JP2534246B2 - ニユ−カツスル病ウイルス遺伝子クロ−ン - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ニユーカツスル病として知られている家禽
疾患と関連したウイルス性ポリペプチドをコード化する
（encode）ポリヌクレオチドおよび組換えDNA法による
これらの調製に関する。
疾患と関連したウイルス性ポリペプチドをコード化する
（encode）ポリヌクレオチドおよび組換えDNA法による
これらの調製に関する。
従来の技術 ニユーカツスル病ウイルス（NDV）は典型的なパラミ
クソウイルスであり、家禽において重度の呼吸器系伝染
病をひきおこす。この病気は経済的に極めて重大な問題
であり、予防接種によつてコントロールするか、または
常習的に大発生した場合には全てのバードを隔離して屠
殺しなければならない。NDVのゲノムは分子量が5.2〜5.
6×106もしくは約15,000ベイスで、負の極性を有するRN
Aの単一ストランドで、ポリメラーゼによつて転写され
てウイルス性mRNAを生産する。ゲノムRNAはウイルス性
ヌクレオカプシド中において３種の蛋白質と結合してい
る。これらの蛋白質はヌクレオカプシド蛋白質NP、燐蛋
白質Ｐおよびラージ蛋白質Ｌである。ヌクレオカプシド
はホスト細胞プラズマ膜から誘導される脂質エンベロー
プ内に含まれ、該エンベロープの内部表面上には膜のシ
エルまたはマトリツクス蛋白質Ｍが存在する。該ウイル
ス性エンベロープの外部表面上には２種のウイルス性糖
蛋白質、即ちヘマグルチニン−ノイラミニダーゼHNおよ
び融合蛋白質Ｆが存在し、前者はウイルスとホスト細胞
とのバインデイング（binding）中に含まれ、後者は該
膜と融合しかつ該膜を貫通して含まれる。
クソウイルスであり、家禽において重度の呼吸器系伝染
病をひきおこす。この病気は経済的に極めて重大な問題
であり、予防接種によつてコントロールするか、または
常習的に大発生した場合には全てのバードを隔離して屠
殺しなければならない。NDVのゲノムは分子量が5.2〜5.
6×106もしくは約15,000ベイスで、負の極性を有するRN
Aの単一ストランドで、ポリメラーゼによつて転写され
てウイルス性mRNAを生産する。ゲノムRNAはウイルス性
ヌクレオカプシド中において３種の蛋白質と結合してい
る。これらの蛋白質はヌクレオカプシド蛋白質NP、燐蛋
白質Ｐおよびラージ蛋白質Ｌである。ヌクレオカプシド
はホスト細胞プラズマ膜から誘導される脂質エンベロー
プ内に含まれ、該エンベロープの内部表面上には膜のシ
エルまたはマトリツクス蛋白質Ｍが存在する。該ウイル
ス性エンベロープの外部表面上には２種のウイルス性糖
蛋白質、即ちヘマグルチニン−ノイラミニダーゼHNおよ
び融合蛋白質Ｆが存在し、前者はウイルスとホスト細胞
とのバインデイング（binding）中に含まれ、後者は該
膜と融合しかつ該膜を貫通して含まれる。
Ｆ遺伝子の一次翻訳生成物には、ポリペプチドの翻訳
中または翻訳後短時間のうちに除去されると考えられる
シグナルシーケンスが含まれる。ポリペプチドのグリコ
シル化は、ポリペプチドが翻訳されて前駆体糖蛋白質F0
をもたらすときにおこなわれる。糖蛋白質F0は通常はイ
ンヴイヴオ内でのプロセツシング中に開裂して、ジスル
フイドブリツジによつて結合したポリペプチドのサブユ
ニツトF2およびF1を与える。これらのサブユニツトF1お
よびF2は−Ｓ−Ｓ−結合によつてシステイン残基間に結
合されるのでこれらは単一の分子を形成する。ペプチド
結合開裂は毒性と相関する。毒性菌株のF0はホスト細胞
の広範囲な領域においてF1とF2に開裂するが、無毒性菌
株、例えばLaSotaおよびB1等のF0はホスト細胞の制限さ
れた領域においてのみ開裂する。F0をこのような意味で
特に使用するか、あるいは特に言及しない限り、本明細
書で使用する「Ｆ」という用語にはＦとF0の両方が含ま
れる。
中または翻訳後短時間のうちに除去されると考えられる
シグナルシーケンスが含まれる。ポリペプチドのグリコ
シル化は、ポリペプチドが翻訳されて前駆体糖蛋白質F0
をもたらすときにおこなわれる。糖蛋白質F0は通常はイ
ンヴイヴオ内でのプロセツシング中に開裂して、ジスル
フイドブリツジによつて結合したポリペプチドのサブユ
ニツトF2およびF1を与える。これらのサブユニツトF1お
よびF2は−Ｓ−Ｓ−結合によつてシステイン残基間に結
合されるのでこれらは単一の分子を形成する。ペプチド
結合開裂は毒性と相関する。毒性菌株のF0はホスト細胞
の広範囲な領域においてF1とF2に開裂するが、無毒性菌
株、例えばLaSotaおよびB1等のF0はホスト細胞の制限さ
れた領域においてのみ開裂する。F0をこのような意味で
特に使用するか、あるいは特に言及しない限り、本明細
書で使用する「Ｆ」という用語にはＦとF0の両方が含ま
れる。
HN遺伝子の一次翻訳生成物は糖蛋白質HNである。２種
類の無毒性菌株においては、前駆体糖蛋白質（HN0）は
Ｃ−末端グリコポリペプチドの開裂によつて活性なHNと
なる。HN0をこのような意味で特に使用するか、あるい
は特に言及しない限り、本明細書で使用する「HN」とい
う用語にはHNとHN0の両方が含まれる。
類の無毒性菌株においては、前駆体糖蛋白質（HN0）は
Ｃ−末端グリコポリペプチドの開裂によつて活性なHNと
なる。HN0をこのような意味で特に使用するか、あるい
は特に言及しない限り、本明細書で使用する「HN」とい
う用語にはHNとHN0の両方が含まれる。
NDV HN糖蛋白質に対して生ずるモノクロナル抗体はND
Vの伝染効力を消す〔イオリオ（R.M.Iorio）およびブラ
ツト（M.A.Bratt）、ジエイ・バイロロジー（J.Virolog
y）、第48巻、第440頁〜第450頁（1983年）参照〕。ウ
ミノ（Y.Umino）らは、NDV HN糖蛋白質に対して単一特
異的な抗血清が、ヘマグルチニンとノイラミニダーゼ活
性に対して高い消効作用を有することを報告している
〔アーカイブズ・オブ・バイロロジー（Archives of Vi
rology）、第81巻、第53頁〜第65頁（1984年）参
照。〕。Ｆ糖蛋白質に対する抗血清は溶血およびウイル
スによつてひき起こされる細胞融合を抑制し、また抗−
HNおよび抗−Ｆ抗血清との組合せはプラク・リダクシヨ
ン・アツセイ（plaque reduction assay）において特に
効果的である。従つて、NDV糖蛋白質HNおよびＦをコー
ド化する人為的な（artificial）DNAまたはRNAを組換え
DNA法によつて調製することは重要である。本明細書に
おいては便宜上、「NDV蛋白質をコード化するDNAまたは
RNA」と呼ぶが、厳密にはイン・ヴイヴオ内で処理され
て糖蛋白質になるそのポリペプチド前駆体のみをコード
化する。イン・ヴイヴオ内でのNDV転写の一次生成物は
ポリアデニル化されてキヤツプ化されたメチル化mRNAで
あり、これらはゲノムRNAに対して相補性があり、沈降
係数は35S、22Sおよび18Sである。18Sおよび35Sのもの
は６種類の蛋白質に対するコードを転写する。即ち、18
S RNAは蛋白質NP、Ｐ、Ｍ、HNおよびＦに対して遺伝暗
号を指定し、35S RNAはラージ蛋白質Ｌに対して遺伝暗
号を指定する。18S RNAは５種類の異なつたモノシスト
ロンポリＡ−mRNAを含んでおり、これらの各々が５種類
の蛋白質のうちの１種に対して遺伝暗号を指定する。ヴ
アイス（S.R.Weiss）らは、これらの18S mRNAが5.0、5.
7、7.1、7.4および8.5×105の分子量を有することを示
した〔ジヤーナル・オブ・バイロロジー、第18巻、第31
6頁〜第323頁（1976年）参照〕。
Vの伝染効力を消す〔イオリオ（R.M.Iorio）およびブラ
ツト（M.A.Bratt）、ジエイ・バイロロジー（J.Virolog
y）、第48巻、第440頁〜第450頁（1983年）参照〕。ウ
ミノ（Y.Umino）らは、NDV HN糖蛋白質に対して単一特
異的な抗血清が、ヘマグルチニンとノイラミニダーゼ活
性に対して高い消効作用を有することを報告している
〔アーカイブズ・オブ・バイロロジー（Archives of Vi
rology）、第81巻、第53頁〜第65頁（1984年）参
照。〕。Ｆ糖蛋白質に対する抗血清は溶血およびウイル
スによつてひき起こされる細胞融合を抑制し、また抗−
HNおよび抗−Ｆ抗血清との組合せはプラク・リダクシヨ
ン・アツセイ（plaque reduction assay）において特に
効果的である。従つて、NDV糖蛋白質HNおよびＦをコー
ド化する人為的な（artificial）DNAまたはRNAを組換え
DNA法によつて調製することは重要である。本明細書に
おいては便宜上、「NDV蛋白質をコード化するDNAまたは
RNA」と呼ぶが、厳密にはイン・ヴイヴオ内で処理され
て糖蛋白質になるそのポリペプチド前駆体のみをコード
化する。イン・ヴイヴオ内でのNDV転写の一次生成物は
ポリアデニル化されてキヤツプ化されたメチル化mRNAで
あり、これらはゲノムRNAに対して相補性があり、沈降
係数は35S、22Sおよび18Sである。18Sおよび35Sのもの
は６種類の蛋白質に対するコードを転写する。即ち、18
S RNAは蛋白質NP、Ｐ、Ｍ、HNおよびＦに対して遺伝暗
号を指定し、35S RNAはラージ蛋白質Ｌに対して遺伝暗
号を指定する。18S RNAは５種類の異なつたモノシスト
ロンポリＡ−mRNAを含んでおり、これらの各々が５種類
の蛋白質のうちの１種に対して遺伝暗号を指定する。ヴ
アイス（S.R.Weiss）らは、これらの18S mRNAが5.0、5.
7、7.1、7.4および8.5×105の分子量を有することを示
した〔ジヤーナル・オブ・バイロロジー、第18巻、第31
6頁〜第323頁（1976年）参照〕。
コリンズ（P.L.Collines）らはイン・ヴイトロ内で翻
訳をおこなうことによつて各々のmRNAによつて遺伝暗号
が指定された蛋白質の帰属をおこなつた〔ジヤーナル・
オブ・バイロロジー、第43巻、第1024頁〜第1031頁（19
82年）参照〕。これらの蛋白質を分子量が大きくなる順
序で示せば次の通りである:M、Ｐ、分子量36Kおよび33K
の蛋白質、NP、非グリコシル化Ｆおよび非グリコシル化
HN。
訳をおこなうことによつて各々のmRNAによつて遺伝暗号
が指定された蛋白質の帰属をおこなつた〔ジヤーナル・
オブ・バイロロジー、第43巻、第1024頁〜第1031頁（19
82年）参照〕。これらの蛋白質を分子量が大きくなる順
序で示せば次の通りである:M、Ｐ、分子量36Kおよび33K
の蛋白質、NP、非グリコシル化Ｆおよび非グリコシル化
HN。
NDVの決定的なゲノムマツプは現在のところ存在しな
い。コリンズらにより、UV転写マツピング法によつてマ
ツプが作成されている〔ジエイ・バイロロジー、第35
巻、第682頁〜第693頁（1980年）および同第28巻、第32
4頁〜第336頁（1978年）参照〕。これらのマツプは相互
に一致しない。最近発表されたこの種の論文には、NP遺
伝子が３′エンドに最も近く位置し、次いでＰ遺伝子が
位置し、これにＭとＦ遺伝子が順不明で続き、次にHN遺
伝子が位置し（これらはすべてゲノムの３′ハーフに位
置する）、ラージＬ遺伝子が５′エンドに最も近く位置
することが示されている。しかしながら、UV転写マツピ
ング法は不正確な技術であり、仙台ウイルスに関する研
究においてこの方法によつて見違つた結果が得られたこ
とが知られている。
い。コリンズらにより、UV転写マツピング法によつてマ
ツプが作成されている〔ジエイ・バイロロジー、第35
巻、第682頁〜第693頁（1980年）および同第28巻、第32
4頁〜第336頁（1978年）参照〕。これらのマツプは相互
に一致しない。最近発表されたこの種の論文には、NP遺
伝子が３′エンドに最も近く位置し、次いでＰ遺伝子が
位置し、これにＭとＦ遺伝子が順不明で続き、次にHN遺
伝子が位置し（これらはすべてゲノムの３′ハーフに位
置する）、ラージＬ遺伝子が５′エンドに最も近く位置
することが示されている。しかしながら、UV転写マツピ
ング法は不正確な技術であり、仙台ウイルスに関する研
究においてこの方法によつて見違つた結果が得られたこ
とが知られている。
最近、デイキンズ（L.E.Dickens）らはヒトの呼吸器
系シンシチウム性ウイルス（パラミクソウイルス）とラ
ブドウイルスVSVおよびNDVの遺伝子の配列順序を比較し
た〔ジエイ・バイロロジー、第52巻、第364頁〜第369頁
（1984年）参照〕。開示された遺伝子の配列順序（３′
〜５′）はNP、Ｐ、Ｍ、Ｆ、HNおよびＬであるが、この
データは他の科学者からの未発表の個人的書簡から得た
ものである。
系シンシチウム性ウイルス（パラミクソウイルス）とラ
ブドウイルスVSVおよびNDVの遺伝子の配列順序を比較し
た〔ジエイ・バイロロジー、第52巻、第364頁〜第369頁
（1984年）参照〕。開示された遺伝子の配列順序（３′
〜５′）はNP、Ｐ、Ｍ、Ｆ、HNおよびＬであるが、この
データは他の科学者からの未発表の個人的書簡から得た
ものである。
HNおよびＦ蛋白質をコード化するSV5遺伝子の配列順
序は決定されている〔ヒーベルト（S.W.Hiebert）ら、
ジエイ・バイロロジー、第54巻、第１頁〜第６頁（1985
年）およびパターソン（R.G.Paterson）ら、プロス・ナ
ツト・アカド・サイ ユー・エス・エイ（Proc.Nat.Aca
d.Sci.USA）、第81巻、第6706頁〜第6710頁（1984年）
参照〕。
序は決定されている〔ヒーベルト（S.W.Hiebert）ら、
ジエイ・バイロロジー、第54巻、第１頁〜第６頁（1985
年）およびパターソン（R.G.Paterson）ら、プロス・ナ
ツト・アカド・サイ ユー・エス・エイ（Proc.Nat.Aca
d.Sci.USA）、第81巻、第6706頁〜第6710頁（1984年）
参照〕。
リチヤードソン（C.D.Richardson）らはNDV、SV5およ
び仙台ウイルスのF1蛋白質のＮ−ターミナルエンドの最
初の20個のアミノ酸の配列順序を決定した〔バイロロジ
ー、第105巻、第205頁〜第222頁（1980年）参照〕。最
小数の可能なコドンを有するこのNDVシーケンスの６個
の連続的アミノ酸をコード化するすべての18一マー（18
−mer）オリゴヌクレオチドの混合物は最低864個の異な
つたオリゴマーを含有する。
び仙台ウイルスのF1蛋白質のＮ−ターミナルエンドの最
初の20個のアミノ酸の配列順序を決定した〔バイロロジ
ー、第105巻、第205頁〜第222頁（1980年）参照〕。最
小数の可能なコドンを有するこのNDVシーケンスの６個
の連続的アミノ酸をコード化するすべての18一マー（18
−mer）オリゴヌクレオチドの混合物は最低864個の異な
つたオリゴマーを含有する。
最近、ウイルデ（A.Wilde）らは22S NDV RNA写しが多
シストロン性RNA分子を生じさせることを示した〔ジヤ
ーナル・オブ・バイロロジー、第51巻、第71頁〜第76頁
（1984年）参照〕。この論文の第75頁、右欄、第16行〜
第19行には、個々のNDV遺伝子から誘導されたcDNAクロ
ーンを、RNAがビーシストロン性またはトリーシストロ
ン性であることを示すのに利用することが記載されてい
