DE69936585T2

DE69936585T2 - Newcastle-krankheitsvirus infektiöser klone, impfstoffe und diagnosetest

Info

Publication number: DE69936585T2
Application number: DE69936585T
Authority: DE
Inventors: Bernardus Petrus Peeters; Olav Sven De Leeuw; Guus Koch; Arnoud Leonard Gielkens
Original assignee: ID Lelystad Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid BV
Current assignee: Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek DLO
Priority date: 1998-06-19
Filing date: 1999-06-17
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2019-06-18
Also published as: DK1088077T3; KR20010053000A; CN101275142A; US20030087417A1; CZ300760B6; SI1088077T1; ATE367442T1; NZ508982A; PT1088077E; AR020091A1; BR9911383A; AU4399199A; HUP0102429A2; EP1088077B2; NO329193B1; US20040235134A1; JP2002518012A; EA200100057A1; IL140381A0; CN1314942A

Description

Die Erfindung betrifft Infektionen von Geflügel mit dem Newcastle-Krankheit-Virus.
Das Newcastle-Krankheit-Virus (Newcastle disease virus; NDV) ist einer der facettenreichsten und tödlichsten Krankheitserreger bei Vögeln. Das nahezu gleichzeitige Auftreten der Newcastle-Krankheit als apparente neue Erkrankung an mehreren verschiedenen geographischen Orten sowie die starke Variation in Bezug auf die Art und Schwere der Erkrankung haben zu einigen Problemen hinsichtlich der Nomenklatur geführt.
Die Erkrankung wurde Pseudo-Geflügel-Pest (pseudo fowl pest), Pseudo-Geflügel-Seuche (pseudo poultry plague), Vogelpest, Vogelstaupe und Vogel-Pneumoenzephalitis genannt. Die Bedeutung dieser Erkrankung ist in erster Linie auf die Entwicklung der Geflügelindustrie während des 20. Jahrhunderts in eine hocheffiziente internationale Industrie, die von einem intensiven Handel zwischen den Staaten abhängig ist, zurückzuführen.
Es wird allgemein angenommen, dass die ersten Ausbrüche der Newcastle-Krankheit 1926 in Java, Indonesien, sowie in Newcastle-upon-Tyne, England, aufgetreten sind (Kraneveld, 1926; Doyle, 1927). Der Name Newcastle-Krankheit wurde von Doyle als zeitweiliger Name eingeführt, um einen umschreibenden Namen zu vermeiden, der mit anderen Erkrankungen verwechselt werden könnte. Es wurde später klar, dass andere, weniger starke Erkrankungen durch Viren verursacht wurden, die nicht von NDV unterscheidbar sind. In den USA wurde eine milde respiratorische Erkrankung als Vogel-Pneumoenzephalitis bezeichnet, und es wurde gezeigt, dass diese von NDV verursacht wird (Beach, 1944). Innerhalb weniger Jahre wurden weltweit zahlreiche NDV-Isolate gefunden, die eine extrem milde oder gar keine Erkrankung in Hühnern verursachten.
Die folgenden Verfahren wurden mit der Ausbreitung der Erkrankung in Verbindung gebracht: 1) die Bewegung von lebenden Vögeln, Wildvögeln, verwilderten Vögeln (feral birds), Federwild und kommerziellen Geflügel; 2) die Bewegung von Menschen und Zubehör; 3) die Bewegung von Geflügelprodukten; 4) die Ausbreitung über die Luft; 5) kontaminiertes Geflügelfutter; 6) kontaminiertes Wasser; 7) unvollständig inaktivierte oder heterogene Impfstoffe. Laut OIE ist die Newcastle-Krankheit eine Erkrankung von Geflügel, die von einem Virus des Vogel-Paramyxovirus-Serotyps 1 (aviäres Paramyxovirus Serotyp-1, APMV-1) verursacht wird, welcher einen intracerebralen Pathogenitätsindex (ICPI) von 0,7 oder mehr in Hühnern aufweist, die einen Tag alt sind. Virulentes Virus kann darüber hinaus durch das Vorhandensein von mehreren basischen Aminosäuren am C-Terminus des F2-Proteins und durch das Vorhandensein von F (Phenylalanin) an Position 117, dem N-Terminus des F1-Proteins, bestätigt werden. Kann diese Aminosäuresequenz nicht nachgewiesen werden, würde dies eine Charakterisierung durch ICPI-Tests erforderlich machen. Der Begriff "Geflügel" bezeichnet einheimisches Geflügel, Truthähne, Perlhühner, Enten, Gänse, Wachteln, Tauben, Fasane, Rebhühner und Laufvögel, die für die Zucht, für die Produktion von Fleisch oder Eiern, zu Verzehrzwecken oder für die Neubelegung der Federwild-Bestände gezüchtet und gehalten werden.
Laut Alexander (1988) sind seit dem ersten Erkennen der Erkrankung drei Panzootien der Newcastle-Krankheit aufgetreten. Die erste wird durch die anfänglichen Ausbrüche der Erkrankung verkörpert und scheint von Südostasien ausgegangen zu sein. Isolierte Ausbrüche, wie derjenige in England im Jahre 1926 waren zufällige Einschleppungen, die der Hauptströmung vorausgingen, welche sich langsam durch Asien nach Europa bewegte.
Eine zweite Panzootie scheint in den späten 60ern im mittleren Osten ihren Anfang genommen zu haben, und sie erreichte die meisten Länder im Jahre 1973. Die schnellere Ausbreitung der zweiten Panzootie wurde wahrscheinlich durch die dramatische Umstellung der Geflügelindustrie mit beträchtlichem internationalen Handel ausgelöst.
Eine dritte Panzootie betraf hauptsächlich heimische Vögel, wie beispielsweise Tauben und Wildtauben (Vindevogel und Duchatel, 1988). Die Erkrankung trat offenbar in den späten 70ern im Mittleren Osten auf. Im Jahre 1981 erreichte sie Europa und breitete sich dann rasch in alle Teile der Welt aus, was im Wesentlichen auf den Kontakt zwischen Vögeln bei Wettkämpfen und Leistungsschauen und auf den internationalen Handel mit solchen Vögeln zurückzuführen ist.
Heutzutage ist die Newcastle-Krankheit immer noch in zahlreichen Ländern Asiens, Afrikas, Nord-, Mittel- und Südamerikas und Europas verbreitet. Lediglich die Länder Ozeaniens scheinen weitgehend frei von der Erkrankung zu sein (Spradbrow, 1988).
NDV gehört zur Ordnung der Mononegavirales, Familie Paramyxoviridae, Subfamilie Paramyxovirinae, Gattung Rubulavirus. Neben NDV, das üblicherweise als Vogel-Paramyxovirus Typ-1 bezeichnet wird, können acht weitere Serotypen, die als Vogel-Paramyxovirus Typ 2 bis 9 bezeichnet werden, auf Basis ihrer Antigen-Verwandtschaft in Hämagglutination-Inhibierungstests und Serum-Neutralisationstests unterschieden werden (Alexander, 1993).
Trotz des Konsistenz der serologischen Gruppierung bestehen einige Kreuzbeziehungen zwischen Viren der verschiedenen Serotypen.
Das Genom von NDV ist ein einzelsträngiges RNA-Molekül mit negativer Polarität, das komplementär zur Polarität der Boten- RNA ist, welche für die Virusproteine kodiert. Das RNA-Genom ist ungefähr 15200 nt groß und kodiert für die folgenden Genprodukte (aufgeführt vom 3'-Ende zum 5'-Ende der genomischen RNA): Nucleocapsid-Protein (NP), Phosphoprotein (P), Matrix-Protein (M), Fusions-Protein (F), Hämagglutinin-Neuraminidase (HN) und großes Polymerase-Protein (L) (Chambers et al., 1986).
Die RNA ist mit den Proteinen NP, P und L komplexiert, wobei ein Ribonucleocapsid-Partikel (RNP) gebildet wird, der von einer Hülle umgeben ist, welche an der Innenseite durch das M-Protein ausgekleidet ist. Die Hülle enthält die Proteine F und HN, die an der Anheftung und das Eindringen in die Wirtszelle beteiligt sind.
Die Replikation von NDV ähnelt der Strategie, die von anderen Paramyxovirinae verwendet wird. Der erste Schritt besteht in der Anheftung des Virus an die Rezeptoren der Wirtszelle, welche vom HN-Protein vermittelt wird. Die Fusion der viralen Hülle mit der Wirtszell-Membran ist sowohl von der Wirkung des HN-Proteins als auch von der Wirkung des F-Proteins abhängig und führt zur Freisetzung des RNP in das Zytoplasma, wo die Virus-Replikation stattfindet.
Die virale RNA-abhängige RNA-Polymerase (die Teil des RNPs ist) erzeugt komplementäre Transkripte, die als mRNAs wirken, und von der Translationsmaschinerie der Zelle zur Synthese der Virusproteine verwendet werden. Aufgrund der Akkumulation von NP-Protein wechselt der RNA-Polymerasekomplex von Transkription zu Replikation, was zur Synthese von genomischen und antigenomischen RNA-Molekülen vollständiger Länge führt.
Neu gebildete RNPs werden an der Zellmembran durch die Wirkung des M-Proteins sowie der Proteine F und HN, die sich in der zellulären Plasmamembran angesammelt haben, eingekapselt. Die neu gebildeten Viruspartikel werden durch einen Knospungsmechanismus aus der infizierten Zelle freigesetzt. Für genauere Informationen bezüglich der Replikation von NDV, siehe Peeples (1988). Für einen kürzlich erschienenen Review in Bezug auf die Molekularbiologie der Paramyxovirinae, siehe Lamb und Kolakofsky (1996).
Neben kommerziellem heimischem Geflügel (d.h. Hühner, Truthähne, Fasane, Perlhühnern, Enten, Gänse, Tauben) ist eine große Vielzahl von gehaltenen, semi-domestizierten und freilebenden Vögeln, einschließlich Wasser-Zugvögeln, für NDV empfindlich, und diese können primäre Infektionsquellen darstellen (Kaleta und Baldauf, 1988).
Die Pathogenität von NDV-Stämmen unterscheidet sich stark von Wirt zu Wirt. Die am stärksten resistenten Spezies scheinen Wasservögel zu sein, während die am stärksten empfindlichen Spezies Schwarmvögel sind, die temporäre oder permanente Schwärme bilden. Hühner sind sehr empfindlich, während Enten und Gänse infiziert werden können aber selbst bei Stämmen, die für Hühner tödlich sind, wenige oder gar keine klinischen Anzeichen zeigen.
Die Newcastle-Krankheit wird dadurch erschwert, dass unterschiedliche Isolate und Stämme des Virus eine enorme Schwankung im Hinblick auf die Schwere der Erkrankung induzieren können. Beard und Hanson (1984) gruppierten die NDV-Stämme und NDV-Isolate in verschiedene Pathotypen, die auf die Erkrankungsanzeichen verweisen, welche in vollständig empfindlichen Hühnern beobachtet werden können: 1) viszerotropes velogenes NDV, das akute lethale Infektionen erzeugt, bei denen hämorrhagische Läsionen im Darm auftreten; und neurotropes velogenes NDV, das zu einer hohen Mortalität führt, der respiratorische und neurologische Symptome vorangehen, jedoch keine Läsionen im Darm; 2) mesogenes NDV, das zu einer geringen Morta lität, zu einer akuten respiratorischen Erkrankung sowie zu nervlichen Symptomen in einigen Vögeln führt; 3) lentogenes NDV, das milde oder nicht-apparente respiratorische Infektionen erzeugt, oder sogar asymptomatisches enterisches NDV, avirulente Viren, die sich offenbar hauptsächlich im Intestinaltrakt replizieren. Es wurde von einigen Überlappungen zwischen den Symptomen, die mit den verschiedenen Gruppen assoziiert sind, berichtet.
Das Virus tritt über den Respirationstrakt und den Intestinaltrakt oder über das Auge in den Körper ein. In der Luftröhre verbreitet sich das Virus durch Cilien sowie durch Verbreitung von Zelle zu Zelle. Nach anfänglicher Vermehrung an der Eintrittsstelle wird das Virus während der Abschnitte einer Virämie zu Milz, Leber, Nieren und Lungen getragen. Die Viren einiger Stämme erreichen vitale Organe wie Leber und Niere sehr schnell, sodass die Vögel sterben können, bevor Krankheitssymptome sichtbar werden.
Die meisten Viren erreichen über das Blut das zentrale Nervensystem, bevor signifikante Mengen Antikörper existieren. Ein langer asymptomatischer Trägerzustand, von dem angenommen wird, dass er in Papageienvögeln vorkommt, ist eine potentielle Bedrohung für die Geflügel-Industrie. Ein langfristiger Trägerzustand sowohl bei lentogenem als auch velogenem Virus kann darüber hinaus auch in Hühnern bestehen (Heuschele und Easterday, 1970).
Während der Replikation von NDV muß das Vorläufer-Glykoprotein Fo zu F1 und F2 gespalten werden, damit das Nachkommen-Virus infektiös ist (Rott und Klenk, 1988). Diese posttranslationale Spaltung wird durch Proteasen der Wirtszelle vermittelt. Wenn keine Spaltung stattfindet, werden nicht-infektiöse Viruspartikel gebildet, und die virale Replikation kann nicht fortschreiten. Das Fo-Protein von virulenten Viren kann durch eine große Vielzahl von Proteasen gespalten werden, wobei jedoch Fo-Proteine in Viren mit geringer Virulenz hinsichtlich ihrer Sensitivität begrenzt sind; diese Viren können lediglich in bestimmten Wirtszellarten in vivo angezüchtet werden, wobei sie im Allgemeinen in vitro nicht angezüchtet werden können.
Lentogene Viren replizieren sich lediglich in Bereichen mit Trypsin-ähnlichen Enzymen, wie beispielsweise im Respirationstrakt und im Intestinaltrakt, während sich virulente Viren in einer Reihe von Geweben und Organen replizieren können, was zu einer verhängnisvollen systemischen Infektion führt.
Eine Aminosäuresequenzierung des Fo-Vorläufers hat gezeigt, dass Viren mit geringer Virulenz ein einzelnes Arginin (R) aufweisen, das die F2-Kette und die F1-Kette verbindet, während virulente Stämme zusätzliche basische Aminosäuren aufweisen, die an der Spaltstelle zwei Paare bilden, wie beispielsweise K/R-X-K/R-R-F. Darüber hinaus beginnt die F2-Kette von virulenten Stämmen im Allgemeinen mit einem Phenylalanin-Rest, während die F2-Kette von nicht-virulenten Stämmen im Allgemeinen mit einem Leucin beginnt.
Bei wenigen NDV-Stämmen wird das HN-Protein auch als Vorläufer erzeugt, das eine Spaltung benötigt, um biologisch aktiv zu sein (Garten et al., 1980; Millar et al., 1988).
Neben der Spaltbarkeit des F-Proteins und des HN-Proteins können andere virale Faktoren zur Pathogenität beitragen. Madansky und Bratt (1978, 1981a, 1981b) haben gezeigt, dass Veränderungen in Bezug auf die Transkription oder Translation das Wachstum und die Ausbreitung des Virus von Zelle zu Zelle und/oder die Zytopathogenität verändern können.
Die anfängliche Immunantwort auf eine Infektion mit NDV ist Zell-vermittelt und kann bereits 2 bis 3 Tage nach Infektion mit lebendigen Impfstoff-Stämmen nachgewiesen werden. Dies erklärt voraussichtlich den frühen Schutz bei Virus-Challenge, der in geimpften Vögeln verzeichnet wurde, bevor eine messbare Antikörper-Antwort zu beobachten war (Gough und Alexander, 1973).
Eine Woche nach Infektion können zirkulierende Antikörper den Wirt vor einer erneuten Infektion schützen. In dieser frühen Phase ist IgM beteiligt, gefolgt von IgG. Die Titer und der Schutz erreichen nach etwa 3 Wochen einen Höhepunkt und nehmen schrittweise ab, sofern es keine Auffrischung gibt. Dies bedeutet, dass für ältere Vögel erneute Impfungen notwendig sind.
Lediglich Lebendimpfstoffe, die über den respiratorischen Weg verabreicht werden, stimulieren Antikörper in allen mukosalen Oberflächen sowie im Serum. Ein inaktivierter Impfstoff löst selbst bei intramuskulärer Verabreichung keine lokale Resistenz im Respirationstrakt aus, obwohl hohe Konzentrationen von Serum-Antikörpern vorliegen.
Dies unterstreicht die Bedeutung von Lebendimpfstoffen, die in der Lage sind, virales Antigen im oberen Respirationstrakt zu präsentieren, um sowohl lokale als auch systemische Immunität zu induzieren. Kleine Tröpfchen dringen in den unteren Respirationstrakt ein, wodurch eine vornehmlich humorale Immunantwort ausgelöst wird, während größere Tröpfchen die lokale Immunität im oberen Respirationstrakt stimulieren.
Folglich erzeugen Aerosole innerhalb eines weiten Bereichs der Tropfengröße die beste gesamt-lokale und gesamt-humorale Immunität.
Es sollte jedoch beachtet werden, dass trotz ausführlicher Impfung mit gegenwärtigen Impfstoffen, die zu hohen Antikörper-Titern führen, immer noch Virus von den Oberflächen der Schleimhäute gewonnen werden kann.
Die Identifizierung der Newcastle-Krankheit in den USA führte zur Verwendung von inaktivierten Impfstoffen (Hofstad, 1953). Die Beobachtung, dass einige der enzootischen Viren lediglich eine milde Erkrankung verursachen, führte zunächst zur Entwicklung des mesogenen Lebendimpfstoffs Roakin (Beaudette et al., 1949), und anschließend zur Entwicklung der milderen Stämme Hitschner B1 (Hitschner und Johnson, 1948) und LaSota (Goldhaft, 1980), die nunmehr die am stärksten verbreiteten Lebendimpfstoffe sind.
NDV-Lebendimpfstoffe können in zwei Gruppen eingeteilt werden: lentogene und mesogene. Mesogene Stämme sind aufgrund ihrer höheren Virulenz lediglich für die Sekundärimpfung von Vögeln geeignet. Die Immunantwort nimmt mit steigender Pathogenität des Lebendimpfstoffs zu. Um das erwünschte Ausmaß an Schutz ohne schwerwiegende Reaktion zu erhalten, werden derzeit folglich Impfprogramme verwendet, welche die sequentielle Verwendung von schrittweise virulenteren Impfstoffen oder die Verwendung von Lebendimpfstoffen gefolgt von inaktivierten Impfstoffen umfassen.
Einer der Hauptvorteile von Lebendimpfstoffen besteht darin, dass diese durch kostengünstige Massenanwendungsverfahren verabreicht werden können. Ein übliches Verfahren der Verabreichung erfolgt über das Trinkwasser. Die Verwendung von Trinkwasser muß jedoch sorgsam überwacht werden, da das Virus durch übermäßige Hitze sowie durch Licht und virizide Verunreinigungen im Wasser inaktiviert werden kann.
Die Massenanwendung von Lebendimpfstoff durch Sprays und Aerosole ist aufgrund der Leichtigkeit, mit der eine große Anzahl von Vögeln in kurzer Zeit geimpft werden kann, ebenfalls sehr populär. Es ist wichtig, die korrekte Partikelgröße zu erhalten, indem die Bedingungen kontrolliert werden, unter denen die Partikel erzeugt werden.
Gegenwärtig verwendete Lebendimpfstoffe haben mehrere Nacheile. Der Impfstoff kann, abhängig von den Umweltbedingungen und des Vorhandenseins von erschwerenden Infektionen, immer noch Symptome der Krankheit verursachen. Es ist daher wichtig, extrem mildes Virus für die primäre Impfung zu benutzen, und aus diesem Grund sind in der Regel mehrere Impfungen notwendig. Des Weiteren können von mütterlicher Seite stammende Antikörper die erfolgreiche Primärimpfung mit lentogenen Lebendimpfstoffen verhindern.
Inaktivierte Impfstoffe werden üblicherweise ausgehend von infektiöser Allantoisflüssigkeit hergestellt, die mit Formalin oder beta-Propiolakton behandelt wird, um das Virus abzutöten, und die mit einem geeigneten Adjuvans gemischt wird. Inaktivierte Impfstoffe werden entweder durch intramuskuläre oder subkutane Injektion verabreicht. Inaktivierte Impfstoffe sind bezüglich ihrer Herstellung und Anwendung kostenintensiv.
Inaktivierte Öl-Emulsions-Impfstoffe sind jedoch durch die mütterliche Immunität nicht so nachteilig betroffen wie Lebendimpfstoffe, und sie können in Hühnern verwendet werden, die einen Tag alt sind. Die Vorteile von inaktivierten Impfstoffen sind das geringe Ausmaß von Nebenwirkungen in den geimpften Vögeln, der hohe Spiegel an schützenden Antikörpern sowie die lange Dauer des Schutzes. Keiner der oben genannten Impfstoffe kann serologisch von Wildtyp-NDV unterschieden werden.
Die Entwicklung von rekombinanten viralen Impfstoffen ist über mehrere Jahre für die Geflügel-Industrie von Interesse gewesen. Das Konzept besteht darin, Gene von entscheidenden immunisierenden Epitopen eines Kranheits-Agens von Interesse in ein nicht-essentielles Gen eines Vektor-Virus einzubringen. Die Impfung mit dem rekombinanten Virus erzeugt dann eine Immunisierung sowohl gegen das Vektor-Virus als auch gegen das Erkrankungs-Agens von Interesse.
Mehrere Arten von Viren sind als potentielle Lebendvirusimpfstoffe für Geflügel begutachtet worden. Zwei Vogelviren, die stärkste Beachtung gefunden haben, sind das Geflügelpockenvirus (fowlpox virus; FPV) und das Putenherpesvirus (herpesvirus of turkeys; HVT). Das Geflügelpockenvirus ist ein DNA-Virus, das ein großes Genom aufweist; es wird daher angenommen, dass es ausreichend Platz aufweist, um fremde Gene zu tragen.
Im attenuierten Zustand verursacht FPV keine klinische Erkrankung und wird im Allgemeinen als Impfstoff in Hühnern verwendet. HVT ist ebenfalls ein DNA-Virus und wird als Serotyp III der Familie des Marek-Krankheit-Virus (MDV) klassifiziert. HVT ist nicht pathogen für Hühner und sogar kreuzprotektiv gegenüber MDV, und es wird im Allgemeinen verwendet, um Hühner gegen die Marek-Krankheit zu impfen.
Es ist gezeigt worden, dass der Schutz gegen die Newcastle-Krankheit durch Verwendung von rekombinanten HVT- oder FPV-Impfstoffen induziert werden kann (Morgan et al., 1992, 1993; Heckert et al., 1996; Boursnell et al., 1990; Taylor et al., 1990).
Der Beginn des Schutzes gegen die Newcastle-Krankheit nach Impfung mit solchen rekombinanten Impfstoffen, die entweder das F-Protein von NDV oder sowohl das F-Protein als auch das HN-Protein exprimieren, war im Vergleich zu einer Impfung mit herkömmlichem Lebendimpfstoff oder mit inaktiviertem NDV-Impfstoff stark verzögert, möglicherweise weil die rekombinanten Impfstoffe kein ausreichend weites immunologisches Spektrum von antigenisch relevanten NDV-Epitopen bereitstellen, die sich von denjenigen unterscheiden, die auf dem NDV-Protein gefunden werden, welches durch den rekombinanten Impfstoff exprimiert wird, oder weil sie dem Immunsystem nicht in angemessener Weise präsentiert werden.
Darüber hinaus wurde in Vögeln, die mit den rekombinanten Impfstoffen geimpft wurden, kein lokaler (mukosaler, respiratorischer oder enterischer) Schutz wirksam induziert. Dies ist ein schwerwiegender Nachteil, da Impfstoffe zur Verwendung als Primärimpfstoff gegen respiratorische Erkrankungen eine lokale Immunität induzieren müssen, um eine Infektion und Ausbreitung von virulenten Viren, die Hühner infizieren, welche unter Praxisbedingungen aufgezogen wurden, zu verhindern.
Antikörper gegen NDV, die in der Lage sind, den Wirt zu schützen, können in Virus-Neutralisationstests gemessen werden. Da es jedoch scheint, dass die Neutralisationsantwort parallel zur Hämagglutination-Inhibierungs (HI)-Antwort verläuft, wird der letztgenannte Test häufig verwendet, um die protektive Reaktion zu bewerten, insbesondere nach einer Impfung.
Antikörper sowohl gegen das F-Protein als auch gegen das HN-Protein können NDV neutralisieren. Antikörper gegen das F-Protein scheinen jedoch in in vivo-Tests und in in vitro-Tests eine stärkere Neutralisierung zu induzieren als diejenigen, die gegen HN gerichtet sind (Meulemans et al., 1986).
Das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern gegen NDV im Serum eines Vogels stellt eine begrenzte Information in Bezug auf den infizierenden NDV-Stamm bereit und hat folglich beschränkten diagnostischen Wert.
Die Allgegenwart von lentogenen NDV-Stämmen in Vögeln in den meisten Ländern sowie die nahezu einheitliche Verwendung von Lebendimpfstoffen, die (zumindest serologisch) nicht von Wildtyp-NDV unterschieden werden können, bedeutet, dass das reine Aufzeigen einer Infektion nur selten ein angebrachter Anlass für anzulegende Kontrollmaßnahmen darstellt. Da die Felderkrankung ein unzuverlässiges Maß für die tatsächliche Virulenz des Virus sein könnte, ist es erforderlich, das aufgefundenen Virus weiter zu charakterisieren.
Gegenwärtig besteht das einzige Verfahren zur Diagnose der Newcastle-Krankheit, das eine Charakterisierung des infizierenden Stamms ermöglicht, in einer Virusisolierung gefolgt von der Untersuchung auf Pathogenität. Gegenwärtig werden zu diesem Zweck drei in vivo-Tests verwendet: 1) mittlere Abtötungszeit (mean death time; MDT) in Eiern; 2) intracerebraler Pathogenitätsindex (ICPI) in Hühnern, die einen Tag alt sind; 3) intravenöser Pathogenitätsindex (IVPI) in Vögeln, die 6 Wochen alt sind.
Diese Tests weisen mehrere Nachteile auf, wie beispielsweise die Verfügbarkeit an Tieren, die geringfügige Reproduzierbarkeit sowie die verhältnismäßig lange Dauer der Untersuchungen. Nicht zuletzt erlauben diese Tests keine einfache serologische Identifizierung von Geflügel, das mit einem Impfstoff geimpft oder mit einem Wildtyp-Stamm infiziert wurde.
Als eine Alternative zu in vivo-Tests ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erfolgreich verwendet worden, um zwischen virulenten und nicht-virulenten Isolaten zu unterscheiden (Staüber et al., 1995; Kant et al., 1997), wobei jedoch wiederum eine serologische Unterscheidung nicht möglich ist.
Die Aufzucht von Geflügel und der Handel mit Geflügelprodukten ist heutzutage auf einer internationalen Basis organisiert und steht häufig unter dem Management von multinationalen Unternehmen. Die Bedrohung durch die Newcastle-Krankheit hat sich als große Einschränkung für einen solchen Handel erwiesen.
Einer erfolgreichen Kontrolle der Newcastle-Krankheit wird man sich nur nähern können, wenn alle Länder Ausbrüche berichten. Internationale Vereinbarungen sind jedoch aufgrund der enormen Abweichungen im Bezug auf den Umfang einer Krankheitsüberwachung in verschiedenen Ländern nicht einfach. Einige Länder führen keine Impfungen durch und wollen nicht, dass irgendeine Form von NDV in heimisches Geflügel eingebracht wird, weil geimpftes Geflügel nicht von dem Geflügel unterschieden werden kann, das mit Wildtyp-NDV infiziert ist.
Andere erlauben lediglich die Verwendung von bestimmten Lebendimpfstoffen und erachten andere Impfstoffe als unakzeptabel virulent. Wiederum andere Länder weisen ein dauerhaftes Vorkommen von zirkulierendem, hoch virulentem Virus auf, das als solches nicht erkannt wird, weil die offenkundige Erkrankung durch die Impfung verdeckt wird.
In zahlreichen Ländern existiert eine Gesetzgebung, um eventuelle Ausbrüche der Newcastle-Krankheit zu kontrollieren. Nationale Kontrollmaßnahmen richten sich auf die Verhinderung der Einschleppung und der Verbreitung. In den meisten Ländern gibt es Beschränkungen des Handels mit Geflügelprodukten, Eiern und lebendem Geflügel. Die meisten Länder haben ein Quarantäneverfahren für den Import errichtet, insbesondere für Papageienvögel.
Einige Länder haben Ausrottungsstrategien erstellt, bei denen infizierte Vögel, ihre Kontakte und Produkte zwingend vernichtet werden. Andere erfordern eine prophylaktische Impfung der Vögel selbst in Abwesenheit von Ausbrüchen, während wieder andere eine Richtlinie für eine Ringimpfung um Ausbrüche herum aufweisen, um eine Pufferzone zu etablieren.
Es besteht eindeutig eine Notwendigkeit für verbesserte Impfstoffe und für verbesserte diagnostische Verfahren, die verwendet werden können, um die Newcastle-Krankheit zu kontrollieren. Aufgrund der großen Unterschiede in Bezug auf die Dosis, die von einzelnen Vögeln während einer Massenanwendung von Lebendimpfstoff erhalten wird, und aufgrund der Abweichung in Bezug auf das Ausmaß der mütterlichen Immunität in jungen Hühnern sind nach der Impfung erfolgende Reaktionen mit Lebendimpfstoffen unumgänglich. Dies ist eine der Hauptbefürchtungen von Landwirten in Ländern, in denen eine Impfung vorgeschrieben ist.
Darüber hinaus sind zahlreiche Impfstoffe Mischungen aus Subpopulationen. Im klonierten Zustand können diese Subpopulationen in Bezug auf die Immunogenität und Pathogenität signifikant voneinander abweichen (Hanson, 1988).
Der größte Nachteil der gegenwärtig verwendeten Lebendimpfstoffe und der inaktivierten Impfstoffe ist jedoch die Tatsache, dass mit den gegenwärtig verwendeten Screening-Verfahren (wie beispielsweise Hämagglunation-Inhibierungstest oder Virus-Neutralisationstest) geimpfte Tiere nicht von infizierten Tieren unterschieden werden können.
Virulentes Feld-Virus kann sich in geimpften Beständen weiter verbreiten, da die Symptome der Erkrankung durch die Impfung verdeckt werden. Da die Isolierung des Virus und die Charakterisierung der Virulenz durch in vivo-Verfahren nicht im großen Maßstab durchführbar ist, gibt es ein großes Bedürfnis nach neuen und wirksamen attenuierten Lebendimpfstoffen, die serologisch von Feld-Viren unterschieden werden können.
Solche Impfstoffe, die als NDV-Marker-Impfstoffe bezeichnet werden (und zugehörige diagnostische Verfahren und Kits), die das größtmögliche immunologische Spektrum von antigenisch relevanten NDV-Epitopen bereitstellen sollten, und die serologisch von Wildtyp-NDV unterschiedlich sein sollten, sind noch nicht verfügbar.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Modifizieren eines Genoms eines Vogel-Paramyxovirus (aviären Paramyxovirus) durch genetische Modifikation sowie ein genetisch modifiziertes Vogel-Paramyxovirus und einen Vogel-Paramyxovirus-Marker-Impfstoff bereit.
Das Aufkommen der modernen molekularbiologischen Verfahren hat die genetische Modifikation zahlreicher RNA-Viren ermöglicht, einschließlich Viren mit negativsträngiger RNA. Diese Methode wird oftmals als "Reverse Genetik" bezeichnet. Man stellt zunächst eine cDNA-Kopie (vollständiger Länge) der viralen RNA bereit, und transkribiert diese DNA in geeigneten Zellen, um infektiöse RNA zu erzeugen, die wiederum repliziert werden kann, um infektiöse Viruspartikel zu erzeugen.
