配列内 に導入される突然変異は、好ましくは、支持プラスミド及び感染性クローンの両 方により保有される。もしそうでなければ、得られるウイルスは適切な突然変異 を保有しない可能性がある。これの唯一の可能な例外はＨＰＩＶ−３系であり、 その場合、ＨＰＩＶ−３感染性クローンはＮＰを発現し、ＮＰ支持プラスミドを 必要としない。それでも、支持ＮＰプラスミドがトランスフェクションにおいて 含まれる場合にＨＰＩＶ−３の著しく大きい収量が得られたので、ＨＰＩＶ−３ ＮＰ支持プラスミドが系に含まれることが好ましい。 ＨＰＩＶ−３の感染性クローンはＨＰＩＶ−３の分子生物学の理解のため及び この重要な病原菌のワクチンを開発するために有用である。ＨＰＩＶ−３内に特 定の突然変異を作製できることにより、ＨＰＩＶ−３複製の全ての面を研究する ことが容易になる。他に関連して以前に研究されたものを初めとするあらゆる突 然変異を今度はこの系で調べることができる。また、特定の突然変異を導入でき ることにより、復帰突然変異体分析の可能性も与え、それによりタンパク質−タ ンパク質またはタンパク質−ＲＮＡ相互作用の理解を精緻なものにすることがで きる。 また、感染性クローンはウイルスを弱毒化する突然変異を同定するためにも有 用である。そのようなウイルスはＨＰＩＶ−３の新規なワクチン株を開発するた めに有用である。さらに、ＨＰＩＶ−３の現在の候補ワクチン株に存在する突然 変異をｐＨＰＩＶ−３中に挿入することができる。多数の有害な突然変異を同定 することにより、ウイルス生活環における様々な段階に影響を与えるいくつかの 突然変異を単一のＨＰＩＶ−３株中に作製することが可能であるはずである。そ のようなウイルスは非常に弱毒化されており、容易に復帰できないはずである。 本発明はある程度の詳しさで記述されているが、付加した請求の範囲において 特定されるような本発明の範囲からそれずに様々な適応及び改変を実施すること ができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ａ．ヒトパラインフルエンザウイルスの正のセンスのアンチゲノムをコ ードするヌクレオチド配列；及び ｂ．該ヌクレオチド配列に機能的に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロ モーター を含んでなる組み換えＨＰＩＶクローン。 ２． ヌクレオチド配列がＨＰＩＶ−３のアンチゲノムをコードする請求の範 囲１のクローン。 ３． 該クローンが該アンチゲノムをコードする配列から下流にリボザイム配 列をさらに含んでなる請求の範囲２のクローン。 ４． ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモー ターである請求の範囲２のクローン。 ５． リボザイムがアンチゲノムのリボザイムである請求の範囲３のクローン 。 ６ リボザイム配列の下流にＲＮＡポリメラーゼターミネーターをさらに含 んでなる請求の範囲３のクローン。 ７． ヌクレオチド配列がＨＰＩＶ−３の改変されたアンチゲノムをコードす る請求の範囲２のクローン。 ８． クローンがＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅ ｃｔｉｏｎに寄託され、受託番号＿を有するプラスミドという特徴を有する請求 の範囲２のクローン。 ９． ＨＰＩＶ−３アンチゲノムをコードする配列が１個またはそれ以上のヌ クレオチドの置換、３個から１２個までのヌクレオチドの欠失及び３個から１２ 個までのヌクレオチドの付加よりなる群から選択され る突然変異を含んでなる請求の範囲７のクローン。 １０． ａ．ｉ．ヒトパラインフルエンザウイルスの正のセンスのアンチゲノ ムをコードするヌクレオチド配列を含んでなるＨＰＩＶクローン； ii．ヒトパラインフルエンザウイルスＬタンパク質をコードする ヌクレオチド配列を含んでなる支持クローン； 及び iii．ヒトパラインフルエンザウイルスＰタンパク質をコードす るヌクレオチド配列を含んでなる支持クローン、その場合、Ｐタンパク質及びＬ タンパク質をコードするヌクレオチド配列が同じ支持クローン上または別々の支 持クローン上にあってもよい、 を含んでなる組み換え系を与え； ｂ．工程（ａ）の組み換え系を宿主細胞中に導入し； ｃ．