JP2003506039A - cDNAからの流行性耳下腺炎ウイルスのレスキュー - Google Patents
cDNAからの流行性耳下腺炎ウイルスのレスキューInfo
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Abstract
Description
ない負センスの一本鎖RNAウイルスの組換え的製造方法、およびそれから形成
される免疫原組成物に関する。付加的態様は、流行性耳下腺炎ウイルスの弱毒お
よび/もしくは感染性ウイルスとしての製造方法に関する。該組換えウイルスは
cDNAクローンから製造され、そして従って定義された変化をゲノム中に有す
るウイルスが得られる。本発明はまた、流行性耳下腺炎以外の病原体のための免
疫原性もしくは製薬学的組成物、遺伝子治療および細胞ターゲッティングを包含
する多くの用途のための外来遺伝情報、例えば外来遺伝子を発現するためのベク
ターとしてそれから形成される組換えウイルスの使用にも関する (発明の背景) エンベロープのある負センスの一本鎖RNAウイルスは独特に組織かつ発現さ
れる。負センスの一本鎖ウイルスのゲノムRNAは、ヌクレオキャプシドの情況
で:メッセンジャーRNA(mRNA)の合成のための鋳型、およびアンチゲノ
ム(+)鎖の合成のための鋳型としての2種の鋳型機能を提供する。負センスの
一本鎖RNAウイルスは、それら自身のRNA依存性RNAポリメラーゼをコー
ドしかつパッケージングする。感染した細胞の細胞質にウイルスが進入すると、
メッセンジャーRNAのみが合成される。ウイルス複製は、mRNAの合成後に
起こり、そしてウイルスタンパク質の継続的合成を必要とする。新たに合成され
たアンチゲノム(+)鎖は、(−)鎖のゲノムRNAのさらなるコピーを生成さ
せるための鋳型としてはたらく。
ureにより1935年にウイルスであることが再現可能に示された(John
sonとGoodpasture、1935)。そのとき以来、組織培養物中で
の増殖が、ウイルスの分類および流行性耳下腺炎ウイルス(MUV)の生物学的
特性に関する研究を助長した。もともと、ミクソウイルス科のインフルエンザウ
イルスで分類された流行性耳下腺炎ウイルスは、以来、ヌクレオキャプシドの形
態学、ゲノムの構成およびタンパク質の生物学的特性に基づき、パラミクソウイ
ルス科、パラミクソウイルス亜科、ルブラウイルス属に再割り当てされている。
ルブラウイルス属の他の例は、シミアンウイルス5(SV5)、ヒトパラインフ
ルエンザウイルスタイプ2およびタイプ4、ならびにニューカッスル病ウイルス
を包含する(LambとKolakofsky、1996)。パラミクソウイル
ス科の全部のウイルスと同様、流行性耳下腺炎ウイルスは形状が多形態性であり
、リボ核タンパク質コアを取り巻く宿主細胞由来の脂質膜を含んで成り;このヌ
クレオキャプシドコアは、ウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質(NP)と
緊密に会合した15,384ヌクレオチドのセグメント化されない負センスRN
Aゲノムより構成されるらせん構造を形成する。MUVゲノムの遺伝子構成は3
’−NP−P−M−F−SH−HN−L−5’であると決定されている(Ela
ngoら、1998)。各遺伝子は、Pシストロン(これから3種の独特のmR
NAが転写される)を除き単一のタンパク質をコードし;1つはVタンパク質を
コードするP遺伝子の正確なコピーであり、他の2種のmRNAはRNAエディ
ティング機構により転写の間に挿入される2および4個の鋳型にされない(no
n−templataed)G残基を含有し、かつ、それぞれPおよびIタンパ
ク質をコードする(PatersonとLamb、1990)。PおよびLタン
パク質は、ヌクレオキャプシドとともに流行性耳下腺炎ウイルスの機能的RNA
ポリメラーゼ複合体を形成する。FおよびHNタンパク質はビリオンの表面から
突出する不可欠な膜タンパク質であり、かつ、細胞のウイルスの付着および進入
に関与する。小さな疎水姓タンパク質(SH)およびマトリックス(M)タンパ
ク質もまた膜会合性であり(Takeuchiら、1996およびLambとK
olakofsky、1996);ウイルスの成長におけるVおよびIタンパク
質の役割は未だ明白でない。
ロープの融合、および細胞の細胞質中へのウイルスのヌクレオキャプシドのその
後の放出に際して開始する。その後一次転写が起こり、全ウイルスタンパク質の
産生をもたらし;ウイルスゲノムの複製への切替えが後に起こり、次いでウイル
ス成分が集成して新たなウイルス粒子を形成し、それらが宿主細胞の原形質膜か
ら発芽する。無傷のヌクレオキャプシド構造のみが、RNAの転写、複製および
その後のウイルス増幅の鋳型として作用することができ;その中にMUVおよび
他の負鎖RNAウイルスの遺伝子操作における困難が存する。裸のゲノムRNA
が感染性でありかつ感染性ウイルスが付加的ウイルス因子の非存在下でゲノムの
1コピーのcDNAから回収することができる正鎖RNAウイルスと異なり(T
aniguchiら、1978;RacanielloとBaltimore、
1981)、負鎖RNAウイルスの裸のゲノムは感染性でなく、また、cDNA
からのウイルスのレスキューは、全部がバクテリオファージT7 RNAポリメ
ラーゼプロモーターの制御下の完全長の正センスもしくは負センスのゲノムRN
A転写物と一緒にウイルスのNP、PおよびLタンパク質の細胞内の共発現を必
要とする(Schnellら、1994;Lawsonら 1995;Whel
anら、1995;Radeckeら、1995;Collinsら、1995
;HoffmanとBanerjee、1997;Durbinら、1997;
Heら、1997;BaronとBarrett、1997;Jinら、199
8;Buchholzら、1999;Peetersら、1999)。報告され
た系の全部において、T7 RNAポリメラーゼは、共感染させる組換えワクシ
ニアウイルス(Fuerstら、1986;Wyattら、1995)もしくは
形質転換された細胞系におけるT7 RNAポリメラーゼの内在性の発現(Ra
deckeら、1995)のいずれかにより供給されている。
作用するシグナルを拘束することにより転写および複製を起動かつ達成する。そ
の後、ウイルス遺伝子が、その3’からその5’端へ一方向でゲノム鋳型から転
写される。一般に、それらの上流の隣接物(neighbors)(すなわち核
タンパク質遺伝子(NP))に関して、下流の遺伝子(例えばポリメラーゼ遺伝
子(L))から作成されるより少ないmRNAが存在する。従って、ゲノムの3
’端に関して該遺伝子の位置に従ったmRNAの豊富さの勾配が常に存在する。
ノムRNAもしくはトランスフェクションされたプラスミドから細胞内で産生さ
れたRNAが感染性でないために、最近まで困難と判明していた(Boyerと
Haenni、1994)。これらの方法は本明細書で「レスキュー(resc
ue)」と称される。数種の組換えのセグメント化されない負鎖RNAウイルス
の単離を可能にするcDNAレスキュー方法の操作方法に関する刊行物が存在す
る(Schnellら、1994)。これらの多様な負鎖ウイルスのレスキュー
のための技術が普遍的なテーマのあとに続くが;しかしながら、各ウイルスは成
功裏のレスキューのための識別する不可欠の成分を有する(BaronとBar
rett、1997;Collinsら、1995;Garcinら、1995
;HoffmanとBanerjee、1997;Lawsonら、1995;
Radeckeら、1995;Schneiderら、1997;Heら、19
97;Schnellら、1994;Whelanら、1995)。ゲノムcD
NAプラスミドのトランスフェクション後に、ファージのT7 RNAポリメラ
ーゼ、およびRNAを切断して3’末端を形成するベクターにコードされるリボ
ザイム配列の組み合わせられた作用により、ゲノムRNAの正確な1コピーが産
生される。このRNAは、コトランスフェクションされた発現プラスミドにより
最初に供給されるウイルスタンパク質によりパッケージングかつ複製される。流
行性耳下腺炎ウイルスの場合、レスキュー方法は未だ確立されなければならず、
そして従って流行性耳下腺炎のレスキュー方法を考案する必要性が存在する。流
行性耳下腺炎ウイルスのレスキュー方法の考案は、他のRNAウイルスに関する
研究と比較して、流行性耳下腺炎ウイルスの生物学に関する広範囲の研究の非存
在により複雑である。また、流行性耳下腺炎ウイルスは組織培養系で効率的に成
長しない。さらに、流行性耳下腺炎ウイルスゲノムの末端の配列は、以前に、レ
スキューを実施するのに十分に詳細に特徴づけられていない。
めには:1)T7 RNAポリメラーゼによるゲノムもしくはアンチゲノムRN
Aの正確な完全長の合成、およびリボザイム配列による3’端のプロセシング;
2)複製を開始するのに適切なレベルでのウイルスのNP、PおよびLタンパク
質の合成;3)転写的に活性かつ複製能力のあるヌクレオキャプシド構造へのゲ
ノムRNAの新たなパッケージング;ならびに4)複製が進行するのに十分なレ
ベルでの新たに形成されたヌクレオキャプシドからのウイルス遺伝子の発現、を
包含する多数の分子事象がトランスフェクション後に起こらなくてはならない。
する。レスキューされた流行性耳下腺炎ウイルスは、抗体生成、診断、予防およ
び治療の用途、細胞ターゲッティング、突然変異体ウイルスの製造ならびに免疫
原組成物の製造のような多数の用途を所有する。さらに、これらの用途への流行
性耳下腺炎の組換え的に製造されたJeryl Lynn株を使用することに対
する多数の利点が存在する。これらの利点のいくつかは、(1)弱毒表現型、(
2)投与される1億を超える投薬量に基づく実質的な安全性の記録、(3)単回
投与で長期間持続する免疫を誘導する能力、および(4)比較的低レベルのゲノ
ム組換えを包含する。
もしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る単離され
た核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに(ii)被包化、転写および複
製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードする最低1種の単離された核
酸分子を含んで成る最低1種の発現ベクター、を含んで成るレスキュー組成物の
トランスフェクションを実施することを含んで成る、組換え流行性耳下腺炎ウイ
ルスの製造方法を提供する。該トランスフェクションは、これらのベクターの共
発現および該組換えウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下で実施する。
その後、組換えウイルスを収穫する。
下腺炎ウイルスの以下のタンパク質、すなわちNP、M、F、SH、HN L、
ならびに上に示されたとおり流行性耳下腺炎ウイルスのP「シストロン」から生
成られるV、PおよびIタンパク質、またはこれらのいずれかの組み合わせを発
現するヌクレオチド配列に関する。関係する態様はこうしたヌクレオチド配列を
含んで成る核酸分子に関する。本発明の好ましい一態様は配列番号1、11およ
び12のヌクレオチド配列である。さらなる態様は、これらのヌクレオチド、上
の流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質およびそれらの変異体のアミノ酸配列に関
する。
断、予防および治療の利用性を所有する。これらの配列を使用して、被包化、複
製もしくは増幅を介する正常なウイルスの発生を妨害もしくは中断する化合物に
ついてのスクリーニング系を設計することができる。該ヌクレオチド配列はまた
、流行性耳下腺炎ウイルス、および/もしくは外来遺伝子を発現させるのに使用
される場合は他の病原体のための免疫原組成物の製造でも使用することができる
。加えて、発現される外来遺伝子は治療的用途を有することができる。
流行性耳下腺炎ウイルスによる感染および/もしくは他の病原体による感染の治
療もしくは予防方法(該方法はこうした組成物を使用する)での使用のため製造
される。
性耳下腺炎ウイルスの生成方法を提供する。該組換えウイルスはcDNAクロー
ンから製造され、そして、従って、定義された変化をゲノム中に有するウイルス
を得ることができる。さらなる態様は、コンセンサスゲノム配列、および/もし
くは外来遺伝子を発現するためのJeryl Lynn株の流行性耳下腺炎の集
団内のゲノム配列のいずれかを使用する。なぜなら、この免許をうけたワクチン
株は安全性について確立した弱毒表現型を包含するからである。コンセンサス配
列は流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムの提案された平均(average)由来
であるため、Jeryl Lynn株の集団内のゲノムのポリヌクレオチド配列
は本発明の態様である。
療および細胞ターゲッティングを包含する多くの用途のための外来遺伝情報、例
えば外来遺伝子を発現するためのベクターとしての、それから形成された組換え
ウイルスの使用にも関する。
明の目的を表す。
れている、流行性耳下腺炎ウイルスのJeryl Lynn株についての全長ゲ
ノムの共通ヌクレオチド配列(配列番号:1)である。
アミノ酸配列(配列番号:2)である。
ミノ酸配列(配列番号:3)である。
ミノ酸配列(配列番号:4)である。
ミノ酸配列(配列番号:5)である。
ミノ酸配列(配列番号:6)である。
ミノ酸配列(配列番号:7)である。
アミノ酸配列(配列番号:8)である。
アミノ酸配列(配列番号:9)である。
アミノ酸配列(配列番号:10)である。
5変異株の完全ヌクレオチド配列(配列番号:11)である。プラーク1は、5
ヌクレオチド位置においてプラーク2とは異なる(表7参照)。配列はアンチゲ
ノム(+,5’〜3’)センスにおけるDNAとして書かれている。
株の完全ヌクレオチド配列(配列番号:12)である。プラーク1は、5ヌクレ
オチド位置においてプラーク2とは異なる(表7参照)。配列はアンチゲノム(
+,5’〜3’)センスにおけるDNAとして書かれている。
造方法に関する。当該技術分野におけるこうした方法は「レスキュー」もしくは
逆(reverse)遺伝子的方法と称される。多様なセグメント化されない負
鎖ウイルスのためのいくつかのレスキュー方法が以下の引用される刊行物に開示
される:BaronとBarrett、1997;Collinsら、1995
;Garcinら、1995;Heら、1997;HoffmanとBaner
jee、1997;Lawsonら、1995;RadeckeとBillet
er、1997;Radeckeら、1995;Schneiderら、199
7;Schnell、1994;Whelanら、1995。レスキューに関す
る付加的刊行物は、MVおよびパラミクソウイルス亜科の他のウイルスについて
公開国際特許出願第WO 97/06270号明細書、およびRSVのレスキュ
ーについて公開国際特許出願第WO 97/12032号明細書を包含する。
ウイルス(Jeryl Lynn株)全体のコンセンサス配列を発生させること
、およびまた流行性耳下腺炎ウイルス(MUV)のミニレプリコンレスキュー系
を開発することが必要であった。コンセンサス配列は、細胞の流行性耳下腺炎ウ
イルス感染の間に存在するRNAゲノムの集団をサンプリングすることにより得
られる。相応して、本発明のさらなる態様は、流行性耳下腺炎ウイルスのゲノム
もしくはアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド配列またはその
タンパク質、ならびにこうした配列の変異体に関する。好ましくは、高ストリン
ジェンシーの条件下で、これらの変異体配列は1種もしくはそれ以上の流行性耳
下腺炎タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする(流行性
