JP2000502889A

JP2000502889A - ｃｐ４５ＨＰＩＶ―３株に基づいた弱毒化した生ワクチンおよびそのようなワクチンにおける弱毒化を確実にするための方法

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Publication number: JP2000502889A
Application number: JP9521479A
Authority: JP
Inventors: ベルシュ，ロバート・ビー; レイ，ランジット
Original assignee: St Louis University
Current assignee: St Louis University
Priority date: 1995-12-08
Filing date: 1996-12-09
Publication date: 2000-03-14
Anticipated expiration: 2016-12-09
Also published as: EP0906019A4; CA2239728A1; KR100386738B1; KR19990072005A; EP0906019A1; US5869036A; JP2004041220A; JP4047782B2; JP4101878B2; AU1149597A; AU703596B2; WO1997020468A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ｃｐ４５の２つの弱毒化傷害の相関に基づく。特に、ｃｐ４５の弱毒化の有意なレベルは、温度感受性および寒冷適応した表現型に夜結果であるが、４５のＬ遺伝子の変異に関連している。ｃｐ４５株中の赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）をコードする遺伝子における第２変異はまた、他の弱毒化変異であると認められた。特異的遺伝子に対するｃｐ４５のこれら２つの弱毒化傷害の相関によりいくつかの実際の応用が可能である。現在、他の野生型ＨＰＩＶ−３ウイルスおよび野生型ＨＰＩＶ−３ウイルス以外の他のウイルスに対する弱毒化ワクチンの製造は、標的ウイルスゲノムにｃｐ４５の変異Ｌおよび／またはＨＮ遺伝子を組み入れること、または別法としてｃｐ４５における他のウイルスからの表面抗原を発現することにより可能である。

Description

【発明の詳細な説明】ｃｐ４５ＨＰＩＶ−３株に基づいた弱毒化した生ワクチンおよびそのようなワクチンにおける弱毒化を確実にするための方法本発明を支持する研究助成が、部分的には、米国の保健および人類公共事業部門によって提供される。米国政府は本発明中で一定の権利を有するであろう。発明の背景本発明はエンベロープ化した、ネガティブセンスの、一本鎖ウイルスにおよび生弱毒化ワクチンなどのウイルスの使用に関する。特に、本発明はパラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、はしかウイルスおよびインフルエンザウイルスなどに関する。本発明はまた、投与前の弱毒化を確実にするようなワクチンのスクリーニング方法および投与後に弱毒化した株の安定性を確認するようなワクチンののスクリーニング方法に関する。多数のウイルスがヒトおよび動物において重篤な感染を引き起こす。例えば、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）およびパラインフルエンザウイルスは新生児および乳幼児における重篤な上部および／または下部気管疾患を引き起こす２つである。他のウイルス、例えば、インフルエンザウイルス、はしかウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスなどはまた、重要な意味を持つ。多様なワクチンは何年もかかって動物およびヒトにおいてウイルス感染を妨害するように開発された。ワクチンの２つの主要なタイプが使用される：殺されたウイルスおよび弱毒化された生ウイルスである。殺されたウイルスは典型的には化学または物理的処置によって不活性化されるが、弱毒化生ワクチンよりも免疫応答持続を剌激することにおいて一般的にそれほど有効でない。弱毒化生ウイルスは、典型的には一層有効である。が、体内にて病原性状態に戻るかもしれない。殺されたワクチンまたは生ワクチンを開発するのにかかる時間とコストは重要である。生の、弱毒化したワクチンは感染した動物から単離された子孫ウイルスから直接得ることができる。例えば、米国特許第３,９２７,２０９号ストラウブ（Stra ub）はウシ気管からのウイルス株として単離されたパラインフルエンザ３型ワクチンを開示している。生弱毒化ワクチンはまた、該ウイルスが元々の病原性を失うまで、適当な培養を通して野生型株を繰り返しコールドパッセージ（cold pas saging）して得ることができる。例えば、ｃｐ４５はＨＰＩＶ−３の寒冷適応した野生型ウイルス（ＪＳ株）であり、低温度での４５倍で得られる（ベルシェ（ Belshe）およびヒッソム（Hissom）、１９８２）。温度感受性ｃｐ４５株は現在ヒトにおける候補ワクチンとしての使用のための査定である（カロン（Karron）ら、１９９５；ホール（Hall）ら、１９９３；ベルシェら、１９９２；クレメンツ（Clements）ら１９９１；クルックシャンクスーニューマン（Crookshanks−N ewman）およびベルシェ１９８６）。子供における最近の査定はｃｐ４５株が非常に浴弱毒化されており免疫応答を剌激することにおいて有効であることを明らかにした（カロンら、１９９５；ベルシェら１９９２）。特定のワクチン株における弱毒化は該株の３つの表現型に関して一般的に査定されている：寒冷適応、温度感受性および組織培養物中でのプラークの大きさまたは収率。寒冷適応はウイルスが２０℃で増殖する能力に関し、温度感受性はそのような増殖が４０℃周辺で抑制されるかどうかに関する。プラーク力価はウイルス増殖の範囲を定量的に査定するためのアッセイであり、一般的に寒冷適応および／または温度感受性表現型の範囲を査定するのに使用される。ワクチンが弱毒化されているか否かを決定するための他の方法は霊長類に対してワクチン投与することに関する。例えば、新規のポリオワクチンは典型的にＦＤＡによって売買を許可される以前にサルに投与されている。続く必要性は新規のワクチンを開発するために存在している。コールドパッセージによる生弱毒化ワクチンを開発する先行技術の方法はしばしば有効ではないが、その継代に関して予測可能ではなく、ついで単一のウイルスに対する応用に必要的に限られる。ウイルスが十分に弱毒化されるか否かを決定するための別法の必要性が存在する。寒冷適応および温度感受性表現型は決定的でない。動物を試験するためのワクチンの投与は同様に決定的でなく、有効でない。発明の要約それゆえ、本発明の目的はヒトおよび動物のウイルス多様性に対する使用に適切であるワクチンの開発および特に、ヒトパラインフルエンザウイルス１型、２型または３型およびＲＳＶなどのウイルスに対する使用に適当なワクチンの開発に関する。同様に、ウイルス株が弱毒化されるか否かを決定する一層有効な再生可能な方法を提供することが目的である。それゆえ、端的には、本発明はエンベロープ化された、ネガティブセンスの、一本鎖ＲＮＡハイブリッドウイルスさらには製薬学的に許容し得る担体と組み合わせてハイブリッドウイルスを含む、弱毒化したヒトおよび／または動物ワクチンに関する。ハイブリッドウイルスを含むワクチンは標的ウイルスの多様性に対して直接働くことができ、このウイルスには、ヒトパラインフルエンザ３型（ＨＰＩＶ−３）ウイルスおよびＨＰＩＶ−３以外のウイルスが含まれる。非ＨＰＩＶ−３標的ウイルスに対して指令するワクチンは、生存ウイルスを形成するのに必要な任意の他の遺伝子と組み合わせて発現に作動可能に結合した遺伝子を含むキメラウイルスゲノムを有する：（ｉ）標的遺伝子の１またはそれ以上の表面抗原をコードする核酸配列および（ii）変異ラージタンパク質をコードする核酸配列。標的ウイルスはｃｐ４５の表面抗原と抗原的に異なる表面抗原またはタンパク質を有する。変異Ｌタンパク質は、野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）Ｌタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を有するＨＰＩＶ−３Ｌ−タンパク質である。さらに、該変異Ｌタンパク質は、野生型ＨＰＩＶ−３Ｌタンパク質に比較して少なくとも１つのアミノ酸変異を有し、、ついで約３９℃の温度で標的ウイルスに通常関連したポリメラーゼ活性より少ないポリメラーゼ活性を有する。直前に記載したハイブリッドウイルスのゲノムは、発現のため、作動可能に結合する：（ｉ）ｃｐ４５の３'リーダー領域の核酸配列；（ii）ＮＰ、ｃｐ４５のヌクレオカプシドタンパク質をコードする核酸配列；（iii）ｃｐ４５のリンタンパク質、Ｐ［＋Ｃ］をコードする核酸配列；（iv）ｃｐ４５のマトリクスタンパク質Ｍをコードする核酸配列；（ｖ）ＨＰＩＶ−１、ＨＰＩＶ−２およびＲＳＶを含む群から選択された標的ウイルスの少なくとも１つの表面抗原をコードする核酸配列；および（vi）この場合、約３９℃で標的ウイルスと通常関連しているポリメラーゼ活性より低いＲＮＡポリメラーゼ活性を有する変異ラージタンパク質Ｌをコードする核酸配列である。この場合、変異Ｌタンパク質は、野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）Ｌタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約９９.８％の配列同一性および第９４２残基のTyrをHisおよび９９２残基のLeuをPheで置換する野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）Ｌタンパク質に比較してアミノ酸配列中に少なくとも２つの置換を有する。非ＨＰＩＶ−３標的ウイルスに対して、直接働くワクチンにおける使用に適した他のハイブリッドウイルスは、発現のため作動可能に結合した遺伝子を含むキメラウイルスゲノムを有する。これらの遺伝子には、生存できるウイルスを形成するのに必要な他の遺伝子と組み合わせて以下をコードする（ｉ）ｃｐ４５の表面抗原と抗原的に異なる非ＨＰＩＶ−３標的ウイルスの少なくとも１つの表面抗原および（ii）ｃｐ４５ＨＮタンパク質の一部。コードされた部分はノイアミニダーゼ活性を有し、ｃｐ４５のＨＮタンパク質の１６０残基から３８５残基のアミノ酸と同一のアミノ酸配列を含む。本発明はさらに、該標的ウイルスにたいする使用に適している生の弱毒化したワクチンに直接かかわる。該ワクチンは、直前に記したハイブリッドウイルスおよび製薬学的に許容し得る担体を含む。本発明はさらにハイブリッドウイルスのゲノムを含むゲノムを有するプラスミドベクターおよびハイブリッドウイルスを産生するための方法に関する。本発明はさらにエンベロープ化された、ネガティブセンスの、ＨＰＩＶ−３ウイルスに対して働くワクチンにおける適切な使用にかかわる。あるそのようなハイブリッドウイルスは、生存可能なウイルスを形成するのに必要他の任意の遺伝子と組み合わせて発現のために作動可能に結合した遺伝子を含む：（ｉ）野生型ＨＰＩＶ−３標的ウイルスの３'リーダー領域の核酸配列と同様である核酸配列または標的ウイルスのマトリクスタンパク質Ｍ、標的ウイルスの融合タンパク質および標的ウイルスの赤血球凝集素ノイラミニダーゼ蛋白質ＨＮよりなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸配列および（ii）変異ＨＰＩＶ−３大タンパク質Ｌをコードする核酸配列。変異Ｌタンパク質は標的ウイルスのＬタンパク質に比較してアミノ酸配列中の少なくとも１つの変異を有するアミノ酸配列を有し、ついで約３９℃の温度で標的ウイルスのＬタンパク質に通常関連したＲＮＡポリメラーゼ活性より少ないＲＮＡポリメラーゼ活性を有する。同様の点において適当な他のハイブリッドウイルスはエンベロープ化された、ネガティブセンスの、生存可能なウイルスを形成するのに必要である任意の他の遺伝子と組み合わせて発現のために作動可能に結合した以下の遺伝子を含む一本鎖ＲＮＡハイブリッドウイルスである：（i）野生型ＨＰＩＶ−３標的ウイルスの３'リーダー領域の核酸配列と同様の核酸配列または標的ウイルスのマトリクスタンパク質、標的ウイルス融合タンパク質Ｍおよび標的ウイルスのラージタンパク質Ｌよりなる群から選択された少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸配列および（ii）変異赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ蛋白質ＨＮをコードする核酸配列。該変異タンパク質は、野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）ウイルスのＨＮタンパク質おアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、および標的ウイルスのＨＮタンパク質に比較してアミノ酸配列において少なくとも１つの変異を有する。変いＨＮタンパク質はまたＨＰＩＶ−３（ＪＳ）ウイルスのＨＮタンパク質に比較した変異は、ＪＳＨＮタンパク質の３８４残基の約５アミノ酸でまたは５アミノ酸以内である。変異ＨＮタンパク質は標的ウイルスのＨＮタンパク質に通常関連したノイラミニダーゼ活性より少ないノイラミニダーゼ活性を有する。本発明はまた、生存可能なプラスミドを形成するのに必要である他の遺伝子と組み合わせて発現のために作動可能に結合した前記ハイブリッドウイルスのいずれかのための遺伝子を有するポジティブまたはネガティブセンスを含む。例えば、本発明の１つのプラスミドベクターのプラスミドゲノムは、以下を含む：（ｉ）標的ウイルスの表面抗原をコードする核酸配列および（ii）変異ラージタンパク質Ｌをコードする核酸配列。標的ウイルス表面抗原は抗原的にｃｐ４５の表面抗原と異なる。変異Ｌタンパク質は野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）Ｌタンパク質のアミノ酸配列において少なくとも１つの変異を有する。変異Ｌタンパク質は約３９ ℃お温度で標的ウイルスに通常関連したポリメラーゼ活性より少ないＲＮＡポリメラーゼ活性を有する。