KR100437888B1

KR100437888B1 - 뉴캐슬병 바이러스 검출용 프라이머 및 상기 프라이머를이용한 뉴캐슬병 바이러스 검출, 병원성 및 유전형 조사방법

Info

Publication number: KR100437888B1
Application number: KR10-2001-0045862A
Authority: KR
Inventors: 김선중; 권혁준; 조선희; 안영진; 설재구; 윤성준
Original assignee: 주식회사 인트론바이오테크놀로지
Priority date: 2001-07-30
Filing date: 2001-07-30
Publication date: 2004-07-03
Also published as: KR20030012022A

Abstract

본 발명은 뉴캐슬병(Newcastle disease) 바이러스 검출용 프라이머와 상기 프라이머를 이용한 뉴캐슬병 바이러스의 검출, 병원성 및 유전형 조사 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는서열번호 1및서열번호 2로 기재되는 뉴캐슬병 바이러스 검출용 프라이머 서열 및 상기 프라이머를 이용한 뉴캐슬병 바이러스의 검출방법,서열번호 3및서열번호 4로 기재되는 프라이머를 이용한 병원성의 조사방법, 상기 뉴캐슬병 바이러스 검출과 병원성을 동시에 수행한 뉴캐슬병 진단 및 RFLP(restriction fragment length polymorphism)를 이용한 뉴캐슬병 바이러스의 유전형 조사방법에 관한 것이다. 본 발명의 뉴캐슬병 바이러스 검출용 프라이머는 알려진 모든 종류의 뉴캐슬병 바이러스를 진단할 수 있으며, 병원성 조사 프라이머를 동시에 사용하여 뉴캐슬병 진단을 할 수 있고, 또한 정확한 뉴캐슬병 바이러스의 병원형과 유전형을 확인할 수 있다.

Description

뉴캐슬병 바이러스 검출용 프라이머 및 상기 프라이머를 이용한 뉴캐슬병 바이러스 검출, 병원성 및 유전형 조사방법{Primer for detection of Newcastle disease virus, and methods for detection, pathotyping and genotyping of the Newcastle disease virus using the same}

본 발명은 뉴캐슬병(Newcastle disease) 바이러스 검출용 프라이머와 상기 프라이머를 이용한 뉴캐슬병 바이러스의 검출, 병원성 및 유전형 조사방법에 관한 것으로서, 구체적으로는서열번호 1및 서열번호 2로 기재되는 뉴캐슬병 바이러스 검출용 프라이머 서열 및 상기 프라이머를 이용한 뉴캐슬병 바이러스의 검출방법,서열번호 3및서열번호 4로 기재되는 프라이머를 이용한 병원성의 조사방법 및 RFLP(restriction fragment length polymorphism)를 이용한 유전형 조사방법에 관한 것이다.

뉴캐슬병(Newcastle disease)은 가금에서 치명적이고 전염성이 강한 제 1종 가축 전염병으로 백신을 접종하지 않은 닭에 감염될 때는 100% 폐사율을 초래하며, 적절한 백신을 하지 않는 경우 호흡기 및 소화기 증상과 산란계에서 산란율 저하로 경제적인 피해를 일으키는 치명적인 질병이다. 매년 발생주의보를 발표하고 있으나 발생이 계속 증가하고 전국적으로 발생되는 추세에 있으며 양계 농가에 큰 피해를 주고 있다. 뉴캐슬병의 주요증상은 처음에는 졸기 시작하여 콧물, 기침 등의 호흡기 증상이 나타나고 녹색설사를 하다 죽는다. 또한, 적절한 백신을 하지 않은 경우 백신 항체가가 낮은 산란계나 종계는 산란율이 떨어지거나 중지되기도 하고 예방 접종을 했더라도 접종 시기나 방법이 잘못되어 항체가가 높지 않은 닭에서는 다리와 목이 마비되는 신경증상이 나타기도 한다.

한국은 일본의 연구자들에 의해 1920년대부터 뉴캐슬 바이러스에 대해 연구를 하였고, 동남아시아 유래의 바이러스가 영국에 전파되어 서양에 처음으로 알려진 후 현재 전 세계적인 발병이 보고되고 있다.

뉴캐슬병 바이러스는 단일 가닥(single stranded) RNA 바이러스로 루버라바이러스 속(Rubulavirus genus)에 속한다. 뉴캐슬병 바이러스는 엔벨롭(envelope)을 가지고 있으며 엔벨롭에는 바이러스가 숙주 세포에 결합할 수 있도록 해주는 HN(Haemagglutinin-Neuraminidase) 단백질과 엔벨롭과 숙주 세포의 융합을 일으키는 F(Fusion) 단백질이 있다. F 단백질과 HN 단백질은 글리코단백질(glycoprotein)로서 엔벨롭의 표면에 분포되어 있다.

F 단백질은 Ⅰ형 막 글리코단백질(type Ⅰ membrane glycoprotein)로써 삼합체(trimeric) 구조를 형성한다(Russell et al.,Virology, 1994, 199: 160-16). F 단백질은 비활성 전구체 형태(F0)로 만들어지고 골지 막(Golgi membranes)을 통해 이동하는 동안 활성 형태인 F1과 F2로 잘리게 된다(Morrison , T., and A. Portner,Structure, function, and intracellular processing of the glycoproteins of Paramyxoviridae, 1991, 347-375). 이러한 과정은 F1 소단위체(subunit)의 아미노 말단에서 소수성 도메인(domain)을 노출시키고 이것은 성숙한 단백질의 생물학적 활성에 중요한 역할을 한다(Scheid and Choppin,Virology, 1974, 57: 470-490; Scheid and Choppin,Virology, 1978, 80: 51-66). 융합 펩티드(fusion peptide)라 불리는 소수성 도메인은 파라믹소바이러스(paramyxovirus) F 단백질에서 매우 보존되어 있고 막 융합을 매개하는데 직접적으로 관여하고 있을 것이라 여겨지고 있다(Lamb,Virology, 1993, 197: 1-11). 파라믹소바이러스 F 단백질은 7개 반복(heptad repeats)을 포함하고 알파 헬릭스 구조를 형성할 가능성이 있는 두 지역을 포함하는 여러 개의 공통된 구조 형태를 갖고 있다(Lamb,Virology, 1993, 197: 1-11). 두 반복중 가장 긴 7개 반복 A(heptad repeat A)는 F1의 아미노 말단에서 소수성 융합 펩티드와 인접해 있으며, 7개 반복 B는 관통막(transmembrane) 지역의 윗부분에 밀착하여 있다. 7개 반복 B는 매 7개 잔기마다 매우 보존된 루이신 혹은 이소루이신의 연속으로 구성되어 있다(Buckland and Wild,Nature, 1989, 338: 547).