耳下腺炎ウイルスタンパク質の遺伝子の開始および遺伝子の終止端を包含する流
行性耳下腺炎ウイルスの完全な地図については、図9の表2を参照されたい)。
より好ましくは、高ストリンジェンシーの条件下で、これらの変異体配列は、配
列番号1、11および12のポリヌクレオチド配列のような1種もしくはそれ以
上の流行性耳下腺炎ウイルス株をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズ
する。高ストリンジェンシーのサザンハイブリダイゼーション条件を定義する目
的上、便宜的にSambrookら(1989)のpp.387−389(引用
することにより本明細書に組み込まれる)に言及することができ、ここでは第1
1段落の洗浄段階が高ストリンジェンシーと考えられる。本発明はまた、ポリヌ
クレオチド配列がヌクレオチド三重項の第三のヌクレオチドへの変化により参照
配列と異なる保存的変異体にも関する。好ましくは、これらの保存的変異体は流
行性耳下腺炎ウイルスの参照ポリヌクレオチドの参照配列に対する生物学的同等
物として機能する。本発明の「単離された」配列は天然に存在しない配列である
。例えば、これらの配列はウイルスのゲノム内でそれらの正常な状態から単離す
ることができるか;または、該配列は合成である(すなわち公知の組換え発現系
のような組換え技術を介して生成されるかもしくは機械により生成される)こと
ができる。
る核酸分子にも関する。上に示されたとおり、所定のヌクレオチドコンセンサス
配列は、Jeryl Lynn株のような流行性耳下腺炎ウイルスの集団内のゲ
ノムの1種もしくはそれ以上を含有することができる。特定の態様は配列番号1
、11もしくは12のコンセンサスヌクレオチド配列、または、転写される場合
に流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質(NP、P/I/V、M、F、SH、HN
およびL)の1種もしくはそれ以上を発現するヌクレオチド配列を使用する。こ
れらの流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質の遺伝子の開始、翻訳開始、翻訳終止
および遺伝子の終止については図10の表3を参照されたい。
ウイルスタンパク質NP、P/I/V、M、F、SH、HNおよびLのアミノ酸
配列、ならびにまたそれらのフラグメントもしくは変異体に関する。好ましくは
、フラグメントおよび変異体のアミノ酸配列、ならびに流行性耳下腺炎ウイルス
タンパク質を発現する変異体のヌクレオチド配列は、弱毒であるにしろ感染性で
あるにしろ双方であるにしろ、所望の組換え流行性耳下腺炎ウイルスを得るため
に、生物学的に同等である(すなわち、それらは、該タンパク質の実質的に同一
の機能を保持する)。こうした変異体のアミノ酸配列は本発明のポリヌクレオチ
ド配列によりコードされる。こうした変異体のアミノ酸配列は、流行性耳下腺炎
ウイルスタンパク質のアミノ酸配列に対する約70%ないし約80%、そして好
ましくは約90%の全体的類似性を有することができる。変異体ヌクレオチド配
列は、転写される場合に流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質のアミノ酸配列もし
くは流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質の変異体のアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列に対する約70%ないし約80%および好ましくは約90%のい
ずれかの全体的類似性を有することができる。流行性耳下腺炎ウイルスタンパク
質NP、P/I/V、M、F、SH、HNおよびLについての例示的ヌクレオチ
ド配列は、(それぞれ図8および9の)表1および2に記述する。
させることにより得ることができる。変異体は、鋳型配列の挿入、置換、欠失も
しくは再配列であることができる。流行性耳下腺炎のポリヌクレオチド配列の変
異体は、PCR突然変異誘発、アミノ酸(アラニン)スクリーニングおよび部位
特異的突然変異誘発のような慣習的方法により生成させることができる。変異体
の表現型は、変異体でのレスキューを実施して所望の組換え流行性耳下腺炎ウイ
ルスが得られるかもしくは所望の生物学的効果が得られるかどうかを評価するこ
とにより評価することができる。変異体はまた、所望の使用が免疫原組成物中に
ある場合は抗原性についても評価することができる。
できる。こうした変化はアミノ酸配列中のあるアミノ酸の代わりに他のアミノ酸
を用いることに基づき得ることができることが既知である。例えば、代替のアミ
ノ酸の置換により、タンパク質に小さなコンホメーション変化を賦与することが
でき、これは流行性耳下腺炎ウイルスの他のタンパク質と結合もしくは相互作用
する低下された能力をもたらすことができる。付加的な変化は、組換え流行性耳
下腺炎ウイルスの弱毒化のレベルを変えることができる。
olittle(1982)により論考されたようなアミノ酸のハイドロパシー
指標(hydropathic index)を使用することができ、ここでは
ある種のアミノ酸を類似のハイドロパシー指標を有する他のアミノ酸の代わりに
用いることができ、かつ、なお類似の生物学的活性を保持することができること
が見出された。あるいは、とりわけ生成されるべきポリペプチド中で望ましい生
物学的機能が免疫学的態様での使用を意図している場合には、親水性に基づいて
同様のアミノ酸の置換を行うことができる。例えば、その隣接するアミノ酸の親
水性により支配されるようなある「タンパク質」の最大の局所の平均の親水性が
その免疫原性と相関すると述べている、米国特許第4,554,101号明細書
(これにより引用することにより本明細書に組み込まれる)を参照されたい。従
って、置換は各アミノ酸に割り当てられる親水性に基づいて行うことができるこ
とが注目される。
かの使用において、これらの値が±2であり、±1がとりわけ好ましく、また、
±0.5以内のものが最も好ましい置換であるアミノ酸の置換を導入することが
好ましい。
ク質の好ましい特徴は、以下、すなわち(a)膜タンパク質であるか、もしくは
膜と直接会合されるタンパク質である;(b)SDSアクリルアミド(10%)
ゲルを使用して1個のタンパク質として分離されることが可能である;ならびに
(c)他の適切な流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質の存在下での所望の組換え
流行性耳下腺炎ウイルスのレスキューおよび産生への寄与においてその生物学的
機能を保持する、の1種もしくはそれ以上を包含する。
炎ウイルスのレスキューにおいて進むことができる。流行性耳下腺炎のレスキュ
ーは、レスキュー組成物を使用して媒体中で最低1個の宿主細胞のトランスフェ
クションもしくは形質転換を実施することにより達成される。レスキュー組成物
は(i)流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする最
低1種のポリヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子を含んで成る転
写ベクター、ならびに(ii)被包化、転写および複製に必要なトランスに作用
するタンパク質をコードする1種もしくはそれ以上の単離された核酸分子(1種
もしくは複数)を含んで成る最低1種の発現ベクターを;前記ベクターの共発現
および該組換えウイルスの産生を可能にするのに十分な条件下に含んで成る。ア
ンチゲノムにより、子孫のゲノムの合成の鋳型として作用する単離された正のメ
ッセージセンスポリヌクレオチド配列を意味する。好ましくは、ポリヌクレオチ
ド配列は、転写する複製するヌクレオキャプシドを生成させるのに必要なタンパ
ク質をコードする相補配列の正のセンス転写物とハイブリダイズする可能性を最
小限にするために、転写に際して、複製性の中間体RNAに対応する流行性耳下
腺炎ゲノムの正センスのバージョンもしくはアンチゲノムを提供するよう構築さ
れるcDNAである。転写ベクターは遺伝子要素、または流行性耳下腺炎の発現
において調節性の役割を有する要素、例えばプロモーター、構造遺伝子もしくは
流行性耳下腺炎RNAに転写されるコーディング配列、ならびに適切な転写開始
および終止配列の集成物を含んで成る、操作可能に連結された転写ユニットを含
んで成る。
孫のヌクレオキャプシドをRNAの複製および転写双方に対して能力があるよう
にするのに必要である、流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質、NP、PおよびL
と共発現される。NP、PおよびLタンパク質は、必要とされるタンパク質をコ
ードする1種もしくはそれ以上の発現ベクター(例えばプラスミド)から生成さ
れるが、とは言えこれらの必要とされるタンパク質の1種、または1種もしくは
それ以上は、安定な形質転換体としてこれらのウイルス特異的遺伝子および遺伝
子産物を含有しかつ発現するように工作された選択された宿主細胞内で産生させ
ることができる。好ましい一態様において、NP、PおよびLタンパク質は1個
の発現ベクターから発現される。より好ましくは、NP、PおよびLタンパク質
はそれぞれプラスミドのような別個の発現ベクターから発現される。後者の場合
、トランスフェクションもしくは形質転換の間に提供される各タンパク質の相対
的量をより容易に制御することができる。付加的な流行性耳下腺炎ウイルスタン
パク質は、NP、PもしくはLを発現するプラスミドから発現させることができ
るか、または、付加的タンパク質は付加的プラスミドを使用することにより発現
させることができる。
することができるが、NP、PおよびLを発現するプラスミドは、細胞内でNP
、PおよびLの有効なモル比を達成するよう調節される。有効なモル比は、所望
の組換え流行性耳下腺炎ウイルスの成功裏のレスキューを提供するのに十分であ
るNP、PおよびLの比である。これらの比は、ミニレプリコン(CAP/レポ
ーター)アッセイで観察されるところの発現プラスミドの比に基づいて得ること
ができる。一態様において、トランスフェクションするプラスミドpMUVNP
:pMUVPの分子比は最低約16:1であり、また、pMUVP:pMUVL
は最低約1:6である。好ましくは、pMUVNP:pMUVPの分子比は約1
6:1ないし約4:1であり、また、pMUVP:pMUVLは約1:6ないし
約1:1である。より好ましくは、pMUVNP:pMUVPの比は約6:1な
いし約5:1であり、かつ、pMUVP:pMUVLは約1:3ないし約1:2
である。
UVLと一緒のゲノムcDNAプラスミドのトランスフェクションもしくは形質
転換後に、ファージT7 RNAポリメラーゼ、およびRNAを切断して3’末
端を形成するベクターにコードされるリボザイム配列の組み合わせられた作用に
より、正確な1コピーのゲノムRNAが産生される。このRNAは、コトランス
フェクションされた発現プラスミドにより最初に供給されるウイルスタンパク質
によりパッケージングかつ複製される。流行性耳下腺炎ウイルスのレスキューの
場合、T7 RNAポリメラーゼを発現する供給源を、NP、PおよびLの供給
源(1種もしくは複数)とともに宿主細胞(もしくは細胞系)に添加する。流行
性耳下腺炎のレスキューは、適切に配置されたT7 RNAポリメラーゼプロモ
ーター、および流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質NP、PおよびLをコードす
る発現プラスミド(1種もしくは複数)を含有する流行性耳下腺炎ウイルスのゲ
ノムcDNAクローンでこの細胞系をコトランスフェクションすることにより達
成する。
されたDNA同等物を、適するDNA依存性RNAポリメラーゼプロモーター(
例えばT7 RNAポリメラーゼプロモーター)と、適する転写ベクター(例え
ば細菌プラスミド)に挿入される自己切断型リボザイム配列(例えばδ型肝炎リ
ボザイム)との間に配置する。この転写ベクターは容易に操作可能なDNA鋳型
を提供し、それからRNAポリメラーゼ(例えばT7 RNAポリメラーゼ)が
、正確なもしくはほぼ正確な5’および3’末端をもつウイルスアンチゲノム(
もしくはゲノム)の1本鎖RNAのコピーを転写する。ウイルスゲノムDNAの
コピーならびに隣接するプロモーターおよびリボザイム配列の向きが、アンチゲ
ノムのRNA同等物が転写されるかゲノムのRNA同等物が転写されるかを決定
する。
ー組成物は、特定の必要性もしくは用途について所望されるように変動させるこ
とができる。レスキュー組成物の一例は、(i)流行性耳下腺炎ウイルスのゲノ
ムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る単離さ
れた核酸分子を含んで成る転写ベクター、ならびに(ii)被包化、転写および
複製に必要なトランスに作用するタンパク質をコードする最低1種の単離された
核酸分子を含んで成る最低1種の発現ベクターを含んで成る組成物である。宿主
細胞中でのレスキュー組成物のトランスフェクションがこれらのベクターの共発
現および組換え流行性耳下腺炎ウイルスの産生をもたらすような転写および発現
ベクターを選択する。
種のゲノムもしくはアンチゲノムをコードする配列を含んで成る。該単離された
核酸分子は、ゲノム、アンチゲノムもしくはそれらの改変されたバージョンをコ
ードするポリヌクレオチド配列を含むことができる。一態様において、該ポリヌ
クレオチドは、操作可能に連結されたプロモーター、所望のゲノムもしくはアン
チゲノム、自己切断型リボザイム配列および転写ターミネーターをコードする。
、再配列、欠失もしくは置換により野性型流行性耳下腺炎ウイルスから改変され
ているゲノムもしくはアンチゲノムをコードする。好ましい態様において、ポリ
ヌクレオチド配列は組換え流行性耳下腺炎ウイルスのcDNAクローンをコード
する。複製するウイルスをレスキューから得る能力は、本来のゲノムおよびアン
チゲノムをコードするポリヌクレオチドがますます改変される際に減少すること
ができることが提案されている。ゲノムもしくはアンチゲノム配列は、流行性耳
下腺炎ウイルスのいずれかの株のもの由来であることができる。ポリヌクレオチ
ド配列はまた、1種もしくはそれ以上の異種供給源からのゲノムもしくはアンチ
ゲノムまたは遺伝子を組換え的に結合することから形成されるキメラゲノムもコ
ードすることができる。
として、または治療もしくは予防的免疫原組成物として使用することができるた
め、ポリヌクレオチドは選択された流行性耳下腺炎ウイルスの野性型もしくは弱
毒の形態もまたコードすることができる。多くの態様において、ポリヌクレオチ
ドは弱毒の感染性の形態の流行性耳下腺炎ウイルスをコードする。とりわけ好ま
しい態様において、ポリヌクレオチドは、公開国際特許出願第WO 98/13
501号明細書(これにより引用することにより組み込まれる)により記述され
るような、3’ゲノムプロモーター領域中に最低1個の弱毒突然変異を有しかつ
RNAポリメラーゼ遺伝子中に最低1個の弱毒突然変異を有する流行性耳下腺炎
ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコードする。
チゲノムをコードするポリヌクレオチド配列に加え、該ポリヌクレオチド配列は
また、1種もしくはそれ以上の異種遺伝子もしくは所望の異種ヌクレオチド配列
と一緒に所望のゲノムもしくはアンチゲノムもコードすることができる。これら
の変異体は、選択されたヌクレオチド配列を、流行性耳下腺炎のゲノムもしくは
アンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列中に導入することにより調製す
る。好ましくは、所望の異種配列を流行性耳下腺炎ゲノムの遺伝子間領域内に挿
入する。しかしながら、所望の異種配列は、流行性耳下腺炎のポリヌクレオチド
