KR100884673B1 - 씨디엔에이로부터 멈프스 바이러스의 구제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 멈프스 바이러스의 구제를 통한, 비분절 네거티브-센스 단일 스트랜드 RNA 바이러스의 재조합 생산방법, 및 이로부터 형성된 면역원 조성물에 관한 것이다. 추가의 양태는 감쇠 및/또는 감염성 바이러스로서 멈프스 바이러스의 생산방법에 관한 것이다. 재조합 바이러스는 cDNA 클론으로부터 제조되며, 따라서 뉴클레오타이드/폴리뉴클레오타이드 결실, 삽입, 치환 및 재배치를 포함한 규정된 변화를 게놈 장소에 갖는 바이러스가 수득된다.
멈프스 바이러스, 면역원 조성물

Description

씨디엔에이로부터 멈프스 바이러스의 구제{RESCUE OF MUMPS VIRUS FROM cDNA}
본 발명은 비분절 네거티브-센스 단일-스트랜드 RNA 바이러스인 멈프스 바이러스를 재조합적으로 생산하는 방법 및 이로부터 형성된 면역원 조성물에 관한 것이다. 추가 양태는 멈프스 바이러스를 감쇠 및/또는 감염성인 바이러스로서 생산하는 방법에 관한 것이다. 재조합 바이러스는 cDNA 클론으로부터 제조되므로, 게놈내에 특정 변화를 갖는 바이러스가 수득된다. 본 발명은 또한 멈프스 이외의 병원체를 위한 면역원 조성물 또는 약학 조성물, 유전자 치료 및 세포 표적화를 포함하는 많은 용도를 위해 상기에서 형성된 재조합 바이러스를 외래 유전 정보, 예를 들면, 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 사용하는 것에 관한 것이다.
엔벨로핑된 네거티브-센스의 단일 스트랜드 RNA 바이러스는 독특하게 구성되고 발현된다. 네거티브-센스 단일 스트랜드 바이러스의 게놈 RNA는 뉴클레오캡시드 내의 맥락에서 두 가지 주형 기능, 즉, 메신저 RNA (mRNA)의 합성을 위한 주형으로서 및 안티게놈 (+) 스트랜드의 합성을 위한 주형으로서 기능한다. 네거티브-센스, 단일 스트랜드 RNA 바이러스는 그 자신의 RNA-의존성 RNA 폴리머라제를 암호화하고 패키징한다. 메신저 RNA는 바이러스가 일단 감염된 세포의 세포질로 들어가면 합성 될 뿐이다. 바이러스 복제는 mRNA의 합성 후에 일어나고 계속적인 바이러스 단백질의 합성을 필요로 한다. 새로이 합성된 안티게놈 (+) 스트랜드는 (-) 스트랜드 게놈 RNA의 추가 카피 생성을 위한 주형으로서 기능한다.
병인제로서의 멈프스는 1935년에 Johnson 및 Goodpasture에 의해 바이러스로 반복재생하는 것으로 처음 밝혀졌다(Johnson and Goodpasture, 1935). 그 이후, 조직 배양에서의 증식은 바이러스 분류 및 멈프스 바이러스(MUV)의 생물학적 성질에 대한 연구를 촉진시켰다. 멈프스 바이러스는 믹소바이러스 과 인플루엔자 바이러스로 원래 분류되었으나, 그 뒤, 뉴클레오캡시드 형태, 게놈 구성 및 단백질의 생물학적 성질에 기초하여, 파라믹소비리대 과, 파라믹소비리내 아과, 루발라바이러스 속으로 재분류되었다. 루발라바이러스 속의 다른 예는 시미안 바이러스 5(SV5), 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 2 및 유형 4 및 뉴캐슬병 바이러스 (Lamb 및 Kolakofsky)를 포함한다. 파라믹소비리대의 모든 바이러스와 마찬가지로, 멈프스 바이러스도 형태에 있어 다형질성이며, 리보핵단백질 코어를 둘러싼 숙주세포로부터 유도된 지질막을 포함하며; 이 뉴클레오캡시드 코어는 나선형 구조를 형성하는데, 이는 15,384 뉴클레오타이드 비분절 네거티브 센스 RNA 게놈이 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질(NP)과 밀접하게 결합하여 구성된다. MUV 게놈의 유전적 구성은 3'-NP-P-M-F-SH-HN-L-5'인 것으로 결정되었다(Elango 등, 1998). 각 유전자는 세 개의 독특한 mRNA로부터 전사되는 P 시스트론을 제외하고는 단일 단백질을 암호화하는데; 상기 세 개의 mRNA에서 하나는 P 유전자의 충실한 카피로서 V 단백질을 암호화하며, 다른 두 개의 mRNA는 RNA 편집 메커니즘에 의해 전사도중 삽입된 비-주 형 G 잔기를 2개 및 4개 함유하는데, 이들은 각각 P 및 I 단백질을 암호화한다(Paterson 및 Lamb, 1990). P 및 L 단백질은 뉴클레오캡시드와 결합하여 멈프스 바이러스의 기능성 RNA 폴리머라제 복합체를 형성한다. F 및 HN 단백질은 비리온의 표면으로부터 돌출된 인테그럴 막 단백질이며, 바이러스의 부착과 세포로의 엔트리에 관여한다. 작은 소수성 단백질 (SH) 및 매트릭스 (M) 단백질도 또한 막과 결합되어 있으며(Takeuchi 등, 1996 및 Lamb 및 Kolakofsky, 1996); 바이러스 생장에 있어서의 V 및 I 단백질의 역할은 아직 확실하지 않다.
멈프스 바이러스의 복제 싸이클은 바이러스 엔벨로프가 숙주세포 원형질막에 융합되어 뒤이어 바이러스 뉴클레오캡시드가 세포질내로 방출됨으로써 개시된다. 그런 다음, 1차 전사가 일어나, 모든 바이러스 단백질의 생산이 야기되며, 후에 바이러스 게놈 복제쪽으로 스위칭된 뒤에 바이러스 성분이 모여서 새로운 바이러스 입자가 형성되어 숙주세포 원형질막으로부터 출아한다. 온전한 뉴클레오캡시드 구조만이 RNA 전사, 복제 및 후속 바이러스 증폭을 위한 주형으로서 작동할 수 있으므로, 여기에 MUV 및 다른 네거티브 스트랜드 RNA 바이러스의 유전자 조작에 어려움이 있다. 네이키드 게놈 RNA가 감염성이고 감염성 바이러스가 추가 바이러스성 인자의 부재하에 게놈의 cDNA 카피로부터 구제될 수 있는 포지티브 스트랜드 RNA 바이러스와는 달리(Taniguchi 등, 1978; Racaniello 및 Baltimore, 198), 네거티브 스트랜드 RNA 바이러스의 네이키드 게놈은 감염성이 아니므로, cDNA로부터 바이러스의 구제는 모두가 박테리오파아지 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 조절하에 있는, 실 길이의 포지티브 센스, 또는 네거티브 센스, 게놈 RNA 전사체와 함께 바이러스 NP, P 및 L 단백질의 세포내 공-발현을 필요로 한다(Schnell 등, 1994; Lawson 등, 1995; Whelan 등, 1995; Radecke 등, 1995; Collins 등, 1995; Hoffman 및 Banerjee, 1997; Durbin 등, 1997; He 등, 1997; Baron 및 Barrett, 1997; Jin 등, 1998; Buchholz 등, 1999; Peeters 등, 1999). 보고된 시스템 모두에서 T7 RNA 폴리머라제는 재조합 백시니아 바이러스를 공-감염시키거나(Fuerst 등, 1986; Wyatt 등, 1995), 또는 형질전환 세포주에서 T7 RNA 폴리머라제의 내생성 발현에 의해(Radecke 등, 1995) 공급된다.
폴리머라제 복합체는 게놈의 3' 말단의 시스-작용 시그널, 특히 프로모터 영역을 관여함으로써 전사 및 복제를 작동시키고 달성한다. 그리고 나서, 바이러스 유전자는 게놈 주형으로부터 이의 3'으로부터 5' 말단으로 일방향으로 전사된다. 다운스트림 유전자(예; 폴리머라제 유전자(L))로부터 만들어지는 mRNA는 업스트림 주변(즉, 핵단백질 유전자(NP))에 비해서 일반적으로 적다. 따라서, 게놈의 3'-말단에 대한 유전자의 위치에 따라 mRNA 양의 구배가 있기 마련이다.
이러한 비분절 RNA 바이러스의 분자 유전적 분석은 네이키드 게놈 RNA 또는 형질감염된 플라스미드로부터 세포내 생산된 RNA가 감염성이 아니기 때문에 최근까지 어려웠다(Boyer 및 Haenni, 1994). 이들 방법을 본원에서 "구제(rescue)"라고 지칭한다. 일부 재조합 비분절, 네거티브-스트랜드 RNA 바이러스의 분리를 허용하는 cDNA 구제 방법을 조작하는 방법에 관한 간행물이 있다(Schnell 등, 1994). 이들 상이한 네거티브 스트랜드 바이러스의 구제를 위한 기술은 공통 주제를 따르지만, 각 바이러스는 성공적인 구제를 위해 구별되는 필수 성분을 갖는다(Baron 및 Barrett, 1997; Collins 등, 1995; Garcin 등, 1995; Hoffman 및 Banerjee, 1997; Lawson 등, 1995; Radecke 등, 1995; Schneider 등, 1997; He 등 1997; Schnell 등, 1994; Whelan 등, 1995). 게놈 cDNA 플라스미드의 전사 후, 게놈 RNA의 정확한 카피는 RNA를 3'말단을 형성하도록 절단하는 벡터-암호화된 리보자임 서열 및 파아지 T7 RNA 폴리머라제의 합동 작용에 의해 생성된다. 이 RNA는 패키징되고 공-형질감염된 발현 플라스미드에 의해 초기 공급된 바이러스 단백질에 의해 복제된다. 멈프스 바이러스의 경우에서, 구제 방법은 아직까지 정립되어 있지 않으므로, 멈프스 구제 방법을 고안할 필요가 있다. 멈프스 바이러스 구제 방법을 고안하는 것은, 다른 RNA 바이러스에 대한 연구와 비교하여 멈프스 바이러스의 생물학에 대한 심도깊은 연구의 부재로 인해 복잡하다. 또한, 멈프스 바이러스는 조직 배양 시스템에서 효율적으로 생장하지 않는다. 더 나아가, 멈프스 바이러스 게놈의 말단 서열은 구제를 수행하기에 충분할 정도로 이전에는 규명되어 있지 않았다.
cDNA로부터 멈프스 바이러스의 성공적인 구제가 수행되도록 하기 위해, 수많은 분자적 현상이 형질감염 후에 일어나야 하는데, 이는 1) T7 RNA 폴리머라제에 의한 게놈 또는 안티게놈 RNA의 정확한 실 길이(full-length) 합성 및 리보자임 서열에 의한 3' 말단 프로세싱; 2) 복제를 개시하기에 적절한 수준으로 바이러스 NP, P, 및 L 단백질의 합성; 3) 게놈 RNA의 전사 활성이고 복제 적격인 뉴클레오캡시드 구조로의 신(新) 패키징; 및 4) 복제가 진행되기에 충분한 수준으로 새로이-형성된 뉴클레오캡시드로부터 바이러스 유전자의 발현.
본 발명은 멈프스 바이러스를 재조합적으로 생산하는 구제 방법을 제공한다. 구제된 멈프스 바이러스는 항체 생산, 진단, 예방 및 치료적 용도, 세포 표적화, 돌연변이 바이러스 제조 및 면역원 조성물의 제조와 같은 다양한 용도를 갖는다. 또한, 이들 용도를 위해 재조합 생산된 멈프스 바이러스의 Jeryl Lynn 스트레인을 사용하는 것이 다수의 이점이 있다. 이들 이점 중 일부는 (1) 감쇠된(attenuated) 표현형, (2) 투여된 1억 이상의 투여량에 기초한 실질적 안전성 기록, (3) 단일 투약으로 장기간 지속되는 면역성 유도능 및 (4) 상대적으로 낮은 게놈 재조합 수준.
발명의 요약
본 발명은 (i) 멈프스 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 전사벡터 및 (ii) 캡시드화, 전사 및 복제에 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 분리된 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 발현벡터를 포함하는 구제 조성물의 형질감염을, 적어도 하나의 숙주세포에서 수행하는 것으로 이루어지는 재조합 멈프스 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다. 형질감염은 이들 벡터의 공-발현과 재조합 바이러스의 생산을 허용하기에 충분한 조건 하에서 수행된다. 그리고 나서, 재조합 바이러스를 획득한다.
부가 양태는 mRNA 전사시 하나 이상의 또는 조합의 하기 멈프스 바이러스의 단백질을 발현하는 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다: NP, M, F, SH, HN L 및 V, P, 및 I 단백질(상기한 바와 같이 멈프스 바이러스의 P "시스트론"으로부터 생성). 관련된 양태는 그러한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 양태는 서열번호 1, 11 및 12의 뉴클레오타이드 서열이다. 추 가 양태는 이들 뉴클레오타이드, 상기 멈프스 바이러스 단백질의 아미노산 서열 및 이의 변이체에 관한 것이다.
본 발명의 단백질 및 뉴클레오타이드 서열은 멈프스 바이러스에 대한 진단, 예방 및 치료적 용도를 갖는다. 이들 서열은 캡시드화, 복제 또는 증폭을 통한 정상적인 바이러스 발생을 간섭하거나 파괴하는 화합물을 위한 스크리닝 시스템을 설계하는 데 사용될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열은 또한 외래 유전자 발현에 사용될 때, 멈프스 바이러스 및/또는 다른 병원체를 위한 면역원 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 또한, 발현된 외래 유전자는 치료적 용도를 가질 수 있다.
바람직한 양태에서, 감염성 재조합 바이러스는 면역원 조성물에서의 사용을 위해 그리고, 그러한 조성물을 사용하여 멈프스 바이러스에 의한 감염 및/또는 다른 병원체에 의한 감염을 치료하거나 예방하기 위한 방법에서의 사용을 위해 생산된다.
대안의 양태에서, 본 발명은 감쇠되거나 감염성이거나 또는 둘 다인 재조합 멈프스 바이러스의 생성 방법을 제공한다. 재조합 바이러스는 cDNA 클론으로부터 제조되므로, 게놈내 특정 변화를 갖는 바이러스가 수득될 수 있다. 또한, 이러한 양태는 외래 유전자를 발현하기 위해 멈프스의 Jeryl Lynn 스트레인의 집단내에서 컨센서스 게놈 서열 및/또는 임의의 게놈 서열을 사용하는데, 이는 이 라이센싱된 백신 스트레인이 안전을 위해 확립되어진 감쇠된 표현형을 포함하기 때문이다. 컨센서스 서열은 멈프스 바이러스의 게놈의 제안된 평균치로부터 유도되기 때문에, Jeryl Lynn 스트레인의 집단내에서 게놈에 대한 폴리뉴클레오타이드 서열은 본 발 명의 양태이다.
본 발명은 또한, 멈프스 이외의 병원체를 위한 면역원 조성물, 유전자 치료, 및 세포 표적화를 포함한 많은 용도를 위해 외래 유전 정보, 예를 들면, 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 상기로부터 형성된 재조합 바이러스의 사용에 관한 것이다.
본원에서 구체적으로 논의되는 상기-확인된 양태와 부가적 양태는 본 발명의 목적을 나타낸다.
도 1은 MUVCAT 미니레플리콘 DNA 작제물 및 T7 RNA 폴리머라제-전사된 미니레플리콘 안티센스 RNA 게놈의 구성을 보여주는 도식을 도시한다. DNA 작제물의 조립에서 사용되는 주요 제한 엔도뉴클레아제 부위가 보여진다. T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열이 정확한 MUV 5' 말단 뉴클레오타이드로 전사를 개시하도록 디자인 되었으며, HDV 리보자임 서열이 미니레플리콘 RNA 전사체에서 정확한 MUV 3' 말단 뉴클레오타이드를 생성하도록 위치시켰다. 듀플리케이트 T7 RNA 폴리머라제 종결 시그널을 HDV 리보자임 서열 뒤에 직렬로 포함시켰다. CAT ORF가 MUV 게놈의 모든 암호화 및 시스트론간(intercistronic) 서열을 대신하고; 남아있는 필수 MUV 특이적 서열은 3' MUV 리더(55 nt)와 인접 90 nt NP 유전자 미해독 영역(UTR), 및 137 nt L 유전자 LTR에 인접한 5' MUV 트레일러(24 nt)를 포함한다.
도 2는 조립 과정에 사용되는 서브게놈 단편 및 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는, MUV 실 길이 게놈 cDNA 작제물의 개략도이다. T7 RNA 폴리머라제 프로모 터 및 HDV 리보자임 서열은 각각 정확한 5' 말단 뉴클레오타이드에서 전사를 개시하고 MUV 안티센스 게놈의 정확한 3' 말단 뉴클레오타이드를 생성하도록 위치시킨다. 직렬로 배열된 T7 RAN 폴리머라제 말단 서열은 RNA 절단의 효율을 개선시키는 것을 돕기 위해 HDV 리보자임에 인접하여 위치한다. 구제된 MUV에 대한 확인 태그로서 사용되는 뉴클레오타이드 치환은 표 1에서 보여진다(도 8 참조).