Im Allgemeinen ist es durch vorhergehende Modifikation der cDNA mit standardmäßigen molekularbiologischen Verfahren möglich, ein genetisch modifiziertes RNA-Virus zu erhalten. Dies wurde jedoch für NDV oder andere Vogel-Paramyxoviren nicht in die Tat umgesetzt; es ist bislang noch nicht einmal möglich gewesen, Minigenom-Fragmente oder Plasmide von genomischen Fragmenten eines Vogel-Paramyxovirus zu erzeugen, um die Ereignisse bei der Replikation des Vogel-Paramyxovirus zu untersuchen, und damit ein Verständnis zu erhalten, wie eine infektiöse Viruskopie zu konstruieren ist.
Obwohl in dieser Beschreibung es nunmehr zweifelsfrei belegt worden ist, dass das Genom des Vogel-Paramyxovirus das kleinste aller bislang sequenzierten Paramyxovirus-Genome ist, ist überraschenderweise insbesondere die 5'-terminale Endsequenz des NDV-Genoms viel länger als zuvor bekannt war und anhand eines Vergleichs mit anderen Paramyxoviridae erwartet worden war.
Die Erfindung stellt nunmehr zum ersten Mal eine vollständige Sequenz eines Vogel-Paramyxovirus-Genoms bereit, und sie stellt cDNA eines solchen Virus von vollständiger Länge oder von minigenomischer Länge bereit.
Die Erfindung stellt vorliegend Vogel-Paramyxovirus-cDNA bereit, die mindestens das 5'-terminale Ende des Genoms von NDV umfasst, welches dem 5'-terminalen Ende von NDV von 6 entspricht, wodurch die Erzeugung einer infektiösen Kopie eines Vogel-Paramyxovirus möglich wird, und wobei die cDNA vorzugsweise eine cDNA vollständiger Länge umfasst. Die Erfindung stellt jedoch ferner cDNA bereit, die mindestens das 5'-terminale Ende des Genoms von NDV umfasst, welches dem 5'-terminalen Ende von NDV von 6 entspricht, wodurch die Erzeugung eines sich replizierenden Vogel-Paramyxovirus-Minigenoms möglich wird. Solche Minigenome können in vorteilhafter Weise verwendet werden, um ausgehend von modifizierten Nukleinsäuresequenzen RNA zu transkribieren und/oder Proteine zu exprimieren. Die Erfindung stellt eine erfindungsgemäße cDNA bereit, die mindestens teilweise von Newcastle-Krankheit-Virus abgeleitet ist, beispielsweise dadurch gekennzeichnet, dass das Newcastle-Krankheit-Virus ein lentogenes Virus ist, vorzugsweise abgeleitet von einem Impfstamm, wie beispielsweise LaSota-Stamm ATCC VR-699.
Die Erfindung stellt darüber hinaus eine erfindungsgemäße cDNA bereit, die mit einer Modifikation in einer Nukleinsäure ausgestattet ist, wie beispielsweise mit einer Deletion, Insertion, Mutation, oder mit einer andersartigen Modifikation. Beispielsweise wird eine cDNA bereitgestellt, bei der die Modifikation eine Nukleinsäure umfasst, welche für eine modifizierte Protease-Spaltstelle kodiert, beispielsweise dadurch gekennzeichnet, dass die Spaltstelle eine Protease-Spaltstelle des Fusionsproteins (F) ist.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine erfindungsgemäße cDNA bereit, bei der die Modifikation eine Nukleinsäure umfasst, welche für ein virales Hybridprotein kodiert, wie beispielsweise für ein Hybrid-Hämagglutinin-Neuraminidase (HN)-Protein, wie es im experimentellen Teil der Erfindung beschrieben wird. Die Erfindung stellt ferner eine erfindungsgemäße cDNA bereit, bei der die Modifikation eine Deletion in einer Nukleinsäure umfasst, welche für ein virales Protein kodiert, beispielsweise für ein Matrix (M)-Protein.
Die Erfindung stellt darüber hinaus ein erfindungsgemäßes cDNA-Molekül bereit, das zusätzlich mit einer Nukleinsäure ausgestattet ist, die für ein heterologes Antigen kodiert, vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen von einem Krankheitserreger für Geflügel abgeleitet ist, wie es beispielsweise nachstehend beschrieben wird. Eine RNA, sowie ein davon abgeleitetes Protein, die ausgehend von einer erfindungsgemäßen cDNA erhalten wurden, werden ebenfalls bereitgestellt.
In den vergangenen Jahren wurden mehrere nicht segmentierte negativsträngige RNA-Viren vollständig charakterisiert, und grundlegende Arbeiten zur Replikation und Expression ihrer Genome hat dazu geführt, dass infektiöse Viren erzeugt werden konnten, indem Zellen gänzlich mit klonierter cDNA des Virus transfiziert wurden (zusammengefaßt von Conzelmann, 1996).
Bislang wurde infektiöses Virus von nicht segmentierten negativsträngigen RNA-Viren ausgehend von klonierter cDNA hergestellt, beispielsweise solche von Rabies-Virus (Schnell et al., 1994; Conzelmann; EP 0 702 085 A1 ) (Schnell et al., 1994, EP 0 702 085 A1 ), vesikulärem Stomatitis-Virus (Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995), Sendai-Virus (Garcin et al., 1995), Masern-Virus (Radecke et al., 1995; Schneider et al., 1997; EP 0 780 475 A1 ), humanem respiratorischem Syncytial-Virus (Collins et al., 1995), Rinderpestvirus (Baron und Barrett, 1997) und humanem Parainfluenzavirus Typ 3 (Hoffman und Banerjee, 1997, Conzelmann; EP 0 702 085 A1 ), (Schnell et al., 1994; EP 0 702 085 A1 ).
Alle der oben genannten infektiösen Kopie-Viren sind in der Lage sowohl in vivo als auch in vitro in Wirten, Geweben oder Zellen verschiedenen Ursprungs zu wachsen, was eine einfache cDNA-Transfektion sowie die Replikation und die Erzeugung von infektiösen Viruspartikeln in einer geeigneten Zelllinie erlaubt.
Eine solche Möglichkeit besteht für NDV nicht, und insbesondere nicht für lentogene NDV-Stämme, die einen Impfstoff bereitstellen können. Die Virulenz eines solchen NDV-Stamms ist mit seiner Fähigkeit assoziiert, sich in einer großen Vielzahl von Zellen zu replizieren, was durch die Tatsache widergespiegelt wird, dass virulente Stämme sich problemlos in vitro und in vivo replizieren können, während Impfstoff-Stämme sich lediglich in vivo replizieren können.
Aus diesem Grund liegt bei NDV eine Zwickmühlensituation vor. Während Versuche zur Herstellung eines infektiösen Kopie-Virus (beispielsweise aus infektiöser cDNA) möglicherweise zu einem infektiösen Virus führen könnte, ist ein solches Virus im Allgemeinen nicht zur Verwendung als Impfstoff geeignet, weil das damit erzeugte infektiöse Virus in der Regel zu virulent ist, um als Impfstoff verwendet zu werden; die Tatsache, dass dieses erzeugt und nach Transfektion von cDNA in einer Zelllinie repliziert werden kann, spiegelt die leichte Spaltbarkeit des Fo-Proteins in F1 und F2 wieder, welche – wie oben besprochen – ein Kennzeichen der Virulenz von NDV ist.
Die Verwendung eines Impfstamms als parentales Material für cDNA würde dieses Problem nicht lösen; ein Impfstamm, insbesondere ein solcher vom lentogenen Typ, enthält kein leicht spaltbares Fo-Protein, was es für die erste Virusgeneration unmöglich macht, die Replikation fortzusetzen. Die zur Transfektion verwendete Zelle wird einfach nicht in der Lage sein, einen oder mehrere Replikationszyklen von Virus des Impfstoff-Typs mit einem nicht gespaltenen Fo-Protein zu unterstützen.
Die Erfindung stellt nunmehr in eleganter Weise eine Lösung für dieses Problem bereit, und sie stellt somit ein infektiöses Kopie-NDV bereit, beispielsweise zur Verwendung in einem Impfstoff.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer infektiösen Kopie eines Newcastle-Krankheit-Virus bereit, bei dem man Zellen transfiziert, die in der Lage sind, die viralen Proteine NP, P und L für die Komplexierung von viraler RNA mit klonierter cDNA vollständiger Länge oder mit cDNA genomischer Länge aus diesem Virus zu exprimieren, und bei dem man ferner diese Zellen in Wachstumsmedium inkubiert, das eine proteolytische Aktivität umfasst, welche die Spaltung des Fo-Proteins des Virus erlaubt.
In unserem System kann die Co-Transfektion eines NP-exprimierenden Plasmids ausgelassen werden. NP wird wahr scheinlich ausgehend von der cDNA vollständiger Länge exprimiert, da das NP-Gen das erste Gen nach dem 5'-Ende der antigenomischen RNA ist. Da eukaryontische mRNAs in der Regel monocystronisch sind, ist die Expression von distalen Genen nicht zu erwarten. Es ist jedoch möglich, eine cDNA vollständiger Länge zu erzeugen, in der die relevanten Positionen des NDV-Gens ausgetauscht sind. Wenn das erste Gen einer cDNA das NP-Gen oder das L-Gen ist, so ist es nicht notwendig, das entsprechende Genprodukt ausgehend von einem co-transfizierten Plasmid zu exprimieren.
Als eine Alternative zur Verwendung von cDNA vollständiger Länge ist es möglich, zwei oder mehr subgenomische cDNAs zu verwenden, die replikationskompetente subgenomische RNAs erzeugen, und die gemeinsam das vollständige Komplement der Vogel-Paramyxovirus-Proteine exprimieren. Selbst wenn die RNAs separat verpackt werden, können die resultierenden virusähnlichen Partikel für aufeinanderfolgende Replikationszyklen verwendet werden, indem man eine Co-Infektion und Komplementierung der Genfunktion durchführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, bei dem die proteolytische Aktivität von einem Enzym abgeleitet ist, wie beispielsweise einem Trypsinähnlichen Enzym, oder von einer Zusammensetzung, welche diese proteolytische Aktivität umfasst. In einer stark bevorzugten Ausführungsform umfasst das Wachstumsmedium Allantoisflüssigkeit, welche die proteolytische Aktivität umfasst. Die Spaltung des Fo-Proteins ist für die Erzeugung von infektiösem Virus erforderlich. Es ist möglich, infektiöses Virus ausgehend von lentogenen Stämmen ohne Zugabe von exogener proteolytischer Aktivität zu erzeugen. Durch Inokulation des Überstands von transfizierten Zellen in die Allantoishöhle von embryonierten Eiern ist die proteolytische Aktivität, welche in der Allantoisflüssigkeit vorhanden ist, in der Lage, das Fo-Protein zu spalten, und so den fusionskompetenten F1-F2-Komplex zu erzeugen. Virione mit einem solchen aktivierten F-Protein sind in der Lage, empfindliche Zellen zu infizieren, und die Replikation in Zellen, welche die gewünschte proteolytische Aktivität exprimieren, führt zu infektiösen Nachkommen. Als eine Alternative zur Zugabe der erwünschten proteolytischen Aktivität in den Überstand von transfizierten Zellen ist es beispielsweise möglich, eine Zelle zu verwenden, die für NDV tolerant ist, und die bereits die proteolytische Aktivität exprimiert. Eine solche Zelllinie wird verwendet, um infektiöses lentogenes NDV ohne Zugabe exogener proteolytischer Aktivität zu erzeugen. Eine solche Zelllinie kann auch durch stabile Transfektion einer Zelllinie mit einem Gen erzeugt werden, das diese Aktivität spezifiziert. Darüber hinaus ist es möglich, eine stabile transfizierte Zelllinie zu erzeugen, die Wildtyp-F-Protein in der Virushülle exprimiert, wodurch infektiöse Partikel (welche nicht mit genomischer Information ausgestattet sind, die für das Wildtyp-F-Protein kodiert) bereitgestellt werden, die Mittel zum Eindringen in die Zelle aufweisen. Das Freisetzen von infektiösem lentogenem Virus ist ferner durch Infektion von transfizierten Zellen mit einem NDV-Helfervirus möglich. Ein essentielles Erfordernis für ein solches Helfervirus besteht darin, dass es selektiert werden kann, beispielsweise durch neutralisierende Antikörper, die das Helfervirus eliminieren, jedoch nicht mit dem lentogenen Virus reagieren. Schließlich kann man eine stabil transfizierte Zelllinie konstruieren, die ein, zwei oder alle der drei essentiellen NDV-Proteine NP, P und L exprimiert. Solche Zelllinien erfordern lediglich die Co-Expression einer Untergruppe der drei essentiellen Proteine oder gar keine Co-Expression, um die Erzeugung von infektiösem Kopie-Virus zu unterstützen.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, bei dem die zur Transfektion verwendeten Zellen von primären oder sekundären Hühnerzellen oder von Zelllinien abgeleitet sind. Die Beschreibung stellt beispielsweise CER- oder CEF-Zellen bereit, die wie die meisten in vitro-Zellen im Allgemeinen keine geeigneten Proteasen aufweisen, die erforderlich sind, um das Fo-Protein von NDV zu spalten, beispielsweise das vom Stamm LaSota. Es können jedoch auch Zellen verwendet werden, die beispielsweise von anderen Vögeln abgeleitet sind.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Erzeugung eines infektiösen Kopie-Newcastle-Krankheit-Virus bereit, bei dem man Zellen mit klonierter cDNA vollständiger Länge oder mit cDNA genomischer Länge dieses Virus transfiziert, wie es beispielsweise in 3 gezeigt ist, und bei dem man ferner die Zellen in Wachstumsmedium inkubiert, das eine proteolytische Aktivität aufweist, welche die Spaltung des Fo-Proteins des Virus erlaubt, und bei dem man ferner das infektiöse Virus gewinnt, indem man diese Zellen kultiviert und Material, welches aus den kultivierten Zellen erhalten wurde, in die Allantoishöhle von embryonierten Eiern inokuliert. Dieses Material umfasst beispielsweise (geerntete oder gefrorene/aufgetaute) Zellen oder Zelltrümmer oder Überstand, der von der Zellkultur erhalten wurde.
Die Beschreibung beschreibt beispielsweise ein Verfahren zur Gewinnung von infektiösem Virus, wobei der Überstand von transfizierten CEF-Monolayern in die Allantoishöhle von embryonierten Eiern inokuliert wurde. Vier Tage später wurde die Allantoisflüssigkeit geerntet, in einem Hämagglinationsassay analysiert und weiter in Eier passagiert.
Darüber hinaus stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, bei dem man ferner das infektiöse Kopie-Newcastle-Krankheit-Virus durch Abernten der Allantoisflüssigkeit und erneute Inokulation in embryonierte Eier passagiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, bei dem das Virus ein lentogenes Virus ist, beispielsweise abgeleitet von einem avirulenten Feldfall von NDV oder von einem Impfstamm von NDV, wie beispielsweise dem NDV-LaSota-Stamm. Darüber hinaus wird ein Verfahren zum Modifizieren eines Vogel-Paramyxovirus-Genoms durch genetische Modifikation bereitgestellt, das die Einbringung einer oder mehrerer Mutationen, Deletionen und/oder Insertionen oder anderer Modifikationen erlaubt. Beispielsweise wird ein Verfahren zur Attenuierung oder Modifizierung der Virulenz von Vogel-Paramyxovirus bereitgestellt, bei dem man cDNA, die beispielsweise für ein virales Protein wie das V-Protein kodiert, modifiziert und die modifizierte cDNA in eine cDNA vollständiger Länge kloniert und ein infektiöses Kopie-Virus aus dieser cDNA vollständiger Länge erzeugt, wodurch neue NDV-Stämme oder neue attenuierte lebende Impfstoffe mit verbesserten Eigenschaften erzeugt werden.
Neben der Attenuierung durch Modifizierung von Genprodukten ist es ferner möglich, Vogel-Parmayxovirus durch Modifizierung der Nukleotidsequenz, die an der Transkription und/oder Replikation beteiligt ist, zu attenuieren. Solche Modifikationen führen zu attenuierten Stämmen, die Wildtyp-ähnliche F-Proteine exprimieren, die sowohl in vitro als auch in vivo in einer großen Vielzahl von Zellen spaltbar sind, und die somit stärker immunogen sind als die klassischen Virus-Stämme.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zur Attenuierung oder Modifizierung der Virulenz eines Vogel-Paramyxovirus, wie beispielsweise eines Newcastle-Krankheit-Virus, bereit, bei dem man eine Proteasespaltstelle eines viralen Proteins durch Modifizierung der cDNA, welche für diese Spaltstelle kodiert, modifiziert, und bei dem man die cDNA in cDNA genomischer Länge, z.B. von Newcastle- Krankheit-Virus, kloniert, und ein infektiöses Kopie-Newcastle-Krankheit-Virus erzeugt. Die Spaltstelle ist beispielsweise eine Proteasespaltstelle in dem F-Protein oder in dem HN-Protein des Newcastle-Krankheit-Virus. Die Attenuierung ist im Allgemeinen auf die Verringerung der Virulenz beschränkt, es ist jedoch nunmehr auch möglich, einen relativ avirulenten Stamm von NDV zu verwenden und die Nachkommen eines solchen Stamms mit erhöhter Virulenz auszustatten, beispielsweise indem man diese mit einer erhöhten Tendenz zur Replikation in einem spezifischen Zelltyp ausstattet. Es ist nunmehr somit möglich, NDV verschiedene Virulenzattribute zu verleihen.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur antigenischen Modifizierung von Vogel-Paramyxovirus, wie beispielsweise eines Newcastle-Krankheit-Virus bereit, bei dem man cDNA modifiziert, die für mindestens einen Teil eines viralen Proteins kodiert, das mindestens ein immundominantes Epitop umfasst, und bei dem man ferner die cDNA in cDNA genomischer Länge des Newcastle-Krankheit-Virus kloniert, und infektiöses Kopie-Newcastle-Krankheit-Virus erzeugt.
Die Erfindung stellt beispielsweise ein Verfahren zur (weiteren) Modifizierung von NDV bereit, beispielsweise durch Verwendung eines Verfahrens zur Herstellung einer infektiösen Kopie von NDV (Impfstoff), die bereitgestellt wurde; ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Marker-NDV-Impfstoffs wird bereitgestellt, sowie ein Marker-Impfstoff, der das größtmögliche oder erforderliche immunologische Spektrum von antigenisch relevanten NDV-Epitopen umfasst, und serologisch vom Wildtyp-NDV unterschiedlich ist, weil ein bestimmtes serologisch relevantes Epitop oder ein bestimmter serologisch relevanter Marker durch rekombinante Verfahren entfernt wurde. Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Modifizierung der antigenischen Ausstattung eines Vogel-Paramyxovirus, wie bei spielsweise NDV, bereit, das folglich die Erzeugung z.B. eines lebenden NDV-Marker-Impfstoffs ermöglicht, der serologisch von Feldstämmen des Vogel-Paramyxovirus unterschieden werden kann.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein infektiöses Kopie-NDV bereit, bei dem das HN-Protein von NDV modifiziert wurde, indem man die cDNA, die für einen Teil dieses HN-Proteins kodiert, mit cDNA rekombiniert hat, die für einen Teil eines HN-Proteins aus einem Vogel-Paramyxovirus kodiert, beispielsweise vom Typ 2 oder Typ 4. Dieses Hybrid-HN-Protein dient als serologischer Marker für den so erhaltenen infektiösen Kopie-NDV-Stamm, oder es kann dazu dienen, den Tropismus des Vogel-Paramyxovirus in Bezug auf andere Zellen und/oder Gewebe zu verändern. Diese durch die Erfindung bereitgestellten sogenannten Markerstämme erlauben die Erzeugung von Impfstoffen, die ein unschätzbares Hilfsmittel bei der Bestimmung der Prävalenz von NDV in kommerziellen Schwärmen weltweit sind. Darüber hinaus wird die Verwendung dieser Marker-Impfstoffe in großem Umfang zur vollständigen Ausrottung von NDV führen, indem ein Verfahren aus intensivem Screening und Ausmustern von infizierten Schwärmen angewendet wird.
Darüber hinaus wird ein Verfahren zur Herstellung eines infektiösen Kopie-NDV-Stamms bereitgestellt, der ein oder mehrere Antigene von anderen Erregern exprimiert, und dazu verwendet werden kann, gegen mehrere Krankheiten zu impfen. Ein solches infektiöses Kopie-NDV-Virus umfasst beispielsweise eine heterologe cDNA, die für ein heterologes Protein kodiert, das beispielsweise von Vogelinfluenza (Avian Influenza; AI) (Hämagglutinin (H5 und H7) und Neuraminidase), Vogel-Leukosevirus (ALV) (env-Protein (gp85)), Hühneranämievirus (CAV) (VP1 + VP2), Marek-Kranheit-Virus (MDV) (Glykoprotein B (gB), gH), infektiöses Laryngotracheitis-Virus (ILT) (gB, gH, gD), infektiöses Bursal-Krankheit-Virus (IBDV) (VP2 und VP3), Truthahn-Rhinotracheitisvirus (TRT) (Fusions (F)-Protein), Vogel- Paramyxovirus-2, -3, -6 (PMV) (F-Protein, Hämagglutinin-Neuraminidase (HN), oder andere), infektiöses Bronchitisvirus (IBV) (Peplomerprotein, Nucleoprotein), Reoviren (Sigmaprotein), Adenoviren, Pneumoviren, Salmonella enteritidis, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Bordetella avium (früher Alcaligenes faecalis), Haemophilus paragallinarum, Pasteurella multocida, Ornithobacterium rhinotracheale, Riemerella (früher Pasteurella) anatipestifer, Mycoplasmata (M. gallisepticum, M. synoviae, M. mereagridis, M. iowae) oder Aspergilli (A. flavus, A. fumigatus).
Die Erfindung stellt vorliegend ein Vogel-Paramyxovirus oder davon abgeleitete Stämme bereit, die als Impfvektor für die Expression von Antigenen aus anderen Erregern für Geflügel verwendet werden können. Einige Eigenschaften machen NDV zu einem idealen Impfvektor für die Impfung gegen respiratorische oder intestinale Erkrankungen. 1) NDV kann in embryonierten Eiern problemlos bis auf hohe Titer kultiviert werden. 2) Eine Massenkultur von NDV in embryonierten Eiern ist verhältnismäßig billig. 3) NDV-Impfstoffe sind relativ stabil und können problemlos durch Massenanwendungsverfahren, wie beispielsweise über das Trinkwasser oder durch Versprühen oder durch Aerosolbildung, verabreicht werden. 4) Der natürliche Infektionsweg von NDV erfolgt über den respiratorischen Trakt und/oder Intestinaltrakt, wobei diese auch die wichtigsten natürlichen Infektionswege von zahlreichen anderen Erregern für Geflügel sind. 5) NDV kann trotz des Vorhandenseins von zirkulierenden mütterlichen Antikörpern eine lokale Immunität induzieren.
Es ist gezeigt worden, dass NDV potente anti-neoplastische sowie auch immunstimulierende Eigenschaften aufweist (siehe Schirrmacher et al., 1998 für einen Review) [Schirrmacher, V., Ahlert, T., Steiner, H.-H., Herold-Mende, C., Gerhards, R. und Hagmüller E. (1998) Immunization with virus-modified tumor cells. Seminars in Oncology 25: 677-696]. Obwohl NDV nicht in der Lage zu sein scheint, sich in normalen humanen Zellen wirksam zu replizieren, wurde ein selektives, von NDV-vermitteltes Abtöten von humanen Krebszellen festgestellt. Nach einer lokalen Therapie mit NDV wurde eine virale Onkolyse und eine vollständige Remission von humanen Tumor-Xenotransplantaten in Nacktmäusen beobachtet. Dies hat zur Verwendung von NDV in der Tumortherapie geführt. Das Problem ist jedoch, dass solche Applikationen auf lokale Behandlungen beschränkt sein könnten.
Die NDV-Infektion induziert Interferone, Chemokine und andere potentiell wichtigen Genprodukte, und sie führt pleiotrope, immunstimulierende Eigenschaften in Tumorzellen ein. Dieses Konzept wurde für die Herstellung von autologen Tumorzell-Impfstofffen verwendet, die aus frisch operierten Proben bestehen, welche mit NDV infiziert sind. Diese Art von Impfstoff wird autologes Tumorimpfstoff-NDV oder ATV-NDV genannt (Schirrmacher et al., 1998). Die NDV-infizierten Zellen werden durch gamma-Bestrahlung inaktiviert, die eine Zellteilung verhindert, jedoch eine Replikation von NDV im Zytoplasma von infizierten Zellen noch erlaubt. Nach Inokulation von Patienten mit ATV-NDV werden T-Zellen durch NDV-induzierte Chemokine rekrutiert. Einige dieser T-Zellen könnten einen T-Zellrezeptor exprimieren, der im Komplex mit Molekülen des Haupt-Histokompatibilitätskomplexes der Klasse I an der Zelloberfläche mit Peptiden aus tumorassoziierten Antigenen interagieren kann. Diese Interaktion führt zur Induktion einer zytotoxischen T-Zell-Antwort, die zu einem spezifischen Abtöten von autologen Tumorzellen führt.
Die Erfindung sorgt dafür, dass das Repertoire und die Menge von Chemokinen und immunstimulatorischen Proteinen, die durch eine NDV-Infektion induziert werden, moduliert werden. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung von rekombinantem NDV bereit, das modifiziert wurde, sodass es ein heterologes Gen (heterologe Gene) umfasst und exprimiert. Ein solches rekombinantes NDV kann verwendet werden, um das Repertoire und die Menge von immunstimulatorischen Proteinen in infizierten Zellen zu modifizieren. In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein rekombinantes NDV bereit, das Gene umfasst und exprimiert, welche für humane Interferone, Chemokine oder andere immunstimulatorischen Proteine kodieren. Das rekombinante NDV wird zur Herstellung von ATV-NDV verwendet, welches wirkungsvoller ist als herkömmliches ATV-NDV. Beispielsweise: Zytokine IFN-α, -β, TNF-α, IL-1, IL-6; Chemokine RANTES, IP-10; andere Gene, wie beispielsweise HSP, ACTH, Endorphin, iNOS, EPA/TIMP, NFκB). Die pleiotropen immunstimulatorischen Eigenschaften von NDV können auch als Adjuvans für die Impfung von Tieren und Menschen gegen Infektionserkrankungen verwendet werden. In einer Ausführungsform der Erfindung werden Fremdgene, die für ein relevantes Antigen (relevante Antigene) eines infektiösen Erregers (von infektiösen Erregern) kodieren, in das NDV-Genom eingebracht, und die gleichzeitige Expression des Antigens (der Antigene) und der immunstimulatorischen Proteine durch infizierte Zellen könnte eine wirkungsvolle Immunantwort gegen den infektiösen Erreger induzieren. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können die immunstimulatorischen Eigenschaften von NDV weiter verbessert werden, indem NDV-Rekombinanten verwendet werden, die gleichzeitig Antigene und spezifische immunstimulatorischen Proteine exprimieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Erfindung dazu verwendet, einen Impfstoff gegen AIDS (erworbenes Immundefizienz-Syndrom) zu erzeugen, indem NDV-Rekombinanten verwendet werden, die relevante Antigene des humanen Immundefizienzvirus (HIV) exprimieren, entweder allein oder in Kombination mit immunstimulatorischen Proteinen.
NDV wird darüber hinaus als Adjuvans für die Impfung von Menschen und Tieren gegen Infektionskrankheiten verwendet. In einer Ausführungsform der Erfindung werden heterologe Gene oder Fremdgene, die für ein relevantes Antigen (relevante Antigene) eines infektiösen Erregers (von infektiösen Erregern) kodieren, in das NDV-Genom eingebracht, und die gleichzeitige Expression des Antigens (der Antigene) und der immunstimulatorischen Proteine durch die infizierten Zellen könnte eine wirkungsvolle Immunantwort gegen den infektiösen Erreger induzieren. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die immunstimulatorischen Eigenschaften von NDV weiter verstärkt, indem NDV-Rekombinanten verwendet werden, die gleichzeitig Antigene und spezifische immunstimulatorischen Proteine exprimieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Erfindung verwendet, um einen Impfstoff gegen AIDS (erworbenes Immundefizienz-Syndrom) zu erzeugen, indem NDV-Rekombinanten verwendet werden, die relevante Antigene des humanen Immundefizienzvirus (HIV) exprimieren, entweder allein oder Kombination mit immunstimulatorischen Proteinen.
Ferner wird ein Verfahren zur Erzeugung einer bedingt letalen NDV-Deletionsmutante bereitgestellt, die als selbstbeschränkender, nicht-übertragbarer (Träger-)Impfstoff verwendet werden kann. Es wurde eine NDV-Deletionsmutante erzeugt, die nicht in der Lage ist, das Matrix (M)-Protein zu exprimieren, welches an der Knospung von NDV an der inneren Zellmembran beteiligt ist. Die Erfindung stellt ein Beispiel eines phänotypisch komplementierten NDV-Stamms bereit, der nicht in der Lage ist, das M-Protein zu exprimieren, welcher aber weiterhin in der Lage ist, Zellen zu infizieren und sich durch Übertragung von Zelle zu Zelle auszubreiten. Das mutierte Virus ist jedoch nicht in der Lage, infektiöse Nachkommen in nicht-komplementierten Zellen zu erzeugen. Dies zeigt dass phänotypisch komplementierte NDV-Deletionsmutanten als sichere, selbstbeschränkende Impfstoffe verwendet werden können, die nicht in der Lage sind, sich in der Umgebung auszubreiten. Ein solcher nicht-übertragbarer Impfstoff vereint den wichtigsten Vorteil von Lebendimpfstoffen, d.h. die Wirksamkeit, mit dem wichtigsten Vorteil eines abgetöteten Impfstoffs, d.h. die Sicherheit.
Die Erfindung stellt Newcastle-Krankheit-Virus oder davon abgeleitete Stämme bereit (beispielsweise durch Passagieren und weitere Kultivierung in embryonierten Eiern oder in geeigneten Zellen), wobei sich dieses von infektiösem Kopie-Virus ableitet, welches durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist.
Es wird beispielsweise NDV bereitgestellt, das auf mindestens eine Weise modifiziert wurde, um infektiöses Kopie-Newcastle-Krankheit-Virus bereitzustellen, das attenuiert ist, bezüglich der Virulenz modifiziert ist, antigenisch modifiziert ist, ein heterologes Antigen exprimiert oder das nicht übertragbar sind, oder Kombinationen dergleichen.
Die Erfindung stellt vorliegend NDV-Impfstoffe bereit, die beispielsweise dadurch charakterisiert sind, dass sie verschiedene Virulenzattribute oder verschiedene antigenische Eigenschaften aufweisen, sei es für die Zwecke als Marker-Impfstoff und/oder für die Expression heterologer Antigene, die von anderen Erregern stammen, sei es in übertragbarer und/oder in nicht-übertragbarer Form.