配列の非コーディング領域内に挿入することができるか、もしくは非コーディン
グ領域とコーディング領域との間に挿入することができるか、もしくはポリヌク
レオチド配列のいずれかの端に挿入することができる。代替の態様において、所
望の異種配列は、非必須遺伝子のコーディング領域内に、もしくは非必須遺伝子
のコーディング領域の代わりに挿入することができる。挿入部位の選択は、流行
性耳下腺炎ウイルスの発現の3’から5’への勾配を利用することができる。異
種ヌクレオチド配列(例えば遺伝子)を所望のとおり変動させることができる。
所望の組換えウイルスの用途に依存して、異種ヌクレオチド配列は、補助因子、
(インターロイキンのような)サイトカイン、T−ヘルパーエピトープ、制限マ
ーカー、アジュバント、または多様な微生物病原体(例えばウイルス、細菌、真
菌もしくは寄生虫)のタンパク質、とりわけ保護的免疫応答を導き出すことが可
能なタンパク質をコードすることができる。所望の流行性耳下腺炎ウイルスもし
くはミニレプリコンウイルスベクターのレスキューの見込みを最大限にするため
に、補助因子、(インターロイキンのような)サイトカイン、T−ヘルパーエピ
トープ、制限マーカー、アジュバント、または多様な微生物病原体(例えばウイ
ルス、細菌もしくは真菌)のタンパク質の免疫原性の部分をコードする異種配列
を選択することが望ましいことができる。他の型の非流行性耳下腺炎部分は、限
定されるものでないが癌細胞もしくは腫瘍細胞からのもの、アレルゲンアミロイ
ドペプチド、タンパク質もしくは他の巨大分子成分を挙げることができる。例え
ば、ある態様において、異種遺伝子は、組換えウイルスの予防的もしくは治療的
特徴を向上させるために選択されるインターロイキン−12のようなサイトカイ
ンをコードする。
的抗原、癌胎児性抗原、MUC−1、Her2、CA−125およびMAGE−
3を挙げることができる。
,877号明細書および公開国際特許出願第WO 99/51259号明細書(
これにより引用することにより組み込まれる)に記述されるものを挙げることが
でき、また、花粉、昆虫毒、動物の鱗屑、真菌の胞子および(ペニシリンのよう
な)薬物を包含する。こうした成分はIgE抗体(アレルギー反応の既知の原因
)の産生を妨害する。
ーシスもしくはアミロイド原性疾患と多様に称される疾患に関与している。β−
アミロイドペプチド(Aβペプチドともまた称される)はAPPの42アミノ酸
のフラグメントであり、これはβおよびγ分泌酵素酵素によるAPPのプロセシ
ングにより生成され、そして以下の配列: Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly
Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn
Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val
Gly Gly Val Val Ile Ala(配列番号97) を有する。
る。驚くべきことに、単離されたAβペプチドの投与が、脊椎動物宿主における
アミロイド沈着物のAβペプチド成分に対する免疫応答を誘導することが今や見
出された(公開国際特許出願第WO 99/27944号明細書を参照されたい
)。こうしたAβペプチドはまた関係のない部分にも連結されている。従って、
本発明の異種ヌクレオチド配列は、このAβペプチド、ならびにAβペプチドの
フラグメント、およびAβペプチドもしくはそれらのフラグメントに対する抗体
の発現を包含する。Aβペプチドの1つのこうしたフラグメントは、(米国特許
第4,666,829号明細書に開示されるような)以下の配列: Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly
Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val
Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn
Lys(配列番号98) を有する28アミノ酸のペプチドである。
ペプチドおよびタンパク質を送達するのに使用することができる流行性耳下腺炎
ウイルスベクターに関する本発明の態様で使用することができる。本明細書に示
される実施例は、流行性耳下腺炎ウイルス転写プロモーターの制御下の1種もし
くはそれ以上の異種遺伝子(および3、4もしくは5種の遺伝子さえ)を発現す
る流行性耳下腺炎ウイルスの能力を立証する。代替の態様において、付加的な異
種核酸配列は、単一の余分な転写ユニットとして発現される7ないし10kbま
での単一の配列であることができる。好ましくは、6の規則(the Rule
of Six)(CalainとRoux、1993)に従う。ある種の好ま
しい態様において、この配列は4ないし6kbまでであることができる。異種遺
伝情報を、付加的なモノシストロン性転写ユニットおよびポリシストロン性転写
ユニットの形態で挿入することもまたできる。付加的なモノシストロン性転写ユ
ニットおよびポリシストロン性転写ユニットの使用は、より多くの遺伝情報の挿
入を可能にするはずである。好ましい態様において、異種ヌクレオチド配列は、
1個もしくはそれ以上のリボソーム進入部位を含有することができる最低1個の
ポリシストロン性転写ユニットとして流行性耳下腺炎のゲノム配列内に挿入され
る。代替の好ましい態様において、異種ヌクレオチド配列は、ポリタンパク質、
および前記ポリタンパク質を切断してポリタンパク質の個々のポリペプチドを生
成させる十分な数のプロテアーゼをコードする。
細胞、例えば唾液腺、リンパ様組織、乳腺、精巣および脳細胞さえ感染させるこ
とができる流行性耳下腺炎ウイルスの通常の感染経路を利用するように選択する
ことができる。異種遺伝子はまた、遺伝子治療もしくは特定の細胞のターゲッテ
ィングに使用される作用物質を提供するのにも使用することができる。通常の流
行性耳下腺炎感染経路の間に曝露される正常細胞を単に利用することに対する一
代替として、異種遺伝子もしくはフラグメントは、組換え流行性耳下腺炎ウイル
スの一部として使用される場合に該組換え流行性耳下腺炎ウイルスを流行性耳下
腺炎ウイルスの正常の経路中にない細胞もしくは組織に向かわせる異なる病原体
からの別のタンパク質もしくはアミノ酸配列をコードすることができる。この様
式で、組換え流行性耳下腺炎ウイルスは広範な外来遺伝子の送達のためのベクタ
ーとなる。
て改変されたウイルスを生成させるのに、化学的突然変異原が添加された細胞培
養物中でのウイルスの成長の間の化学的突然変異誘発、次いで温度感受性および
/もしくは寒冷適合突然変異を選択するための至適に及ばない温度での継代にか
けられたウイルスの選択、細胞培養物中で小さなプラークを生じさせる突然変異
体ウイルスの同定、ならびに宿主範囲の突然変異について選択するための異種宿
主による継代、のような慣習的な手段を使用する。弱毒突然変異の導入の代替の
一手段は、部位特異的突然変異誘発を使用して予め決められた突然変異を作成す
ることを含んで成る。1種もしくはそれ以上の突然変異を導入することができる
。その後、これらのウイルスを、細胞培養物および/もしくは動物モデル中でそ
れらの生物学的活性の弱毒化についてスクリーニングする。弱毒流行性耳下腺炎
ウイルスをヌクレオチドシークエンシングにかけて、弱毒突然変異の部位の位置
をつきとめる。
識の確認および抗体に基づくアッセイのようなインビトロの手段により、その所
望の表現型(温度感受性、寒冷適合、プラークの形態学、ならびに転写および複
製の減弱)について試験する。
ルを用いて攻撃実験を実施することができる。非ヒト霊長類がヒト疾患の病因論
に好ましい動物モデルを提供する。これらの霊長類を最初に弱毒化された組換え
的に製造されたウイルスで免疫化し、その後野性型の形態の該ウイルスで攻撃す
る。
タンパク質をコードする単離された核酸分子の選択は、所望のウイルスの選択に
依存して変動することができる。宿主細胞中での転写ベクター(1種もしくは複
数)とのそれらの共発現、および選択された条件下での組換えウイルスの産生を
可能にするために、発現ベクターを調製する。
てウイルスゲノムcDNAを含有する転写ベクターからのアンチゲノム(もしく
はゲノム)の一本鎖RNAの転写を駆動する、適切な細胞環境、好ましくは哺乳
類を包含する。共転写的にもしくはその直後のいずれかに、このウイルスアンチ
ゲノム(もしくはゲノム)RNA転写物が、ヌクレオキャプシドタンパク質によ
り機能的鋳型中に被包化され、かつ、必要とされるウイルス特異的なトランスに
作用するタンパク質をコードするコトランスフェクションされた発現プラスミド
から同時に産生される必要とされるポリメラーゼ成分により拘束される。これら
の事象および過程は、ウイルスmRNAの欠くことのできない転写、新たなゲノ
ムの複製および増幅、ならびにそれにより新規ウイルスの子孫の産生すなわちレ
スキューにつながる。
ニアウイルスにより提供することができる。しかしながら、この系は、物理的も
しくは生化学的手段により、またはワクシニアウイルスにとって良好な宿主でな
い細胞もしくは組織中での反復される継代により、レスキューされたウイルスを
ワクシニアウイルスから分離することを必要とする。この要件は、哺乳動物細胞
中で増殖しないワクシニアウイルスの制限された株(例えばMVA−T7)を宿
主細胞として使用することにより回避される。バクテリオファージT7 RNA
ポリメラーゼを発現する2種の組換えMVAが報告されている。MVA/T7組
換えウイルスは、7.5Kの弱い初期/後期プロモーター(Sutterら、1
995)もしくは11Kの強い後期プロモーター(Wyattら、1995)の
いずれかの調節下に、組み込まれた1コピーのT7 RNAポリメラーゼを含有
する。
系は、レスキューに選択された条件に基づき広範に変動することができる。宿主
細胞は、所望の組換え流行性耳下腺炎ウイルスを産生するようにレスキュー組成
物のベクターの共発現を可能にする条件下で培養する。こうした宿主細胞は、真
核生物細胞、および好ましくは脊椎動物細胞を包含する広範な細胞から選択する
ことができる。鳥類細胞を使用することができるが、しかし好ましい宿主細胞は
ヒト胚腎細胞のようなヒト細胞由来である。例示的宿主細胞はヒト293細胞、
A549細胞およびHep2細胞である。Vero細胞ならびに多くの他の型の
細胞もまた宿主細胞として使用することができる。適する宿主細胞の他の例は:
(1)ヒト二倍体一次細胞系:例えばWI−38およびMRC5細胞;(2)サ
ル二倍体細胞系:例えばFRhL−胎児アカゲザル肺細胞;(3)擬(quas
i)一次連続細胞系:例えばAGMK−アフリカミドリザル腎細胞;(4)CH
O、MDCK(Madin−Darbyイヌ腎)および一次ニワトリ胚線維芽細
胞(CEF)のような他の潜在的細胞系である。数種の真核生物細胞系はウイル
スの増殖に他者より適しており、また、数種の細胞系は数種のウイルスについて
全くうまくゆかない。生存可能なウイルスのレスキューを容易に検出することが
できるために、検出可能な細胞変性効果を生じさせる細胞系を使用する。流行性
耳下腺炎の場合、該ウイルスはVero細胞上で迅速に広がりかつ容易に検出可
能なプラークを作成するため、トランスフェクションされた細胞をVero細胞
上で共培養することができる。一般に、選択されたウイルスの成長を許容する宿
主細胞を使用する。
て細胞によるDNAの取込みを増大させることができる。これらの試薬の多くが
当該技術分野で既知である。リポフェクテース(LIPOFECTACE)(ラ
イフ テクノロジーズ(Life Technologies)、メリーランド
州ゲイタースバーグ)およびエフェクティーン(EFFECTENE)(キアゲ
ン(Qiagen)、カリフォルニア州バレンシア)が普遍的な例である。リポ
フェクテース(Lipofectace)およびエフェクティーン(Effec
tene)は双方が陽イオン性脂質である。それら双方はDNAを被覆しかつ細
胞によるDNAの取込みを高める。リポフェクテース(Lipofectace
)はDNAを取り巻くリポソームを形成する一方、エフェクティーン(Effe
ctene)はDNAを被覆するがしかしリポソームを形成しない。
ラスミドベクターであることができる。被包化、転写および複製に必要なトラン
スに作用するタンパク質をコードする最低1種の単離された核酸分子を含んで成
る発現ベクターは、これらのタンパク質を同一の発現ベクターもしくは最低2個
の異なるベクターから発現することができる。これらのベクターは基本的なレス
キュー方法から公知であり、そしてそれらは本発明の改良方法での使用のために
変えられる必要はない。
7℃)を使用することができるが;しかしながら、上昇された温度でのレスキュ
ーが組換えRNAウイルスの回収を向上させることが示されている。上昇された
温度は熱ショック温度と称される(公開国際特許出願第WO 99/63064
号明細書(これにより引用することにより本明細書に組み込まれる)を参照され
たい)。効果的な熱ショック温度は、組換えウイルスの回収のレベルが向上され
る組換えウイルスのレスキューの実施に示唆される標準的温度より上の温度であ
る。温度範囲の例示的一覧は以下のとおりである:38℃から約47℃まで、約
42℃から約46℃までがより好ましい。あるいは、43℃、44℃および45
℃の熱ショック温度がとりわけ好ましいことが注目される。
段を使用する。本明細書の実施例に示されるとおり、クロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ(CAT)レポーター遺伝子を使用して組換えウイルス
のレスキューの条件をモニターかつ至適化する。レポーター遺伝子の対応する活
性が、組換えウイルスの発現の基礎および試験レベルを確立する。他の方法は、
得られた組換えウイルスのプラークの数を検出すること、およびシークエンシン
グによりレスキューされたウイルスの産生を確かめることを包含する。
ランスフェクションされたレスキュー組成物を、プラーク拡張段階(すなわち増
幅段階)にかける。トランスフェクションされたレスキュー組成物を、最低一層
のプラーク拡張細胞(PE細胞)上に移す。トランスフェクションされた細胞か
らの組換えウイルスの回収は、流行性耳下腺炎ウイルスもしくは組換え流行性耳
下腺炎ウイルスが高められた成長を表すプラーク拡張細胞を選択することにより
向上される。好ましくは、レスキュー組成物を含有するトランスフェクションさ
れた細胞を、実質的にコンフルエントなPE細胞の単層上に移す。プラーク拡張
を包含するレスキュー技術の多様な改変は、公開国際特許出願第WO 99/6
3064号明細書にもまた示される。
よび治療の用途に使用する。好ましくは、本発明の方法から製造される組換えウ
イルスは弱毒化される。弱毒組換えウイルスは、ヒトおよび動物宿主を感染させ
る野生型ウイルスに比較して、毒性の実質的な低下を表すはずである。弱毒化の
程度は大部分の個体において感染の症状が生じることができないようであるが、
しかし、該ウイルスは感染性であるのに十分な複製能力を保持しかつワクチンに
所望の免疫応答の特徴を導き出すことができる。弱毒組換えウイルスは、単独で
、または医薬、抗原、免疫化剤もしくはアジュバントとともに、疾患の予防もし
くは改善におけるワクチンとして使用することができる。これらの有効成分は、
慣習的手段により、すなわち希釈剤もしくは製薬学的に許容できる担体を使用す
ることにより処方かつ送達することができる。
流行性耳下腺炎ウイルスは、(i)最低1種の組換え的に製造された弱毒流行性
耳下腺炎ウイルスおよび(ii)製薬学的に許容できる緩衝剤または希釈剤、補
助物質もしくは担体の最低1種を含んで成る免疫原組成物で使用する。好ましく
は、これらの組成物は流行性耳下腺炎の感染の予防および/もしくは改善におけ
る免疫原組成物としての治療的および予防的用途を有する。こうした用途におい
て、免疫学的有効量の本発明の最低1種の弱毒組換え流行性耳下腺炎ウイルスを