도 3a는 세 개의 박막 크로마토그램을 도시하는데, 이는 293 세포를 MUV로 감염시키고 실시예 2에 기술된 바와 같은 pMUVCAT로부터 시험관내 전사된 RNA로 형질감염한 후에 상기 세포에 존재하는 CAT 활성을 보여준다.
도 3b는 MVA-T7 감염된 Hep2 및 A549 세포를 pMUVCAT과 MUV NP, P 및 L 단백질을 발현하는 플라스미드로 형질감염한 후에 상기 세포에 존재하는 CAT 활성을 보여주는 박막 크로마토그램을 도시한다. pMUVNP 발현 플라스미드의 수준은 양쪽 세포주 모두에서 적정되는데; 레인 1-4는 200 ng pMUVCAT, 50 ng pMUVP, 200 ng pMUVL 각각, 및 300 ng, 450 ng, 600 ng, 750 ng pMUVNP 각각을 함유하는 혼합물로 형질감염한 후의 CAT 활성을 보여주고; 레인 5는 pMUVL이 형질감염 혼합물이 누락되었을 때 생성된 CAT 활성을 보여준다.
도 4는 실시예 3에 기술된 바와 같이 A549 세포상에 형질감염된 세포 상등액의 계대(Passage; P1)를 도시한다. A, B 및 C 면은 구제된 멈프스 바이러스, 멈프스 바이러스 부재(대조군) 및 멈프스의 Jeryl Lynn 스트레인에 대응된다. 이들 도면은 A 및 C에 대한 유사한 감염성 병소를 보여준다.
도 5는 실시예 3에 기술된 바와 같이 베로(Vero) 세포 단일층에서 구제된 멈 프스 바이러스의 전세포 ELISA를 도시한다.
도 6은 rMUV를 확인하기 위해 사용되는 RT/PCR 산물의 겔 분석을 도시한다(실시예 4에 기술된 바와 같다). 총 RNA는 형질감염된 세포로부터 rMUV 바이러스의 계대 2로 감염된 베로 세포 단일층으로부터 제조된다. RT/PCR 반응이 pMUVFL 및 rMUV에만 존재하는 3개의 분리된 뉴클레오타이드 태그 부위를 스패닝하는 cDNA 산물을 생성하도록 셋업시킨다. 레인 1은 마커 1kb 래더(ladder)(Gibco/BRL)를 보여주며; 레인 2, 3 및 4는 각각 6081, 8502 및 11731 뉴클레오타이드 태그 위치를 아우르는 RT/PCR 산물을 보여준다. 이들 RT/PCR 산물이 오염성 플라스미드 DNA로부터 유도되지 않았음을 증명하기 위해, 레인 4에 보여진 cDNA의 생성을 위해 사용된 것과 동일한 반응이 RT 없이 수행되었으며; 이 반응의 산물은 레인 5에 보여진다. pMUVL이 형질감염 혼합물로부터 누락되었을 때 아무런 rMUV가 회수될 수 없음을 증명하기 위해서, 레인 4에 보여진 cDNA 산물을 생성하는 데 사용된 것과 동일한 RT/PCR 반응이 pMUVL 없이 수행된 형질감염으로부터 유도된 베로 세포 RNA를 사용하여 셋업 되었으며, 이 반응으로부터의 산물은 레인 6에 보여진다.
도 7은 rMUV에서 확인 태그 부위에 걸친 뉴클레오타이드 서열을 보여주는 세 개의 일렉트로페로그램(A, B, 및 C)을 도시한다. RT/PCR 산물(도 6)이 세 개의 태그 부위 각각에 걸쳐서 서열분석 되었다. rMUV cDNA에 대해 수득된 각 태그 부위에서의 뉴클레오타이드 서열은 pMUVFL을 유도하기 위해 사용된 MUV의 플라크 분리체(플라크 분리체 4, PI 4)에 대한 컨센서스 서열과 비교된다.
도 8은 Jeryl Lynn 스트레인에 대한 컨센서스 서열(서열번호 1)과 실 길이 cDNA 클론과 플라크 분리체 4(PI4)간의 뉴클레오타이드 및 아미노산 차이를 수록한 표(표 1)이다.
도 9는 멈프스 바이러스의 완전한 유전자 지도를 기술하는 표(표 2)로서, 멈프스 바이러스 단백질을 위한 유전자 개시와 유전자 종결 부위를 포함한다. 55개의 뉴클레오타이드 길이 3' 리더 및 24개의 뉴클레오타이드 길이 5' 트레일러의 서열이 또한 보여진다.
도 10은 서열번호 1에 제공된 바와 같은 멈프스 게놈의 개별 유전자에 대한 해독 개시 및 종결 위치와 함께 멈프스 바이러스 유전자 전사 개시 및 종결 뉴클레오타이드 위치를 수록하는 표(표 3)이다. 표 3에서 각 전사 (유전자) 개시에서부터 각 종결 뉴클레오타이드 위치까지의 뉴클레오타이드는 단백질 NP, P, M, F, SH, HN 및 L (각각 서열번호 93-99)에 대한 뉴클레오타이드 서열에 상응한다.
도 11은 유전자 M 및 F 사이의 멈프스 바이러스 게놈내로 루시퍼라제 및 베타갈락토시다제 유전자의 삽입을 보여주는 도식이다. AscI 부위는 M 유전자의 5' 비암호화 영역에서의 부위 특이적 돌연변이에 의해 생성된다. 멈프스 바이러스 특이성 M-F 유전자간 서열 및 각 리포터 유전자를 플랭킹하는 말단 AscI 부위를 생성하기 위해서 네스팅된(nested) PCR이 사용되었다. 생성되는 PCR 산물은 AscI로 분해되고, 게놈 AscI 부위로 도입된다.
도 12는 멈프스 바이러스 게놈내로 두 개의 유전자(루시퍼라제 및 CAT)의 삽입을 보여주는 도식이다. 폴리시스트론의 두 번째 유전자의 발현을 위한 내부 리보솜 유입 부위를 함유하는 단일의 전사 단위와 두 개의 분리된 전사 단위가 M-F 유 전자간 영역에 존재하는 AscI 부위 내로 별도로 삽입된다. 각각의 유전자 및 전사 단위를 플랭킹하는 적절한 멈프스 바이러스 M-F 유전자간 서열을 생성하기 위하여 네스팅된 PCR이 사용되었다.
도 13은 실시예 7에 기술된 바와 같이 멈프스 Jeryl Lynn 백신의 10 바이얼로부터 분리되어 RT-PCR에 의해 증폭된 RNA로부터 결정된, JL5/JL2의 상대적 분량에 대한 10 Mumpsvax R 백신 샘플의 MAPREC 분석으로부터의 결과물을 도시한다. 레인 1 및 2에서 시험된 샘플은 분석을 위한 선형도의 하한을 정하기 위해 사용되는 비분해 PCR 산물의 연속 희석물이다. 레인 3에서, PCR 산물은 JL5의 정제 분리체로부터 왔다. 레인 4에서, PCR 산물은 JL2의 정제 분리체로부터 왔다. 레인 5-8에서, PCR 산물은 하기 비로 혼합된 JL5 및 JL2 바이러스 샘플로부터 왔다: 각각 99 JL5/ 1 JL2, 95 JL5/5 JL2, 85 JL5/15 JL2, 및 75 JL5/25 JL2. 레인 9-18의 경우, PCR 산물은 MumpsvaxR 샘플 1-10으로부터 왔다.
도 14는 실시예 5에 기술된 바와 같이 CAT 및 루시퍼라제 모두를 함유하는 rMUV로 감염된 베로 세포의 추출물에 존재하는 CAT 활성을 보여주는 박막 크로마토그램을 도시한다.
도 15는 실시예 5에 기술된 바와 같이, 베타-갈락토시다제 유전자를 함유하는 rMUV로 감염된 베로 세포 단일층의 세포학적 염색을 보여주는 사진이다. 진한 청색의 존재는 베타-갈락토시다제 발현 및 활성을 나타낸다. 패널 C는 또한 임의의 부가적 외래 유전자를 함유하지 않는 rMUV에 의해 만들어진 "투명" 플라크를 보여 준다.
주요 서열의 간단한 요약
서열 1은 멈프스 바이러스의 Jeryl Lynn 스트레인의 실 길이 게놈에 대한 컨센서스 뉴클레오타이드 서열로서(서열번호 1), 이는 안티게놈(+, 5'에서 3'으로) 메시지 센스로 쓰여진다.
서열 2는 멈프스 바이러스 Jeryl Lynn 스트레인 NP 단백질의 아미노산 서열이다(서열번호 2).
서열 3은 멈프스 바이러스 Jeryl Lynn 스트레인 P 단백질의 아미노산 서열이다(서열번호 3).
서열 4는 멈프스 바이러스 Jeryl Lynn 스트레인 I 단백질의 아미노산 서열이다(서열번호 4).
서열 5는 멈프스 바이러스 Jeryl Lynn 스트레인 V 단백질의 아미노산 서열이다(서열번호 5).
서열 6은 멈프스 바이러스 Jeryl Lynn 스트레인 M 단백질의 아미노산 서열이다(서열번호 6).
서열 7은 멈프스 바이러스 Jeryl Lynn 스트레인 F 단백질의 아미노산 서열이다(서열번호 7).
서열 8은 멈프스 바이러스 Jeryl Lynn 스트레인 SH 단백질의 아미노산 서열이다(서열번호 8).
서열 9는 멈프스 바이러스 Jeryl Lynn 스트레인 HN 단백질의 아미노산 서열 이다(서열번호 9).
서열 10은 멈프스 바이러스 Jeryl Lynn 스트레인 L 단백질의 아미노산 서열이다(서열번호 10).
서열 11은 플라크 2에 대한 멈프스 Jeryl Lynn JL5 변이체의 완전한 뉴클레오타이드 서열이다(서열번호 11). 플라크 1은 플라크 2와 1703번 위치에서 상이하다(표 6 참조). 서열은 안티게놈(+, 5'에서 3'으로) 센스로 DNA가 읽히도록 쓰여졌다.
서열 12는 플라크 2에 대한 멈프스 Jeryl Lynn JL2 변이체의 완전한 뉴클레오타이드 서열이다(서열번호 12). 플라크 1은 플라크 2와 5번 뉴클레오타이드 위치에서 상이하다(표 7 참조). 서열은 안티게놈(+, 5'에서 3'으로) 센스로 DNA가 읽히도록 쓰여졌다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 재조합 멈프스 바이러스(MUV)를 생산하는 방법에 관한 것이다. 당분야에서의 이러한 방법은 "구제" 또는 역 유전법으로 언급된다. 상이한 비분절 네거티브-스트랜드 바이러스에 대한 여러 구제 방법이 하기 문헌에 개시되어 있다: Baron 및 Barrett, 1977; Collins 등, 1955; Garcin 등, 1995; He 등, 1997; Hoffman 및 Banerjee, 1997; Lawson 등, 1995; Radecke 및 Billeter, 1997; Radecke 등, 1995; Schneider 등, 1997; Schnell, 1994; Whelan 등, 1995. 구제에 관한 다른 문헌은 MV 및 파라믹소비리내 아과의 다른 바이러스에 대한 국제 특허 공개 WO97/06270 및 RSV 구제에 대한 국제 특허 공개 WO97/12032를 포함한다.
재조합 멈프스 바이러스의 구제를 수행하기 전에, 전체 멈프스 바이러스(Jeryl Lynn 스트레인)에 대한 컨센서스 서열을 개발하고 또한 멈프스 바이러스(MUV)에 대한 미니레플리콘 구제 시스템을 개발하는 것이 필수이다. 컨센서스 서열은 세포의 멈프스 바이러스 감염 동안에 존재하는 RNA 게놈 집단을 샘플링함으로써 수득되었다. 대응하여, 본 발명의 추가 양태는 멈프스 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열 및 이의 단백질, 뿐만 아니라, 이들 서열의 변이체에 관한 것이다. 바람직하게는, 고 엄중(stringency) 조건 하에서, 이들 변이체 서열은 하나 이상의 멈프스 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화 한다(멈프스 바이러스 단백질에 대한 유전자 개시 및 유전자 종결을 포함하는 멈프스 바이러스의 완전한 지도에 대해서는 도 9의 표 2 참조). 보다 바람직하게는, 고 엄중 조건 하에서, 이들 변이체 서열은 서열번호 1, 11 및 12의 폴리뉴클레오타이드 서열과 같이, 하나 이상의 멈프스 바이러스 스트레인을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화 한다. 고 엄중 서던 하이브리드화 조건을 규정하기 위해, Sambrook 등(1989)의 387-389쪽이 통상적으로 참조될 수 있을 것이며, 이는 본원에서 참조로 인용되며, 여기에서 11 단락에서 세척 단계가 고 엄중으로 고려된다. 본 발명은 또한 폴리뉴클레오타이드 서열이 뉴클레오타이드 트리플렛의 세 번째 뉴클레오타이드의 변화를 통해 기준 서열과 상이하게 되는 보존적 변이체에 관한 것이다. 바람직하게는, 이들 보존적 변이체는 멈프스 바이러스 기준 폴리뉴클레오타이드 기준 서열에 대해 생물학적 등 가물로서 기능한다. 본 발명의 "분리된" 서열은 비-천연 서열이다. 예를 들면, 이들 서열은 바이러스의 게놈내 정상 상태로부터 분리될 수 있거나; 또는 서열은 합성, 즉, 잘 알려진 재조합 발현 시스템과 같은 재조합 기술을 통해 생성되거나 기계로 생성될 수 있을 것이다.
본 발명은 또한 그러한 폴리뉴클레오타이드 하나 이상을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 전술한 바와 같이, 주어진 뉴클레오타이드 컨센서스 서열은 Jeryl Lynn 스트레인과 같이 멈프스 바이러스의 집단내에 하나 이상의 게놈을 함유할 수 있다. 특정 양태는 서열번호 1, 11 및 12의 컨센서스 뉴클레오타이드 서열, 또는 전사시 하나 이상의 멈프스 바이러스 단백질(NP, P/I/V, M, F, SH, HN 및 L)을 발현하는 뉴클레오타이드 서열을 사용한다. 이들 멈프스 바이러스 단백질에 대한 유전자 개시, 해독 개시, 해독 종결, 및 유전자 종결에 대해서는 도 10의 표 3을 참조.
추가 양태는 서열번호 2-10 각각에 개시된 바와 같은 멈프스 바이러스 단백질 NP, P/I/V, M, F, SH, HN 및 L에 대한 아미노산 서열 및 이의 단편 또는 변이체에 관한 것이다. 바람직하게는, 멈프스 바이러스 단백질을 발현하는 단편 및 변이체 아미노산 서열과 변이체 뉴클레오타이드 서열은 생물학적 등가물, 즉, 그들은 감쇠되거나, 감염성이거나 또는 둘 모두이든 간에 바람직한 재조합 멈프스 바이러스를 수득하기 위하여 실질적으로 동일한 단백질 기능을 보유한다. 그러한 변이체 아미노산 서열은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된다. 그러한 변이체 아미노산 서열은 멈프스 바이러스 단백질의 아미노산 서열에 대해 전체 약 70% 내지 약 80%, 및 바람직하게는 약 90%의 유사도를 가질 수 있다. 변이체 뉴클레오타이드 서열은 전사시 멈프스 바이러스 단백질의 아미노산 서열 또는 멈프스 바이러스 단백질의 변이체 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열과 전체 약 70% 내지 약 80%, 바람직하게는 약 90%의 유사도를 가질 수 있다. 멈프스 바이러스 단백질 NP, P/I/V, M, F, SH, HN 및 L에 대한 예시적 뉴클레오타이드 서열은 표 1 및 2(각각, 도 8 및 9에서)에 기술되어 있다.
생물학적 등가물은 뉴클레오타이드 서열 또는 단백질 서열의 변이체를 생성함으로써 수득될 수 있다. 변이체는 주형 서열의 삽입, 치환, 결실, 또는 재배열일 수 있다. 멈프스 폴리뉴클레오타이드 서열의 변이체는 통상적인 방법, 예를 들면, PCR 돌연변이유발, 아미노산(알라닌) 스크리닝, 및 부위 특이성 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다. 변이체의 표현형은 목적하는 재조합 멈프스 바이러스가 얻어지는지 또는 목적하는 생물학적 효과가 얻어지는지 평가하기 위하여 변이체를 가지고 구제를 수행함으로써 평가될 수 있다. 변이체는 또한 원하는 사용이 면역원 조성물에서의 사용일 경우, 항원성에 대해 평가될 수도 있다.