HN 단백질은 Ⅱ형 막 글리코단백질(type Ⅱ membrane glycoprotein)로 바이러스 엔벨롭의 표면에서 4합체(tetramer)를 형성하여 세포막에 침투한다(Ng et al.,J. Cell. Biol., 1989, 109: 3273-3289). HN 단백질은 비리온(virion)이 글리코접합(glycoconjugates)의 시알산(sialic acids)에 결합함으로써 호스트 세포 표면에 위치시키는 기능을 한다. HN 단백질은 관통막(transmembrane) 도메인, 줄기(stalk) 도메인 및 구형(globular) 도메인의 세 지역으로 나뉜다. 항원성인 수용체 결합과 뉴라미니다제(neuraminidase) 활성 위치는 모두 구형 도메인에 위치해 있다. 융합 유도 활성은 줄기 도메인에 위치해 있고 이것은 F 단백질과 상호작용 한다(Sergei et al.,Viorology, 1993, 193: 717-726). 줄기 도메인은 예상되는 형태로 α-헬릭스와 함께 2개의 7개 반복 지역 A(74-88 위치)와 7개 반복 지역 B(96-110 위치)를 갖고 있다. 또한, 구조를 파괴하는 어떤 돌연변이도 수용체 결합과 뉴라미니다제 활성을 감소시키는 원인이 된다는 보고가 있다(Stone-Hulslander and Morrison,J. Virol., 1999, 193: 717-726).

뉴캐슬병 바이러스는 비병원성부터 강병원성까지 다양한 병원성을 갖는 바이러스이다. 이들의 생물학적 성질을 연구하려는 시도가 많이 진행되어 왔고 그 예로, 플라크 형성 능력, 플라크의 크기 등이 병원성과 관계가 있다는 보고가 있다(Hanson et al.,Avian Dis., 1967, 11: 49-53; Daniel et al.,Avian Dis., 1968, 12: 423-33; Schloer et al.,Am. J. Vet. Res., 1968, 29:883-95; Reeve etal.,J. Hyg(Lond), 1970, 68: 61-69). 또한 최근의 연구 결과에 의하면 뉴캐슬병 바이러스의 병원성의 차이는 바이러스의 엔벨롭(envelope)과 숙주세포의 세포막을 융합시키는 F 단백질의 절단위치의 아미노산 서열 차이에 의한 것으로 알려져 있다. 서로 다른 배 기원(embryological origin)의 세포의 F 단백질과 HN 단백질의 단백질 분해 절단능력(proteolytic cleavability)에 대해 연구한 결과 강병원성의 뉴캐슬병 바이러스 균주의 F 단백질과 HN 단백질은 세포내 프로테아제(protease)에 의해 잘려져 활성형을 가지나 비병원성 균주는 잘려지지 않아 비활성형을 갖게 되어 주변세포로의 재감염이 일어나지 않게 된다(Nagai et al.,Virology, 1976, 72: 494-508). 또한, F 단백질 유전자의 염기서열을 분석하고, 병원성 균주의 단백질 분해 절단 위치(proteolytic cleavage site)의 아미노산 서열을 분석한 결과 비병원성 뉴캐슬병 바이러스 균주와는 다르다는 것을 알게 되었다(Collins et al.,Arch. Virol., 1993, 128: 363-370).

HN 단백질은 아미노산의 숫자에 따라 세가지 형으로 나누는데, 강병원성 주(velogenic)와 중병원성 주(mesogenic)는 571 아미노산의 HN 단백질을 갖고 있고 약병원성 주(lentogenic)는 577 아미노산의 HN 단백질을 갖는다. 비병원성 균주는 616 아미노산의 비활성 형태의 HN 단백질을 갖고 있다. HN 단백질의 완전한 기능을 위해서는 단백질 분해 절단이 필요하다(Nagai and Klenk, 1977).

역학 조사에 의한 F 단백질의 절단위치와 병원성에 대한 상호 관계를 연구한 결과, 절단 위치가 병원성 균주의 절단 위치로 대치된 라소타(La Sota) 균주의 경우 유전적으로 표지된 변이체의 ICPI(Intracerebral pathogenicity index, 뇌내병원성지수: 어린 병아리의 뇌 내로 뉴캐슬병 바이러스를 접종하여 임상증상 및 폐사 유무를 수치화하여 병원성을 평가하는 지수로 0에서 2까지의 지수로 표시하며 수치가 높을수록 강병원성 바이러스이다)가 갑작스럽게 증가하는 것을 알게되었다(Peeters et al.,J. Virol., 1999, 73: 5001-9). 뉴캐슬병 바이러스의 다양한 병원성이 하나의 메카니즘에 의해서만 설명되지는 않지만 F 단백질의 절단 능력이 병원성을 측정하는데 중요한 역할을 하고 있다.

현재까지 여러 연구자들이 시험관 내에서(in vitro) 뉴캐슬병 바이러스의 병원성을 조사하는 방법을 개발해 왔다. 아미노산 차이에 의한 염기서열의 차이를 이용하여 병원형 특이(pathotype-specific) 올리고-DNA 탐침(probe) 또는 F 단백질의 절단 위치에 해당하는 항체를 도트-블랏 혼성화에 이용하여 병원성 균주와 비병원성 균주의 차이를 확인하는 방법이 개발되었고, 최근에는 형광 물질과 켄처(quencher)를 표지한 안쪽 탐침을 이용하여 리얼-타임(real-time) PCR 하는 방법도 보고되었다. 하지만 상기와 같은 병원성 조사 방법은 많은 비용과 시간을 필요로 하기 때문에 좀 더 간단하고 시간을 줄일 수 있는 진단 방법의 개발이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 뉴캐슬병 바이러스에 공통적으로 존재하는 프라이머 서열을 이용하여 모든 종류의 뉴캐슬병 바이러스를 검출할 수 있으며 또한 병원성 및유전형을 정확하게 확인할 수 있는 방법을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 뉴캐슬병 바이러스 검출용 프라이머 서열, 상기 프라이머를 이용한 뉴캐슬병 바이러스의 검출, 병원성 및 유전형 조사방법을 제공하는 것이다.