る。このような遺伝子クローンに関してこれ以上の情報
はこの論文には開示されていない。
シストロン性RNA分子を生じさせることを示した〔ジヤ
ーナル・オブ・バイロロジー、第51巻、第71頁〜第76頁
（1984年）参照〕。この論文の第75頁、右欄、第16行〜
第19行には、個々のNDV遺伝子から誘導されたcDNAクロ
ーンを、RNAがビーシストロン性またはトリーシストロ
ン性であることを示すのに利用することが記載されてい
る。このような遺伝子クローンに関してこれ以上の情報
はこの論文には開示されていない。
仙台ウイルスHNおよびＦ遺伝子の配列順序はブルンベ
ルク（B.M.Blumberg）らによつて示されている〔ジヤー
ナル・オブ・バイロロジー、第66巻、第317頁〜第331頁
（1985年）およびセル（Cell）、第42巻、第269頁〜第2
78頁（1985年）参照〕。また、ヒダカ（Y.Hidaka）らに
よつてＦ遺伝子の部分的な配列順序が報告されている
〔ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Nucleic Acids
Research）、第12巻、第7965頁〜第7973頁（1984年）参
照〕。
ルク（B.M.Blumberg）らによつて示されている〔ジヤー
ナル・オブ・バイロロジー、第66巻、第317頁〜第331頁
（1985年）およびセル（Cell）、第42巻、第269頁〜第2
78頁（1985年）参照〕。また、ヒダカ（Y.Hidaka）らに
よつてＦ遺伝子の部分的な配列順序が報告されている
〔ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ（Nucleic Acids
Research）、第12巻、第7965頁〜第7973頁（1984年）参
照〕。
本発明者は組換えDNA技法によつてNDV遺伝子のクロー
ン化の研究に従事している。一般微生物学会の研究集会
において（1985年１月10日、バーミンガム、イングラン
ド）、本発明者はHNとＬ遺伝子との間のジヤンクシヨン
（junction）の領域中に存在すると考えられているcDNA
シーケンスの短い領域を含む研究のアウトラインについ
て口頭発表した。オープン・リーデイング・フレーム
（open reading frame）は示されなかつた。
ン化の研究に従事している。一般微生物学会の研究集会
において（1985年１月10日、バーミンガム、イングラン
ド）、本発明者はHNとＬ遺伝子との間のジヤンクシヨン
（junction）の領域中に存在すると考えられているcDNA
シーケンスの短い領域を含む研究のアウトラインについ
て口頭発表した。オープン・リーデイング・フレーム
（open reading frame）は示されなかつた。
本発明者は生化学学会の集会（1985年７月17日、オツ
クスフオード、イングランド）において、オーバーヘツ
ド・プロジエクターを用いる口頭発表をおこなつた。研
究の詳細ではなくてアウトラインを示す簡潔な概要が19
85年の６月頃に代表者（delegates）に配布された。ポ
スターは該集会の７月17日に公開された。該ポスターに
は、注意深くおこなう難しいマツピング（mapping）技
法によつてＦとHN遺伝子の全体に及びことが示された一
連のオーバーラツプする小さなフラグメントのプラスミ
ドpBR322中のクローニングが報告された。このポスター
には、コーデイング領域におけるヌクレオチドシーケン
スに関する情報は記載されておらず、HN遺伝子の５′エ
ンド近くの還元された69−残基アミノ酸シーケンスNPTS
AVFD… …PLLVEILKNのみが報告された。このシーケン
スには、ユニークなDNAコドンを有するトリプトフアン
残基またはメチオニン残基は含まれていなかつた。この
口頭発表においては該ポスターに記載された内容以上の
ことは公表されなかつた。
クスフオード、イングランド）において、オーバーヘツ
ド・プロジエクターを用いる口頭発表をおこなつた。研
究の詳細ではなくてアウトラインを示す簡潔な概要が19
85年の６月頃に代表者（delegates）に配布された。ポ
スターは該集会の７月17日に公開された。該ポスターに
は、注意深くおこなう難しいマツピング（mapping）技
法によつてＦとHN遺伝子の全体に及びことが示された一
連のオーバーラツプする小さなフラグメントのプラスミ
ドpBR322中のクローニングが報告された。このポスター
には、コーデイング領域におけるヌクレオチドシーケン
スに関する情報は記載されておらず、HN遺伝子の５′エ
ンド近くの還元された69−残基アミノ酸シーケンスNPTS
AVFD… …PLLVEILKNのみが報告された。このシーケン
スには、ユニークなDNAコドンを有するトリプトフアン
残基またはメチオニン残基は含まれていなかつた。この
口頭発表においては該ポスターに記載された内容以上の
ことは公表されなかつた。
発明が解決しようとする問題点 以上の研究報告にもかかわらず、UV転写マツピング法
は信頼できないので、NDVゲノム上でのHNとＦ遺伝子の
位置を正確に特定することは不可能であつた。当業者が
少数のプローブを組み立て、NDV遺伝子ライブラリー中
の関連する遺伝子を該プローブと雑種形成させ、該ライ
ブラリーから抽出することを可能にするようなヌクレオ
チドシーケンスに関する情報は公表されていなかつた。
さらにまた、このようなNDV遺伝子ライブラリーは本件
出願の優先日においては知られていなかつた。従つて、
NDVのHNとＦ遺伝子に対して遺伝暗号を指定するcDNAま
たはRNAを調製することは依然として問題となつてい
る。
は信頼できないので、NDVゲノム上でのHNとＦ遺伝子の
位置を正確に特定することは不可能であつた。当業者が
少数のプローブを組み立て、NDV遺伝子ライブラリー中
の関連する遺伝子を該プローブと雑種形成させ、該ライ
ブラリーから抽出することを可能にするようなヌクレオ
チドシーケンスに関する情報は公表されていなかつた。
さらにまた、このようなNDV遺伝子ライブラリーは本件
出願の優先日においては知られていなかつた。従つて、
NDVのHNとＦ遺伝子に対して遺伝暗号を指定するcDNAま
たはRNAを調製することは依然として問題となつてい
る。
問題点を解決するための手段 本発明によれば、ニユーカツスル病ウイルスRNAのHN
とＦポリペプチドの一部または全部をコード化するDNA
が提供される。NDVのゲノムの長さはほぼ15,000ヌクレ
オチドであるが、本発明によれば、Ｆポリペプチドに対
して遺伝暗号を指定する部分の長さはほぼ1,660ヌクレ
オチドであり、HNポリペプチドに対して遺伝暗号を指定
する部分の長さはほぼ1,730ヌクレオチドである。ゲノ
ムのこれらのHN−およびＦ−コーデイング部分は免疫刺
激性（immunity−stimulating）ポリペプチドを生じさ
せる部分と考えられている。本発明は、ゲノムの残余部
分内の実質的エレメントに関してではなく、これらの遺
伝子に相当するか、またはこれらの遺伝子に対して相補
的な比較的短い長さのDNAを提供する。従つて、該DNA
は、NDVゲノムの他の部分に相当するか、または該部分
に対して相補的な実質的な長さの付加的シーケンスを含
まないと考えられる。他方、本発明においては、このよ
うなHN−およびＦ−遺伝子ヌクレオチドは短い長さの付
加的なNDV遺伝子シーケンスを含むDNA例えばＦおよび／
またはHN遺伝子の一方のエンドまたは両方のエンドにお
けるｎヌクレオチド（ｎは例えば１〜200、特に１〜50
の数を示す）を除外するものではない。HN−およびＦ−
遺伝子に相当するか、または該遺伝子に対して相補的な
ポリヌクレオチドの定義内に該シグナルシーケンスが含
まれることに注意すべきである。「付加的な遺伝子シー
ケンス（additional gene sequence）」は、RNAからHN
−およびＦ−遺伝子が得られるプロセツシング（proces
sing）中に含まれかつ各々のポリペプチドをコード化し
ないHN−およびＦ−シーケンスの一部分のみというより
も、他のNDV遺伝子からのシーケンスを意味する。
とＦポリペプチドの一部または全部をコード化するDNA
が提供される。NDVのゲノムの長さはほぼ15,000ヌクレ
オチドであるが、本発明によれば、Ｆポリペプチドに対
して遺伝暗号を指定する部分の長さはほぼ1,660ヌクレ
オチドであり、HNポリペプチドに対して遺伝暗号を指定
する部分の長さはほぼ1,730ヌクレオチドである。ゲノ
ムのこれらのHN−およびＦ−コーデイング部分は免疫刺
激性（immunity−stimulating）ポリペプチドを生じさ
せる部分と考えられている。本発明は、ゲノムの残余部
分内の実質的エレメントに関してではなく、これらの遺
伝子に相当するか、またはこれらの遺伝子に対して相補
的な比較的短い長さのDNAを提供する。従つて、該DNA
は、NDVゲノムの他の部分に相当するか、または該部分
に対して相補的な実質的な長さの付加的シーケンスを含
まないと考えられる。他方、本発明においては、このよ
うなHN−およびＦ−遺伝子ヌクレオチドは短い長さの付
加的なNDV遺伝子シーケンスを含むDNA例えばＦおよび／
またはHN遺伝子の一方のエンドまたは両方のエンドにお
けるｎヌクレオチド（ｎは例えば１〜200、特に１〜50
の数を示す）を除外するものではない。HN−およびＦ−
遺伝子に相当するか、または該遺伝子に対して相補的な
ポリヌクレオチドの定義内に該シグナルシーケンスが含
まれることに注意すべきである。「付加的な遺伝子シー
ケンス（additional gene sequence）」は、RNAからHN
−およびＦ−遺伝子が得られるプロセツシング（proces
sing）中に含まれかつ各々のポリペプチドをコード化し
ないHN−およびＦ−シーケンスの一部分のみというより
も、他のNDV遺伝子からのシーケンスを意味する。
蛋白質HNおよびＦが糖蛋白質であることは知られてい
る。本発明によるDNAはそのポリペプチド部分、即ち、
その後イン・ヴイヴオにおいてグリコシル化される部分
をコード化する。
る。本発明によるDNAはそのポリペプチド部分、即ち、
その後イン・ヴイヴオにおいてグリコシル化される部分
をコード化する。
Ｆポリペプチドはイン・ヴイヴオでのプロセスにおい
て２種のより短いポリペプチドF1およびF2に開裂され
る。従つて本発明には、別々の分子もしくはジスルフイ
ド架橋による単一分子としてのF1およびF2ポリペプチド
またはこれらの生前駆体Ｆポリペプチドをコード化する
ポリヌクレオチドが含まれる。ヴイリオンRNAもしくはD
NAが、イン・ヴイヴオでの免疫性の刺激に関して他の部
分よりもより直接的に関連した部分を含んでいるという
ことは一般に認められている。これらのエピトープはか
なり小さい。例えば、足部および口腔の疾患ウイルスの
場合、VP1ポリペプチドの最大の抗原性領域は210−アミ
ノ酸長鎖のアミノ酸140〜160の間に位置する。この領域
によつてコード化されたFMDVの比較的短いポリペプチド
が、畜牛のこのような疾患に対する免疫性を刺激するこ
とが報告されている。
て２種のより短いポリペプチドF1およびF2に開裂され
る。従つて本発明には、別々の分子もしくはジスルフイ
ド架橋による単一分子としてのF1およびF2ポリペプチド
またはこれらの生前駆体Ｆポリペプチドをコード化する
ポリヌクレオチドが含まれる。ヴイリオンRNAもしくはD
NAが、イン・ヴイヴオでの免疫性の刺激に関して他の部
分よりもより直接的に関連した部分を含んでいるという
ことは一般に認められている。これらのエピトープはか
なり小さい。例えば、足部および口腔の疾患ウイルスの
場合、VP1ポリペプチドの最大の抗原性領域は210−アミ
ノ酸長鎖のアミノ酸140〜160の間に位置する。この領域
によつてコード化されたFMDVの比較的短いポリペプチド
が、畜牛のこのような疾患に対する免疫性を刺激するこ
とが報告されている。
NDVのゲノムはネガテイブなストランドのRNAである。
即ち、蛋白質を実際にコード化するストランドはの相補
体である。イン・ヴイヴオでのプロセツシングにおいて
は、該相補体はmRNAである。本発明にはもちろん、単一
ストランドとしてのこの種のcDNA、このようなストラン
ドが二重になつたDNAである。本発明へ導いた組換えDNA
の研究において使用したニユーカツスル病ウイルスの菌
株はボーデツト（Beaudette）Ｃである。この菌株は極
めて広範囲から入手可能なものであり、本発明の場合に
はカリフオルニア大学（ロスアンジエンス，米国）のフ
オツクス（C.F.Fox）教授から最初に入手した。該菌株
は、NDVに関する国際委託研究所として活動する政府基
金中央獣医研究所〔ウエイブリツジ（Weybridge）、サ
レー（Surrey）、KT15、3NB、イギリス国〕から入手可
能である。
即ち、蛋白質を実際にコード化するストランドはの相補
体である。イン・ヴイヴオでのプロセツシングにおいて
は、該相補体はmRNAである。本発明にはもちろん、単一
ストランドとしてのこの種のcDNA、このようなストラン
ドが二重になつたDNAである。本発明へ導いた組換えDNA
の研究において使用したニユーカツスル病ウイルスの菌
株はボーデツト（Beaudette）Ｃである。この菌株は極
めて広範囲から入手可能なものであり、本発明の場合に
はカリフオルニア大学（ロスアンジエンス，米国）のフ
オツクス（C.F.Fox）教授から最初に入手した。該菌株
は、NDVに関する国際委託研究所として活動する政府基
金中央獣医研究所〔ウエイブリツジ（Weybridge）、サ
レー（Surrey）、KT15、3NB、イギリス国〕から入手可
能である。
本発明には特に、NDVボーデットＣ菌株のＦまたはHN
ポリペプチドをコード化するDNAヌクレオチドシーケン
スが含まれる。免疫学的な研究により、NDVの異なつた
菌株間の変異（variation）は大きくはなく、NDVと他の
パラミクソウイルス、例えば仙台ウイルスとSV5との間
の差異よりも実質上小さいことが示されている。ボーデ
ツトＣ菌株のＦおよびHN遺伝子に対するヌクレオチドシ
ーケンスを以下の実施例において示す。
ポリペプチドをコード化するDNAヌクレオチドシーケン
スが含まれる。免疫学的な研究により、NDVの異なつた
菌株間の変異（variation）は大きくはなく、NDVと他の
パラミクソウイルス、例えば仙台ウイルスとSV5との間
の差異よりも実質上小さいことが示されている。ボーデ
ツトＣ菌株のＦおよびHN遺伝子に対するヌクレオチドシ
ーケンスを以下の実施例において示す。
本発明によつて提供されるシーケンス情報を利用する
ことにより、ボーデツトＣのRNAまたはNDVもしくはその
補体の他の菌株に対するcDNAを得るための近道を当業者
がとれることが予期される。これは例えば、NDVボーデ
ツトＣ菌株のHN−および／またはＦ−コーデイング領域
に対してユニークになる合理的な機会をもたらすのに十
分な長さを有するオリゴヌクレオチドの化学的な合成法
によつておこなうことができる。このようなオリゴヌク
レオチドの最低の長さは通常12〜18個のヌクレオチド
で、正確な最低数は、NDVゲノム中の他の領域の別の同
一もしくはほぼ同一なシーケンスではないものとしてそ
こに割り当てられる確実性の度合の関数である。あるい