아미노산 변화는 뉴클레오타이드 서열의 코돈을 변화시킴으로써 수득될 수 있다. 그러한 변화는 아미노산 서열에서 특정 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하는 것에 기초하여 수득될 수 있다. 예를 들면, 대안적 아미노산의 치환을 통해, 작은 형태적 변화가 단백질에 부여되어 멈프스 바이러스의 다른 단백질과 결합하거나 상호작용하는 능력에 있어서의 감소를 초래할 수 있다. 부가적인 변화가 재조합 멈프스 바이러스의 감쇠 수준을 변경시킬 수도 있다.
폴리펩타이드에 상호적인 생물학적 기능을 부여함에 있어서 아미노산의 수치요법(hydropathic) 지수를 사용할 수 있는데, 이는 Kyte 및 Doolittle(1982)에 의해 논의되었으며, 여기에서 특정 아미노산이 유사한 수치요법 지수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유한 것으로 밝혀졌다. 대안적으로, 유사 아미노산의 치환은 친수성에 기초하여, 특히 생성될 폴리펩타이드에서 목적하는 생물학적 기능이 면역학적 양태에서 사용될 것으로 의도되는 경우에 행해질 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,554,101호(참조로 본원에 인용)를 참조하면, 이는 인접 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같이 "단백질"의 최대 국부 평균 친수성도가 면역원성과 상관관계가 있다고 기술한다. 따라서, 치환은 각 아미노산에 할당된 친수성에 기준하여 행해질 수도 있음이 주목된다.
각 아미노산에 값을 부여하는 친수성 지수 또는 수치요법 지수 어느 것을 사용함에 있어서, 값이 ±2, 특히 바람직하게는 ±1, 가장 바람직한 치환의 경우에는 ±0.5의 값을 갖는 아미노산의 치환을 도입하는 것이 바람직하다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 멈프스 바이러스 단백질의 바람직한 특성은 하기 하나 이상을 포함한다: (a) 막 단백질이거나, 막과 직접적으로 관련된 단백질임; (b) SDA 아크릴아미드 (10%) 겔을 사용하여 단백질로 분리될 수 있음; 및 (c) 다른 적당한 멈프스 바이러스 단백질의 존재하에 바람직한 재조합 멈프스 바이러스의 구제와 생산에 기여함에 있어서 생물학적 기능을 보유.
상기 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 가지고, 멈프스 바이러스를 구제하 는 것을 진행시킬 수 있다. 멈프스 구제는 구제 조성물을 사용하여 배지 내에서 적어도 하나의 숙주세포의 형질감염 또는 형질전환을 수행함으로써 달성된다. 구제 조성물은 (i) 멈프스 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 전사벡터 및 (ii) 캡시드화, 전사 및 복제에 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 하나 이상의 분리된 핵산 분자을 포함하는 적어도 하나의 발현벡터를, 재조합 바이러스의 생산과 상기 벡터의 공-발현을 허용하기에 충분한 조건하에 포함한다. 안티게놈이라 함은 후대(progeny) 게놈의 합성을 위한 주형으로서 기능하는 분리된 포지티브 메시지 센스 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드 서열은 전사, 복제되는 뉴클레오캡시드 생성에 필요한 단백질을 암호화하는 상보 서열의 포지티브 센스 전사체와 하이브리드화 할 확률을 최소화하기 위하여, 전사시 복제성 중간체 RNA 또는 안티게놈에 상응하는 멈프스 게놈의 포지티브 센스 형태를 제공하도록 작제되는 cDNA이다. 전사벡터는 멈프스 발현에서 조절 역할을 갖는 유전자 요소, 예를 들면, 프로모터, 구조 유전자 또는 멈프스 RNA로 전사될 암호화 서열, 및 적절한 전사 개시 및 종결 서열의 조립체를 포함하는 작동적으로 연결된 전사 단위를 포함한다.
전사벡터는 RNA를 복제할 수 있는 뉴클레오캡시드 생산에 필요하며 또한 후대 뉴클레오캡시드를 RNA 복제 및 전사 모두에 적격이게 하는 멈프스 바이러스 단백질, NP, P 및 L과 공-발현된다. NP, P 및 L 단백질은, 비록 요구되는 단백질의 하나 또는 하나 이상이 안정적 형질전환체로서 이들 바이러스-특이성 유전자 및 유 전자 산물을 함유하고 발현하도록 공학처리된 선택된 숙주세포 내에서 생산될 수 있다 할지라도, 이들 요구되는 단백질을 암호화하는 하나 이상의 발현벡터(예, 플라스미드)로부터 생성된다. 바람직한 양태에서, NP, P 및 L 단백질은 발현벡터로부터 발현된다. 보다 바람직하게는, NP, P 및 L 단백질은 플라스미드와 같은 분리된 발현벡터로부터 각각 발현된다. 나중 경우에, 형질감염 또는 형질전환 동안에 제공되는 각 단백질의 상대량을 보다 용이하게 조절할 수 있다. 부가적 멈프스 바이러스 단백질은 NP, P 또는 L을 발현하는 플라스미드로부터 발현될 수 있거나, 단백질은 추가 플라스미드를 사용함으로써 더 발현될 수 있다.
NP, P 및 L의 양이 발현용 숙주세포의 내성에 의존하여 변한다 할지라도, NP, P 및 L을 발현하는 플라스미드는 세포 내에서 NP, P 및 L의 유효 몰비를 이루도록 조정된다. 유효 몰비는 원하는 재조합 멈프스 바이러스의 성공적인 구제를 제공하기에 충분한 NP, P 및 L의 비이다. 이들 비는 미니레플리콘(CAT/리포터) 분석에서 관찰되는 바와 같이 발현 플라스미드의 비에 의존하여 수득될 수 있다. 일 양태에서, 형질감염 pMUVNP:pMUVP 플라스미드의 몰비는 적어도 약 16:1이며 pMUVP:pMUVL은 적어도 약 1:6이다. 바람직하게는, pMUVNP:pMUVP의 몰비는 약 16:1 내지 약 4:1이며, pMUVP:pMUVL은 약 1:6 내지 약 1:1이다. 보다 바람직하게는, pMUVNP:pMUVP의 비는 약 6:1 내지 약 5:1이며, pMUVP:pMUVL은 약 1:3 내지 약 1:2이다.
멈프스 바이러스 발현 플라스미드 pMUVNP, pMUVP 및 pMUVL과 함께 게놈 cDNA 플라스미드의 형질감염 또는 형질전환 후, 게놈 RNA의 정확한 카피는 RNA를 3' 말 단이 형성되게 절단하는 벡터-암호화된 리보자임 서열과 파아지 T7 RNA 폴리머라제의 합동 작용에 의해 생성된다. 이 RNA는 공-형질감염된 발현 플라스미드에 의해 초기 공급된 바이러스 단백질에 의해 패키징되고 복제된다. 멈프스 바이러스 구제의 경우, T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 공급원이 NP, P 및 L에 대한 공급원과 함께 숙주세포(또는 세포주)로 가해진다. 멈프스 구제는 적절하게 위치한 T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 함유하는 멈프스 바이러스 게놈 cDNA 클론과 멈프스 바이러스 단백질 NP, P 및 L을 암호화하는 발현 플라스미드로 이 세포주를 공-형질감염함으로써 달성된다.
멈프스의 구제를 위해, 바람직한 바이러스 게놈의 클로닝된 DNA 등가물은 적절한 DNA-의존성 RNA 폴리머라제 프로모터(예; T7 RNA 폴리머라제 프로모터)와 적절한 전사벡터(예; 박테리아 플라스미드) 내로 삽입된 자가-절단 리보자임 서열(예; 간염 델타 리보자임) 사이에 위치한다. 이 전사벡터는 용이하게 조작가능한 DNA 주형을 제공하는데, 이로부터 RNA 폴리머라제(예; T7 RNA 폴리머라제)가 정밀하거나 거의 정밀한 5' 및 3' 말단을 가진 바이러스 안티게놈(또는 게놈)의 단일-스트랜드 RNA 카피를 전사한다. 바이러스 게놈 DNA 카피 및 플랭킹 프로모터와 리보자임 서열의 배향이 안티게놈 또는 게놈 RNA 등가물이 전사될지 여부를 결정한다.
따라서, 구제 방법에서 구제 조성물이 사용된다. 구제 조성물은 특정 요구 또는 용도를 위해 원하는 대로 변화시킬 수 있다. 구제 조성물의 한 예는 (i) 멈프스 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함 하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 전사벡터 및 (ii) 캡시드화, 전사 및 복제를 위해 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 분리된 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 발현벡터를 포함하는 조성물이다. 전사 및 발현벡터는, 구제 조성물의 숙주세포내로의 형질감염이 이들 벡터의 공-발현과 재조합 멈프스 바이러스의 생성을 유도하도록 선택된다.
전술한 바와 같이, 분리된 핵산 분자는 멈프스 바이러스의 적어도 하나의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 서열을 포함한다. 분리된 핵산 분자는 게놈, 안티게놈 또는 이들의 변형된 형태를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 작동가능하게 연결된 프로모터, 목적하는 게놈 또는 안티게놈, 자가-절단 리보자임 서열 및 전사 터미네이터를 암호화한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드 삽입, 재배열, 결실 또는 치환에 의해 야생형 멈프스 바이러스로부터 변형되어진 게놈 또는 안티-게놈을 암호화한다. 바람직한 양태에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 재조합 멈프스 바이러스에 대한 cDNA 클론을 암호화한다. 구제로부터 복제하는 바이러스 수득능은 본래의 게놈 및 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 크게 변형될수록 감소될 수 있다고 주장된다. 게놈 또는 안티게놈 서열은 멈프스 바이러스의 어느 스트레인의 것으로부터 유도될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 이종 공급원으로부터 게놈 또는 안티게놈 또는 유전자를 재조합적으로 결합시킴으로써 형성된 키메라 게놈을 암호화할 수도 있다.
본 발명의 방법에 의해 생성된 재조합 바이러스는 진단학적 연구수단으로서 또는 치료 또는 예방적 면역원 조성물로서 이용될 수 있으므로, 상기 폴리뉴클레오타이드는 또한 선택된 멈프스 바이러스의 자연형이나 감쇠형을 암호화할 수 있다. 많은 예에서, 폴리뉴클레오타이드는 상기 멈프스 바이러스의 감쇠된 감염형을 암호화하고 있다. 참조로 본 명세서에 인용된, 공개된 국제특허출원 WO 98/13501에 기술된 바와 같이, 특히 바람직한 양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 3' 게놈 프로모터 영역에 하나 이상의 감쇠변이를 갖고 있으며, RNA 폴리머라제 유전자 내에 하나 이상의 감쇠변이를 갖는 멈프스 바이러스의 게놈이나 안티게놈을 암호화하고 있다.
상기한 바와 같이 원하는 멈프스 게놈 및 안티게놈의 변형된 형태를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 외에도, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 또한 하나 이상의 이종 유전자 또는 하나의 원하는 이종 뉴클레오타이드 서열과 함께 원하는 게놈 또는 안티게놈을 암호화할 수 있다. 이러한 변이체는 선택된 뉴클레오타이드 서열을, 멈프스의 게놈이나 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열내에 도입함으로써 제조된다. 바람직하게는, 원하는 이종 서열을 멈프스 게놈의 유전자간 영역으로 삽입한다. 그러나, 원하는 이종 서열을 상기 멈프스 폴리뉴클레오타이드 서열의 비암호화 부위, 또는 비암호화 부위와 암호화 부위 사이, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드 서열의 어느 하나의 말단부에 삽입할 수 있다. 대안의 양태에서, 원하는 이종 서열을 비필수 유전자를 암호화하는 부위에 삽입하거나, 비필수 유전자 암호화 부위를 대신하여 삽입할 수도 있다. 삽입부위의 선택에 멈프스 바이러스 의 발현에 있어서의 3'에서 5'을 향하는 구배를 이용할 수 있다. 상기 이종 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 유전자)은 목적에 따라 다양할 수 있다. 원하는 재조합 바이러스의 적용에 따라, 상기 이종 뉴클레오타이드 서열은 보조인자, 사이토카인(예를 들어, 인터루킨), T-헬퍼 에피토프, 제한 마커, 보조제, 또는 여러가지의 미생물 병원체(예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균류 또는 기생충)의 단백질, 특히 보호적 면역반응을 유도할 수 있는 단백질을 암호화할 수 있다. 원하는 멈프스 바이러스 또는 미니레플리콘 바이러스 벡터의 구제 가능성을 최대화하기 위해 보조 인자의 면역원 부분, (인터루킨과 같은) 사이토카인, T-헬퍼 에피토프, 제한 마커, 보조제, 또는 여러가지 미생물 병원체(예를 들어, 바이러스, 박테리아 또는 진균류)의 단백질을 암호화하는 이종 서열을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 멈프스가 아닌 부분으로서 그외 다른 유형으로는 암세포 또는 종양세포, 알레르겐, 아밀로이드 펩타이드, 단백질 또는 그외 다른 거대분자 성분이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 특정 양태에서는, 이종 유전자는 재조합 바이러스의 예방적 또는 치료적 특징이 향상될 수 있도록 선택되어진, 인터루킨-12와 같은 사이토카인을 암호화한다.
암세포 또는 종양세포의 예에는 전립선 특이성 항원, 암 엠브리오 항원(carcino-embryonic antigen), MUC-1, Her2, CA-125 및 MAGE-3이 포함되나, 이에 한정되지 않는다.
알레르겐의 예에는 참조로 인용된, 미국특허 제5,830.877호 및 공개된 국제특허출원 WO 99/51259에 기재된 것들, 그리고, 꽃가루, 곤충독소, 동물비듬, 진균 포자 및 약품(페니실린 등)이 포함되나 이에 한정되지 아니한다. 그러한 성분은 알러지 반응의 원인으로 알려진 IgE 항체의 생성을 방해한다.
아밀로이드 펩타이드 단백질(APP)은 알츠하이머병, 아밀로이도시스 또는 아밀로이도제닉병이라고 다양하게 언급되는 질환에 관련된다. β-아밀로이드 펩타이드(또한 Aβ펩타이드로 약칭)는 APP의 42개의 아미노산으로 된 단편인데, 이는 β 및 γ분비효소에 의한 APP의 프로세싱에 의해 형성되며, 하기의 서열을 갖는다:
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala (서열번호 97)
일부 환자에서, 아밀로이드 층은 통합된 Aβ펩타이드의 형태를 취한다. 놀랍게도, 분리된 Aβ펩타이드를 투여하면 척추동물 숙주내 아밀로이드 층의 Aβ펩타이드 성분에 대한 면역반응이 유도됨이 확인된 바 있다(공개된 국제특허출원 WO99/27944 참고). 그러한 Aβ펩타이드는 또한 관련없는 부분에도 결합되어 있었다. 그러므로, 본 발명의 이종 뉴클레오타이드 서열은 Aβ펩타이드의 단편, 및 Aβ펩타이드 또는 그의 단편에 대한 항체 뿐만 아니라 Aβ펩타이드의 발현을 포함한다. Aβ펩타이드의 그러한 단편 중 하나는 하기 서열을 갖는 28개의 아미노산으로 된 펩타이드이다(US 특허 제4,666,829호에 개시됨):
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys (서열번호 98)
이들 이종 서열은, 다양한 RNA, 아미노산 서열, 폴리펩타이드 및 단백질을 동물이나 인간에게 전달하는 데 사용될 수 있는 멈프스 바이러스 벡터에 관한 본 발명의 양태에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기술된 예들은 멈프스 바이러스가 멈프스 바이러스 전사 프로모터의 조절하에서 하나 이상의 이종 유전자(및 3, 4 또는 5개 유전자까지)를 발현할 수 있음을 보여주고 있다. 대안적 양태에서, 추가적 이종 핵산 서열은 7 내지 10 kb에 이르는 단일 서열일 수 있는데, 이는 단일의 부가적 전사 단위로 발현된다. 바람직하게는, Rule of Six(Calain and Roux, 1993)에 따른다. 어떤 바람직한 양태에서는, 이러한 서열은 4 내지 6 kb에 이를 수 있다. 또한 이종 유전자의 정보를 추가적인 모노시스트론 전사 단위 및 폴리시스트론 전사 단위의 형태로 삽입할 수 있다. 상기 추가적 모노시스트론 전사 단위 및 폴리시스트론 전사 단위를 사용하는 경우 보다 더 많은 유전정보의 삽입이 허용될 것이다. 바람직한 양태에서, 상기 이종 뉴클레오타이드 서열은 하나 이상의 폴리시스트론 전사 단위로서 멈프스 게놈 서열내로 삽입되는데, 이는 하나 이상의 리보솜 유입부를 포함할 수 있다. 대안적인 바람직한 양태에서, 상기 이종 뉴클레오타이드 서열은 다중단백질 및 이 다중단백질을 절단하여 개개의 폴리펩타이드를 생성하기에 충분한 프로테아제를 암호화한다.