도 1은 RT-PCR에 의해 뉴캐슬병 바이러스를 검출하여 뉴캐슬병 바이러스 특이 밴드(120 bp)를 검출한 전기영동 사진이고,

1 ; 울스터, 2 : 라소타, 3 : SNU8050, 4 : SNU80143,

5 : SNU8419, 6 : SNU8426, 7 : SNU8465, 8 : SNU8490,

9 : SNU8550, 10 : SNU8557, 11 : SNU8559, 12 : SNU8566,

13 : SNU85135, 14 : SNU8861, 15 : SNU8871, 16 : SNU8876,

17 : SNU8887, 18 : SNU88139, 19 : SNU88147, 20 : SNU9033,

21 : SNU90111, 22 : SNU9222, 23 : SNU9227, 24 : SNU9229,

25 : SNU9257, 26 : SNU9275, 27 : SNU9280, 28 : SNU9282,

29 : SNU9283, 30 : SNU9284B, 31 : SNU92105, 32 : SNU9358GG,

33 : SNU9358GS, 34 : SNU9515, 35 : SNU9550, 36 : SNU9575,

37 : SNU9586, 38 : SNU9598, 39 : SNU95107, 40 : SNU95124,

41 : SNU96130, 42 : SNU9969, 43 : SNU9970, 44 : SNU9983,

도 2는 다중 RT-PCR에 의해 뉴캐슬병 바이러스의 검출과 병원성 조사를 동시에 수행하여 뉴캐슬병 바이러스 특이 밴드(120 bp) 또는 병원성 특이 밴드(201 bp)를 검출한 전기영동 사진이고,

1 ; SNU9139, 2 : SNU9222, 3 : SNU9227, 4 : SNU9257,

5 : SNU9275, 6 : SNU9276S, 7 : SNU9280, 8 : SNU9282,

9 : SNU9283, 10 : SNU9284B, 11 : SNU9358GG, 12 : SNU9358GS,

13 : SNU92105, 14 : SNU9550, 15 : SNU9575, 16 : SNU9586,

17 : SNU9598, 18 : SNU95124, 19 : 라소타, 20 : 울스터,

21 : SNU9515, 22 : SNU96130, M : 분자 마커,

도 3은 제한효소 HinfⅠ과 PstⅠ을 이용하여 RFLP 분석에 의한 뉴캐슬병 바이러스 균주의 유전형을 조사한 전기영동 사진이고,

1 ; 울스터, 2 : 라소타, 3 : SNU8426, 4 : SNU8490,

5 : SNU8861, 6 : SNU8876, 7 : SNU8897, 8 : SNU88139,

9 : SNU90111, 10 : SNU9222, 11 : SNU9227, 12 : SNU9229,

13 : SNU9257, 14 : SNU9275, 15 : SNU9280, 16 : SNU9282,

17 : SNU9283, 18 : SNU9284, 19 : SNU92105, 20 : SNU9358GG,

21 : SNU9358GS, 22 : SNU9515, 23 : SNU9550, 24 : SNU9575,

25 : SNU9586, 26 : SNU9598, 27 : SNU95107, 28 : SNU95124,

29 : SNU96130, 30 : SNU9969, 31 : SNU9970, 32 : SNU9971,

33 : SNU8050, 34 : SNU80143, 35 : SNU8419, 36 : SNU8465,

37 : SNU8550, 38 : SNU8557, 39 : SNU8559, 40 : SNU8566,

41 : SNU85135, 42 : SNU8871, 43 : SNU88147, 44 : SNU9033,

M : 분자 마커,

도 4는 클러스탈(Clustal) 프로그램을 이용하여 결정된 뉴캐슬병 바이러스의 comHN(nt 658-736)의 서열 짝 거리(sequence pair distance)를 나타낸 것이고,

도 5는 이웃 결합 방법(neighbor joining method)에 의해 HN 단백질 유전자의 뉴클레오티드 658-736 부분의 염기서열을 토대로 하여 제작한 계통수이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 뉴캐슬병 바이러스 검출용 프라이머 서열 및 상기 프라이머 서열을 이용한 뉴캐슬병 바이러스의 검출방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 뉴캐슬병 바이러스의 검출과 병원성 조사를 동시에 수행하여 뉴캐슬병의 진단방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 뉴캐슬병 바이러스의 유전형 조사 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 뉴캐슬병 바이러스 검출용 프라이머 서열 및 상기 프라이머 서열을 이용한 뉴캐슬병 바이러스의 검출방법을 제공한다.

본 발명의 뉴캐슬병 바이러스 검출용 프라이머 서열은서열번호 1과서열번호 2로 기재된다.

뉴캐슬병 바이러스는 RNA 바이러스로서 RNA-의존 RNA 중합효소에 교정(proofreading) 기능이 없기 때문에 오류율이 DNA 바이러스에 비해 비교적 높다. 따라서 뉴캐슬병 바이러스 균주에서 F 단백질과 HN 단백질 유전자의 유전적 분기(genetic divergence)는 5-18%에 이르고 이는 매 20 뉴클레오티드당 1-4 뉴클레오티드가 바뀌는 것과 같다. 뉴클레오티드의 치환은 위치를 가리지 않고 일어나기 때문에 20 개 정도의 뉴클레오티드를 갖는 프라이머가 미스매칭 없이 어닐링하기는 매우 힘들다. 또한, 다른 유전형간의 F 단백질과 HN 단백질 유전자의 염기서열 유사성이 10% 정도 밖에 안되기 때문에 모든 한국 뉴캐슬병 바이러스 균주에서 보존된 부위를 찾는 것은 매우 힘들다. 그러나 한국 균주의 경우에는 두 개의 독특한 유전형(Ⅵf와 Ⅶa)으로 나뉘고 각각의 유전형별로 균주들의 염기서열 유사성이 98-100%로 매우 높은 것으로 나타났다.