、通常の流行性耳下腺炎感染の経過において実質的な低減を引き起こすためにこ
うした量で使用する。
原組成物は付加的抗原成分(例えばポリペプチドもしくはそのフラグメント、ま
たは抗原もしくはそのフラグメントをコードする核酸)を含むことができ、かつ
、好ましくは製薬学的に許容できる担体を包含する。適する製薬学的に許容でき
る担体および/もしくは希釈剤は、いずれかのかつ全部の慣習的な溶媒、分散媒
、増量剤、固体担体、水性溶液、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤お
よび吸収遅延剤などを包含する。「製薬学的に許容できる担体」という用語は、
それが投与される患者においてアレルギー反応もしくは他の都合の悪い影響を引
き起こさない担体を指す。適する製薬学的に許容できる担体は、例えば水、生理
的食塩水、リン酸緩衝生理的食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど
の1種もしくはそれ以上、ならびにそれらの組み合わせを包含する。製薬学的に
許容できる担体は、抗原の貯蔵寿命もしくは有効性を高める、少量の湿潤剤もし
くは乳化剤、保存剤もしくは緩衝剤のような補助物質をさらに含むことができる
。製薬学的有効成分のためのこうした媒体および作用物質の使用は当該技術分野
で公知である。いずれかの慣習的媒体もしくは作用物質が有効成分と不適合であ
る限りを除き、本発明の免疫原組成物におけるそれらの使用が企図される。
の慣習的な有効な形態によることができるか、またはエアゾルスプレーによるよ
うな鼻内、口腔、眼、肺、膣もしくは直腸表面のような粘膜表面に局所的に適用
することができる。好ましい投与手段は非経口もしくは鼻内である。
ン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど
のような通常使用される賦形剤を包含する。
リン酸アルミニウム;スティミュロン[Stimulon](商標)QS−21
(アキラ バイオファーマシューティカルズ インク(Aquila Biop
harmaceuticals,Inc.)、マサチューセッツ州フラミンガム
);MPL(商標)(3−O−デアシル化モノホスホリルリピドA;RIBI
イムノケム リサーチ(RIBI ImmunoChem Research)
、モンタナ州ハミルトン)、IL−12(ジェネティックス インスティテュー
ト(Genetics Institute)、マサチューセッツ州ケンブリッ
ジ);N−アセチルムラミル−L−トレオニル−D−イソグルタミン(thr−
MDP);N−アセチルノルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(C
GP 11637、ノル−MDPと称される);N−アセチルムラミル−L−ア
ラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’−ジパルミト
イル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)エチルアミン(CG
P 19835A、MTP−PEと称される);およびコレラトキシンを挙げる
ことができるアジュバントを包含することができる。使用することができる他者
は、そのBサブユニット(例えば、その中でアミノ酸位置29のグルタミン酸が
、公開国際特許出願第WO 00/18434号明細書(これにより本明細書に
組み込まれる)に従って、別のアミノ酸、好ましくはヒスチジンにより置き換え
られる)を包含するコレラトキシンの非毒性の誘導体、および/またはコレラト
キシンもしくはそのBサブユニット、プロコレラゲノイド(procholer
agenoid)、真菌多糖との非流行性耳下腺炎ポリペプチドの複合物もしく
は遺伝子的に工作された融合物である。
中の唯一の活性の免疫原として投与することができる。あるいは、しかしながら
、免疫原組成物は、他の病原体種に対する他の免疫学的に活性の抗原を包含する
他の活性の免疫源を包含することができる。他の免疫学的に活性の抗原は、複製
病原体もしくは非複製病原体であることができる。複製病原体は、例えば弱毒形
態の麻疹ウイルス、風疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、パライン
フルエンザウイルス(PIV)およびRSウイルス(RSV)を包含する。
階を含んで成る、前記哺乳動物における免疫応答の誘導方法に関する。該免疫原
組成物は、こうした組成物中に含有される免疫学的有効量のポリペプチド(1種
もしくは複数)が流行性耳下腺炎感染に対する所望の応答をもたらすような、治
療された動物もしくはヒトにおいて免疫原性である組成物である。好ましい態様
は、免疫学的有効量の免疫原組成物をヒトに投与することを含んで成る、ヒトに
おける流行性耳下腺炎感染の改善を包含する治療、もしくは予防方法に関する。
投薬量は個体の特定の状態に依存して変動することができる。この量は、当業者
に既知の手段による慣例の試験で決定することができる。
サブユニットワクチンの形成で使用することができる。それらはまた、ポリクロ
ーナルもしくはモノクローナル抗体を生じさせるために抗原として、および抗流
行性耳下腺炎ウイルスタンパク質反応性抗体の検出のためのイムノアッセイで使
用することもできる。本発明により包含されるイムノアッセイは、限定されるも
のでないが、米国特許第4,367,110号(二重モノクローナル抗体サンド
イッチアッセイ)および米国特許第4,452,901号明細書(ウェスタンブ
ロット)(これらの米国特許は引用することにより本明細書に組み込まれる)に
記述されるものを挙げることができる。他のアッセイは、インビトロおよびイン
ビボ双方の標識されたリガンドの免疫沈降および免疫組織化学を包含する。
する段階を含んで成る、流行性耳下腺炎感染の診断方法、もしくは投与された流
行性耳下腺炎ワクチン株の同定方法も提供する。いかなる慣習的診断方法も使用
することができる。これらの診断方法は、アミノ酸配列もしくはポリペプチドの
存在に容易に基づくことができる。好ましくは、こうした診断方法は、本発明の
アミノ酸配列に普遍的である最低10、および好ましくは最低20のアミノ酸を
有するポリペプチドに合致する。
きる。これらの核酸配列は、流行性耳下腺炎ウイルスタンパク質をコードする核
酸配列に特異的にハイブリダイズする能力を有する比較的短いDNAおよびRN
A配列を調製するのに使用することができる。核酸プローブは、診断アッセイの
特異性の選択されたパラメータに照らして所望の長さについて選択する。該プロ
ーブは、所定のサンプル中の、病原性生物体の存在を検出するための診断アッセ
イ、もしくは投与された流行性耳下腺炎ワクチンの同定において使用することが
できる。組換え発現のための現在の進歩した技術を用い、存在する抗体との反応
性、または診断もしくは治療試薬を生成させる能力について対応するオリゴペプ
チドおよびポリペプチドをスクリーニングする目的上、発現構築物中に核酸配列
を挿入することができる。適する発現制御配列および宿主細胞/クローニングベ
ヒクルの組み合わせは当該技術分野で公知であり、そして、例としてSambr
ookら(1989)に記述される。
される核酸配列は、最低約10ないし約20ヌクレオチドのヌクレオチド伸長に
相補的である配列を包含するが、とは言え最低約10ないし30、もしくは約3
0ないし60ヌクレオチドを使用することができる。Falkowら、米国特許
第4,358,535号明細書に記述されるもののような診断アッセイを包含す
る、多様な既知のハイブリダイゼーション技術および系を、本発明のハイブリダ
イゼーションの局面の実務に使用することができる。
イブリダイゼーションにおける試薬として、ならびに固相を使用する態様におい
ての双方で有用であることができることが予見される。固相を必要とする態様に
おいて、滲出液、体液(例えば羊膜液、中耳滲出液、気管支肺胞洗浄液)、もし
くはなお組織のような疑われる臨床サンプルからの試験DNA(もしくはRNA
)を、選択されたマトリックスもしくは表面に吸収させるかもしくは別の方法で
固定する。その後、この固定された一本鎖核酸を、所望の条件下に選択されたプ
ローブを用いる特異的ハイブリダイゼーションにかける。選択された条件は、必
要とされる特定の基準(例えば、G+C含量、標的核酸の型、核酸の供給源、ハ
イブリダイゼーションプローブの大きさなどに依存する)に基づく特定の情況に
依存することができる。非特異的に結合されたプローブ分子を除去するようなハ
イブリダイズされた表面の洗浄の後に、特異的ハイブリダイゼーションを標識に
よって検出、もしくは定量さえする。
それらの変異体は、例えば米国特許第4,603,102号明細書に述べられる
ようなPCR(商標)技術とともに有用であることができる。本発明の流行性耳
下腺炎ウイルス配列のいずれかの多様な部分を、流行性耳下腺炎ウイルス遺伝子
の定義された一部分、もしくは流行性耳下腺炎ウイルスヌクレオチドのPCR(
商標)増幅のためのオリゴヌクレオチドプローブとして利用することができ、そ
の配列をその後、相補的配列を含有するハイブリダイゼーションプローブを用い
るハイブリダイゼーションにより検出することができる。この様式で、極端に低
い濃度の流行性耳下腺炎核酸を、本発明のヌクレオチド配列を利用してサンプル
中で検出することができる。
ながら、当業者は、本開示に照らして、多くの変更を、開示される特定の態様で
行うことができ、かつ、本発明の技術思想および範囲から離れることなく同様の
もしくは類似の結果をなお得ることができることを認識するはずである。
を制限すると解釈されるべきでない。
S Inc.Preston,CT)から得られ、そして5%胎児ウシ血清を補
足されたイーグルの基本培地(BME)において培養された。Hep2細胞、2
93細胞、A549、およびVero細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション(ATCC)から得られ、そして10%胎児ウシ血清を補足され
たDulbeccoの改変イーグル培地(DMEM)において増殖された。流行
性耳下腺炎ウイルスのJeryl Lynn株は、MumpsvaxR,ロット
番号0089E,0656J,および1159H(Merck and Co.
,Inc.,West Point,PA)のバイアルからCEF細胞において
直接培養された。バクテリオファージT7RNAポリメラーゼを発現する組み換
えワクシニアウイルスは、Dr.B.Moss[(National Inst
itutes of Health,Bethesda,MD)、Wyatt
et al.,1995、参照]から得られた。
炎ウイルスJeryl Lynn株は、5%胎児ウシ血清を補足されたDulb
eccoの改変イーグル培地(DMEM)または5%胎児ウシ血清を補足された
イーグルの基本培地(BME)における一次ニワトリ胚繊維芽細胞(CEF,S
pafas,Inc.)においてMumpsvaxR(ロット番号1159H,
Merck and Co.,Inc.)のバイアルから直接培養された。T−
75フラスコにおいて塗布されたCEFは、室温で2時間、感染多重度(moi
)約0.002において再懸濁されたMumpsvaxにより感染された。イノ
キュラムが細胞から除去され、そして新鮮培地で置換された。細胞は37℃で4
日間培養され、この時点で広範囲のシンシチウムおよび細胞変性が観察された。
ウイルスが培養培地中に細胞を掻き取ることによって回収され、続いてドライア
イス/エタノール浴中で2回凍結・融解され、そして37℃でインキュベートさ
れた。細胞デブリは、BeckmanGS−6KR遠心機(Beckman,I
nstruments,Inc.,Palo Alto,CA)において2,5
00rpmでの遠心分離によって除去された。ウイルスは−80℃で保存された
。
ルスRNAは、製造者(GibcoBRL,Grand Island,NY)
によるTrizol LS試薬を用いて凍結された一定分量のウイルスから単離
された。ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)へと続く逆転写は、鋳型として
単離されたウイルスRNAおよびTitan One−Tube RT−PCR
System(Boehringer Mannheim,Indianan
polis,IN)を用いて実施された。流行性耳下腺炎ゲノムは、次のプライ
マーペアを用いて、4個の別々のフラグメントにおいて増幅された:5′-1ACCAA
GGGGAGAATGAATATGGG23(配列番号95)および5′-3875CTGAACTGCTCTTACTAATCTG
GAC3851(配列番号82)(3.9kb産物);5′-3773CTGTGTTACATTCTTATCTGTGACAG3 798 (配列番号21)および5′-7783TGTAACTAGGATCTGATTCCAAGC7760(配列番号
72)(4kb産物);5′-7678AGAGTTAGATCAGCGTGCTTTGAG7701(配列番号32)
および5′-11685CCTTGGATCTGTTTTCTTCTACCG11662(配列番号62)(4kb産物);
5′-11529GTGTTAATCCCATGCTCCGTGGAG11552(配列番号42)および5′-15384ACC
AAGGGGAGAAAGTAAAATC15363(配列番号53)(3.9kb産物)。製造者(Boeh
ringer Mannheim,Indiananpolis,IN,カタロ
グ番号1855476)から指示されるプロトコールがRTおよびPCR条件に
ついて行われた。PCR生成物は1%アガロースゲルにおいて精製された。
Sequencer(Applied Biosystems,Inc.,Fo
ster City,CA)を用いて配列決定された。シークエンシングのため
に、以下の表4に示されるような全流行性耳下腺炎ゲノムにわたる一連のプライ
マーが設計された。これらのプライマー配列は、不完全に配列決定された流行性
耳下腺炎ウイルス株の様々な組み合わせについてGenbankから得られたヌ
クレオチド配列情報に基づいた。公表された配列を用いて、タンパク質をコード
している仮定の流行性耳下腺炎ゲノム配列が得られ、次いで、プライマーがそれ
から生成された。
おける配列を正確に決定するために、ウイルスゲノムRNAがその末端において
結合され、次いで、cDNAが結合領域を横断してPCRによって増幅された。
各反応では、3−5μgウイルスRNAが、10%DMSO、5X連結反応バッ
ファーおよび脱イオン水中で83℃で3分間インキュベートされてすべての2次
構造を変性し、次いで直ちに氷上に置かれた。T4RNAリガーゼ(20ユニッ
ト,New England Biolabs,Inc.,Beverly,M
A)およびRNasin(Promega)40ユニットが添加されて最終連結
反応混合液20μlが得られ、これが16℃で一夜インキュベートされた。連結
反応生成物は、フェノール/クロロホルム抽出され、そしてゲノムの結合領域に
わたる次のプライマーペアを用いてRT−PCRにかけられた:5′-15166GCGCA
TTGATATTGACAATG15185(配列番号52)および5′-216CCCTCCTCACCCCTGTCTTG197 (配列番号92)。PCR生成物は、次のネストプライマーを用いて第2ラウン
ドのPCRにかけられた:5′-15227GAATAAAGACTCTTCTGGC15245(配列番号93
)および5′-138GGTAGTGTCAAAATGCCCCC119(配列番号94)。最終PCR生成物
はゲル生成され、そして配列決定された。
団の混合物を含有することが分かっていた(Afzal et al.,199
3)。したがって、レスキュー過程においてサブオプティマルなタンパク質−タ
ンパク質相互作用の可能性を最小にする(異なるウイルス集団由来のcDNAフ