は、ボーデツトC cDNAのシーケンスは制限酵素を使用し
て切除し、標識付けしてプローブとして使用することが
できる。ssポリヌクレオチドのプローブを調製し、これ
を、NDVの同一もしくは異なつた菌株のウイルス性RNAま
たはこれに対して相補性のcDNAの遺伝子ライブラリーの
プローブとして使用する。都合のよいことには、cDNAラ
イブラリーを使用し、コロニー雑種形成によつて、HNま
たはＦボーデツトＣ遺伝子に対して相補性のDNAを含む
クローンを検知することが可能である。所望により、関
連する遺伝子のサブ−クローニングに対しては適当な制
限酵素を使用することができる。このような遺伝子抽出
法においては、必要ならば試行錯誤により、このような
プローブとして使用する少なくとも、例えば18個のヌク
レオチドシーケンスのロケーシヨンをおこなうことは比
較的簡単な事柄であることが認められるであろう。従つ
て本発明によれば特に、 （１）第１図の１〜第１図の６に記載の配列において、
47〜1705の番号のヌクレオチドシーケンスによりコード
されるニューカッスル病ウイルスボーデッドＣ菌株のＦ
ポリペプチド、またはそのアレル変異体を単独でまたは
シグナルペプチドと共にコード化するヌクレオチドシー
ケンス；または該ヌクレオチドシーケンスにおいて１も
しくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換されてお
り、且つニューカッスル病ウイルスのＦポリペプチドを
単独でまたはシグナルペプチドと共にコード化するヌク
レオチドシーケンス、 （２）上記配列の395〜1705の番号のヌクレオチドシー
ケンスによりコードされるニューカッスル病ボーデッド
Ｃ菌株のF1ポリペプチド、またはそのアレル変異体をコ
ード化するヌクレオチドシーケンス；または該ヌクレオ
チドシーケンスにおいて１もしくは複数の塩基が付加、
欠失もしくは置換されており、且つニューカッスル病ウ
イルスのF1ポリペプチドをコード化するヌクレオチドシ
ーケンス、 （３）上記配列の47〜394の番号のヌクレオチドシーケ
ンスによりコードされるニューカッスル病F2ポリペプチ
ド、またはそのアレル変異体を単独でまたはシグナルペ
プチドと共にコード化するヌクレオチドシーケンス；ま
たは該ヌクレオチドシーケンスにおいて１もしくは複数
の塩基が付加、欠失もしくは置換されており、且つニュ
ーカッスル病ウイルスのF2ポリペプチドを単独でまたは
シグナルペプチドと共にコード化するヌクレオチドシー
ケンス、または （４）上記配列の1915〜3645の番号で示されるヌクレオ
チドシーケンスによりコードされるニューカッスル病ボ
ーデッドＣ菌株のHNポリペプチド、またはそのアレル変
異体をコード化するヌクレオチドシーケンス；または該
ヌクレオチドシーケンスにおいて１もしくは複数の塩基
が付加、欠失もしくは置換されており、且つニューカッ
スル病ウイルスのHNポリペプチドをコード化するヌクレ
オチドシーケンス を含むDNAが提供される。
ことにより、ボーデツトＣのRNAまたはNDVもしくはその
補体の他の菌株に対するcDNAを得るための近道を当業者
がとれることが予期される。これは例えば、NDVボーデ
ツトＣ菌株のHN−および／またはＦ−コーデイング領域
に対してユニークになる合理的な機会をもたらすのに十
分な長さを有するオリゴヌクレオチドの化学的な合成法
によつておこなうことができる。このようなオリゴヌク
レオチドの最低の長さは通常12〜18個のヌクレオチド
で、正確な最低数は、NDVゲノム中の他の領域の別の同
一もしくはほぼ同一なシーケンスではないものとしてそ
こに割り当てられる確実性の度合の関数である。あるい
は、ボーデツトC cDNAのシーケンスは制限酵素を使用し
て切除し、標識付けしてプローブとして使用することが
できる。ssポリヌクレオチドのプローブを調製し、これ
を、NDVの同一もしくは異なつた菌株のウイルス性RNAま
たはこれに対して相補性のcDNAの遺伝子ライブラリーの
プローブとして使用する。都合のよいことには、cDNAラ
イブラリーを使用し、コロニー雑種形成によつて、HNま
たはＦボーデツトＣ遺伝子に対して相補性のDNAを含む
クローンを検知することが可能である。所望により、関
連する遺伝子のサブ−クローニングに対しては適当な制
限酵素を使用することができる。このような遺伝子抽出
法においては、必要ならば試行錯誤により、このような
プローブとして使用する少なくとも、例えば18個のヌク
レオチドシーケンスのロケーシヨンをおこなうことは比
較的簡単な事柄であることが認められるであろう。従つ
て本発明によれば特に、 （１）第１図の１〜第１図の６に記載の配列において、
47〜1705の番号のヌクレオチドシーケンスによりコード
されるニューカッスル病ウイルスボーデッドＣ菌株のＦ
ポリペプチド、またはそのアレル変異体を単独でまたは
シグナルペプチドと共にコード化するヌクレオチドシー
ケンス；または該ヌクレオチドシーケンスにおいて１も
しくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換されてお
り、且つニューカッスル病ウイルスのＦポリペプチドを
単独でまたはシグナルペプチドと共にコード化するヌク
レオチドシーケンス、 （２）上記配列の395〜1705の番号のヌクレオチドシー
ケンスによりコードされるニューカッスル病ボーデッド
Ｃ菌株のF1ポリペプチド、またはそのアレル変異体をコ
ード化するヌクレオチドシーケンス；または該ヌクレオ
チドシーケンスにおいて１もしくは複数の塩基が付加、
欠失もしくは置換されており、且つニューカッスル病ウ
イルスのF1ポリペプチドをコード化するヌクレオチドシ
ーケンス、 （３）上記配列の47〜394の番号のヌクレオチドシーケ
ンスによりコードされるニューカッスル病F2ポリペプチ
ド、またはそのアレル変異体を単独でまたはシグナルペ
プチドと共にコード化するヌクレオチドシーケンス；ま
たは該ヌクレオチドシーケンスにおいて１もしくは複数
の塩基が付加、欠失もしくは置換されており、且つニュ
ーカッスル病ウイルスのF2ポリペプチドを単独でまたは
シグナルペプチドと共にコード化するヌクレオチドシー
ケンス、または （４）上記配列の1915〜3645の番号で示されるヌクレオ
チドシーケンスによりコードされるニューカッスル病ボ
ーデッドＣ菌株のHNポリペプチド、またはそのアレル変
異体をコード化するヌクレオチドシーケンス；または該
ヌクレオチドシーケンスにおいて１もしくは複数の塩基
が付加、欠失もしくは置換されており、且つニューカッ
スル病ウイルスのHNポリペプチドをコード化するヌクレ
オチドシーケンス を含むDNAが提供される。
本明細書においてニューカッスル病ウイルスボーデッ
トＣ菌株のＦまたはF1もしくはF2ポリペプチド、または
HNポリペプチドの「アレル変異体」とは天然由来のペプ
チドであってそれぞれニューカッスル病ウイルスのＦま
たはF1もしくはF2ポリペプチド、またはHNポリペプチド
の活性を示すものをいう。本発明において、ニューカッ
スル病ウイルスボーデッドＣ菌株のニューカッスル病ウ
イルスのＦまたはF1もしくはF2ポリペプチド、またはHN
ポリペプチドのアレル変異体をコード化するヌクレオチ
ドシーケンスは、ニューカッスル病ウイルスボーデット
Ｃ菌株のＦまたはF1もしくはF2ポリペプチド、またはHN
ポリペプチドをそれぞれコード化するヌクレオチドシー
ケンスに対して少なくとも80％、好ましくは85％、より
好ましくは95％のヌクレオチドホモロジーを有する。
トＣ菌株のＦまたはF1もしくはF2ポリペプチド、または
HNポリペプチドの「アレル変異体」とは天然由来のペプ
チドであってそれぞれニューカッスル病ウイルスのＦま
たはF1もしくはF2ポリペプチド、またはHNポリペプチド
の活性を示すものをいう。本発明において、ニューカッ
スル病ウイルスボーデッドＣ菌株のニューカッスル病ウ
イルスのＦまたはF1もしくはF2ポリペプチド、またはHN
ポリペプチドのアレル変異体をコード化するヌクレオチ
ドシーケンスは、ニューカッスル病ウイルスボーデット
Ｃ菌株のＦまたはF1もしくはF2ポリペプチド、またはHN
ポリペプチドをそれぞれコード化するヌクレオチドシー
ケンスに対して少なくとも80％、好ましくは85％、より
好ましくは95％のヌクレオチドホモロジーを有する。
本発明には特に、ベクターが発現ベクターであるDNA
が含まれる。発現ベクターは、例えば原核生物細胞発現
ベクターまたは真核生物細胞発現ベクター、例えば禽痘
ウイルスDNAであってもよい。本明細書で使用する「ベ
クター」という用語にはシャトルべクターも含まれる。
発現が必要な場合には、mRNAから所望のHNおよび／また
はＦ蛋白質への翻訳およびその他のプロセシングに対し
て有効なシグナルシーケンスをDNAに含ませる。
が含まれる。発現ベクターは、例えば原核生物細胞発現
ベクターまたは真核生物細胞発現ベクター、例えば禽痘
ウイルスDNAであってもよい。本明細書で使用する「ベ
クター」という用語にはシャトルべクターも含まれる。
発現が必要な場合には、mRNAから所望のHNおよび／また
はＦ蛋白質への翻訳およびその他のプロセシングに対し
て有効なシグナルシーケンスをDNAに含ませる。
本発明にはさらに、上記の組換DNAを含有する、また
は該DNAによって感染されたホスト細胞が包含される。
は該DNAによって感染されたホスト細胞が包含される。
上記の技法を適用できる多数のNDV菌株が存在する。
よく知られている菌株としては次の菌株が挙げられる:A
V、LK、Ｎ（La Sota）、HP−16、テキサス（Texas）、
ヘルツ（Herts）、Ｆ、クイーンズランド（Queenslan
d）、ウルスター（Ulster）2Cおよびヒツチナー（Hitch
ner）B1。特にヒツチナーB1はよく知られた菌株であつ
て、例えばチヤンバーズ（P.Chanbers）らの論文に記載
されている〔ジエイ・ジエネラル・バイロロジー、第58
巻、第１頁〜第12頁（1982年）参照〕。ヒツチナーB1は
前記の中央獣医研究所から入手可能である。
よく知られている菌株としては次の菌株が挙げられる:A
V、LK、Ｎ（La Sota）、HP−16、テキサス（Texas）、
ヘルツ（Herts）、Ｆ、クイーンズランド（Queenslan
d）、ウルスター（Ulster）2Cおよびヒツチナー（Hitch
ner）B1。特にヒツチナーB1はよく知られた菌株であつ
て、例えばチヤンバーズ（P.Chanbers）らの論文に記載
されている〔ジエイ・ジエネラル・バイロロジー、第58
巻、第１頁〜第12頁（1982年）参照〕。ヒツチナーB1は
前記の中央獣医研究所から入手可能である。
エピトープおよびポリペプチドのロケーシヨンは、HN
またはＦポリペプチドに対するモノクロナル抗体に対す
る耐性に基づいて選択されるNDVのボーデツトＣ菌株変
異体のcDNAのシーケンシングによつておこなうことがで
きる。アミノ酸シーケンスの変化が群生する領域はエピ
トープの位置を示す。ある程度の予測と確認はコード化
されたアミノ酸についての研究から得られ、エピトープ
領域には親水性アミノ酸、例えばアルギニン（Ｒ）、リ
ジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸
（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）に
比較的富んでいるべきであることが一般に計算されてい
る。このようにしてエピトープ領域が決定されると、こ
れらの領域に関するポリペプチドをコード化するDNAオ
リゴヌクレオチドもしくはポリペプチドを合成すること
が可能となる。この合成は化学的な方法でおこなつても
よく、あるいは本明細書に記載のような組換えDNA法に
よつて得られるより長いDNAに制限酵素を適当に組合せ
て作用させることによつておこなつてもよい。
またはＦポリペプチドに対するモノクロナル抗体に対す
る耐性に基づいて選択されるNDVのボーデツトＣ菌株変
異体のcDNAのシーケンシングによつておこなうことがで
きる。アミノ酸シーケンスの変化が群生する領域はエピ
トープの位置を示す。ある程度の予測と確認はコード化
されたアミノ酸についての研究から得られ、エピトープ
領域には親水性アミノ酸、例えばアルギニン（Ｒ）、リ
ジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸
（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）に
比較的富んでいるべきであることが一般に計算されてい
る。このようにしてエピトープ領域が決定されると、こ
れらの領域に関するポリペプチドをコード化するDNAオ
リゴヌクレオチドもしくはポリペプチドを合成すること
が可能となる。この合成は化学的な方法でおこなつても
よく、あるいは本明細書に記載のような組換えDNA法に
よつて得られるより長いDNAに制限酵素を適当に組合せ
て作用させることによつておこなつてもよい。
HNおよび／またはＦ−遺伝子コーデイングシーケンス
のみの一部を含む本発明によるDNAは、雑種形成またはN
DVウイルスの菌株の核酸の入手過程において有用であ
る。RNAまたは別のNDV菌株のcDNAに対する本発明による
ポリヌクレオチドの雑種形成を確実におこなうために
は、雑種形成のヌクレオチドシーケンスのホモロジー度
は通常は85％より小さくすべきではなく、好ましくは少
なくとも90％、最も好ましくは90％もしくはそれ以上で
ある。しかしながら、このようなホモロジー度は雑種形
成されるべき特定の長さ、例えば最低12〜18個のヌクレ
オチドに対してのみ適用されるものである。このような
ホモロジー度は分子全体にわたつて適用される必要はな
い。もちろん、雑種形成用に選択されるオリゴヌクレオ
チドもしくはポリヌクレオチドがより長くてそのホモロ
ジー度が大きいほど、雑種形成のストリンジエンシー
（stringency）はより高くなり、従つて所望の結果を達
成する確実性がより高くなる。しかしながら、上記の全
体的なホモロジー度は通常は全体としてのHNもしくはＦ
遺伝子シーケンスにわたつて適用され得るものである。
選択したシーケンスが非常に短いときは、これに対応し
てホモロジー度を非常に高くすべきである。例えば、12
個のヌクレオチドのような短い長さのシーケンスにわた
つては95〜100％にすべきであり、また少なくとも16個
のヌクレオチドのような長さのシーケンスにわたつては
85％もしくはそれ以上、好ましくは90％もしくはそれ以
上にすべきである。プローブの最小の長さおよびパラミ
クソウイルスとホモロジー度は好ましくはこれに応じて
調整される。
のみの一部を含む本発明によるDNAは、雑種形成またはN
DVウイルスの菌株の核酸の入手過程において有用であ
る。RNAまたは別のNDV菌株のcDNAに対する本発明による
ポリヌクレオチドの雑種形成を確実におこなうために
は、雑種形成のヌクレオチドシーケンスのホモロジー度
は通常は85％より小さくすべきではなく、好ましくは少
なくとも90％、最も好ましくは90％もしくはそれ以上で
ある。しかしながら、このようなホモロジー度は雑種形
成されるべき特定の長さ、例えば最低12〜18個のヌクレ