이에, 본 발명자들은 모든 뉴캐슬병 바이러스 균주를 검출할 수 있는 프라이머를 제작하기 위하여 한국 뉴캐슬병 바이러스의 HN 단백질 유전자 서열 데이터를 기초로 하여 균주들 사이의 보존된 부분을 찾았고 상기 보존된 두 부분을 이용하여서열번호 1로 기재되는 comHNF와서열번호 2로 기재되는 comHNR 프라이머 세트를 제작하였다.

본 발명자들은 상기서열번호 1및서열번호 2로 기재되는 프라이머가 효과적으로 뉴캐슬병 바이러스를 검출할 수 있는지 확인하기 위하여, 먼저 1980년부터 2000년 사이의 닭들로부터 뉴캐슬병 바이러스 균주를 분리하였으며 상기 프라이머서열을 이용하여 뉴캐슬병 바이러스 균주를 검출하였다.

그 결과, 상기서열번호 1과서열번호 2로 기재되는 프라이머 서열(comHNF/comHNR)은 최근의 한국 뉴캐슬병 바이러스 균주뿐만 아니라 외국의 뉴캐슬병 바이러스 균주도 검출할 수 있었다. 따라서서열번호 1과서열번호 2로 기재되는 본 발명의 뉴캐슬병 바이러스 검출 프라이머는 한국과 외국의 모든 뉴캐슬병 바이러스 균주를 검출하는데 사용될 수 있다(도 1참조).

본 발명의 뉴캐슬병 바이러스 검출용 프라이머 서열은서열번호 1과서열번호 2로 기재되고, 뉴캐슬병 바이러스의 병원성 조사 프라이머 서열은서열번호 3및서열번호 4로 기재된다.

본 발명은 상기 뉴캐슬병 바이러스 검출용 프라이머와 병원성 조사 프라이머를 동시에 사용하여 뉴캐슬병 진단방법을 제공한다.

PCR 산물의 효과적인 증폭을 위해서는 프라이머와 타겟 서열의 상동성이 매우 중요하다. 프라이머의 3'-말단에 존재하는 G-T, C-T, A-T 등의 미스매치에 따라 200, 1,400, 2,500배 정도 DNA 합성 효율이 떨어진다(Pertruska et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1988, 85: 6252-6). 강병원성의 뉴캐슬병 바이러스 균주의 F와 HN 단백질은 세포내 프로테아제(protease)에 의해 잘려져 활성형을 가지나비병원성 균주는 잘려지지 않아 비활성형을 갖게 되어 주변세포로의 재감염이 일어나지 않게 된다(Nagai et al.,Virology, 1976, 72: 494-508).

이에, 본 발명자들은 뉴캐슬병 바이러스의 병원성을 조사하기 위하여 뉴캐슬병 바이러스 균주들의 F 유전자의 절단 부위 염기서열을 비교 분석하여 단지 병원성 균주에만 어닐링하는서열번호 3과서열번호 4로 기재되는 프라이머 세트를 제조하였다.서열번호 3으로 기재되는 센스 프라이머(Pt)는 가운데 부분을 변성(degeneracy)으로 제작하여 한국 뉴캐슬병 바이러스 균주들에 적합하도록 만들었다.

본 발명자들은 상기서열번호 3과서열번호 4로 기재되는 프라이머 세트를서열번호 1과서열번호 2로 기재되는 프라이머 세트와 한 튜브에서 반응하도록 하여 뉴캐슬병 바이러스 검출과 뉴캐슬병 바이러스의 병원성 조사를 동시에 수행하는 다중(multiplex) RT-PCR을 실시하여 뉴캐슬병을 진단하였다.

그 결과, 병원형 특이 프라이머 세트의 증폭성은 단지 유전형 Ⅵf의 야생형 균주에만 적합하였고, 뉴캐슬병 바이러스-특이 프라이머와 뉴캐슬병 바이러스의 병원성 조사 프라이머를 포함하는 다중 RT-PCR은 균주의 병원성에 따라 하나 혹은 두 개의 밴드로 나타나 뉴캐슬병 바이러스 검출과 병원성 조사를 동시에 수행하여 뉴캐슬병 진단을 할 수 있었다(도 2참조).

본 발명자들은 RFLP(restriction fragment length polymorphism)의 원리를이용하여 뉴캐슬병 바이러스의 유전형을 조사하는 방법을 제공한다. 구체적으로,서열번호 1과서열번호 2로 기재되는 프라이머를 통해 증폭된 HN 단백질 유전자의 보존된 부위의 PCR 산물을 제한효소로 절단한 후 RFLP를 조사함으로써 뉴캐슬병 바이러스 유전형을 조사하는 방법을 제공한다.

최근의 야생형 균주는 적어도 HinfⅠ 또는 PstⅠ 인식부위를 포함하고 있고 이 제한 효소에 의해 잘린 절편은 원래의 절편보다 젤 상에서 빨리 움직인다. 따라서 젤 상에서 원래의 절편이 사라진 것은 야생형 균주로부터 증폭된 앰플리콘임을 의미한다(도 3참조).