Solch ein Impfstoff kann ein abgetöteter Impfstoff oder ein Lebendimpfstoff sein. Vorzugsweise ist ein solcher Impfstoff ein Lebendimpfstoff, wobei jedoch abgetötete Impfstoffe, die von der vorliegenden Erfindung bereitgestellt werden, unter solchen Umständen, bei denen ein Lebendimpfstoff nicht oder nur in geringem Maße anwendbar ist, vorteilhaft sind, beispielsweise aufgrund von Handelsbeschränkungen oder aufgrund von anderen Bedingungen, die von krankheitskontrollierenden Behörden eingefordert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein diagnostisches Verfahren bereit, um Antikörper gegen serologisch relevante immundominante Epitope und Marker nachzuweisen, wodurch Verfahren und Mittel bereitgestellt werden, um ein Verfahren zur Kontrolle und/oder zur Ausrottung von NDV und/oder anderer Geflügel-Krankheiten in Geflügel durchzuführen. Die Erfindung stellt neue und wirksame Impfstoffe bereit, die serologisch von Feld-Viren und Impfstoffen älteren Typs unterschieden werden können. Diese neuen Impfstoffe, die als NDV-Marker-Impfstoffe bezeichnet werden, stellen das größtmögliche immunologische Spektrum von antigenisch relevanten NDV-Epitopen bereit, und sie sind durch begleitende diagnostische Verfahren serologisch von Wildtyp-NDV unterscheidbar.
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Unterscheidung von ungeimpften Tieren oder von Tieren, die mit einem erfindungsgemäßen NDV-Impfstoff geimpft wurden, von Tieren, die mit Wildtyp-NDV infiziert sind oder mit einem unmodifizierten mesogenen oder lentogenen NDV-Impfstamm geimpft wurden, bereit, bei dem mindestens eine Probe (wie beispielsweise Serum, Blut, Eier oder Augenflüssigkeit) von dem Tier genommen wird, und in dieser Probe das Vorhandensein von Antikörpern bestimmt wird, die gegen ein immundominantes Epitop oder einen Marker gerichtet sind, welcher von dem Wildtyp oder dem unmodifizierten NDV exprimiert wird, jedoch nicht von einem erfindungsgemäßen Impfstoff.
Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, bei dem die Antikörper gegen das HN- oder F-Protein von NDV gerichtet sind, beispielsweise gegen ein Hybridprotein, wie es im experimentellen Teil dieser Beschreibung beschrieben wird. Die Erfindung stellt beispielsweise ein diagnostisches Verfahren bereit, bei dem das Tier ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Geflügel, vorzugsweise Hühnern.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein schneller und rascher Hämagglutination-Inhibierungstest (HI) verwendet, um zwischen geimpften Tieren und infizierten Tieren zu unterscheiden. Tiere, die mit einem Marker-Impfstoff geimpft wurden, bei dem der komplette globuläre Kopf von HN des NDV gegen den entsprechenden Teil von HN eines anderen Serotyps ersetzt wurde, werden keine Antikörper gegen HN von NDV induzieren, und sie werden aus diesem Grund die Hämagglutination von Erythrozyten durch NDV-Virionen nicht hemmen.
Durch Verwendung von Marker-Impfstoff-Virione in dem HI-Test werden Antikörper gegen das Hybrid-HN-Protein nachgewiesen, und diese können als Maß für die Wirksamkeit der Impfung verwendet werden. Als Alternative wird ein ELISA, der Antikörper gegen das F-Protein von NDV nachweist, für die Messung der Effizienz der Impfung verwendet.
Abgesehen von dem HI-Test kann ein ELISA verwendet werden, um das Vorhandensein von Antikörpern gegen HN von NDV nachzuweisen. Das in einem solchen Test zu verwendende Antigen ist beispielsweise NH von NDV, das durch rekombinante DNA-Verfahren exprimiert wird, oder ein konserviertes Peptid von HN von NDV.
Ein blockierender ELISA kann ebenfalls verwendet werden. In diesem Fall werden ein oder mehrere monoklonale Antikörper gegen konservierte Epitope von HN von NDV verwendet, um zu bestimmen, ob kompetitive Antikörper in den Proben aus geimpften Tieren vorhanden sind. Die ELISA-Tests können in vorteilhafter Weise verwendet werden, wenn der Marker-Impfstoff lediglich ein chimäres NH-Protein enthält, oder wenn einige Epitope von HN von NDV ersetzt werden.
Die Erfindung wird weiter im experimentellen Teil dieser Beschreibung erläutert, ohne dass die Erfindung auf diesen beschränkt wird.
EXPERIMENTELLER TEIL
MATERIAL UND METHODEN
Standardklonierungsverfahren wurden gemäß Sambrook et al. (1989) durchgeführt, soweit es nicht anders angegeben ist. Alle Konstruktionen, die mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) erzeugte DNA-Fragmente umfassen, wurden durch Sequenzanalyse verifiziert. In den nachstehenden Primersequenzen entsprechen die unterstrichenen Nukleotide den NDV-Sequenzen, und die Position innerhalb des NDV-Genoms ist angegeben. Die Nukleotidsequenzen von Restriktionsschnittstellen, die zur Klonierung verwendet wurden, sind in Fettdruck angegeben.
Zellen und Viren
CER-Zellen (Smith et al., 1976) wurden in GMEM/EMEM (1:1) angezüchtet, das 5 % fötales Kälberserum und 2 % einer Antibiotika-Mischung enthielt, welche 1000 U/ml Penicillin, 1000 mg/ml Streptamycin, 20 μg/ml Fungizon, 500 μg/ml Polymixin B und 10 mg/ml Kanamycin enthielt. QT35-Zellen (Moscovici et al., 1977; Cho, 1982) wurden in Medium angezüchtet, das von GibcoBRL/Life. Technologies stammte (Katalognummer 041-91536; geschützte Mischung von Fort Dodge) und mit 5 % FCS und 2 % Antibiotika-Mischung supplementiert war. QM5-Zellen (Antin und Ordahl, 1991) wurden in M199-Medium angezüchtet, das mit 10 % Tryptose-Phosphat-Nährlösung, 10 % FCS und 2 % Antibiotika-Mischung supplementiert war.
Der NDV-Stamm LaSota wurde von der ATCC (ATCC VR-699) erhalten und zweimal in embryonierten Eiern passagiert. Bevor wir mit der Konstruktion und Klonierung von cDNA begannen, wurde das Virus durch drei Runden Plaque-Reinigung auf primären Hühnerembryo-Fibroblasten (CEF) Plaque-gereinigt. Zu diesem Zweck wurde das Virus auf CEF-Zellen titriert, welche in GMEM/EMEM (1:1) kultiviert worden waren, das 5 % fötales Kälberserum, 2 % Antibiotika-Mischung, 5 % Allantoisflüssigkeit, 30 mM MgCl₂, 200 μg/ml DEAE-Dextran (Sigma) und 0,8 % Agar Nobel (Difco) enthielt. Virus aus der dritten Runde Plaque-Reinigung (als Klon E13-1 bezeichnet) wurde in embryonierten Eiern angezüchtet, und 4 Tage nach Inokulation wurde die Allantoisflüssigkeit geerntet und in Aliquots bei -70 °C gelagert. Das rekombinante Geflügelpockenvirus fpEFLT7pol (Britton et al., 1996; nachfolgend als FPV-T7 bezeichnet), welches die T7-RNA-Polymerase exprimierte, war ein Geschenk von Dr. Michael Skinner und wurde auf QT35-Zellen angezüchtet.
Isolierung von viraler RNA
Alle Manipulationen wurden in RNase-freien Glasgegenständen oder Kunststoffgegenständen durchgeführt, und alle Lösungen wurden mit RNase-freiem Wasser hergestellt, das mit 1 % Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandelt und durch Autoklavieren sterilisiert worden war. Virus wurde aus Allantoisflüssigkeit durch Zentrifugation bei 21000 UpM für 70 Minuten in einem SW40-Rotor von Beckman bei 4 °C sedimentiert. Das Pellet wurde in Homogenisierungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,5 % SDS) resuspendiert und mit Proteinase K (200 μg/ml) für 90 Minuten bei 37 °C unter ständigem Schütteln behandelt. Das Lysat wurde zweimal mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1:1) pH 5,4 und einmal mit einem gleichen Volumen Chloroform extrahiert. Die virale RNA wurde durch Zusatz von 0,1 Volumen 3M NaOAc pH 5,3 und 2,5 Volumen 100 % Ethanol aus der wässrigen Phase präzipitiert. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt, einmal mit 70 Ethanol gewaschen, in Wasser resuspendiert und in Aliquots bei -70 °C gelagert.
Reverse Transkription
Virale RNA (1,5 μg) wurde mit 500 ng Primer in einem Volumen von 12 μl gemischt und für 10 Minuten bei 70 °C inkubiert. 4 μl 5 × RT-Puffer (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂; GibcoBRL/Life Technologies), 2 μl 0,1 M DTT und 2 μl 10 mM dNTP's (jeweils 2,5 mM) wurden zugesetzt, und die Mischung wurde für 2 Minuten bei 42 °C inkubiert. Die reverse Transkription wurde in einem finalen Volumen von 20 μl durch Zugabe von 200 Einheiten reverser Transkriptase (Superscript II; GibcoBRL/Life Technologies) gefolgt von einer Inkubation für 60 Minuten bei 42 °C durchgeführt.
Polymerasekettenreaktion (PCR)
Alle PCR-Reaktionen, die verwendet wurden, um das 3'-Ende und das 5'-Ende des NDV-Genoms (siehe unten) zu bestimmen, wurden unter Verwendung einer Taq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer) durchgeführt. Für die Klonierung von einzelnen NDV-Genen oder großen subgenomischen cDNAs wurde entweder die DNA-Polymerase Pwo mit Proofreading-Funktion oder Mischungen aus Taq und Pwo ("Expand High Fidelity"-Kit oder "Expand Long Template"-Kit) gemäß den Anweisungen des Herstellers (Boehringer Mannheim) verwendet. Alle Proben wurden vor dem Start der angegebenen Anzahl von PCR-Zyklen für 2 Minuten bei 94 °C inkubiert. Nach der angegebenen Anzahl von PCR-Zyklen wurden die Proben bei der Elongationstemperatur für mindestens 3 × die Dauer der Elongationszeit des PCR-Zyklus inkubiert. PCR-Fragmente wurden direkt unter Verwendung des "High Pure PCR Product Purification"-Kits (Boehringer Mannheim) oder nach Agarosegelelektrophorese durch Verwendung des "QiaexII"- Extraktionskits (Qiagen) im Wesentlichen nach Angaben des Herstellers aufgereinigt.
Sequenzanalyse
Alle Sequenzen wurden unter Verwendung des "PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing"-Kits (Perkin Elmer) bestimmt. Die Reaktionsmischungen (5 μl) wurden 25 Zyklen einer linearen Amplifikation (10 Sekunden bei 94 °C, 5 Sekunden bei 50 °C und 4 Minuten bei 60 °C) in einem Gene-Amp2400-Thermocycler unterworfen. Anschließend wurden die Reaktionsmischungen mit Ethanol gefällt, einmal mit 70 Ethanol gewaschen, in 15 ml TSR-Puffer (Perkin Elmer) resuspendiert und für 2 Minuten bei 94 °C erhitzt, bevor sie auf ein automatisches Applied Biosystems-AB310-Sequenziergerät geladen wurden.
Die Nukleotidsequenzen der Primer, die verwendet wurden, um das vollständige Genom von NDV-Stamm LaSota zu sequenzieren, wurden entweder ausgehend von veröffentlichten Sequenzen erhalten, oder ausgehend von Sequenzen, die während dieses Sequenzierprojekts erhalten wurden. Die Primer sind in Tabelle 1 gezeigt.
Klonierung und Sequenzierung des 3'-Terminus und des 5'-Terminus des Genoms von NDV-Stamm LaSota
Die Nukleotidsequenz des 3'-Terminus und des 5'-Terminus des NDV-Genoms wurden unter Verwendung der RACE-Methode (rapid amplification of cDNA ends) bestimmt. NDV-RNA wurde in einer reversen Transkriptionsreaktion in einem Endvolumen von 20 μl eingesetzt, unter Verwendung des Primers p360 (5'-GGCGATGTAATCAGCCTAGTGCTT-3'; nt 14756-14779), der von der veröffentlichten Sequenz des L-Gens von NDV (Yusoff et al., 1987) abgeleitet wurde. Die einzelsträngige cDNA (2,5 μl der RT-Mischung) wurde zu 8 pmol des Anker-Primers ALG3 (5'-CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC-3') gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur in 20 μl einer Reaktionsmischung ligiert, die 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 10 μg/ml BSA, 25 PEG, 1 mM HCC, 20 μM ATP und 10 Einheiten T4-RNA-Ligase (New England Biolabs) enthielt, wie es von Tessier et al. (1986) beschrieben wurde. 1 μl der Ligationsreaktion wurde als Matrize in einer PCR-Reaktion unter Verwendung der Primer p375 (5'-CAATGAATTCAAAGGATATTACAGTAACT-3'; nt 14964-14983) und ALG4 (5'-GAAGGATCCAGAATCGATAG-3') verwendet. Der letztgenannte Primer ist komplementär zum Anker-Primer ALG3. Die PCR-Bedingungen (40 Zyklen) waren die Folgenden: 1 Minute bei 94 °C, 1 Minute bei 55 °C und 2 Minuten bei 72 °C. Die PCR-Produkte wurden aufgereinigt und in den T-Vektor pBluescript-II-TSK (Ichihara und Kurosawa, 1993) kloniert. Alternativ dazu wurden die aufgereinigten PCR-Produkte mit Klenow-DNA-Polymerase I behandelt, um glatte Enden zu erzeugen, und sie wurden in die HinCII-Schnittstelle des Plasmids pGEM4Z (Promega) kloniert. Dreizehn unabhängige Klone (8 × pBluescriptII-TSK und 5 × pGEM4Z) wurden sequenziert, um die Nukleotidsequenz des 5'-Endes des Genoms von NDV-Stamm LaSota zu bestimmen. Die Nukleotidsequenz des 3'-Endes wurde durch zwei unabhängige Verfahren bestimmt. In Verfahren I wurde der Primer ALG3 an das 3'-Ende der viralen RNA ligiert, indem eine T4-RNA-Ligase verwendet wurde, wie es von Schütze et al. (1995) beschrieben wurde. Die Reaktionsmischung (Endvolumen von 10 μl) enthielt 2,5 μg NDV-RNA, 100 pmol ALG3, 1 μl 10 × T4-RNA-Ligasepuffer (500 mM Tris-HCl, pH 7,8, 100 mM MgCl₂, 100 mM DTT, 10 mM ATP), 1 μl DMSO, 1 μl 10 μM Hexamin-Kobaltchlorid, 1 ml RNasin (Promega) und 10 Einheiten T4-RNA-Ligase (New England Biolabs). Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert, und 5 μl der Ligationsreaktion wurden als Matrize in einer reversen Transkriptionsreaktion unter Verwendung von ALG4 als Primer verwendet. 1 μl der RT-Reaktion wurde in eine PCR-Reaktion unter Verwendung der Primer ALG4 und p376 (5'-GAGCCTTAAGGAGCTGCTCGTACTGATC-3'; nt 137-164), der von der veröffentlichten Sequenz des 3'-Endes von NDV abgeleitet ist (Ishida et al., 1986), eingesetzt. Die PCR-Bedingungen waren die oben für die 5'-RACE beschriebenen Bedingungen. In Verfahren II wurden das 3'-Ende und 5'-Ende der viralen NDV-RNA miteinander ligiert, wobei eine T4-RNA-Ligase unter denselben Bedingungen, wie sie oben für Verfahren I beschrieben wurden, verwendet wurde. 5 μl der Ligationsmischung wurden als Matrize in einer reversen Transkriptionsreaktion unter Verwendung von Primer p360 verwendet. 1 μl der RT-Reaktion wurde in eine PCR-Reaktion unter Verwendung der Primer p375 und p376 und den oben für die 5'-RACE verwendeten PCR-Bedingungen eingesetzt. Die PCR-Produkte wurden mit Klenow-DNA-Polymerase I behandelt, um glatte Enden zu erzeugen, und sie wurden in die HincII-Schnittstelle des Plasmids pGEM4Z (Promega) kloniert. Zehn unabhängige Klone (4 aus Verfahren I und 6 aus Verfahren II) wurden sequenziert, um die Nukleotidsequenz des 3'-Endes des Genoms von NDV-Stamm LaSota zu bestimmen.
Konstruktion des Transkriptionsvektors
Ein Transkriptionsvektor mit geringer Kopienzahl wurde unter Verwendung des Plasmids pOK12 (Vieira und Messing, 1991) als Ausgangsreplikon konstruiert. Plasmid pOK12 wurde mit PvuII verdaut, und das DNA-Fragment, welches den Replikationsursprung und das Kanamycin-Resistenzgen enthielt, wurde isoliert. Dieses DNA-Fragment wurde mit einem Eco47III-AflII-Fragment (die AflII-Schnittstelle wurde unter Verwendung von Klenow-DNA-Polymerase I geglättet) aus dem Transkriptionsvektor 2.0 (ein Geschenk von Dr. Andrew Ball; Pattnaik et al., 1992) ligiert. Aus dem resultierenden Plasmid wurde ein XbaI-NheI-Fragment deletiert, um so viele einzeln vorkommende Schnittstellen wie möglich zu eliminieren. Das resultierende Plasmid wurde als pOLTV5 bezeichnet (1). Der Transkriptionsvektor pOLTV5 enthält den T7-DNA-abhängigen RNA- Polymerase-Promotor gefolgt von einer einzeln vorkommenden StuI-Schnittstelle und einer einzeln vorkommenden SmaI-Schnittstelle, dem autokatalytischen Ribozym aus dem Hepatitis delta-Virus (HDV) und dem Transkriptions-Terminationssignal aus dem Bakteriophagen T7. DNA-Fragmente, die zwischen die Restriktionsschnittstellen StuI und SmaI kloniert werden, können entweder in vitro oder in vivo unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase transkribiert werden. Nach der Transkription enthält das 5'-Ende der resultierenden Transkripte zwei G-Reste, die von dem Plasmid kodiert werden. Aufgrund der autokatalytischen Wirkung des HDV-Ribozyms entspricht das 3'-Ende des Transkripts dem exakten terminalen Nukleotid des klonierten DNA-Fragments (Pattnaik et al., 1992).
Konstruktion von Minigenom-Plasmiden
Um die Erfordernisse für die Replikation und Transkription von NDV zu untersuchen, wurden Minigenom-Plasmide konstruiert, die die 3'- und die 5'-terminale Region von NDV enthielten, welche ein Reportergen flankierten, das sämtliche NDV-Gene ersetzte (2). DNA-Fragmente, die der 3'- und der 5'-terminalen Region von NDV entsprachen, wurden mittels PCR unter Verwendung einer Pwo-DNA-Polymerase (30 Zyklen; 15 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 50 °C und 30 Sekunden bei 72 °C) erzeugt, wobei Plasmide verwendet wurden, welche das 3'- und das 5'-RACE-Fragmente als Matrizen enthielten (siehe oben).
Die 3'-Region (nt 1-119) wurde erzeugt, indem die Primer 3UIT (5'-ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3'; nt 1-27) und SEAP3 (5'-ATCGATACTGGTCAGCATGCTGGCAGAAGGCTTTCTCG-3'; nt 102-119) verwendet wurden. Die 5'-Region (nt 14973-15186) wurde erzeugt, indem die Primer SEAP5 (5'-GCATGCTGACCAGTATCGATATTACAGTAACTGTGACT-3'; nt 14973-14990) und 5NDV (5'-ACCAAACAAAGATTTGGTGAATGACGA-3'; nt 15158-15186) verwendet wurden. Die beiden DNA-Fragmente wurden in einer überlappenden PCR verbunden (die Überlappung ist in Kursivbuchstaben in den oben aufgeführten Primersequenzen gezeigt), wobei die Primer 3UIT und 5WDV verwendet wurden. Das resultierende DNA-Fragment, welches eine Fusion aus dem 3'-Ende und dem 5'-Ende von NDV ist, die durch 20 Nukleotide voneinander getrennt sind, wurde durch Behandlung mit T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert und in beiden Orientierungen in das Transkriptionsplasmid pOLTV5 kloniert (1), welches mit StuI und SmaI gespalten und mit CIP (calf intestinal phosphatase; Boehringer Mannheim) dephosphoryliert worden war. Schließlich wurde das SEAP-Gen (welches für die sekretierte alkalische Phosphatase kodiert) durch Verdau mit SphI und ClaI aus dem Plasmid pSAEP-Basic (Clontech) gewonnen und zwischen die SphI-Schnittstelle und die ClaI-Schnittstelle zwischen 3'-Ende und 5'-Ende von NDV kloniert. Die resultierenden Plasmide wurden pOLTV535 bzw. pOLTV553 genannt. Die in vivo- oder in vitro-Transkription von Plasmid pOLTV535 unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase führt zur antigenomischen RNA ([+]-RNA), während die Transkription von Plasmid pOLTV553 zur genomischen RNA ([-]-RNA) führt.
Die Plasmide pOLTV535N0 bis -N5 und pOLTV553N0 bis -N5 wurden erzeugt, indem selbst-komplementäre Oligonukleotide in die ClaI-Schnittstelle eingesetzt wurden, die zwischen dem SEAP-Gen und dem 5'-Ende von NDV in pOLTV535 bzw. pOLTV553 lokalisiert war (siehe 2). Die verwendeten Oligonukleotide waren: N0, 5'-CGCGAGCTCG-3'; N1, 5'-CGCGAGSCTCG-3'; N2, 5'-CGCGAGCGCTCG-3'; N3, 5'-CGCGAGCWGCTCG-3'; N4, 5'-CGCGAGCATGCTCG-3'; N5, 5'-CGCGAGCASTGCTCG-3' (W = A oder T; S = C oder G).
Modifikation des T7-Promotors in den Plasmiden pOLTV535 und pOLTV553
Um in vitro oder in vivo Transkripte zu erzeugen, die das authentische 5'- terminale Ende und das authentische 3'-terminale Ende von NDV enthielten, wurde der T7-Promotor in den Plasmiden pOLTV535 und pOLTV553 so modifiziert, dass die Transkription am ersten Nukleotid des 3'-terminalen Endes oder des 5'-terminalen Endes von NDV startet. Es wurden Primer erzeugt, die das Folgende enthielten: 1) eine BglI-Restriktionsschnittstelle, 2) die Sequenz des T7-Promotors (in Kursivbuchstaben dargestellt), die so modifiziert wurde, dass die zwei G-Reste am Ende des T7-Promotors gegen einen A-Rest ersetzt wurden, und 3) das 3'-Ende (nt 1-21) oder das 5'-Ende (nt 15164-15186) von NDV. Es wurden die Primer BGL3F2 (5'-GATATGGCCATTCAGGCTTAATACGACTCACTATAACCAAACAGAGAATCCGTGAG-3') und SEAP3 (siehe oben) verwendet, um ein DNA-Fragment zu erzeugen, das den modifizierten T7-Promotor enthielt, sowie das gesamte 3'-Ende von NDV bis zum Start des SEAP-Gens in pOLTV535. In ähnlicher Weise wurde ein DNA-Fragment erzeugt, das den modifizierten T7-Promotor und das gesamte 5'-Ende von NDV bis zum Ende des SEAP-Gens in pOLTV553 enthielt, indem die Primer BGL5F2 (5'-GATATGGCCATTCAGGCTTAATACGACTCACTATAACCAAACAAAGATTTGGTGAATG-3') und SEAP5 verwendet wurden. Die resultierenden Fragmente wurden mit BglI und SphI (3'-Ende) bzw. mit BglI und ClaI (5'-Ende) verdaut und dazu verwendet, das BglI-SphI-Fragment in pOLTV535 bzw. das BglI-ClaI-Fragment in pOLTV553 zu ersetzen. Die resultierenden Plasmide wurden als pOLTV735 bzw. pOLTV753 bezeichnet. Die Plasmide pOLTV735N3 und pOLTV753N3 wurden erzeugt, indem ein selbst-komplementäres Oligonukleotid (5'-CGCGAGCWGCTCG-3'; W = A oder T) in die ClaI-Schnittstelle eingesetzt wurde, die in pOLTV735 bzw. pOLTV753 zwischen dem SEAP-Gen und dem 5'-Ende von NDV lokalisiert ist.
Konstruktion von SEAP-Reporterplasmiden
Das Plasmid pCIneoSEAP wurde konstruiert, indem ein XhoI-ClaI-Fragment (die ClaI-Schnittstelle wurde unter Verwendung von Klenow-DNA-Polymerase I geglättet), welches das SEAP-Gen aus dem Plasmid pSEAP-Basic (Contech) enthielt, zwischen die XhoI-Schnittstelle und die SmaI-Schnittstelle des eukaryontischen Expressionsvektors pCIneo (Promega) kloniert wurde. Das letztgenannte Plasmid enthielt den Promotor des humanen Cytomegalievirus (hCMV) und darüber hinaus den Bakteriophagen-T7-Promotor. Um die SEAP-Expression durch Transkripte, die ausschließlich vom T7-Promotor erzeugt werden, zu untersuchen und zu quantifizieren, wurde ein weiteres Plasmid konstruiert, dem der hCMV-Promotor fehlte. Zu diesem Zweck wurde der hCMV-Promotor aus pCIneo durch partiellen Verdau mit HindIII gefolgt von einem kompletten Verdau mit BglII deletiert. Das DNA-Fragment (nt 756-5469 gemäß der Nummerierung von Clontech), aus dem der hCMV-Promotor deletiert worden war, wurde isoliert, zur Erzeugung glatter Enden mit T4-DNA-Polymerase behandelt, und unter Verwendung der T4-DNA-Ligase rezirkularisiert. Das resultierende Plasmid wurde pCIneoD genannt. Schließlich wurde das SEAP-Gen aus pSEAP-Basic als ein MluI-AccI-Fragment gewonnen und in pCIneoD zwischen die Schnittstellen MluI und ClaI kloniert. Das resultierende Plasmid wurde als pCIneoD SEAP bezeichnet.
Transfektionen
Die Zellen wurden in Kulturschalen mit 24 Vertiefungen ausgesät, über Nacht auf eine Konfluenz von 60 bis 80 angezüchtet und bei einer m.o.i. von 1 mit FPV-T7 für 1 Stunde bei 37 °C infiziert. Die Zellen wurden mit 0,5 μg Minigenom-Plasmid-DNA transfiziert, wobei 3 μl LipofectAMIN^TM und OptiMem. im Wesentlichen wie von den Anbietern (GibcoBRL/Life Technologies) beschrieben verwendet wurden. Nach einer Inkubation von 4 Stunden (CER-Zellen) oder von 16 Stunden (QM5-Zellen) bei 37 °C wurden die Zellen entweder mit NDV (Niederländisches Vi rulenz-Isolat Nr. 152608; 200 μl pro Vertiefung) für 1 Stunde bei einer m.o.i. von 5 infiziert, oder sie wurden nicht infiziert. Das Inoculum wurde verdampft und durch 1 ml Komplettmedium ersetzt, und die Zellen wurden weiter bei 37 °C inkubiert. Für die Co-Transfektionen wurden Zellen in Kulturschalen mit 6 Vertiefungen angezüchtet und wie oben beschrieben mit FPV-T7 infiziert. Die Zellen wurden mit 0,25 μg Minigenom-Plasmid-DNA, 0,4 μg pCIneoNP, 0,2 μg pCIneoP und 0,2 μg pCIneoL(c) oder mit pCIneo co-transfiziert, wobei entweder 8 μl LipofectAMIN oder 9 μl FuGene 6 (Boehringer Mannheim) verwendet wurden. Um infektiöses Virus zu erzeugen, wurde das Minigenom-Plasmid durch ein Transkriptionsplasmid ersetzt, welches die vollständige cDNA von NDV enthielt.
Quantifizierung der SEAP-Aktivität
Die Menge von SEAP, die in das Medium der transfizierten Zellen ausgeschieden wurde, wurde in Einwegplatten mit 96 Vertiefungen gemessen, wobei das Phosphat-Light^TM-Kit für den Chemilumineszenz-Reporter-Assay auf sekretierte alkalische Phosphatase im Wesentlichen wie vom Anbieter (Tropix) beschrieben verwendet wurde. Die Chemilumineszenz wurde unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers (Wallac 1450 Microbeta PLUS) quantifiziert.
Klonierung und Sequenzierung von cDNAs, die das gesamte Genom von NDV-Stamm LaSota umfassen
Um das gesamte Genom des NDV-Stamms LaSota zu klonieren und zu sequenzieren, wurden durch RT-PCT große subgenomische cDNA-Klone erzeugt und in pGEM-T kloniert. Die Synthese des ersten cDNA-Strangs (first strand cDNA synthesis) wurde unter Verwendung des Primers 3UIT wie oben beschrieben durchgeführt, und 1 μl der RT-Reaktion wurde in einer PCR-Reaktion verwendet, wobei das "Expand Long Template"-PCR-Kit (Boehringer Mannheim) eingesetzt wurde. Die PCR bestand aus 5 Zyklen von 10 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 58 °C und 6 Minuten bei 68 °C, gefolgt von 10 Zyklen von 10 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 58 °C und 6 Minuten bei 68 °C, wobei die Elongationszeit bei 68 °C um 20 Sekunden pro Zyklus erhöht wurde. Die PCR-Fragmente wurden in pGEM-T kloniert, wobei das gGEM-T-Klonierungskit im Wesentlichen wie vom Anbieter (Promega) beschrieben verwendet wurde. Ligationsmischungen wurden in E. coli-Stamm SURE II (Stratagene) transformiert. Zwei unabhängige RT-PCR-Reaktionen (A und B) wurden durchgeführt, und jede führte zu einer ähnlichen Gruppe von cDNA-Klonen. Die Nukleotidsequenz der subgenomischen cDNA-Klone wurde unter Verwendung von NDV-spezifischen Primern (Tabelle 1), sowie von Primern, die das Insert flankieren, bestimmt. Nach Vergleich der Nukleotidsequenz der Klon-Serien A und B wurden verbleibende Unsicherheiten durch Sequenzierung der relevanten Regionen einer dritten unabhängigen Serie von cDNAs (C-Serie) beseitigt. Die Nukleotidsequenz des NDV-Stamms LaSota ist in 3 gezeigt.
Konstruktion eines genomischen NDV-cDNA-Klons vollständiger Länge
Die NDV-cDNA vollständiger Länge wurde im Transkriptionsplasmid pOLTV5 unter Verwendung von pOLTV535 als Ausgangsplasmid zusammengesetzt. Die DNA-Fragmente wurden an Überlappungen durch Verwendung üblicher Restriktionsenzyme zusammengefügt, wie es in 4B gezeigt ist. In einer Serie von Klonierungsschritten wurde ein Plasmid (als p535-DI bezeichnet) konstruiert, das die Nukleotide 1-3521 und 12355-15186 enthielt, die durch eine ClaI-Schnittstelle getrennt waren, welche durch Verbinden der ClaI-Schnittstellen an den Positionen 3521 und 12355 erzeugt wurde. In einer anderen Serie von Klonierungsschritten wurde ein Plasmid (als pGEM-B bezeichnet) konstruiert, welches einen Teil des NDV-Genoms enthielt, einschließ lich der Nukleotide 3521-12355 (ClaI-Fragment). Um die Klonierung zu ermöglichen, wurde das letztgenannte ClaI-Fragment mit dem Gen für die Chloramphenicol-Resistenz (Cm) aus dem Plasmid pACYC184 (Chang und Cohen, 1978) versehen. Zu diesem Zweck wurde das Cm-Gen aus pACYC184 mittels PCR unter Verwendung der Primer CAT-F (5'-GCGTACGTCTAGACTGGTGTCCCTGTTGATACCGG-3') und CAT-R (5'-GCTCTAGACGTACGACCCTGCCCTGAACCGACG-3') gewonnen. Die PCR wurde mit Pwo-DNA-Polymerase durchgeführt und bestand aus 30 Zyklen von 30 Sekunden bei 94 °C, 45 Sekunden bei 60 °C und 60 Sekunden bei 72 °C. Das resultierende PCR-Fragment wurde mit BsiWI verdaut und in die einzeln vorkommende BsiWI-Schnittstelle von pGEM-B kloniert, was zu pGEM-B(CAT) führte. Das ClaI-Fragment von pGEM-B(CAT) wurde in die einzeln vorkommende ClaI-Schnittstelle von p535-DI kloniert, was zu pNDFL(CAT) führte. Schließlich wurde das Cm-Gen aus diesem Plasmid durch Verdau mit BsiWI entfernt, gefolgt von der Religation und Transformation des E. coli-Stamms DH5a. Das resultierende Plasmid wurde pNDFL+ genannt, und es enthielt die gesamte cDNA-Sequenz von NDV, welche im Transkriptionsplasmid pOLTV5 zwischen dem T7-Promotor und dem HDV-Ribozym kloniert war.
Klonierung und Expression von einzelnen NDV-Genen.
DNA-Fragmente, die jedes der Gene von NDV-LaSota enthielten, wurden durch RT-PCR erzeugt und in pCIneo kloniert. Nach der Klonierung wurden alle Fragmente unter Verwendung von Primern sequenziert, welche die Inserts flankieren, sowie durch Gen-spezifische Primer. NP-Gen: Der Primer 386 (5'-GAGCAATCGAAGTCGTACGGGTAGAAGGTG-3'; nt 40-69) wurde für die reverse Transkription verwendet. Die Primer 365 (5'-GTGTGAATTCCGAGTGCGAGCCCGAAG-3'; nt 77-94) und 892 (5'-TTGCATGCCTGCAGGTCAGTACCCCCAGTC-3; nt 1577-1593) wurden für die PCR verwendet, wobei eine Pwo-DNA-Polymerase eingesetzt wurde. Das folgende PCR-Profil (30 Zyklen) wurde verwendet; 30 Sekunden bei 95 °C, 40 Sekunden bei 65 °C und 45 Sekunden bei 72 °C. Das resultierende DNA-Fragment wurde mit EcoRI verdaut und zwischen die EcoRI-Schnittstelle und die SmaI-Schnittstelle in pCIneo kloniert. Die Expression von NP wurde in einem Immunperoxidase-Monolager-Assay (IPMA) wie von Peeters et al., (1992) beschrieben verifiziert, wobei der monoklonaler Antikörper 38 (Russell et al., 1983) verwendet wurde. P-Gen: Der Primer pRTl (5'-CAAAGAATTCAGAAAAAAGTACGGGTAGAA-3'; nt 1794-1814) wurde für die reverse Transkription verwendet. Primer pRTl und p2 (5'-GCAGTCTAGATTAGCCATTCACTGCAAGGCGC-3'; nt 3053-3071) wurden für die PCR verwendet, wobei eine Pwo-DNA-Polymerase eingesetzt wurde. Das folgende PCR-Profil (30 Zyklen) wurde verwendet; 30 Sekunden bei 95 °C, 40 Sekunden bei 65 °C und 60 Sekunden bei 72 °C. Das resultierende DNA-Fragment wurde mit EcoRI und XbaI verdaut und zwischen die EcoRI-Schnittstelle und die XbaI-Schnittstelle in pCIneo kloniert. Die Expression von P wurde in einem IPMA unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 688 (Russell et al., 1983) verifiziert.