オチドに対してのみ適用されるものである。このような
ホモロジー度は分子全体にわたつて適用される必要はな
い。もちろん、雑種形成用に選択されるオリゴヌクレオ
チドもしくはポリヌクレオチドがより長くてそのホモロ
ジー度が大きいほど、雑種形成のストリンジエンシー
（stringency）はより高くなり、従つて所望の結果を達
成する確実性がより高くなる。しかしながら、上記の全
体的なホモロジー度は通常は全体としてのHNもしくはＦ
遺伝子シーケンスにわたつて適用され得るものである。
選択したシーケンスが非常に短いときは、これに対応し
てホモロジー度を非常に高くすべきである。例えば、12
個のヌクレオチドのような短い長さのシーケンスにわた
つては95〜100％にすべきであり、また少なくとも16個
のヌクレオチドのような長さのシーケンスにわたつては
85％もしくはそれ以上、好ましくは90％もしくはそれ以
上にすべきである。プローブの最小の長さおよびパラミ
クソウイルスとホモロジー度は好ましくはこれに応じて
調整される。
本発明によるcDNAは適当な酵素を用いてゲノム性RNA
を転写してRNA:DNA雑種を得、該雑種をdC−テイルし（d
C−tail）、これをdG−テイルされた制限プラスミドベ
クターに対するアニーリング処理に付し、これによつて
該雑種を該ベクター内に組み入れ、このプラスミドベク
ターを用いてバクテリア性ホストに形質転換をおこさせ
た。関連するクローンは常法における抗生的な（antibi
otic）感性と耐性によつて選択し、さらに別々に調製し
たNDV cDNAのプローブに対するコロニー雑種形成によつ
て確認した。使用したこの方法の独創的な点はマツピン
グ技法（mapping technique）にあり、これによつてＦ
遺伝子のRNAに対して組換えDNAのサブ−クローンを雑種
形成させることが明らかに不可能であつた問題点を克服
した。NPとＦ遺伝子は非常に類似した分子量を有するた
めに、電気泳動法によつてこれらのmRNAを十分に分離す
ることは困難であつた。しかしながら、種々の方法の巧
妙な組合せによつて、生産された種々のクローンを正し
い遺伝子に帰属することが明らかに可能となつた。
を転写してRNA:DNA雑種を得、該雑種をdC−テイルし（d
C−tail）、これをdG−テイルされた制限プラスミドベ
クターに対するアニーリング処理に付し、これによつて
該雑種を該ベクター内に組み入れ、このプラスミドベク
ターを用いてバクテリア性ホストに形質転換をおこさせ
た。関連するクローンは常法における抗生的な（antibi
otic）感性と耐性によつて選択し、さらに別々に調製し
たNDV cDNAのプローブに対するコロニー雑種形成によつ
て確認した。使用したこの方法の独創的な点はマツピン
グ技法（mapping technique）にあり、これによつてＦ
遺伝子のRNAに対して組換えDNAのサブ−クローンを雑種
形成させることが明らかに不可能であつた問題点を克服
した。NPとＦ遺伝子は非常に類似した分子量を有するた
めに、電気泳動法によつてこれらのmRNAを十分に分離す
ることは困難であつた。しかしながら、種々の方法の巧
妙な組合せによつて、生産された種々のクローンを正し
い遺伝子に帰属することが明らかに可能となつた。
以下の実施例１によつて調製されたcDNAは長さが約70
0〜1400個のヌクレオチドの一連のクローン形態をとつ
ており、このうちのDNAインサートの適当な部分は遺伝
子の全長もしくはほぼ全長に対して相補性のDNAを生産
するように一緒に連結する。プラスミドインサートは周
知の方法、例えば第一のクローンのDNAインサートを、
その５′エンドでユニークに切断する制限酵素を用いて
制限することによつて一緒に連結することができる。こ
の第一のDNAインサートは、その５′の方向の第二のDNA
インサートと連結される。第二のDNAインサートは同じ
酵素によつてその３′エンドの近くの位置において制限
される。この２つのインサートは次いで周知の方法によ
つて連結することができ、その末端は使用する制限酵素
の種類によつてステイツキーエンド（sticky end）また
はブラントエンド（blunt end）にすることができる。
所望により、第三のインサートを同様にしてこの２つの
連結したインサートに連結し、得られた組換え分子を適
当なベクターに連結させることができる。
0〜1400個のヌクレオチドの一連のクローン形態をとつ
ており、このうちのDNAインサートの適当な部分は遺伝
子の全長もしくはほぼ全長に対して相補性のDNAを生産
するように一緒に連結する。プラスミドインサートは周
知の方法、例えば第一のクローンのDNAインサートを、
その５′エンドでユニークに切断する制限酵素を用いて
制限することによつて一緒に連結することができる。こ
の第一のDNAインサートは、その５′の方向の第二のDNA
インサートと連結される。第二のDNAインサートは同じ
酵素によつてその３′エンドの近くの位置において制限
される。この２つのインサートは次いで周知の方法によ
つて連結することができ、その末端は使用する制限酵素
の種類によつてステイツキーエンド（sticky end）また
はブラントエンド（blunt end）にすることができる。
所望により、第三のインサートを同様にしてこの２つの
連結したインサートに連結し、得られた組換え分子を適
当なベクターに連結させることができる。
HNおよびＦ蛋白質の発現に対しては、いずれかの通常
の発現ベクター、特に、強力なプロモーターを含んでい
て所望のホストに対して適合したバクテリア性ベクター
を使用することができる。特に好ましいこのような発現
ベクターは、強力なプロモーターシーケンスを有するも
の、例えばPL（フアージラムダの左方向のプロモータ
ー）を含むフアージラムダベクター、またはベーターラ
クタマーゼもしくはベーターガラクトシダーゼ遺伝子を
変換させ（switch on）かつ本発明によるDNAによつてコ
ード化されたHNもしくはF NDV遺伝子に連結させること
ができるlacもしくはgalプロモーターを含むプラスミド
である。いわゆる乱雑な（promiscuous）プラスミド、
例えばRP4またはプラスミドのInc−P1（incompatibilit
y−P1）グループの別のものを使用することができる。
の発現ベクター、特に、強力なプロモーターを含んでい
て所望のホストに対して適合したバクテリア性ベクター
を使用することができる。特に好ましいこのような発現
ベクターは、強力なプロモーターシーケンスを有するも
の、例えばPL（フアージラムダの左方向のプロモータ
ー）を含むフアージラムダベクター、またはベーターラ
クタマーゼもしくはベーターガラクトシダーゼ遺伝子を
変換させ（switch on）かつ本発明によるDNAによつてコ
ード化されたHNもしくはF NDV遺伝子に連結させること
ができるlacもしくはgalプロモーターを含むプラスミド
である。いわゆる乱雑な（promiscuous）プラスミド、
例えばRP4またはプラスミドのInc−P1（incompatibilit
y−P1）グループの別のものを使用することができる。
ベクター用の有用なバクテリア性ホストには常套のい
ずれのベクター、例えば大腸菌、枯草菌またはストレプ
トミセス属の放線菌の種（species）が含まれる。下等
な真核生物、例えば容易に入手し得るイースト中におけ
るクローニングは適当なシヤトルベクターを使用するこ
とによつておこなうことができ、これによつて、ベクタ
ー内のインサートDNAを例えば大腸菌からイーストへ行
来させる（shuttle）ことができる。
ずれのベクター、例えば大腸菌、枯草菌またはストレプ
トミセス属の放線菌の種（species）が含まれる。下等
な真核生物、例えば容易に入手し得るイースト中におけ
るクローニングは適当なシヤトルベクターを使用するこ
とによつておこなうことができ、これによつて、ベクタ
ー内のインサートDNAを例えば大腸菌からイーストへ行
来させる（shuttle）ことができる。
適当なシヤトルベクターとしては、大腸菌およびイー
スト有機体麦酒酵母菌中で複製可能なベクターであるYR
P７およびPJDB219が例示される。
スト有機体麦酒酵母菌中で複製可能なベクターであるYR
P７およびPJDB219が例示される。
以下の実施例１は、NDVのゲノム性RNAに対するHN−お
よび／またはＦ−コーデイングcDNAのインサートを有す
るプラスミドを含むバクテリアクローンを得るために使
用した組換えDNA技法およびボーデツトＣウイルスNDV R
NAのＦおよびHN遺伝子をコード化するcDNAの正確なもし
くは実質上正確なシーケンスについて説明する。実施例
２はNDVの別の菌株のHN−およびＦ−コーデイングcDNA
RNAの調製とシーケンシングについて説明する。
よび／またはＦ−コーデイングcDNAのインサートを有す
るプラスミドを含むバクテリアクローンを得るために使
用した組換えDNA技法およびボーデツトＣウイルスNDV R
NAのＦおよびHN遺伝子をコード化するcDNAの正確なもし
くは実質上正確なシーケンスについて説明する。実施例
２はNDVの別の菌株のHN−およびＦ−コーデイングcDNA
RNAの調製とシーケンシングについて説明する。
実施例１ 原料 NDV菌株ボーデツトＣはフオツクス（C.F.Fox）教授
（カリフオルニア大学、ロサンジエルス）から入手し
た。NDV菌株ヒツチナーB1はマクフエラン氏（J.B.McFer
ran）〔獣医リサーチ研究所（Veterinary Research Lab
oratories）、ストーモント、英国〕から入手した。マ
ジン・アンド・ダービ・ボビン腎臓（Madin and Darby
bovine kindney;MDBK）の細胞はフロー研究所（Flow La
boratories）（アーヴイン、英国）から入手した。大腸
菌株DH1はピーター・ミーコツク氏（Peter Meacock）
（レスター大学、英国）から入手した。逆転写酵素はラ
イフ・サイエンシズ社（Life Sciences Inc.）（フロリ
ダ、米国）から入手した。子牛胸腺DNAとターミナル転
移酵素のDNアーゼ消化によつて生じたランダムヘキサヌ
クレオチドプライマー混合物はフアーマシア社（Pharma
cia）（ミルトンキーンズ、英国）から入手した。ラジ
オヌクレオチドはアマーシヤム・インターナシヨナル社
（Amersham International）（アマーシヤム、英国）か
ら入手した。DNアーゼ１はシグマ社（Sigma）（ロンド
ン、英国）から入手した。DNAポリメラーゼおよびクレ
ナウ（Klenow）フラグメントはビー・シー・エル社（BC
L）（ルイス、英国）から入手した。ニトロセルロース
フイルターはミリポア社（Millipore）（モルシエイ
ム、フランス）またはアマーシヤム・インターナシヨナ
ル社（英国）から入手した。ポリヌクレオチドキナー
ゼ、バナジルリボヌクレオシドコンプレツクスおよびオ
リゴdG−テイル化Pst IカツトpBR322はビー・アール・
エル社（BRL）（ケンブリツジ、英国）から入手した。
制限エンドヌクレアーゼはビー・アール・エル社、ビー
・シー・エル社またはエヌ・ビー・エル・エンザイムズ
（NBL enzymes）（クラムリントン、英国）から入手し
た。ポール・バイオダイン（Pall Biodyne）Ａ膜はポー
ル・プロセス・フイルトレーシヨン社（Pall Process F
iltration Ltd.）（ポーツマス、・英国）から入手し
た。
（カリフオルニア大学、ロサンジエルス）から入手し
た。NDV菌株ヒツチナーB1はマクフエラン氏（J.B.McFer
ran）〔獣医リサーチ研究所（Veterinary Research Lab
oratories）、ストーモント、英国〕から入手した。マ
ジン・アンド・ダービ・ボビン腎臓（Madin and Darby
bovine kindney;MDBK）の細胞はフロー研究所（Flow La
boratories）（アーヴイン、英国）から入手した。大腸
菌株DH1はピーター・ミーコツク氏（Peter Meacock）
（レスター大学、英国）から入手した。逆転写酵素はラ
イフ・サイエンシズ社（Life Sciences Inc.）（フロリ
ダ、米国）から入手した。子牛胸腺DNAとターミナル転
移酵素のDNアーゼ消化によつて生じたランダムヘキサヌ
クレオチドプライマー混合物はフアーマシア社（Pharma
cia）（ミルトンキーンズ、英国）から入手した。ラジ
オヌクレオチドはアマーシヤム・インターナシヨナル社
（Amersham International）（アマーシヤム、英国）か
ら入手した。DNアーゼ１はシグマ社（Sigma）（ロンド
ン、英国）から入手した。DNAポリメラーゼおよびクレ
ナウ（Klenow）フラグメントはビー・シー・エル社（BC
L）（ルイス、英国）から入手した。ニトロセルロース
フイルターはミリポア社（Millipore）（モルシエイ
ム、フランス）またはアマーシヤム・インターナシヨナ
ル社（英国）から入手した。ポリヌクレオチドキナー
ゼ、バナジルリボヌクレオシドコンプレツクスおよびオ
リゴdG−テイル化Pst IカツトpBR322はビー・アール・
エル社（BRL）（ケンブリツジ、英国）から入手した。
制限エンドヌクレアーゼはビー・アール・エル社、ビー
・シー・エル社またはエヌ・ビー・エル・エンザイムズ
（NBL enzymes）（クラムリントン、英国）から入手し
た。ポール・バイオダイン（Pall Biodyne）Ａ膜はポー
ル・プロセス・フイルトレーシヨン社（Pall Process F
iltration Ltd.）（ポーツマス、・英国）から入手し
た。
NDVの分子クローニング クローニングの手順はカン（A.J.Cann）らの論文〔ヌ
クレイツク・アシツズ・リサーチ、第11巻、第1267頁〜
第1281頁（1983年）〕に記載の方法を修正したものであ
る。NDV菌株ボーデツトＣは、チヤンバーズ（P.Chamber
s）らの方法〔ジヤーナル・オブ・ジエネラル・パイロ
ロジー、第50巻、第155頁〜第166頁（1980年）参照〕に
従つてエツグ中で増殖させた後、遠心分離処理に付して
精製した。RNAは、プロテアーゼK2mgを含有する緩衝液
〔10mMバナジルリボヌクレオシドコンプレツクス、0.15
M NaCl、１％SDS、12mM EDTA、0.1Mトリス/HCl（pH7.
5）含有〕を用いてNDV（蛋白質約5mg含有）を37℃で１
時間消化し、次いで８−ヒドロキシキノリン0.1％（w/
v）含有するフエノールを用いて56℃で３回抽出するこ
とによつて抽出した。ビリオンRNAはエタノール沈殿法
によつてH2Oの最終容量が100μｌになるまで濃縮した。
クレイツク・アシツズ・リサーチ、第11巻、第1267頁〜
第1281頁（1983年）〕に記載の方法を修正したものであ
る。NDV菌株ボーデツトＣは、チヤンバーズ（P.Chamber
s）らの方法〔ジヤーナル・オブ・ジエネラル・パイロ
ロジー、第50巻、第155頁〜第166頁（1980年）参照〕に
従つてエツグ中で増殖させた後、遠心分離処理に付して
精製した。RNAは、プロテアーゼK2mgを含有する緩衝液
〔10mMバナジルリボヌクレオシドコンプレツクス、0.15
M NaCl、１％SDS、12mM EDTA、0.1Mトリス/HCl（pH7.