さらに本発明は、本発明のプラスミドベクターで宿主細胞をトランスフェクションすることに関する。本発明はまた、エンベロープ化された、ネガティブセンスの、一本鎖ＲＮＡウイルスを産生するための方法に関する。宿主細胞は、上記ハイブリッドウイルス（例えば詳細を上記に記載されたようなプラスミドベクターなど）の１つのゲノムを含む本発明のプラスミドベクターでトランスフェクションしている。ついで、該宿主細胞は野生型ＨＰＩＶ−３、ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質を発現するプラスミドベクターでコトランスフェクションしている。該トランスフェクションした細胞をインキュベートしてハイブリッドウイルスを産生する。ついで、該ハイブリッドウイルスを製薬学的に許容し得る担体または培地中で単離する。さらにそのうえ、本発明はＨＰＩＶ−３またはｃｐ４５−ハイブリッドウイルスを弱毒化されているか否かを決定するための方法に関する。該方法は野生型ＨＰＩＶ−３のゲノムに比較してウイルスのゲノムにおいて少なくとも１つの変異をの存在を確認する。該変異はＬタンパク質またはＨＮタンパク質をコードするゲノムの領域中に存在する。本発明はまた、ウイルスが温度感受性表現系を有するか否かを決定するための方法にも関する。ＨＰＩＶ−３またはｃｐ４５ハイブリッドウイルスのサンプルが得られ、ついで最初のプラークアッセイが行われた。宿主細胞は野生型ＨＰＩＶ−３Ｌタンパク質を発現するプラスミドベクターでトランスフェクションし、ウイルスで感染させる。インキュベーション後、第２プラークアッセイを行い、最初のプラークアッセイに比較する。本発明は多様なウイルスに関連して使用されることができる生ワクチンを産生する新規の機会を提供する。本発明のワクチンが好ましい態様にｃｐ４５によって示される弱毒化傷害を生じるｃｐ４５を包含するため、本明細書に開示され請求されているワクチンはヒトまたは動物中における使用の間に弱毒化されることを期待されている。さらに、本発明はＨＰＩＶ−３ウイルスおよびｃｐ４５ハイブリッドウイルスにおいての温度感受性表現系および弱毒化を決定するための直接的および有効な方法を提供する。本発明の他の特徴および目的は当業者および部分的に以後指摘するものに明らかであるであろう。図面の簡単な説明図１はＨＰＩＶ−３ウイルスゲノムの模式図であり、そのｃＤＮＡセンス配列を垂直方向に５'（上部）から３'（下部）に示されている。そのゲノム領域は該リーダー配列およびヌクレオカプシドタンパク質、ＮＰ、リンタンパク質、Ｐ（＋Ｃ）、マトリクスタンパク質、Ｍ、融合タンパク質、Ｆ、赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパク質、ＨＮおよびラージタンパク質、Ｌをコードするゲノウの領域に対応して標識される。該ゲノムに関するその位置に対応したリーダー領域におけるヌクレオチドの変化の位置の数は、個々の遺伝子内でのヌクレオチド、の位置に関する他の位置の数をいう。図２Ａおよび２Ｂはｃｐ４５および野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）の間のＰタンパク質遺伝子のｍＲＮＡレベルを比較したサザンハイブリダイゼーションまたはサザンブロット分析の結果を描いた写真である。図２Ａは野生型ＨＰＩＶ−３（レーン１）、ｃｐ４５（レーン２）およびＰ遺伝子（レーン３）を含むプラスミドＤＮＡからのＰＣＲ増幅の１５サイクル後のｃＤＮＡを示す。増幅されたＤＮＡの大きさは右の矢印によって示されるように、ΦＸ１７４／HaeIII-消化ＤＮＡマーカー（データ示さず）。図２Ｂはモレキュラー・ダイナミクス・リン光体イメージャー（Molecular Dynamics Phosphor Imager）を用いたリン光体イメージング分析を用いたスロットブロットハイブリダイゼーション分析の結果を示す。そのうえに示されるように、左側のレーンはｃｐ４５、右側のレーンは野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）株である。図３Ａおよび３Ｂはパルスチェイス実験の結果を示し、それによってウイルスタンパク質合成の力動学を証明する。野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）またはｃｐ４５で感染させた細胞を３９.５℃で増殖させ、ついで１時間³⁵Ｓ−タンパク質でパルス図３Ａウサギ抗−ＨＰＩＶ−３で免役沈降された細胞溶解物を示し、ついで野生型ＪＳ株（最も左側の５レーン）およびｃｐ４５（最も右側の５レーン）の両方のために各レーン（０、１、２、３および４時間）の下指示された時点で示す。図３Ｂは、野生型ＪＳ株（最も左側の４レーン）およびｃｐ４５（最も右側の４レーン）の両方のために各レーン（０、１、２、３および４時間）の下で指示された時点での野生型ＨＰＩＶ−３のＨＮおよびＮＰに対するプールされたモノクローナル抗体で免役沈降された細胞リゼイトを示す。図４Ａおよび４Ｂは、ＥＬＩＳＡによって決定されるように、ｃｐ４５および野生型ＨＰＩＶ−３のＨＮタンパク質（図４Ａ）およびＦタンパク質（図４Ｂ）に対するモノクローナル抗体との応答性を示す棒グラフである。結果は抗体の特定の希釈（１：１８００）での３つの異なる実験から平均の吸光度（Ｏ.Ｄ.）として示される。該モノクローナル抗体７．１２．３、９．１．６．２、７,１４．２、５.４.８および９.４.３.６はＨＰＩＶ−３（４７８８５株）の抗原部位を定義する。モノクローナル抗体１７０／７、７７／５、ｃ／２６７、ｃ／２１５、ｂ／１０８、ａ／６４０およびａ／５９１をジュディ・ビーラー（Judy Bee ler）（ワールド・ヘルス・オーガニゼーション・リージェント・バンク（World Health Organization Reagent Bank）により提供された。図５Ａおよび５Ｂは、ウサギ抗血清およびモノクローナル抗体によって発現されたＨＰＩＶ−３タンパク質の免役沈降を示すゲル写真である。HeLa−Ｔ４細胞をＨＰＩＶ−３Ｌ、ＰまたはＮＰ遺伝子を含むプラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクリョンの約２０時間後、該細胞を３７℃で１時間［³⁵Ｓ］−メチオニン−［³⁵Ｓ］−システインで放射線標識した。細胞溶解物からのＨＰＩＶ−３タンパク質をＨＰＩＶ−３に対するウサギ抗血清またはＮＰにたいするモノクローナル抗体で免役沈降してＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。標識されたタンパク質を、還元剤２−メルカプトエタノールの存在下、ＳＤＳ−７．５％（図５Ａ）およびＳＤＳ−１０％（図５Ｂ）上で電気泳動した。図５Ａのレーンは、以下のものに対応する：ＨＰＩＶ−３に対するウサギ抗血清で免役沈降したベクターＤＮＡトランスフェクション細胞溶解物（レーン１）；ＨＰＩＶ− ３に対するウサギ抗血清で免役沈降したＰ−遺伝子−トランスフェクション細胞溶解物（レーン２）；およびＨＰＩＶ−３に対するウサギ抗血清で免役沈降したＬ−遺伝子−トランスフェクション細胞溶解物（レーン３）。図５Ｂのレーンは、以下のものに対応する：ＨＰＩＶ−３に対するウサギ抗血清で免役沈降したベクターＤＮＡトランスフェクション細胞溶解物（レーン１）；ＨＰＩＶ−３に対するウサギ抗血清で免役沈降したＬ−遺伝子−トランスフェクション細胞溶解物（レーン２）；およびＨＰＩＶ−３に対するウサギ抗血清で免役沈降したＮＰ− 遺伝子−トランスフェクション細胞溶解物（レーン３）。分子量マーカーの位置は、キロダルトンの左側に示す。図６ＡからＤは、ＨＰＩＶ−３ＮＰタンパク質（図６Ａ）、Ｐタンパク質（図６Ｂ）またはＬタンパク質（図６Ｃ）を一時的に発現する細胞の間接的免疫蛍光染色を表す写真であり、陰性対照に比較したそれらの増殖を示している（図６Ｄ）。ＨＰＩＶ−３ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質を発現する細胞およびベクターＤＮＡでトランスフェクションしたコントロール細胞を固定し、最初に抗ＨＰＩＶ −３抗体および第２に免疫蛍光でコンジュゲートしたマウス抗ウサギ免疫グロブリンＧ−蛍光イソチオシアネートで反応させる。図７Ａおよび７Ｂは、３２℃でＬ−１３２細胞培養物中に培養培地に対して外在的な細菌ノイラミニダーゼの付加あり、またはなしでのｃｐ４５（図７Ａ）およびＨＰＩＶ−３（ＪＳ）（図７Ｂ）の増殖の特徴づけを示すグラフである。バーは３つの独立した実験の標準誤差を示している。図８Ａから８Ｄは、外在性ノイラミニダーゼなしの培養物中での増殖後ｃｐ４５（図８Ａ）およびＨＰＩＶ−３（ＪＳ）（図８Ｂ）で感染させた細胞および外在性ノイラミニダーゼの存在下での増殖後、ｃｐ４５（図８Ｃ）およびＨＰＩＶ −３（ＪＳ）（図８Ｄ）で感染させた細胞によって細胞変性効果を示している写真である。細胞を０.０１の感染多重度で感染させ、３２℃で３６時間、外在性ノイラミニダーゼあり、またはなしのいずれかでインキュベートする。図９Ａから９Ｄは、外在性ノイラミニダーゼなしでの増殖後、組織培養細胞中でｃｐ４５（図９Ａ）およびＨＰＩＶ−３（ＪＳ）（図９Ｂ）のＨＮ糖タンパク質および外在性ノイラミニダーゼの存在下での増殖後の組織培養細胞中でのｃｐ４５（図９Ｃ）およびＨＰＩＶ−３（ＪＳ）（図９Ｄ）の分布を示す免疫蛍光法に基づいた写真である。図１０Ａおよび１０Ｂは、多様なｐＨでのｃｐ４５（図１０Ａ）およびＨＰＩＶ−３（ＪＳ）（図１０Ｂ）のノイラミニダーゼ活性における多様性を示すグラフである。ノイラミニダーゼ活性アッセイを基質としてフェチュイン（中抜き円）またはノイラミニダーゼ（塗りつぶした円）を用いて行われたノイラミニダーゼ活性アッセイである。図１１Ａおよび１１Ｂは、２→３結合（図１１Ａ）または２→６結合（図１１Ｂ）のいずれかを有するノイラミンラクトース基質を用いてアッセイした。図１２Ａおよび１２Ｂは、ｃｐ４５（陰を付した領域）およびＨＰＩＶ−３（ＪＳ）（影を付していない領域）をアフィニテイー精製したＨＰＩＶ−３ＨＮ糖タンパク質が、基質としてフェチュイン（図１２Ａ）およびノイラミンラクトース（図１２Ｂ）のいずれかを用いてＮＨ糖タンパク質、２−１４−１、１３−９ −６−２および１７０／８に対する３つのモノクローナル抗体でアッセイする。発明の詳細な説明本明細書で使用する「ＨＰＩＶ−３」はヒトパラインフルエンザ３型およびすべてのＨＰＩＶ−３株を意味し、すべての野生型ＨＰＩＶ−３株およびｃｐ４５などの弱毒化した株を含む。「野生型ＨＰＩＶ−３」は野生型株を意味し、弱毒化株は含まない。「ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）」または「ＪＳ株」はＨＰＩＶ−３のＪＳ株の野生型を意味する（ベルシュ（Belshe）およびヒッソム（Hissom）１９８２）。「ｃｐ４５」なる語は弱毒化した温度感受性で寒冷適応した野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）のｃｐ４５株でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）（ロックビル、メリーランド）、受託番号第号である。本明細書に引用される参考文献の各々はその全体を参照のために包含する。本発明は４５のウイルスゲノムにおける遺伝的欠損に特異的であるｃｐ４５の弱毒化傷害の２つに相関する。特に、温度感受性および寒冷適応表現型を生じるｃｐ４５の弱毒化の有意なレベルは、野生型ＪＳ株において対応する遺伝子である大またはＬ遺伝子の突然変異と直接関係がある。さらにそのうえ、第２弱毒化傷害は温度感受性傷害の傾向が独立して存在することを理解する。［ＨＮ］遺伝子の突然変異と直接関連がある。特異的遺伝子のこれらの２つのｃｐ４５の弱毒化傷害の相関はいくつかの実施可能な応用が可能である。現在他の野生型ＨＰＩＶ−３ウイルスに直接のワクチンを作成したり、そのうえ、遺伝的操作技術を用いてＨＰＩＶ−３以外の標的ウイルスに関する。例えば、変異Ｌおよび／またはｃｐ４５のＨＮ遺伝子は、標的ウイルスのウイルスゲノムに組み込まれることができる。別法として、表面抗原をコードする標的ウイルスは、ｃｐ４５のウイルスゲノムに組み入れられることができる。さらに、ＨＰＩＶ−３株またはハイブリッド・ウイルス株の存在下で、本明細書に記載の方法により、弱毒化し、確認し、その１および／または遺伝子を弱毒化する。ＨＰＩＶ−３はエンベロープされ、ネガティブセンスで一本鎖のＲＮＡウイルスである。そのウイルスゲノムは少なくとも６つの構造タンパク質をコードし、３'末端から引き続いて：［３’−ＮＰ−Ｐ（＋Ｃ）−Ｍ−Ｆ−ＨＮ−Ｌ−５'］、ここで３'はゲノムの３'リーダー領域をいい、ＮＰ、Ｐ（＋Ｃ）、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬはそれぞれヌクレオカプシドタンパク質、リンタンパク質、マトリクスタンパク質、融合タンパク質、赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパク質および大タンパク質をいう（スプリッグス（Spriggs）およびコリンズ（Collins）１９８６；ストーレイ（Storey）ら１９８４）。相対的に短く、該領域のそれぞれをわける非コーディング介在配列領域は機能的タンパク質をコードする。ヌクレオカプシドタンパク質であるＮＰは最も豊富に存在する構造タンパク質である。該タンパク質はゲノムＲＮＡをカプシド化され、構造の統一およびゲノムの鋳型機能を維持すると信じられている。Ｌタンパク質はＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼとして機能し、Ｐタンパク質はＬの機能を支持する補助調節タンパク質として機能する。Ｐ（＋Ｃ）遺伝子はまた（Ｃ＋）リーディングフレームをも含む。マトリクスタンパク質、融合タンパク質および赤血球凝集素ノイラミニダーゼータンパク質（それぞれＭ、ＦおよびＨＮ）は集合的にヌクレオカプシドのコアを包む液体エンベロープを作成する。Ｍは該エンベロープの内部構造を形成し、ＭおよびＨＮは表面糖タンパク質である。赤血球凝集素またはＨ部位のＨＮタンパク質はＨＰＩＶ−３によって宿主細胞に接着または透過することに責任を負っており、一方でそのノイラミニダーゼまたはＨＮタンパク質のＮタンパク質が複製後宿主細胞から子孫ウイルスの放出に責任を負っている。