제한효소 분석이 간단함에도 불구하고 제한효소 인식부위에서 하나의 염기가 바뀌면 다른 밴드 패턴을 나타내고 이것은 잘못된 결과를 나타낸다. 1980년과 1985년 사이의 야생형 균주는 백신 균주와 동일한 밴드 패턴을 나타나므로 이들은 백신 균주로 여겨진다. 그러나서열번호 1과서열번호 2로 기재되는 comHNF/comHNR 프라이머에 의해 증폭된 뉴캐슬병 바이러스 특이 절편(comHN)의 염기서열을 기초로 하면 이들은 야생형 균주로 분류된다. 이들을 염기서열 분석을 하면 comHNF/comHNR에 의해 증폭된 부위의 염기 분기(divergence)는 0-6.5%이고(도 4참조) 뉴캐슬병 바이러스 균주 사이에서 높은 상동성을 보여준다. 따라서, comHN의 아미노산 서열은 뉴캐슬병 바이러스 균주 사이에서 100% 동일하고 이 부위는 HN 단백질의 기능 또는 구조에 매우 중요함을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 뉴캐슬병 바이러스의 검출

<1-1> 프라이머 제작

뉴캐슬병 바이러스 균주를 모두 검출할 수 있는 프라이머를 제작하기 위해 균주들 사이의 보존된 부분을 찾고자 F 단백질과 HN 단백질의 유전자를 비교하였고, 그 중 HN 단백질 유전자에서 보존된 두 부분을 찾았다.

구체적으로,서열번호 18내지서열번호 24로 기재되는 뉴캐슬병 바이러스의 서로 다른 균주의 HN 단백질 염기서열을 비교분석하고, 상기 서열 중 보존된 두 부분을 이용하여서열번호 1(comHNF)과서열번호 2(comHNR)로 기재되는 프라이머를 제작하였다. 상기 프라이머의 염기서열을 GenBank에 있는 다른 균주의 유전자와 비교해 보면 대부분의 뉴캐슬병 바이러스 균주에서 100% 동일하였다. 상기 프라이머 세트의 염기서열은 닭 세포와 미생물총(microflora)의 유전자 같은 검체에 있을 것이라 생각되는 비-뉴캐슬병 바이러스 유전자에서 상동성이 없고, 다른 조류 질병 바이러스와도 상동성이 없었다.

<1-2> 바이러스의 분리

뉴캐슬병 바이러스 균주는 1980년부터 2000년 사이의 닭으로부터 표준적인방법(Alexander, 1989)에 의해 분리하였다. 바이러스를 분리하기 위하여 호흡관(trachea), 전위(proventriculus), 소장(small intestine) 및 맹장편도(cecal tonsil)와 같은 출혈성 외상의 샘플을 사용하였다. 상기 분리한 바이러스를 10% BCS(bovine calf serum, Gibco/BRL, Grand Island, NY)를 첨가한 DMEM(Gibco/BRL, Grand Island, NY)에서 키운 계배(chicken embryo) 간 혹은 신장 세포의 일차 배양액(primary culture)에 접종하고, 세포들은 5% CO₂, 37℃ 습윤에서 항온 배양하였다. 융합세포(syncytia)를 관찰한 후에 상층액을 9-10일된 SPF 계배(Sunrise Co., NY)의 요막강(allantoic cavity)에 접종하고 요막액(allantoic fluids)을 회수하였다. 상기 회수한 요막액은 닭 적혈구 세포의 응집반응(agglutination)과 박테리아 감염을 테스트하였다. 그 결과, 본 발명자들은 여러 종류의 뉴캐슬병 바이러스 균주를 분리하였다(표 1).

균 주	농장 위치	임상 증세^**
SNU8050	-^*	-
SNU80108	-	-
SNU80143	-	-
SNU8419	평택	RS
SNU8426	주내	RS
SNU8465	인천	NS
SNU8490	화성	RS,HA(Tra & SI)
SNU8550	수원	ATM
SNU8557	화성	RS, NS
SNU8559	용인	RS
SNU8566	안성	HA Prov. CT
SNU85135	화성	NS
SNU0021	용인	RS, HA(EL, Tra & SI)
SNJ0036	여주	HA(Prov, CT, SI & Tra)

* : 정보 없음

** : NS(신경 증상), RS(호흡기 증상), HA(출혈), Prov(전위), EL(눈꺼풀), Tra(호흡관), ATM(위축 흉선), SI(소장), CT(맹장편도)

<1-3> RT-PCR에 의한 뉴캐슬병 바이러스 검출

상기 실시예 <1-1>의 프라이머 세트가 특이성을 나타내는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 실시예 <1-2>에서 분리한 뉴캐슬병 바이러스 및 1980년대 초의 한국 뉴캐슬병 바이러스 균주를 포함하여 RT-PCR 반응을 실시하였다.

바이러스 게놈 RNA는 산-구아니딘-페놀(acid-guanidinium-phenol) 방법(Chomzinski and Sacci, 1985)에 의해 요막액으로부터 추출하였다. 구체적으로 요막액 100 ㎕를 1 ㎖의 TRI 반응물(MRC co., MA)에 첨가하여 추출하고 RNA 침전물을 DEPC(0.1% diethyl pyrocarbonate)-처리된 DW 50 ㎕로 용해시켰다.

상기에서 추출한 RNA 1 ㎕, 랜덤 헥사머(random hexamer, 20 ng/㎕) 1 ㎕, 5x 1^st가닥 버퍼 2 ㎕, DEPC-처리된 DW 4.5 ㎕를 잘 섞어서 72℃에서 15분간 반응시키고 얼음에 냉각하였다. dNTPs(Bioneer co., Korea) 1 ㎕와 역전사 효소(Superscript Ⅱ, Gibco, BRL) 0.5 ㎕를 상기 반응물에 첨가하여 42℃에서 60분간 반응시키고 역전사 효소는 94℃에서 5분 동안 처리하여 불활성화 시켰다. 4배 희석한 cDNA 1 ㎕, 10x PCR 버퍼 2.5 ㎕, 2.5 mM dNTPs 1 ㎕, 뉴캐슬병 바이러스 진단 프라이머(5 pmol/㎕ 농도의서열번호 1(comHNF)과서열번호 2(comHNR)로 기재되는 프라이머) 0.5 ㎕, Taq 중합효소(Bioneer co., 1 U/㎕) 1 ㎕ 및 DW 17.5㎕를 혼합하였다. 상기 반응액을 94℃에서 4분간 변성시킨 후 94℃ 20초, 55℃ 15초, 72℃ 20초로 35번 반복 실시하고 난 뒤 72℃에서 7분간 더 반응시켰다. PCR 산물은 2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 EtBr로 염색하여 관찰하였다.