ラグメントを一緒にゲノムcDNAにスプライシングすることによって)ために
、Jeryl Lynnワクチン調製物から良好に分離されたプラーク(プラー
ク分離株4,PI4)が選別され、そして全長ゲノムcDNA、ならびにNP,
PおよびL発現プラスミドの誘導のために増幅された。
、pMUVP、pMUVL)は、脳心筋炎ウイルス(EMC)のキャップ非依存
性翻訳エンハンサー(CITE)を含有する改変プラスミドベクターpEMC(
Moss et al.,1990)のT7RNAポリメラーゼプロモーターお
よびT7RNAポリメラーゼ転写終結配列間の各ORFのcDNAをスプライシ
ングすることによって構築された。総MUV感染細胞(CEF)RNAからの、
MUV NPタンパク質ORFのRT−PCR増幅のために使用されるプライマ
ーは、5′CGTCTCCCATGTTGTCTGTGCTCAAAGC(配列番号99)および5′ATCATTCTCG
AGTTGCGATTGGGGTTAGTTTG(配列番号100)であった;得られるcDNAフラグ
メントはゲル精製され、BsmBIおよびXhoIにより切断(trim)され
、次いでNcoI/XhoIカットpEMC中に結合されて、NPタンパク質O
RFのAUGがCITEに隣接された。MUV P ORFの増幅のためのプラ
イマーは、5′TTCCGGGCAAGCCATGGATC(配列番号101)および5′ATCATTCTCGAG
AGGGAATCATTGTGGCTCTC(配列番号102)であった。P ORF cDNA(ウ
イルスポリメラーゼによって同時転写により挿入されてP mRNAを生成する
2つのGヌクレオチドを含むように部位特異的突然変異によって改変された)は
、また、pEMCのNcoI/XhoI部位中にクローン化された。その大きい
サイズのために、Lタンパク質ORFは、2段階において構成された;プライマ
ー5′ATCATTCGTCTCCCATGGCGGGCCTAAATGAGATACTC(配列番号103)および5′CT
TCGTTCATCTGTTTTGGATCCG(配列番号104)が、第1段階において使用されて、
BsmBIおよびBamHIにより切断され、次いでpEMCのNcoI/Ba
mHI中にクローン化されるcDNAフラグメントが生成された。第2段階では
、プライマー5′CAGAGTACCTTATATCGGATCC(配列番号105)および5′ATCATTCT
GCAGGAATTTGGATGTTAGTTCGGCAC(配列番号106)が使用されて上記段階1から
のプラスミドのBamHI/PstI部位中にクローン化されるcDNAフラグ
メントが増幅され、Lタンパク質ORFが完成された。3種のORFの各々につ
いて4種のcDNAクローンが配列決定され、そしてJeryl Lynn共通
ヌクレオチド/アミノ酸配列に対する最高レベルの相同性をもつORFが、各場
合、レスキュー実験における使用のために選ばれた。
ポリメラーゼプロモーター配列は、正確なMUV5’末端ヌクレオチドにより転
写を開始するよう設計され、そしてHDVリボザイム配列(Been et a
l.)が、ミニレプリコンRNA転写物中に正確なMUV3’末端ヌクレオチド
を生成するよう置かれた。複製T7RNAポリメラーゼ末端シグナルは、HDV
リボザイム配列後に包含された。細菌のクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ(CAT)ORFは、MUVゲノムのコーディングおよびシストロン
間配列のすべてを置換する;残りの必須MUV特異的配列は、隣接した90nt
NP遺伝子非翻訳領域(UTR)をもつ3’MUVリーダー(55nt)、およ
び137ntL遺伝子UTRに隣接した5’MUVトレーラー(24nt)を含
有する。
すcDNAから構成され、この場合コーディングおよびシストロン間領域はCA
T ORFによって置換された。MUV5’および3’末端についてのcDNA
は、プライマーペア5′ACCAAGGGGAGAATGAATATGGG(配列番号107)/5′ATCAT
TCGTCTCTTTTCCAGGTAGTGTCAAAATGCC(配列番号108)、および5′ACCAAGGGGAGA
AAGTAAAATC(配列番号109)/5′ATCATTCGTCTCTATCGAATAAAGACTCTTCTGGC(配
列番号110)をそれぞれ使用して、総感染細胞(CEF)RNAからのRT/
PCRによって増幅された。PCRの第2ラウンドでは、ネストプライマーが、
それぞれMUV5’および3’末端に、T7RNAポリメラーゼプロモーターお
よび肝炎デルタウイルス(HDV)リボザイム配列を付加するために使用された
;これらのプライマーペアは、T7RNAポリメラーゼプロモーターの付加のた
めには5′AAGCTCGGCGGCCGCTTGTAATACGACTCACTATAACCAAGGGGAGAAAGTAAAATC(配列
番号111)/5′ATCATTCGTCTCTATCGAATAAAGACTCTTCTGGC(配列番号112)、
そしてリボザイム成分の付加のためには5′ATCATTGGCGCCAGCGAGGAGGCTGGGACCATG
CCGGCCACCAAGGGGAGAATGAATATGGG(配列番号113)/5′ATCATTCGTCTCTTTTCCAG
GTAGTGTCAAAATGCC(配列番号114)であった。CAT ORF cDNAは、
プライマー5′TCATTCGTCTCGGAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACC(配列番号115
)および5′ATCATTCGTCTCTCGATTTACGCCCCGCCCTGCCACTC(配列番号116)を用
いて増幅された。すべて3成分はゲル精製され、BsmBIで切断され、4ウエ
イ(4−way)結合においてともに接合され、そして改変pBSK S(+)
(Sidhu et al.,1995)のNotI/NarI部位にクローン
化されて、完全ミニレプリコンプラスミド、pMUVCATを生成した。
DNA(pMUVFL)は、pMUVCATの構築のために使用された同じプラ
スミド骨格への隣接するcDNAフラグメントの連続的クローニングによって5
’末端〜3’末端を構成された(図2参照)。各cDNAフラグメントは、ユニ
ーク制限部位を適当に含有するプライマーペアを用いるRT−PCRによって総
感染細胞RNAから増幅された;各場合、段階的クローニング戦略を容易にする
ために、ウイルス特異的エンドヌクレアーゼ部位に加えて5’近接のNotI部
位を含有した。成長する全長クローンへの付加前に、ウイルス3’末端からBs
sHII部位にわたるcDNAフラグメントが、pBluescriptII
SK(+)(Stratagene,La Jolla,CA)中に別々に構成
された。第1段階では、BssHII/ClaIcDNAフラグメントが、5’
延長プライマーを用いてpBluescriptのClaI/XhoI部位中に
クローン化されてウイルス特異的BssHII部位に隣接するXhoI部位を生
成した。第2段階では、ウイルス3’末端〜ClaIcDNAフラグメントが、
第1段階からのプラスミドのNotI/ClaI部位中にクローン化されてウイ
ルス3’末端〜BssHII配列が完成した。T7RNAポリメラーゼプロモー
ター配列は、ウイルス3’末端/ClaI末端フラグメントを生成するために使
用された(+)センスRT/PCRプライマーへの組み入れによってウイルス3
’末端に付加された。ゲノムcDNAの5’末端フラグメント(BamHI/N
arI)は、HDVリボザイム配列のNarI部分に5’末端を付加するために
、PCR増幅の第2ラウンドにおいて別々に改変された。4クローニングサイク
ルのすべてがpMUVFLの構成のために用いられた;各ラウンド後、4クロー
ンは、新しく付加されたcDNAの領域において配列決定され、そしてMUV共
通配列に比較された。最少突然変異数を含有するcDNAクローンが、次いで、
次のcDNAフラグメントの付加のために選択された。完全に構成されたcDN
Aが再び配列決定されて細菌増殖の間の安定性が証明された。エレクトロコンピ
テントSURE細胞(Stratagene,La Jolla,CA)および
DH5アルファ細胞(GibcoBRL,Grand Island,NY)が
、MUVcDNAのクローニングのための細菌宿主として使用された。
のために、細胞はMUVにより感染され、そしてイン・ビトロで転写されたMU
VCATミニレプリコンRNAを用いてトランスフェクションされるか、または
MVA−T7により感染され、そしてpMUVNP、pMUVPおよびpMUV
L発現プラスミドとともにpMUVCATによりトランスフェクションされるか
いずれかであった。イン・ビトロの転写は、製造者のプロトコール(Prome
ga,Madison,WI)にしたがって最終容量20μlにおいてT7RN
Aポリメラーゼのための鋳型としてpMUVCAT4μgを用いて実施された;
次いで、鋳型DNAがRQ−1DNアーゼにより消化された。6穴ディッシュに
おいて約80%集密まで増殖された293細胞の一夜培養物が、moi1−2に
おいてMUVにより感染された;感染後1時間(hpi)に、製造者のプロトコ
ールにしたがって、イン・ビトロ転写反応液5−10μl(約5−10μgRN
A)およびLipofectACE(GibcoBRL)10−12μlを含有
する混合液が各ウエルに添加された。48hpiにおいて、細胞は懸濁液中にか
き集められ、遠心によって回収され、0.25MtrisバッファーpH7.8
100μl中に再懸濁され、3回の凍結−融解にかけられた。澄明な細胞抽出
液が、次に、基質としての14C標識クロラムフェニコール(Sidhu et
al.,1995)か、または蛍光標識クロラムフェニコール(Molecul
ar Probes.Eugene,Ore)かいずれかを用いてCAT活性を
アッセイされ、続いて薄層クロマトグラムにおいて反応生成物が分析された。
ep2およびA549細胞が、6穴ディッシュにおいて約80%集密まで一夜増
殖され、moi 10においてMVA−T7により感染され、そして1hpiに
、200ngpMUVCAT、300ngpMUVNP、50ngpMUVP、
200ngpMUVL、およびLipofectACE10−12μlを含有す
る混合液によりトランスフェクションされた。24hpiにおいて、トランスフ
ェクション混合液は、新鮮な増殖培地2mlで置換され、そして細胞がさらに2
4時間培養され、続いて上記のように細胞抽出液の調製およびCATアッセイが
行われた。
UVのレスキューのために、6穴ディッシュにおいて約90%集密まで一夜増殖
されA549細胞は、moi4においてMVA−T7により感染された;1hp
iにおいて、細胞は、3−7ugpMUVFL、300ngpMUVNP、50
ngpMUVP、200ngpMUVLおよびLipofectace14μl
を含有する混合液によりトランスフェクションされた。24hpiにおいて、ト
ランスフェクション混合液は、増殖培地(10%胎児ウシ血清を含有するDME
M)で置換され、そして細胞は37℃でさらに24時間培養された;上澄液(P
1)か、または懸濁液中にかき取られた総トランスフェクション細胞モノレヤー
のいずれかが、集密なA549細胞モノレヤー上に直接移され、これが37℃で
4日間培養され、次いで、MUV感染性フォーカスを検出するために全細胞EL
ISA(下記参照)のために調製された。これらのA549指標細胞からの上澄
液(P2)は、集密Vero細胞モノレヤー上に継代され、37℃で3−4日間
培養されてMUV誘導シンシチウムが観察された。
MUV)の最初の同定は、全細胞ELISAを用いて実施された;感染性上澄液
(上記参照)により感染されたA549細胞は、1Xリン酸バッファー食塩水(
PBS)中10%ホルムアルデヒドにより室温で30分間固定された;次いで、
細胞はPBSで1回、そしてブロッキング溶液(x1PBS中5%(w/v)ミ
ルク)で1回洗浄され、続いてブロッキング溶液中4℃で一夜インキュベートさ
れた。次いで、一夜ブロッキング溶液は除去され、そして細胞は、新鮮ブロッキ
ング溶液中1/400希釈されたMUVポリクローナルウサギ抗血清(Acce
ss Biomedical,San Diego)により室温で2−3時間イ
ンキュベートされた。次いで、ポリクローナル抗血清が除去され;細胞は、ブロ
ッキング溶液で5回洗浄され、次いで室温で2−3時間、ブロッキング溶液中1
/1000に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ共役のヤギ抗ウサ
ギ血清(DAKO Corporation,Carpinteria,CA)
とともにインキュベートされた。次に、ヤギ血清が除去された;細胞は、ブロッ
キング溶液で5回およびPBSで1回洗浄され、続いて細胞モノレヤーをカバー
するのに十分なAEC基質(DAKO Corporation)を添加され、
これが、次に染色の出現を促進するために37℃で15−20分間インキュベー
トされた。
されたJeryl LynnMUVにも存在しない)が、(P2)rMUVによ
り感染されたVero細胞からのRT/PCRによって増幅されたcDNAフラ
グメントの配列解析によってrMUV中に証明された。RNAは、6穴ディッシ
ュにおける感染細胞から製造者のプロトコールにしたがってTrizol(Gi
bcoBRL)による抽出によって調製された;各ウエルからの総RNAの1/
5が、3つの別々なヌクレオチドタグの各々に隣接しているプライマーペアを用
いる、Titan Kit(Boehringer Mannheim,Ind
ianapolis,IN)についての指示にしたがうRT/PCR増幅のため
の鋳型として使用された。得られるRT/PCRフラグメントは、エレクトロエ
ルーションによって1%アガロースゲルから精製され、そしてApplied
Biosystems(ABI)377 Sequencer(Applied
Biosystems,Inc.,Foster City,CA)を用いて
製造者のプロトコールにしたがって配列決定された。
NAから感染性流行性耳下腺炎ウイルスのレスキューを可能にするシステムの定
義を助けるために、CATレポーター遺伝子を含有する流行性耳下腺炎ウイルス
ミニレプリコンが構成された。構築物は、T7RNAポリメラーゼプロモーター
の制御下でネガティブ極性のRNAミニレプリコンの合成を可能にするよう設計
された。T7プロモーターの3つの末端G残基がミニレプリコンの構築の間に除
かれて、MUVゲノムの正確な5’ヌクレオチドにより始まる転写開始部位を提
供した。ミニレプリコン構築物におけるHDVリボザイムの包含は、確実なMU
V特異的3’末端を生成するT7RNAポリメラーゼ転写物の切断を可能にした
。MUVCATミニレプリコンRNA中のヌクレオチドの総数(966)は、ゲ
ノムの長さが6の倍数ではない場合には効率的な複製が起きないと述べているR
ule of Six(Calain snd Roux,1993)にしたが
って6で割ることができた。CAT遺伝子の発現は、MUV特異的プロモーター
の制御下にあって、ミニレプリコンRNAがNPタンパク質により包膜され、次
いで機能性MUV特異的RNAポリメラーゼタンパク質と相互作用するようにな
った場合にのみ起きた。
察された。第1の操作では、イン・ビトロ転写されたMUVCAT RNAが、
既にMUVにより感染されている293細胞にトランスフェクションされた。こ
れらの条件下でレスキューされるCAT活性は、通常は低いが、再現可能であり
、そして常に、バックグラウンドレベルを十分越えていた(図3A参照)。パネ
ルA1,A2およびA3は、3回の別々のレスキュー実験の結果を示す;パネル
A1、列1は、イン・ビトロ転写されたpMUVCAT RNAなしにトランス
フェクションされたMUV感染細胞におけるCAT活性を示し、列2は、pMU
VCATからのイン・ビトロで転写されたRNAによりトランスフェクションさ
れたMUV感染細胞におけるCAT活性を示し、列3は、pMUVCAT−GG