5）含有〕を用いてNDV（蛋白質約5mg含有）を37℃で１
時間消化し、次いで８−ヒドロキシキノリン0.1％（w/
v）含有するフエノールを用いて56℃で３回抽出するこ
とによつて抽出した。ビリオンRNAはエタノール沈殿法
によつてH2Oの最終容量が100μｌになるまで濃縮した。
相補DNA（cDNA）合成は、ビリオンRNA1〜２μｇにラ
ンダムヘキサヌクレオチドプライマー２μｇおよび以下
の成分を含む緩衝液に含有させた逆転写酵素20ユニツト
を37℃で30分間作用させ、次いで42℃で90分間作用させ
ることによつておこなつた:100mM NaCl、8mM MgCl2、20
mM2−メルカプトエタノール、１μCurデオキシシチジン
トリフオスフエート、50μＭデオキシヌクレオシドトリ
フオスフエート、50mMトリス/HCl（pH8.3）。
ンダムヘキサヌクレオチドプライマー２μｇおよび以下
の成分を含む緩衝液に含有させた逆転写酵素20ユニツト
を37℃で30分間作用させ、次いで42℃で90分間作用させ
ることによつておこなつた:100mM NaCl、8mM MgCl2、20
mM2−メルカプトエタノール、１μCurデオキシシチジン
トリフオスフエート、50μＭデオキシヌクレオシドトリ
フオスフエート、50mMトリス/HCl（pH8.3）。
RNA:DNA雑種はセフアデツクス（Sephadex）G100カラ
ム2mlで脱塩し、エタノールを用いて沈殿させた後、H2O
（最終容量:10μｌ）中に再懸濁させた。RNA:DNA雑種
は、以下の成分を含む緩衝液中に含有させたターミナル
転移酵素10ユニツトと共に37℃で20分間培養することに
よつてオリゴdCでテイル化させた:140mMカコジル酸カリ
ウム（pH6.9）、1mMCoCl2、25μＭデオキシシチジント
リフオスフエートおよび１μCur3Hデオキシシチジント
リフオスフエート（この第２の合成反応においてはより
多量のラジオヌクレオチドを使用した）。オリゴdC−テ
イル化RNA:DNA雑種を、アニーリング緩衝液（100mM NaC
l、0.1mM EDTA、10mMトリス/HCl、pH7.5）を含むセフア
デツクスカラム2ml中を通した。アニーリング緩衝液中
のオリゴdC−テイル化RNA:DNA雑種100μｌを65℃で５分
間、次いで45℃で２時間アニールすることによつてオリ
ゴdG−テイル化Pst I−カツトpBR322 1μｌ（0.25μ
ｇ）とし、これを室温まで一夜冷却した後、氷上でさら
に24時間保持した（雑種:pBR322のこのような最適割合
は小規模のアニーリングおよび形質転換によつて決定し
た）。アニールした混合物を反応性の（competent）大
腸菌菌株DH1へ形質転換させ、テトラサイクリン10μg/m
l含有寒天上で培養させた。
ム2mlで脱塩し、エタノールを用いて沈殿させた後、H2O
（最終容量:10μｌ）中に再懸濁させた。RNA:DNA雑種
は、以下の成分を含む緩衝液中に含有させたターミナル
転移酵素10ユニツトと共に37℃で20分間培養することに
よつてオリゴdCでテイル化させた:140mMカコジル酸カリ
ウム（pH6.9）、1mMCoCl2、25μＭデオキシシチジント
リフオスフエートおよび１μCur3Hデオキシシチジント
リフオスフエート（この第２の合成反応においてはより
多量のラジオヌクレオチドを使用した）。オリゴdC−テ
イル化RNA:DNA雑種を、アニーリング緩衝液（100mM NaC
l、0.1mM EDTA、10mMトリス/HCl、pH7.5）を含むセフア
デツクスカラム2ml中を通した。アニーリング緩衝液中
のオリゴdC−テイル化RNA:DNA雑種100μｌを65℃で５分
間、次いで45℃で２時間アニールすることによつてオリ
ゴdG−テイル化Pst I−カツトpBR322 1μｌ（0.25μ
ｇ）とし、これを室温まで一夜冷却した後、氷上でさら
に24時間保持した（雑種:pBR322のこのような最適割合
は小規模のアニーリングおよび形質転換によつて決定し
た）。アニールした混合物を反応性の（competent）大
腸菌菌株DH1へ形質転換させ、テトラサイクリン10μg/m
l含有寒天上で培養させた。
pBR322のPst Iサイトはアンペシリン耐性遺伝子内に
存在する。形質転換体（transfomant）の75％以上がア
ンピシリン感性（ampicillin−sensitive）であり、従
つて含有インサートはPst Iサイトに存在すると考えら
れる。37℃で２日間増殖させた形質転換体を寒天プレー
ト上のニトロセルロースフイルター上で画線培養させた
後、グルンスタイン（M.Grunstein）とホグネス（D.S.H
ogness）の方法〔プロス・ナト・アカド・サイ・ユー・
エス・エイ（Proc.Nat.Acad.Sci.USA）、第72巻、第396
1頁〜第3965頁（1975年）参照〕によつて溶解させ、次
いでベーキング処理に付した。NDVに特有の（NDV−spec
ific）インサートを含有する形質転換体はフイルター上
のコロニー雑種形成によつて検出した。NDV遺伝子プロ
ーブを以下のようにして調製した。NDVのゲノム性RNAを
上記の様にして逆転写させた〔但し、この場合は非放射
性デオキシアデノシントリフオスフエートおよび3Hデオ
キシシチジントリフオスフエートを省略し、20μCurの
（α−35S）デオキシアデノシントリフオスフエートを
使用した〕。放射性同位体20〜30％を典型的な反応によ
つてcDNA内へ組み入れた。cDNAを沸騰によつてRNAから
分離させた。得られた標識付けされたssDNAをプローブ
として使用した。フイルターを、５×〔デンハルト（De
nhardt）溶液〕、６×SSC（0.9M NaCl、90mMクエン酸ナ
トリウム）および子牛の沸騰剪断胸腺DNA50μg/mlを含
有する溶液中において65℃で３時間の前雑種形成処理に
付した後、同じ溶液中において65℃で一夜、プローブに
対して雑種形成させた。フイルターを３×SSC/0.1％SDS
中において65℃で１時間にわたり３回洗浄し、乾燥後、
Ｘ線フイルム〔コダツク（Kodak）NS 59T〕に−70℃で
さらした。NDVに特有のクローン700から成るバンクを２
段階で形成させた。最初の300のクローンは残りのクロ
ーンが生じる前に分析した。大部分のインサートは500
〜1000の塩基対の範囲内にあつたが、わずかなインサー
トは2000以上の塩基対を有していた。
存在する。形質転換体（transfomant）の75％以上がア
ンピシリン感性（ampicillin−sensitive）であり、従
つて含有インサートはPst Iサイトに存在すると考えら
れる。37℃で２日間増殖させた形質転換体を寒天プレー
ト上のニトロセルロースフイルター上で画線培養させた
後、グルンスタイン（M.Grunstein）とホグネス（D.S.H
ogness）の方法〔プロス・ナト・アカド・サイ・ユー・
エス・エイ（Proc.Nat.Acad.Sci.USA）、第72巻、第396
1頁〜第3965頁（1975年）参照〕によつて溶解させ、次
いでベーキング処理に付した。NDVに特有の（NDV−spec
ific）インサートを含有する形質転換体はフイルター上
のコロニー雑種形成によつて検出した。NDV遺伝子プロ
ーブを以下のようにして調製した。NDVのゲノム性RNAを
上記の様にして逆転写させた〔但し、この場合は非放射
性デオキシアデノシントリフオスフエートおよび3Hデオ
キシシチジントリフオスフエートを省略し、20μCurの
（α−35S）デオキシアデノシントリフオスフエートを
使用した〕。放射性同位体20〜30％を典型的な反応によ
つてcDNA内へ組み入れた。cDNAを沸騰によつてRNAから
分離させた。得られた標識付けされたssDNAをプローブ
として使用した。フイルターを、５×〔デンハルト（De
nhardt）溶液〕、６×SSC（0.9M NaCl、90mMクエン酸ナ
トリウム）および子牛の沸騰剪断胸腺DNA50μg/mlを含
有する溶液中において65℃で３時間の前雑種形成処理に
付した後、同じ溶液中において65℃で一夜、プローブに
対して雑種形成させた。フイルターを３×SSC/0.1％SDS
中において65℃で１時間にわたり３回洗浄し、乾燥後、
Ｘ線フイルム〔コダツク（Kodak）NS 59T〕に−70℃で
さらした。NDVに特有のクローン700から成るバンクを２
段階で形成させた。最初の300のクローンは残りのクロ
ーンが生じる前に分析した。大部分のインサートは500
〜1000の塩基対の範囲内にあつたが、わずかなインサー
トは2000以上の塩基対を有していた。
クローン化インサートのマツプの作成 以下の４つの技法を使用してクローン化インサートの
相互間の位置およびこれらのNDVゲノム中での位置に関
するマツプを作成した。
相互間の位置およびこれらのNDVゲノム中での位置に関
するマツプを作成した。
1.ドツト・ブロツト（dot blot）雑種形成 最初に調製した300のクローンのうちから27のクロー
ンを選択して、α−35Sで標識付けしたcDNAに対するこ
れらの大きな雑種形成力、および「ミニプレプス（mini
preps）」として知られている小規模なプラスミド調製
品から決定されたこれらの大きなインサートサイズ（典
型的には1000〜2000塩基対）に関する研究をおこなつ
た。より大きな規模のプラスミドの単離をおこない、次
いでプラスミドDNAをHind IIIを用いて線状にし、沸騰
させることによつてDNAストランドを分離させ、２×SSP
E（0.36M NaCl、2mM EDTA、20mM NaH2PO4、pH8.3）を加
え、これを既知パターン内のニトロセルロースフイルタ
ー上に点在させ、次いで真空下、80℃で２時間のベーキ
ング処理に付すことによつてDNAをニトロセルロースを
結合させた。特定のプラスミド、例えば「2.87」で指定
されるものからPst Iによつて切断され、アガロースゲ
ル上で精製した後、電気溶離およびフエノール抽出処理
に付し〔マクドネル（M.S.McDonnell）ら、ジエイ・モ
イ・バイオル（J.Mol.Biol.）、第110巻、第119頁〜第1
46頁（1977年）参照〕、次いで（α−35S）デオキシア
デノシントリフオスフエートを用いるニツク翻訳によつ
て標識付けされたインサートのcDNAの調製品を用いるプ
ロービング（probing）処理にDNAドツトのパターンを付
した。雑種形成条件、洗浄処理およびＸ線フイルムに対
する暴露は、形質転換体のスクリーニングに関する前記
の場合と同様である。（2.87自体を含む）10種類のプラ
スミドは該プローブと強固に雑種形成する。
ンを選択して、α−35Sで標識付けしたcDNAに対するこ
れらの大きな雑種形成力、および「ミニプレプス（mini
preps）」として知られている小規模なプラスミド調製
品から決定されたこれらの大きなインサートサイズ（典
型的には1000〜2000塩基対）に関する研究をおこなつ
た。より大きな規模のプラスミドの単離をおこない、次
いでプラスミドDNAをHind IIIを用いて線状にし、沸騰
させることによつてDNAストランドを分離させ、２×SSP
E（0.36M NaCl、2mM EDTA、20mM NaH2PO4、pH8.3）を加
え、これを既知パターン内のニトロセルロースフイルタ
ー上に点在させ、次いで真空下、80℃で２時間のベーキ
ング処理に付すことによつてDNAをニトロセルロースを
結合させた。特定のプラスミド、例えば「2.87」で指定
されるものからPst Iによつて切断され、アガロースゲ
ル上で精製した後、電気溶離およびフエノール抽出処理
に付し〔マクドネル（M.S.McDonnell）ら、ジエイ・モ
イ・バイオル（J.Mol.Biol.）、第110巻、第119頁〜第1
46頁（1977年）参照〕、次いで（α−35S）デオキシア
デノシントリフオスフエートを用いるニツク翻訳によつ
て標識付けされたインサートのcDNAの調製品を用いるプ
ロービング（probing）処理にDNAドツトのパターンを付
した。雑種形成条件、洗浄処理およびＸ線フイルムに対
する暴露は、形質転換体のスクリーニングに関する前記
の場合と同様である。（2.87自体を含む）10種類のプラ
スミドは該プローブと強固に雑種形成する。
2.ノーザン・ブロツト（Northern blot）雑種形成 選択されたプラスミドのそれらの対応するmRNAに対す
るマツピングをノーザン・ブロツト雑種形成によつてお
こなつた。MDBK細胞をNDV菌株ヒツツナーB1を用いて100
0EID50/90mmペトリ皿で感染させた（EID50：エツグを感
染する確率が50％のNDVの適用量）。感染から24時間経
過後、細胞の単層をPBS（137mM NaCl、8.1mM Na2HPO4、
2.7mM KCl、1.5mM KH2PO4）を用いてすすぎ、次いで4.2
Mグアニジニウムチオシアネート、0.5％サルコシル（sa
rkosyl）Ｌ、25mMクエン酸ナトリウム、0.33％シグマ・
アンチフオーム（Sigma antifoam）Ａ、を用いて溶解さ
せた。この細胞溶解物を、25mM酢酸ナトリウム溶液（pH
5.0）中に塩化カルシウム5.7M加えたクツシヨン上に載
置し、MSE6×15mlローター内において一夜遠心分離処理
（35000rpm）に付することによつて全細胞質RNAをペレ
ツトとした。このペレツト化したRNAを、5mM EDTA、１
％SDS、10mMトリス/HCl（pH7.4）を含む溶液中に再懸濁
させ、クロロホルムとブタノールの混合溶媒（4:1v/v）
を用いて抽出し、次いで0.1容量の3M酢酸ナトリウムお
よび2.2容量のエタノールを添加後、−20℃で沈殿させ
た。コントロール調製品を非感染細胞から調製した。RN
Aを50％ホルムアミド、10％ホルムアルデヒドを用いて6
0℃で５分間変性させ、次いで6.5％ホルムアルデヒドお
よび20mM燐酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）を含有する1.8
％アガロースゲル上での電気泳動処理に付すことによつ
て個々のmRNAを得た。個々のNDV mRNAをこれらの分子量
に基づくゲル電気泳動法によつて分割し、これらのmRNA
の蛋白質コーデイング・アサインメント（coding assig
nment）をイン・ヴイトロでの翻訳によつて決定した
（コリンズらの前記文献参照）。交互レーン（alternat
e lanes）に感染および非感染細胞質RNAを、ブロツテイ
ング（blotting）後にフイルターを各ストリツプあたり
感染物質および非感染物質の各々の１つのトラツクを有
するストリツプに切断できるように配置させた（10μg/
トラツク）。RNAを染色処理（staining）またはゲルの
前処理をおこなうことなく、トーマス（G.Thomas）らの
論文に記載のようにしてポール・バイオダインＡ膜上へ
移動させた〔プロス・ナト・アカド・サイ・ユー・エス
・エイ、第77巻、第5201頁〜第5205頁（1980年）参
照〕。ストリツプの各バツチからの１つの試料をウイル
スのゲノム性RNAを用いるプロービング処理に付し、ア
ルカリを用いて加水分解し、次いでポリヌクレオチドキ
ナーゼにより、（α32P）アデノシントリフオスフエー
トを用いてエンドを標識付けした。これは全てのmRNAバ
ンドを示すコントロールである。その他のストリツプは
個々に、ニツク翻訳により（α32P）デオキシシチジン
トリフオスフエートを用いて標識付けした適当な選択さ
れたプラスミドDNAを用いるプロービング処理に付し
た。雑種形成の条件はトーマスらの前記文献（1980年）
に記載の方法に基づいた。フイルターは、50％脱イオン
化ホルムアミド、2.5Xデーンハルト溶液、２×SSPE、0.