M-Gen: Der Primer 3UIT (5'-ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3'; nt 1-27) wurde für die reverse Transkription verwendet. Die Primer NDV5M (5'-GGGTGCTAGCGGAGTGCCCCAATTGTGCCAA-3'; nt 3268-3288) und NDV3M (5'-TCTCCCCGGGGCAGCTTATTTCTTAAAAGGAT-3'; nt 4368-4389) wurden für die PCR verwendet, wobei das "Expand High Fidelity"-Kit eingesetzt wurde. Die PCR bestand aus 10 Zyklen von 15 Sekunden bei 95 °C, 30 Sekunden bei 55 °C und 2 Minuten bei 68 °C, gefolgt von 15 Zyklen, bei denen die Elongationszeit bei 68 °C um 20 Sekunden pro Zyklus erhöht wurde. Das resultierende DNA-Fragment wurde zur Erzeugung glatter Enden mit T4-DNA-Polymerase behandelt, mit NheI verdaut und zwischen die NheI-Schnittstelle und die SmaI-Schnittstelle in pCIneo kloniert. Die Expression des M-Proteins wurde in einem IPMA unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 424 (Russell et al., 1983) verifiziert.
F-Gen: Der Primer 3UIT (siehe oben) wurde für die reverse Transkription verwendet. Die Primer NDV5F (5'-ACGGGCTAGCGATTCTGGATCCCGGTTGG-3'; nt 4508-4526) und NDV3F (5'-ACTACCCGGGAAACCTTCGTTCCTCAT-3'; nt 6212-31) wurden für die PCR verwendet, wobei das "Expand High Fidelity"-Kit unter Verwendung der oben für das M-Gen beschriebenen Bedingungen eingesetzt wurde. Das resultierende DNA-Fragment wurde zur Erzeugung glatter Enden mit T4-DNA-Polymerase behandelt, mit NheI verdaut und zwischen die NheI-Schnittstelle und die SmaI-Schnittstelle in pCIneo kloniert. Die Expression des F-Proteins wurde in einem IPMA unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 8E12A8C3 (ID-DLO, Abteilung für Vogel-Virologie) verifiziert.
HN-Gen: Der Primer 3UIT wurde für die reverse Transkription verwendet. Für die PCR wurden die Primer NDV5HN (5'-GTAGGCTAGCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3'; nt 6335-6354) und NDV3HN (5'-CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG-3'; nt 8205-8227) verwendet, wobei das "Expand High Fidelity"-Kit unter Verwendung der oben für das M-Gen beschriebenen Bedingungen eingesetzt wurde. Das resultierende DNA-Fragment wurde zur Erzeugung glatter Enden mit T4-DNA-Polymerase behandelt, und es wurde nach Verdau mit XmaI zwischen die geglättete (Klenow-DNA-Polymerase) NheI-Schnittstelle und die XmaI-Schnittstelle in pCIneo kloniert. Die Expression des HN-Proteins wurde in einem IPMA unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 86 (Russell et al., 1983) verifiziert.
L-Gen: Das L-Gen wurde ausgehend von dem cDNA-Klon pGEM-L7a (4A) durch Verdau mit SacII und Sall gewonnen. Vor dem Verdau mit SalI wurde die SacII-Schnittstelle durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase geglättet. Das resultierende Fragment wurde zwischen die geglättete (Klenow-DNA-Polymerase) NheI-Schnittstelle und die SalI-Schnittstelle in pCIneo kloniert. Die 5'-untranslatierte Region zwischen dem T7-Promotor und dem ATG-Startkodon des L-Gens enthielt zwei ATG-Kodons außerhalb des Leserahmens, welche die korrekte Expression des L-Proteins stören könnten. Daher wurde ein neues Plasmid konstruiert, dem das erste ATG fehlte, und in dem das zweite ATG mittels PCR-Mutagenese gegen AAG ausgetauscht wurde, wie es nachfolgend beschrieben ist. Die Primer 5LE(E) 5'-CAATGGAATTCAAGGCAAAACAGCTCAAGGTAAATAATACGGG-3; nt 8332-8374) und 3LE(B) 5'-GTGAATCTAGAATGCCGGATCCGTACGAATGC-3; nt 8847-8870) wurden in einer PCR-Reaktion verwendet, wobei das Plasmid pGEM-L7a (4) als Matrize eingesetzt wurde. Die PCR wurde unter Verwendung einer Pwo-DNA-Polymerase durchgeführt und bestand aus 30 Zyklen von 30 Sekunden bei 94 °C, 45 Sekunden bei 60 °C und 60 Sekunden bei 72 °C. Das resultierende DNA-Fragment wurde mit EcoRI und XbaI verdaut und zwischen die EcoRI-Schnittstelle und die XbaI-Schnittstelle in pCIneo kloniert, wodurch das Plasmid pCIneoL(N) erzeugt wurde. Anschließend wurde das BsiWI-SalI-Fragment aus pGEM-L7a, das den verbleibenden Teil des L-Gens (nt 8852-15046) enthielt, zwischen die BsiWI-Schnittstelle und die SalI-Schnittstelle in pCIneoL(N) kloniert, wodurch das Plasmid pCIneoL(c) erzeugt wurde. Da Antikörper gegen das L-Protein nicht verfügbar sind, konnte die Expression von L nicht immunchemisch geprüft werden.