이종 뉴클레오타이드 서열은 멈프스 바이러스의 감염의 정상 경로를 이용하여, 호흡관을 통해 체내로 들어가 다양한 조직과 세포, 예를 들어, 타액선, 림프조직, 유선, 고환 및 편평 뇌 세포를 감염시킬 수 있다. 또한 이종 유전자는 유전자 치료 또는 특정 세포에 표적화된 약제를 제공하는 데 사용될 수 있다. 단순히 멈프스 감염의 정상 경로에 노출된 정상 세포를 이용하는 데 대한 대안으로서, 상기 이 종 유전자 또는 단편은 상이한 병원체로부터의 또다른 단백질이나 아미노산 서열을 암호화할 수 있는데, 이들은 재조합 멈프스 바이러스의 일부로서 이용되는 경우 재조합 멈프스 바이러스를 멈프스 바이러스의 정상 경로에 있지 아니하는 세포 또는 조직으로 인도한다. 이러한 방식으로, 재조합 멈프스 바이러스는 보다 다양한 외래 유전자를 전달할 수 있는 벡터가 된다.
감쇠된 멈프스 바이러스를 이용하는 양태의 경우, 화학적 돌연변이 유도물질을 첨가한 세포 배양액에서 바이러스가 생장하는 동안의 화학적 돌연변이유발, 이어서 온도 감수성 및/또는 저온 순응 변이체를 선별하기 위해 최적 이하의 온도에서 계대시킨 바이러스의 선별, 세포 배양액에서 소형 플라크를 생성하는 돌연변이체 바이러스의 동정, 및 숙주 범위 돌연변이를 선별하기 위한 이종 숙주를 통한 계대와 같은 통상적인 수단이 변형된 바이러스를 생산하기 위해 감쇠 돌연변이를 도입하는 데 사용된다. 감쇠 돌연변이를 도입하는 대안적 수단에는 부위특이적 돌연변이 유발을 사용하여 미리 예정된 돌연변이를 제조하는 것이 포함된다. 하나 이상의 돌연변이가 도입될 수 있다. 이들 바이러스는 그 후 세포 배양물 및/또는 동물 모델에서의 생물학적 활성이 감쇠되었는지 스크리닝된다. 감쇠 돌연변이 부위를 정하기 위해 감쇠된 멈프스 바이러스에 대해 뉴클레오타이드 서열분석을 수행한다.
구제된 재조합 멈프스 바이러스가 원하는 표현형(온도 감수성, 저온 적응성, 플라크 형태, 그리고 전사 및 복제 감쇠)을 나타내는지에 대해, 우선 서열 확인, 서열 태그의 확인 그리고 항체-기본 분석과 같은 시험관내 수단에 의해 시험한다.
구제된 바이러스의 감쇠된 표현형이 존재한다면, 적당한 동물 모델로 실험을 수행해볼 수 있다. 비인간 영장류가 인간 질병의 발병원인연구에 바람직한 동물모델을 제공한다. 이러한 영장류를 우선 감쇠되고 재조합 생성된 바이러스로 면역화한 다음, 그 바이러스의 야생형을 적용해본다.
캡시드화, 전사 및 복제에 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 분리된 핵산분자 뿐만 아니라 발현벡터는 원하는 바이러스의 선택에 따라 다르게 선택될 수 있다. 발현벡터는 숙주세포내에서 전사벡터와 함께 공발현될 수 있도록 그리고 선택된 조건하에서 재조합 바이러스의 생산이 허용될 수 있도록 제조된다.
멈프스의 구제에는 T7 RNA 폴리머라제가 존재하여 바이러스 게놈 cDNA-함유 전사벡터로부터 안티게놈(또는 게놈) 단일-스트랜드 RNA의 전사를 유도하는 적당한 세포 환경이, 바람직하게는 포유류가 포함된다. 공전사적으로 또는 그 직후에, 상기 바이러스 안티게놈(또는 게놈) RNA 전사체는 뉴클레오캡시드 단백질에 의해 기능성 주형으로 캡시드화되고, 바이러스-특이성 트랜스-작용 단백질을 암호화하고 있는 공형질감염된 발현 플라스미드로부터 동시적으로 생산된 필수적인 폴리머라제 성분에 의해 포획된다. 상기 추이 및 과정에 따르면, 바이러스 mRNA의 선행 전사, 새로운 게놈의 복제와 증폭, 그리고 그에 따른, 새로운 바이러스 후대의 생산, 즉 구제가 이루어진다.
본 발명의 구제방법에서, T7 RNA 폴리머라제는 재조합 백신 바이러스에 의해 제공될 수 있다. 그러나, 이러한 시스템에서는, 물리적 또는 생화학적 수단에 의해, 또는 백시니아 바이러스에 대한 양호한 숙주가 아닌 세포 또는 조직내로 반복 계대시킴에 의해, 구제된 바이러스가 백시니아 바이러스로부터 분리될 것이 요구된 다. 이러한 요구는 포유류 세포내에서 증식하지 못하는 백시니아 바이러스(예를 들어 MVA-T7)의 제한된 스트레인을 숙주세포로 사용함으로서 회피된다. 박테리오파아지 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 재조합 MVA 두 가지가 보고된 바 있다. MVA/T7 재조합 바이러스는 7.5K의 약한 전기/후기 프로모터(Sutter et al., 1995) 또는 11K의 강한 후기 프로모터(Wyatt et al., 1995)의 조절하에서 T7 RNA 폴리머라제의 통합된 하나의 카피를 함유한다.
구제 조성물의 형질감염에 이용되는 숙주세포 또는 세포주는 구제를 위해 선택된 조건에 따라 매우 다양하다. 숙주세포는, 원하는 재조합 멈프스 바이러스를 생산하도록 상기 구제 조성물의 벡터의 공발현을 허용하는 조건하에서 배양된다. 그러한 숙주세포는, 진핵세포 및 바람직하게는 척추동물 세포를 비롯하여, 매우 다양한 세포로부터 선택될 수 있다. 조류 세포가 사용될 수 있으나, 바람직한 숙주세포는 인간 배 신장 세포와 같은 인간 세포에서 유래된 것이다. 숙주세포의 예를 들면, 인간 293 세포, A549 세포 및 Hep2 세포이다. 많은 다른 형태의 세포 뿐만 아니라 베로 세포도 숙주세포로서 사용될 수 있다. 적합한 숙주세포의 다른 예로서는: (1) 인간 이배체 일차 세포주: 예를 들어, WI-38 및 MRC5 세포; (2) 원숭이 이배체 세포주: 예를 들어, FRhL(Fetal Rhesus Lung) 세포; (3) 유사-일차 연속 세포주: 예를 들어, AGMK(African green monkey kidney) 세포; (4) CHO, MDCK(Madin-Darby Canine Kidney) 및 일차 병아리 배 섬유아세포(CEF)와 같은 기타 잠재적 세포주가 있다. 어떤 진핵세포주는 바이러스를 증식시키는데 다른 것들에 비해 보다 적합하며, 어떤 세포주는 몇몇 바이러스에 대해서는 전혀 작용하지 않는다. 생존가 능한 바이러스의 구제를 용이하게 검출할 수 있도록 확인가능한 세포변성 효과를 나타내는 세포주가 사용된다. 멈프스의 경우에는, 형질감염된 세포가 베로세포 상에서 빠르게 퍼져나가 쉽게 확인되는 플라크를 생성하므로, 베로세포 상에 공배양될 수 있다. 일반적으로, 선택된 바이러스의 생장을 허용하는 숙주세포가 이용된다.
대안적으로 바람직한 양태에서는, 세포에 의한 DNA의 흡수가 증가되도록 형질감염-촉진 반응물이 첨가될 수 있다. 이들 반응물 중 많은 것이 본 기술분야에 공지되어 있다. LIPOFECTACE(Life Technologies, 미국 메릴랜드 게이터스버그 소재) 및 EFFECTENE(Qiagen, 미국 캘리포니아 발렌시아 소재)이 통상적인 예이다. Lipofectace와 Effectene은 모두 양이온성 지질이다. 이들 모두는 DNA를 코팅해서 세포에 의한 DNA의 흡수를 촉진시킨다. Lipofectace는 DNA를 둘러싸는 리포솜을 형성하는 반면, Effectene은 DNA를 코팅하기는 하지만 리포솜을 형성하지는 않는다.
전사벡터와 발현벡터는 숙주세포내에서 발현되도록 고안된 플라스미드 벡터일 수 있다. 캡시드화, 전사 및 복제에 필요한 트랜스-작용 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 분리된 핵산 분자를 포함하는 발현벡터는 동일한 발현벡터 또는 적어도 두 개의 상이한 벡터로부터 상기 단백질을 발현할 수 있다. 일반적으로 이들 벡터는 기초적 구제 방법에서 알려져 있으며, 본 발명의 개량된 방법에 사용되기 위해 변경될 필요가 없다.
본 발명의 방법에서, 구제를 위한 표준온도 범위(약 32℃ 내지 약 37℃)가 사용될 수 있으나, 승온에서의 구제가 재조합 RNA 바이러스의 구제를 보다 양호하 게 하는 것으로 확인되었다. 승온은 열 쇼크 온도로 언급된다(참고자료로서 첨부된, 공개된 국제특허출원 WO 99/63064 참조). 유효 열 쇼크 온도는 재조합 바이러스의 구제 수준이 향상되는 재조합 바이러스 구제를 수행하는데 제안된 표준온도 이상의 온도이다. 온도 범위에 대한 예시적 리스트는 다음과 같다: 38℃ 내지 약 47℃, 보다 더 바람직하게는 약 42℃ 내지 약 46℃. 대안적으로, 43℃, 44℃ 및 45℃의 열 쇼크 온도가 특히 바람직함이 확인된다.
원하는 재조합 멈프스 바이러스의 구제 수준을 결정하는데 다양한 방법이 이용된다. 본 명세서의 양태에서 확인되듯이, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 리포터 유전자가 상기 재조합 바이러스의 구제 조건을 모니터링하여 최적화하는데 사용된다. 상기 리포터 유전자의 해당 활성으로 기준선을 설정하고, 상기 재조합 바이러스의 발현 수준을 시험한다. 다른 방법으로서는 수득된 재조합 바이러스 플라크의 수를 검사하는 것과 서열분석에 의해 구제된 바이러스의 생성을 확증하는 것이 있다.
바람직한 양태에서, 숙주세포 내에 존재하듯이, 형질감염된 구제 조성물은 플라크 팽창 단계(즉, 증폭단계)를 거치게 된다. 형질감염된 구제 조성물을 최소한 한층의 플라크 팽창 세포(PE 세포)상에 옮긴다. 멈프스 바이러스 또는 재조합 멈프스 바이러스의 증가된 생장을 보여주는 플라크 팽창 세포를 선별함으로써, 형질감염된 세포로부터의 재조합 바이러스의 구제가 향상된다. 바람직하게는, 구제 조성물을 함유하는 상기 형질감염된 세포를 실질적으로 융합하는 PE 세포의 단일층 상에 옮긴다. 플라크 팽창을 비롯하여 구제 기술의 다양한 변형이 또한 공개된 국제 특허출원 WO 99/63064에 기재되어 있다.
본 발명의 방법으로부터 제조된 재조합 멈프스 바이러스는 진단적, 예방적 및 치료적 적용분야에 사용된다. 바람직하게는, 본 발명의 방법으로부터 제조된 재조합 바이러스는 감쇠되어 있다. 감쇠된 재조합 바이러스는 인간 및 동물 숙주를 감염시키는 야생형에 비교할 때 그 독력의 상당한 감소를 보여야 한다. 감쇠 정도는 감염 징후가 대부분의 개체에서 나타날 정도이지만 바이러스가 감염에 충분한 복제 능력을 보지하고 백신에 대해 원하는 면역반응 프로필을 도출할 수 있을 정도이다. 감쇠된 재조합 바이러스는 단독으로 또는 의약, 항원, 면역화제 또는 보조제와 함께 질환의 예방 또는 개선을 위한 백신으로 사용될 수 있다. 이러한 활성제는 제형되고, 통상의 수단으로, 즉, 희석제 또는 약학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 감쇠된 재조합 생산된 멈프스 바이러스가 면역원 조성물에 이용된다: 면역원 조성물은 다음을 포함한다: (i) 적어도 하나의 재조합 생산된 감쇠된 멈프스 바이러스 및 (ii) 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 완충제 또는 희석제, 보조제 또는 담체. 바람직하게는, 이들 조성물은 멈프스 감염의 예방 및/또는 개선하는데에 면역원 조성물로서 치료적, 예방적 적용이 가능하다. 그러한 적용에 있어, 본 발명의 감쇠된 재조합 멈프스 바이러스 하나 이상이 면역학적 유효량, 즉 정상적인 멈프스 감염 진행의 상당한 감소를 유발할 수 있는 양으로 사용된다.
그러한 면역원 조성물의 제제는 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 면역 원 조성물은 부가적인 항원 성분(예를 들어, 폴리펩타이드 또는 그의 단편, 또는 항원을 암호화하는 핵산 또는 그의 단편)을 포함하고, 바람직하게는, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 약학적 허용가능한 담체 및/또는 희석제로 적합한 예에는 모든 통상적인 용매, 분산매, 충진제, 고형 담체, 수용액, 코팅제, 항생제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수지연제 등이 포함된다. 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 투여된 환자에게 알러지 반응이나 그외 다른 역효과를 유발하지 않는 담체를 말한다. 약학적으로 허용가능한 담체로서 적합하게는 예를 들어, 물, 식염수, 인산염 완충 생리식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 뿐만 아니라 그들의 조합 중의 하나 이상이 포함된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 또한, 습윤제 또는 윤활제, 보존제 또는 완충제와 같은 항원의 수명 또는 효능을 증가시키는, 소량의 보조 성분을 포함할 수 있다. 약학적 활성 물질에 대한 그러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 어떠한 통상의 매질 및 제제가 활성 성분과 양립 불가능한 경우를 제외하고서는 그들의 본 발명의 면역원 조성물에서의 사용이 고려된다.
그러한 면역원 조성물의 투여는 비강내, 구강, 눈, 폐, 질 또는 직장의 표면과 같은 점막 표면에, 비강내, 비경구, 경구, 또는 국소 투여, 및 에어로졸 분사와 같은 통상적이고 효과적인 어떤 형태로든 적용될 수 있다. 바람직한 투여방식은 비경구 또는 비내 투여이다.
경구 투여를 위한 제형에는 예를 들어, 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로스, 탄산 마그네슘 등과 같은 통 상 이용되는 부형제가 포함된다.
본 발명의 백신 조성물은 보조제를 포함할 수 있으며, 이러한 보조제에는 수산화 알루미늄; 인산 알루미늄; Stimulon™QS-21(Aquila Biopharmaceuticals, Inc., 미국 매사추세츠 프래밍햄 소재); MPL™(3-O-탈아실화된 모노포스포릴 지질 A; RIBI ImmunoChem Research, 미국 미시건 해밀톤 소재); IL-12(Genetics Institute, 미국 매사추세츠 캠브리지 소재); N-아세틸-뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP); N-아세틸-노르-뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, 노르-MDP로 약칭); N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴옥시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE로 약칭함); 및 콜레라 독소가 포함되나 이에 한정되지 아니한다. 사용가능한 그외 다른 것으로는 B 서브유닛(예를 들어, 29번 아미노산 위치의 글루타민산이 다른 아미노산, 바람직하게는, 본 명세서에 참고로 첨부된 공개된 국제특허출원 WO 00/18434에 따라 히스티딘으로 치환된 것)을 비롯한 콜레라 독소의 무독성 유도체, 및/또는 비-멈프스 폴리펩타이드와 콜레라 독소나 B 서브유닛, 프로콜레라게노이드, 진균류의 다당류와의 컨쥬게이트 또는 유전 공학처리 융합물이 있다.
재조합 생산된 본 발명의 감쇠된 멈프스 바이러스는 면역원 조성물내 유일한 활성 면역원으로서 투여될 수 있다. 그러나, 대안적으로, 면역원 조성물은, 다른 병원종에 대한 면역학적 활성 항원을 비롯하여, 다른 활성 면역원을 함유할 수도 있다. 그 면역학적 활성 항원은 복제성 제제이거나 비복제성 제제일 수 있다. 복제성 제제에는 예를 들면, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스(VZV), 파라인플루엔자 바이러스(PIV) 및 호흡기 합포체 바이러스(RSV)의 감쇠형이 포함된다.
본 발명의 중요한 측면의 하나는 본 발명의 면역원 조성물을 포유류에 제공하는 단계를 포함하는 포유류내 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 면역원 조성물은 상기 조성물 내에 함유된 폴리펩타이드의 면역학적 유효량이 멈프스 감염에 대해 원하는 반응을 일으킬 수 있을 정도로 처리된 동물 또는 인간에 면역원성을 갖는 조성물이다. 바람직한 양태는 상기 면역원 조성물의 면역학적 유효량을 인간에게 투여하는 것을 포함하는 인간내 멈프스의 개선을 비롯한 치료 또는 예방하는 방법에 관련된다. 투여량은 개체의 구체적인 상태에 따라 다를 수 있다. 그 투여량은 당업자에 공지된 방식으로 결정될 수 있다.