상기서열번호 1과서열번호 2로 기재되는 프라이머 세트(comHNF/comHNR)를 사용하여 RT-PCR을 수행한 결과, 뉴캐슬병 바이러스 균주는 120 bp에서 하나의 밴드만 관찰되었다(도 1). 또한 상기 프라이머는 최근의 한국 뉴캐슬병 바이러스 균주 뿐만 아니라 외국의 뉴캐슬병 바이러스 균주 대부분도 검출하였다. 따라서 이 프라이머 세트는 한국과 외국의 모든 뉴캐슬병 바이러스 균주를 검출하는데 사용될 수 있다.

<실시예 2> 다중 RT-PCR에 의한 뉴캐슬병 바이러스 진단과 병원성 조사(pathotyping)

<2-1> 프라이머 제작

병원성 조사의 효율을 높이기 위해 본 발명자들은서열번호 5내지서열번호 17로 기재되는 뉴캐슬병 바이러스의 서로 다른 균주의 F 단백질 염기서열을 기초로서열번호 3과서열번호 4로 기재되는 프라이머를 제작하였다.

상기 프라이머의 염기서열을 상기 표 1에 기재된 뉴캐슬병 바이러스 균주와 기타 한국 뉴캐슬병 바이러스 균주들의 염기서열과 비교한 결과,서열번호 3으로 기재되는 센스 프라이머(Pt)는 가운데 부분을 변성(degeneracy)으로 제작하여 대부분의 한국 뉴캐슬병 바이러스 균주들에 적합하였다. 그러나 SNU95119와 SNU95124의 경우는 3'-말단의 2번째 뉴클레오티드에서 미스매치(mismatch, C/T)되어 있었다.서열번호 4로 기재되는 앤티센스 프라이머(I-1)는 1995년 이전에 추출한 한국 뉴캐슬병 바이러스 균주들과 100% 일치하였고, 1995년 이후에 추출한 한국 뉴캐슬병 바이러스 균주들과는 9번째(C/A)와 16번째(C/T) 뉴클레오티드가 미스매치되어 있었다.

<2-2> 다중 RT-PCR에 의한 뉴캐슬병 바이러스 검출, 병원성 조사 및 뉴캐슬병 진단

바이러스 게놈 RNA는 상기 실시예 <1-3>과 동일한 방법으로 추출하였고, 추출한 RNA를 이용하여 상기 실시예 <1-3>과 동일한 방법으로 역전사 반응을 실시하였다. 상기 반응액을 4배 희석한 cDNA 1 ㎕, 10x PCR 버퍼 2.5 ㎕, 2.5 mM dNTPs 1 ㎕, 병원성 조사 프라이머(10 pmol/㎕ 농도의서열번호 3(Pt)과서열번호 4(I-1)로 기재되는 프라이머) 1 ㎕, 뉴캐슬병 바이러스 진단 프라이머(5 pmol/㎕ 농도의서열번호 1(comHNF)과서열번호 2(comHNR)로 기재되는 프라이머) 0.5 ㎕, Taq 중합효소(Bioneer co., 1 U/㎕) 1 ㎕ 및 DW 16.5 ㎕를 혼합하였다. 상기 반응액을 94℃에서 4분간 변성시킨 후 94℃ 20초, 50℃ 15초, 72℃ 20초로 35번 반복하여 PCR을 실시한 후 72℃에서 7분간 더 반응시켰다. PCR 산물은 2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 EtBr로 염색하여 관찰하였다.

그 결과, 어닐링 온도를 55℃로 했을 때는 본 발명의 프라이머의 변성(degeneracy)과 미스매치로 인하여 1995년 이후 분리한 균주에서는 병원형 특이 앰플리콘(amplicon)은 없고 단지 뉴캐슬병 바이러스 특이 앰플리콘만 나타났고,어닐링 온도를 50℃로 낮췄을 때는 두 앰플리콘 모두 나타났다. 또한 병원성 특이 프라이머 세트의 증폭성은 단지 유전형 Ⅵf의 야생형 균주에서만 적합하였다.

또한, 다중 RT-PCR에 의해 모든 뉴캐슬병 바이러스는 120 bp에 해당하는 밴드가 나타났고, 균주가 병원성이 있으면 201 bp에서 또 하나의 밴드가 나타났고 병원성이 없으면 밴드가 나타나지 않으므로, 본 발명의 프라이머 세트를 사용한 다중 RT-PCR에 의해 뉴캐슬병 바이러스 검출과 병원성 조사를 동시에 수행하여 뉴캐슬병을 진단할 수 있다(도 2).

<실시예 3> RT-PCR-RFLP에 의한 유전형 조사(Genotyping)

본 발명자들은서열번호 18내지서열번호 24로 기재되는 뉴캐슬병 바이러스의 서로 다른 균주의 HN 단백질 염기서열을 비교분석하고, 상기 서열 중 보존된 부위의 서열 데이터를 이용하여 제한효소 인식 부위를 예측하고(MacDNAsis, Ver. 3.1), 두가지 제한효소 HinfⅠ과 PstⅠ을 RFLP용으로 선택한 후 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 얻은 RT-PCR 산물을 RFLP 분석을 위해 사용하였다.

제한효소 반응은 NE 버퍼 2(NEB Inc., Beverly, MA, USA) 1.2 ㎕와 HinfⅠ과 PstⅠ(NEB Inc., 10 U/㎕) 0.1 ㎕를 PCR 산물 11 ㎕에 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켜 실시하였다. 뉴캐슬병 바이러스 특이 프라이머 세트에 의해 증폭된 PCR 산물은 매우 짧기(120 bp) 때문에 제한효소에 의해 잘려진 절편은 15% 폴리아크릴아미드 젤에서 200 V로 2시간 동안 전기영동한 후 은 염색법을 실시하였다(Bassam et al., 1991). 구체적으로, 젤을 DW로 간단히 세척한 후 1% 질산(nitric acid)에서 5분 동안 반응 후 다시 DW로 세척하고 질산은(silver nitrate, 1.5 g/L)에 20분 동안 담궈 두었다가 DW로 두 번 세척하고 마지막으로 밴드가 보일 때까지 젤을 탄산나트륨(sodium carbonate 29 g/L, 포르말린 500 ㎕)에 넣어 두었다.