Einführung eines genetischen Anhangs in das F-Gen.
Um zweifelsfrei zu zeigen, dass ausgehend von klonierter cDNA vollständiger Länge infektiöses Virus erzeugt werden kann, wurde mittels PCR-Mutagenese ein genetischer Anhang (tag) in das F-Gen eingebracht. Zu diesem Zweck wurde das F-Gen unter Verwendung zwei überlappender PCR-Fragmente kloniert. Das erste PCR-Fragment wurde unter Verwendung der Primer NDV5F (siehe oben) und F5R (5'-AAAGCGCCGCTGTCTCCTCCCTCCAGATGTAGTCAC-3; nt 4859-4894) erzeugt. Die fett dargestellten Reste sind Austausche, die in den Primer eingebracht wurden, um die Aminosäuresequenz der proteolytischen Spaltstelle zwischen F1 und F2 von der des NDV-Stamms LaSota (GGRQGR | L) zu der Konsensus-Spaltstelle für virulente NDV-Stämme (GRRQRR | F) zu verändern. Das zweite PCR-Fragment wurde unter Verwendung der Primer F3F (5'-GGAGGAGACAGCGGCGCTTTATAGGCGCCATTATTGG-3'; nt 4875-4911) und IV09 (5'-CTCTGTCGACACAGAOTACCAGAACTTTCAC-3'; nt 6246-6266) erzeugt. Die PCR wurde mit einer Pwo-DNA-Polymerase durchgeführt und bestand aus 25 Zyklen von 15 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 55 °C und 2 Minuten bei 72 °C. Die zwei überlappenden PCR-Fragmente (die Überlappung ist in der Primersequenz in Kursivbuchstaben dargestellt) wurden in einer zweiten PCR unter Verwendung der Primer NDV5F und IV09 zusammengefügt, wobei die gleichen PCR-Bedingungen angelegt wurden. Das resultierende Fragment, das den Gesamt-ORF des F-Gens enthielt und für eine virulente Konsensus-Spaltstelle kodierte, wurde mit NheI und SalI verdaut und zwischen die NheI-Schnittstelle und die SalI-Schnittstelle in pCIneo kloniert, was zu pCIneoF^wt führte. Das StuI-NotI-Fragment (nt 4646-4952) von pCIneoF^wt wurde verwendet, um das entsprechende Fragment in Plasmid p535-S zu ersetzen, welches konstruiert worden war, indem das ClaI-ScaI (nt 3521-10311) von pGEM-B in p535-DI zwischen die ClaI-Schnittstelle und die ScaI-Schnittstelle eingebracht worden war (siehe 4C). Das resultierende Plasmid wurde als p535-S [F^wtc] bezeichnet. Ein PCR-Fragment, welches das Cm-Resistenzgen aus pACYC184 (siehe oben) enthielt, wurde als XbaI-Fragment in die einzeln vorkommende XbaI-Schnittstelle (Position 6172 in der NDV-Sequenz) von Plasmid p535-S[F^wtc] kloniert, was zu dem Plasmid p535-S[F^wtc]Cm führte. Anschließend wurde das mit Cm ausgestattete (Cm-tagged) ApaI-SpeI-Fragment (nt 2285-8094) dieses Plasmids dazu verwendet, das entsprechende Fragment des cDNA-Klons pNDFL+ vollständiger Länge zu ersetzen. Schließlich wurde das Cm-Gen aus diesem Plasmid durch Verdau mit XbaI entfernt, gefolgt von einer Rezirkularisierung unter Verwendung von T4-DNA-Ligase. Das resultierende Plasmid, welches die genetisch mit Anhang ausge stattete (tagged) NDV-cDNA vollständiger Länge enthielt, wurde als pNDFL+[F^wt] bezeichnet.
Erzeugung von stabil transformierten Zelllinien, die einzelne NDV-Gene exprimieren
Die Plasmide pCIneoNP, pCIneoP, pCIneoM, pCIneoF, pCIneoF^wt und pCIneoHN wurden für die Erzeugung von stabil transformierten Zelllinien verwendet, die diese Proteine einzeln exprimieren. Am Tag vor der Transfektion wurden CER-Zellen in Kulturschalen von 6 cm ausgesät und über Nacht inkubiert, um eine Konfluenz von 60 bis 80 zu erreichen. Die Zellen wurden mit 2 μg Plasmid-DNA unter Verwendung von 12 μl LipofectMmin und OptiMem transfiziert, wie es im Wesentlichen vom Anbieter (GibcoBRL/Life Technologies) beschrieben wurde. Nach 48 Stunden wurden die Zellen mit Trypsin behandelt, und es wurden Verdünnungen mit Medium in Kulturschalen von 10 cm ausgesät, die 500 μg/ml G418 (Boehringer Mannheim) enthielten. Alle 3 Tage wurde das Medium gegen frisches Medium ersetzt, das (in Stufen von 100 μg/ml) ansteigende Mengen von G418 enthielt, bis eine Konzentration von 800 μg/ml erreicht wurde. Die Zellen wurden im Medium gehalten, das 800 μg/ml G418 enthielt, und 3 Wochen nach der Transfektion wurden einzelne Kolonien ausgewählt und auf Kulturschalen mit 96 Vertiefungen überführt. Die klonierte Zelllinie wurde im Hinblick auf die Expression des entsprechenden NDV-Gens untersucht, indem ein IPMA wie oben beschrieben für Untersuchungen zur transienten Expression verwendet wurde. Die Zelllinien, die NP, P, M oder F konstitutiv exprimierten konnten identifiziert und isoliert werden. Wir waren jedoch nicht in der Lage, Zelllinien herzustellen, die das HN-Protein exprimieren. Möglicherweise ist die konstitutive Expression von HN für die Zellen toxisch.
Erzeugung von stabil transformierten Zelllinien, welche die T7-RNA-Polymerase exprimieren.
Das für die T7-RNA-Polymerase kodierende Gen wurde durch Verdau mit EcoRI und SalI aus dem Plasmid pRT7NT (René van Gennip, ID-DLO, Abteilung für Säugetier-Virologie) gewonnen. Das resultierende Fragment enthält das T7-RNA-Polymerase-Gen, das hinter dem Baculovirus-p10-Promotor lokalisiert ist. Das DNA-Fragment wurde zwischen die EcoRI-Schnittstelle und die SalI-Schnittstelle in das Plasmid pCIneo0 kloniert, wodurch das Plasmid pCIneo107 erzeugt wurde. Dem Plasmid pCIneo0 fehlt der T7-Promotor, und es wurde ausgehend von pCIneo durch Verdau mit NheI, gefolgt von einem partiellen Verdau mit ScaI, Auffüllen der klebrigen Enden mit Klenow-DNA-Polymerase und Rezirkularisierung unter Verwendung einer T4-DNA-Ligase gewonnen. Die Baculovirus-Sequenzen wurden durch Verdau mit EcoRI und PacI, gefolgt von einer Behandlung mit T4-DNA-Polymerase zur Erzeugung glatter Enden und Rezirkularisierung aus pCIneo107 entfernt. Das resultierende Plasmid wurde pCIneo007 genannt. Die Expression der T7-RNA-Polymerase wurde durch Co-Transfektion von Zellen mit pCIneo007 und pPRh01 verifiziert. Das letztgenannte Plasmid enthält das E2-Protein des klassischen Schweinefieber-Virus, welches hinter einen T7-Promotor kloniert ist, sowie eine interne Ribosomeneintrittsstelle (René van Gennip, persönliche Mitteilung). Die Expression von E2 wurde in einem IPMA unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers V4 (Wensvoort et al., 1986) bestimmt. Stabil transformierte CER-Zelllinien, welche die T7-RNA-Polymerase exprimierten, wurden wie oben beschrieben erzeugt und isoliert, mit der Ausnahme, dass Kulturschalen von 10 cm verwendet wurden, und die Zellen mit 5 μg pCIneo007-DNA und 25 μl LipofectAmin transfiziert wurden. Um einzelne Zelllinien auf die Expression der T7-RNA-Polymerase zu untersuchen, wurden diese mit dem Plasmid pPRh01 transfiziert, und die Expression von E2 (die von der von T7-RNA-Polymerase abhängt) wurde in einem IPMA unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers V4 untersucht. Es wurden einige Zelllinien identifiziert, welche die T7-RNA-Polymerase exprimierten. Eine Zelllinie, die als CER-C9 bezeichnet wurde, wurde für nachfolgende Experimente verwendet.
Klonierung und Expression von HN-Genen und Hybrid-HN-Genen
Der Primer 3UIT wurde dazu verwendet, einzelsträngige cDNA. von NDV und von Vogel-Paramyxovirus Serotyp 2 und 4 (APMV2 und APMV4) wie oben beschrieben zu synthetisieren. Alle nachfolgenden PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von 25 Zyklen von 15 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 55 °C und 2 Minuten bei 72 °C durchgeführt.
Die gesamte kodierende Region des HN-Gens von APMV2 wurde durch eine PCR erhalten, bei der die Primer IV03 (5'-GGGGGAATTCCCCATTCAATGAAGGGTCTAC-3') und IV05 (5'-GATCCCCGGGTCTTAAACCAGGCTTCGCAATG-3') verwendet wurden, welche ausgehend von der Sequenz des HN-Gens von APMV2 (Gen-Bank Zugriffsnummer D14030) abgeleitet wurden. Die gesamte kodierende Region des HN-Gens von APMV4 wurde durch eine PCR erhalten, bei der die Primer IV06 (5'-GGGGGAATTCTGGTAGGGTGGGGAAGGTAGC-3') und IV08 (5'-ATTGCCCGGGGGGTAACTAATCAGGATCTCAG-3') verwendet wurden, welche ausgehend von der Sequenz des HN-Gens von APMV4 (Gen-Bank Zugriffsnummer D14031) abgeleitet wurde. Die resultierenden PCR-Fragmente wurden (entweder direkt oder nach Subklonierung in pGEM-T) mit EcoRI und XmaI verdaut und zwischen die EcoRI-Schnittstelle und die XmaI-Schnittstelle in pCIneo kloniert. Die resultierenden Plasmide wurden als pCIneoHN2 bzw. pCIneoHN4 bezeichnet.
Hybride zwischen dem HN-Gen des NDV-Stamms LaSota und dem HN-Genen von APMV2 und APMV4 wurden mittels überlappender PCR wie folgt konstruiert. Der N-terminale Teil (aa 1-141) des HN-Gens des NDV-Stamms LaSota wurde mit einer Pwo-DNA-Polymerase unter Verwendung der Primer IV01B (5'-GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3'; nt 6325-6354) und IV10 (5'-AATGAGTTCTTTGCCTATCCCCCC-3'; nt 6811-6834) amplifiziert. Der C-terminale Teil des HN-Gens von APMV2 (aa 142-580) wurde mit einer Pwo-DNA-Polymerase unter Verwendung der Primer IV11B (5'-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTCAAGGAGATGCATCTGCAGGC-3') und IV05 amplifiziert. Die resultierenden PCR-Fragmente wurden in einer überlappenden PCR (Überlappung in Kursivbuchstaben dargestellt) unter Verwendung der Primer IV01B und IV05 sowie unter Verwendung der "Expand High Fidelity"-Enzymmischung zusammengefügt. Das resultierende PCR-Fragment wurde (entweder direkt oder nach Subklonierung in pGEM-T) mit EcoRI und XmaI verdaut und zwischen die EcoRI-Schnittstelle und die XmaI-Schnittstelle in pCIneo kloniert. Das resultierende Plasmid, das ein Hybrid-HN-Gen enthielt und aus den aa 1-141 von NDV und den aa 142-580 von APMV2 bestand, wurde als pCIneoHN1/2¹⁴¹ bezeichnet.
Der C-terminale Teil des HN-Gens von APMV4 (aa 143-569) wurde unter Verwendung der Primer IV14B (5'-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGATGATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3') und IV08 amplifiziert. Dieses Fragment wurde mit dem N-terminalen Teil des HN-Gens von NDV (siehe oben) in einer überlappenden PCR unter Verwendung der Primer IV01B und IV08 zusammengefügt. Das resultierende PCR-Fragment wurde (entweder direkt oder nach Subklonierung in pGEM-T) mit EcoRI und XmaI verdaut und zwischen die EcoRI-Schnittstelle und die XmaI-Schnittstelle in pCIneo kloniert. Das resultierende Plasmid, das ein Hybrid-HN-Gen enthielt, welches aus den aa 1-141 von NDV und aa 143-569 von APMV4 bestand, wurde pCIneoHN1/4¹⁴¹ genannt.
In Analogie zu den oben beschriebenen Konstruktionen wurden Hybrid-HN-Gene konstruiert, die aus den aa 1-143 von NDV und den aa 144-580 von APMV2, oder aus den aa 1-143 von NDV und den aa 145-569 von APMV4 bestanden. Für diese Konstruktionen wurden PCR-Fragmente unter Verwendung der nachfolgenden Primerpaare erhalten; NDV aa 1-143, Primer IV01B und IV13 (5'-ATCTACAATGAGTTCTTTGCCTATC-3'; nt 6816-6840); APMV2 aa 144-580, Primer IV14B (5'-GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGATGATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3') und IV05; APMV4 aa 145-569, Primer IV15B (5'GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGATCAAACAGCTGACTACACAGCAG-3') und IV08. Die PCR-Fragmente wurden (entweder direkt oder nach Subklonierung in pGEM-T) mit EcoRI und XmaI verdaut und zwischen die EcoRI-Schnittstelle und die XmaI-Schnittstelle in pCIneo kloniert. Die resultierenden Plasmide wurden pCIneo1/2¹⁴³ bzw. pCIneo1/4¹⁴³ genannt. Um die Expression der HN-Proteine zu untersuchen, wurden CER-Zellen oder die QM5-Zellen mit FPV-T7 für 1 Stunde bei einer m.o.i. von 1 infiziert, mit den Plasmiden pCIneoHN, pCIneoHN2, pCIneoHN4, CIneoHN1/2¹⁴¹, CIneoHN1/2¹⁴³, CIneoHN1/4¹⁴³ und pCIneoHN1/4¹⁴³ transfiziert, und 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Monolayer mit einer 1%igen Suspension aus Hühner-Erythrozyten in PBS für 45 Minuten bei Raumtemperatur überschichtet. Anschließend wurden die Monolayer sorgfältig dreimal mit PBS gewaschen, und die Adhäsion der Erythrozyten an die transfizierten Zellen wurde mikroskopisch untersucht. Um die Induktion der Zellfusion nach Co-Expression des HN-Proteins und des F-Proteins zu untersuchen, wurden CER-Zellen oder QM5-Zellen mit pCIneoF^wt gemeinsam mit entweder pCIneo-HN1, pCneoHN2, pCIneoHN4, pCIneoHN1/2¹⁴¹, pCIneoHN1/4¹⁴¹, pCIneoHN1/2¹⁴³ oder pCIneoHN1/4¹⁴³ co-transfiziert. Nach Inkubation für 2 bis 3 Tage wurden die Monolayer mit PBS gewaschen, für 15 Minuten mit Giemsa-Lösung (1:30-Verdünnung in Wasser) gewaschen und mikroskopisch untersucht.
Klonierung von Hybrid-HN-Genen in genomische NDV-cDNA vollständiger Länge
Ein synthetisches Verbindungsmolekül (linker), das als HN12 bezeichnet wurde, wurde zwischen die NotI-Schnittstelle und die SpeI-Schnittstelle von pGEM-T (Promega) eingesetzt, wobei die Oligonukleotide HN12a (5'-GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGACTTA-3') und HN12b (5'-CTAGTAAGTCGTTAACTCTAGAATATGC-3') verwendet wurden. Ein synthetisches Verbindungsmolekül, das als HN14 bezeichnet wurde, wurde zwischen die NotI-Schnittstelle und die SpeI-Schnittstelle von pGEM-T eingesetzt, wobei die Oligonukleotide HN14a (5'-GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGA-3') und HN14b (5'-CTAGTCGTTAACTCTAGAATATGC-3') verwendet wurden. Die resultierenden Plasmide wurden als pGEM-HN12 bzw. pGEM-HN14 bezeichnet. Diese Plasmide wurden mit NotI und XbaI verdaut und dazu verwendet, das NotI-SpeI-Fragment (nt 3390-7488) aus dem Plasmid p535-S[F^wtc]Cm zu klonieren. Die resultierenden Plasmide wurden pGEM-HN1/2NS bzw. pGEM-HN1/4NS bezeichnet. Die HN-Gene dieser Plasmide wurden durch die Hybrid-HN-Gene aus den Plasmiden pCIneoHN1/2¹⁴³ bzw. pCIneoHN1/4¹⁴³ ersetzt (siehe Abschnitt: Klonierung und Expression von HN-Genen und Hybrid-HN-Genen). Zu diesem Zweck wurden pCIneoHN1/2¹⁴³ und pCIneoHN1/4¹⁴³ mit NheI und SmaI verdaut, und die resultierenden Fragmente (welche die Hybrid-Gene HN1/2¹⁴³ und HN1/4¹⁴³ enthielten) wurden zwischen die NheI-Schnittstelle und die HpaI-Schnittstelle der Plasmide pGEM-HN1/2NS und pGEM-HN1/4NS kloniert, was zu pGEM+HN12 bzw. pGEM+HN14 führte. Die letztgenannten Plasmide wurden dazu verwendet, um die Hybrid-HN-Gene in den genomischen NDV-cDNA-Klon vollständiger Länge einzubringen. Zu diesem Zweck wurden die Plasmide pGEM+HN12 und pGEM+HN14 mit NotI und SpeI verdaut, und das Fragment, welches entweder das HN12-Gen oder das HN14-Gen enthielt, wurde dazu verwendet, das entsprechende Fragment von pNDFL+ auszutauschen, was zu pNDFL+HN1/2¹⁴³Cm bzw. pNDFL+HN1/4¹⁴³Cm führte. Das Cm-Gen wurde aus diesen Plasmiden durch Verdau mit XbaI gefolgt von einer Rezirkularisierung unter Verwendung der T4-DNA-Ligase entfernt. Um der "rule-of-six" zu entsprechen, wurde ein Verbindungsmolekül in die einzeln vorkommende SpeI- Schnittstelle dieser Plasmide unter Verwendung von selbstkomplementären Oligonukleotiden eingebracht. Das Verbindungsmolekül H2 (5'-CTAGCGAGCGCTCG-3') wurde in das Plasmid pNDFL+HN1/2¹⁴³ eingebracht, und das Verbindungsmolekül H3 (5'-CTAGCGAGCWGCTCG-3') wurde in pNDFL+HN1/4¹⁴³ eingebracht, was zu den Plasmiden pNDFL+HN1/2¹⁴³(H2) bzw. pNDFL+HN1/4¹⁴³(H3) führte.
Eliminierung eines spezifischen Epitops im HN-Protein von NDV-LaSota
Ein spezifisches Epitop, d.h. Aminosäuren 346 bis 354 (PDE-QDYQIR) in dem HN-Protein von NDV-LaSota, das von Mab 4D6 (Long et al., 1986; Meulemans et al., 1986) erkannt wird, wurde eliminiert, indem diese Sequenz durch die entsprechende Sequenz aus dem HN-Protein entweder von APMV-2 (NRTDIQQTI) oder von APMV-4 (PDPLQDQIL) ersetzt wurde. Zu diesem Zweck wurde das Plasmid pCIneoHN (siehe Abschnitt: Klonierung und Expression von einzelnen NDV-Genen) als Matrize verwendet, um überlappende PCR-Fragmente zu erzeugen. Für die APMV-2-Sequenz wurde das erste PCR-Fragment erzeugt, indem die Primer IV01 (5'-GTAGACGCGTAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3') und 3HN2 (5'-GATAGTTTGCTGTATATCAGTCCGATTGCATGTGTCATTGTATCGCTTGTATATCAC-3') verwendet wurden. Das zweite PCR-Fragment wurde unter Verwendung der Primer 5HN2 (5'-AATCGGACTGATATACAGCAAACTATCATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAGCC-3') und NDV3-HN (5'-CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG-3') erzeugt. Die resultierenden Fragmente wurden kombiniert und als Matrize für eine dritte PCR unter Verwendung der Primer IV01B (5'-GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3') und NDV3-HN verwendet. Für die APMV-4-Sequenz wurde das erste PCR-Fragment unter Verwendung der Primer IV01 und 3HN4 (5'-TAAGATCTGATCTTGCAGCGGGTCAGGGCATGTGTCATTGTATCGCTTGTATATCAC-3') erzeugt. Das zweite PCR-Produkt wurde unter Verwendung der Primer 5HN4 (5'-CCTGACCGCTGCAAGATCAGATCTTAATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAGCC-3') und NDV3-HN erzeugt. Die resultierenden Fragmente wurden kombiniert und als Matrize für eine dritte PCR verwendet, wobei die Primer IV01B und NDV3-HN verwendet wurden. Die Primer 3HN2/5HN2 und 3HN4/5HN4 sind teilweise komplementär und enthalten die genetischen Kodes für die HN2-Sequenz (NRTDIQQTI) bzw. die HN4-Sequenz (PDPLQDQIL). Die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung des "Expand Long Template"-PCR-Kits (Boehringer Mannheim) durchgeführt. Die PCR bestand aus 30 Zyklen von 10 Sekunden bei 94 °C, 30 Sekunden bei 58 °C und 2 Minuten bei 68 °C, gefolgt von einem Zyklus von 4 Minuten bei 68 °C. Die PCR-Fragmente wurden mit EcoNI und Bsu36I verdaut und zwischen die EcoNI-Schnittstelle und die Bsu36I-Schnittstelle von pCIneoHN kloniert. Die resultierenden Plasmide wurden pCIne-oHN1(HN2e) bzw. pCIneoHN1(HN4e) genannt. Die Untersuchung der transienten Expression ergab, dass die modifizierten HN-Proteine korrekt exprimiert und zur Zelloberfläche transportiert wurden, wie anhand von Hämadsorbtionsuntersuchungen unter Verwendung von Hühner-Erythrozyten beurteilt wurde. Darüber hinaus reagierte MAb 6D4, der gegen ein lineares Epitop aus HN von NDV gerichtet ist, das aus den Aminosäuren 346-354 besteht (oder diese zumindest umfasst), nicht mit den modifizierten HN-Proteinen.
Die Plasmide pCIneoHN1(HN2e) und pCIneoHN1(HN4e) wurden mit NarI und SpeI verdaut, und die Fragmente, welche die modifizierten HN-Gene enthielten, wurden zwischen die NarI-Schnittstelle und die SpeI-Schnittstelle von pGEM-HN1/2NS bzw. pGEM-HN1/4NS kloniert. Die resultierenden Plasmide, die als pGEM-HN1(HN2e) und pGEM-HN1(HN4e) bezeichnet wurden, wurden mit NotI und SpeI verdaut und dazu verwendet, dass NotI-SpeI-Fragment in pNDFL+ zu ersetzen. Die resultierenden Plasmide wurden pNDFL-HN(HN2e)Cm bzw. pNDFL-HN(HN4e)Cm genannt. Das Cm-Gen wurde aus diesen Plasmiden durch Verdau mit XbaI ge folgt von einer Religation entfernt. Die resultierenden Plasmide wurden als pNDFL-HN(HN2e) bzw. pNDFL-HN(HN4e) bezeichnet.
ERGEBNISSE
Nukleotidsequenz des 3'-terminalen Endes und des 5'-terminalen Endes des Genoms vom NDV-Stamm LaSota
Die Sequenz eines putativen 3'-Endes des NDV-Genoms ist veröffentlicht worden (Ishida et al., 1986), wenn auch von einem anderen NDV-Stamm (D26) als dem vorliegend verwendeten (LaSota). Yusoff et al. (1987) haben eine Sequenz des L-Gens und die einer relativ großen, nicht-kodierenden Region hinter dem L-Gen von NDV-Stamm Beaudette C veröffentlicht. Wie jedoch vorliegend gezeigt wird, enthielt diese Sequenz nicht das vollständige terminale 5'-Ende des viralen Genoms, wodurch es unmöglich ist, infektiöses Kopie-NDV zu erzeugen. Das 3'-terminale Ende und das 5'-terminale Ende des Genoms von negativsträngigen RNA-Viren erfüllt eine essentielle Funktion bei der Replikation und Transkription (Lamb und Kolakofsky, 1996). Um folglich eine NDV-cDNA vollständiger Länge zu erzeugen, die dazu verwendet werden kann, infektiöses Virus durch reverse genetische Manipulation zu erzeugen (Conzelmann, 1996), ist es absolut erforderlich, dass korrekte 3'-Ende und 5'-Ende des viralen Genoms einzuschließen. Aus diesem Grunde haben wir die exakte Nukleotidsequenz sowohl des 3'-Endes als auch des 5'-Endes der genomischen RNA von NDV-Stamm LaSota unter Verwendung eines 3'- und 5'-RACE-Verfahrens (rapid amplification of cDNA ends) bestimmt. Das 5'-Ende wurde durch PCR nach Ligation eines einzelsträngigen Anker-Primers (ALG3) an einzelsträngige cDNA erhalten, die durch reverse Transkription des 5'-Endes der genomischen RNA erzeugt wurde. Unter Verwendung eines Primers (ALG4), der komplementär zum Anker-Primer ist, sowie eines NDV-spezifischen Primers wurden PCR-Produkte erzeugt, die das 5'-Ende enthielten. Um das 3'-Ende von NDV zu klonieren, wurde der einzelsträngige Anker-Primer ALG3 unter Verwendung einer T4-RNA-Ligase an das 3'-Ende der viralen RNA ligiert und mittels PCR unter Verwendung des Primers ALG4 und eines NDV-spezifischen Primers amplifiziert (Verfahren I). Alternativ dazu wurden das 3'-Ende und das 5'-Ende der NDV-RNA miteinander ligiert, wobei eine T4-RNA-Ligase verwendet wurde, und die resultierende verknüpfte RNA wurde für eine RT-PCR unter Verwendung von NDV-spezifischen Primern verwendet, welche den Ligationspunkt flankierten (Verfahren II). Die Produkte der 3'- und 5'-RACE wurden in den T-Vektor pBluescriptII-TSK (Ichihara und Kurosawa, 1993) oder in pGEM4Z kloniert, und mehrere unabhängige Klone wurden isoliert und sequenziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Um einen direkten Vergleich des 3'-terminalen Endes und des 5'-terminalen Endes zu ermöglichen, sind die Sequenzen in Form einer DNA gezeigt, und das 3'-Ende des genomischen Strangs wird als das 5'-Ende des antigenomischen Strangs gezeigt. Auf Ebene der genomischen RNA lautet die Sequenz des 3'-Endes 3'-UGGUUUGUCUCUUAG gelesen, während die Sequenz des 5'-Endes UUUAGAAACAAACCA-5' lautet. Die Sequenz des 3'-Endes ähnelt fast der veröffentlichten 3'-terminalen Sequenz des NDV-Stamms D26 (Ishida et al., 1986). Die Sequenz des 5'-Endes zeigt jedoch, dass der NDV-Stamm LaSota 64 zusätzliche Nukleotide im Vergleich mit der veröffentlichten Sequenz des L-Gens von NDV-Stamms Beaudette C (Yusoff et al., 1987) aufweist. (6.)
Replikation von NDV-Minigenomen durch ein Helfervirus
Um zu bestimmen, ob das 3'-Ende und das 5'-Ende von NDV funktionell an der Replikation und Transkription beteiligt sind, wurden Minigenome konstruiert, die aus dem 3'-Ende von NDV (nt 1-119), einem für sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) kodierenden Reportergen und dem 5'-Ende von NDV (nt 14973-15186) bestand (2). Diese Minigenome wurden in beiden Orientierungen in den Transkriptionsvektor pOLTV5 klo niert, wobei die Plasmide pOLTV535 bzw. pOLTV553 erzeugt wurden (für Details bezüglich der Konstruktion, siehe Material und Methoden). Das Plasmid pOLTV5 (1) enthält den T7-RNA-Polymerase-Promotor gefolgt von einer einzeln vorkommenden StuI-Schnittstelle und einer einzeln vorkommenden SmaI-Schnittstelle, das autokatalytische Ribozym von Hepatitis Delta-Virus (HDV) und das Transkriptions-Terminationssignal des Bakteriophagen T7 (Pattnaik et al., 1992). Eine in vivo-Transkription oder eine in vitro-Transkription des Plasmids pOLTV535 unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase führt zu antigenomischer RNA (oder [+]-RNA), während die Transkription von Plasmid pOLTV553 zu genomischer RNA (oder [-]-RNA) führt (5).
Um zu untersuchen, ob die Minigenom-RNAs, die durch die Plasmide pOLTV535 und pOLTV553 erzeugt wurden, unter Verwendung von NDV als Helfervirus repliziert und exprimiert werden können, haben wir CER-Zellen verwendet, welche die T7-RNA-Polymerase entweder konstitutiv exprimieren (CER-C9-Zellen, siehe Material und Methoden) oder nach Infektion mit rekombinanten Geflügelpocken fpEFLT7pol (Britton et al., 1995; im Folgenden FPV-T7 genannt), das die T7-RNA-Polymerase exprimiert. CER-C9-Zellen und FPV-T7-infizierte CER-Zellen wurden mit den Minigenom-Plasmiden pOLTV535 oder pOLTV553 transfiziert, und nach Inkubation für 3 Stunden bei 37 °C wurden die Zellen entweder mit NDV für 1 Stunde infiziert, oder sie wurden nicht infiziert. Ungefähr 24 Stunden nach der Transfektion wurde eine Probe aus dem Medium genommen und auf eine SEAP-Aktivität untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die SEAP-Expression in FPV-T7-infizierten Zellen, welche mit pOLTV535 transfiziert worden waren, sehr hoch war. Dies ist nicht überraschend, da die Transkription durch die T7-RNA-Polymerase antigenomische [+]-RNA erzeugt, die durch die Geflügelpocken-Enzyme mit einer Cap-Struktur versehen und von der Wirtszelle wirksam translatiert wird. In pOLTV553-transfizierten Zellen erzeugt die Transkription durch die T7-RNA-Polymerase genomische [-]-RNA, die durch das Helfervirus in [+]-RNA umgewandelt werden muß, um in ein SEAP-Protein translatiert zu werden (siehe 5). In beiden Fällen konnte keine Erhöhung der SEA2-Expression in NDV-infizierten Zellen im Vergleich zu nicht-infizierten Zellen beobachtet werden. Im Gegenteil; die SEAP-Expression in NDV-infizierten Zellen war durchgehend ungefähr zweimal niedriger als in nicht-infizierten Zellen (Ergebnisse nicht gezeigt). Bei pOLTV535-transfizierten Zellen kann dies durch das bereits sehr hohe Ausmaß der SEAP-Expression durch Transkripte erklärt werden, welche durch die T7-RNA-Polymerase erzeugt werden. In pOLTV553-tranfizierten Zellen jedoch, in denen die Expression von SEAP von der Umwandlung der genomischen [-]-RNA in antigenomische [+]-RNA oder mRNA durch den viralen Polymerasekomplex abhängig ist, hätten wir eine Erhöhung der SEAP-Expression nach NDV-Infektion erwartet. Wir können uns zwei Gründe vorstellen, warum die Minigenome nicht von NDV exprimiert und repliziert werden konnten. Zunächst entspricht die Größe der Minigenom-RNAs nicht der sogenannten "rule-of-six" (Calain und Roux, 1993; Kolakofsky et al., 1998). Gemäß dieser Regel werden Paramyxovirus-Genome nur wirksam repliziert, wenn sie ein Vielfaches von 6 nt lang sind. Zum Zweiten können die zwei zusätzlichen G-Reste, die am 5'-Ende der Minigenom-RNAs vorhanden sind, die korrekte Replikation und/oder Transkription durch den viralen Polymerasekomplex stören. Um herauszufinden, ob die Replikation der Genome von der "rule-of-six" abhängig ist, haben wir eine Reihe von kurzen selbst-komplementären Oligonukleotiden, bei denen sich die Länge um 1 nt vergrößerte, in die einzeln vorkommende ClaI-Schnittstelle der Plasmide pOLTV535 und pOLTV553 eingebaut (siehe 2). Die resultierenden Plasmide (pOLTV535N0 bis -N5 und pOLTV553N0 bis -N5) unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Länge von 1 bis 6 nt, und folglich sollte eines dieser Plasmide eine Minigenom-RNA erzeugen, die der "rule-of-six" entspricht. Die Plasmide wurden verwendet, um CER-Zellen oder FPV-T7-infizierte CER-C9-Zellen wie oben beschrieben zu transfizieren. Die Ergebnisse zeigten, dass lediglich die Plasmide pOLTV535N3 und pOLTV553N3 zu einer erhöhten SEAP-Aktivität nach einer NDV-Infektion führten. Die Länge der Minigenom-RNAs, die ausgehend von diesen Plasmiden durch eine T7-RNA-Polymerase erzeugt wurden, wurden auf 6 nt+2 berechnet. Da zwei zusätzliche G-Reste am 5'-Ende der Minigenom-RNAs vorhanden waren, verweisen diese Ergebnisse darauf, dass nur die Größe der RNA-Sequenz, welche zwischen dem tatsächlichen 3'-Ende und dem tatsächlichen 5'-Ende der Minigenom-RNAs vorhanden ist, für die "rule-of-six" relevant ist. Dies wurde verifiziert, indem Minigenom-Plasmide konstruiert wurden, in denen der Transkriptionstart der T7-RNA-Polymerase so verändert wurde, dass das erste Nukleotid, welches in die RNA eingebaut wurde, das erste Nukleotid des 3'-Endes oder des 5'-Endes von NDV war (siehe Material und Methoden). Die Transfektion dieser Plasmide verwies darauf, dass lediglich Minigenom-RNAs, die ausgehend von den Plasmiden pOLTV735N3 und pOLTV753N3 erzeugt wurden, durch das Helfervirus repliziert wurden (Ergebnisse nicht gezeigt). Dieses Erkenntnisse verweisen wiederum darauf, dass die Replikation von NDV streng von der "rule-of-six" abhängig ist. Ferner verweisen diese Erkenntnisse darauf, dass das Vorhandensein von zwei zusätzlichen G-Resten am 5'-Ende der Minigenom-RNAs die korrekte Replikation nicht stören. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Minigenom-Plasmiden (oder DI-Plasmiden) von anderen Paramyxoviridae erhalten (Pattnaik et al., 1992; Harty und Palese, 1995).
Verpackung von NDV-Minigenomen durch Helfervirus
Um zu bestimmen, ob Minigenom-RNAs durch NDV-Helfervirus verpackt werden können, wurde das Medium von transfizierten Zellen auf frische Monolayer überführt, und nach 1 Stunde Adsorption wurden die Monolayer dreimal mit PBS gewaschen und weiter in Komplettmedium inkubiert. Nach 24 Stunden Inkubation wurde die SEAP-Aktivität im Medium gemessen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine SEAP-Aktivität lediglich in Zellen vorhanden war, die mit Medium von Zellen behandelt worden waren, welche mit Minigenom-Plasmid pOLTV555N3 transfiziert worden waren (Tabelle 4). Diese Erkenntnis verweist darauf, dass Minigenom-RNAs in NDV-Hüllen verpackt werden können, und dass diese Partikel in der Lage sind, Zellen zu infizieren. Des Weiteren zeigen diese Ergebnisse, dass die Verpackung von der Replikation abhängig ist, was darauf verweist, dass lediglich RNA-Moleküle, die mit dem viralen Proteinen NP, P und L kom- plexiert sind, in Virus-ähnliche Partikel verpackt werden.