명백하게, 멈프스 바이러스의 단백질에 대한 분리된 아미노산 서열은 서브유닛 백신을 형성하는데 사용될 수 있다. 또한 상기 서열은 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 배양하는데 있어서의 항원으로 사용될 수 있으며, 면역분석법에서 항-이하선염 바이러스 단백질-반응성 항체의 검출에 항원으로 사용될 수 있다. 본 발명에 의해 포괄되는 면역분석법에는 본 명세서에 참고자료로서 첨부된 미국특허 제 4,367,110 호(이중 모노클로날 항체 샌드위치 분석) 및 미국특허 제4,452,901호(웨스턴 블로팅)이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 그외 다른 분석법에는 시험관내 및 생체내 모두에서, 표지된 리간드의 면역침전법과 면역세포화학법이 포함된다.
또한 본 발명은 서열번호 2 내지 10 중 하나의 아미노산 서열이 샘플내에 존재하는지를 측정하는 단계를 포함하는, 멈프스 감염을 진단하거나 투여된 멈프스 백신 스트레인을 동정하는 방법을 제공한다. 통상적인 진단방법 어떠한 것이든 사용될 수 있다. 이러한 진단방법은 아미노산 서열 또는 폴리펩타이드의 존재에 용이하게 기초할 수 있다. 바람직하게는, 그러한 진단방법은 본 발명의 아미노산 서열에 공통되는 최소한 10개, 바람직하게는 최소한 20개의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드에 매치된다.
본 명세서에 기재된 핵산 서열은 또한 다양한 진단적 적용에 이용될 수 있다. 이들 핵산 서열은 멈프스 바이러스 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 특이적으로 하이브리드화하는 능력을 갖는 상대적으로 짧은 길이의 DNA 및 RNA 서열을 제조하는데 이용될 수 있다. 핵산 프로브는 진단적 분석의 특이성에 대한 선택된 변수들을 고려하여 원하는 길이로 선택한다. 상기 프로브는 주어진 샘플내, 병원성 유기체가 존재하는지를 확인하는 진단적 분석이나, 투여된 멈프스 백신을 확인하는데 사용될 수 있다. 재조합 발현에 대한 최근의 진보된 기술에 따라, 존재하는 항체와의 반응성 또는 진단이나 치료용 반응물을 생성하는 능력에 대응하는 올리고펩타이드 및 폴리펩타이드를 스크리닝할 목적으로, 핵산 서열을 발현 작제물에 삽입할 수 있다. 적합한 발현 조절 서열과 숙주세포/클로닝 비히클 조합이 당업계에 잘 알려져 있으며, 예로서, Sambrook et al. (1989)에 기재되어 있다.
바람직한 양태에서, 하이브리드화 연구 또는 분석에 이용되는 핵산 서열에는, 적어도 약 10 내지 30개, 또는 약 30 내지 60개의 뉴클레오타이드가 사용될 수도 있으나, 적어도 약 10 내지 약 20개의 뉴클레오타이드로 이루어진 뉴클레오타이드 스트레치에 상보적인 서열이 포함된다. Falkow et al., 미국특허 제4,358,535호 에 기술된 바와 같은 진단분석법을 비롯하여, 다양한 공지된 하이브리드화 기술 및 시스템이 본 발명의 하이브리드화 측면의 실시에 사용될 수 있다.
일반적으로, 본 명세서에 기재된 하이브리드화 프로브는 고체상을 이용하는 양태에서 뿐만 아니라 액체 하이브리드화에서도 반응물로 유용할 것이다. 고체상을 수반하는 양태에서, 삼출물, 체액(예를 들어, 양수, 중이 삼출액, 기관지폐포 세척액) 또는 편평 조직과 같은 의심되는 임상 샘플로부터 수득된 시험 DNA(또는 RNA)는 선택된 매트릭스 또는 표면에 흡수되거나 아니면 부착된다. 이렇게 고정된 단일 스트랜드 핵산을 원하는 조건하에서 선택된 프로브와 특이적 하이브리드화시킨다. 선택된 조건은 요구되는 특정 기준(예를 들면, G+C 함량, 표적 핵산의 유형, 핵산의 기원, 하이브리드화 프로브의 크기 등에 따라)에 기초한 특정 상황에 따라 좌우될 것이다. 비특이적으로 결합된 프로브 분자를 제거하기 위해 하이브리드화된 표면을 세척한 다음, 표지물을 이용하여 특이적 하이브리드화를 검출 또는 정량한다.
본 발명의 멈프스 바이러스 단백질을 암호화하는 핵산 서열 또는 그의 변이체가 예를 들어 미국특허 제4,603,102호에 제시된 PCR™기술과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 멈프스 바이러스 서열 중 다양한 부분을 멈프스 유전자의 한정된 부분 또는 멈프스 바이러스 뉴클레오타이드를 PCR™증폭하는데 올리코뉴클레오타이드 프로브로 사용할 수 있는데, 이들 서열은 그 후 상보서열을 갖는 하이브리드화 프로브와의 하이브리드화에 의해 검출될 수 있다. 이러한 방식으로, 본 발명의 핵산 서열을 이용하여 어떤 샘플내의 매우 적은 농도의 멈프스 핵산을 검출할 수 있는 것이다.
이하의 실시예는 본 발명의 특정 양태를 기술하고자 하는 것이다. 그러나, 당업자는 본 명세서의 견지에서, 개시된 구체적인 예들에 많은 변경이 이루어질 수 있음을 이해하고, 본 발명의 취지와 범위에서 벗어나지 않고 동일 또는 유사한 결과를 얻을 수 있을 것이다.
하기 실시예는 설명의 수단으로 제공되는 것으로, 상기한 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 아니된다.
실시예 1
재료 및 방법
세포 및 바이러스: 병아리 일차 배 섬유아세포(CEF) 세포를 SPAFAS Ins.(미국 커네티컷 프레스톤 소재)로부터 입수하여, 5% 태 송아지 혈청을 보충한 이글 기본 배지(BME)에서 배양하였다. Hep 2 세포, 293 세포, A549, 및 베로 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)으로부터 입수하여 10% 태 송아지 혈청을 보충한 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 생장시켰다. MumpsvaxR, Lot Nos. 0089E, 0656J, 및 1159H(Merck and Co., Ltd, 미국 펜실베이니아 웨스트포인트 소재)로부터 멈프스 바이러스의 Jeryl Lynn 스트레인을 CEF 세포상에서 직접 배양했다. 박테리오파아지 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 재조합 백신 바이러스 Ankara(MVA-T7)를 B. Moss 박사로부터 입수하였다[National Institutes of Health, 미국 메릴랜드 베데스다 소재, Wyatt et al., 1995 참조].
1.A. 멈프스 바이러스 Jeryl Lynn 컨센서스 서열의 생성
멈프스 바이러스 Jeryl Lynn 스트레인 집단의 생장: 멈프스 바이러스 Jeryl Lynn 스트레인을 Mumpsvax(lot# 1159H, Merck and Co., Inc)로부터, 5% 태 송아지 혈청이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 또는 5% 태 송아지 혈청이 보충된 이글 기본 배지(BME)내 병아리 일차 배 섬유아세포(CEFs, Spafas, Inc.) 상에서 직접 배양했다. T-75 플라스크에 플레이팅된 CEF를 재현탁된 Mumpsvax로 실온에서 2시간 동안 대략 0.002의 감염 중복도(multiplicity of infection, moi)로 감염시켰다. 접종물을 세포로부터 제거하고, 신선한 배지로 대체했다. 세포를 37℃에서 4일 동안 배양시켰으며, 그 기간에서 극심한 합포체와 세포병변이 관찰되었다. 상기 세포를 배양 배지 중으로 스크래핑시켜 바이러스를 수집한 후, 드라이아이스/에탄올 조에서 2회 동결-해동하고, 37℃에서 배양했다. 세포 파쇄물을 Beckman GS-6KR 원심분리기(Beckman Instruments, Inc., 미국 펜실베이니아 팔로알토 소재)에서 2500 rpm으로 원심분리하여 제거했다. 바이러스를 -80℃에 보관했다.
바이러스 RNA의 분리, 증폭 및 서열분석
멈프스 바이러스 RNA를 제조업자(GibcoBRL, 미국 뉴욕 그랜드아일랜드 소재)에 따른 트리졸(Trizol) LS 시약을 사용하여 바이러스 동결 분획으로부터 분리하였다. 분리된 바이러스 RNA를 주형으로 사용하고 Titan One-Tube RT-PCR 시스템(Boehringer Mannheim, 미국 인디애나 인디애나폴리스 소재)을 사용하여 역전사 후, 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 수행했다. 멈프스 게놈을 하기 프라이머 쌍을 사용하여 4개의 분리된 단편으로 증폭시켰다:
5'-1ACCAAGGGGAGAATGAATATGGG23(서열번호 95) 및
5'-3875CTGAACTGCTCTTACTAATCTGGAC3851(서열번호 82)(3.9 kb 산물);
5'-3773CTGTGTTACATTCTTATCTGTGACAG3798(서열번호 21) 및
5'-7783TGTAACTAGGATCTGATTCCAAGC7760(서열번호 72)(4 kb 산물);
5'-7678AGAGTTAGATCAGCGTGCTTTGAG7701(서열번호 32) 및
5'-11685CCTTGGATCTGTTTTCTTCTACCG11662(서열번호 62)(4 kb 산물);
5'-11529GTGTTAATCCCATGCTCCGTGGAG11552(서열번호 42) 및
5'-15384ACCAAGGGGAGAAAGTAAAATC15363(서열번호 53)(3.9 kb 산물)
제조업자(Boehringer Mannheim, 미국 인디애나 인디애나폴리스 소재, 카탈로그 # 1855476)가 제안하는 프로토콜에 따른 RT와 PCR 조건을 따랐다. PCR 산물이 1% 아가로스 겔 상에서 정제되었다.
Applied Biosystems(ABI) 377 서열분석기(Applied Biosystems, Inc., 미국 캘리포니아 포스터시티 소재)를 사용하여 PCR 산물의 서열을 결정하였다. 서열분석을 위해, 하기 표 4에서 보여지듯이 전체 멈프스 게놈을 스패닝하는 일련의 프라이머가 고안되었다. 이들 프라이머 서열은, 불완전하게 서열분석된 멈프스 바이러스 스트레인의 여러가지의 조합을 위해 유전자은행으로부터 얻은 뉴클레오타이드 서열 정보에 기초된 것이다. 공개된 서열을 사용하여, 단백질을 암호화하는 가상의 멈프스 게놈 서열을 고안했으며, 그로부터 프라이머를 생성했다.
멈프스 Jeryl Lynn 게놈의 5' 및 3' 말단의 서열을 정확하게 결정하기 위해, 바이러스 게놈 RNA를 그 양 말단과 cDNA에 연결시킨 후 연결된 영역에 걸쳐 PCR 증폭시켰다. 각 반응에서, 3-5 ㎍의 바이러스 RNA를 10% DMSO, 5X 연결 완충액 및 탈이온수에서 83℃로 3분 동안 배양하여 이차구조를 변성시킨 후, 즉시 얼음상으로 옮겼다. T4 RNA 리가아제(20 단위, New England Biolabs, Inc., 미국 매사추세츠 베벌리 소재)와 40 단위의 RNasin(Promega)을 첨가하여 16℃에서 밤새 배양된 20 ㎕의 최종 연결 혼합물을 수득하였다. 상기 연결 혼합물을 페놀/클로로포름 추출한 후, 게놈의 연결 영역을 스패닝하는 하기의 프라이머 쌍을 사용하여 RT-PCR을 수행했다:
5'-15166GCGCATTGATATTGACAATG15185(서열번호 52) 및
5'-216CCCTCCTCACCCCTGTCTTG197(서열번호 92)
PCR 산물에 대해 하기의 네스팅된 프라이머를 사용하여 PCR 2 라운드를 수행했다:
5'-15227GAATAAAGACTCTTCTGGC15245(서열번호 93) 및
5'-138GGTAGTGTCAAAATGCCCCC119(서열번호 94)
최종 PCR 산물을 겔-정제하고 서열분석했다.


표 4
MUV 게놈의 서열분석에 이용되는 프라이머
Figure 112002003496918-pct00001
Figure 112002003496918-pct00002
종래의 연구는 Jeryl Lynn 백신 스트레인에 두 개의 서로 다른 바이러스 집단의 혼합물이 함유되어 있음을 보여주었다(Afzal et al., 1993). 그러므로, 구제 과정 동안 최적 이하의 단백질-단백질 상호작용의 가능성을 최소화하기 위해(상이한 바이러스 집단으로부터 유래한 cDNA 단편을 함께 결합시켜 게놈 cDNA로 만듦에 의함), Jeryl Lynn 백신 제제로부터 잘 분리된 플라크(플라크 분리체 4로 표시, PI 4)를 선택하여, 실 길이 게놈 cDNA 그리고, NP, P, 및 L 발현 플라스미드를 유도하기 위해 증폭시켰다.
1.B MUV NP, P 및 L 단백질에 대한 발현 플라스미드의 작제
뇌심근염 바이러스(EMC)의 cap 독립성 해독 인핸서(CITE)를 함유하는 변형된 플라스미드 벡터 pEMC(Moss et al., 1990)의 T7 RNA 폴리머라제 프로모터와 T7 RNA 폴리머라제 전사 종결 서열 사이에 각각의 ORF에 대한 cDNA를 결합시켜 MUV NP, P 및 L 단백질에 대한 발현 플라스미드(pMUVNP, pMUVP, pMUVL)를 작제했다. 상기 MUP NP 단백질 ORF를 RT-PCR 증폭하는데 사용되는 프라이머는 전체 MUV 감염된 세포(CEF) RNA로부터 유도된 것으로서, 5'CGTCTCCCATGTTGTCTGTGC-TCAAAGC(서열번호 99)와 5'ATCATTCTCGAGTTGCGATTGGGGTTAGTTTG(서열번호 100)이며; 생성되는 cDNA 단편을 겔상 정제하고, BsmBI와 XhoI로 절단한 후, NcoI/XhoI 절단된 pEMC에 연결시켜, NP 단백질 ORF의 AUG가 CITE에 인접하도록 하였다. 상기 MUV P ORF의 증폭에 사용되는 프라이머는 5'TTCCGGGCAAGCCATGGATC(서열번호 101) 및 5'ATCATTCTCGAGAGGGAATCATTGTGGCTCTC(서열번호 102)이었다. 상기 P ORF cDNA(P mRNA를 생성하는 바이러스 폴리머라제에 의해 공전사적으로 삽입된 두 개의 G 뉴클레오타이드를 포함하도록 부위 특이적으로 돌연변이에 의해 변형됨)를 또한 pEMC 의 NcoI/XhoI 부위로 클로닝했다. 크기가 매우 커서, 상기 L 단백질 ORF는 다음의 두 단계로 조립 되었다; 프라이머 5'ATCATTCGTCTCCCATGGCGGGCCTAAATGAGATACTC(서열번호 103) 및 5'CTTCGTTCATCTGTTTTGGATCCG(서열번호 104)를 제 1 단계에 사용하여 cDNA 단편을 생성한 다음 이를 BsmBI와 BamHI로 트리밍하고 나서, pEMC의 NcoI/BamHI 부위로 클로닝시킨다. 제 2 단계에서, 프라이머 5′CAGAGT ACCTTATATCGGATCC(서열번호 105) 및 5′ATCATTCTGCAGGAATTTGGAT GTTAGTTCGGCAC(서열번호 106)를 사용하여 cDNA 단편을 증폭시키고 이를 상기 단계 1로부터의 플라스미드의 BamHI/PstI 부위 중으로 클로닝하여 L 단백질 ORF를 완성시킨다. 3개의 ORF 각각에 대한 4개의 cDNA 클론을 서열분석하고 Jeryl Lynn 컨센서스 뉴클레오타이드/아미노산 서열과 상동성이 최대 수준인 ORF를 구제 실험에 사용하기 위해 각각의 경우에서 선택한다.
1.C 합성 MUV 미니레플리콘의 작제
도 1에서, T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 정확한 MUV 5′말단 뉴클레오타이드로 전사를 개시하도록 디자인하고, HDV 리보자임 서열(Been 등)을 위치시켜 미니레플리콘 RNA 전사체에 정확한 MUV 3′말단 뉴클레오타이드를 생성시킨다. 듀플리케이트 T7 RNA 폴리머라제 종결 시그널이 HDV 리보자임 서열 뒤에 포함되었다. 박테리아 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) ORF는 MUV 게놈의 암호화 및 시스트론간 서열 전부를 대치한다; 잔류 필수 MUV 특이성 서열은 인접한 90nt NP 유전자 비해독 영역(UTR)을 갖는 3′MUV 리더(55nt), 및 137nt L 유전자 UTR에 인접한 5′MUV 트레일러(24nt)를 포함한다.