375％SDS、250μg/ml沸騰サーモン精液DNAを含む溶液中
において42℃で４〜６時間インキユベートすることによ
つて前雑種形成処理に付した。雑種形成は、プローブを
含有する類似の溶液中において同温度で一夜（18〜20時
間）おこなつた。フイルターを、２×SSC、0.1％SDSを
含有する溶液中において室温で15分間にわたつて４回洗
浄し、次いで１×SET（150mM NaCl、2mM EDTA、30mMト
リス/HClpH8.0）中において室温で15分間にわたつて１
回洗浄し、さらに１×SETまたは0.5×SET中において68
℃で20分間にわたつて２回洗浄した。含湿気フイルター
を薄いポリエチレン製バツグ内へ封入し、これにＸ−線
フイルム（コダツクＸ−Omat S）を室温でさらした。
るマツピングをノーザン・ブロツト雑種形成によつてお
こなつた。MDBK細胞をNDV菌株ヒツツナーB1を用いて100
0EID50/90mmペトリ皿で感染させた（EID50：エツグを感
染する確率が50％のNDVの適用量）。感染から24時間経
過後、細胞の単層をPBS（137mM NaCl、8.1mM Na2HPO4、
2.7mM KCl、1.5mM KH2PO4）を用いてすすぎ、次いで4.2
Mグアニジニウムチオシアネート、0.5％サルコシル（sa
rkosyl）Ｌ、25mMクエン酸ナトリウム、0.33％シグマ・
アンチフオーム（Sigma antifoam）Ａ、を用いて溶解さ
せた。この細胞溶解物を、25mM酢酸ナトリウム溶液（pH
5.0）中に塩化カルシウム5.7M加えたクツシヨン上に載
置し、MSE6×15mlローター内において一夜遠心分離処理
（35000rpm）に付することによつて全細胞質RNAをペレ
ツトとした。このペレツト化したRNAを、5mM EDTA、１
％SDS、10mMトリス/HCl（pH7.4）を含む溶液中に再懸濁
させ、クロロホルムとブタノールの混合溶媒（4:1v/v）
を用いて抽出し、次いで0.1容量の3M酢酸ナトリウムお
よび2.2容量のエタノールを添加後、−20℃で沈殿させ
た。コントロール調製品を非感染細胞から調製した。RN
Aを50％ホルムアミド、10％ホルムアルデヒドを用いて6
0℃で５分間変性させ、次いで6.5％ホルムアルデヒドお
よび20mM燐酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）を含有する1.8
％アガロースゲル上での電気泳動処理に付すことによつ
て個々のmRNAを得た。個々のNDV mRNAをこれらの分子量
に基づくゲル電気泳動法によつて分割し、これらのmRNA
の蛋白質コーデイング・アサインメント（coding assig
nment）をイン・ヴイトロでの翻訳によつて決定した
（コリンズらの前記文献参照）。交互レーン（alternat
e lanes）に感染および非感染細胞質RNAを、ブロツテイ
ング（blotting）後にフイルターを各ストリツプあたり
感染物質および非感染物質の各々の１つのトラツクを有
するストリツプに切断できるように配置させた（10μg/
トラツク）。RNAを染色処理（staining）またはゲルの
前処理をおこなうことなく、トーマス（G.Thomas）らの
論文に記載のようにしてポール・バイオダインＡ膜上へ
移動させた〔プロス・ナト・アカド・サイ・ユー・エス
・エイ、第77巻、第5201頁〜第5205頁（1980年）参
照〕。ストリツプの各バツチからの１つの試料をウイル
スのゲノム性RNAを用いるプロービング処理に付し、ア
ルカリを用いて加水分解し、次いでポリヌクレオチドキ
ナーゼにより、（α32P）アデノシントリフオスフエー
トを用いてエンドを標識付けした。これは全てのmRNAバ
ンドを示すコントロールである。その他のストリツプは
個々に、ニツク翻訳により（α32P）デオキシシチジン
トリフオスフエートを用いて標識付けした適当な選択さ
れたプラスミドDNAを用いるプロービング処理に付し
た。雑種形成の条件はトーマスらの前記文献（1980年）
に記載の方法に基づいた。フイルターは、50％脱イオン
化ホルムアミド、2.5Xデーンハルト溶液、２×SSPE、0.
375％SDS、250μg/ml沸騰サーモン精液DNAを含む溶液中
において42℃で４〜６時間インキユベートすることによ
つて前雑種形成処理に付した。雑種形成は、プローブを
含有する類似の溶液中において同温度で一夜（18〜20時
間）おこなつた。フイルターを、２×SSC、0.1％SDSを
含有する溶液中において室温で15分間にわたつて４回洗
浄し、次いで１×SET（150mM NaCl、2mM EDTA、30mMト
リス/HClpH8.0）中において室温で15分間にわたつて１
回洗浄し、さらに１×SETまたは0.5×SET中において68
℃で20分間にわたつて２回洗浄した。含湿気フイルター
を薄いポリエチレン製バツグ内へ封入し、これにＸ−線
フイルム（コダツクＸ−Omat S）を室温でさらした。
3.制限酵素マツピング ドツド・ブロツト雑種形成によつて決定されたよう
に、オーバーラツプしたプラスミドのマツピングを、制
限酵素パネルを用いる消化によつておこなつた。第一
に、クローン化インサートにおけるPst I、Eco RI、Hin
d III、Bam HI、Pvu IIおよびAvaＩサイトのマツピング
をおこなつた。多くの場合、これによつてインサートを
相互に配列するのに十分なデータが得られた。必要な場
合には、付加的な制限酵素のサイトのマツピングをおこ
なつて、ドツド・ブロツト雑種形成によつて示されたオ
ーバーラツプを確認した。
に、オーバーラツプしたプラスミドのマツピングを、制
限酵素パネルを用いる消化によつておこなつた。第一
に、クローン化インサートにおけるPst I、Eco RI、Hin
d III、Bam HI、Pvu IIおよびAvaＩサイトのマツピング
をおこなつた。多くの場合、これによつてインサートを
相互に配列するのに十分なデータが得られた。必要な場
合には、付加的な制限酵素のサイトのマツピングをおこ
なつて、ドツド・ブロツト雑種形成によつて示されたオ
ーバーラツプを確認した。
4.コロニー雑種形成 NDVに特有のクローンのバンクを、ニツク翻訳された
（α35S）標識化インサートcDNAを用いるプロービング
処理に付すことによつて、最初のドツド・ブロツト雑種
形成においてマツプされた領域を拡張するクローンを検
出した。クローンを、前記のNDVの分子クローニングの
場合のように、ニトロセルロース上に画線状に載置さ
せ、寒天上において37℃で一夜増殖させ、溶解させた
後、ベーキング処理に付し、次いで前記のドツト・ブロ
ツト雑種形成の場合のように、プローブに対して雑種形
成させ、洗浄後、乾燥させた。プローブに対して雑種形
成させたクローンを分析し、プラスミド中のインサート
のサイズを決定した。見込みのある場合には、より大き
な規模でのプラスミドの調製を実施し、制限酵素サイト
のマツピングをおこなつて、新たに選択されたプラスミ
ドがプローブのインサート中に存在する領域を越える
（extend）かどうかを決定した。前記のドツト・ブロツ
ト雑種形成技術（１）により、27個のプラスミドのうち
の22個のプラスミドを、ドツト・ブロツト雑種形成によ
る２つの非オーバーラツピンググループに対するマツピ
ング処理に付したところ、10個のプラスミドがプラスミ
ド2.87に対して強い雑種形成能を示した。その他のもの
は微弱な非再現性スポツトのみを与えた。前記のノーザ
ン・ブロツテイング（２）によつて、特定のプラスミド
中において、該プラスミドが雑種形成するmRNAによつて
どの遺伝子が表現されるかということを、一つの重要な
条件付けで演繹することが可能であつた。この条件は、
NPとＦのmRNAが十分に分割されないためにこれらのmRNA
に対して雑種形成されたプラスミドをこれらのデータの
みに基づいてNP遺伝子またはＦ遺伝子に帰属できなかつ
たことである。ノーザン・ブロツテイングにのみ基づい
て解釈された８個のプラスミドから得られた実質的な結
果を簡単化した形で以下の表−１に示す。表中、「イエ
ス（Yes）」は特定の遺伝子の少なくとも一部に対して
強い雑種形成能を有することを示す。プラスミド2.87
は、ドツト雑種形成によつて分離されたプラスミドの前
記の２つの非オーバーラツピンググループのうちの１つ
であつて、Ｌ遺伝子中に位置することが見出された。
（α35S）標識化インサートcDNAを用いるプロービング
処理に付すことによつて、最初のドツド・ブロツト雑種
形成においてマツプされた領域を拡張するクローンを検
出した。クローンを、前記のNDVの分子クローニングの
場合のように、ニトロセルロース上に画線状に載置さ
せ、寒天上において37℃で一夜増殖させ、溶解させた
後、ベーキング処理に付し、次いで前記のドツト・ブロ
ツト雑種形成の場合のように、プローブに対して雑種形
成させ、洗浄後、乾燥させた。プローブに対して雑種形
成させたクローンを分析し、プラスミド中のインサート
のサイズを決定した。見込みのある場合には、より大き
な規模でのプラスミドの調製を実施し、制限酵素サイト
のマツピングをおこなつて、新たに選択されたプラスミ
ドがプローブのインサート中に存在する領域を越える
（extend）かどうかを決定した。前記のドツト・ブロツ
ト雑種形成技術（１）により、27個のプラスミドのうち
の22個のプラスミドを、ドツト・ブロツト雑種形成によ
る２つの非オーバーラツピンググループに対するマツピ
ング処理に付したところ、10個のプラスミドがプラスミ
ド2.87に対して強い雑種形成能を示した。その他のもの
は微弱な非再現性スポツトのみを与えた。前記のノーザ
ン・ブロツテイング（２）によつて、特定のプラスミド
中において、該プラスミドが雑種形成するmRNAによつて
どの遺伝子が表現されるかということを、一つの重要な
条件付けで演繹することが可能であつた。この条件は、
NPとＦのmRNAが十分に分割されないためにこれらのmRNA
に対して雑種形成されたプラスミドをこれらのデータの
みに基づいてNP遺伝子またはＦ遺伝子に帰属できなかつ
たことである。ノーザン・ブロツテイングにのみ基づい
て解釈された８個のプラスミドから得られた実質的な結
果を簡単化した形で以下の表−１に示す。表中、「イエ
ス（Yes）」は特定の遺伝子の少なくとも一部に対して
強い雑種形成能を有することを示す。プラスミド2.87
は、ドツト雑種形成によつて分離されたプラスミドの前
記の２つの非オーバーラツピンググループのうちの１つ
であつて、Ｌ遺伝子中に位置することが見出された。
ドツト・ブロツト雑種形成とノーザン・ブロツト雑種
形成においてマツプされた領域間のギヤツプを満たすた
めのクローンをコロニー雑種形成によつて選択した。例
えば、ノーザン・ブロツト雑種形成においてはHN遺伝子
に対してプラスミド2.73のマツピングをおこなつた。制
限酵素マツピングにより、これは、ドツト・ブロツト雑
種形成によつて分離された非オーバーラツピングプラス
ミドの第２グループの最も離れた３′方向のものである
ことが示された。2.73からのインサートを用いてコロニ
ー・バンクのプロービングをおこなつたところ、特にク
ローン4.68はポジテイブな雑種形成能を示した。制限酵
素マツピンクにより、4.68からのインサートがさらに
３′方向へ延びてHN遺伝子に達することが示された。
形成においてマツプされた領域間のギヤツプを満たすた
めのクローンをコロニー雑種形成によつて選択した。例
えば、ノーザン・ブロツト雑種形成においてはHN遺伝子
に対してプラスミド2.73のマツピングをおこなつた。制
限酵素マツピングにより、これは、ドツト・ブロツト雑
種形成によつて分離された非オーバーラツピングプラス
ミドの第２グループの最も離れた３′方向のものである
ことが示された。2.73からのインサートを用いてコロニ
ー・バンクのプロービングをおこなつたところ、特にク
ローン4.68はポジテイブな雑種形成能を示した。制限酵
素マツピンクにより、4.68からのインサートがさらに
３′方向へ延びてHN遺伝子に達することが示された。
Ｍ遺伝子とＬ遺伝子との間をふさぐ（fill in）ため
のこのように延びた一連のプラスミドDNAインサートに
よつてのみ、ＦおよびHN遺伝子の正確な配列を演繹する
ことが可能であつた。表−１のプラスミド3.01および4.
77はそれぞれＦ遺伝子およびNP遺伝子に帰属された。こ
のようなタイプの実験をおこなうことによつて、NDVに
特有のクローン化されたインサートのマツプを作成し、
ゲノム性RNAの遺伝子−コーデイング領域の配列を次の
様に演繹した：（３′）NP P M F HN L（５′）。NPは
３′末端に位置すると考えられるが、これは（１）ビシ
ストロン性（bicistronic）NDV写しに対するクローンの
雑種形成によつて、NP−Ｐ、Ｐ−ＭおよびＭ−Ｆ写しが
生ずることが示され、また（２）NPにおけるクローンの
発生量が少なかつたからである。このような観察は、類
似のクローニング方法を用いることによつて得られたカ
ン（A.J.Cann）らの発見、即ちポリオウイルス３型のゲ
ノム性RNAの３′−エンドにおけるクローンの発生量が
少ないという知見と一致する〔ヌクレイツク・アシツズ
・リサーチ、第11巻、第1267頁〜第1281頁（1983年）参
照〕 DNAシーケンシンク 第２のドツト雑種形成グループからの２つのクローン
1.13および3.73はオーバーラツプするcDNAを与え、また
両者はNDVのHN遺伝子およびＬ遺伝子の間にジヤンクシ
ヨン（junction）を有する。これらのクローンはオーバ
ーラツプ領域に重点をおくDNAシーケンス解析のために
最初に選択されたものであつた。cDNAインサート内にお
ける「フオースークローン（force−clone）」フラグメ
ントに対するマツピングをおこなつた制限酵素サイトを
使用することによつて、DNAをベクターM13 mp8 mp9、
mp18およびmp19へサブクローン化した。次いでHN−Ｌ遺
伝子ジヤンクシヨンからHN遺伝子とＦ遺伝子を経て３′
の方向へ延びたcDNAのオーバーラツピングに類似の方法
を使用した。
のこのように延びた一連のプラスミドDNAインサートに
よつてのみ、ＦおよびHN遺伝子の正確な配列を演繹する
ことが可能であつた。表−１のプラスミド3.01および4.