Replikation von NDV-Minigenomen durch Plasmide, welche die Proteine NP, P und L exprimieren
Um zu bestimmen, ob die Minigenom-RNAs auch durch Plasmide repliziert werden können, die für die essentiellen Proteine NP, P und L kodieren, haben wir Co-Transfektions-Experimente in Zellen durchgeführt, welche mit FPV-T7 infiziert waren. Die Zellen wurden mit einer Kombination aus Plasmiden transfiziert, die aus dem Minigenom-Plasmid und den Plasmiden pCIneoNP, -P bzw. -L(c) bestand. Als Negativkontrolle wurde pCIneoL(c), welches für das essentielle Protein L kodiert, gegen das Vektorplasmid pCIneo ersetzt. Die Ergebnisse (Tabelle 5) verwiesen darauf, dass Plasmide, welche für NP, P und L kodieren, tatsächlich in der Lage sind, Minigenom-RNAs zu replizieren. Die Ergebnisse zeigen ferner, dass ähnlich wie bei der Minogenom-Replikation durch Helfervirus die Replikation durch die Proteine NP, P und L ebenfalls von der "rule-of-six" abhängig ist.
Nukleotidsequenz des vollständigen Genoms vom NDV-Stamm LaSota
Subgenomische cDNA-Fragmente, die das gesamte NDV-Genom umfassen, wurden mittels RT-PCR konstruiert (4). Um die Anzahl von PCR-Fehlern minimal zu halten, wurde ein Proofreading-Enzym-Mix (Expand Long Template; Boehringer Mannheim) in Kombination mit einer begrenzten Anzahl von PCR-Zyklen (15 Zyklen) verwendet. Der Primer 3UIT, der komplementär zu dem 3'-Ende der NDV-RNA ist, wurde für die reverse Transkription verwendet, und Gen-spezifische Primer wurden für die PCR verwendet. Um mögliche PCR-Fehler zu identifizieren, wurden drei unabhängige RT-Reaktionen durchgeführt und dazu verwendet, um drei unabhängige Gruppen von subgenomischen cDNAs zu erzeugen. Die cDNAs, die hinsichtlich ihrer Größe von ungefähr 4 bis 7 kb reichten, wurden in pGEM-T kloniert. Die Nukleotidsequenz von zwei Gruppen von cDNAs wurde unter Verwendung von Primern bestimmt, die entweder von veröffentlichten NDV-Sequenzen abgeleitet waren, oder unter Verwendung von Primern, die von der NDV-Sequenz abgeleitet war, welche während dieses Sequenzierungsprojekts erhalten wurde (Tabelle 1). Verbliebene Unsicherheiten wurden durch Sequenzierung der relevanten Regionen der drei Gruppe von cDNA-Klonen beseitigt. Das Genom des NDV-Stamms LaSota besteht aus 15186 nt (3), womit dieses das kleinste aller Paramyxovirus-Genome ist, von dem bislang die gesamte Sequenz ermittelt wurde (Kolakofsky et al. 1998).
Konstruktion eines NDV-cDNA-Klons vollständiger Länge im Transkriptionsplasmid pOLTV5
Um einen cDNA-Klon vollständiger Länge des NDV-Stamms LaSota zu konstruieren, wurden überlappende cDNA-Klone, die das gesamte NDV-Genom umfassten, an gemeinsamen Restriktionsschnittstellen gemäß der in 4 gezeigten Strategie zusammengefügt. Die gesamte NDV-cDNA wurde in dem Minigenom-Plasmid pOLTV535 (siehe oben), das von dem Transkriptionsplasmid pOLTV5 abgeleitet ist, zusammengesetzt. Wie in 4B gezeigt wird, bestand der letzte Schritt beim Zusammenbau der vollständigen NDV-cDNA in der Klonierung eines ungefähr 8,8 kb großen ClaI (nt 3521-12355)-Fragments von pGEM-B in p535-DI, das die NDV-Sequenzen enthielt, welche die ClaI-Schnittstelle auf beiden Seiten flankiert (d.h. nt 1-3521 bzw. 12355-15186). Es zeigte sich, dass dieser Schritt verhältnismäßig schwierig war, da wir wiederholt bei der Erzeugung der korrekten Klone keinen Erfolg hatten. Aus diesem Grund wurde das ClaI-Fragment von pGEM-B mit dem Chloramphenicol-Resistenz (Cm)-Gen aus dem Plasmid pACYC184 versehen (tagged). Das ClaI-Fragment, welches das Cm-Gen enthielt, wurde isoliert und in die ClaI-Schnittstelle von p535-DI kloniert, und Transformanten wurden auf ihre Resistenz gegen Cm selektiert. Da Transformanten nur geringfügig wuchsen, wurde die Antibiotika-Selektion auf 15 μg/ml Cm und 10 μg/ml Km verringert, und die Inkubationstemperatur wurde von 37 °C auf 32 °C verringert. Schließlich wurde das Cm-Gen durch Verdau mit BsiWI aus diesem Plasmid entfernt, gefolgt von einer Rezirkularisierung durch Verwendung einer T4-DNA-Ligase. Nach Transformation von E. coli wurden Zellen, die das erwünschte Plasmid enthielten, phänotypisch durch Screening nach Km-Resistenz und Cm-Sensitivität identifiziert. Das resultierende Plasmid, das aus der NDV-cDNA vollständiger Länge bestand, welche zwischen die Schnittstellen SmaI und StuI des Transkriptionsplasmids pOLTV5 kloniert war, wurde als pNDFL+ bezeichnet.
Erzeugen eines infektiösen NDV aus cDNA vollständiger Länge
Um infektiöses NDV gänzlich ausgehend von klonierter cDNA zu erzeugen, wurde das Plasmid pNDFL+ bei Co-Transfektionsexperimenten mit pCIneoNP, -P und -L(c) verwendet, wie es oben für die Minigenomplasmide beschrieben ist. Die Transfektion von CER- und CEF-Zellen wurde unter Verwendung des Minigenomplasmids pOLTV553N3 und durch Messung der SEAP-Expression überprüft. Als Negativkontrolle wurde pCIneoL(c) durch pCIneo ersetzt. Nach der Co-Transfektion wurden die Zellen für 3 bis 6 Tage in Medium inkubiert, das 5 Allantoisflüssigkeit ent hielt. Die Zugabe von Allantoisflüssigkeit ist notwendig, weil CER- oder CEF-Zellen geeignete Proteasen fehlen, die erforderlich sind, um das F-Protein des NDV-Stamms LaSota zu spalten. Die Spaltung des F-Proteins ist für die Ausbreitung von Zelle zu Zelle und für die Erzeugung eines infektiösen Virus absolut erforderlich. Nach 3 Tagen Inkubation führten wir eine immunologische Färbung der fixierten Monolayer unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen das F-Protein durch. Die Ergebnisse zeigten, dass Zellen, die mit dem Antikörper gefärbt wurden, lediglich in Monolayern vorhanden waren, die mit pNDFL(+), pCIneoNP, -P und -L(c) co-transfiziert worden waren. Diese Ergebnisse verwiesen darauf, dass die Replikation und Expression des Genoms in diesen Zellen auftrat. Keine Färbung von Zellen wurde beobachtet, wenn pCIneoL(c) in den Co-Transfektionsexperimenten gegen pCIneo ersetzt wurde.
Um infektiöses Virus zu erhalten, wurde der Überstand von transfizierten CEF-Monolayern in die Allantois-Höhle von embryonierten Eiern injiziert. Vier Tage später wurde die Allantoisflüssigkeit abgeerntet, in einem Hämagglutination-Assay analysiert und weiter in Eiern passagiert. Die Ergebnisse zeigten, dass lediglich der Überstand von Zellen, die mit einer Kombination aus pNDFL+ und pCIneoNP, -P und -L(c) transfiziert worden waren, zu einer positiven Reaktion im Hämagglutination-Assay führten. Allantoisflüssigkeit, die eine positive Hämagglutinationsreaktion zeigte, wurde anschließend in einem Hämagglutination-Inhibierungsassay unter Verwendung der monoklonalen Antikörper 7B7, 8C11, 5A1, 7D4 und 4D6 (Long et al., 1986), welche verwendet werden können, um zwischen verschiedenen NDV-Stämmen zu unterscheiden, analysiert. Die Ergebnisse dieses Assays verwiesen darauf, dass der NDV-Stamm, der aus den inokulierten Eiern gewonnen wurde, dieselbe Reaktion zeigte wie der ursprünglich LaSota-Stamm. Das Virus, das aus den inokulierten Eiern gewonnen wurde, wurde NDFL genannt, um es von dem ursprünglichen LaSota-Stamm zu unterscheiden.
Erzeugen eines genetisch modifizierten NDV aus cDNA vollständiger Länge
Um unzweifelhaft zu zeigen, dass das Co-Transfektions-System verwendet werden kann, um infektiöses Virus aus klonierter NDV-cDNA vollständiger Länge zu erhalten, wurde ein genetischer Anhang (tag) in das Plasmid pNDFL(+) eingebracht. Zu diesem Zweck wurde die Aminosäuresequenz der Proteasespaltstelle im Fo-Protein durch PCR-Mutagenese von der Sequenz des LaSota-Stamms (GGRQGR | L) zur Konsensussequenz von virulenten NDV-Stämmen (GRRQRR | F) verändert (siehe Material und Methoden für Details). Das resultierende Plasmid pNDFL+[F^wt] wurde verwendet, um Virus zu erzeugen, indem das oben beschriebene Co-Transfektions-System eingesetzt wurde. Infektiöses Virus, das NDFL[F^wt] genannt wurde, wurde aus der Allantoisflüssigkeit von embryonierten Eiern gewonnen, die mit dem Medium von co-transfizierten CEF-Zellen inokuliert worden war. In einem HI-Test zeigten alle MAbs, einschließlich 7D4, der spezifisch für den LaSota-Stamm ist, dieselbe Reaktivität mit dem neu erzeugten Virus wie mit dem ursprünglichen LaSota-Stamm. Die Nukleotidsequenz der Region, die für die Proteasespaltstelle des F-Proteins kodiert, wurde mittels RT-PCR bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Nukleotidsequenz die exakten Nukleotid-Austausche enthielt, welche in den mutagenen Primer eingebracht worden waren, der verwendet wurde, um die ursprüngliche LaSota-Sequenz zu modifizieren. Diese Erkenntnis zeigt, dass das Virus von dem Plasmid pNDFL+[F^wt] erhalten wurde, und dies zeigt, dass (genetisch modifiziertes) NDV gänzlich ausgehend von klonierter NDV-cDNA vollständiger Länge erzeugt werden kann.
Die Proteasespaltstelle des Fo-Proteins von NDV ist eine wesentlich Determinante für die Virulenz
Es wird im Allgemeinen angenommen, dass die Aminosäuresequenz der Proteasespaltstelle des Fo-Proteins eine wesentliche Determinante für die Virulenz von verschiedenen NDV-Stämmen ist. Die Erzeugung eines genetisch modifizierten LaSota-Stamms, bei dem die Aminosäuresequenz der Proteasespaltstelle von der eines lentogenen (nicht-virulenten) NDV-Stamms zu der eines velogenen (virulenten) NDV-Stamms verändert wurde, bot die einzigartige Gelegenheit, diese Annahme zu überprüfen. Aus diesem Grunde haben wir den intercerebralen Pathogenitätsindex (ICPI) des neu erzeugten Virus NDFL[F^wt] bestimmt und diesen mit dem des Stamms NDFL und dem des ursprünglichen LaSota-Stamms (Klon E13-1) verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass der ICPI des Stamms NDFL[F^wt] 1,3 betrug, was bei weitem über dem Wert für die Stämme NDFL (ICPI = 0,0) und Klon E13-1 (ICPI = 0,3) lag. Diese Ergebnisse zeigen, dass erwartungsgemäß die Virulenz von NDV in hohem Maße durch die Aminosäuresequenz der Proteasespaltstelle des Fo-Proteins bestimmt wird.
Einbringung eines serologischen Markers
Die Glykoproteine F und HN aus der Hülle von NDV sind die am stärksten immunogenen Proteine des Virus. Nach der Infektion zeigen sowohl das F-Protein als auch das HN-Protein eine starke Antwort mit einem neutralisierenden Antikörper. Die Induktion einer solchen Antwort mit einem neutralisierenden Antikörper ist die Basis für eine erfolgreiche Impfung durch nicht-virulente NDV-Stämme (wie beispielsweise mit dem weit verbreiteten LaSota-Stamm). Die Antikörperantwort gegen NDV-Impfstämme kann jedoch nicht von der Antikörperantwort gegen virulente NDV-Feldstämme unterschieden werden. Daher können Infektionen mit virulentem Feld-Virus nicht mit serologischen Verfahren aufgespürt werden. Diese Situation ist unerwünscht, da Infektionen mit Feld-Virus durch eine Impfung verdeckt werden, und die durch Feldstämme verursachten klinischen Symptome übersehen oder sogar der Impfung zugeschrieben werden können.
Da die erfolgreiche Differenzierung zwischen Impfung und Infektion für die Ausrottung von NDV notwendig ist, haben wir damit begonnen, genetisch modifizierte NDV-Stämme zu entwickeln, die für die Impfung verwendet werden können, und die serologisch von NDV-Feldstämmen unterschieden werden können (sogenannte Marker-Impfstoffe). Um einen NDV-Marker-Impfstoff zu entwickeln, muß das Virus genetisch modifiziert werden, sodass ein oder mehrere immundominante Epitope von einem der (Haupt)-Antigene entweder deletiert oder modifiziert werden. Die Deletion eines Teils (von Teilen) eines essentiellen Proteins kann zum Verlust der Funktion dieses Proteins führen. Aus diesem Grunde haben wir uns entschlossen, eines der immundominanten Proteine der Hülle von NDV so zu modifizieren, dass die biologische Funktion des Proteins beibehalten wurde, während das Antikörper-Repertoire gegen das modifizierte Protein sich von dem Antikörper-Repertoire gegen das ursprüngliche Protein unterschied. Aus den nachstehend genannten Gründen haben wir für eine Ausführungsform der Erfindung beschlossen, das HN-Protein von NDV zu modifizieren. Die Infektion von NDV wird durch Fusion der Hülle des Virions mit der Plasmamembran der Wirtszelle ausgelöst. Für diesen Vorgang ist sowohl das F-Protein als auch das HN-Protein erforderlich. Es ist gezeigt worden, dass das F-Protein und das HN-Protein physikalisch Wechselwirken und, dass diese Wechselwirkung für die Membranfusion erforderlich ist (Deng et al., 1995). Des Weiteren ist gezeigt worden, dass die Interaktion Typen-spezifisch ist, d.h. das F-Protein und das HN-Protein müssen vom selben Virus stammen, um eine Fusionsaktivität zu zeigen. Die interagierende Domäne des HN-Proteins von NDV ist in der sogenannten Stiel- oder Stammregion des Proteins lokalisiert worden, welche die ersten 92 Aminosäurereste der Ektodomäne des HN-Proteins umfasst (Deng et al., 1995). Es wurde gezeigt, dass Hybrid-HN-Proteine, die aus den aa 1-141 von NDV und den aa 141-572 des humanen Parainfluenzavirus Typ-3 (hPIV3) bestehen, ihre Fusionsaktivität beibehalten, wenn sie mit dem F-Protein von NDV co-exprimiert werden. Diese Ergebnisse verweisen darauf, dass genetisch modifizierte NDV-Stämme, die ein Hybrid-HN-Protein enthalten, welches aus der Stammregion von NDV besteht, welcher der globuläre Kopf eines HN-Proteins aus einem anderen Vogel-Paramyxovirus-Serotyp folgt, lebensfähig sein können. Des Weiteren würden solche Stämme eine anti-HN-Antikörper-Antwort zeigen, die sich von der von NDV unterscheidet. Da die Antwort mit neutralisierendem Antikörper gegen das F-Protein ausreichend ist, um einen wirksamen Schutz gegen die Bedrohung einer Virusinfektion zu erzielen, erfüllen solche genetisch modifizierten NDV-Stämme, die beiden essentiellen Erfordernisse eines Marker-Impfstoffs, d.h. Schutz gegen Erkrankung und serologische Abgrenzung.
Es wurden Hybrid-HN-Gene konstruiert, die aus einer Fusion der aa 1-141 von NDV und der aa 142-580 des Vogel-Paramyxovirus Typ-2 (APMV2) (als HN1/2¹⁴¹ bezeichnet) oder aus einer Fusion der aa 1-143 von NDV und der aa 144-580 von APMV2 (als HN1/2¹⁴³ bezeichnet). In ähnlicher Weise wurden Hybrid-HN-Gene konstruiert, die entweder aus den aa 1-141 von NDV und den aa 143-569 von AMPV4 (als HN1/4¹⁴¹ bezeichnet) bestanden oder aus den aa 1-143 von NDV und den aa 145-569 von APMV4 (als HN1/4¹⁴³ bezeichnet). Die Hybrid-Gene wurden in den eukaryontischen Expressionsvektor pCIneo kloniert und in co-Transfektions-Experimenten mit einem Plasmid verwendet, welches das NDV-F-Protein enthielt. Zu diesem Zweck wurde das F-Protein so modifiziert, dass die Aminosäuresequenz der proteolytischen Spaltstelle zwischen F2 und F1 von der Sequenz von LaSota zu der Konsensussequenz von virulenten NDV-Stämmen verändert wurde (F^wt, siehe Abschnitt Material und Methoden). Die Co-Transfektions-Experimente in CER-Zellen und QM5-Zellen zeigten, dass sowohl HN1/2¹⁴¹ und HN1/2¹⁴³ sowie auch HN1/4¹⁴¹ und HN1/4¹⁴³ eine Zellfusion bei einer Co-Expression mit dem F^wt-Protein induzierten. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Komplexe zwischen den Hybrid-HN-Proteinen und dem F-Protein biologisch aktiv waren. Die Hybrid-HN-Proteine HN1/2¹⁴³ und HN1/4¹⁴³ wurden dazu verwendet, die ursprünglichen HN-Gene in dem cDNA-Klon vollständiger Länge pNDFL+ zu ersetzen, was zu pNDFL-HN1/2¹⁴³ und pNDFL-HN1/4¹⁴³ führte. Die beiden letztgenannten Plasmide wurden anschließend für die Erzeugung von infektiösem Virus verwendet, indem das oben beschriebene Co-Transfektions-System eingesetzt wurde. Lebensfähige rekombinante Viren (als NDFL-HN1/2¹⁴³ und NDFL-HN1/4¹⁴³ bezeichnet) konnten aus der Allantoisflüssigkeit von embryonierten Eiern isoliert werden, die mit dem Überstand von transfizierten Monolagern inokuliert worden waren.
Das Vorhandensein des Hybrid-HN-Gens wurde in jeder der zwei Rekombinanten mittels RT-PCR verifiziert. Hämagglutination-Inhibierungstests zeigten, dass monoklonale Antikörper polyvalente Antiseren gegen NDV nicht in der Lage waren, die Agglutination von Hühner-Erythrozyten durch die rekombinanten Viren NDFL-HN1/2¹⁴³ und NDFL-HN1/4¹⁴³ zu hemmen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Stämme in der NDFL-HN1/2¹⁴³ und NDFL-HN1/4¹⁴³ als Impfstoffe verwendet werden können, die serologisch von klassischen NDV-Impfstoffen unterschieden werden können.
Expression eines heterologen Proteins ausgehend von rekombinantem NDV
Um zu untersuchen, ob Fremdgene in das NDV-Genom eingebracht werden können, haben wir ein rekombinantes Virus konstruiert, welches das SEAP-Reportergen enthielt. Das SEAP-Gen wurde von dem Plasmid pOLTV535 abgeleitet und wurde so modifiziert, dass es die übliche Transkriptions-Stopp-Box und die übliche Transkriptions-Start-Box von NDV enthielt. Ein DNA-Fragment, welches das SEAP-Gen enthielt, und dem die von den Transkriptions-Stopp-Box und die Transkriptions-Start-Box folgte, wurde in die XmnI-Schnittstelle (nt 109) in das Plasmid pNDFL+[F^wt] eingebracht. Infektiöses Virus, das als NDFL-AP bezeichnet wurde, wurde mittels des Co-Transfektions-Systems erzeugt, und das Vorhandensein des SEAP-Gens wurde mittels RT-PCR verifiziert. Zellen, die mit dem Stamm NDFL-AP infiziert waren, exprimierten sehr hohe Mengen des SEAP-Proteins. Durch Verwendung der spezifischen Aktivität des SEAP-Proteins berechneten wir, das x% des Proteins in den mit NDFL-AP infizierten Zellen aus SEAP-Protein bestand. Diese Ergebnisse zeigen, dass heterologe Gene in sehr starkem Ausmaß von rekombinantem NDV exprimiert werden können.
Erzeugen einer NDV-Deletionsmutante in einer transkomplementierenden Zellline
Um die Expression des M-Proteins von NDV auszuschalten, wurde ein großer Teil des M-Gens durch Verdau von pNDFL+[F^wt] mit BsaAI (nt 3087) gefolgt von einem partiellen Verdau mit HindIII (nt 4252) deletiert. Nach Auffüllen des HindIII-Endes mit Klenow-DNA-Polymerase wurde das Fragment durch Verwendung von T4-DNA-Ligase rezirkularisiert und dazu verwendet, E. coli zu transformieren. Das resultierende Plasmid, das als pNDFL+[F^wt]dM bezeichnet wurde, wurde verwendet, um Virus mit Hilfe des Co-Transfektions-Systems in trans-komplementierenden CER-M-Zellen zu erzeugen, die das M-Protein von NDV exprimierten. Der Überstand von transfizierten Monolagern wurde dreimal in CER-M-Zellen passagiert und im Hinblick auf das Vorhandensein des Virus analysiert. Es wurde Virus erhalten, wie durch die Tatsache gezeigt wurde, dass der Kulturüberstand der dritten Passage positive Ergebnisse beim Hämagglutination (HA)-Test und beim Hämagglutination-Inhibierungs (HI)-Test ergab. Das Virus wurde als NDFL-dM bezeichnet. Wenn NDFL-dM verwendet wurde, um Monolayer von CEF-Zellen zu transfizieren, war das Virus immer noch in der Lage, sich durch Übertragung von Zelle zu Zelle zu verbreiten, wie in einem IPMA unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen das F-Protein beobachtet werden konnte. Wie erwartet konnte die Expression des M-Proteins in einem IPMA unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen das M-Protein nicht gezeigt werden. Wenn der Überstand verwendet wurde, um entweder CEF-Zellen oder CER-M-Zellen zu infizieren, waren wir nicht in der Lage, das Vorhandensein von replizierendem Virus in diesen Monolagern durch IPMA zu demonstrieren. Diese Erkenntnis verweist darauf, dass in nicht-komplementierenden CEF-Zellen kein infektiöses Virus erzeugt werden konnte. Diese Erkenntnis wurde durch die Beobachtung bestätigt, dass eine Inokulation von embryonierten Eiern mit Überstand von infizierten CEF-Zellen nicht zur Erzeugung von Nachkommenvirus führte, wenn eine Untersuchung mittels HA-Test oder HI-Test durchgeführt wurde.
Die Bedürfnis nach besseren NDV-Impfstoffen, und insbesondere das Bedürfnis nach NDV-Marker-Impfstoffen hat uns veranlasst, ein System der reversen genetischen Manipulation zu entwickeln, das die genetische Modifikation von NDV erlaubt. In diesem Dokument beschreiben wir die Erzeugung von infektiösem NDV, die ausschließlich von klonierter cDNA vollständiger Länge ausgeht. Wir zeigen, dass die Virulenz von NDV dramatisch verändert werden kann, indem lediglich drei Nukleotide modifiziert werden, welche die Spezifität der Proteasespaltstelle des F-Proteins bestimmen. In diesem Fall wurde die Proteasespaltstelle von der Spaltstelle des Stamms LaSota in die Konsensusspaltstelle von virulenten NDV-Stämmen geändert. Indem dieser genetisch modifizierte NDV-Stamm erzeugt wurde, haben wir den formalen Beweis dafür erbracht, dass die Spaltbarkeit des F-Proteins die wesentliche Determinante (jedoch nicht die einzige Determinante) für die Virulenz von NDV ist. Durch Verwendung des gleichen reversen genetischen Ansatzes kann die Spaltstelle nach Belieben in jede andere Aminosäuresequenz modifiziert werden. Dies kann zur Erzeugung einer Serie von NDV-Stämmen führen, die ein Spektrum von Virulenz-Niveaus zeigen.
In vivo
Wie bereits oben erwähnt ist gezeigt worden, dass neben der Spaltbarkeit des F-Proteins und des HN-Proteins andere virale Faktoren zur Pathogenität beitragen können. Veränderungen der Transkription und Translation können das Wachstum und die Ausbreitung des Virus von Zelle zu Zelle und/oder die Zytopathogenität modulieren. Die Verfügbarkeit einer infektiösen cDNA von NDV erlaubt die systematische Modifikation von Sequenzen, die bei der Transkription und Replikation beteiligt sind. Dies kann zur Erstellung von neuen NDV-Impfstoffen führen, die eine optimale Immunogenität und eine nahezu nicht vorhandene Virulenz zeigen. Sicherheit ist eine der wichtigsten Eigenschaften von Lebendimpfstoffen. Die Immunogenität steht jedoch bei vielen Lebendimpfstoffen einschließlich NDV, oftmals in einem umgekehrten Verhältnis zur Virulenz. Aus diesem Grund ist die weitere Attenuierung von Lebendimpfstoffen ohne Verlust von Immunogenität eine der am stärksten erwünschten Veränderungen, für die eine genetische Modifikation eingesetzt werden könnte. In dieser Hinsicht ist erwähnenswert, dass es gezeigt wurde, dass die Eliminierung der Expression des V-Proteins des Sendai-Virus zu einer deutlich verringerten in vivo-Pathogenität für Mäuse führt (Kato et al., 1997). Ähnlich wie das Sendai-Virus erzeugt auch NDV ein V-Protein durch einen Mechanismus, der als RNA-Editierung bekannt ist (Steward et al., 1993). Es ist vorhersagbar, dass die Eliminierung der Expression des V-Proteins von NDV ebenfalls zu einem attenuierten Phänotyp in vivo führen könnte. Neben der Veränderung der Virulenz von NDV zeigen wir, dass es möglich ist, die Antigen-Ausstattung von NDV so zu modifizieren, dass Stämme erzeugt werden können, die serologisch von NDV-Feldstämmen unterschieden werden können. Diese sogenannten Marker-Impfstoffe sind ein unschätzbares Werkzeug um die Verbreitung von NDV in kommerziellen Schwärmen weltweit zu erfassen. Darüber hinaus könnte die Anwendung dieser Marker-Impfstoffe in großen Ausmaß letztlich zur vollständigen Ausrottung von NDV führen, indem ein Verfahren aus in tensivem Screening und Ausmustern von infizierten Schwärmen angewendet wird. In diesem Dokument zeigen wir, dass Fremdgene in das Genom von NDV eingebaut werden können. Diese Fremdgene können in infizierten Zellen in sehr hohem Ausmaß exprimiert werden. Dies zeigt, dass NDV als Impfvektor für die Expression von Antigenen aus anderen (Geflügel-)Erregern verwendet werden kann. Einige Eigenschaften machen NDV zu einem idealen Impfvektor für die Impfung gegen respiratorische oder intestinale Erkrankungen. 1) NDV kann in embryonierten Eiern problemlos zu sehr hohen Titern kultiviert werden. 2) Die Massenkultur von NDV in embryonierten Eiern ist verhältnismäßig kostengünstig. 3) NDV-Impfstoffe sind verhältnismäßig stabil und können einfach durch Massenanwendungsverfahren, wie beispielsweise durch Trinkwasser oder durch Versprühen oder Aerosolbildung, verabreicht werden. 4) Der natürliche Infektionsweg für NDV erfolgt über den Respirationstrakt und/oder über den Intestinaltrakt, wobei diese auch die wichtigsten natürlichen Infektionswege von zahlreichen anderen Erregern für Geflügel sind. 5) NDV kann trotz des Vorhandenseins von zirkulierenden mütterlichen Antikörpern eine lokale Immunität induzieren.
Schließlich zeigen wir, dass lebensfähige NDV-Deletionsmutanten erzeugt werden können, indem man trans-komplementierende Zelllinien verwendet. Eine NDV-Deletionsmutante wurde erzeugt, die nicht in der Lage ist, das Matrix (M)-Protein zu exprimieren, welches an der Knospung von NDV an der inneren Zellmembran beteiligt ist. Wir zeigen, dass ein phänotypisch komplementierter NDV-Stamm, der nicht in der Lage ist, das M-Protein zu exprimieren, immer noch in der Lage ist, Zellen zu infizieren und sich durch Übertragung von Zelle zu Zelle zu verbreiten. Das mutierte Virus ist jedoch nicht in der Lage, infektiöse Nachkommen in nicht-komplementierenden Zellen zu bilden. Diese Erkenntnis zeigt, dass phänotypisch komplementierte NDV-Deletionsmutanten als sichere selbst-beschränkende Impfstoffe verwendet werden können, die nicht in der Lage sind, sich in ihrer Umgebung zu verbreiten. Ein solcher nicht-übertragbarer Impfstoff vereint den wichtigsten Vorteil von Lebendimpfstoffen, d.h. die Wirksamkeit, mit dem wichtigsten Vorteil von abgetöteten Impfstoffen, d.h. die Sicherheit.
FIGURENBESCHREIBUNGEN
1.
Transkriptionsvektor pOLTV5 ist ein Derivat des Transkriptionsvektors, der von Pattnaik et al. (1992) beschrieben wurde. Siehe Text für Details hinsichtlich der Konstruktion. Das Plasmid enthält den T7-DNA-abhängigen RNA-Polymerase-Promotor (fett dargestellt) gefolgt von den einzeln vorkommenden Restriktionsschnittstellen StuI und SmaI und dem autokatalytischen Ribozym aus dem Hepatitis-Delta-Virus (HDV). DNA-Fragmente können zwischen die Schnittstellen StuI und SmaI kloniert und entweder in vitro oder in vivo unter Verwendung der T7-RNA-Polymerase transkribiert werden. Das 5'-Ende des resultierenden Transkripts enthält zwei zusätzliche G-Reste, die nicht vom Insert kodiert werden. Aufgrund der Wirkung des Ribozyms entspricht das 3'-Ende des Transkripts exakt dem letzten Nukleotid des Inserts.
2.
Struktur der Minigenom-Plasmide pOLTV535 (2A) und pOLTV553 (2B). Die Minigenom-Plasmide basieren auf dem Transkriptionsplasmid pOLTV5 (vgl. 1) und enthalten die 3'-Region (nt 1-119) und die 5'-Region (nt 14970-15186) vom NDV-Stamm LaSota, welche das Gen flankieren, das für die sekretierte alkalische Phosphatase (SEAP) kodiert. Die Transkription von pOLTV535 durch die T7-RNA-Polymerase ergibt antigenomische RNA (oder [+]-RNA), während die Transkription von pOLTV553 genomische RNA (oder [-]-RNA) ergibt. Die Start (S)-Box und die Ende (E)-Box, bei denen es sich um Signale für die Initiation und Termination der viralen Transkription handelt, sind dargestellt. Das Startkodon des SEAP-Gens ist unterstrichen. Die Sequenzen der Insertionen (N0-N5) in die ClaI-Schnittstelle, die zu Minigenom-Plasmiden führen, welche sich jeweils um 1 nt in ihre Länge unterscheiden (pOLTV535N0-N5 bzw. pOLTV553N0-N5) sind ebenfalls gezeigt.
3.
Nukleotidsequenz des Genoms von NDV-Stamm LaSota und abgeleitete Aminosäuresequenz der NDV-Gene. Die gezeigte Sequenz entspricht dem antigenomischen Strang und ist in 5'-3'-Richtung in Form der ssDNA gezeigt. Die in dieser Figur gezeigte Sequenz ist die der Konsensussequenz, die durch vollständige Sequenzierung von zwei unabhängigen Gruppen überlappender, subgenomischer cDNAs ermittelt wurde, welche das gesamte NDV-Genom umfassen. Verbliebene Unsicherheiten (wahrscheinlich das Ergebnis von PCR-Fehlern) wurden durch Sequenzierung der relevanten Regionen von einer dritten unabhängigen Gruppe von Klonen beseitigt. Die Sequenz des cDNA-Klons vollständiger Länge pNDFL+, die aus überlappenden subgenomischen cDNA-Klonen zusammengesetzt wurde (siehe 4) unterscheidet sich von derjenigen der Konsensus-NDV-Sequenz an den folgenden Positionen (Konsensus-Sequenz in Klammern): nt 1755, G (A); nt 3766, A (G); nt 5109, G (A); nt 6999, T (C); nt 7056, G (A); nt 9337, G (A); nt 9486, A (T); nt 10195, T (C); nt 13075, A (G). Diese Unterscheide führen zu 3 Aminosäureveränderungen (Konsensussequenz in Klammern: F-Protein, R¹⁸⁹ (Q); HN-Protein S²⁰⁰ (P); L-Protein N³⁶⁹ (I).
4.