感染した細胞の細胞質中でのＨＰＩＶ−３などのパラミグゾウイルスの複製の間、ヌクレオカプシドタンパク質（ＲＮＡ−ＮＰ）はウイルスＲＮＡポリメラーゼ、Ｌの全力によって転写の鋳型として機能する。ＬおよびＰタンパク質は、両者ともにＲＮＡ−ＮＰコアに関連し、予備転写の間、Ｌ−Ｐ−複合体はウイルスタンパク質をコードする個々のｍＲＮＡにゲノムＲＮＡを転写させるはずである。さらに、感染細胞中での複製の間、ＮＰはＰとともに可溶性複合体を形成する。本複合体は第１次転写からウイルスＲＮＡの複製へとスイッチするためのヌクレオカプシド複合体を転写させることと相互作用があると考えられている。野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）ゲノムおよび温度感受性ｃｐ４５ゲノムの完全な核酸配列は公知であり、比較されている（ストークス（Stokes）ら、ガリンスキ（Galinski）ら、１９８８：ガリンスキら１９８６；ガリンスキら１９８６'；スプリッグス（Spriggs）およびコリンズ１９８６；スプリッグスおよびコリンズ１９８６'；ストーレイ（Storey）ら、１９８４）。野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）ゲノムとｃｐ４５ゲノムの間に存在する少なくとも１８ヌクレオチドの差異が図１に示されるように存在する。しかしながら、これらの１８ヌクレオチドの変化のうちの９つが弱毒化されていない株において見いだされるか、またはコードするタンパク質におけるアミノ酸変化を結果としない。残りの変化のうちの２つは非コーディング３'リーダー領域において存在するが、調節に重要であるようである。従って、ｃｐ４５ゲノムと野生型ゲノムとの間の少なくとも残りの７つのヌクレオチド差異は４つの変異タンパク質におけるアミノ酸配列の変化という結果となる：Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ_o対応する野生型ＪＳタンパク質に比較した変異型ｃｐ４５タンパク質のアミノ酸配列における変化は、以下を含む：Ｍ遺伝子において、１９９残基でプロリン（Pro）をトレオニン（Thr）で置換する；Ｆ遺伝子において、４２０残基でイソロイシン（Ile）をバリン（Val）で置換し、４５０残基でアラニン（Ala）をトレオニン（Thr）で置換する；ＨＮ遺伝子において、３８４残基でバリンをアラニンで置換する；Ｌ遺伝子において、９４２残基でチロシン（Tyr）をヒスチジン（His）で置換し、９９２残基でロイシン（ Leu）をフェニルアラニン（Phe）で置換し、および１５５８残基でトレオニン（ Thr）をイソロイシン（Ile）で置換する。Ｌタンパク質をコードする野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）の領域における変異は現在ｃｐ４５株の温度感受性表現型に直接相関すると理解されている。すなわち、ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）のｃｐ４５株の温度感受性表現型が、野生型ＪＳ株の対応する遺伝子に比較下ｃｐ４５のラージまたはＬ遺伝子における変異によって引き起こされる。Ｌ遺伝子はＨＰＩＶ−３ウイルスのＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼをコードする。本明細書で変異Ｌタンパク質という変異Ｌ遺伝子の遺伝子産物は、いっそう高い、非寛容的温度で野生型ＪＳ株のものと比較して、低減したポリメラーゼ活性を有する。そのような低減したポリメラーゼ活性はウイルスＲＮＡの低減した転写およびウイルスタンパク質の低減した合成となる。転写活性における幾分かの低減は、約３７℃で観察され始め、ついで顕著な低減は約３８℃ またはそれ以上の温度で起こる。従って、ｃｐ４５の非寛容な温度は約３７℃より非常に高い温度であるとみなされ、一般に約３７℃から約４０℃の範囲である。理論に縛られることなく、さらに高い温度およびｐＨは、そのように高温は変異ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼのコンフォメーションの変化を引き起こすためある細胞のコンパートメントにおいて発達されると信じられている。特に、それぞれ９４２残基および９９２残基でのＬタンパク質中のHisおよびPhe置換は、温度感受性表現型の存在に重大に貢献していると信じられている。ヒスチジン−フェニルアラニン相互作用はｐＨ依存性であり、細胞内のｐＨの変化は温度によって影響を及ぼされる。一層高い非寛容な温度およびｐＨにおける対応する変化への移行は、ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌタンパク質）におけるコンフォメーションの変化を引き起こすヒスチジン−フェニルアラニン相互作用という結果となる。今度はそのようなコンフォメーション上の変化は、低減されたポリメラーゼ活性および対応する転写および複製における低減となる。ポリメラーゼ活性において観察された低減がより低い寛容な温度で観察されないので、変異Ｌタンパク質を有するウイルスは弱毒化され、特徴的な温度感受性表現型を示し、それによってワクチンとしての使用に適切になる。野生型ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼはそのような温度感受性のコンフォメーション上の変化を経験しないでいるかもしれない。ｃｐ４５株の温度依存性複製ははっきりとｃｐ４５ワクチンにおいて観察された弱毒化に貢献している。表１に示すように、温度感受性ｃｐ４５株の複製は野生型（“ＷＴ”）ＪＳ株（実施例１）の複製に比較して約１０⁶の因子によって低減させられている。ｃｐ４５は一層高い温度で２４時間後、３９.５℃から３２℃までインキュベーション温度を移動させ、ついで特徴的である温度感受性表現型を示した。ｃｐ４５のウイルス株の貧弱な転写活性は３９．５℃で顕著に低減されたＭＲＮＡ合成となり、ついでその結果、タンパク質合成およびウイルス増殖を有意に影響する（実施例１）。表１温度シフト実験におけるｃｐ４５および親野生型（ＷＴ）ウイルスの収率の比較 ^aＬ−１３２細胞、同様の感染多重度で感染したウイルスの収率を、インキュベーション４８時間後に示した。 ^b温度シフトｃｐ４５ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌタンパク質）の温度依存活性および非寛容温度（約４０℃）でのｃｐ４５の低減した転写はＬタンパク質をコードするウイルスゲノムの領域で変異に関連づけた。ｃｐ４５で感染した細胞は単独では有意には複製しないし、細胞は複製の有意なレベルを示す（実施例４および実施例５）。表２は、Ｌ−１３２上での補体プラークアッセイの複製収率をレポートしている。端的には、ＣＶ−１細胞をＳＶ４０大Ｔ抗原をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＲＳＶ−Ｔ）および組換えプラスミドＤＮＡｓ（Ｌ、Ｐおよび／またはＮＰ）で同時トランスフェクションされた。ＣＶ−１細胞はついでｃｐ４５ウイルスでトランスフェクションの２０時間後に感染させ、ついで３９.５℃ で２８時間インキュベートした。表２に示すように、温度感受性ｃｐ４５株が補体アッセイにおいて、非変異野生型Ｌタンパク質によって補足されている場合、複製レベルは、プラークアッセイ法によって測定されるように、補足されていないｃｐ４５に比較して１００より多くの因子によって増加される。対照的に、野生型Ｐタンパク質または野生型ＮＰタンパク質で補足されているｃｐ４５株は複製に全く影響を及ぼさない。ｃｐ４５と同時トランスフェクションした細胞および野生型Ｌ、Ｐタンパク質または野生型Ｌ、ＰおよびＮＰタンパク質と同時トランスフェクションした細胞はｃｐ４５で同時トランスフェクションした細胞および野生型Ｌタンパク質単独で同時トランスフェクションした細胞を越えて収率が同様に増加することを示し、それによりＬタンパク質の中心的役割を示している。表２非寛容の温度（３９.５℃）でのｃｐ４５ウイルスの回収のための補体アッセイ重要なことに、ｃｐ４５子孫ウイルスは野生型Ｌタンパク質が非肝要な温度でのｃｐ４５株を補足するために使用される同時トランスフェクションした細胞から産生され、親ｃｐ４５株の温度感受性表現型を保有した（実施例６）。さらに、ｃｐ４５のＬタンパク質補体は異種型的に排他的である（実施例６）。従って、一層高温の非寛容温度でのｃｐ４５複製の回収は変異Ｌタンパク質（ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ）がｃｐ４５の温度感受性表現型に責任を負っている。他の弱毒化領域もｃｐ４５の弱毒化に貢献しているが、変異タンパク質の貢献が特別に有意である。ｃｐ４５株の第２弱毒化傷害は、野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）株において対応する遺伝子に比較して、ｃｐ４５の赤血球凝集素ノイラミニダーゼ遺伝子または［ＨＮ］遺伝子における変異に結合する。ＨＮ遺伝子は赤血球凝集素活性およびノイラミニダーゼ活性の両方を有するタンパク質をコードする。本明細書で変異体ＨＮタンパク質という変異ＨＮ遺伝子変異体の遺伝子産物は、野生型（ＪＳ）株のＨＮタンパク質に比較している。低減したノラミニダーゼはアミノ酸置換に貢献するコンフォメーション変化のために、宿主細胞からの程度を減少させるようにしている。いくつかの実験は、低減したノイラミニダーゼは変異ＨＮタンパク質と直接関連するものである（実施例７）。図７Ａに示すように、ｃｐ４５ウイルス力価は外在性ノイラミニダーゼを欠如した培養培地中での約５０時間のインキュベーション後に測定し、それは外在性ノイラミニダーゼの培養培地を含む培養培地中でのインキュベートの後で測定した（図７Ｂ）。さらに、低い感染多重度でｃｐ４５で感染させたおよび特徴的な高い巨大細胞または多核形成とで、限局した細胞融合を示した３２℃で増殖した（図８Ａ；実施例８）。矛盾せずに、ｃｐ４５で３３℃で感染したＬ−１３２細胞において発現された変異体ＨＮタンパク質の分布は限局された領域に制限されている。（図９Ａ；実施例９）。しかしながら、２つの直前に記載した実験の各々に類似している実験での培養培地に外在性ノイラミニダーゼを加えると、限局した細胞融合の程度（図８Ｃ）と制限および限局された変異ＨＮタンパク質（図９Ｃ）の分布の程度の両方で劇的に減少する。外在性ノイラミニダーゼの存在下でインキュベートしたｃｐ４５感染細胞において見られる細胞変性効果はＪＳ感染細胞において見られる効果と類似であり、外在性が欠如している（図８Ｂ）か、外在性ノイラミニダーゼの存在下（図８Ｄ）でインキュベートされるか否かにかかわりなく有意差がほとんどない細胞融合が見られる。野生型ＪＳＨＮ糖タンパク質の均一か類似の分布は、外在性が欠如している（図８Ｂ）か、外在性ノイラミニダーゼの存在下（図９Ｂ）でインキュベートされるかどうかにかかわりなく観察される。培養培地中の細菌性ノイラミニダーゼの添加後の融合促進活性の不在は、ｃｐ４５の融合がそのノイラミニダーゼ活性と関連があることを示している。培地中の変異ＨＮタンパク質の限局された分布および極度に限局された細胞融合は、感染細胞からのウイルス子孫の放出が野生型ＪＳ株で感染した細胞に比較して減少し、ウイルスの多細胞複製は変異ｃｐ４５ＨＮタンパク質によって抑制されることを示す。ノイラミニダーゼ活性試験は、野生型ＪＳ株のＨＮタンパク質に比較したｃｐ４５変異ＨＮタンパク質においてコンフォメーション変化を示唆する。表３を参照すると、ＪＳ株に比較したｃｐ４５株のノイラミニダーゼ活性における減少は、非寛容（３９.５℃）と寛容（３２℃）温度の両方にて示されている。一層高くでは、非寛容温度で、フェチュインまたはノイラミンラクトースがアッセイ基質として使用されるか否かにかかわらずＪＳ株のノイラミンラクトースから異なるものを有する。低いところでは、しかしながら２つの株のためのノイラミニダーゼ活性における差異は、基質としてのフェチュインを用いたアッセイにおいてのみ観察された。寛容温度ではｃｐ４５とＪＳ株の活性の間に該アッセイが相対的に小さなノイラミノラクトース基質を使用する場合は、ｃｐ４５およびＪＳ株の活性の間で寛容な温度では、全く差異は見られなかった。観察された基質依存性は、ｃｐ４５のＨＮタンパク質の、ノイラミニダーゼ活性付与部位の三次構造がＪＳ株の構造と異なっているようであることを示唆している。表３ｃｐ４５と親野生株（ＷＴ）ウイルスのノイラミニダーゼ活性の比較 ^aＨＡ＝赤血球凝集素活性 ^b結果は５４９ｎｍでの吸光度として示されている。控訴的特性におけるさらなる差異は、さらなるノイラミニダーゼ研究で観察された。ｃｐ４５およびＪＳ株におけるノイラミニダーゼ活性のｐＨ最適条件フェチュインまたはノイラミンラクトースのいずれかでノイラミニダーゼ活性アッセイを用いることによって比較された（実施例１０）。図１０Ａおよび１０Ｂにおいてのデータを比較することによって見られるように、ノイラミニダーゼ活性が小さな基質でアッセイする場合、ｃｐ４５およびＪＳ株のための最適化ｐＨは同様であり、約５.５であった。しかしながら、より大きな基質であるフェチュインでアッセイした場合、ｃｐ４５のための最適ｐＨは約４.９であり、ＪＳ株の最適化ｐＨは約６.３であった。理論に縛られることなく、ｃｐ４５のノイラミニダーゼアッセイのための野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）の活性に比較して、低いｐＨ最適化はｃｐ４５の最適ｐＨより野生型ＪＳ株の最適化ｐＨに密接しているｐＨを有する気道の領域においてイン・ビボＨＰＩＶ−３感染が開始されるところのｃｐ４５の弱毒化傷害である変異ＨＮタンパク質と一致する。酵素力学的研究において、ｃｐ４５およびＪＳ株のノイラミニダーゼ活性は２→３または２→ ６結合（実施例１０）のいずれかを有するノイラミンラクトース基質お有するアッセイを用いて決定された。力学的研究がｐＨ５.５でおこなわれ、ノイラミンラクトースのための最適条件であることが示された。ｃｐ４５およびＪＳ株の活性における変化の割合の比較は両方の株が同様に２→３結合を好む（図１１Ａ）ための活性を有する一方、ｃｐ４５はＪＳ株よりも２→６結合を非常に好む（図１１Ｂ）ことを示している。