두개의 참고 백신 균주를 포함하는 균주들을 RT-PCR-RFLP에 의해 유전형 분석을 실시한 결과, 두 개의 참고 백신 균주를 포함하여 상용 닭에서 분리한 백신 균주(SNU9515, SNU96130)와 1985년 이전의 야생형 균주에서는 잘리지 않은 120 bp의 밴드가 나타났다. SNU90111은 HinfⅠ에 의해 잘려져서 두 개의 밴드(62 bp, 58 bp)로 나타나고, SNU88139, SNU88147, SNU9033, SNU9550, SNU9575, SNU9586, SNU95107 및 SNU95124는 PstⅠ 인식 부위만 포함하므로 77 bp와 43 bp의 두 밴드가 관찰되었다. 그러나 SNU8861, SNU8871, SNU9222, SNU9227, SNU9229, SNU9257, SNU9280,SNU9282, SNU9283, SNU9284B, SNU92105, SNU9358GG, SNU9358GS, SNU9598, SNU9969, SNU9970 및 SNU9971은 HinfⅠ과 PstⅠ두개의 인식 부위를 포함하므로 62 bp, 43 bp 및 15 bp 절편이 생성되었다(표 2,도 3; 15 bp는 도면에서는 보이지 않음).

제한 효소	균주	밴드 위치
HinfⅠ(-)/PstⅠ(-)	울스터, 라소타, SNU8050, SNU80143, SNU8419, SNU8426, SNU8550, SNU8465, SNU8490, SNU8557, SNU8559, SNU8566, SNU85135, SNU9515, SNU96130, SNU9983, SNU8876, SNU8887	120bp
HinfⅠ(-)/PstⅠ(+)	SNU88139, SNU9550, SNU88147, SNU9033, SNU9575, SNU9586, SNU95107, SNU95124	77bp/43bp
HinfⅠ(+)/PstⅠ(-)	SNU90111	58bp/62bp
HinfⅠ(+)/PstⅠ(+)	SNU8861, SNU8871, SNU9222, SNU9227, SNU9229, SNU9257, SNU9280, SNU9282, SNU9283, SNU9284B, SNU92105, SNU9358GG, SNU9358GS, SNU9598, SNU9969, SNU9970, SNU9971	62bp/43bp/15bp

<실험예 1> 염기서열 분석에 의한 분자 역학(Molecular epidemiology)

본 발명자들은 실시예 1과 동일한 방법으로 얻은 PCR 산물의 염기서열을 분석하였다. HN 단백질 유전자의 comHN을 ABI377 DNA 자동분석장치와 다이 종결 키트(dye terminator kit, Perkin Elmer, Foster, CA)를 사용하여 염기서열을 분석하였다(Kwon et al., 2000). PCR 산물 5 ㎕를 3M 소듐 아세테이트(pH 5.2) 1 ㎕, 95% 에탄올 12.5 ㎕에 첨가하여 얼음에 10분간 두고 난 후 14,000 rpm에서 15분간 원심분리하고 70% 에탄올로 세척한 후 침전물을 말리고 이를 1x PCR 버퍼 10 ㎕에 녹였다. 염기서열 분석을 경제적으로 하기 위해 다이 종결 키트를 DW로 2.5배 희석하고 희석된 키트 2 ㎕를 DNA 1 ㎕, 1x PCR 버퍼 2 ㎕, comHNF 또는 comHNR 프라이머(1x PCR 버퍼 3 pmol/㎕) 1 ㎕에 첨가하였다. PCR은 96℃에서 10초동안 반응 후 96℃ 10초, 56℃ 5초, 60℃ 20초의 반응을 25회 반복 실시하였고 4℃에서 반응을 종결시켰다. PCR이 끝난 후 PCR 산물은 에탄올 침전을 실시하였고 침전물을 말린 후 블루 덱스트란/EDTA(Blue Dextran/EDTA, Perkin Elmer Co.) 로딩 버퍼(포름아미드 5 부피, 블루 덱스트란/EDTA 1 부피) 2 ㎕에 녹였다. 변성 후 ABI377 DNA자동분석장치에서 반응을 실시하였다.

상기 방법으로 분석된 염기서열은 B1(M24708), 울스터(Ulster, M24694), 이탈리안(Italien, M24703), 미야데라(Miyadera, M24701), 와윅(Warwick, ZA2111), 라소타(LaSota, M24709), CA 1085/71(AF001106), 1168/84(Collins et al., Arch. Virol., 1994, 128: 363-370), CH-1/95(AF001132), E-1/93(AF001126), DK-1/95(AF001129), H-310/82(AF001112), Iraq AG/68(AF001108), RI-3/88(AF001135), TW/84C(AF083965) 및 TW98/4(AF083963) 등의 공지의 균주들의 염기서열과 BLAST를 통해 비교분석 하였고, 염기서열과 추정되는 아미노산 서열은 멕 얼라인 패키지(MegAlign package, Windows ver. 3.12e; DNASTAR, Madison, Wis)로 분석한 후 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였다.

그 결과, 백신 균주와 동일한 RFLP를 보이는 뉴캐슬병 바이러스 균주 중에서 단지 SNU8419와 SNU8426 만이 B1/라소타 형 백신 균주였다. 그 이외의 것들은 백신 균주와는 92-93%, 독성 야생형(virulent field) 균주와는 96-98% 유사성을 나타내었다. 1995년에 분리한 뉴캐슬병 바이러스 균주는 대부분 유전형 Ⅶa로 분류되었는데 이들은 2000년에 분리한 균주들과 낮은 유사성을 나타내었다(도 4).

병원성 뉴캐슬병 바이러스 균주 사이의 염기 유사성은 매우 다양하게 나타나는데, 이 부위는 분자 역학(molecular epidemiology)에 유용하게 사용될 수 있다. 뉴캐슬병 바이러스 균주의 염기서열에 근거하여 계통수를 제작한 결과, 1980년과 1999년 사이의 한국에서 분리한 병원성 뉴캐슬병 바이러스 균주는 독특한클러스터(clusters)를 형성하였고 이 부위에 의해 제작된 계통수의 위상(topology)은 F 단백질 유전자의 염기서열에 의해 제작된 계통수와 비슷하였다(도 5).