(A) Gesamtstrategie, die beim Zusammensetzen der NDV-cDNA vollständiger Länge aus subgenomischen, überlappenden cDNA- Klonen verwendet wurde. Die cDNA wurde in Plasmid pOLTV535 zusammengesetzt, das bereits das 3'-Ende und 5'-Ende des NDV-Stamms LaSota enthielt (siehe 2). Das resultierende Plasmid, das als pNDFL+ bezeichnet wurde, wurde für die Erzeugung von infektiösem NDV verwendet.
(B) Detailliertes Klonierungsverfahren für das Zusammensetzen von NDV-cDNA vollständiger Länge aus subgenomischen, überlappenden cDNA-Klonen. Cm bezeichnet das Chloramphenicol-Resistenz-Gen, welches zeitweise als phänotypischer Anhang eingebracht wurde (siehe Text für Details).
(C) Detailliertes Klonierungsverfahren für die Herstellung von genetisch modifizierter NDV-cDNA vollständiger Länge. Die Modifikation besteht aus 3 Nukleotidveränderungen, die in das F-Gen eingebracht wurden, und die zu der Modifikation der Aminosäuresequenz der proteolytischen Spaltstelle des F-Proteins führt (siehe Text für Details).

5.
(A) pOLTV535-Serie.
Die Transkription durch T7-RNA-Polymerase ergibt antigenomische RNA (oder [+]-RNA) die direkt von der Zelle in SEAP-Protein translatiert werden kann. Nach Infektion der Zelle mit Helfervirus (oder nach Co-Transfektion von Plasmiden, die für NP, P und L kodieren) wird die antigenomische RNA von dem viralen Polymerasekomplex für die Synthese von genomischer RNA (oder [-]-RNA) verwendet. Die genomische RNA wird dann von dem viralen Polymerasekomplex für die Synthese von mRNA (durch Verwendung der spezifischen Transkriptionsstart-Box [S] und der Transkriptionsende-Box [E]) und für die Synthese von antigenomischer RNA verwendet.
(B) pOLTV553-Serie.
Die Transkription durch T7-RNA-Polymerase ergibt genomische RNA (oder [-]-RNA), die nicht in SEAP-Protein translatiert werden kann. Nach Infektion der Zelle mit Helfervirus (oder nach Co-Transfektion von Plasmiden, die für NP, P und L kodieren) wird die genomische RNA von dem viralen Polymerasekomplex für die Synthese von mRNA (durch Verwendung der spezifischen Transkriptionsstart-Box [S] und der Transkriptionsende-Box [E]) und für die Synthese von antigenomischer RNA verwendet.
6.
Nukleinsäuresequenz-Alignment: die 5'-terminalen Enden von NDV-LaSota und anderen Paramyxoviren werden als Sequenzvergleich von NDV mit den 4 Mitgliedern der Gattung Rubulavirus, 3 Mitgliedern der Gattung Paramoxyvirus und 3 Mitgliedern der Gattung Morbillivirus gezeigt. Die Sequenzen werden ausgehend von der Ende-Box des L-Gens bis zum 5'-Ende (3'-5' cDNA) gezeigt. NDV, Newcastle-Krankheit-Virus; hPIV2, humanes Parainfluenzavirus 2; MuV, Mumpsvirus; SV5 und SV4X, Simianes Virus 5 bzw. 41; SeV, Sendaivirus; bPIV3 und hPIV3, bovines bzw. humanes Parainfluenzavirus; CDV, canines Staupe-Virus; MeV, Masernvirus; RPV, Rinderpest-Virus. Die Nukleotid (nt)-Sequenzen der gesamten Genome wurden wie folgt erhalten (Zugriffsnummern): NDV (AF077761); hPIV2 (X57559); MuV (AB000388); SV5 (AF052755); SV41 (X64275); bPIV3 (D84095); hPIV3 (Z11575); CDV (L13194); MeV (X16565); RPV (Z30697).
LITERATURHINWEISE