さらに、ｃｐ４５は２→６結合よりも２→３結合を非常に好む（図１１Ａおよび図１１Ｂを比較）。理論に縛られることなく、ノイラミニダーゼ活性アッセイに関する実験の結果は、ｃｐ４５のＨＮタンパク質がＨＰＩＶ−３（ＪＳ）の三次構造に比較して変わった三次構造を有することおよび変異ＨＮタンパク質の活性が温度、ｐＨ、基質および／または結合依存性であることが累積的に示唆される。ノイラミニダーゼ活性における減少は感染した細胞表面からの子孫ウイルス粒子の放出を制限する。しかしながら約５から約１０の間の範囲にわたる因子による活性における減少は、変異ＨＮタンパク質が変異体Ｌタンパク質に比較してあまり重要ではない傷害に貢献していることを示唆している。さらに、野生型株の３'リーダー領域に比較して、ｃｐ４５の３'リーダー領域におけるヌクレオチド変化は寒冷適応、温度感受性および／またはｃｐ４５の弱毒化特性に影響される。ｃｐ４５の転写活性およびノイラミニダーゼ活性が野生型ＨＰＩＶ−３に比較して減少しているか他の生物学的特性は有意に変化しない。初期の研究はエンベロープ糖タンパク質の抗原部位はモノクローナル抗体のパネルの反応性によって定義されるが、野生型株に比較してｃｐ４５において影響されないままであることを示している。しかしながら、ｃｐ４５の表面抗原の幾分の調節は、ｃｐ４５およびＨＰＩＶ−３（ＪＳ）のノイラミニダーゼ活性部位の関連性を野生型ＨＰＩＶ−３のノイラミニダーゼ活性を抑制すると知られている抗体および抗血清を用いて比較されるさらなる研究において示されている。ｃｐ４５およびＨＰＩＶ −３（ＪＳ）ノイラミニダーゼ活性の抑制を、３つのモノクローナ抗体（２−１４−１、１３−９−６−２および１７０／８）および精製ＨＮに対するアフィニティーのウサギ抗血清にモノ特異的である（実施例１１）。フェチュインをノイラミニダーゼ活性の抑制を決定するための基質として使用する場合、ｃｐ４５とＨＰＩＶ−３（ＪＳ）の間の有意な差異は見られなかった（図１２Ａ）。相対的に小さなノイラミンラクトース基質を使用する場合、しかしながら、ｃｐ４５株のノイラミニダーゼ活性は、ＪＳ株の活性よりも抑制されておらず、モノクローナル抗体１２−９−６−２および１７０／８によってのほうが抑制されやすい（図１２Ｂ）。２つの株の中のノイラミニダーゼ活性の阻害の程度はモノクローナル抗体２−１４−１およびモノ特異的ウサギ血清（図１２Ｂ）である。理論に縛られることなく、ＣＰ４５ＨＮタンパク質の酵素部位のアミノ酸配列における変異はモノクローナル抗体１２−９−６−２および１７０／８によって認識される抗原部位に小さな変化を引き起こすようであるが、他の抗原部位に顕著な影響を及ぼさず、例えば、２−１４−１抗体によって認識される抗原部位を含む。それにもかかわらず、コンフォメーション上のエピトープにおける小さな変化にもかかわらず変異ＨＮタンパク質はＨＰＩＶ−３に特異的な免疫応答を引き出す能力を保有する。同様に、ＨＮおよびＦ糖タンパク質の細胞表面への輸送およびＨＮタンパク質の赤血球凝集素によって決定されるのだが、これらは野生型ＪＳ株に比較して実質的には異ならない（実施例３）。さらに、限られたウイルス形態形成は非寛容温度で観察された。ｃｐ４５のＬ遺伝子およびＨＮ遺伝子の変異体と関連した傷害の弱毒化は他の野生型ＨＰＩＶ−３ウイルスに対するワクチンを創造し、さらに、ＨＰＩＶ−３の他の別の標的ウイルスに有効である。一般的に、標的ウイルスは１またはそれ以上の表面抗原を有するエンベロープタンパク質である。本明細書で使用する「表面抗原」とは、イン・ビボにおける免疫応答を産生することができるタンパク質またはその一部をいい、ついで一般的に表面タンパク質を含み、表面糖タンパク質および／または宿主細胞にウイルスが接着することに責任を負っている他の残基、そしてそれは、ウイルスが感染を確立する宿主細胞に透過することができるようにし、および／または感染した宿主細胞からの子孫ウイルスの放出を容易にする。多様なウイルスまたはウイルス株の表面抗原はイン・ビボでの免疫応答を産生するような異なる抗原部位であるならば、互いに「異なっている」とみなされる。本発明の目的のため、差異は、表面抗原が異なる抗体によって、選択的にスクリーニングされるかまたは選択的に抑制されることを示すイン・ビトロアッセイを用いて証明されることができる。標的ウイルスは一般的に野生が部であり、または生の弱毒化したワクチンを使用することが望まれる変異体ウイルスをも含むことができる。好ましい標的ウイルスは、ヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ− １）、ヒトパラインフルエンザウイルス２型（ＨＰＩＶ−２）、呼吸器合胞性ウイルス（ＲＳＶ）、ヒトインフルエンザウイルスＡ型、ヒトインフルエンザウイルスＢ型、耳下腺炎および麻疹ウイルスなどの関連した、エンベロープ化した、ネガティブセンスの、一本鎖ＲＮＡウイルスを含む。ＨＰＩＶ−１、ＨＰＩＶ− ２、ＲＳＶインフルエンザおよび麻疹などの標的ウイルスは各々、宿主細胞に接着し、宿主細胞に透過するウイルスに関連した表面タンパク質を有し、ＨＰＩＶ −３のＦおよびＨＮタンパク質に機能的に類似であると考えられることができる。これらのウイルスの各々の表面タンパク質をコードする核酸配列が知られている。ＨＰＩＶ−１およびＨＰＩＶ−２はＨＰＩＶ−３同様、各々２つの表面糖タンパク質ＨＮおよびＦを有し、それぞれは機能的にＨＰＩＶ−３のＨＮおよびＦタンパク質に類似である。１型および２型パラインフルエンザウイルスの両方に関して、ＨＮタンパク質およびＦタンパク質のＨ部位は接着および透過にそれぞれ関連し、他方、ＨＮタンパク質は子孫ウイルスの放出に責任を負う。ＨＰＩＶ −１に関するＦ遺伝子およびＨＮ遺伝子の核酸配列は以前に決定されていた（マーソン（Merson）ら；マツオカ（Matsuoka）ら１９９０）。ＨＰＩＶ−２のＦ遺伝子およびＨＮ遺伝子の核酸配列は、同様に決定される（フ（Ｈｕ）ら、１９９０；プレシャス（Precious）ら、１９９０；カワノ（Kawano）ら、１９９０' ；カワノら、１９９０）。ＲＳＶ−ＡおよびＲＳＶ−Ｂ各々は２つの糖タンパク質、ＦおよびＧを有する。Ｇタンパク質はＨＰＩＶ−３のＨＮタンパク質の赤血球凝集素活性に機能的に類似である；該タンパク質は宿主細胞上の接着に関する活性を有する。Ｆは宿主細胞へのヌクレオカプシドの透過に関する。ＲＳＶ−ＡのＦ遺伝子およびＧ遺伝子の核酸配列が決定される（ロペス（Lopez）ら１９９８；マーチン−ギャラルド（Martin-Gallardo）ら１９９１；アンダーソン（And erson）ら１９９２；マーチン−ギャラルドら１９９３；コリンズら１９９３）。ＲＳＶ−ＢのＦ遺伝子およびＧ遺伝子の核酸配列はまた、以前に決定している（ベイバット（Baybutt）およびプリングル（Pringle）１９８７；サレンダー（ Sullender）ら１９９０；サレンダーら１９９１）。これらの配列またはその一部はまた拡張的に比較されてきた（ジョンソン（Johnson）およびコリンズ１９８８；ジョンソンおよびコリンズ１９８８'）。インフルエンザＡ型およびＢ型はまた２つの表面糖タンパク質：ＨおよびＮを有する。Ｈタンパク質は宿主細胞への接着および透過に関する活性を有する。Ｎタンパク質は感染した宿主からの子孫ウイルスの放出に関する。インフルエンザウイルスの抗原部位は典型的には毎年ごと位に変化するが、現在の株のサンプルは（米国センター・フォー・インフェクシャス・ディジーズ・コントロール（Ｕ.Ｓ.Center for InfectiousDis ease Control））から容易に利用でき、現在の表面糖タンパク質を定義する核酸配列はそれらから決定される。麻疹ウイルスまた２つ表面糖タンパク質：ＨＮおよびＦを有する。ＨＰＩＶ−３同様に、ＨＮタンパク質およびＦタンパク質のＨ部位はそれぞれ接着および透過に関連し、一方、タンパク質のｎ部位は始祖ウイルスの放出に責任を負っている。ウシＲＳＶウイルスはヒトＲＳＶ株に機能的に類似である２つの表面タンパク質を有する。ウシＲＳＶＧおよびＦ糖タンパク質の核酸配列を決定している（ラーチ（Lerch）ら１９９０；ウォルラベンズ（Wal ravens）ら１９９０。）分子的および機能的に類似の表面タンパク質のためＨＰＩＶ−３に関するウイルスが好ましく、本発明の標的ウイルスはまた他のエンベロープ化したウイルス、例えば他のパラミグゾウイルスィズ、他のオリトミグゾウイルスィズ、レトロウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶは接着機能（ＨＩＶ−ＧＰ１２０）および透過機能（ＨＩＶ−ＧＰ４１）を有する）、アリーナウイルス、コロナウイルス、ブニヤウイルス、ラブドウイルス、トガウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびヘパドナウイルスを含む。好ましい標的ウイルスは細胞質において産生するエンベロープウイルスを含む。本発明の標的ウイルスはヒトに特異的であり、動物に特異的または動物およびヒトの両方に共通するであろう。ウシＲＳＶおよび家畜ＨＰＩＶ−３（輸送熱ウイルス）は本発明の範囲内に含まれる典型的な動物ウイルスである。ＨＰＩＶ−３ウイルスでは好ましくはエンベロープ化した、ネガティブセンスの、一本鎖ＲＮＡウイルスであるハイブリッドウイルスを創造するために、遺伝的操作技術を用いることによって創造することができる。そのようなハイブリッドウイルスは創造されることができ、概して、Ｌを有する標的ウイルスのゲノム中の野生型Ｌおよび／またはＨＮ遺伝子を置換することによって一般的に創造されることができる。そのＬまたはＨＮ遺伝子は変異体Ｌおよび／またはＨＮタンパク質をコードし、低減したポリメラーゼおよび／またはノイラミニダーゼ活性をそれぞれ有する。ついでハイブリッドウイルスは弱毒化ワクチンを形成するために製薬学的に許容し得る担体と組み合わせられる。ＨＰＩＶ−３標的ウイルスに対するワクチンにおいての使用に適しているハイブリッドウイルスは、ＨＰＩＶ−３標的ウイルスの３'リーダー領域または以下のタンパク質の１またはそれ以上をコードする核酸配列と同様の核酸配列を含む：野生型ＨＰＩＶ−３標的ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質［ＮＰ］、リンタンパク質［Ｐ（＋Ｃ）］、マトリクスタンパク質［Ｍ］および／または融合タンパク質［Ｆ］。ウイルスゲノムはさらにＨＮおよびＬ遺伝子を含む。ウイルスゲノムのＨＮ遺伝子は標的ウイルスの野生型ＨＮタンパク質かまたは約３９℃ の温度での標的ウイルスのＨＮタンパク質に関連するノイラミニダーゼ活性より少ないノイラミニダーゼ活性を有する標的ウイルスまたは変異ＨＮタンパク質をコードする。同様に、ウイルスゲノムのＬ遺伝子は標的ウイルスの野生型Ｌタンパク質かまたは約３９℃の温度で標的ウイルスのＬタンパク質に関連するＲＮＡポリメラーゼ活性を有する変異Ｌタンパク質をコードする。いずれの場合も、ＨＮ遺伝子またはハイブリッドウイルスのＬ遺伝子のいずれかは変異タンパク質、例えば野生型ＨＰＩＶ−３ウイルスに比較して少なくとも１つの弱毒化傷害（変異ＨＮまたは変異体Ｌタンパク質のいずれかに基づく）を有する。一態様において、ハイブリッドウイルスのゲノムは変異体Ｌタンパク質をコードする核酸配列および変異体ＨＮタンパク質をコードする核酸配列を含む。そのようなハイブリッドウイルスはｃｐ４５同様に、少なくとも２つの弱毒化傷害を有する。さらにハイブリッドウイルスの３'リーダー領域は、野生型ＨＰＩＶ− ３標的ウイルスの３'リーダー領域に比較して少なくとも１つの核酸変異を有する変異３'リーダー領域であってよい。ｃｐ４５３'リーダー領域は好ましい変異体３'リーダー領域である。同様に、ハイブリッドウイルスのゲノムは、個々の野生型タンパク質に比較して、１つのアミノ酸変異を有する変異ＮＰ、Ｐ（＋Ｃ）、ＭまたはＦタンパク質をコードする核酸配列を含むことができる。ｃｐ４５、ＮＰ、Ｐ（＋Ｃ）、ＭおよびＦタンパク質は好ましい変異体タンパク質である。かわりに、わずかに少なく弱毒化したハイブリッドウイルスは変異Ｌタンパク質をコードする核酸配列および野生型ＨＮタンパク質をコードする核酸入れうを含むゲノムを有する。このハイブリッドウイルスの３'リーダー領域は野生型または変異体３'リーダー領域であってよく、およびウイルスゲノムはまた野生型かまたは変異体ＮＰ、Ｐ（＋Ｃ）ＭおよびＦタンパク質をコードする核酸配列を含むことができる。模範的なハイブリッドウイルスは、ｃｐ４５のＨＮ遺伝子が野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）で置換されている修飾したｃｐ４５ウイルスである。特別に、そのように修飾したｃｐ４５ハイブリッドウイルスは、その３'末端から続いて（ｉ）３'リーダー領域の核酸配列と同様である核酸配列、（ii）ｃｐ４５のヌクレオカプシドタンパク質［ＮＰ］をコードする核酸配列、（iii）ｃｐ４５のリンタンパク質［Ｐ（＋Ｃ）］をコードする核酸配列、（iv）ｃｐ４５のマトリクスタンパク質［Ｍ］、（v）ｃｐ４５または標的ウイルスの融合タンパク質［Ｆ］をコードする核酸配列、（vi）標的ウイルスの赤血球凝集素−ノイラミニダーゼタンパク質［ＨＮ］および（vii）ｃｐ４５のＬタンパク質をコードする核酸配列。例えば、上記の修飾したｃｐ４５ウイルス（野生型（ＪＳ）ＨＮタンパク質およびｃｐ４５Ｌタンパク質を有する）は野生型ＪＳ株に比較してｃｐ４５よりも少なく弱毒化されている。これらのワクチンは例えば、ｃｐ４５での臨床上の試行は、複製のわずかに高いレベルおよび一層高い免疫応答を結果する事が望ましいことを示している。ＨＰＩＶ−３の他のウイルスを目的としているワクチンはまた創造されている。例えば、標的ウイルスの１またはそれ以上の表面糖タンパク質または表面抗原（典型的には接着、透過、ウイルスおよびウイルスの子孫の放出に責任を負うタンパク質）が組み合わせられ、遺伝子操作を介して、複製および内部構造に責任のあるタンパク質を責任を負うタンパク質をコードするｃｐ４５ウイルスゲノムの領域が存在する。得られたハイブリッドウイルスはｃｐ４５ウイルスゲノムおよび標的ウイルスのウイルス特異的抗原的特性によって貢献される温度感受性弱毒化特性を有するであろう。そのように、ハイブリッドウイルスは安全および免疫原製の予測可能なレベルを有し、ヒトにおいてワクチンとして使用するために適当である。