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 뉴캐슬병 바이러스 검출용 프라이머는 알려진 모든 종류의 뉴캐슬병 바이러스를 진단할 수 있으며, 병원성 조사 프라이머를 동시에 사용하여 뉴캐슬병 진단을 할 수 있고, 또한 정확한 뉴캐슬병 바이러스의 병원형과 유전형을 확인할 수 있다.

<110> INTRON BIOTECHNOLOGY CO., LTD <120> Primer for diagnosisof Newcastle disease virus, and methods for d iagnosis, pathotyping and genotyping of the Newcastle disease vir us using the same <130> 1p-05-38 <160> 24 <170> KopatentIn 1.55 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> comHNF <400> 1 catctgcaac agggagggta 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> comHNR <400> 2 tmgagcacag catatcacaa c 21 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pt <400> 3 aggagacrra aacgct 16 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> I-1 <400> 4 tgccactgct agttgcgata 20 <210> 5 <211> 1584 <212> DNA <213> Newcastle disease virus <400> 5 atgctgatca cccgaatcat gttgatattg agctgtatct gtctgacgag ctctctcgat 60 ggcaggcctc tcgcagctgc ggggattgtg gtaacaggag ataaagcagt caatatatac 120 acctcatctc agacagggtc aatcatagtc aagctgctcc caaatatacc caaagataaa 180 gaggcgtgtg caaaagcccc gttagaagca tacaacagaa cactgaccac tttactcacc 240 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ggataggcaa ggaactcata 360 gtagacgaca ctagtgatgt cacatcattc tatccttccg cataccaaga acacctgaat 420 tttatcccgg cgcctaccac agggtcaggt tgcactcgga taccctcatt cgacatgagt 480 gctacccact actgttatac ccacaatgtg atattgtctg gctgcagaga tcactcacac 540 tcacatcaat acttagcact tggtgtgctc cggacatctg caacagggag ggtattcttt 600 tctactctgc gttccatcaa tttagacgac acccagaatc ggaagtcctg cagtgtgagt 660 gcaactcctc taggttgtga tatgctgtgc tctaaagtca cagaaactga ggaagaggac 720 tacaagtcaa ttacccccac atcaatggtg catggaaggt taggcttcga cggtctatat 780 catgaaaagg atttagacat cacaatctta tttaaggatt gggtggcaaa ttatccggga 840 gtgggaggtg gatcctttat tgatggccgt gtatggttcc cagtttacgg agggctaaaa 900 cctaattcac ctagcgacac tgcacaagaa gggaaatatg taatatacaa gcgctataat 960 aacacatgcc ccgataaaca agattaccaa atccggatgg ctaagtcttc gtacaagcct 1020 gggcggttcg gtggaaagcg cgtacagcaa gccatcttat ccatcaaagt gtcaacatcc 1080 ttaggtgagg acccggtgtt gactgttccg cctaacacaa ttacactcat gggggccgag 1140 ggcagagttc tcacagtagg gacatctcat ttcttgtacc aacgggggtc ttcgtatttt 1200 tcccccgcct tattatatcc tatgacagtc cataacaaaa cagctactct tcgtagccct 1260 tatacattta atgctttcac ccggccaggt agtgtcccct gtcaggcatc agcaagatgc 1320 cctaactcat gtatcactgg agtctatact gatccgtatc ctttagtctt ctataagaat 1380 cataccttgc gaggggtctt cgggacaatg cttgatgatg aacaagcaag gctcaacccc 1440 gtatccgcag tattcaacga catatcccgc agtcgtgtaa cccgagtaag ttcaagtagt 1500 accaaggcag catacacgac atcgacatgt tttaaagttg tcaagaccaa taaagcttac 1560 tgtcttagta ttgcagaaat atccaatacc ctatttgggg aatttaggat cgttccttta 1620 ctagttgaga ttcttaagga tgatagag 1648 <210> 24 <211> 1312 <212> DNA <213> Newcastle disease virus <400> 24 ctagagaatg aggaaagaga agcaaagaac acatggcgcc tggttttccg gatcgcagtc 60 ttactttcaa tggcaatgac tctagctatc tccgcagctg ccctgacata cagcatgggg 120 gccagtacgc cgcacgacct cgcaggcata tcgactgtga tctccaagac agaagataag 180 gttacgtctt tactcagttc aagtcaagat gtgatagata ggatatataa acaagtggct 240 cttgaatctc cgctggcgct actaaacact gaatctataa ttatgaatgc aataacctct 300 ctttcttatc aaatcaacgg ggctgcgaac 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gaattctcac agtagggaca 1200 tctcacttct tgtaccaacg agggtcttca tatttctccc ctgccttatt atatcccatg 1260 acagtaaata acaaaacagc tacactccat agtccttata tgtttaatgc tt 1312

Claims

서열번호 1및서열번호 2로 기재되는 뉴캐슬병 바이러스 검출하기 위한 PCR용 프라이머.
제 1항의 프라이머를 이용하는 것을 특징으로 하는 뉴캐슬병 바이러스 검출방법.
서열번호 3및서열번호 4로 기재되는 뉴캐슬병 바이러스 병원성 조사하기 위한 PCR용 프라이머.
제 3항의 프라이머를 이용하는 것을 특징으로 하는 뉴캐슬병 바이러스 병원성 조사방법.
제 1항의 프라이머를 이용한 뉴캐슬병 바이러스 검출하는 단계 및 제 3항의 프라이머를 이용한 뉴캐슬병 바이러스 병원성 조사 단계를 포함하는 뉴캐슬병 진단방법.
제 1항의 프라이머를 사용하여 얻은 PCR 산물을 이용한 RFLP를 수행하는 뉴캐슬병 바이러스의 유전형 조사방법.
제 6항에 있어서, RFLP는 제한효소로서 HinfⅠ과 PstⅠ을 사용하는 것을 특징으로 하는 뉴캐슬병 바이러스의 유전형 조사방법.
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