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TABELLE 1

TABELLE 1 (FORTSETZUNG)

P9371+	GCAGAATCCGTGACTCATGC	9371-9411
P9390+	ATAGCTACTGTATTCTCTGG	9392-9411
P9686+	TCACACGATATCATGTTGAG	9686-9705
P9799+	CACACCCTAACGATAATTGG	9801-9820
P10198+	ATAAGAAACGTATCACTGAC	10200-10219
P10601+	TTGTCGCGTTGCCTGTATGG	10603-10622
P11006+	GCAGACATACTTTGACTCTG	11008-11027
P11393+	TCCCTTATTGTCTGGAGTGC	11395-11414
P11798+	TGATACGATAGAACTCGTAG	11800-11819
L12000	CATATGTCGCCACATGTGAAGGCT	12008-12031
P12373+	CAACCAGGACATATGATGAG	12375-12394
P12796+	TCGACTGTTCTTACCAACTC	12798-12817
P12978+	CACACCAACTTGCAGATACG	12978-12997
P13236+	GAGTATCTACTGTCGGATGC	13238-13257
P13601+	ATACTTGTTCAGAGGAATAG	13603-13622
P13943+	GACCTGACCTCAGATAAAGC	13946-13965
P14002+	TATCATTGCTGCATTGTGAC	14004-14023

TABELLE 1 (FORTSETZUNG)

P360	GGCGATGTAATCAGCCTAGTGCTT	14756-14779
P14812+	ACTAAGGACATACTTGAAGC	14812-14831


P230-	CCGGGACTTCTACTTTTAAG	230-211
P998-	TTTGGATATCGCCTGAGAGG	998-979
P1898-	AAAGGTGGCCATGTTTGTCC	1898-1879
P2617-	TGATAGTCAACTTTACTTAC	2617-2598
P3328-	GCAGAATCAAAGTACAGCCC	3330-3311
P3610-	CTTGCCAACTCAACAAGATC	3612-3593
P3990-	GATTAGCATAGTATCCACTG	3992-3973
NDV3-M	TCTCCCCGGGGCAGCTTATTTCTT AAAAGGAT	4400-4368
P4593-	GACAGATGCAACTCAGTACC	4625-4606
P4618-(LS)	ATGCAACTCAGTACCAGCGC	4620-4601
P5390-	GTAGAGTTACCTGTATACCC	5411-5392
NDV3-F	ACTACCCGGGAAACCTTCGTTCCT CAT	6238-6212
P6710-(LS)	TCTCAGTTTTTAACAATGCC	6712-6693
P7093-(LS)	GTTGATGGAACGCAGAGTAG	7095-7076
P7522-(LS)	CTGCTGGATGCGTTTCCCAC	7524-7505
P367	AGGGACCTCAATACTAGCCAGTTC	8692-8666
P9905-	CTCTATCAAGAGGCGATTAG	9907-9888
P10320-	TAAGACAGTACTTTTGCAGG	10322-10303
P10684-	GATGCAACTGTGTCAACACC	10687-10706
P11122-	AATTGGGCAGGAGTCAGAAC	11124-11105
P11510-	TGCCTCCATGATAGCATGCG	11512-11493

TABELLE 1 (FORTSETZUNG)

P11903-	ATTGCTTGGAAGATGGAACC	11905-11836
P12717-	TGTCATACACTATTATGGCG	12719-12700
P13141	CAAAGAGTACCGTGTACAGACAGC ATAACC	13172- 13143
P13281-	GACATGATAGAGCTCACCTG	13302-13283
P14101-	ACGGAATGCATGGCAATCAG	14163-14144
P14522-	GCTCACCAAACTCTCTGCAC	14524-14505
P14687-	AGGATCTGTCTCGTGCACTG	14709-14690
P377	TTTCCTTAAGTTTGGTAATACCTA GGAC	14888- 14861
P359	CACCAAGTCGACAATTGGCCAGAA AAGGAG	15046- 15017
SNDV	ACCAAACAAAGATTTGGTGAATGA CGA	15186- 15159

Tabelle 2. Sequenz des 3'-terminalen Endes und des 5'-terminalen Endes vom Genom des NDV-Stamms LaSota A. Sequenz des 3'-terminalen Endes (gezeigt als 5'-Ende des antigenomischen DNA-Strangs)

Verfahren I.	Klon	Sequenz
	04	ACCAAACAGAGAATC
	05	ACCAAACAGAGAATC
	13	ACCAAACAGAGAATC
	21	ACCAAACAGAGAATC
Verfahren II.	Klon	Sequenz
	26	ACCAAACAGAGAATC
	28	ACCAAACAGAGAATC
	30	ACCAAACAGAGAATC
	31	GCCAAACAGAGAATC
	32	ACCAAACAGAGAATC
	33	ACCAAACAGAGAATC
	Konsensus	ACCAAACAGAGAATC

B. Sequenz des 5'-terminalen Endes (gezeigt als DNA)

pBluescriptII-TSK-Klone	Klon	Sequenz
	r3101-13	ACCAAACAAAGATTT
	r3101-14	ACCAAACAAAGATTT
	r3101-15	ACCAAACAAAGATTT
	r2601-17	ACCAAACAAAGATTT
	r2601-18	ACCAAACAAAGATTT
	r2601-19	ACCAAACAAAGATTT
	r2601-20	AACAAGGTGAAGATA
	r2601-21	ACCAAACAAAGATTT
PGEM4Z-Klone	Klon	Sequenz
	r3101-16	ACCAAACAAAGATTT
	r3101-17	ACCAAACAAAGATTT
	r3101-18	ACCAAACAAAGATTT
	r3101-19	ACCAAACAAAGATTT
	r3101-22	ACCAAACAAAGATTT
	Konsensus	ACCAAACAAAGATTT

Tabelle 3. Minigenom-Replikation durch NDV-Helfervirus A. SEAP-Aktivität (cps) nach Transfektion von CER-C9-Zellen mit der pOLTV535-Plasmidserie und der pOLTV553-Plasmidserie.

Plasmid	+NDV	-NDV	Verhältnis
pOLTV535N0	3.5 × 10⁴	7.1 × 10⁴	0.49
pOLTV535N1	5.9	12.1	0.49
pOLTV535N2	2.4	6.2	0.39
pOLTV535N3	7.6	5.2	1.46
pOLTV535N4	1.8	4.1	0.44
pOLTV535N5	1.5	3.0	0.50
pOLTV553N0	5.5 × 10³	9.6 × 10³	0.57
pOLTV553N1	9.6	27.6	0.35
pOLTV553N2	2.4	3.5	0.68
pOLTV553N3	15.1	9.5	1.59
pOLTV553N4	3.4	7.9	0.43
pOLTV553N5	2.9	4.8	0.60

B. SEAP-Aktivität (cps) nach Transfektion von FPV-T7-infizierten CER-Zellen mit der pOLTV553-Plasmidserie.

Plasmid	+NDV	-NDV	Verhältnis
pOLTV553N0	7.2 × 10⁴	8.3 × 10⁴	0.86
pOLTV5533N1	8.4	12.0	0.70
pOLTV553N2	8.9	12.6	0.71
pOLTV553N3	27.4	8.6	3.19
pOLTV553N4	9.7	10.4	0.93
pOLTV553N5	8.5	8.1	1.05

Tabelle 4. Transfer der SEAP-Aktivität (cps) nach Behandlung von CER-Zellen mit dem Überstand von FPV-T7-infizierten Zellen, die mit der pOLTV553-Plasmidserie transfiziert und mit NDV superinfiziert worden waren (siehe Tabelle 3).

Plasmid
pOLTV553N0	2.4 × 10³
pOLTV553N1	6.2
pOLTV553N2	2.0
pOLTV553N3	20.6
pOLTV553N4	2.0
pOLTV553N5	2.1

Tabelle 5. SEAP-Aktivität (cps) nach Co-Transfektion von CER-Zellen mit der pOLTV553-Plasmidserie sowie mit den Plasmiden pCIneoNP, pCIneoP und pCIneoL(c) (oder mit pCIneo als Negativkontrolle).

Plasmid	NP, P & L	NP, P & pCIneo	Verhältnis
pOLTV553N0	3.1 × 10⁴	2.7 × 10³	11.7
pOLTV553N1	4.1	5.2	7.9
pOLTV553N2	3.1	3.1	10.0
pOLTV553N3	35.9	3.6	100.8
pOLTV553N4	1.9	4.6	4.1
pOLTV553N5	1.0	4.1	2.5

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Vogel-Paramyxovirus-cDNA, die mindestens das 5'-terminale Ende des Genoms des Newcastle-Krankheit-Virus (Newcastle-Disease-Virus, NDV) umfasst, welches dem in 6 gezeigten 5'-terminalen Ende des NDV entspricht, und die die Herstellung einer infektiösen Kopie eines Vogel-Paramyxovirus ermöglicht.
cDNA gemäß Anspruch 1, die eine cDNA vollständiger Länge umfasst.
cDNA, die mindestens das 5'-terminale Ende des Genoms des NDV umfasst, welches dem in 6 gezeigten 5'-terminalen Ende des NDV entspricht, und die die Herstellung eines replizierenden Vogel-Paramyxovirus-Minigenoms ermöglicht.
cDNA gemäß einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, die zumindest teilweise vom Newcastle-Krankheit-Virus abgeleitet ist.
cDNA gemäß Anspruch 4, wobei das Newcastle-Krankheit-Virus ein lentogenes Virus ist, das vorzugsweise von einem Impfstamm abgeleitet ist.
cDNA gemäß Anspruch 5, wobei der Impfstamm ein LaSota Stamm ATCC VR-699 ist.
cDNA gemäß einem der Ansprüche 1-6, die zusätzlich mit einer durch genetische Modifikation erzeugten Modifikation in einer Nukleinsäure ausgestattet ist, wobei die cDNA das wie in Anspruch 1 spezifizierte 5'-terminale Ende umfasst.
cDNA gemäß Anspruch 7, wobei die Modifikation eine Nukleinsäure umfasst, die für eine modifizierte Proteasespaltstelle kodiert.
cDNA gemäß Anspruch 8, wobei die Spaltstelle eine Proteasespaltstelle des Fusions (F)-Proteins ist.
cDNA gemäß Anspruch 7, wobei die Modifikation eine Nukleinsäure umfasst, die für ein hybrides virales Hüllprotein kodiert.
cDNA gemäß Anspruch 10, wobei das Protein ein Hämagglutinin-Neuraminidase (HN)-Protein ist.
cDNA gemäß Anspruch 7, wobei die Modifikation eine Deletion in einer Nukleinsäure umfasst, die für ein virales Protein kodiert.
cDNA gemäß Anspruch 12, wobei das virale Protein ein Matrix (M)-Protein ist.
cDNA gemäß einem der Ansprüche 1-13, die zusätzlich mit einer Nukleinsäure ausgestattet ist, die für ein heterologes Antigen kodiert.
cDNA gemäß Anspruch 14, wobei das Antigen von einem Geflügelerreger abgeleitet ist.
RNA, die von einer cDNA gemäß einem der Ansprüche 1-15 erhalten wurde.
Verfahren zur Herstellung einer infektiösen Kopie eines Vogel-Paramyxovirus, bei dem man mindestens eine Zelle mit cDNA gemäß einem der Ansprüche 7-15 transfiziert.
Verfahren gemäß Anspruch 17, bei dem die Zelle zumindest in der Lage ist, virales Nucleocapsid (NP)-Protein, Phospho (P)-Protein oder großes Polymerase (L)-Protein zu exprimieren.
Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18, bei dem man ferner die Spaltung des Fusionsproteins des Virus erlaubt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17-19, bei dem man ferner die Zelle in Wachstumsmedium inkubiert, das eine proteolytische Aktivität umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 20, bei dem das Wachstumsmedium Allantoisflüssigkeit umfasst, welche die proteolytische Aktivität umfasst.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17-21, bei dem die Zelle von einer Hühnerzelle abgeleitet ist.
Infektiöses Vogel-Paramyxovirus, das ein heterologes Gen umfasst, und das durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 17-22 erhältlich ist.
Impfstoff, der ein Virus gemäß Anspruch 23 umfasst.
Impfstoff gemäß Anspruch 24, der einen Lebendimpfstoff umfasst.
Impfstoff gemäß Anspruch 24 oder 25, wobei die infektiöse Kopie des Vogel-Paramyxovirus von einem Newcastle-Krankheit-Virus (NDV) abgeleitet ist.
Verfahren zur Unterscheidung einer Probe von nicht geimpften Tieren oder Tieren, die mit einem NDV-Impfstoff geimpft wurden, von Proben von Tieren, die mit Wildtyp-NDV infiziert sind oder mit einem unmodifizierten oder lentogenen NDV Stamm geimpft wurden, bei dem man: in mindestens einer Probe der Tiere das Vorhandensein von Antikörpern bestimmt, die gegen ein immundominantes Epitop oder einen Marker des Wildtyps oder des unmodifizierten NDV, aber nicht des Impfstoffs gerichtet sind, wobei der NDV-Impfstoff ein Virus umfasst, das durch Transfizieren mindestens einer Zelle mit cDNA gemäß einem der Ansprüche 10 oder 11 erhalten wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 27, bei dem die Antikörper gegen das HN-Protein oder das F-Protein des NDV gerichtet sind.
Verfahren gemäß Anspruch 27 oder 28, bei dem das Tier aus der Gruppe bestehend aus Geflügel, vorzugsweise Hühnern, ausgewählt ist.
Infektiöses Vogel-Paramyxovirus gemäß Anspruch 23, wobei des heterologe Gen immunstimulatorische Proteine exprimiert.