非ＨＰＩＶ−３標的ウイルスと組み合わせて環境改変したウイルスはエンベロープ化した、ネガティブセンスの、一本鎖ＲＮＡハイブリッドウイルスがを含み、ＲＮＡハイブリッドウイルスと適当な製薬学的に許容し得る担体を含む。ハイブリッドウイルスは、少なくとも１つの標的ウイルスの表面抗原。コードした表面抗原は抗原的にｃｐ４５などのＨＰＩＶ−３ウイルスの表面抗原と結果的には異なる。ハイブリッドウイルスゲノムはまた以下またはそのすべてをコードする核酸配列を含む：（ｉ）約３９℃の温度で標的ウイルスに関する一層低い活性を有する、および／または、ＲＮＡポリメラーゼ活性を有する変異体大タンパク質［Ｌ］、および／または（ii）約３９℃の温度で気温３９℃にてノイラミニダーゼ活性をわずかしかもたない部位である。ＨＮタンパク質のコードされた部位は好ましくは少なくとも約５０アミノ酸残基長、より好ましくは少なくとも１００残基一層好ましくは少なくとも２００アミノ酸残基長であり、最も好ましくは２２０アミノ酸残基である。コードされた部位は好ましくはｃｐ４５のＨＮ部位の３８４アミノ酸残基長を含み、またはｃｐ４５の３８４残基の５アミノ酸ないで機能的に類似の変異残基を含む。コードされた部位は、最も好ましくはｃｐ４５の１６０−３８５残基からのアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を含む。非弱毒化株への先祖返りの可能性は、もし、ハイブリッドウイルスのゲノムが３'リーダー領域およびＮＰ、Ｐ［＋Ｃ］およびＭタンパク質をコードする領域におけるｃｐ４５ゲノムにより密接に類似している場合には低い。従って、ＨＰＩＶ−３株以外の標的ウイルスに対するワクチンにおける使用に適している好ましいハイブリッドウイルスはその３'末端から引き続く：ｃｐ４５ウイルスゲノムの３'リーダー領域の核酸配列と同様の核酸配列；ｃｐ４５のヌクレオカプシドタンパク質［ＮＰ］をコードする核酸配列、リンタンパク質Ｐ［＋Ｃ］およびマトリクスタンパク質［Ｍ］；ＨＰＩＶ−３ウイルス以外のエンベロープ化された標的ウイルスの表面抗原、少なくとも１つの表面抗原である変異Ｌタンパク質をコードする核酸配列をコードする。上記のハイブリッドウイルスにおいて記述されているように、ＨＰＩＶ−３および非ＨＰＩＶ−３標的ウイルスに直接対する変異体Ｌタンパク質は、野生型ＨＰＩＶ−３タンパク質に最も密接に構造的に関連したタンパク質に比較したアミノ酸配列において少なくとも１つの変異を有する(すなわち、変異体が由来する野生型タンパク質または変異体タンパク質をコードする変異体遺伝子、が由来する遺伝子によってコードされた野生型タンパク質に比較して)。本明細書での目的は、ＨＰＩＶ−３Ｌタンパク質は、野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）Ｌタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。変異体Ｌタンパク質と野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）Ｌタンパク質の間の配列の同一性は、嗜好の増加のため、より好ましくは少なくとも約９５％で、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９.５％、少なくとも約９９.７％および少なくとも約９９.８％である。ＪＳ株Ｌタンパク質は２,２５８アミノ酸を有し、一般的には、最もＨＰＩＶ −３Ｌ部位があり、最もＨＰＩＶ−３Ｌタンパク質は２０００をこえるアミノ酸残基を野生型と変異タンパク質との間のアミノ酸配列の約４つのバリエーションに対応し、９９.８％の配列の同一性を示す。同様に、変異体ＨＰＩＶ−３Ｌタンパク質は標的ウイルスの野生型ポリメラーゼ部位と同様のタンパク質であるはずがなかった（標的ウイルスがＨＰＩＶ−３ウイルスまたは非ＨＰＩＶ−３ウイルスであるかにかかわらず）。従って、変異体Ｌタンパク質は、標的ウイルスのＬタンパク質（または機能的に類似なポリメラーゼタンパク質）に比較して少なくとも１つのアミノ酸配列におけるバリエーションを有する。さらに、変異Ｌタンパク質は約３７℃−４０℃からの範囲にわたる非寛容な温度で、および好ましくは約３９℃の温度で標的ウイルスに通常関連したポリメラーゼ活性より少ないＲＮＡポリメラーゼ活性を有する。変異体Ｌタンパク質のポリメラーゼ活性は、標的ウイルスのポリメラーゼ活性より少ない、少なくとも約１０％である。変異体Ｌタンパク質のポリメラーゼ活性はより好ましくは、嗜好性を増加させるために、標的ウイルスのポリメラーゼ活性より少ない１０²、１０³、１０⁴、１０⁵および１０⁶の因子である。変異体Ｌタンパク質はもっとも好ましくは変異体ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）Ｌタンパク質である。すなわち、このましい変異体Ｌタンパク質は少なくとも１つの変異をＨＰＩＶ−３（ＪＳ）のＬタンパク質に比較したアミノ酸配列において有する。変異体なる語には、アミノ酸残基内の付加、欠失または置換を意図し、該変異体は、好ましくは野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）Ｌタンパク質に関連したｃｐ４５Ｌタンパク質の置換に機能的に類似である置換である。従って、ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）に比較したアミノ酸配列における変異体は、好ましくは、９４２残基、９９２残基または１５５８残基の約（すなわち、それより多少）５つのアミノ酸残基である。とりわけ、ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）に比較したアミノ酸配列における変異には、好ましくは以下の置換の１またはそれ以上を含む：９４２残基でのTy rのかわりにHis、９９２残基でのLeuの代わりのPheおよび１５５８残基でのThr の代わりのIle。変異体Ｌタンパク質は、好ましくは、野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）タンパク質に比較してのアミノ酸配列中の少なくとも２つの変異を有する：９４２残基でのTyrのかわりにHis、９９２残基でのLeuの代わりのPhe。変異体Ｌタンパク質は、一層好ましくは、ｃｐ４５Ｌタンパク質のアミノ酸配列における全部で３つの変異体を有し、他の変異体も含むことができる。他の置換または変異は、直後に記載するものに加えて、変異体Ｌタンパク質のアミノ酸配列に存在し、変異体ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）タンパク質は、これらの列挙した置換のみを有し、ついで低減されたポリメラーゼ活性は一般的に十分である。変異体Ｌタンパク質は最も好ましくはｃｐ４５のＬタンパク質である。変異体赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質は、上記ハイブリッドウイルス中において、野生型ＨＰＩＶ−３ＨＮタンパク質に構造的に最も緊密に関連したアミノ酸配列中に少なくとも１つの変異を有するＨＮタンパク質である。変異体ＨＮタンパク質は、野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）ＨＮタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約９０％の配列の同一性を有するアミノ酸配列である。変異体ＨＮタンパク質と野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）ＨＮタンパク質の間の配列の同一性は、嗜好を増加させるために、より好ましくは、少なくとも９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％少なくとも約９９ .５％である。ＨＰＩＶ−３ＨＮタンパク質は、典型的には少なくとも約４００アミノ酸残基を含み、９９.５％の配列同一性は、野生型および変異型のタンパク質のアミノ酸配列アミノ酸配列に約２つの変異が一致している。同様に、変異体ＨＰＩＶ−３ＨＮタンパク質は野生型ノイラミニダーゼタンパク質が存在している；変異ＨＮタンパク質は、ノイラミニダーゼ野生型に比較したアミノ酸からノイラミニニダーゼタンパク質に比較して、少なくとも１つの変異体を有する（または機能的に類似のタンパク質）である。さらに、変異体ＨＮタンパク質は約３７℃〜４０℃にわたる非寛容な温度標的ウイルスに関連させ、ついで好ましくは３９℃の温度である。変異体ＨＮタンパク質のノイラミニダーゼ活性は、少なくとも約３の因子によって、より好ましくは、少なくとも約５の因子によって、さらにより好ましくは少なくとも約１０および最も好ましくは少なくとも約１５の因子によって標的ウイルスのポリメラーゼ活性より好ましくは少ない。変異体ＨＮタンパク質は、好ましくは、ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）のＨＮタンパク質に比較したアミノ酸配列における少なくとも１つの変異を有する変異体ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）ＨＮタンパク質である。変異は、付加、欠失または置換であることができるが、該変異は、好ましくは、野生型ＨＰＩＶ−３ＨＮタンパク質に比較したｃｐ４５ＨＮタンパク質の置換に機能的に類似である。従って、該置換は好ましくは、ＪＳ株タンパク質のアミノ酸残基３８４のうちの約５アミノ酸残基（すなわち、それより多少）である。変異体ＨＮタンパク質はより好ましくは、３８４残基でのValのかわりにAlaまたはその５残基内での他の機能的に同等の置換を含む。他の変異には、直後に記載するものに加えて、変異体ＨＮタンパク質のアミノ酸配列にもまた存在する；しかしながら、列挙した１つのアミノ酸置換を結ううし、低減したノイラミニダーゼ活性を付与する異体ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）ＨＮタンパク質は、一般に十分である。変異体ＨＮタンパク質は最も好ましくは、ｃｐ４５のＨＮタンパク質である。ハイブリッドウイルスのゲノムに含まれているような上記の遺伝子は、実際、発現のためには、作動可能に結合する。該遺伝子が結合した正確な配列は狭く重要ではない。さらに、多様なウイルスゲノムは、さらに多様な遺伝子間の非コーディング核酸残基を含むことができる。弱毒化されたハイブリッドウイルスに加えて、本発明のワクチンはまた、弱毒化ハイブリッドウイウのための製薬学的に適当または許容し得る担体を含む。典型的な担体には、ウイルスが増殖する組織培養液体、リン酸緩衝食塩水などの希釈剤および／またはゼラチンなどの安定化剤を含む。標的野生型ウイルスに体するヒトワクチンとしての使用に適した弱毒化ハイブリッドウイルスを産生する方法には、ｃｐ４５ゲノム中にある対応する表面糖タンパク質遺伝子のかわりにｃｐ４５ゲノムのコード標的遺伝子配列を挿入するのいん適している弱毒化ハイブリッドウイルス、低減した活性を有する変異タンパク質を有する標的ウイルス中でノイラミニダーゼタンパク質またはポリメラーゼタンパク質をコードする天然に存在する遺伝子の置換である。以下に詳細に記す方法は、例示的方法である。当業者は本方法および他の方法においての変異もまた、ハイブリッドウイルス産生に適していることを認識するでろう。それらの目的のため、分子生物学における標準的な方法は多様な公知文献に見いだされることができ、例えば、サンブルックら、モレキュラー・クローニング（MolecularC loning）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、第２版、１９８９（Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd）を含む。特に本方法は、ＨＰＩＶ−１、ＨＰＩＶ−２、ＲＳＶ、インフルエンザおよび麻疹標的ウイルスに対するするワクチンにおける使用のために弱毒化したハイブリッドウイルスを産生するために使用されることができる。ｃｐ４５が骨格として使用され、標的ウイルスからの表面抗原と組み合わせて使用されるｃｐ４５ハイブリッドウイルスを産生するため、ｃｐ４５のウイルスゲノムは最初に全長ｃＤＮＡクローンに変換される。典型的には、該ゲノムのいくつかの項となる部位が、ＰＣＲを用いて増幅され、さらなる工程で全長ｃＤＮＡクローンにライゲーションされる。標的表面糖タンパク質をコードする標的ウイルスゲノムの領域もまた、ｃＤＮＡクローンに変換される。ネガティブセンスまたはポジティブセンスを有するゲノム領域、ＨＰＩＶ−１、ＨＰＩＶ−２、ＲＳＶ、麻疹およびインフルエンザウイルスなどの一本鎖ＲＮＡゲノムはｃｐ４５と同様の方法で変換される。ＤＮＡゲノムを有するウイルスからのＤＮＡは、ＤＮＡプラスミドベクターに直接ライゲーションできる。ついで、ｃｐ４５ゲノムのｃＤＮＡクローンはプラスミドベクターに組み入れられる。ｐBluescriptII（ストラタジーン（Stratagene））または引き続くトランスフェクションおよび哺乳動物細胞中での発現に適している他の市販されて入手可能なベクターが使用されることができる。端的には、ｃＤＮＡクローンおよびプラスミドベクターは制限酵素消化およびライゲーション反応を用いて組み合わせる。ついで、組換えプラスミドはクローニングされ、精製される。遺伝的操作を行って、標的の１またはそれ以上の表面糖タンパク質をコードする標的ウイルスの遺伝子のｃＤＮＡまたはＤＮＡコピーを有するＦおよびＨＮタンパク質をコードするｃｐ４５ｃＤＮＡゲノムの領域を置換する。ついで、ネガティブセンス、一本鎖ＲＮＡハイブリッドウイルスは、逆遺伝子技術を用いた子孫ウイルスゲノム、ウイルスタンパク質およびウイルス粒子の合成のための哺乳動物細胞などの細胞に、ハイブリッドｃＤＮＡプラスミドベクターをトランスフェクションすることによって組換えウイルスゲノムから産生される（パレス（Palese）１９９５：ローソン（Lawson）ら、１９９５；シュネル（ Schnell）ら、１９９４）。端的に、ｃＤＮＡコピーを含むプラスミドベクターはバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウイルスで以前にトランスフェクションした宿主細胞にトランスフェクションする。