합성 MUV 미니레플리콘(MUVCAT)이 변형된 MUV 게놈을 나타내는 cDNA로부터 조립되며, 여기에서 모든 암호화 및 시스트론간 영역은 CAT ORF로 대치되었다. MUV 3′및 5 ′말단에 대한 cDNA를 각각 프라이머 쌍 5′ACCAAGGGGAGAATGAATATGGG(서열번호 107)/5 ′ATCATTCGTCTCTTTTCCAGGTAGTGTCAAAATGCC(서열번호 108), 및 5 ′ACCAAGGGGAGAA AGTAAAATC(서열번호 109)/5′ATCATTCGTCTCTATCGAATAAAGACTCTTCTGGC(서열번호 110)를 사용하여, 전체 감염 세포(CEF) RNA로부터 RT/PCR에 의해 증폭시킨다. PCR 증폭의 제 2 라운드에서, 네스팅된 프라이머는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터 및 간염 델타 바이러스(HDV) 리보자임 서열의 5′내지 NarI 부위를 각각 MUV 5′및 3′말단에 첨가하는 데 사용되며; 이들 프라이머는 5′AAGCTCGGCGGCCGCTTGTAATACGACTCACTATAACCAAGGGGAGAAAGTAAAATC(서열번호 111)/5′ATCATT CGTCTCTATCGAATAAAGACTCTTCTGGC(서열번호 112)이며; T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 첨가를 위해, 및 리보자임 성분의 첨가를 위해 5′ATCATTGGCGCCAGCGAGGAGGCTGGGACCATGCCGGCCACCAAGGGGAGAATGAATATGGG(서열번호 113)/5′ATCATTCGTCTCTTTTCCAGGTAGTGTCAAAATGCC(서열번호 114). 프라이머 5′TCATTCGTCTCGGAAAATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACC(서열번호 115) 및 5′ATCATTCGTCTCTCGATTTA CGCCCCGCCCTGCCACTC(서열번호 116)을 사용하여 CAT ORF cDNA를 증폭시킨다. 모든 3종류의 성분을 겔 정제하고, BsmBI으로 트리밍하며, 4 방향 연결로 함께 결합시킨 다음 변형된 pBSK S(+)(Sidhu 등, 1995)의 NotI/NarI 부위에 클로닝시켜 완전한 미니레플리콘 플라스미드 pMUVCAT를 생성시킨다.
1.D MUV에 대한 실 길이 게놈 cDNA의 작제
MUV의 실 길이 게놈 cDNA(pMUVFL)를 pMUVCAT의 작제에 사용되었던 동일한 플라스미드 백본 중으로 인접한 cDNA 단편을 연속 클로닝함으로써 5′말단에서 3′말단 방향으로 조립시킨다(도 2 참조). 각각의 cDNA 단편을 적당하게 고유한 제한 부위를 함유한 프라이머 쌍을 사용하는 RT-PCR에 의해 전 감염 세포 RNA로부터 증폭 시킨다; 각각의 경우에, + 센스 프라이머는 바이러스 특이성 엔도뉴클레아제 부위 외에도 5′근위 NotI 부위를 함유하여 단계별 클로닝 전략을 촉진한다. 바이러스 3′말단에서 BssHII 부위까지 스패닝하는 cDNA 단편을, 생장하는 실 길이 클론에 첨가하기에 앞서, pBluescript II SK(+)(Stratagene, 미국 캘리포니아 라 졸라 소재)에 별도로 조립시킨다. 제 1 단계에서, BssHII/ClaI cDNA 단편을 pBluescript의 ClaI/XhoI 부위 중으로, 5′연장 프라이머를 사용하여 클로닝시켜 바이러스 특이성 BssHII 부위에 인접한 XhoI 부위를 생성시킨다. 제 2 단계에서, ClaI cDNA 단편에 대한 바이러스 3′말단을 제 1 단계에서의 플라스미드의 NotI/ClaI 부위 중으로 클로닝하여 BssHII 서열에 대한 바이러스 3′말단을 완성시킨다. T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 바이러스 3′말단/ClaI 말단 단편을 생성하는 데 사용된 (+) 센스 RT/PCR 프라이머 중으로 혼입시킴으로써 바이러스 3′말단에 가한다. 게놈 cDNA의 5′말단 단편(BamHI/NarI)을 PCR 증폭의 제 2 라운드에서 별도로 변형시켜 5′말단을 HDV 리보자임 서열의 NarI 부위에 가한다. 전체 4번의 클로닝 사이클이 pMUVFL의 조립에 이용되며; 각 라운드 후에, 4개의 클론을 새로 첨가된 cDNA의 영역에서 서열분석하고 MUV 컨센서스 서열과 비교한다. 이어서, 최소수의 돌연변이를 갖는 cDNA 클론이 후속 cDNA 단편의 첨가를 위해 선택된다. 완전히 조립된 cDNA 클론을 재서열분석하여 박테리아 증폭 동안의 안정성을 증명한다. 일렉트로컴피턴트 SURE 세포(Stratagene, 미국 캘리포니아 라 졸라 소재) 및 DH5알파 세포(GibcoBRL, 미국 뉴욕 그랜드 아일랜드 소재)를 MUV cDNA의 클로닝을 위한 박테리아 숙주로 사용한다.
1.E 형질감염 세포로부터 CAT 활성의 구제
CAT 활성의 구제를 위하여, 세포를 MUV로 감염시킨 다음 시험관내 전사된 MUVCAT 미니레플리콘 RNA로 형질감염시키거나 MVA-T7으로 감염시킨 다음 pMUVNP, pMUVP 및 pMUVL 발현 플라스미드와 함께 pMUVCAT로 형질감염시킨다. 시험관내 전사는 제조업자의 프로토콜에 따라(Promega, 미국 위스콘신 매디슨 소재) 20 ㎕ 최종 용적으로 T7 RNA 폴리머라제에 대한 주형으로서 pMUVCAT 4 ㎍으로 수행된다; 이어서, 주형 DNA를 RQ-1 DNase로 분해시킨다. 6-웰 디쉬에서 대략 80% 융합까지 생장된 293 세포의 철야 배양액을 1 내지 2의 moi에서 MUV로 감염시키고; 1시간 후-감염(hpi)에서, 5 내지 10 ㎕의 시험관내 전사 반응(대략 5 내지 10 ㎍ RNA) 및 10 내지 12 ㎕의 LipofectACE(GibcoBRL)를 함유하는 혼합물을 제조업자의 프로토콜에 따라, 각각의 웰에 가한다. 48 hpi에서, 세포를 현탁액 중으로 스크래핑하고, 원심분리 수거하여, 0.25 M 트리스 완충액 pH 7.8 100 ㎕에 재현탁시킨 다음, 동결-해동의 3 라운드에 투입한다. 이어서, 청징화된 세포 추출물을 14C 표지 클로람페니콜(Sidhu 등, 1995) 또는 플루오레신 표지 클로람페니콜을 기질로(Molecular Probes. Eugene, Ore) 사용하여 CAT 활성에 대해 분석한 다음, 박층 크로마토그램 상에서 반응 산물을 분석한다.
MUV 헬퍼 바이러스의 부재하에서 CAT 활성의 구제를 위해, 293, Hep2 및 A549 세포를 밤새 6-웰 디쉬에서 생장시켜 대략 80% 융합이 되게 하고, MVA-T7으로 10 moi로 감염시킨 다음 200 ng pMUVCAT, 300 ng pMUVNP, 50 ng pMUVP, 200 ng pMUVL, 및 10 내지 12 ㎕의 LipofectACE를 함유하는 혼합물로 1 hpi 형질감염시킨다. 24 hpi에서, 형질감염 혼합물을 2 ml의 신선한 생장 배지로 대치한 다음 세포를 추가로 24시간 동안 배양하고, 이어서 전술한 바와 같이 세포 추출물을 제조하여 CAT 분석을 한다.
1.F 형질감염 세포로부터 감염성의 실 길이 MUV의 회수
cDNA로부터 감염성 MUV의 구제를 위해, 6-웰 디쉬에서 대략 90% 융합으로 밤새 생장시킨 A549 세포를 MVA-T7으로 4 moi로 감염시키고; 1 hpi에서 세포를 3 내지 7 ㎍ pMUVFL, 300 ng pMUVNP, 50 ng pMUVP, 200 ng pMUVL 및 14 ㎕의 Lipofectace를 함유하는 혼합물로 형질감염시킨다. 24 hpi에서, 형질감염 혼합물을 생장 배지(10% 태 송아지 혈청을 함유하는 DMEM)로 대치하고, 세포를 37℃에서 추가로 48시간 동안 배양하며; 이어서, 상등액(P1) 또는 현탁액 중으로 스크래핑한 전체 형질감염 세포 단일층을 융합성 A549 세포 단일층 상에 직접 옮겨, 이를 4일간 37℃에서 배양한 다음 전세포 ELISA(하기 참조)를 위해 제조하여 MUV 감염성 병소를 검출한다. 이들 A549 지시 세포로부터의 상등액(P2)을 융합성 베로 세포 단일층에 추가 계대시켜 37℃에서 3 내지 4일간 배양하여 MUV 유도된 합포체를 관찰한다.
1.G 구제된 MUV의 동정 및 입증
구제된 MUV(rMUV)의 초기 동정은 전세포 ELISA를 사용하여 수행되며; 형질감염 상등액(상기 참조)으로 감염된 A549 세포를 30분간 실온에서 1X 인산염 완충 생리식염수(PBS) 중에 10% 포름알데하이드로 고정시킨다; 이어서 세포를 PBS로 1회, 블로킹 용액(x1 PBS 중의 5%(w/v) 밀크)으로 1회 세정한 다음, 블로킹 용액 중 4℃에서 밤새 배양한다. 이어서, 철야 블로킹 용액을 제거하고 세포를 신선한 블로킹 용액에 1/400으로 희석한 MUV 폴리클로날 토끼 항혈청(Access Biomedical, 미국 샌디에고 소재)과 실온에서 2 내지 3시간 동안 배양시킨다. 이어서, 폴리클로날 항혈청을 제거하고; 세포를 블로킹 용액으로 5회 세정한 다음 블로킹 용액에 1/1000으로 희석한 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP) 접합 염소 항-토끼 혈청(DAKO Corporation, 미국 캘리포니아 카핀테리아 소재)과 실온에서 2 내지 3시간 배양한다. 이어서, 염소 혈청을 제거하고; 세포를 블로킹 용액으로 5회 및 PBS로 1회 세척한 다음, 충분량의 AEC 기질(DAKO Corporation)을 첨가하여 세포 단일층을 피복하고, 이어서 이를 37℃에서 15 내지 20분간 배양하여 염색의 전개를 촉진시킨다.
pMUVFL에만 존재하는 뉴클레오타이드 태그(실험실 생장 Jeryl Lynn MUV에는 존재하지 않음)가 (P2) rMUV로 감염된 베로 세포로부터 RT/PCR에 의해 증폭된 cDNA 단편의 서열 분석에 의해 rMUV에서 확인된다. RNA를 제조업자의 프로토콜에 따라 트리졸(GibcoBRL)로 추출하여 6-웰 디쉬 중의 감염 세포로부터 제조한다; 각각의 웰로부터의 전체 RNA의 1/5을 Titan 키트(Boehringer Mannheim, 미국 인디애나 인디애나폴리스 소재)에 대한 지시에 따라 RT/PCR 증폭을 위한 주형으로 사용하며, 프라이머 쌍은 3개의 분리된 뉴클레오타이드 태그 각각을 플랭킹한다. 생성되는 RT/PCR 단편을 전기용출에 의해 1% 아가로스 겔로부터 정제하고, 제조업자의 프로토콜에 따라 Applied Biosystems(ABI) 377 서열분석기(Applied Biosystems, Inc., 미국 캘리포니아 포스터 시티 소재)를 사용하여 서열분석한다.
실시예 2
형질감염 세포로부터 리포터 유전자 활성의 구제
cDNA로부터 감염성 멈프스 바이러스의 구제를 허용하게 될 시스템 정의를 돕기 위하여, CAT 리포터 유전자를 함유하는 멈프스 바이러스 미니레플리콘을 조립시킨다. 작제물을 T7RNA 폴리머라제 프로모터의 조절하에 음의 극성을 띠는 RNA 미니게놈의 합성을 허용하도록 디자인한다. T7 프로모터의 3개의 말단 G 잔기가 미니레플리콘의 작제 중에 제거되어 MUV 게놈의 정확한 5′뉴클레오타이드로 개시되는 전사 개시 부위를 제공한다. 미니레플리콘 작제물에 HDV 리보자임을 포함시키면 T7RNA 폴리머라제 전사체의 절단이 허용되어 신뢰할 만한 MUV 특이성 3′말단이 생성된다. MUVCAT 미니레플리콘 RNA 중의 뉴클레오타이드 총수(966)는 게놈 길이가 6의 배수가 아닐 경우, 효율적인 복제가 일어나지 않게 될 것임을 언급하는 Rule of Six(Calain and Roux, 1993)와 일치하여, 6으로 나누어질 수 있다. CAT 유전자의 발현은 MUV 특이성 프로모터의 조절하에 있으며, 미니레플리콘 RNA가 NP 단백질로 캡시드화된 다음 기능성 MUV 특이성 RNA 폴리머라제 단백질과 상호작용할 경우에만 일어날 수 있다.
CAT 활성의 구제는 두 개의 사이한 구제 시스템을 사용하여 관찰된다. 제 1 절차에서, 시험관내 전사된 MUVCAT RNA를 MUV로 사전에 감염시킨 293 세포 중으로 형질감염시킨다. 이러한 조건하에서, 구제된 CAT 활성은 통상적으로 비교적 낮지만, 재현가능하고 항상 백그라운드 수준보다는 높다(도 3a 참조). 패널 A1, A2 및 A3는 3개의 별도 구제 실험으로부터의 결과를 보여준다; 패널 A1, 레인 1은 시험관 내 전사된 pMUVCAT RNA 없이 형질감염된 MUV-감염 세포에서의 CAT 활성을 나타내고; 레인 2는 pMUVCAT로부터 시험관내 전사된 RNA로 형질감염된 MUV-감염 세포에서의 CAT 활성을 나타내며; 레인 3은 pMUVCAT-GG로부터 시험관내 전사된 RNA로 형질감염된 MUV-감염 세포에서의 CAT 활성을 나타내며; 레인 4는 pMUVCAT로부터 시험관내 전사된 RNA로 형질감염된 비감염 세포에서의 CAT 활성을 나타낸다. 패널 A1에 나타낸 각각의 CAT 분석은 37℃에서 3 내지 4시간 동안 대략 106 형질감염 세포로부터의 추출물 20%로 수행되었다. 패널 A2 레인 1은 pMUVCAT로부터 시험관 전사된 RNA로 형질감염된 MUV-감염 세포를 나타내고; 레인 2는 pMUVCAT로부터 시험관내 전사된 RNA로 형질감염된 비감염 세포를 나타낸다. 패널 A2에 나타낸 각각의 CAT 분석은 대략 106 형질감염 세포로부터의 추출물 50%를 사용하여 37℃에서 5시간 동안 수행된다. 패널 A3 레인 1은 pMUVCAT로부터 시험관내 전사된 RNA로 형질감염된 MUV 감염 세포를 나타내며; 레인 2는 시험관내 전사된 pMUVCAT RNA 없이 형질감염된 MUV-감염 세포를 나타내며; 레인 3은 pMUVCAT로부터 시험관내 전사된 RNA로 형질감염된 비감염 세포를 나타낸다. 패널 A3에 나타낸 각각의 CAT 분석은 대략 106 형질감염 세포로부터의 추출물 50%를 사용하여 37℃에서 4시간 동안 수행한다.