77はそれぞれＦ遺伝子およびNP遺伝子に帰属された。こ
のようなタイプの実験をおこなうことによつて、NDVに
特有のクローン化されたインサートのマツプを作成し、
ゲノム性RNAの遺伝子−コーデイング領域の配列を次の
様に演繹した：（３′）NP P M F HN L（５′）。NPは
３′末端に位置すると考えられるが、これは（１）ビシ
ストロン性（bicistronic）NDV写しに対するクローンの
雑種形成によつて、NP−Ｐ、Ｐ−ＭおよびＭ−Ｆ写しが
生ずることが示され、また（２）NPにおけるクローンの
発生量が少なかつたからである。このような観察は、類
似のクローニング方法を用いることによつて得られたカ
ン（A.J.Cann）らの発見、即ちポリオウイルス３型のゲ
ノム性RNAの３′−エンドにおけるクローンの発生量が
少ないという知見と一致する〔ヌクレイツク・アシツズ
・リサーチ、第11巻、第1267頁〜第1281頁（1983年）参
照〕 DNAシーケンシンク 第２のドツト雑種形成グループからの２つのクローン
1.13および3.73はオーバーラツプするcDNAを与え、また
両者はNDVのHN遺伝子およびＬ遺伝子の間にジヤンクシ
ヨン（junction）を有する。これらのクローンはオーバ
ーラツプ領域に重点をおくDNAシーケンス解析のために
最初に選択されたものであつた。cDNAインサート内にお
ける「フオースークローン（force−clone）」フラグメ
ントに対するマツピングをおこなつた制限酵素サイトを
使用することによつて、DNAをベクターM13 mp8 mp9、
mp18およびmp19へサブクローン化した。次いでHN−Ｌ遺
伝子ジヤンクシヨンからHN遺伝子とＦ遺伝子を経て３′
の方向へ延びたcDNAのオーバーラツピングに類似の方法
を使用した。
DNAシーケンスの解析は、一般的なプライマーおよび
標識としての（α35S）デオキシアデノシントリフォス
フエートを使用するジデオキシ法によつておこなつた。
ヌクレオチドシーケンスは、薄いポリアクリルアミド緩
衝液グラデイエントゲル上においてフジ（Fuji）Ｘ線フ
イルムを使用して決定した。シーケンシングのデータを
記憶装置に入れ、アセンブルし、解析することによつて
コンセンサスシーケンスを得た。ＦおよびHN遺伝子をコ
ード化するcDNA（コーデイングストランド）のシーケン
スを第１図の１〜第１図の６に示す。このシーケンスは
ゲノム性RNAに対して相補性であつて、慣例に従つて
５′から３′の方向に示す。Ｆ遺伝子はヌクレオチド１
〜1792まで延び、これに遺伝子間（intergenic）ジヌク
レオチドが続き、次いでHN遺伝子がヌクレオチド1795〜
3825にわたつて延びると考えられている。
標識としての（α35S）デオキシアデノシントリフォス
フエートを使用するジデオキシ法によつておこなつた。
ヌクレオチドシーケンスは、薄いポリアクリルアミド緩
衝液グラデイエントゲル上においてフジ（Fuji）Ｘ線フ
イルムを使用して決定した。シーケンシングのデータを
記憶装置に入れ、アセンブルし、解析することによつて
コンセンサスシーケンスを得た。ＦおよびHN遺伝子をコ
ード化するcDNA（コーデイングストランド）のシーケン
スを第１図の１〜第１図の６に示す。このシーケンスは
ゲノム性RNAに対して相補性であつて、慣例に従つて
５′から３′の方向に示す。Ｆ遺伝子はヌクレオチド１
〜1792まで延び、これに遺伝子間（intergenic）ジヌク
レオチドが続き、次いでHN遺伝子がヌクレオチド1795〜
3825にわたつて延びると考えられている。
最初にＦ遺伝子cDNAに注目し、５′から３′の方向へ
考察してゆくと、Ｆ−コーデイング領域はヌクレオチド
47〜49における提案されたATGスタートコドンからヌク
レオチド1706〜1708におけるTGAストツプコドンまで延
びる。cDNAは、イン・ヴイヴオにおいてF2およびF1に開
裂するF0ポリペプチドをコード化する（F2およびF1はそ
れぞれF0遺伝子cDNAの５′−エンドおよび３′−エンド
となる）。開裂は、ヌクレオチド392〜394によつてコー
ド化されたアルギニンのＣ−ターミナル側において起こ
る。提案された開裂サイトから後のアミノ酸シーケン
ス、即ち、ヌクレオチド395〜454によつてコード化され
たアミノ酸シーケンスは、リチヤードソンら（前記文献
参照）によつて決定されたF1のＮ−ターミナルにおける
20個のアミノ酸のシーケンスと同様である。F1−コーデ
イングシーケンスのエンドを越えた部分にはmRNAの３′
エンドに相当する非コーデイング（non−coding）部分
が存在し、これはヌクレオチド1787〜1792のポリ−Ａシ
ーケンスにおいて終了する。
考察してゆくと、Ｆ−コーデイング領域はヌクレオチド
47〜49における提案されたATGスタートコドンからヌク
レオチド1706〜1708におけるTGAストツプコドンまで延
びる。cDNAは、イン・ヴイヴオにおいてF2およびF1に開
裂するF0ポリペプチドをコード化する（F2およびF1はそ
れぞれF0遺伝子cDNAの５′−エンドおよび３′−エンド
となる）。開裂は、ヌクレオチド392〜394によつてコー
ド化されたアルギニンのＣ−ターミナル側において起こ
る。提案された開裂サイトから後のアミノ酸シーケン
ス、即ち、ヌクレオチド395〜454によつてコード化され
たアミノ酸シーケンスは、リチヤードソンら（前記文献
参照）によつて決定されたF1のＮ−ターミナルにおける
20個のアミノ酸のシーケンスと同様である。F1−コーデ
イングシーケンスのエンドを越えた部分にはmRNAの３′
エンドに相当する非コーデイング（non−coding）部分
が存在し、これはヌクレオチド1787〜1792のポリ−Ａシ
ーケンスにおいて終了する。
このDNAシーケンスはF0においてアスパラギンが結合
した５つの有意な潜在的グリコシル化サイトを有する。
即ち１つ（NRT）はF2の299〜307に存在し、他の４つ（N
KT、NTS、NISおよびNNS）はF1の617〜625、1142〜115
0、1385〜1393および1457〜1465に存在する。F1のＣ−
エンドに近接するNNTサイトは、膜を交差しない蛋白質
領域中に位置するので重要ではないと考えられている。
した５つの有意な潜在的グリコシル化サイトを有する。
即ち１つ（NRT）はF2の299〜307に存在し、他の４つ（N
KT、NTS、NISおよびNNS）はF1の617〜625、1142〜115
0、1385〜1393および1457〜1465に存在する。F1のＣ−
エンドに近接するNNTサイトは、膜を交差しない蛋白質
領域中に位置するので重要ではないと考えられている。
HNポリペプチド遺伝子のアミノ酸シーケンスはヌクレ
オチド1915〜1917に位置するATGスタートコドンおよび
ヌクレオチド3646〜3648に位置するTAGストツプコドン
と共に示され、後者の後には177−ヌクレオチド非コー
デイング領域が続き、該領域はmRNAの３′エンドにおけ
るポリ−Ａシーケンスにおいて終了する。このDNAシー
ケンスはHNにおいては６つの潜在的なグリコシル化サイ
ト（NNG、NDT、NKT、NHT、NPT、NKT）を2269〜2277、29
35〜2943、3211〜3219、3353〜3363、3412〜3420および
3526〜3534に有する。
オチド1915〜1917に位置するATGスタートコドンおよび
ヌクレオチド3646〜3648に位置するTAGストツプコドン
と共に示され、後者の後には177−ヌクレオチド非コー
デイング領域が続き、該領域はmRNAの３′エンドにおけ
るポリ−Ａシーケンスにおいて終了する。このDNAシー
ケンスはHNにおいては６つの潜在的なグリコシル化サイ
ト（NNG、NDT、NKT、NHT、NPT、NKT）を2269〜2277、29
35〜2943、3211〜3219、3353〜3363、3412〜3420および
3526〜3534に有する。
非コーデイング領域は3712〜3720において潜在的なグ
リコシル化サイト（NQT）を含んでおり、またmRNAの
３′エンドの近くの3757〜3759においてTGAストツプコ
ドンを有している。該ストツプコドンによつてNDVの特
定の菌株におけるHN0のオリジン（origin）を説明する
こともできる。
リコシル化サイト（NQT）を含んでおり、またmRNAの
３′エンドの近くの3757〜3759においてTGAストツプコ
ドンを有している。該ストツプコドンによつてNDVの特
定の菌株におけるHN0のオリジン（origin）を説明する
こともできる。
NDV菌株ウルスター（Ulster）およびクイーンズラン
ド（Queensland）のHN蛋白質は前駆体形態（HN0）で合
成されることが知られており、該前駆体はＣ−ターミナ
ルグリコペプチドの除去による開裂によつて活性なHNと
なる。これらの考察から次のことが示唆される。即ち、
特定の無毒性NDV菌株のHN蛋白質に関するHN0前駆体をコ
ード化する遺伝子は、より長いオープンリーデイングフ
レームを生じさせてより大きなHNポリペプチドを合成す
る突然変異によつてNDVのより毒性の菌株のHN蛋白質を
コード化する遺伝子とは相違する。
ド（Queensland）のHN蛋白質は前駆体形態（HN0）で合
成されることが知られており、該前駆体はＣ−ターミナ
ルグリコペプチドの除去による開裂によつて活性なHNと
なる。これらの考察から次のことが示唆される。即ち、
特定の無毒性NDV菌株のHN蛋白質に関するHN0前駆体をコ
ード化する遺伝子は、より長いオープンリーデイングフ
レームを生じさせてより大きなHNポリペプチドを合成す
る突然変異によつてNDVのより毒性の菌株のHN蛋白質を
コード化する遺伝子とは相違する。
ＦおよびHNポリペプチドをコード化する完全な長さのcD
NA ＦおよびHN遺伝子のコーデイング領域の完全な長さの
コピーを以下の様にして調製した。
NA ＦおよびHN遺伝子のコーデイング領域の完全な長さの
コピーを以下の様にして調製した。
（１）Ｆ遺伝子 3.01、7.58および7.44で指定されるプラスミドからの
cDNAインサートはオーバーラツプし、NDVのＦ遺伝子の
全コーデイング領域を全体としてカバーする。NDVのＦ
遺伝子のコーデイング領域の完全な長さのコピーは、以
下に記載の制限されたベクターDNA（ａ）並びに各制限
フラグメント（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を一回の同時
連結（simultaneous ligation）によつて連結すること
によつてプラスミドクローニングベクターpUC18内へ挿
入した。これらのすべてのDNA試料（ａ）、（ｂ）、
（ｃ）および（ｄ）は、ドツト・ブロツト雑種形成に関
連して引用したマクドネルらの前記の論文に記載のよう
にして、アガロースゲル上での電気泳動処理、電気溶離
処理およびフエノール抽出処理に付すことによつて精製
した。子牛の腸のアルカリ性フオスフアターゼを、以下
のフラグメント（ｂ）および（ｄ）の調製に使用した制
限処理中に存在させた。
cDNAインサートはオーバーラツプし、NDVのＦ遺伝子の
全コーデイング領域を全体としてカバーする。NDVのＦ
遺伝子のコーデイング領域の完全な長さのコピーは、以
下に記載の制限されたベクターDNA（ａ）並びに各制限
フラグメント（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を一回の同時
連結（simultaneous ligation）によつて連結すること
によつてプラスミドクローニングベクターpUC18内へ挿
入した。これらのすべてのDNA試料（ａ）、（ｂ）、
（ｃ）および（ｄ）は、ドツト・ブロツト雑種形成に関
連して引用したマクドネルらの前記の論文に記載のよう
にして、アガロースゲル上での電気泳動処理、電気溶離
処理およびフエノール抽出処理に付すことによつて精製
した。子牛の腸のアルカリ性フオスフアターゼを、以下
のフラグメント（ｂ）および（ｄ）の調製に使用した制
限処理中に存在させた。
Ｆ遺伝子のコーデイング領域の完全な長さのコピーを
構成するのに使用した制限フラグメントは以下の通りで
ある： （ａ）酵素Bam HIおよびPst Iによつて制限されたクロ
ーニングベクタープラスミドPUC18（フラグメントのサ
イズ：約2.7Kb）。
構成するのに使用した制限フラグメントは以下の通りで
ある： （ａ）酵素Bam HIおよびPst Iによつて制限されたクロ
ーニングベクタープラスミドPUC18（フラグメントのサ
イズ：約2.7Kb）。
（ｂ）酵素Bam HIおよびSst Iによつて制限されたプラ
スミド3.01（フラグメントのサイズ：約0.6Kb）。
スミド3.01（フラグメントのサイズ：約0.6Kb）。
（ｃ）酵素Sst IおよびAva Iによつて制限されたプラス
ミド7.58（フラグメントのサイズ：約0.5Kb）。
ミド7.58（フラグメントのサイズ：約0.5Kb）。
（ｄ）酵素Ava IおよびPst Iによつて制限されたプラス
ミド7.44（フラグメントのサイズ：約1.25Kb）。
ミド7.44（フラグメントのサイズ：約1.25Kb）。
上記の（ｄ）に関連したPst Iサイトは前述の分子ク
ローニング中に形成された人為サイトであり、ポリ（G,
C）トラクト（tract）によつて、前記のDNAシーケンス
のヌクレオチド2514におけるプラスミド7.44のcDNAイン
サートのエンドに結合される。上記の（ｂ）、（ｃ）お
よび（ｄ）に関連したBam HI、Sst IおよびAva Iサイト
はそれぞれ前記のDNAシーケンスの17〜22、671〜676お
よび1258〜1263の位置に生ずるもので、それぞれ該当す
る位置に示される。制限フラグメント（ａ）、（ｂ）、
（ｃ）および（ｄ）の各々約0.1μｇをT4 DNAリガーゼ
と室温で２時間反応させる単一反応によつて、これらの
フラグメントを連結させた。この連結ミツクス（ligati
on mix）を使用して大腸菌の菌株JM105に形質転換をお
こさせ、インサートを含む組換えプラスミドはアンピシ
リン−Xgalインジケターープレート上において白色コロ
ニーとして選択された〔ルター（U.Ruther）、モル・ゲ
ン・ゲネツト・（Mol.Gen.Genet.）、第178巻、第475頁
〜第477頁（1980年）参照〕。プラスミドインサートの
サイズおよび適当な制限酵素サイトの存在はプラスミド
ミニ調製品（minipreps）を使用して立証した。スクリ
ーン処理に付した10/11プラスミドはNDVのＦ遺伝子の完
全な長さのコピーを含んでいた。
ローニング中に形成された人為サイトであり、ポリ（G,
C）トラクト（tract）によつて、前記のDNAシーケンス
のヌクレオチド2514におけるプラスミド7.44のcDNAイン
サートのエンドに結合される。上記の（ｂ）、（ｃ）お
よび（ｄ）に関連したBam HI、Sst IおよびAva Iサイト
はそれぞれ前記のDNAシーケンスの17〜22、671〜676お
よび1258〜1263の位置に生ずるもので、それぞれ該当す
る位置に示される。制限フラグメント（ａ）、（ｂ）、
（ｃ）および（ｄ）の各々約0.1μｇをT4 DNAリガーゼ
と室温で２時間反応させる単一反応によつて、これらの
フラグメントを連結させた。この連結ミツクス（ligati
on mix）を使用して大腸菌の菌株JM105に形質転換をお
こさせ、インサートを含む組換えプラスミドはアンピシ
リン−Xgalインジケターープレート上において白色コロ
ニーとして選択された〔ルター（U.Ruther）、モル・ゲ
ン・ゲネツト・（Mol.Gen.Genet.）、第178巻、第475頁
〜第477頁（1980年）参照〕。プラスミドインサートの
サイズおよび適当な制限酵素サイトの存在はプラスミド
ミニ調製品（minipreps）を使用して立証した。スクリ
ーン処理に付した10/11プラスミドはNDVのＦ遺伝子の完
全な長さのコピーを含んでいた。
（２）HN遺伝子 HN遺伝子の完全な長さのクローンを形成するのに使用
した条件は、制限酵素として以下の（ａ）〜（ｄ）を使
用する以外は上記の条件と同様である。
した条件は、制限酵素として以下の（ａ）〜（ｄ）を使
用する以外は上記の条件と同様である。
（ａ）酵素Sph IおよびSst Iによつて制限されたクロー
ニングベクタープラスミドpUC19（フラグメントのサイ
ズ：約2.7Kb）。
ニングベクタープラスミドpUC19（フラグメントのサイ
ズ：約2.7Kb）。
（ｂ）酵素Sph IおよびNar Iによつて制限されたプラス
ミド7.44（フラグメントのサイズ：約0.8Kb）。
ミド7.44（フラグメントのサイズ：約0.8Kb）。
（ｃ）酵素Nar IおよびAcc Iによつて制限されたプラス
ミド4.68（フラグメントのサイズ：約0.45Kb）。
ミド4.68（フラグメントのサイズ：約0.45Kb）。
（ｄ）酵素Acc IおよびSst Iによつて制限されたプラス
ミド1.13（フラグメントのサイズ：約0.87Kb）。
ミド1.13（フラグメントのサイズ：約0.87Kb）。