実施例４に記載される方法により産生されたＨＰＩＶ−３、ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質を発現するプラスミドベクターを発現するプラスミドベクターは、宿主細胞に同時トランスフェクションされる。ｃＤＮＡは完全長のネガティブセンス（ゲノム）ＲＮＡを産生するよう転写される。ＮＰ、ＬおよびＰタンパク質の発現は、子孫ハイブリッドウイルスの合成を促進する。ついで、ハイブリッドビリオン（virion）は、単離され、適当な哺乳動物細胞中で増殖させられ、ついで温度感受性表現型および関連した弱毒化を査定すべく試験される。ｃｐ４５のＬおよびＨＮ遺伝子中の欠損に弱毒化したｃｐ４５損傷が相関するという観察に関連する本発明の他の実際的な応用は、ＨＰＩＶ−３ウイルスまたはｃｐ４５−ハイブリッドウイルスが弱毒化されているか否かを決定するための方法である。本明細書において使用される「ｃｐ４５−ハイブリッド」ウイルスは変異体タンパク質が上記であるような変異体Ｌタンパク質および／または変異体ＨＮタンパク質をコードする遺伝子を有するキメラウイルスをいう。そのような決定は野生型ＨＰＩＶ−３のゲノムの対応領域に関するＬタンパク質をコードするＨＰＩＶ−３ゲノムの領域に少なくとも１つの変異の存在を確認することによって行われる。別法として、ＨＮタンパク質をコードする遺伝子における欠失および特に、３８４残基の約５残基または５残基内での欠失は、低減したノイラミニダーゼ活性の指標となりうる。決定は、同様にして、ｃｐ４５ハイブリッドウイルスが弱毒化されるか否かに関して行われる。弱毒化の査定は多様な状況において必要である。例えば、研究所において、ワクチンの市販物における品質コントロールとして、調節的な作因におる査定として、および患者に投与するまたはに新規のワクチンロットにおける最終チェックとして査定は有用である。弱毒化の査定は、同様に、患者への投与後、ワクチンの安定性をチェックするのに有用である。患者からの単離物は温度感受性表現型を子孫ウイルスが保有することを確認するためにチェックする。ヌクレオチドの変異の存在を確認するための方法の多様性は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｌタンパク質をコードする核酸領域は全体をシークエンシングされ、Ｌの野生型遺伝子に比較されることができる。別法として、試験されたウイルス株はｃｐ４５またはｃｐ４５ハイブリッドウイルスであり、該Ｌ遺伝子は残基９４２、９９２および１５５８残基での期待された変異の近辺で制限酵素で切断されることができ、ついで小さな断片は野生型ＨＰＩＶ−３またはｃｐ４５のＬ遺伝子と比較してシークエンシングされることができる。より好ましい様式は、一本鎖形態において試験されているウイルス株から核酸を単離すること、変異をフランキングするプローブにウイルス核酸をハイブリダイズすること、ＰＣＲを用いてプローブ間の領域を増幅することおよび野生型ＨＰＩＶ− ３またはｃｐ４５に比較したＬ遺伝子の増幅領域をシークエンシングすることをを含むであろう。シングル・ヌクレオチド・エクステンション（singlenucleoti de extension）反応などの遺伝子のシークエンシングにおける点突然変異を決定するための別法は（クプスワミー（Kuppuswamy）ら、１９９１）また当該技術分野において公知である。本発明の捕捉アッセイは、実施例３および４に詳細に記載するが、また、Ｌ遺伝子における少なくとも１つの変異の存在を確認するために使用されることができる。本方法は遺伝子の配列の変化を確認するためならびに、同時にまた、Ｌ遺伝子におけるそのような変異の機能的な効果を確認する。そのような試験の二重の本質は、サプレッサー変異の可能性のため、シークエンシングの常法単独を越えて利点がある。端的には、ウイルスサンプル株は、新規のワクチンロットとしてかまたは精製した患者の単離物として得られる。もし必要ならば、サンプルは細胞培養培地中で増殖させることによって増幅される。標準的、最初のプラークアッセイがコントロールとして非寛容温度（約４０℃）でインキュベートすることによっておよび複製を測定することによって行われる。ついで捕捉アッセイは、宿主細胞が野生型ＨＰＩＶ−３Ｌタンパク質を発現するプラスミドベクターでトランスフェクションし、ウイルスサンプルで感染させる（実施例３および４参照）。野生型ＮＰおよび／またはＰタンパク質を発現するプラスミドベクターは宿主細胞中で同時トランスフェクションすることができる。第２のプラークアッセイ捕捉されたウイルスサンプルに関して行われ、結果は第１のプラークアッセイの結果と比較される。サンプルウイルスＬ遺伝子における変異は有意な増加によって指示されるであろうし、プラークアッセイにおいて測定されるように、非捕捉サンプルに比較される捕捉ウイルスサンプルの複製において、好ましくは少なくとも１０倍の増加であり、ついで最も好ましくは１００倍の増加である。同様のやり方で、ノイラミニダーゼ増殖実験および活性アッセイはＨＮ遺伝子における欠失の存在を確認するために、外在性のノイラミニダーゼの不在および存在下で行われることができる。以下の非制限的な実施例は本発明の主義および利点を解説する。実施例以下の実施例において使用されるように、ｃｐ４５は野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ株）から由来し、熱病性呼吸器疾患を有する子供から、もともとが培養された単利物であった。寒冷適応変異を２０℃で４５回のウイルス連続継代後に選択され、プラーク精製によって単離された（バルシェおよびヒッソム１９８２）。ｃｐ４５ウイルスは、持続的な細胞株において３２℃で引き続き増殖された。競合アッセイを使用し、以下で議論する実験の各々において、アッセイ中に存在する最初のウイルスの量を、赤血球凝集素アッセイ分析を用いて決定した。端的には、ｃｐ４５ウイルスで感染させ、３２℃で７２時間増殖させたＬ−１３２細胞を細胞スクレイパーを用いて培養皿から除去した。ペレッティングした細胞をＰＢＳで洗浄し、超音波処理し、ついで赤血球凝集素の分析のために使用された。超音波処理したウイルス感染細胞の連続２倍希釈を９６ウエルＶ底マイクロタイタープレートを１００μｌＰＢＳ(Ｃａ⁺²およびＭｇ⁺²なし)で行った。ついで１００μｌのモルモット赤血球の０.５％懸濁液を各ウエルに加え、ついでそのプレートを４℃で２時間、底が透明になるまでインキュベートし、ＨＡはそれぞれネガティブおよびポジティブコントロールである。実施例１：ｃｐ４５の温度依存性複製、タンパク質合成およびｍＲＮＡ合成野生型ＨＰＩＶ−３株とは異なり、ｃｐ４５株はその複製能力を非寛容のより高い温度（約３７℃より高い）で複製能力を失う。この複製活性の損失は、ｃｐ４５ワクチンにおいて観察された弱毒化に貢献する。さらに、ウイルウ特異的ｍＲＮＡ合成およびタンパク質合成における関連した減少は野生型株に関連したｃｐ４５株において存在する。ｃｐ４５ウイルスを３２℃で１時間細胞培養培地に吸収させ、ついで３９. ５℃で２４時間増殖させる。ついで感染した細胞を増殖のため３２℃に移動させ、２４時間おく。培養上清におけるウイルス力価をＬ−１３２細胞におけるプラークアッセイによって決定された。感染した細胞単層はヘマトキシリン−エオジンＹ染色するかまたはウイルスプラークの可視化のため０.９％アガーおよび０. ００５％ニュートラルレッドで覆う。少なくとも３つの独立した実験からの結果はウイルスの回収（５倍の変異より少ない）に一致を示した。温度シフトアッセイにおける寛容（３２℃）および非寛容（３９.５℃）でのＬ−１３２細胞におけるｃｐ４５および野生型（ＪＳ）ウイルス複製の比較は表１に示す。両ウイルスの正常の増殖は、寛容温度で観察された。しかしながら、ｃｐ４５の乏しい複製（〜１０⁶倍の減少）は、該ウイルスが３９.５℃でＬ−１３２細胞に吸着され、同温度でインキュベートされる場合に観察された。しかしながら、該ウイルスは、２４時間後３９.５から３２℃のインキュベーション温度を変えるといくつかの複製を示した。他方、野生型ウイルスは３９.５℃および３２℃での同様の複製を示した。３９.５から３２℃への温度の移動で複製されたｃｐ４５ウイルスは、特徴的な温度感受性表現型を示し、３９.５から３２ ℃で先祖返りした（revertant）ウイルスの不在を示す。ｃｐ４５株内に存在するウイルス特異的ＲＡ合成は、同様に、野生型株におけるそのような合成より有意に低い。従って、低レベルのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が非寛容で産生される。非寛容温度での全体のウイルス転写活性を決定するため、ｃｐ４５ウイウイルスのＰタンパク質遺伝子からのｍＲＮＡ合成は、逆転写ＰＣＲによって実験される。野生型ウイルスと比較することによって試験する。端的には、Ｌ−１３２細胞を感染の同様の多重度でｃｐ４５または野生型ウイルスに感染させる。３２℃でのウイルス吸着後は細胞を３９.５℃で２４時間増殖させる。感染した細胞をアクチノマイシンＤ（１０μｇ／ｍｌ）で１４時間処理し、グアニジン酸チオシアネートフェノールクロロホルム抽出によって調製された。ＰｍＲＮＡの増幅は、同量の総ＲＮＡ（１０μｇ）およびウイルス特異的センス（ CCAACAACAACTCCCAGATC 、ヌクレオチド位置２７４０から２７５９）およびアンチセンス（ TGCCTCCATAAGTGGGTCAA 、ヌクレオチド位置３２８０から３２９９）合成オリゴヌクレオチドプライマーから逆転写ＰＣＲによって行われた。増幅反応は、サイクルパラメーターが、９４ ℃で１分変性させ、５０℃で１.５分でプライマーアニーリングし、ついで７２ ℃で２分間プライマーエクステンションする自動化サーモサイクラー（パーキン −エルマー・セタス（Perkin-Elmer Cetus）によって行われた。内部の標準として、アクチンｍＲＮＡの増幅が同様のＲＮＡ調製物を用いて逆転写ＰＣＲの使用により行ゎれ、βアクチン遺伝子特異的センス（GCATGGAGTCCTGTGGCATCCACGヌクレオチド位置２５６３から２５８６）およびアンチセンス（CTAGAAGCATTTG CGG TGGACGAT、ヌクレオチド位置２９７７から３０００）合成オリゴヌクレオチドプライマーから逆転写ＰＣＲによって行われた。ＨＰＩＶ−３のＰタンパク質遺伝子を含むプラスミドＤＮＡは、マーク・エス・ガリンスキ（Mark Ｓ．Galinski ）(ザ・クリーブランド・クリニック・ファウンデーション（TheCleaveland Cli nic Foundation）、クリーブランド、オハイオ)によって親切に提供されたが、ＰＣＲ増幅においてポジティブコントロールとして使用された。Ｐタンパク質遺伝子プラスミドＤＮＡからのＰＣＲ増幅された〜５５９bp断片を０.８％アガロースゲル中での電気泳動によって単離した。そのＤＮＡバンドを切り出し、無紫外線ＭＣカラム（ミリポア・コーポレーション（MilliporeCorporation）、ベッドフォード（Bedford）、マサチューセッツ）を用いて溶出し、ついで市販されており入手可能なキット(ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Boehr inger Mannheim Biochemicals）、インディアナポリス、インディアナ)を用いてプローブとしての使用のために、ランダムプライマーオリゴヌクレオチド標識法を使用して、［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰで放射線標識した。アクチンプローブはサザン・ハイブリダイゼーションにおける使用のために同様に調製された。ｍＲＮＡ合成は類似の実験において、２つのＲＮＡ調製物の間のメッセージのレベルを比較することによって試験された。ＰＣＲ増幅の異なるサイクルからの反応産物をアガロースゲル電気泳動、続いて、エチジウムブロマイド染色による分析の後、ｃｐ４５および野生型ウイルスから産生されたメッセージのレベルにおける有意な変化を示す。他方、アクチン遺伝子の類似のメッセージレベルは、ｃｐ４５および野生型ウイルス感染細胞からのＲＮＡ単離物に関して観察された。類似の監査が、電気泳動されたＤＮＡのサザンハイブリダイゼーションの後に気づかれた。ウイルスｍＲＮＡからのＰＣＲ産物の典型的な増幅プロファイルは図２Ａに示している。半定量的なアプローチは１つのｃＤＮＡサンプルの４倍の希釈をするスロットブロットハイブリダイゼーションによってこれらのメッセージ間の差異の推定のために取られた。結果の代表例は、図２Ｂに示しているが、さらに、ＰＣＲ増幅の１５および２０サイクルでｃｐ４５からのＰ遺伝子および野生型ウイルス感染細胞のメッセージにおける差異を示す。ｃｐ４５ウイルスのＰタンパク質遺伝子からのメッセージを、ホスホルイメージング（PhosphorImagin g）分析によって野性型のメッセージの約１７％に推定される。一層高温の非寛容温度でのタンパク質合成はまた、野生型株に比較してｃｐ４５株における有意に低いものである。ｃｐ４５ウイルスポリペプチド合成をパルスチェイス実験によって分析した後、ＨＰＩＶ−３に対する超免疫ウサギ抗血清、またはＨＮおよびＮＰに対するモノクローナル抗体で免疫沈降する。端的には、ウイルス感染細胞を３９.５または３２℃で２４時間増殖させ、³⁵ −Ｓタンパク質標識（アマシャム・コーポレーション（Amersham Corporation）、アーリントン・ハイツ、イリノイ）で１時間パルスした。標識した細胞溶解物を、ＨＰＩＶ−３に対する超免疫ウサギ抗血清で、または抗−ＨＮおよび抗−ＮＰモノクローナル抗体で０、１、２、３および４時間後にチェイスした。免疫沈降は、ドデシルサルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動後オートラジオグラフィーにかけた。その結果は、野生型およびｃｐ４５ウイルスの間のウイルス間の主要な差異を示している。パルス時期の間に野生型ウイルスポリペプチドの合成は、４−ｈチェイス時期（図３）の間にさらに進まないかまたは修飾されるかであった。他方、ｃｐ４５ウイルスポリペプチド合成は非常に弱いかまたはほとんど検出不可能であるようであった。しかしながら、ｃｐ４５および野生型ウイルスポリペプチドの合成は、細胞が３２℃で増殖する場合には同様であるとわかった。実施例２：ｃｐ４５の温度依存性のノイラミニダーゼ活性ｃｐ４５ウイルスは３２または３９.