CAT 활성은 T7RNA 폴리머라제 프로모터에 통상 존재하는 3개의 부가적인 G 잔기 중 2개를 함유한 MUVCAT 작제물(pMUVCAT-GG)로부터는 구제될 수 없다. 그러나, 동일한 MUVCAT 작제물의 MUV 트레일러 영역에 존재하는 두 돌연변이는 이러한 관찰의 단정적인 해석을 방해한다. 이러한 실험으로부터의 결과는 MUV 게놈의 nt1- 145 및 nt15223-15384가 게놈 캡시드화, 전사 및 아마도 복제에 필요한 서열을 함유함을 시사한다. MUV 발현된 헬퍼 단백질의 존재하에 CAT 활성의 구제를 허용하는 미니레플리콘 서열을 규정함에 있어, 제 2 시스템은 pMUVCAT, pMUVNP, pMUVP 및 pMUVL을 포함한 형질감염 DNA로부터의 CAT 활성의 구제를 수행하도록 디자인된다. 이 시스템에서, MUV NP, P 및 L 단백질과 MUVCAT 미니레플리콘 RNA 전사체가 MVA-T7 유도된 T7RNA 폴리머라제의 조절하에, 293, Hep2, 및 A549 세포 내측에서 동시 발현된다. 293 세포에서 수행된 초기 실험은 CAT 구제가 효율적이고 재현가능함을 시사한다. CAT 구제의 증가된 효율이 293 세포에 대해 Hep2 세포에서 보였으며, 일련의 플라스미드 적정을 수행하여 형질감염 혼합물내 각 플라스미드의 상대량을 최적화한다. 6-웰 디쉬 중 하나의 웰로부터의 A549 세포 용해물 20%를 사용하여, 구제 효율의 추가 증가가 3시간 CAT 분석에서 기질의 거의 100% 전환율로, Hep2 세포에 대해 A549 세포에서 관찰되었다(도 3b). 이러한 결과는 pMUVNP, pMUVP 및 pMUVL로부터 발현된 MUV 헬퍼 단백질이 MUVCAT 안티센스 RNA 미니게놈의 캡시드화, 복제 및 전사에 충분함을 증명한다. 또한, CAT 구제에 대해 관찰된 최적 조건은 완전히 cDNA로부터 감염성 MUV의 구제를 위한 출발점을 제공한다.
실시예 3
형질감염 세포로부터 실 길이 멈프스 바이러스의 회수
실 길이 MUV cDNA를 T7 RNA 폴리머라제 프로모터의 조절하에 바이러스 게놈의 정확한 15,384nt + 센스 RNA 카피의 합성을 허용하도록 조립한다. MUVCAT 미니레플리콘으로 하였을 때와 같이, T7 RNA 폴리머라제 프로모터 서열을 변형시켜 3개 의 말단 G 잔기를 제거하면, 정확한 MUV 말단 뉴클레오타이드에서 개시되는 전사 개시 부위가 제공된다. HDV 리보자임을 사용하여 + 센스 게놈 전사체의 정확한 MUV 3′말단 뉴클레오타이드를 생성시킨다.
cDNA로부터 MUV를 회수하기 위하여, A549 세포를 T7 RNA 폴리머라제를 발현하는 MVA-T7으로 감염시킨 다음, pMUVFL, MUV NP, P 및 L 단백질을 발현하는 플라스미드로 형질감염시킨다. MUVCAT 미니레플리콘으로부터 리포터 유전자 활성의 구제에 대한 결과와 관련 루불라바이러스 SV5(He et al., 1997; Murphy and Parks, 1997)에 대한 유사 작업으로부터의 결과는 MUV NP, P 및 L 단백질이 T7 RNA 폴리머라제 생성된 + 센스 게놈 RNA 전사체를 캡시드화하고 복제한 다음 전사하는 데 충분할 것임을 시사하며, 단 모든 상호작용 성분은 작동 가능한 수준과 비율로 존재한다. A549 세포가 MUV 구제 실험을 위해 선택되었는데, 이유는 이들이 MUV 복제를 지원하고 시험된 타 세포주보다 더 효율적인 CAT 구제 활성을(잠재적으로는 더 효율적인 형질감염을 통해) 지원하며, 이들이 또한 MVA-T7 유도된 세포병리에 더욱 내성을 띠기 때문이다. 첫 번째의 성공적인 구제 실험에서, 형질감염 세포로부터의 상등액 배지(청징화하지 않음)를 신선한 A549 지시 세포에 옮긴다. 3개의 감염 병소가 지시 세포의 5개의 웰 중 하나에서 전세포 ELISA에 의해 관찰되었다(도 4). 이들 세포로부터의 상등액을 신선한 베로 세포 단일층에 계대시킨 뒤에, 3개의 합포체가 현미경하에서 관찰되었다. 이들 합포체 중 하나를 액체 플라크 선택으로서 배지 중으로 흡입시켜, 신선한 베로 세포 감염에 사용한다; 이어서 다수의 합포체가 상기 세포 단일층에서 관찰되며(도 5), 전 감염 세포 RNA를 구제된 바이러스의 동정을 위해 추출한다. 제 2 구제 실험에서, 적어도 10 내지 20개의 감염성 병소가 전세포 ELISA에 의해 염색된 지시 세포 상에서 보이는 바와 같이 형질감염 세포의 각각의 웰로부터 수득된다(도 5). 이러한 실험에서, 형질감염 혼합물로부터 pMUVL이 생략된 경우를 제외하고는 모든 웰이 구제된 바이러스를 함유하였으며, 이는 구제 과정이 매우 재현가능함을 시사한다. cDNA로부터 MUV의 구제에 대해 측정된 각 플라스미드의 최적 수준은 300 ng pMUVNP, 50 ng pMUVP, 200 ng pMUVL 및 3 내지 7 ㎍의 pMUVFL이다.
실시예 4
구제된 MUV의 동정
rMUV가 pMUVFL로부터 유도되었음을 증명하는 것이 중요하다. 이러한 과정은, 실 길이 게놈 cDNA의 조립 중에 RT-PCR 오혼입에 의해 도입된, pMUVFL 중의 3개 뉴클레오타이드 태그의 존재에 의해 가능하다. 이러한 태그는 Jeryl Lynn 백신 바이러스의 컨센서스 서열, 및 pMUVFL이 유도되는 Jeryl Lynn 백신 제제의 계대된 플라크 분리체 양자와 pMUVFL을 구별시킨다. 태그 중 둘은 각각 F 및 L 유전자내 뉴클레오타이드 6081과 11731에서의 사일런트 변화를 나타내고; 세 번째 태그는 pMUVFL의 L 단백질의 아미노산 22(뉴클레오타이드 위치 8502에 상응)에서 Lys의 Arg로의 치환을 일으킨다. rMUV가 실험실에서 생장시킨 다른 두 MUV 집단 중 하나로부터 생긴 것이 아니라 pMUVFL로부터 생겼음을 보이기 위하여, rMUV 감염-세포 RNA로부터 제조되고, 세 뉴클레오타이드 태그 각각을 스패닝하는 RT/PCR 산물을 적당한 위치에서 서열분석한다. 이들 RT/PCR 산물이 오로지 감염 세포 RNA로부터 유도되고, 미 량의 형질감염 플라스미드 DNA의 이월(carry-over)로부터 유도되지 않았음을 증명하기 위하여, 하나의 반응을 선행 역전사 없이 PCR 증폭을 위한 주형으로서 rMUV 감염 세포 RNA로 수행한다. RT/PCR 증폭으로부터의 결과, 및 이에 뒤이은 RT/PCR 산물의 서열분석을 도 6에 나타내었다. 전 RNA가 형질감염 세포로부터의 P2 rMUV 바이러스로 감염된 베로 세포 단일층으로부터 제조된다. RT/PCR 반응을 셋업하여 pMUVFL과 rMUV에만 존재하는 3개의 분리된 뉴클레오타이드 태그 부위를 스패닝하는 cDNA 산물을 생성시킨다. 레인 1은 마커 1 kb 래더(Gibco/BRL)를 나타내고; 레인 2, 3 및 4는 뉴클레오타이드 태그 위치 6081, 8502 및 11731을 각각 스패닝하는 RT/PCR산물을 나타낸다. 이들 RT/PCR 산물이 오염성 플라스미드 DNA로부터 유도되지 않았음을 증명하기 위하여, 레인 4에 나타낸 cDNA의 생성에 사용된 것과 동일한 반응을 RT 없이 수행한다; 이러한 반응의 산물은 레인 5에 나타내었다. 형질감염 혼합물로부터 pMUVL이 생략되었을 때 rMUV가 회수될 수 없음을 증명하기 위하여, 레인 4에 나타낸 cDNA 산물의 생성에 사용된 것과 동일한 RT/PCR 반응을 pMUVL 없이 수행된 형질감염으로부터 유도된 베로 세포 RNA를 사용하여 셋업시킨다; 이 반응으로부터의 산물을 레인 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 RT/PCR 산물로부터 생성된 컨센서스 서열 데이터는 구제된 MUV가 MUV의 실 길이 게놈 cDNA에만 존재하는 동일한 뉴클레오타이드 태그를 함유하였음을 명백히 보여준다(도 7). 실 길이 cDNA 클론과 플라크 분리체 4(PI 4) 간의 뉴클레오타이드 및 아미노산 차이의 리스트 및 Jeryl Lynn 스트레인의 컨센서스 서열(서열번호 1)에 대해 도 8의 표 1 참조.
상기 실시예의 견지에서, 감염성 멈프스 바이러스가 바이러스 게놈의 DNA 카피로부터 생성되었음이 결론 내려진다. 이러한 절차는 MUV NP, P 및 L 단백질을 암호화하는 플라스미드와, 멈프스 바이러스의 완전한 게놈 cDNA를 함유하는 플라스미드로 MVA-T7-감염 A549 세포를 동시 형질감염시킬 것을 요한다. 이러한 과정의 성공은 완전 멈프스 바이러스 게놈(Jeryl Lynn 스트레인)에 대한 컨센서스 서열의 발생 및 멈프스 바이러스 미니레플리콘 구제 시스템의 새로운 발생시에 일어날 수 있다.
주의: 실 길이 작제물에서 L 단백질의 아미노산 22에서 Lys의 Arg로의 치환은 구제된 멈프스 바이러스의 수득을 막지 못한다.
실시예 5
하나 이상의 이종 유전자에 대한 발현벡터로서 멈프스 바이러스
하기 실험은 발현벡터로서 멈프스 바이러스를 설정한다. 이러한 양태는 하나 이상의 리포터 유전자를 발현하는 감염성 재조합 멈프스 바이러스의 회수에 의해 증명된다.
베타-갈락토시다제 유전자, 반딧불이 루시퍼라제 유전자, 또는 반딧불이 루시퍼라제 유전자와 CAT 유전자를 함유하는 재조합 멈프스 바이러스의 작제
이종 유전자 또는 외래 유전 정보를 멈프스 바이러스 게놈 중으로 삽입되도록 하기 위하여, 부위 지향성 돌연변이유발을 이용하여 실 길이 게놈 cDNA에 고유한 AscI 제한 엔도뉴클레아제 부위를 생성시킨다. AscI 부위를 M 유전자의 5′비-암호화 영역(게놈 뉴클레오타이드 4451-4458)에 위치시켜, 멈프스 바이러스의 적당 한 플랭킹 조절 서열과 말단 AscI 부위를 함유하는 부수적인 이종 유전자를 바이러스 M과 F 유전자 사이의 멈프스 게놈 중으로 통합시켜, 외래 유전자를 발현할 수 있는 신규한 감염성 멈프스 바이러스 재조합체를 생성시킬 수 있다. 베타-갈락토시다제 유전자 또는 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 함유하는 멈프스 바이러스 재조합체를 작제한다(도 11 참조). 루시퍼라제 해독 개시 코돈에 인접한 EMC 바이러스 CITE를 함유하는 다른 재조합 멈프스 바이러스도 해독 개시를 위한 정상 멈프스 바이러스 시스-작용 조절 요소를 이용하는 루시퍼라제-함유 재조합체에 의해 생성된 단백질(루시퍼라제) 수준과 비교하기 위해 작제한다.
루시퍼라제 유전자의 ATG 및 UAA에 인접하여 멈프스 바이러스 특이성 서열(각각, 게놈 뉴클레오타이드 4459-4538 및 4392-4449)을 혼입한 프라이머를 사용하여, 네스팅된 PCR의 2 라운드에 의해 멈프스 바이러스 게놈 중으로 삽입을 위해 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 제조한다. 이러한 과정에서, 게놈 뉴클레오타이드 4450은 최종 루시퍼라제-함유 재조합 게놈에 "rule-of-six"를 유지하기 위하여 PCR-생성된 DNA 단편으로부터 결실된다; 또한, 동일한 DNA 단편에서, 게놈 뉴클레오타이드 4539-4545는 루시퍼라제 ATG의 상류에서 통상적으로 발견되는 7개의 뉴클레오타이드에 의해 대치된다. 최종 PCR 산물에 존재하는 말단 AscI 부위는 멈프스 바이러스 게놈 중으로 루시퍼라제 유전자 및 플랭킹 멈프스 바이러스 특이성 서열의 첨가를 촉진한다. 이와 마찬가지로, 베타-갈락토시다제 유전자를 함유하는 분리된 멈프스 바이러스 재조합체를 작제한다. 베타-갈락토시다제 유전자 및 플랭킹 멈프스 바이러스 특이성 서열을 혼입하는 PCR-생성된 DNA 단편은 루시퍼라제-함유 DNA 단편에서와 같이 게놈 뉴클레오타이드 4450이 동일하게 결실되었다. 그러나, 제 2 TAA 트리뉴클레오타이드를 베타-갈락토시다제 유전자의 정상 TAA 해독 종결 코돈에 인접하게 혼입시켜, 최종 재조합 멈프스 바이러스 게놈에 "rule-of-six"를 보존시킨다. 또한, 루시퍼라제-함유 작제물과는 달리, 베타-갈락토시다제 ATG를 플랭킹하는 7개의 상류 뉴클레오타이드(게놈 뉴클레오타이드 4539-4545)는 멈프스 바이러스 특이성이다. 루시퍼라제 유전자의 ATG에 인접한 EMC 바이러스 CITE를 함유하는 세 번째 멈프스 바이러스 재조합체도 작제한다. 루시퍼라제 유전자만을 함유하는 재조합체에 대해서와 같이, 네스팅된 PCR 반응을 이용하여 각각 CITE 및 루시퍼라제 유전자의 5′및 3′말단에서 멈프스 바이러스 특이성 서열을 별도로 첨가한다. 3방향 연결에서, CITE의 3′말단 및 루시퍼라제 유전자의 5′말단을 NcoI 제한 엔도뉴클레아제 부위에 결합시킨 다음 멈프스 바이러스 게놈의 AscI 부위에 가한다. 게놈 뉴클레오타이드 4450이 결실되었고, 트리뉴클레오타이드 ACT가 PCR 중에 CITE의 5′말단에 첨가되어 생성되는 재조합 멈프스 바이러스내 "rule-of-six"를 보존시킨다.
두 분리된 전사 단위로서, 또는 폴리시스트론의 제 2 유전자(루시퍼라제)의 해독을 위한 내부 리보솜 유입 부위로서 EMC CITE를 함유하는 단일 전사 단위로서, CAT 유전자 및 루시퍼라제 유전자 모두를 함유한 멈프스 바이러스 재조합체를 작제한다(도 12 참조). 네스팅된 PCR를 사용하여 두 DNA 단편을 생성시키며, 그 중 하나는 CAT 유전자를 함유하고 다른 하나는 루시퍼라제 유전자를 함유하며, 각각은 적당한 멈프스 바이러스 특이성 유전자간 cDNA 서열로 플랭킹된다. 이들 단편 둘 모두를 결합시킨 다음 앞서 단일 리포터 유전자의 삽입에 사용된 AscI 부위를 통해 멈프스 바이러스 게놈 cDNA에 연결시킨다. 이와 마찬가지로, 네스팅된 PCR을 이용하여 CAT 유전자 및 루시퍼라제 유전자에 융합된 EMC CITE를 함유하는 DNA 단편을 별도로 생성시키며, 각각은 적당한 멈프스 바이러스 특이성 유전자간 cDNA 서열로 플랭킹된다. 두 DNA 단편을 결합시킨 다음 멈프스 바이러스 게놈 cDNA의 AscI 부위 중으로 연결시킨다. 두 게놈 작제물내 리포터 유전자의 순서는 5′CAT-LUC 3′및 5′CAT CITE LUC 3′였다.
멈프스 바이러스 재조합체의 구제
재조합 멈프스 바이러스 게놈을 함유하는 플라스미드를, 실시예 3에서 전술한 바와 같이, 멈프스 바이러스 NP, P 및 L 단백질을 발현하는 지지 플라스미드와 함께 MVA-T7-감염 A549 세포 중으로 형질감염시킨다. 형질감염 세포로부터의 전체 구제된 바이러스를 먼저 신선한 A549 세포에서 증폭시키고(계대 1), 이어서 베로 세포에서 증폭시킨다. 계대 3에서, 구제된 바이러스를 리포터 유전자 활성에 대해 분석한다.
리포터 유전자 활성의 분석
멈프스 바이러스 재조합체로 감염시킨 세포의 추출물에서 또는 감염 세포 단일층의 세포학적 염색에 의해 리포터 유전자 활성을 측정한다. 루시퍼라제 유전자, 또는 EMC 바이러스 CITE에 융합된 루시퍼라제 유전자를 함유하는 멈프스 바이러스 재조합체로 감염된 세포로부터의 추출물을 광도계(Analytical Luminescence Laboratory, Monolight 2010)에서 루시퍼라제 활성에 대해 분석한다. 세포 추출물 의 제조 및 루시퍼라제 분석을 Enhanced Luciferase Assay Kit(Pharmingen, 미국 캘리포니아 샌디에고 소재)에 대한 제조업자의 프로토콜에 따라 수행한다. 베타-갈락토시다제 유전자를 함유하는 멈프스 바이러스 재조합체로 감염된 세포로부터의 추출물을 베타-gal 염색 키트(Promega, 미국 위스콘신 매디슨 소재)에 대한 프로토콜에 따라 세포학적 염색에 의해 분석한다. CAT 활성의 측정을 상기 실시예에서 전술한 바와 같이, 감염 세포의 동결-해동 용해물에 대해 수행한다.