からのイン・ビトロで転写されたRNAによりトランスフェクションされたMU
V感染細胞におけるCAT活性を示し、列4は、pMUVCATからのイン・ビ
トロ転写されたRNAによりトランスフェクションされた未感染細胞におけるC
AT活性を示す。パネルA1に示される各CATアッセイは、約106のトラン
スフェクション細胞からの抽出物の20%とともに37℃で3−4時間実施され
た。パネルA2列1は、pMUVCATからのイン・ビトロで転写されたRNA
によりトランスフェクションされたMUV感染細胞を示し;列2は、pMUVC
ATからのイン・ビトロで転写されたRNAによりトランスフェクションされた
未感染細胞を示す。パネルA2に示される各CATアッセイは、約106のトラ
ンスフェクション細胞からの抽出物の50%を用いて37℃で5時間実施された
。パネルA3列1は、pMUVCATからのイン・ビトロで転写されたRNAに
よりトランスフェクションされたMUV感染細胞を示し;列2は、イン・ビトロ
転写されたpMUVCAT RNAなしでトランスフェクションされたMUV感
染細胞を示し;列3は、pMUVCATからのイン・ビトロで転写されたRNA
によりトランスフェクションされた未感染細胞を示す。パネルA3に示される各
CATアッセイは、約106のトランスフェクション細胞からの抽出物の50%
を用いて37℃で4時間実施された。
の付加的G残基の2つを含有するMUVCAT構築物(pMUVCAT−GG)
からはレスキューすることはできなかった。しかしながら、同じMUVCAT構
築物のMUVトレーラー領域に存在する2つの突然変異は、この観察の決定的な
解釈を妨げた。これらの実験からの結果は、MUVゲノムのnt1−145およ
びnt15223−15384が、ゲノムの包膜、転写および多分複製のために
必要な配列を含有していることを示唆した。MUV発現されたヘルパータンパク
質の存在下でCAT活性のレスキューを許したミニレプリコン配列を定義したの
で、第2のシステムが、pMUVCAT、pMUVNP、pMUVPおよびpM
UVLを含む、トランスフェクションされたDNAからCAT活性のレスキュー
を実施するために設計された。このシステムでは、MUV NP、PおよびLタ
ンパク質ならびにMUVCATミニレプリコンRNA転写物は、MVA−T7誘
導のT7RNAポリメラーゼの制御下で、293、Hep2およびA549細胞
内に同時発現された。293細胞において実施された最初の実験は、CATレス
キューが効率的で、再現性があることを示した。CATレスキューの効率増大は
、293細胞に比例してHep2細胞において見られ、そして一連のプラスミド
滴定が実施されて、トランスフェクション混合液における各プラスミドの相対量
を最適化した。レスキュー効率におけるさらなる増大は、6穴ディッシュの1つ
のウエルからのA549細胞溶解物の20%を用いる、3時間CATアッセイに
おける基質のほとんど100%転化により観察された(図3B)。これらの結果
は、pMUVNP、pMUVPおよびpMUVLから発現されたMUVヘルパー
タンパク質が、MUVCATアンチセンスRNAミニレプリコンの包膜、複製お
よび転写を促進するのに十分であったことを例証した。さらにまた、CATレス
キューについて観察された最適条件は、cDNAから完全に感染性MUVをレス
キューするための出発点を提供した。
MUVcDNAは、T7RNAポリメラーゼプロモーターの制御下でウイルスゲ
ノムの正確な15,384ntポジティブセンスRNAコピーの合成を可能にす
るように構成された。MUVCATミニレプリコンについてと同様に、T7RN
Aポリメラーゼプロモーター配列は、3個の末端G残基を除くように改変され、
そして正確なMUV末端ヌクレオチドにおいて始まる転写開始部位を提供した。
HDVリボザイムが使用されて、ポジティブセンスゲノム転写物の正確なMUV
3’末端ヌクレオチドを生成した。
ーゼを発現するMVA−T7により感染され、次いで、pMUVFL、およびM
UV NP、PおよびLタンパク質を発現するプラスミドによりトランスフェク
ションされた。関連するルブラ(rubula)ウイルスSV5(He et
al,1997;Murphy and Parks,1997)における類似
の研究からの結果とともにMUVCATミニレプリコンからのレポーター遺伝子
活性のレスキューについての結果は、すべての相互作用する成分が操作可能なレ
ベルおよび比率で存在する場合には、MUV NP、PおよびLタンパク質が、
T7RNAポリメラーゼで生成されたポジティブセンスゲノムRNA転写物を包
膜、複製、次いで転写するのに十分であることを示した。A549細胞がMUV
レスキュー実験のために選ばれたが、その理由は、それらが、MUV複製と、そ
して試験された他の細胞系よりも効率的なCATレスキュー活性(場合によって
は、より効率的なトランスフェクションをとおして)を支持し、そしてまた、そ
れらがMVA−T7誘導の細胞変性に対してより耐性であったからである。最初
のレスキュー実験の成功では、感染細胞からの上澄液培地(清澄化なしに)が新
鮮なA549指標細胞にトランスフェクションされた。3つの感染性フォーカス
が、全細胞ELISAによって指標細胞の5ウエルのうち1つにおいて観察され
た(図4)。新鮮なVero細胞モノレヤー上へのこれらの細胞からの上澄液の
継代に続いて、3つのシンシチウムが顕微鏡下で観察された。これらのシンシチ
ウムの1つが、液体プラークピックとして培地中に吸引され、そして新鮮なVe
ro細胞を感染させるために使用された;次いで、多数のシンシチウムがこの細
胞モノレヤーにおいて観察され(図5)、そして総感染細胞RNAがレスキュー
されたウイルスの同定のために抽出された。第2のレスキュー実験では、少なく
とも10−20の感染性フォーカスが、全細胞ELISAによって染色された指
標細胞において見られたように、感染細胞の各ウエルから得られた(図5)。こ
の実験では、全ウエルが、pMUVLがトランスフェクション混合液から除かれ
たウエル以外、レスキューされたウイルスを含有し、レスキュー方法が非常に再
現性が高いことを示した。cDNAからのMUVのレスキューについて決定され
る限り、各プラスミドの最適レベルは、300ngpMUVNP、50ngpM
UVP、200ngpMUVLおよび3−7μgpMUVFLである。
を例証することは重要である。これは、全長ゲノムcDNAの構成の間にRT/
PCRミス組み入れによって導入される、pMUVFL中の3つのヌクレオチド
タグの存在によって可能にされた。これらのタグは、Jeryl Lynnワク
チンウイルスの共通配列、ならびにpMUVFLが得られたJeryl Lyn
nワクチン調製物の継代プラーク分離株の両方からpMUVFLを区別した。タ
グの2つは、それぞれFおよびL遺伝子におけるヌクレオチド6081および1
1731におけるサイレント変化を表し;第3のタグは、pMUVFLのLタン
パク質のアミノ酸22(ヌクレオチド位置8502に対応する)におけるLys
からArgへの置換をもたらす。rMUVがpMUVFLから生成し、実験室で
増殖された他の2つのMUV集団のいずれからも生成しないことを示すために、
3つのヌクレオチドタグの各々にわたる、rMUV感染細胞RNAから調製され
たRT/PCR生成物が、関係する位置において配列決定された。RT/PCR
生成物が、感染細胞RNAからのみ得られ、そして微量のトランスフェクション
するプラスミドDNAのキャリーオーバーからは得られないことを例証するため
に、1つの反応が、前以て逆転写することなく、PCR増幅のための鋳型として
rMUV感染細胞RNAを用いて実施された。RT/PCR増幅からの結果、そ
して続くRT/PCR生成物のシークエンシング解析が図6において示される。
総RNAは、トランスフェクション細胞からのP2rMUVウイルスにより感染
されたVero細胞モノレヤーから調製された。RT/PCR反応は、pMUV
FLおよびrMUVにおいてのみ存在する3つの別々のヌクレオチドタグ部位に
わたるcDNA生成物を生成するために設定された。列1は、マーカー1kbラ
ダー(Gibco/BRL)を示す;列2,3および4は、それぞれヌクレオチ
ドタグ位置6081,8502および11731にわたるRT/PCR生成物を
示す。これらのRT/PCR生成物が混入しているプラスミドDNAに由来しな
かったことを例証するために、列4に示されるcDNAの生成について使用され
たものと同一の反応がRTなしに行われた;この反応の生成物が列5に示される
。pMUVLがトランスフェクション混合物から省略された場合、rMUVが回
収できなかったことを例証するために、列4に示されるcDNA生成物を生成す
るために使用されたものと同一の反応が、pMUVLなしで実施されたトランス
フェクション由来のVero細胞RNAを用いて設定された;この反応からの生
成物が列6に示される。
レスキューされたMUVが、MUVの全長ゲノムcDNAにおいてのみ存在する
同じヌクレオチドタグを含有していたことを明らかに例証する(図7)。全長c
DNAクローンおよびプラーク分離株4(PI4)およびJeryl Lynn
株についての共通配列(配列番号:1)間のヌクレオチドおよびアミノ酸差異の
列挙のための図8の表1、参照。
DNAコピーから生産されたと結論される。この操作は、流行性耳下腺炎ウイル
スの完全なゲノムcDNAを含有するプラスミドとともに、MUV NP、Pお
よびLタンパク質をコードしているプラスミドによるMVA−T7感染A549
細胞の同時トランスフェクションを必要とする。この方法の成功は、完全な流行
性耳下腺炎ウイルスゲノム(Jeryl Lynn株)についての共通配列の開
発および流行性耳下腺炎ウイルスミニレプリコンのレスキューシステムの新規開
発に左右された。
rgへの置換は、レスキューされる流行性耳下腺炎ウイルスを獲得することを途
絶させない。
実施態様は、1個以上のレポーター遺伝子を発現する感染性組み換え流行性耳下
腺炎ウイルスの回収によって例証される。
たは外来遺伝情報の挿入を可能にするために、ユニークAscI制限エンドヌク
レアーゼ部位が、部位特異的変異誘発を用いて、全長ゲノムcDNAにおいて生
成された。AscI部位が、M遺伝子(ゲノムヌクレオチド4451−4458
)の5’非コーディング領域に置かれ、その結果、適当に隣接する流行性耳下腺
炎ウイルス調節配列および末端AscI部位を含有する付加異種遺伝子が、ウイ
ルスのMおよびF遺伝子間で流行性耳下腺炎ゲノム中に組み込まれて、外来遺伝
子を発現することが可能な新規な感染性流行性耳下腺炎ウイルス組み換え株が生
成された。β−ガラクトシダーゼ遺伝子またはホタルのルシフェラーゼ遺伝子の
いずれかを含有する流行性耳下腺炎ウイルス組み換え株が構築された(図11、
参照)。また、ルシフェラーゼ翻訳開始コドンに隣接するEMCウイルスCIT
Eを含有するその他の組み換え流行性耳下腺炎ウイルスが、翻訳の開始のために
正常な流行性耳下腺炎ウイルスのシス−作用調節要素を利用したルシフェラーゼ
含有組み換え株によって生産されるタンパク質(ルシフェラーゼ)レベルとの比
較のために構築された。
に隣接する流行性耳下腺炎ウイルス特異配列(それぞれゲノムヌクレオチド44
59−4538および4392−4449)を組み入れたプライマーを用いて、
2ラウンドのネストPCRによって流行性耳下腺炎ウイルスゲノムへの挿入のた
めに調製された。この方法では、ゲノムヌクレオチド4450は、最終のルシフ
ェラーゼ含有組み換えゲノムにおいて「rule−of−six」を維持するよ
うPCR生成されたDNAフラグメントから欠失された;また、同じDNAフラ
グメントにおいて、ゲノムヌクレオチド4539−4545は、ルシフェラーゼ
ATGの上流に普通見いだされる7個のヌクレオチドによって置換された。最終
PCR生成物に存在する末端のAscI部位は、流行性耳下腺炎ウイルスゲノム
中へのルシフェラーゼ遺伝子および隣接する流行性耳下腺炎ウイルス特異配列の
付加を容易にした。同様に、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する別の流行性
耳下腺炎ウイルス組み換え株が構築された。β−ガラクトシダーゼ遺伝子および
隣接する流行性耳下腺炎ウイルス特異配列を組み入れているPCR生成DNAフ
ラグメントは、ルシフェラーゼ含有DNAフラグメントにおけるように、ゲノム
ヌクレオチド4450の同じ欠失を含有した。しかしながら、第2のTAAトリ
ヌクレオチドは、最終の組み換え流行性耳下腺炎ウイルスゲノムにおいて「ru
le−of−six」を維持するために、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の正常な
TAA翻訳終止コドンに隣接して組み入れられた。また、ルシフェラーゼ含有構
築物とは異なり、β−ガラクトシダーゼATG(ゲノムヌクレオチド4539−
4545)に隣接する7個の上流ヌクレオチドは流行性耳下腺炎ウイルスに特異
的であった。ルシフェラーゼ遺伝子のATGに隣接するEMCウイルスCITE
を含有する第3の流行性耳下腺炎ウイルス組み換え株がまた構築された。ルシフ
ェラーゼ遺伝子のみを含有する組み換え株に関するように、ネストPCR反応が
使用されて、それぞれCITEおよびルシフェラーゼ遺伝子の5’末端および3
’末端において流行性耳下腺炎ウイルス特異配列が別々に付加された。スリーウ
エイ連結反応では、CITEの3’末端およびルシフェラーゼ遺伝子の5’末端
が、NcoI制限エンドヌクレアーゼ部位において接合され、そして流行性耳下
腺炎ウイルスゲノムのAscI部位中に付加された。ゲノムNcoI4450は
欠失され、そしてトリヌクレオチドACTは、得られる組み換え流行性耳下腺炎
ウイルスにおいて「rule−of−six」を維持するために、PCRの間に
CITEの5’末端に付加された。
フェラーゼ)の翻訳のための内部リボソームのエントリー部位としてEMC C
ITEを含有する、2つの別々の転写単位か、または1個の転写単位のいずれか
のように、両CAT遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子を含有したものが構築さ
れた(図12参照)。ネストPCRが使用されて2種のDNAフラグメントが生
成されたが、この1つはCAT遺伝子を、そして他はルシフェラーゼ遺伝子を含
有し、そして各々は、適当な流行性耳下腺炎ウイルス特異的遺伝子間cDNA配
列と隣接された。これらの両フラグメントは接合され、次いで単一レポーター遺
伝子の挿入に既に使用されたAscI部位を介して流行性耳下腺炎ウイルスゲノ
ムcDNA中に結合された。同様に、ネストPCRが使用されてCAT遺伝子お
よびルシフェラーゼ遺伝子に融合されたEMC CITEを含有するDNAフラ
グメントが別々に生成されたが、各々は、適当な流行性耳下腺炎ウイルス特異的
遺伝子間cDNA配列と隣接された。両DNAフラグメントは接合され、そして
流行性耳下腺炎ウイルスゲノムcDNAのAscI部位中に結合された。両ゲノ
ム構築物におけるレポーター遺伝子の順序は、5’CAT−LUC3’および5
’CAT CITE LUC3’であった。
NP、PおよびLタンパク質を発現するサポートプラスミドとともに、組み換え
流行性耳下腺炎ウイルスゲノムを含有するプラスミドは、例3において既に記述
されたように、MVA−T7感染A549細胞中にトランスフェクションされた
。感染細胞からの総レスキューウイルスが、最初に新鮮なA549細胞(継代1
)において、続いてVBero細胞において増幅された。継代3において、レス
キューされたウイルスがレポーター遺伝子活性についてアッセイされた。
炎ウイルス組み換え株で感染された細胞の抽出液においてか、または感染細胞モ
ノレヤーの細胞学的染色によって測定された。ルシフェラーゼ遺伝子か、または
EMCウイルスCITEに融合されたルシフェラーゼ遺伝子のいずれかを含有す