５℃でＬ−１３２細胞上で増殖し、ついで、ウイルス感染細胞ホモジネートをノイラミニダーゼ活性に関して分析した。ｃｐ４５株は非寛容な、より高温での低減したノイラミニダーゼ活性を示した。活性におけるそのような低減は感染した細胞の表面からの子孫ウイルス粒子の放出を抑制する。端的には、１００μｌの０.２Ｍの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５.５）を赤血球凝集素活性単位の公知の数とともに等量の感染細胞ホモジネートを混合する。ついで、０.１ｍｌのウシフェチュイン（１５ｍｇ／ｍｌ、４型；シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Company）、セントルイス、ミズーリ）を同バッファーに溶かし、反応混合物に加え、ついでその混合物を３７℃で一夜インキュベートした。反応混合物中の放出されたノイラミン酸の量を決定する。野生型親ウイルス反応また、比較のため本実験に含む。２つの異なる分子の大きさの基質で試験する場合、非寛容温度でインキュベートされたそのｃｐ４５ウイルスのノイラミニダーゼ特性は、約４から約１０の間の範囲の因子によって野生型ウイルスでの感染した細胞より（表３）、低活性を示した。実施例３：ｃｐ４５の他の生物学的な特性の確認ｃｐ４５の抗原関連性および野生型親ウイルス株は、最初はアフィニティー精製したＨＰＩＶ−３ＨＮ糖タンパク質を用いた赤血球凝集素（ＨＡ）抑制および中和アッセイによってモノ特異的ウサギ抗血清を用いて比較された。ウサギ抗ＨＮは類似のＨＡ抑制活性および中和力価（２倍の変異）をウイルス株の両方で示した。引き続き、ＨＮおよびＦ糖タンパク質の顕著な抗原部位を認識しておる代表的な抗−ＨＮおよび抗−Ｆモノクローナル抗体が酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＺＡ)で試験した。ダイナテク・ポリビニル・プレート（Dynatech polyvinylp lates）（イムロンＩ(Immulon Ｉ)）を１ウエルあたり凍結乾燥崩壊ビリオン（f reeze-thaw disrupted virions）１μｇでコートしている。モノクオーナル抗体を２倍の連続希釈で各ウイルス株（ｃｐ４５および野生型）を希釈し、ついでその結果は、反応性パターンの線形スロープで比較している。その結果は、０.０５〜０.０８内に変異を示す３つの独立した実験から平均的吸光度として提示された（図４）。ｃｐ４５ウイルスのＨＮおよびＦ糖タンパク質を認識した抗体は野生型ウイルスのものに類似の力価を示した。ｃｐ４５ウイルスの抗原部位が野生型ウイルスのもの示唆されている。これは、ｃｐ４５ウイルスの抗原部位を２０℃で増殖に適応した結果としてかわってない。さらに、ｃｐ４５ウイルス糖タンパク質は非寛容温度でさえ、細胞の表面である細胞にプロセシングし、輸送する。感染したＬ−１３２細胞はＨＮおよびＦに特異的なモノクローナル抗体での免疫蛍光による感染後に２４時間後試験した。Ｌ−１３２細胞のコンフルエント単層をカバースリップ上で増殖させ、ウイルスに感染させ、３２または３９.５℃でインキュベートした。感染２４時間後、細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、モノクローナル抗体で試験した。両方のインキュベーターの温度（３２または３９.５℃）で、ｃｐ４５感染細胞が細胞表面上で免疫蛍光を示したＨＡおよび融合活性もまた調査された。３２℃で増殖させたウイルスｃｐ４５ウイルスは超遠心によってペレッティグされＨＮ糖タンパク質の機能的な特性を試験するためにＨＡアッセイを行った。ｃｐ４５ウイルスが３９.５℃の非常に乏しい増殖を示した場合、本発明者らは、非寛容の温度で感染細胞のホモジネートのＨＡ活性をインキュベーションの後で決定した。結果は、寛容または非寛容温度増殖したｃｐ４５ウイルスノ検出可能なＨＡ活性を示した。ｃｐ４５ウイルス感染ＬＬＣ−ＭＫ₂、ベロおよびＬ−１３２細胞はまた、３２℃で増殖した場合、多核巨細胞の形成または合胞体の形成、ウイルス融合活性の特徴を示した。しかしながら、融合活性は３９.５℃でｃｐ４５ウイルス感染細胞のインキュベーションに関して有意に減少し、おそらくそれは非寛容温度でのウイルスの複製の乏しさによる。実施例４：ＨＰＩＶ−３ＮＰ、Ｐおよびアイルドタイプタンパク質ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）株の野生型ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質は、同時発現アッセイにおける使用のため発現された。ＨＰＩＶ−３ＮＰ、ＰおよびＬ遺伝子の分子クローニングおよび配列分析は以前に記載した（ガリンスキら１９８８；ガリンスキら１９８６；ガリンスキら１９８６'）。端的には、すべての遺伝子をその制限エンドヌクレアーゼ消化によってその組換えベクターから除去し、ｐｃＤＬ−ＳＲβ８.２べクターＤＮＡの適当な部位にライゲーションした。このベクターは、ｐｃＤＬ−ＳＲα−２９６由来であり、ＳＲαプロモーターから下流のＴ７およびＳＰ６プロモーター配列をフランキングしたポリバレント制限部位を含む。ｐｃＤＬ−ＳＲβ８.２は多機能性ベクターであり、遺伝子発現は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーターを使用するか、または別法としてＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスを用いることによって、駆り立てられることができる。ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質をコードする核酸領域を含むプラスミドはＤＮＡベクターに含まれる。プラスミドｐＳＰ１８−ＮＰは、ＮＰ遺伝子を含み、Sph Ｉで最初に消化し、ついで得られた相補末端をＴ７ＤＮＡポリメラーゼで修復した。ついでその遺伝子をベクターからBamH Ｉで放出し、ついでEcoR Ｉで消化したｐｃＤＬ−ＳＲβ８.２にライゲーションし、引き続いてクレノウフラグメントで修復し、ついでさらに、BamH Ｉで処理した。Ｐ遺伝子を含むプラスミドｐＳＰ１９−ＰはBamH Ｉで消化し、ついでＰ遺伝子を放出すべくPvuI Ｉで消化した。その遺伝子を引き続き、Xba Ｉで消化したｐｃＤＬ−ＳＲβ８.２にライゲーションし、引き続いてクレノウフラグメントで修復し、ついでさらに、BamHＩで処理した。Ｌ遺伝子を含むプラスミドｐＧＥＭ３−Ｌは、最初にHindIIIで消化し、ついで得られた相補末端をクレノウフラグメントで修復した。ついでそのＬ遺伝子をベクターからSac Ｉで放出し、ついでEcoR Ｉで消化したｐｃＤＬ−ＳＲ β８.２にライゲーションし、引き続いてクレノウフラグメントで修復し、ついでさらに、SacＩで処理した。すべてのライゲーション反応はインサートのライゲーションをＳＲαおよびＴ７プロモーターに比較して所望の報告に挿入させるであろう可変末端を有するベクターおよび遺伝子断片を含む。組換えクローンはランダムに取り上げられ、さらに制限エンドヌクレアーゼ消化により、サブクローニングの報告と有効性の確認によってさらに分析する。その遺伝子末端は、ダイデオキシ配列分析（米国バイオケミカル（Ｕ.Ｓ.Biochemical、クリーブランド、オハイオ）によって確認され、メチオニンでの開始と終結コドンが維持されていることを確認した。多様なヌクレオカプシド関連タンパク質の生物学的特性を試験するために、本発明者らは最初に、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子（ｖＴＦ７−３）を含む組換えワクシニアウイルスを用いて一時的な発現システム内でのＬ（Ｌ−１１）、Ｐ（Ｐ−１）および（ＮＰ−１）のタンパク質発現に関して試験した。HeLa-Ｔ４細胞は、相対的にワクシニアウイルスの細胞変性効果に比較的耐性があるが、ｖＴＦ７−３で感染させ、ついでリポフェクタミン（ベツダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Bethesda Research Laboratories）。ゲイザーアウバーグ、メリーランド）を用いて、ＨＰＩＶ−３Ｌ、ＰおよびＮＰタンパク質の発現をＨＰＩＶ−３に対する超免疫ウサギ抗血清またはＮＰに対するモノオーナル抗体ＮＰ（図５Ａ）で免疫沈降することによってトランスフェクションした［³⁵ Ｓ］メチオニン−［３^5S］システイン標識した細胞溶解物中で２０時間後に検出された。免疫沈降はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分析され、ついでオートラジオグラフィーにかけた。大分子ラージＬタンパク質の一層の分解を得るため、免疫沈降はまた、低パーセンテージのポリアクリルアミドゲル（図５Ｂ）もまた、分離される。対応するＤＮＡトランスフェクションした細胞からのＬＰおよびＮＰポリペプチドは伝統的なウイルスタンパク質からの大きさは区別がつかない。Ｌタンパク質の量は、トランスフェクションした細胞溶解物からの抗血清によって免疫沈降したＰ、ＮＰより低い。実施例５：野生型タンパク質でのｃｐ４５の捕捉本実施例は、一時的にＬ、ＰまたはＮＰタンパク質を発現するＣＶ−１細胞が非寛容温度にてｃｐ４５を救出（すなわち、プラークアッセイによって測定されたように、ウイルスの複製を増加する）することができるか否かを考える。端的には、ＣＶ−１細胞をプラスミドベクターｐＲＳＶ−Ｔ（ラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列によって駆り立てられるＳＶ４０大Ｔ抗原をコードする）で同時トランスフェクションし、ＮＰ、Ｐ、またはＬ遺伝子を含む１またはそれ以上の組換えプラスミドで同時トランスフェクションし、ついで３７℃でインキュベートした。トランスフェクション２０時間後、発現細胞をＣＰ４５または野生型ウイルスで１の感染の多重度で感染させ、ついで感染細胞をさらに３９.５℃で２８時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞培養培地を回収し、ついでＨＰＩＶ−３力価を寛容（３２℃）および非寛容（３９.５℃）の温度でＬ−１３２細胞にてプラークアッセイによって決定した。感染細胞の単層をヘマトキシリンおよびエオジン−Ｙで染色するか、またはウイルスプラークの可視化のために０.９％アガーおよび０.００５％のニュートラルレッドで覆った。ワクシニアウイルス系は優れた発現レベルを提供するが、細胞の単層において細胞変性の拡大効果を引き起こすウイルスベクターの使用およびワクシニアウイルスの同時感染実験におけるＨＰＩＶ−３複製を測定することに由来する困難に関する配慮のため、本発明者らは、プラスミドベクターの転写を駆り立てるためのワクシニアウイルスの使用に必要ではない発現系を使用した。ベクターｐｃＤＬ−ＳＲβ８.２はＳＲαと名付けられたプロモーターを含み、ＳＶ４０初期プロモーター及びＲセグメントおよびヒトＴ−細胞白血病ウイルスの長い末端繰り返し配列のＵ５配列（Ｒ−Ｕ５’）の一部からなる。そのベクターはまた、ＳＶ４０複製起点およびＣＯＳ−１またはＣＯＳ７細胞におけるタンパク質発現の有意なレベルを提供し、そのプラスミドはＴ抗原の内在的なレベルによって増幅される。本発現系の利用は他のプラスミドベクターｐＲＳＶ−Ｔ（３５）（ジェームズ・パイパス（James Pipas）、ピッツバーグ大学、のご厚意により提供された）からラージＴ抗原のtrans中に同時発現することによって、ＣＶ−１細胞に拡張された。トランスフェクションされたＣＶ−１細胞を最初に免疫蛍光によってウイルスタンパク質の細胞内発現に関して試験した。端的には、細胞をアセトン−メタノール（１：１）中で−２０℃で１０分間固定した。ＨＰＩＶ−３（陰性トランスフェクション細胞で前もって完全に吸着させた）超免疫ウサギ抗血清を一次抗体として使用し、ついでフルオレセインイソチオシアネート（fluoresceinisothio cyanate）付加したマウス抗ウサギ免疫グロブリンＧを二次抗体として使用した。細胞をエピフルオレセンス（epifluorescence）を備えたニコン（Nikon）顕微鏡上で倍率６００倍で試験し、ついでコンピューター・イメージング・システム（オンカー・イメージ・システムズ・インク（Oncor ImageSyste ms，Inc.）を用いてデジタル写真をとらえた。図６に示すように、ＬおよびＰは小さな含有物を形成するようであるが、ＮＰは一層均一な、正確な染色パターンを与えるようである。ネガティブコントロール細胞は検出可能な蛍光は全く示さなかった。典型的な捕捉実験の結果は、表２に示す；同様の結果が３回行われたアッセイにおいて達成された。３９.５℃で産生されたウイルスは、非寛容温度でｃｐ４５の有意なレベルを示した。これらの結果は、野生型Ｌタンパク質は生物学的に機能的であり、ｃｐ４５Ｌタンパク質の温度感受性変異を補うことが可能であるが、Ｌの不在下ではＰおよびＮＰの発現は非機能的である。ウイルス力価は、３Ｘ１０６細胞中約９５０および１１，５００ＰＦＵの補体効率を示す。Ｌ、ＰおよびＮＰでトランスフェクションした細胞は、Ｌ単独またはＬおよびＰでトランスフェクションした細胞と比較したｃｐ４５ウイルス算せ位において１０倍の増加を示す。これは、効率よいウイルスの複製のためのヌクレオカプシド複合体の形成のためのこれらのタンパク質の中での相互作用のためである可能性がある。しかしながら、ウイルスの複製の間、それらの特異的な相互作用は決定されるべきものとしてなお決定すべきである。本実施例の結果はさらに、転写に不可欠であるＲＮＡ−依存ＲＮＡポリメラーゼ活性としてのＬタンパク質の役割およびＨＰＩＶ−３のライフサイクルをさらに支持するものである。Ｌ遺伝子でトランスフェクションしていない他の細胞株は検出可能なウイルス力価を産生することができなかった。実施例６：ＨＰＩＶ−１Ｌタンパク質のｃｐ４５を補う能力およびｃｐ４５子孫における温度感受性表現型の保有非寛容温度にて、Ｌ−遺伝子トランスフェクションＣＶ−１細胞から産生されたｃｐ４５ウイルスは、Ｌ−発現細胞において複製する能力にもかかわらず、細胞増殖のための温度感受性を保有すべきである。救出された子孫ウイルスの少なくとも１０プラーク精製したウイルストックを試験し、全てのウイルスストックを温度感受性子孫を維持していることを認めた。