宿主細胞のトランスフェクション及び組み換えヒトパラインフル エンザウイルスの形成を与えるために十分な時間の間工程（ｂ）の宿主細胞を培 養し；そして ｄ．トランスフェクトされた宿主細胞の培養物から組み換えヒトパラ インフルエンザウイルスを回収すること を含んでなる組み換えヒトパラインフルエンザウイルスの製造方法。 １１． ＨＰＩＶクローンのアンチゲノムをコードする配列がＲＮＡポリメラ ーゼプロモーターに機能的に連結され； 支持クローンのＰタンパク質をコードする配列がＲＮＡポリメラーゼ プロモーターに機能的に連結され； 支持クローンのＬタンパク質をコードする配列がＲＮＡポリメラーゼプロモータ ーに機能的に連結され；そして 宿主細胞が該ＨＰＩＶクローン及び該支持クローンのＲＮＡポリメラ ーゼプロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含んでなる、請求の範囲１１ の方法。 １２． 宿主細胞中への組み換え系の導入の前にまたはそれと組み合わせてＲ ＮＡポリメラーゼを発現することができるウイルス組み換え体を宿主細胞に感染 させる、請求の範囲１１の方法。 １３． 組み換えヒトパラインフルエンザウイルスを製造するための宿主細胞 であって、 ａ．ヒトパラインフルエンザウイルスの正のセンスのアンチゲノムをコードす るヌクレオチド配列を含んでなるＨＰＩＶクローン； ｂ．ヒトパラインフルエンザウイルスＬタンパク質をコードするヌクレオチド 配列を含んでなる支持クローン；及び ｃ．ヒトパラインフルエンザウイルスＰタンパク質をコードするヌクレオチド 配列を含んでなる支持クローン； その場合、Ｐタンパク質及びＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列は同 じ支持クローン上または別々の支持クローン上にあってもよい、 を含んでなる該宿主細胞。 １４． ヒトパラインフルエンザウイルスＮＰタンパク質をコードするヌク レオチド配列を含んでなる支持クローンをさらに含んでなる請求の範囲１３の宿 主細胞。 １５． ＨＰＩＶクローンがＨＰＩＶ−３のアンチゲノムをコードす るヌクレオチド配列を含んでなる請求の範囲１３の宿主細胞。 １６． ＨＰＩＶ−３のアンチゲノムをコードする配列が部位特異的突然変異 を含んでなる請求の範囲１５の宿主細胞。 １７． ＨＰＩＶ−３クローンがＨＰＩＶ−３アンチゲノム配列に機能的に連 結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターをさらに含んでなり、そして支持クロ ーンの各々が該支持クローンのＨＰＩＶ−３タンパク質をコードする配列に機能 的に連結されたＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含んでなる請求の範囲１４の 宿主細胞。 １８． 以下の工程： ａ．特定の部位で突然変異を有するヒトパラインフルエンザウイルスアンチゲ ノムをコードするヌクレオチド配列を含んでなるクローンを調製し； ｂ．工程（ａ）のクローン、ＨＰＩＶ Ｌタンパク質をコードするヌクレオチ ド配列を含んでなる支持クローン及びＨＰＩＶ Ｐタンパク質をコードするヌク レオチド配列を含んでなる支持クローンで宿主細胞を共トランスフェクトし； その場合、Ｐタンパク質及びＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列は同 じ支持クローン上または別々の支持クローン上にあってもよく；そして ｃ．組み換えヒトパラインフルエンザウイルスを形成させるために十分な時間 の間トランスフェクトされた宿主細胞を培養すること を含んでなる、組み換えヒトパラインフルエンザウイルスのゲノム中への部位特 異的突然変異の導入方法。 １９． ＨＰＩＶ ＮＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列を 含んでなる支持クローンで宿主細胞をトランスフェクトする工程をさらに含んで なる請求の範囲１８の方法。 ２０． ポリメラーゼ連鎖反応技術及びヒトパラインフルエンザウイルスアン チゲノムをコードするヌクレオチド配列を含んでなるクローンを鋳型として用い て工程（ａ）のクローンを調製し、その場合、該鋳型クローンのアンチゲノムを コードするヌクレオチド配列が部位特異的突然変異を欠いている請求の範囲１８ の方法。