る流行性耳下腺炎ウイルス組み換え株により感染された細胞からの抽出液が、ル
ミノメーター(Analytical Luminescence Labor
atory,Monolight 2010)においてルシフェラーゼ活性をア
ッセイされた。細胞抽出液の調製およびルシフェラーゼアッセイは、Enhan
ced Luciferase Assay Kit(Pharmingen,
San Diego,CA)のための製造者のプロトコールにしたがって行われ
た。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する流行性耳下腺炎ウイルス組み換え株
で感染された細胞からの抽出液は、β−gal染色キット(Promega,M
adison,Wisc.)のプロトコールにしたがって細胞学的染色によって
アッセイされた。CAT活性の測定は、先の例において既に記述されたように、
感染細胞の凍結−融解溶解液において実施された。
ラーゼ活性は、レスキューウイルスで感染された細胞の抽出液中に検出された。
各場合、レスキューウイルスは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子単独か、または縦
列に両CAT遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子か、いずれかを含有する組み換
え流行性耳下腺炎ウイルスゲノムcDNAから得られた。両CATおよびルシフ
ェラーゼ遺伝子を含有するrMUVにより感染されたVero細胞の抽出液に存
在するCAT活性を示す薄層クロマトグラムである、図14、参照。1つの転写
単位(rMUVC/C/L)としてCATおよびルシフェラーゼ遺伝子を含有す
る組み換えウイルスは、CATアッセイの前に総レスキューウイルスから精製(
1X)されたプラークであった。個々の転写単位(rMUVC/L)としてCA
Tおよびルシフェラーゼ遺伝子を含有するレスキュー組み換えウイルスは、プラ
ーク精製なしに総集団としてアッセイされた。図14において指示される場合、
Vero細胞抽出液におけるルシフェラーゼ活性がまた、両rMUVC/C/L
およびrMUVC/Lウイルス組み換え株について測定された。
団から単離された、ルシフェラーゼ遺伝子(rMUV LUCおよびrMUV
CITE−LUC)を含有する流行性耳下腺炎ウイルス組み換え株のクローン集
団についての相対的明るさの単位(relative light unit)
(RLU)読み取りを示す。表5に示されるように、流行性耳下腺炎ウイルス組
み換え株によるルシフェラーゼ活性の強い発現は、組み換えゲノムから1種以上
の異種遺伝子を発現する流行性耳下腺炎ウイルスの潜在能力を明らかに例証して
いる。
シダーゼを含有するレスキュー流行性耳下腺炎ウイルスが同定された。レスキュ
ーウイルスは、β−ガラクトシダーゼを含有する組み換え流行性耳下腺炎ウイル
スゲノムcDNAから得られた。β−ガラクトシダーゼ活性は、直接の細胞学的
染色後に、組み換え流行性耳下腺炎ウイルスによって感染された細胞において証
明された。β−ガラクトシダーゼ活性の強い青色染色は、β−ガラクトシダーゼ
遺伝子を含有する組み換え流行性耳下腺炎ウイルスにより感染された細胞におい
てのみ存在していた。いかなるさらなる異種遺伝子も含有しないレスキュー流行
性耳下腺炎ウイルスは、同じ染色アッセイにおいてクリヤープラークを生じた(
図15参照)。組み換え流行性耳下腺炎ウイルスによるβ−ガラクトシダーゼの
発現は、さらに、流行性耳下腺炎ウイルス転写プロモーターの制御下で比較的大
きい異種遺伝子を発現する流行性耳下腺炎ウイルスの能力を例証している。
変異株、JL5およびJL2からなることが分かっている(Afzal et
al.,1993)。JL5およびJL2と呼ばれる2つの変異株は、ワクチン
調製物中に比率約JL2 1対JL5 5において存在することが示された。こ
れらの変異株は、SHおよびHN遺伝子近くのゲノム中に配列の差異を有するの
で、この差異が、各々の純粋な集団を単離し、そしてそれらの完全なゲノムのシ
ーケンシングによって遺伝子レベルにおいて変異株を区別するために使用された
。
細胞(CEF)において1継代間培養された。次いで、このウイルス保存液が、
10倍増加において連続に希釈され、そして6穴プレート(Becton Di
ckinson,Franklin Lakes,NJ)上で集密CEFを感染
させるために使用された。細胞は、室温で1.5時間振動させることによって感
染された。次いで、各ウエル上のイノキュラムは、アガロースのオーバーレイ(
overlay)(0.9%アガロース[Seaplaque,FMC Bio
products,Rockland,ME]、最少必須培地[MEM]、0.
2mM非必須アミノ酸、0.2mg/mlペニシリン/ストレプトマイシン、2
%FBSおよび0.3375%重炭酸ナトリウムを含有する)で置き換えられた
。オーバーレイを室温で固化させた後、感染された細胞は、プラークが肉眼およ
び光学顕微鏡で見られるまで37℃で6〜8日間培養された。
除去するために滅菌パスツールピペット(VWR Scientific,Ne
w York,NY)を用いて分離された。分離されたプラークは、培地(2%
FBS、20mMHEPESおよび0.1mg/mlペニシリン/ストレプトマ
イシンを補足されたMEM)1ml中に入れられ、そして回転され、そして第2
ラウンドのプラーク精製のための感染に使用された。続く段階では、各希釈プラ
ークの10,50,75,100もしくは200μlが使用されて6穴プレート
上の新鮮な細胞を感染させた。感染、オーバーレイおよびプラーク分離が上記の
ように実施された。第2ラウンドのプラーク形成からウイルスを分離した後、方
法は第3回目を繰り返した。
6穴プレート上のCEFにおいて37℃で4〜6日間増殖された。次いで、ウイ
ルスは、T−25フラスコ中のCEFにおける増殖によって拡大された。感染細
胞が最大の細胞変性を示した5〜7日後に、ウイルスが収穫され、そして−80
℃で凍結保存された。
およびシーケンシング」の節において記述されたように実施された。次の遺伝子
特異的プライマーが、SHおよびHN遺伝子の部分を増幅するために使用された
:6223TGAATCTCCTAGGGTCGTAACGTC6246(配列番号27)および8969ACCCACTCCACT
CATTGTTGAACC8946(配列番号69)。 増幅生成物は、1%アガロースでゲル精製され、そしてWizard PCR
Purification Kit(Promega,Madison,WI)
を用いてゲル切片から単離された。次いで、増幅生成物は、SH遺伝子領域にお
いて[プライマー6223TGAATCTCCTAGGGTCGTAACGTC6246(配列番号27)、6783GG
ATGATCAATGATCAAGGC6802(配列番号30)、7325CATCACTGAGATATTGGATC7306(配
列番号74)、6909GATACCGTTACTCCGTGAAT6980(配列番号75)を用いて]配列
決定されて、JL5もしくはJL2として同定された。
JL5であるか、そしてどれがJL2であるかを決定した。最初は、すべての3
回プラーク精製されたウイルスはJL5と一致した。JL2分離株を得るために
、1回プラーク精製され、そして凍結保存されたウイルスが、SH遺伝子領域に
おけるRT−PCRおよびシーケンシングによって選別されて、それらがJL2
か、またはJL5かいずれであるか決定された。JL2を含有するプラークとし
てこの方式で同定された2分離株は、さらに連続2ラウンドのプラーク精製にか
けられた。上記のように、これらの分離株はCEFにおいて2回拡大され、続い
てRNA抽出、増幅およびシーケンシングが実施された。
株の2つの別々の分離株が、完全なゲノムのシーケンシングのために選ばれた。
RT−PCRは、全ゲノムにわたるフラグメントを増幅するために、次のプライ
マーペアを用いて、単離されたRNAにおいて実施された:1ACCAAGGGGAGAATGAA
TATGGG23(配列番号95)および2507TGAGGCTCCATTCCCGTCTATG2486(配列番号8
6)、2107CGTTGCACCAGTACTCATTG2126(配列番号17)および3875CTGAACTGCTCT
TACTAATCTGGAC3851(配列番号82)、3773CTGTGTTACATTCTTATCTGTGACAG3798(
配列番号21)および6347CAGACATACAGGGTTATGATGAG6325(配列番号76)、622 3 TGAATCTCCTAGGGTCGTAACGTC6246(配列番号27)および8969ACCCACTCCACTCATTG
TTGAACC8946(配列番号69)、7678AGAGTTAGATCAGCGTGCTTTGAG7701(配列番号
32)および9753TCATGCCGCATCTCAATGAG9734(配列番号67)、9583CCGAGAGTCC
ATGTGTGCTC9602(配列番号37)および11685CCTTGGATCTGTTTTCTTCTACCG11662(
配列番号62)、11529GTGTTAATCCCATGCTCCGTGGAG11552(配列番号42)および 13412 CATATTCGACAGTTTGGAGT13393(配列番号58)、13219CGATTATGAGATAGTTGTT
C13238(配列番号46)および15384ACCAAGGGGAGAAAGTAAAATC15363(配列番号5
3)。増幅生成物が精製され、そして例1.Aの「ウイルスRNAの単離、増幅
およびシーケンシング」の節において記述されたように配列決定された。各ウイ
ルス分離株のゲノム末端の配列を決定するために、RNA末端が結合され、接合
部をとおしてRT−PCRおよびシーケンシングが実施された(例1.Aにおい
て記述されたように)。
Arbor,MI)を用いて整列された。JL5およびJL2配列は、各変異株
について両方の配列決定されたプラーク分離株を比較することによって決定され
た共通性を表した。精製されたJL5およびJL2ウイルスは、例1.Aの表4
に列挙されたプライマーの同じシリーズを用いて配列決定された。両変異株では
、2つの別々のプラーク分離株は完全に配列決定された(JL5およびJL2、
各々のプラーク2について、それぞれの共通配列についての配列番号:11およ
び12、参照)。期待されたように、少数の配列差異が、2つのJL5プラーク
分離株(表6参照)および2つのJL2プラーク分離株(表7参照)間に観察さ
れた。
されている、413個のJL5との差異を含有する。これらの差異の5個はウイ
ルスの5’または3’リーダー配列において存在している。総数360の配列差
異は、ウイルス遺伝子のコーディング領域内にある;しかしながら、これらの差
異のうち73個のみがアミノ酸の差異をコードしている。残りの48の配列差異
は、ウイルス遺伝子の非コーディング領域内にある。興味あることに、遺伝子間
領域中または内部のシス−作用シグナル(すなわち、遺伝子開始または遺伝子終
結シグナル)のいずれか内には配列差異が存在しないことに注目すべきである。
率を決定するために、2つの変異株間の制限エンドヌクレアーゼ多型による配列
差異を利用するアッセイが開発された。アッセイは、PCRおよび制限エンドヌ
クレアーゼ切断による変異解析(MAPREC)と呼ばれる。位置3828(ア
ンチゲノムセンス)において、JL5ゲノム中のBssHII制限エンドヌクレ
アーゼ認識部位が存在する。JL2では、この部位におけるGからAへのヌクレ
オチド変異は、BssHII認識の欠如をもたらす。JL5およびJL2の混合
集団からのRNAが単離され、そしてこの部位を取り巻くプライマーを用いて増
幅されて254塩基対の生成物がもたらされた。使用されたプライマーは、プラ
イマー3708CAGGCCAGCGCCGATAAATATG3729(配列番号117)および3962AATGACAC
CCTTCTCCATCAGGG3941(配列番号118)であった。プライマーは、両JL5お
よびJL2に対して同一の配列を含有した;かくして、いずれの変異株からのフ
ラグメントも等しい確率において増幅すると期待された。さらにまた、先に挙げ
られた第1のプライマーは、その5’末端にフルオレセインを含有した。フルオ
レセイン化されたフラグメントはBssHIIにより切断され、そしてアクリル
アミドゲルにおいて分離された。FluorImagerがゲルをスキャンし、
そしてJL5およびJL2をそれぞれ表す、切断および不切断生成物の相対的多
量を定量するために使用された。BssHIIによる切断は、JL5では120
塩基対の蛍光生成物を、そしてJL2では254塩基対(すなわち不切断)蛍光
生成物を残した。
ロット番号0656J,Merck and Co.,Inc.,West P
oint,PA)の10ワクチンバイアルから単離された。RNAは、増幅(先
のプライマーを使用することによって)され、PCR生成物がBssHIIによ
り消化され、ゲルにおいて分離され、そしてFluorImagerにおいてス
キャンされた。酵素消化は、PCR反応混合物の1/5にBssHII(Roc
he Molecular Biology,Indianapolis,IN
)5単位を添加し、そして50℃で2.5時間インキュベートすることによって
実施された。次いで、切断された生成物は、6%アクリルアミドゲルにおいて分
離され、次いで、これがFluorImager(Molecular Dyn
amics,Sunnyvale,CA)を用いてスキャンされた。
Dynamics,Sunnyvale,CA)を用いて定量された。一連の対
照が基準として使用された;これらのサンプルは、次のタイターに基づく比:9
9% JL5/1% JL2,95% JL5/5% JL2,85% JL5
/15% JL2,および75% JL5/25% JL2において混合された
純粋なJL5およびJL2ウイルスからなった。RNAは混合ウイルスから単離
され、そしてMAPREC操作において使用された。これらの対照からの結果が
使用されてアッセイのための標準曲線が作成され、ワクチン混合物におけるJL
5およびJL2の相対パーセントを決定するために使用された。さらに、不消化
のJL5PCR生成物の一連の2倍希釈液が使用されてFluorImager
における測定結果の直線範囲が決定された。さらにまた、純粋なJL2ウイルス
RNAがネガティブ対照として使用され、そして純粋なJL5ウイルスRNAが
ポジティブ対照として使用された。また、純粋なJL5サンプルは、BssHI
I酵素の効率を決定するために対照として役立った。MAPRECアッセイおよ
び定量は再現性のために3回繰り返された。結果は3実験について平均された。
図13は、代表的なスキャンされたゲル画像を示す。切断および不切断生成物が
矢印で示される。JL2に対応する不切断生成物は254塩基対の長さであり、
一方JL5に対応する切断生成物は長さ120塩基対である。各スキャンされた
ゲルについて相対的多量を定量するために、値は最初にバックグラウンド蛍光お
よび純粋なJL5対照サンプルにおける不消化DNA量について補正された。%
JL5値は、消化および不消化DNAの合計によって消化DNA量を割ることに
よって、そしてその値に100%掛けることによって決定された。各実験のため
に、混合されたJL5およびJL2ウイルスのセットからのRNAが使用されて
標準曲線が作成された。ワクチンサンプルについての前記計算結果が標準曲線に
おいてプロットされて表9において示される値を得た。最後の欄では、各ワクチ
ンサンプルについての平均値が3実験に対して与えられる。最後の欄における結
果を平均することによって得られた10ワクチンサンプルに関する総平均が表の
下欄に示される。
についての結果を総括している。これらのサンプルについてのワクチン内の2変
異株の相対的多量は、範囲73.1% JL5/26.9% JL2〜76.1
% JL5/23.9% JL2であった。全3実験についての全10ワクチン