上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）に関連す
る制限酵素サイトSph I、Nar I、Acc IおよびSst Iはそ
れぞれ前記のDNAシーケンスの位置1610〜1615、2406〜2
411、2860〜2865および3733〜3738において生ずる。
る制限酵素サイトSph I、Nar I、Acc IおよびSst Iはそ
れぞれ前記のDNAシーケンスの位置1610〜1615、2406〜2
411、2860〜2865および3733〜3738において生ずる。
HN遺伝子の場合には、16のコロニーをプラスミドミニ
調製品によつてチエツクしたところ、このうちの１つが
HN遺伝子の完全な長さのコピーを含んでいた。
調製品によつてチエツクしたところ、このうちの１つが
HN遺伝子の完全な長さのコピーを含んでいた。
pUC18内でクローン化されたＦ遺伝子のcDNA（ヌクレ
オチド18〜2514）およびpUC19内でクローン化されて大
腸菌へ形質転換されたHN遺伝子のcDNA（ヌクレオチド16
15〜3737）は、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に
関するブダペスト条約の規定による特許寄託物として、
ナシヤナル・コレクシヨン・オブ・インダストリアル・
バクテリア（National Collection of Industrial Bact
eria）〔トリー・リサーチ・ステーシヨン（Torry Rese
arch Station）、私書箱31、135アベイ・ロード（Abbey
Road）、アバーデーン（Aberdeen）AB98DG、スコツト
ランド〕にそれぞれNCIB12277およびNCIB12278の番号で
1986年７月１日に寄託されている。
オチド18〜2514）およびpUC19内でクローン化されて大
腸菌へ形質転換されたHN遺伝子のcDNA（ヌクレオチド16
15〜3737）は、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に
関するブダペスト条約の規定による特許寄託物として、
ナシヤナル・コレクシヨン・オブ・インダストリアル・
バクテリア（National Collection of Industrial Bact
eria）〔トリー・リサーチ・ステーシヨン（Torry Rese
arch Station）、私書箱31、135アベイ・ロード（Abbey
Road）、アバーデーン（Aberdeen）AB98DG、スコツト
ランド〕にそれぞれNCIB12277およびNCIB12278の番号で
1986年７月１日に寄託されている。
実施例２ NDV菌株ウルスター2Cの分子クローニングおよびヌク
レオチドシーケンシング NDV菌株ウルスター2Cはアレキサンダー氏（Dr.D.J.Al
exader）（中央獣医研究所、ウエイブリツジ、英国）か
ら入手した。cDNAの分子クローニングおよびNDVに特有
のクローンの選択は実施例１のNDV菌株ボーデツトＣの
場合のようにしておこなつた。ＦおよびHN遺伝子中のシ
ーケンスを含むクローンは、実施例１に記載されたNDV
菌株ボーデツトＣの完全な長さのcDNAクローンに対する
雑種形成に基づいたコロニーバンクから選択した。
レオチドシーケンシング NDV菌株ウルスター2Cはアレキサンダー氏（Dr.D.J.Al
exader）（中央獣医研究所、ウエイブリツジ、英国）か
ら入手した。cDNAの分子クローニングおよびNDVに特有
のクローンの選択は実施例１のNDV菌株ボーデツトＣの
場合のようにしておこなつた。ＦおよびHN遺伝子中のシ
ーケンスを含むクローンは、実施例１に記載されたNDV
菌株ボーデツトＣの完全な長さのcDNAクローンに対する
雑種形成に基づいたコロニーバンクから選択した。
Ｆ遺伝子のcDNAは、制限酵素Bam HI、Hind IIIおよび
Ava Iを用いるF cDNA含有プラスミドの消化によつて調
製した。２つの制限フラグメントはそれらの間に完全な
F cDNAを含んでいた。これらはいずれも約1.25Kbのサイ
ズであつて、アガロースゲル上で一緒に移動し（comigr
ate）、これらは該アガロースゲルからマクドネルらの
前記文献に記載のようにして一緒に調製し、ニツク翻訳
により（α35S）dATPを用いて標識付けした。HN遺伝子
のcDNAは、制限酵素Sph I、Sst IおよびPvu IIを用いる
HNのcDNA含有プラスミドの消化によつて調製した。２つ
の制限フラグメントはそれらの間に完全なHNのcDNAを含
んでいた。これらはいずれも約1.05Kbのサイズであつ
て、アガロースゲル上で一緒に移動し、これらは該アガ
ロースゲルから一緒に調製し、上記のＦ遺伝子フラグメ
ントの場合のようにして標識付けした。NDVのウルスタ
ーに特有のクローンのバンクを、実施例１の「コロニー
雑種形成」のセクシヨンに記載のようにして、標識付け
されたHNもしくはＦ遺伝子のcDNAを用いるプロービング
処理に付した。NDVウルスターのＦおよびHN遺伝子のク
ローンはコロニーバンクから選択し、実施例１に記載の
ようにしてDNAのシーケンシングをおこなつた。このよ
うにして得られたDNAシーケンスを第２図〜第５図に示
す。ウルスター菌株に関するヌクレオチドシーケンスお
よび演繹されたアミノ酸シーケンスの４つのセクシヨン
（Ａ〜Ｄ）は実施例１において示したボーデツトＣ菌株
に関するヌクレオチドナンバー１〜274（Ａ）、796〜94
0（Ｂ）、1363〜1705（Ｃ）および2037〜2235（Ｄ）に
それぞれ対応する。Ａ〜ＣはＦ遺伝子中に存在し、Ｄは
HN遺伝子中に存在する。NDVのボーデツトＣ菌株とウル
スター菌株との間のＦおよびHN遺伝子の領域における全
体的なホモロジーは、アミノ酸のレベルでは93％であ
り、ヌクレオチドのレベルでは92％である。
Ava Iを用いるF cDNA含有プラスミドの消化によつて調
製した。２つの制限フラグメントはそれらの間に完全な
F cDNAを含んでいた。これらはいずれも約1.25Kbのサイ
ズであつて、アガロースゲル上で一緒に移動し（comigr
ate）、これらは該アガロースゲルからマクドネルらの
前記文献に記載のようにして一緒に調製し、ニツク翻訳
により（α35S）dATPを用いて標識付けした。HN遺伝子
のcDNAは、制限酵素Sph I、Sst IおよびPvu IIを用いる
HNのcDNA含有プラスミドの消化によつて調製した。２つ
の制限フラグメントはそれらの間に完全なHNのcDNAを含
んでいた。これらはいずれも約1.05Kbのサイズであつ
て、アガロースゲル上で一緒に移動し、これらは該アガ
ロースゲルから一緒に調製し、上記のＦ遺伝子フラグメ
ントの場合のようにして標識付けした。NDVのウルスタ
ーに特有のクローンのバンクを、実施例１の「コロニー
雑種形成」のセクシヨンに記載のようにして、標識付け
されたHNもしくはＦ遺伝子のcDNAを用いるプロービング
処理に付した。NDVウルスターのＦおよびHN遺伝子のク
ローンはコロニーバンクから選択し、実施例１に記載の
ようにしてDNAのシーケンシングをおこなつた。このよ
うにして得られたDNAシーケンスを第２図〜第５図に示
す。ウルスター菌株に関するヌクレオチドシーケンスお
よび演繹されたアミノ酸シーケンスの４つのセクシヨン
（Ａ〜Ｄ）は実施例１において示したボーデツトＣ菌株
に関するヌクレオチドナンバー１〜274（Ａ）、796〜94
0（Ｂ）、1363〜1705（Ｃ）および2037〜2235（Ｄ）に
それぞれ対応する。Ａ〜ＣはＦ遺伝子中に存在し、Ｄは
HN遺伝子中に存在する。NDVのボーデツトＣ菌株とウル
スター菌株との間のＦおよびHN遺伝子の領域における全
体的なホモロジーは、アミノ酸のレベルでは93％であ
り、ヌクレオチドのレベルでは92％である。
第１図の１〜第１図の６はボーデツトＣ菌株に関するcD
NAシーケンスを示す。 第２図〜第５図はそれぞれウルスター菌株に関するDNA
シーケンスの４つのセクシヨンＡ〜Ｄを示す。
NAシーケンスを示す。 第２図〜第５図はそれぞれウルスター菌株に関するDNA
シーケンスの４つのセクシヨンＡ〜Ｄを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 フィリップ・チャンバーズ イギリス国イングランド、ニューカース ル・アポン・タイン・エヌ・イー・６ ５・エヌ・ワイ、モウブレイ・ストリー ト ８番 (72)発明者 ピーター・タンレイ・エマーソン イギリス国イングランド、ニューカース ル・アポン・タイン、エヌ・イー・20 ９・イー・エイチ、ポンテランド、ダン スグリーン 20番 (72)発明者 ネイル・ステュワート・ミラー イギリス国イングランド、シェフィール ド エス・エル・０ ３・キュー・エ ス、スタンパーロウ・ホール・ロード 32番
Claims (7)
- 【請求項１】（１）以下のヌクレオチド配列： において、47〜1705の番号のヌクレオチドシーケンスに
よりコードされるニューカッスル病ウイルスボーデッド
Ｃ菌株のＦポリペプチド、またはそのアレル変異体を単
独でまたはシグナルペプチドと共にコード化するヌクレ
オチドシーケンス；または該ヌクレオチドシーケンスに
おいて１もしくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換
されており、且つニューカッスル病ウイルスのＦポリペ
プチドを単独でまたはシグナルペプチドと共にコード化
するヌクレオチドシーケンス、 （２）上記配列の395〜1705の番号のヌクレオチドシー
ケンスによりコードされるニューカッスル病ボーデッド
Ｃ菌株のF1ポリペプチド、またはそのアレル変異体をコ
ード化するヌクレオチドシーケンス；または該ヌクレオ
チドシーケンスにおいて１もしくは複数の塩基が付加、
欠失もしくは置換されており、且つニューカッスル病ウ
イルスのF1ポリペプチドをコード化するヌクレオチドシ
ーケンス、 （３）上記配列の47〜394の番号のヌクレオチドシーケ
ンスによりコードされるニューカッスル病F2ポリペプチ
ド、またはそのアレル変異体を単独でまたはシグナルペ
プチドと共にコード化するヌクレオチドシーケンス；ま
たは該ヌクレオチドシーケンスにおいて１もしくは複数
の塩基が付加、欠失もしくは置換されており、且つニュ
ーカッスル病ウイルスのF2ポリペプチドを単独でまたは
シグナルペプチドと共にコード化するヌクレオチドシー
ケンス、または （４）上記配列の1915〜3645の番号で示されるヌクレオ
チドシーケンスによりコードされるニューカッスル病ボ
ーデッドＣ菌株のHNポリペプチド、またはそのアレル変
異体をコード化するヌクレオチドシーケンス；または該
ヌクレオチドシーケンスにおいて１もしくは複数の塩基
が付加、欠失もしくは置換されており、且つニューカッ
スル病ウイルスのHNポリペプチドをコード化するヌクレ
オチドシーケンス を含むDNA。 - 【請求項２】ベクターDNAおよびこれに対して外来のDNA
から成り、該外来のDNAが （１）以下のヌクレオチド配列： において、47〜1705の番号のヌクレオチドシーケンスに
よりコードされるニューカッスル病ウイルスボーデッド
Ｃ菌株のＦポリペプチド、またはそのアレル変異体を単
独でまたはシグナルペプチドと共にコード化するヌクレ
オチドシーケンス；または該ヌクレオチドシーケンスに
おいて１もくしは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換
されており、且つニューカッスル病ウイルスのＦポリペ
プチドを単独でまたはシグナルペプチドと共にコード化
するヌクレオチドシーケンス、 （２）上記配列の395〜1705の番号のヌクレオチドシー
ケンスによりコードされるニューカッスル病ボーデッド
Ｃ菌株のF1ポリペプチド、またはそのアレル変異体をコ
ード化するヌクレオチドシーケンス；または該ヌクレオ
チドシーケンスにおいて１もしくは複数の塩基が付加、
欠失もしくは置換されており、且つニューカッスル病ウ
イルスのF1ポリペプチドをコード化するヌクレオチドシ
ーケンス、 （３）上記配列の47〜394の番号のヌクレオチドシーケ
ンスによりコードされるニューカッスル病F2ポリペプチ
ド、またはそのアレル変異体を単独でまたはシグナルペ
プチドと共にコード化するヌクレオチドシーケンス；ま
たは該ヌクレオチドシーケンスにおいて１もしくは複数
の塩基が付加、欠失もしくは置換されており、且つニュ
ーカッスル病ウイルスのF2ポリペプチドを単独でまたは
シグナルペプチドと共にコード化するヌクレオチドシー
ケンス、または （４）上記配列の1915〜3645の番号で示されるヌクレオ
チドシーケンスによりコードされるニューカッスル病ボ
ーデッドＣ菌株のHNポリペプチド、またはそのアレル変
異体をコード化するヌクレオチドシーケンス；または該
ヌクレオチドシーケンスにおいて１もしくは複数の塩基
が付加、欠失もしくは置換されており、且つニューカッ
スル病ウイルスのHNポリペプチドをコード化するヌクレ
オチドシーケンス を含むDNAである、組換えDNA。 - 【請求項３】ベクターDNAがクローニングビヒクルであ
る第２項記載のDNA。 - 【請求項４】ベクターDNAが禽痘ウイルスからのDNAを含
む第２項記載のDNA。 - 【請求項５】ベクターDNAおよびこれに対して外来のDNA
から成り、該外来のDNAが （１）以下のヌクレオチド配列： において、47〜1705の番号のヌクレオチドシーケンスに
よりコードされるニューカッスル病ウイルスボーデッド
Ｃ菌株のＦポリペプチド、またはそのアレル変異体を単
独でまたはシグナルペプチドと共にコード化するヌクレ
オチドシーケンス；または該ヌクレオチドシーケンスに
おいて１もしくは複数の塩基が付加、欠失もしくは置換
されており、且つニューカッスル病ウイルスのＦポリペ
プチドを単独でまたはシグナルペプチドと共にコード化
するヌクレオチドシーケンス、 （２）上記配列の395〜1705の番号のヌクレオチドシー
ケンスによりコードされるニューカッスル病ボーデッド
Ｃ菌株のF1ポリペプチド、またはそのアレル変異体をコ
ード化するヌクレオチドシーケンス；または該ヌクレオ
チドシーケンスにおいて１もしくは複数の塩基が付加、
欠失もしくは置換されており、且つニューカッスル病ウ
イルスのF1ポリペプチドをコード化するヌクレオチドシ
ーケンス、 （３）上記配列の47〜394の番号のヌクレオチドシーケ
ンスによりコードされるニューカッスル病F2ポリペプチ
ド、またはそのアレル変異体を単独でまたはシグナルペ
プチドと共にコード化するヌクレオチドシーケンス；ま
たは該ヌクレオチドシーケンスにおいて１もしくは複数
の塩基が付加、欠失もしくは置換されており、且つニュ
ーカッスル病ウイルスのF2ポリペプチドを単独でまたは
シグナルペプチドと共にコード化するヌクレオチドシー
ケンス、または （４）上記配列の1915〜3645の番号で示されるヌクレオ
チドシーケンスによりコードされるニューカッスル病ボ
ーデッドＣ菌株のHNポリペプチド、またはそのアレル変
異体をコード化するヌクレオチドシーケンス；または該
ヌクレオチドシーケンスにおいて１もしくは複数の塩基
が付加、欠失もしくは置換されており、且つニューカッ
スル病ウイルスのHNポリペプチドをコード化するヌクレ
オチドシーケンス を含むDNAである、組換えDNAを含有するホスト細胞。 - 【請求項６】ベクターDNAがクローニングビヒクルであ
る第５項記載のホスト細胞。 - 【請求項７】ベクターDNAが禽痘ウイルスからのDNAを含
む第５項記載のホスト細胞。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB858531147A GB8531147D0 (en) | 1985-12-18 | 1985-12-18 | Disease virus gene clones |
| GB8531147 | 1985-12-18 | ||
| GB8609037 | 1986-04-14 | ||
| GB868609037A GB8609037D0 (en) | 1986-04-14 | 1986-04-14 | Newcastle disease virus gene clones |
| US88576586A | 1986-07-15 | 1986-07-15 | |
| US885765 | 1986-07-15 | ||
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| US8609037 | 1986-07-15 |
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|---|---|
| JPS62163693A JPS62163693A (ja) | 1987-07-20 |
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-
1989
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