さらに、補体ｃｐ４５のＬ−タンパク質は異種型排他的（heterrotypicexclus ive）である。Ｌ−１３２または第１代アカゲザル腎臓細胞は、ＨＰＩＶ−１及びｃｐ４５で同時感染させた場合、非寛容温度でのｃｐ４５の増殖を救出しなかった。実施例７：外在性ノイラミニダーゼ有りまたは無しでのｃｐ４５およびＨＰＩＶ −３（ＪＳ）のためのプラークアッセイｃｐ４５および野生型（ＪＳ）ウイルスの増殖特徴は外在性のノイラミニダーゼ有りまたは無しで決定された。ｃｐ４５および別々の実験において、ＪＳウイルスはＬ−１３２細胞に吸着させられる３２℃で１時間吸着させられ、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃ.perfrngens）から単離された細菌性ノイラミニダーゼの付加有りか無しかで、指示された時間枠の間、培養培地中で増殖させた。培養上清中のウイルス力価を以前に記載したようにＬ−１３２細胞でプラークアッセイした（ベルシュおよびヒッソム、１９８２）。感染細胞単層をヘマトキシリンおよびエオジン−Ｙで染色するか、またはウイルスプラークの可視化のために０.９％アガーおよび０.００５％のニュートラルレッドで覆った。各アッセイを３回繰り返した。その結果をｃｐ４５に関しては図７ＡおよびＪＳ株に関しては図７Ｂに３回の独立したアッセイの標準偏差を示すエラーバーと共に示す。図７Ａは外在性ノイラミニダーゼなしの培養培地中で約５０時間インキュベーションした後のｃｐ４５ウイルス力価が、外在性ノイラミニダーゼを服務培養培地中でインキュベーションした後の対応する力価より５−１５倍低かったことを示す。図７Ｂには、対照的に、野生型ＪＳウイルス力価が培養培地中外在性ノイラミニダーゼが存在するか否かにかかわらず、約２５時間後には実質的に同一であったことを示す。実施例８：ｃｐ４５の局在化した融合活性および外在性ノイラミニダーゼによるその抑制Ｌ−１３２細胞をｃｐ４５と低い感染多重度で感染させ、ウイルスの細胞変性効果を査定するためにノイラミニダーゼ有りまたは無しで増殖させた。ＨＰＩＶ −３（ＪＳ）株を用いた類似の実験を比較実験として行った。細胞を０.１の感染多重度（moi）で感染させた。ウイルス感染の低い感染多重度を使用して、少数の細胞を初期に感染させ、それによって外在性ノイラミニダーゼが不在である培養液中で、３２℃で３６時間インキュベーションする間、細胞単層での細胞変性の性質をモニターすることができた。別の実験において、感染細胞を１ml当たり５０μg（０.５Ｕ）の細菌性ノイラミニダーゼを服務培養培地中でインキュベーションした。その結果を図８Ａから図８Ｄに示す。図８Ａおよび図８Ｂはそれぞれ外在性ノイラミニダーゼが不在である培養液中で増殖させた後のｃｐ４５、およびＨＰＩＶ−３（ＪＳ）で感染させた細胞の写真である。ｃｐ４５感染細胞は、多核性巨大細胞または多核成の存在によって示唆されるように、有意な限局した融合を示す（図８Ａ）。そのような限局した融合は、ＪＳ株感染細胞において観察されなかった（図８Ｂ）。図８Ｃおよび図８Ｄはそれぞれ外在性ノイラミニダーゼの存在下の培養液中で増殖させた後のｃｐ４５およびＨＰＩＶ−３（ＪＳ）で感染させた細胞の写真である。ｃｐ４５感染細胞に関しての限局した細胞融合の程度は有意に低減し（図８Ｃ）、ＪＳ株感染細胞において観察されたものに類似の細胞変性効果を示した（図８Ｄ）。実施例９：ｃｐ４５感染細胞におけるノイラミニダーゼの限定された分布を示す免疫蛍光染色３３℃でｃｐ４５で感染したＬ−１３２細胞における変異ＨＮタンパク質の分布を表面免疫蛍光技術を用いて調査した。端的には、カバースリップ上のＬ−１３２細胞を０.０１の感染多重度でｃｐ４５またはＪＳウイルスで感染させた。ウイルスの吸着後、細胞を培養培地中で外在性ノイラミニダーゼ有りまたはなしで３３℃で３６時間インキュベーションした。感染細胞を洗浄し、ついでＨＰＩＶ−３のＨＮ糖タンパク質に対するモノクローナル抗体（１３−９−６−２）と表面免疫蛍光に関して反応させた。その結果を図９Ａから図９Ｄに示す。図９Ａおよび図９Ｂは、それぞれ外在性ノイラミニダーゼが不在である培養液中で増殖させた後のｃｐ４５およびＨＰＩＶ−３（ＪＳ）で感染させた細胞の写真である。変異ＨＮタンパク質の分布は、野生型ＪＳＨＮタンパク質の分布（図９Ｂ）に比較して、実質的に限局されていた（図９Ａ）。図９Ｃおよび図９Ｄはそれぞれ、外在性ノイラミニダーゼの存在下の培養液中で増殖させた後のｃｐ４５およびＨＰＩＶ−３（ＪＳ）で感染させた細胞の写真である。これらの条件下でｐ４５で感染した変異ＨＮタンパク質の分布は（図９Ｃ）ＪＳ−株感染細胞における野生型ＨＮタンパク質の分布（図９Ｄ）と類似であった。実施例１０：ノイラミニダーゼ活性アッセイ：最適ｐＨおよび力動学的試験ｃｐ４５ウイルスで感染させ、３２℃で７２時間増殖させたＬ−１３２細胞を細胞スクレイパーを用いて細胞培養皿から除去した。ペレッティングした細胞をＰＢＳで洗浄し、超音波処理し、ついでノイラミニダーゼ活性の分析に使用した。ノイラミニダーゼ活性を公知のｐＨの０.５Ｍリン酸バッファー５０μlと、等量の公知の赤血球凝集素の単位の感染細胞ホモジネートを混合することによって決定した。水に溶かした異なる大きさの基質、フェチュイン(ＩＶ型)(１５mg/ml )、３’−Ｎ−アセチルノイラミン−ラクトース（１mg/ml）または６’−Ｎ−アセチル−ノイラミン−ラクトース（１mg/ml）（シグマ・ケミカル・カンパニー（Sigma Chemical Company）、セントルイス、ミズーリ）を反応混合物に加え、３７℃で一夜インキュベーションした。別個の実験の間、多様な値でのインキュベーションの間、ｐＨをコントロールした。反応混合液中に放出されたノイラミン酸を分光光度技術で決定した。ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）感染細胞をｃｐ４５感染細胞と同様のやり方で、類似活性分析を比較のために行った。１つのセットの実験において、ｃｐ４５ノイラミニダーゼ活性の最適pHを分析し、ついで親ＪＳ株のものと比較した。図１０Ａは非寛容温度（３９.５℃）のフェチュインまたはノイラミンラクトースアッセイを用いて試験した場合のｐＨでのｃｐ４５ウイルスのノイラミニダーゼの活性位おける変異を示している。ｃｐ４５に関して、ノイラミンラクトースアッセイが使用される場合には、最適なｐＨは約５.５であった（図１０Ａ−塗りつぶした円）が、フェチュインアッセイが使用される場合には（図１０Ａ−中抜き円）、低かった（約４.９）。図１０Ｂは類似実験におけるｐＨでのＨＰＩＶ−３（ＪＳ）ウイルスのノイラミニダーゼ活性における変化を示す。ＪＳ株に関して、ノイラミニダーゼアッセイが使用される場合には、ｃｐ４５と同様に最適なｐＨは約５.５であった（図１０Ｂ−塗りつぶした円）。しかしながら、ＪＳ株に関しての最適なｐＨを決定するためにフェチュインアッセイが使用される場合には（図１０Ｂ−中抜き円）、最適なｐＨは高かった（約６.３）。図１０Ａまたは図１０Ｂを参照すると、異なるアッセイ基質によって決定されたノイラミニダーゼの絶対値の比較は、それぞれのアッセイにおいて存在するウイルスの初期値によって影響され得るようである基質の各々に関して報告された絶対値であるので、特には有意的ではない。図１０Ａおよび図１０Ｂ上のバーは３つの別々の実験試行からの標準偏差を示唆している。別のセットの実験において、酵素力学的試験が低分子量ノイラミンラクトース基質の２つの異なる結合：２→３および２→６でのインキュベーションの最初の段階で行われた。ｐＨは５.５に維持された−−ｃｐ４５および野生型ＪＳ株の両者のノイラミンラクトース基質に関しての酵素的な最適ｐＨである。図１１Ａはｃｐ４５および野生型ＪＳ株が類似の２→３結合への嗜好性を有していることを示している。図１１Ｂはｃｐ４５が野生型ＪＳ株に比較して２→６結合への嗜好を有することを示している。図１１Ａと図１１Ｂの比較は、ｃｐ４５が２→６結合への嗜好より２→３結合への嗜好を一層有することを示している。実施例１１：ｃｐ４５およびＨＰＩＶ−３（ＪＳ）抗原部位の比較に関するノイラミニダーゼ感染アッセイｃｐ４５のノイラミニダーゼ活性部位およびそのウイルスの親ＪＳ株の抗原結合性をノイダミニダーゼ抑制抗体を用いて比較した。アフィニティー精製したＨＰＩＶ−３のＨＮ糖タンパク質に対する一つに特異的なウサギ抗血清およびＨＮ糖タンパク質２−１４−１、１３−９−６−２および１７０／８に対するモノクローナル抗体をノイラミニダーゼ抑制アッセイに使用した。これらの抗体は、プロトタイプＨＰＩＶ−３（４７８８５）株のノイラミニダーゼ活性部位を認識すると知られている。その抗体を核ウイルス株に関して、２倍の連続希釈で試験し、ついでその結果を反応パターンの線形勾配で比較した。ウイルスのＨＡを排他的に抑制するMab３−８−１をネガティブコントロールとして使用したが、ノイラミニダーゼ活性の抑制的役割を示さなかった（データ示さず）。図１２Ａは、ｃｐ４５とＨＰＩＶ−３（ＪＳ）の間の抗原部位における有意な差異が、アッセイの基質としてフェチュインが使用された場合のｃｐ４５とＪＳの間の任意の抑制抗体または抗血清のいずれに関しても全く観察されなかったことを示す。図１２Ｂは、ｃｐ４５株のノイラミニダーゼ活性が、アッセイ基質として、相対的に小さなノイラミンラクトース基質が使用された場合にモノクローナル抗体１２−９ −６−２および１７０／８によってＪＳ基質の活性より、抑制が少ないことを示している。しかしながら、２つの株の抑制の程度は、モノクローナル抗体２−１４−１およびモノ特異的なウサギ抗血清に関してのと類似である。本発明の詳細な記載および上記実施例に照らし合わせて、本発明のいくつかの目的が達成されることが認めれられ得る。本明細書に記された説明および例示は他の当業者に、その原理および実際的な応用を知らしめることを意図している。当業者波、本発明を実際の使用の必要性に最も適するように、多数の形態に本発明を適応および応用することができる。したがって、提示された本発明の具体的な態様は、本発明を余すところ無く、または制限的にすることを意図したものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/16 Ａ６１Ｋ 31/00 ６３１ＬＡ６１Ｋ 39/12 39/12 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．ゲノムが（i）ｃｐ４５ウイルスゲノムの３'リーダー領域の核酸配列と同一である核酸配列；（ii）ｃｐ４５のヌクレオカプシドタンパク質［ＮＰ］をコードする核酸配列；（iii）ｃｐ４５のリンタンパク質Ｐ［＋Ｃ］をコードする核酸配列；（iv）ｃｐ４５のマトリクスタンパク質［Ｍ］をコードする核酸配列；（v）エンベロープ化された、ネガティブセンス、一本鎖ＲＮＡ標的ウイルスの各表面抗原、ｃｐ４５の表面抗原と異なる各表面抗原をコードする核酸配列；および（vi）ｃｐ４５のラージタンパク質Ｌをコードする核酸配列を含むエンベロープ化された、ネガティブセンス、一本鎖キメラＲＮＡゲノムを含むハイブリッドウイルス。２．（i）野生型ＨＰＩＶ−３標的ウイルスの３'リーダー領域の核酸配列と同一である核酸配列または標的ウイルスのマトリクスタンパク質Ｍ、標的ウイルスの融合タンパク質Ｆ、標的ウイルスの赤血球凝集素ノイラミニダーゼタンパク質ＨＮより成る群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸配列、および（ii）ｃｐ４５のタンパク質Ｌをコードする核酸配列を含むゲノムを有するエンベロープ化された、ネガティブセンスの、一本鎖ＲＮＡハイブリッドウイルス。３．（i）野生型ＨＰＩＶ−３標的ウイルスの３'リーダー領域の核酸配列と同一である核酸配列または標的ウイルスのマトリクスタンパク質Ｍ、標的ウイルスの融合タンパク質Ｆ、および標的ウイルスのラージタンパク質Ｌよりなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする核酸配列、および（ii）ｃｐ４５のＨＮタンパク質をコードする核酸配列を含むゲノムを有するエンベロープ化された、ネガティブセンスの、一本鎖ＲＮＡハイブリッドウイルス。４．ゲノムが（i）ｃｐ４５ウイルスゲノムの３'リーダー領域の核酸配列と同一である核酸配列；（ii）ｃｐ４５のヌクレオカプシドタンパク質［ＮＰ］をコードする核酸配列；（iii）ｃｐ４５のリンタンパク質Ｐ［＋Ｃ］をコードする核酸配列；（iv）ｃｐ４５のマトリクスタンパク質［Ｍ］をコードする核酸配列；（v）ｃｐ４５の融合タンパク質［Ｆ］をコードする核酸配列；（vi）野生型ＨＰＩＶ−３ウイルスのノイラミニダーゼタンパク質［ＨＮ］をコードする核酸配列；および（vii）ｃｐ４５のラージタンパク質Ｌをコードする核酸配列を含むエンベロープ化された、ネガティブセンスの、一本鎖キメラＲＮＡゲノムを含むハイブリッドウイルス。５．ＨＰＩＶ−３のラージタンパク質Ｌをコードするゲノムを有するエンベロープ化された、ネガティブセンスの、一本鎖ＲＮＡウイルスが弱毒化されているか否かを決定するための方法であって、該方法が野生型ＨＰＩＶ−３（ＪＳ）のゲノムに比較して、ウイルスのゲノムにおいて少なくとも１つの置換の存在を確認することを含む方法であって、該置換はＬタンパク質をコードするゲノムの領域に存在し、残基９４２においてTyrの代わりにHis、残基９９２においてLeuの代わりにPhe、および残基１５５８においてThrの代わりにIleよりなる群から選択される方法。６．ＨＰＩＶ−３のラージタンパク質Ｌをコードするゲノムを有するエンベロープ化された、ネガティブセンスの、一本鎖ＲＮＡウイルスが弱毒化されているか否かを決定するための方法であって、該方法がウイルスからサンプルを獲得し；サンプル中に存在するウイルスの数を決定するためのサンプルに関する第１のプラークアッセイを行い；野生型ＨＰＩＶ−３ウイルスのＬタンパク質を発現するプラスミドベクターでイン・ビトロで哺乳動物宿主細胞にトランスフェクションし；該ウイルスで宿主細胞を感染させ；補体化されたウイルスを産生するためにインキュベーションし；補体化されたサンプル中に存在するウイルスの数を決定するための補体化されたウイルスのサンプルに関する第２プラークアッセイを行い；ついで第２プラークアッセイを該ウイルスが弱毒化されるか否かを決定するために第１のプラークアッセイと比較することを含む方法。