サンプルの総平均は、73.9% JL5/26.1% JL2であった。
のミニレプリコンアンチセンスRNAゲノムの構成を示す図を表す。DNA構築
物の構成において利用されるキー制限エンドヌクレアーゼ部位が示される。T7
RNAポリメラーゼプロモーター配列は、正確なMUV5’末端ヌクレオチドに
よる転写を開始するよう設計され、そしてHDVリボザイム配列は、ミニレプリ
コンRNA転写物における正確なMUV3’末端ヌクレオチドを生成するように
置かれた。複製T7RNAポリメラーゼ終結シグナルは、HDVリボザイム配列
後に縦列に含まれた。CAT ORFは、MUVゲノムのコーディングおよびシ
ストロン間配列のすべてを置換する;残りの必須MUV特異的配列は、隣接した
90ntNP遺伝子非翻訳領域(UTR)をもつ3’MUVリーダー(55nt
)、および137ntL遺伝子UTRに隣接した5’MUVトレーラー(24n
t)を含有する。
アーゼ部位を含む、MUV全長ゲノムcDNA構築物の図による表示である。T
7RNAポリメラーゼプロモーターおよびHDVリボザイム配列は、正確な5’
末端ヌクレオチドによる転写を開始するように置かれ、そしてそれぞれ、MUV
アンチセンスゲノムの正確な3’末端ヌクレオチドを生成する。縦列のT7RN
Aポリメラーゼ終結配列は、HDVリボザイムに隣接して置かれ、RNA切断の
効率の改善を助ける。レスキューされるMUVに対する同定タグとして利用され
るヌクレオチド置換が表1(図8参照)において示される。
・ビトロで転写されたRNAによるトランスフェクション後の293細胞におい
て存在するCAT活性を示す3種の薄層クロマトグラムを表す。
ドによるトランスフェクション後のMVA−T7感染のHep2およびA549
細胞におけるCAT活性を示す薄層クロマトグラムを表す。pMUVNP発現プ
ラスミドのレベルは、両細胞系において滴定された;列1−4は、各々、200
ngpMUVCAT、50ngpMUVP、200ngpMUVL、およびそれ
ぞれ300ng、450ng、600ng,750ngpMUVNPを含有する
混合物によるトランスフェクション後のCAT活性を示す;列5は、pMUVL
がトランスフェクション混合物から省略された場合に生産されるCAT活性を示
す。
胞上澄液の継代(P1)を表す。写真A,BおよびCは、レスキューされた流行
性耳下腺炎ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルスなし(対照)および流行性耳下腺
炎ウイルスのJeryl Lynn株に対応する。写真はAおよびCについて類
似の感染性フォーカスを示す。
れた流行性耳下腺炎ウイルスの全細胞ELISAを表す。
PCR生成物のゲル分析を示す。総RNAは、トランスフェクションされた細胞
からのrMUVウイルスの継代2により感染されたVero細胞モノレヤーから
作成された。RT/PCR反応は、pMUVFLおよびrMUVにおいてのみ存
在する3種の別々なヌクレオチドタグ部位にわたるcDNA生成物を生成するよ
うに設定された。列1は、マーカー1kbラダー(Gibco/BRL)を示す
;列2,3および4は、それぞれヌクレオチドタグ位置6081,8502およ
び11731にわたるRT/PCR生成物を示す。これらのRT/PCR生成物
が混入しているプラスミドDNAに由来しなかったことを例証するために、列4
に示されるcDNAの生成に使用されたものと同一の反応がRTなしに行われた
;この反応の生成物が列5に示される。pMUVLがトランスフェクション混合
物から省略された場合、rMUVが回収できなかったことを例証するために、列
4に示されるcDNA生成物を生成するために使用されたものと同一の反応が、
pMUVLなしで実施されたトランスフェクション由来のVero細胞RNAを
用いて設定された;この反応からの生成物が列6に示される。
泳動図を表す。3種のタグ部位の各々を横断して配列決定されたRT/PCR生
成物(図6)。rMUVcDNAについて得られた各タグ部位におけるヌクレオ
チド配列が、pMUVFLを得るために使用されたMUVのプラーク分離株(プ
ラーク分離株4,PI4)についての共通配列と比較される。
Lynn株についての共通配列(配列番号:1)間のヌクレオチドおよびアミノ
酸差異を列挙する表(表1)である。
点を含む、流行性耳下腺炎ウイルスの完全遺伝子地図を記す表(表2)である。
55ヌクレオチド長の3’リーダーおよび24ヌクレオチド長の5’トレーラー
の配列がまた示される。
ての翻訳開始および終止位置とともに、流行性耳下腺炎ウイルス遺伝子の転写開
始および終結ヌクレオチド位置を列挙する表(表3)である。表3における各転
写(遺伝子)開始から各終結ヌクレオチド位置までのヌクレオチドは、タンパク
質NP,P,M,F,SH,HNおよびLについてのヌクレオチド配列(それぞ
れ配列番号:93−99)に対応する。
よびβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の挿入を示す図である。AscI部位は、M遺
伝子の5’非コーディング領域における部位特異的突然変異によって生成された
。ネスト(nested)PCRは、流行性耳下腺炎ウイルス特異的M−F遺伝
子間配列および各レポーター遺伝子に隣接する末端AscI部位を生成するため
に使用された。得られるPCR生成物は、AscIにより消化され、そしてゲノ
ムAscI部位中に移入された。
AT)の挿入を示す図である。ポリシストロンの第2の遺伝子の発現のための内
部リボソームのエントリー部位を含有する2個の分離した転写単位および1個の
転写単位が、別々に、M−F遺伝子間領域に存在するAscI部位中に挿入され
た。ネストPCRは、各遺伝子および転写単位に隣接する適当な流行性耳下腺炎
ウイルスのM−F遺伝子間配列を生成するために使用された。
yl Lynnワクチンから単離され、そしてRT−PCRによって増幅された
RNAから決定されるJL5/JL2の比例部分に関する10個のMumpsv
axRワクチンサンプルのMAPREC解析の結果を表す。列1および2の試験
サンプルは、アッセイの直線性の下方限界を定義するために使用された未消化の
PCR生成物の連続希釈液である。列3では、PCR生成物はJL5の精製分離
株に由来する。列4では、PCR生成物はJL2の精製分離株に由来する。列5
−8では、PCR生成物は、それぞれ次の比:99 JL5/1 JL2,95
JL5/5 JL2,85 JL5/15 JL2,および75 JL5/2
5 JL2において混合されたJL5およびJL2ウイルスのサンプルに由来す
る。列9−18では、PCR生成物はMumpsvaxRサンプル1−10に由
来する。
るrMUVにより感染されたVero細胞の抽出物に存在するCAT活性を示す
薄層クロマトグラムを表す。
Vにより感染されたVero細胞モノレヤーの細胞学的染色を示す写真である。
強い青色染色の存在は、β−ガラクトシダーゼ発現および活性を指示した。パネ
ルCはまた、いかなる付加的な外来遺伝子も含有しないrMUVによって形成さ
れた「クリアー」プラークを示す。
Claims (44)
- 【請求項1】 最低1個の宿主細胞中で、(i)流行性耳下腺炎ウイルスの
ゲノムもしくはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列またはその変異
体のポリヌクレオチド配列を含んで成る単離された核酸分子を含んで成る転写ベ
クター、ならびに(ii)被包化、転写および複製に必要なトランスに作用する
タンパク質(NP、PおよびL)をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成
るもう1種の単離された核酸分子(1種もしくは複数)を含んで成る最低1種の
発現ベクター、を含んで成るレスキュー組成物の媒体中でのトランスフェクショ
ンもしくは形質転換を;前記ベクターの共発現および該組換えウイルスの産生を
可能にするのに十分な条件下で実施すること を含んで成る、組換え流行性耳下腺炎ウイルスの製造方法。 - 【請求項2】 組換えウイルスを収穫することをさらに含んで成る、請求項
1記載の方法。 - 【請求項3】 流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコ
ードする単離された核酸分子が、1種以上のゲノムもしくはアンチゲノム供給源
のキメラである、請求項1記載の方法。 - 【請求項4】 流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコ
ードする単離された核酸分子が、配列番号1、11および12より成る群から選
択されるポリヌクレオチド配列を含んで成る、請求項1記載の方法。 - 【請求項5】 流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコ
ードする単離された核酸分子が、弱毒ウイルスもしくは感染性の形態の該ウイル
スをコードする、請求項1記載の方法。 - 【請求項6】流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコー
ドする単離された核酸分子が感染性の形態の該ウイルスをコードする、請求項1
記載の方法。 - 【請求項7】 流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコ
ードする単離された核酸分子が弱毒ウイルスをコードする、請求項1記載の方法
。 - 【請求項8】 流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムをコ
ードする単離された核酸分子が感染性の弱毒ウイルスをコードする、請求項1記
載の方法。 - 【請求項9】 宿主細胞が真核生物細胞である、請求項1記載の方法。
- 【請求項10】 宿主細胞が脊椎動物細胞である、請求項1記載の方法。
- 【請求項11】 宿主細胞が鳥類細胞である、請求項1記載の方法。
- 【請求項12】 宿主細胞がヒト細胞由来である、請求項1記載の方法。
- 【請求項13】 宿主細胞がヒト胚細胞由来である、請求項9記載の方法。
- 【請求項14】 宿主細胞がヒト胚腎細胞由来である、請求項12記載の方
法。 - 【請求項15】 請求項1記載の方法から製造される組換え流行性耳下腺炎
ウイルス。 - 【請求項16】 (i)請求項1記載の方法から製造される組換え流行性耳
下腺炎ウイルスおよび(ii)製薬学的に許容できる担体を含んで成る組成物。 - 【請求項17】 転写ベクターがT7 RNAポリメラーゼ遺伝子をさらに
含んで成る、請求項1記載の方法。 - 【請求項18】 単離された組換え的に製造された弱毒流行性耳下腺炎ウイ
ルスおよび生理学的に許容できる担体を含んで成る免疫原組成物。 - 【請求項19】 請求項18記載の免疫原組成物を個体に投与することを含
んで成る、流行性耳下腺炎ウイルスに対する保護を誘導するための個体の免疫化
方法。 - 【請求項20】 流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムを
コードするポリヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子。 - 【請求項21】 配列番号1、配列番号11および配列番号12より成る群
から選択される正鎖のアンチゲノムメッセージセンス中に流行性耳下腺炎ウイル
ス配列を含んで成る、請求項20記載の核酸分子。 - 【請求項22】 流行性耳下腺炎ウイルスの1種もしくはそれ以上のタンパ
ク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成る核酸分子。 - 【請求項23】 前記ポリヌクレオチド配列が、1種もしくはそれ以上の異
種ヌクレオチド配列または1種もしくはそれ以上の異種遺伝子をさらに含んで成
る、請求項20記載の核酸分子。 - 【請求項24】 前記ポリヌクレオチド配列が、1種もしくはそれ以上の異
種ヌクレオチド配列または1種もしくはそれ以上の異種遺伝子をさらに含んで成
る、請求項22記載の核酸分子。 - 【請求項25】 流行性耳下腺炎ウイルスのゲノムもしくはアンチゲノムを
コードするポリヌクレオチド配列を含んで成るプラスミド。 - 【請求項26】 流行性耳下腺炎ウイルスの1種もしくはそれ以上のタンパ
ク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んで成るプラスミド。 - 【請求項27】 ポリヌクレオチド配列が、1種もしくはそれ以上の異種ヌ
クレオチド配列または1種もしくはそれ以上の異種遺伝子をさらに含んで成る、
請求項25記載のプラスミド。 - 【請求項28】 前記ポリヌクレオチド配列が、1種もしくはそれ以上の異
種ヌクレオチド配列または1種もしくはそれ以上の異種遺伝子をさらに含んで成
る、請求項26記載のプラスミド。 - 【請求項29】 請求項25記載の最低1種のプラスミドで形質転換された
宿主細胞。 - 【請求項30】 請求項26記載の最低1種のプラスミドで形質転換された
宿主細胞。 - 【請求項31】 請求項27記載の最低1種のプラスミドで形質転換された
宿主細胞。 - 【請求項32】 流行性耳下腺炎ウイルス以外の病原体に対する最低1種の
抗原をさらに含んで成る、請求項18記載の免疫原組成物。 - 【請求項33】 最低1種の抗原が弱毒RNAウイルスである、請求項32
記載の免疫原組成物。 - 【請求項34】 最低1種の抗原が、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、水痘帯
状疱疹ウイルス(VZV)、パラインフルエンザウイルス(PIV)およびRS
ウイルス(RSV)から選択される弱毒ウイルスである、請求項33記載の免疫
原組成物。 - 【請求項35】 最低1種の抗原が組換え的に製造される、請求項32記載
の免疫原組成物。 - 【請求項36】 最低1種の抗原が組換え的に製造される、請求項32記載
の免疫原組成物。 - 【請求項37】 流行性耳下腺炎ウイルス以外の病原体の最低1種の抗原が
、組換え的に製造された弱毒流行性耳下腺炎ウイルスから発現される、請求項3
2記載の免疫原組成物。 - 【請求項38】 流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、
水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、パラインフルエンザウイルス(PIV)およ
びRSウイルス(RSV)以外の病原体の最低1種の抗原が、組換え的に製造さ
れた弱毒流行性耳下腺炎ウイルスから発現される、請求項32記載の免疫原組成
物。 - 【請求項39】 異種ヌクレオチド配列が、単一の転写ユニットとして流行
性耳下腺炎ゲノム配列内に挿入される、請求項27記載のプラスミド。 - 【請求項40】 異種ヌクレオチド配列が、1種もしくはそれ以上のモノシ
ストロン性転写ユニットとして流行性耳下腺炎ゲノム配列内に挿入される、請求
項39記載のプラスミド。 - 【請求項41】 異種ヌクレオチド配列が、最低1種のポリシストロン性転
写ユニットとして流行性耳下腺炎ゲノム配列内に挿入され、それが1種もしくは
それ以上のリボソーム進入部位を含有することができる、請求項39記載のプラ
スミド。 - 【請求項42】 異種ヌクレオチド配列が、1種のポリタンパク質、および
前記ポリタンパク質を切断して個々のポリペプチドを生成させる十分な数のプロ
テアーゼをコードする、請求項41記載のプラスミド。 - 【請求項43】 請求項27記載の宿主細胞により産生される単離された組
換え的に製造された弱毒流行性耳下腺炎ウイルス、および生理学的に許容できる
担体を含んで成る製薬学的組成物。 - 【請求項44】 組換え流行性耳下腺炎ウイルスのcDNAクローンの配列
を含んで成るヌクレオチド配列。
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