멈프스 바이러스에 의한 반딧불이 루시퍼라제의 발현
활발한 루시퍼라제 활성이 구제 바이러스로 감염된 세포의 추출물에서 검출되었다. 각 경우에서, 구제 바이러스는 반딧불이 루시퍼라제 유전자만을 함유하거나 직렬로 CAT 유전자와 루시퍼라제 유전자를 모두 함유하는 재조합 멈프스 바이러스 게놈 cDNA로부터 유도되었다. 참조: 도 14(CAT와 루시퍼라제 유전자를 모두 함유하는 rMUV로 감염된 베로 세포의 추출물에 존재하는 CAT 활성을 보여주는 박막 크로마토그램). 1 전사 단위로서 CAT와 루시퍼라제 유전자를 함유하는 재조합 바이러스(rMUVC/C/L)가 CAT 분석 전에 전체 구제 바이러스로부터 플라크 정제되었다(1X). 각 전사 단위로서 CAT와 루시퍼라제 유전자를 함유하는 구제 재조합 바이러스(rMUVC/L)는 플라크 정제 없이 전체 집단으로 분석되었다. 도 14에 나타나 있는, 베로 세포 추출물에서의 루시퍼라제 활성 또한 rMUVC/C/L 및 rMUVC/L 바이러스 재조합체 모두에 대해 측정되었다.
또한, 하기의 표 5는 플라크 정제 연속 3회로 구제 바이러스 집단으로부터 분리된, 루시퍼라제 유전자를 함유하는 멈프스 바이러스 재조합체(rMUV LUC 및 rMUV CITE-LUC)의 클론 집단의 상대 광 단위(RLU) 판독을 보여준다. 표 5에 나타나 있는 바와 같이, 멈프스 바이러스 재조합체에 의한 루시퍼라제 발현의 활발한 활성은, 재조합 게놈(들)으로부터 1 이상의 이종 유전자를 발현하는 멈프스 바이러스의 잠재력을 명확하게 입증한다.
rMUVLUC 및 rMUVCITE-LUC에 의해 생성된 루시퍼라제의 정량
바이러스 RLU* LUC(pg) 전체 LUC(ng) LUC/세포(fg)
rMUVLUC-2 2.9 ×105 8.7 pg 300 ng 150 fg
rMUVLUC-3 1.3 ×105 7.9 pg 170 ng 85 fg
rMUVLUC-4 2.0 ×105 8.3 pg 400 ng 200 fg
rMUVCITE-LUC-1 0.9 ×105 6.7 pg 190 ng 95 fg
rMUVCITE-LUC-2 0.2 ×105 3.2 pg 180 ng 90 fg
rMUVCITE-LUC-4 1.1 ×105 7.7 pg 190 ng 95 fg
RMUV 0 0 0 0
* 104 투입 pfu로 표준화된 두 단일층 감염의 평균

멈프스 바이러스에 의한 베타-갈락토시다제의 발현
베타-갈락토시다제를 함유하는 구제 멈프스 바이러스가 동정되었다. 구제 바이러스는 베타-갈락토시다제 유전자를 함유하는 재조합 멈프스 바이러스 게놈 cDNA로부터 유도되었다. 베타-갈락토시다제 활성은 재조합 멈프스 바이러스에 의해 감염된 다음, 직접적인 세포학적 염색된 세포에서 명백하다. 베타-갈락토시다제 활성의 진한 청색 염색은 베타-갈락토시다제 유전자를 함유하는 재조합 멈프스 바이러스로 감염된 세포에서만 나타난다. 추가의 이종 유전자를 함유하지 않는 구제 멈프스 바이러스는 동일한 염색 분석에서 투명한 플라크를 생성하였다(참조: 도 15). 재조합 멈프스 바이러스에 의한 베타-갈락토시다제의 발현 활성은 추가로 멈프스 바이러스 전사 프로모터의 조절하에 비교적 많은 이종 유전자를 발현하는 멈프스 바이러스의 능력을 입증하였다.
실시예 6
JL5과 JL2의 컨센서스 서열의 결정
멈프스 바이러스의 Jeryl Lynn 백신 스트레인은 두 가지의 각 변이체(JL5 및 JL2)로 이루어지는 것으로 나타났다(Afzal et al., 1993). JL5 및 JL2로 불리는, 두 변이체는 백신 제제에서 약 1 JL2 대 5 JL5의 비로 존재하는 것으로 나타났다. 이들 변이체는 SH 및 HN 유전자 근처의 게놈에서 서열 차이가 있기 때문에, 이 차이가 각각의 순수한 집단을 분리하여 전체 게놈을 서열분석함에 의한 유전자 수준으로의 변이체 구별에 사용된다.
멈프스 바이러스 Jeryl Lynn 스트레인으로부터 JL5 및 JL2 변이체의 분리
멈프스 바이러스 Jeryl Lynn 스트레인이 1 계대 동안 병아리 배아 섬유아세포(CEF)에서 직접 배양되었다. 이 바이러스 스톡은 이어서 10배 증분으로 연속 희석되어 6-웰 플레이트에서 융합성 CEF를 감염시키는 데 사용된다(Becton Dickinson, 미국 뉴저지 프랭클린 레이크스 소재). 세포는 실온에서 1½시간 동안 요동시킴으로써 감염시킨다. 이어서 각 웰의 접종원이 아가로스 오버레이(0.9% 아가로스[FMC Bioproducts, Seaplaque, 미국 메인 로크랜드 소재], 최소 필수 배지[MEM], 비필수 아미노산 0.2 mM, 페니실린/스트렙토마이신 0.2 mg/㎖, 2% FBS 및 0.3375% 나트륨 비카보네이트 함유)로 대체된다. 오버레이가 실온에서 응고된 후에, 감염된 세포는 플라크가 육안으로 및 광학현미경으로 보일 때까지 37℃에서 6 내지 8일간 배양된다.
바이러스를 함유하는 각 플라크가 멸균 파스퇴르 피펫(VWR Scientific, 미국 뉴욕주 뉴욕시 소재)을 사용하여 분리되어 각 플라크 상의 아가로스 플러그가 제거된다. 분리된 플라크를 배지(2% FBS, HEPES 20 mM 및 페니실린/스트렙토마이신 0.1 mg/㎖가 보충된 MEM) 1 ㎖에 두고, 진탕시킨 다음, 2차 플라크 정제를 위해 감염시키는 데 사용된다. 후속 단계를 위해, 각 희석된 플라크 10, 50, 75, 100 또는 200 ㎕가 6-웰 플레이트에서 신선한 세포를 감염시키는 데 사용된다. 감염, 오버레이 및 플라크 분리는 전술한 바와 같이 수행된다. 플라킹 2 라운드로부터 바이러스를 분리한 후에, 과정이 3회 반복된다.
3 라운드 플라크로부터 분리된 바이러스를 4 내지 6일간 37℃에서, 6-웰 플레이트에서 CEF 상에서 증식시켜 스톡이 제조된다. 이어서 바이러스는 T-25 플라스크에서 CEF 상에 증식시킴으로써 팽창된다. 감염된 세포가 최고 세포병원성을 보이는 때인 5 내지 7일 후에, 바이러스가 수확되어 -80℃에서 동결 보관된다.
분리 변이체의 RT-PCR 및 서열분석
RNA 분리 및 RT-PCR이 실시예 1.A.의 "바이러스 RNA의 분리, 증폭 및 서열분석" 단락에 설명된 바와 같이 수행된다. 하기의 유전자-특이성 프라이머는 SH 및 HN 유전자 일부를 증폭시키는 데 사용된다: 6223TGAATCTCCTAGGGTCGTAACGTC6246(서열번호 27) 및 8969ACCCACTCCACTCATTGTTGAACC8946(서열번호 69). 증폭 산물은 1% 아가로스 상에서 겔-정제되고 Wizard PCR 정제 키트(Promega, 미국 위스콘신 매디슨 소재)를 사용하여 겔 슬라이스로부터 분리된다. 이어서 증폭 산물은 SH 유전자 영역에서 서열분석되어[프라이머 6223TGAATCTCCTAGGGTCGTAACGTC6246(서열번호 27), 6783GGATGATCAATGATCAAGGC6802(서열번호 30), 7325CATCACTGAGATATTGGATC 7306(서열번호 74), 6909GATACCGTTACTCCGTGAAT6980(서열번호 75) 사용] JL5 또는 JL2로 동정된다.
SH 유전자 영역에서의 예비 서열분석이 수행되어 정제된 바이러스가 JL5인지, JL2인지를 규정한다. 초기에, 모든 삼중-플라크-정제된 바이러스는 JL5에 매치된다. JL2 분리체를 수득하기 위해서는, 1회 플라크-정제되어 동결 보관된 바이러스가 RT-PCR에 의해 스크리닝되고 SH 유전자 영역에서 서열분석되어 이들이 JL2인지, JL5인지 결정된다. 이 방법으로 JL2-함유 플라크로 동정된 두 분리체는 추가의 2회 연속 플라크 정제에 가해진다. 상기와 같이, 이러한 분리체는 CEF에서 2회 팽창된 다음 RNA 추출, 증폭 및 서열분석된다.
각 플라크 분리체를 JL5 또는 JL2로 규정한 후에, 각 변이체의 두 개별 분리체가 전체 게놈의 서열분석을 위해 선택된다. RT-PCR이 전체 게놈을 스패닝하는 단 편을 증폭시키기 위해 하기의 프라이머 쌍을 사용하여 분리된 RNA로 수행된다:
Figure 112002003496918-pct00003
증폭 산물은 실시예 1.A.의 "바이러스 RNA의 분리, 증폭 및 서열분석" 단락에서 설명된 바와 같이 정제되고 서열분석된다. 각 바이러스 분리체의 게놈 말단 서열을 결정하기 위해, RNA 말단이 연결된 다음 연결점에 걸쳐 RT-PCR을 수행하고, 서열분석된다(실시예 1.A.에 설명된 바와 같음).
서열은 Sequencher 소프트웨어(Genecodes, 미국 미시간 앤 아버 소재)를 사용하여 정렬된다. JL5 및 JL2 서열은 각 변이체에 대해 두 서열분석된 플라크 분리체를 비교함으로써 측정된 컨센서스를 나타낸다. 정제된 JL5 및 JL2 바이러스는 실시예 1.A.의 표 4에 수록된 동일한 일련의 프라이머로 서열분석된다. 두 변이체 모두에 대해서, 두 개별 플라크 분리체가 완전히 서열분석된다(참조: JL5과 JL2의 각 컨센서스 서열에 대해서 서열번호 11 및 12, 각각 플라크 2). 예상한 바와 같이, 약간의 서열 차이가 두 JL5 플라크 분리체(참조: 표 6)와 두 JL2 플라크 분리체(참 조: 표 7) 사이에 관찰되었다. JL5 플라크 1과 2의 컨센서스 서열은 각각 4 및 3 뉴클레오타이드에 의해 Jeryl Lynn 컨센서스 서열과 상이하였다(표 6 참조).
JL2의 서열은 표 8에 요약된 바와 같이, 전체 게놈에 걸쳐서, JL5와 413 가지의 차이점을 가진다. 이들 차이점 중 5 가지는 바이러스 5' 또는 3' 리더 서열에 있다. 360 가지의 서열 차이점 모두는 바이러스 유전자의 암호화 영역에 있지만; 이들 차이점 중 73 가지 만이 아미노산 차이를 암호화한다. 나머지 48 가지 서열 차이점은 바이러스 유전자의 비암호화 영역에 있다. 유전자간 영역 또는 내부 시스-작용 시그널(즉, 유전자 개시 또는 유전자 종결 시그널)에는 서열 차이가 없음이 주목된다.
JL5의 플라크 분리체 간의 서열 차이
위치 Jeryl Lynn 컨센서스 JL5 플라크 1 JL5 플라크 2 아미노산 유전자/AA 위치
1405 G A A pro(사일런트) N/420
1685 T C C tyr(T) 또는 his(C) N/514
1703 T A T ser(T) 또는 thr(A) N/520
9619 T C C phe(사일런트) L/394






JL2에 대한 플라크 분리체 간의 서열 차이
위치 Jeryl Lynn 컨센서스 JL2 플라크 1 JL2 플라크 2 아미노산 유전자/AA 위치
4 A C A NA 리더
3352 A C A gln(A) 또는 his(C) M/30
3508 T T C val(T) 또는 ala(C) M/82
3517 T T C val(T) 또는 ala(C) M/85
13467 A G A lys(A) 또는 arg(G) L/1677

JL5와 JL2 간의 서열 차이의 요약
유전자 JL5와 JL2 간의 차이
비암호화 영역 3′말단 5′말단 암호화 사일런트
리더 4 - Na na
NP 3 9 8 30
P 2 2 14 22
M 2 1 5 17
F 2 6 12 33
SH 1 6 5 5
HN 4 3 16 35
L 0 7 13 145
트레일러 - 1 Na na
총계 18 35 73 287
na = 해당 없음

실시예 7
Jeryl Lynn 백신에서 JL5와 JL2의 상대적 풍부성의 측정
Jeryl Lynn의 백신 로트내 JL5 대 JL2의 상대비를 측정하기 위하여, 두 변이체 간의 제한 엔도뉴클레아제 다형성에 기인한 서열 차이를 이용한 분석이 개발되 었다. 분석방법은 PCR 및 제한 엔도뉴클레아제 절단에 의한 돌연변이 분석으로 불린다(MAPREC). 위치 3828에서(안티게놈 센스), JL5 게놈내 BssH II 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위가 존재한다. JL2에서, 이 부위에서의 G 내지 A 뉴클레오타이드 변이는 BssH II 인식의 부족을 초래한다. JL5 및 JL2의 혼합 집단으로부터의 RNA를 분리하고 이 부위를 둘러싸는 프라이머를 사용하여 증폭시키면, 254 염기쌍 산물이 생성된다. 사용된 프라이머는 프라이머
3708CAGGCCAGCGCCGATAAATATG3729(서열번호 117) 및
3962AATGACACCCTTCTCCATCAGGG3941(서열번호 118)이다. 프라이머는 두 JL5 및 JL2 모두에 동일한 서열을 함유하였다; 따라서, 두 변이체 중 하나로부터의 단편은 동일 확률로 증폭될 것으로 기대된다. 또한, 상기 수록된 제 1 프라이머는 이의 5 ′말단에 플루오레신을 함유한다. 플루오레신 처리된 단편을 BssH II로 절단하고, 아크릴아미드 겔 상에서 분리시킨다. FluorImager를 사용하여 겔을 스캐닝하고 각각 JL5와 JL2를 나타내는 절단 및 비절단 산물의 상대적 풍부성을 정량한다. BssH II로 절단하면 JL5에 대해서는 120 염기쌍 형광 산물이, JL2에 대해서는 254 염기쌍(즉, 비절단) 형광 산물이 남는다.
멈프스 바이러스 Jeryl Lynn(Mumpsvax 로트 # 0656J, Merck and Co., Inc., 미국 펜실베이니아 웨스트 포인트 소재)의 10개의 백신 바이얼로부터 RNA를 분리한다. RNA를 (상기 프라이머를 사용하여) 증폭시키고 PCR 산물을 BssH II로 분해하고, 겔 상에 분리시킨 다음, FluorImager 상에서 스캐닝한다. BssH II(Roche Molecular Biology, 미국 인디애나 인디애나폴리스 소재) 5 단위를 PCR 반응 믹스 1/5에 가하고 50℃에서 2시간 30분간 배양함으로써 효소 분해시킨다. 이어서, 절단 산물을 6% 아크릴아미드 겔 상에서 분리시킨 다음 FluorImager(Molecular Dynamics, 미국 캘리포니아 서니베일 소재)를 사용하여 스캐닝한다.
스캐닝된 이미지를 ImageQuant 소프트웨어(Molecular Dynamics, 미국 캘리포니아 서니베일 소재)를 사용하여 정량한다. 대조군 시리즈를 표준으로 사용한다; 이들 샘플은 역가를 기준으로 한 하기 비율: 99% JL5/1% JL2, 95% JL5/5% JL2, 85% JL5/15% JL2, 및 75% JL5/25% JL2로 혼합된 순수한 JL5 및 JL2 바이러스로 이루어진다. RNA를 혼합 바이러스로부터 분리하고 MAPREC 절차에 사용한다. 이들 대조군으로부터의 결과를 이용하여 분석을 위한 표준곡선을 생성시키고, 이를 사용하여 백신 혼합물내 JL5와 JL2의 상대%를 측정한다. 또한, 비분해 JL5 PCR 산물의 2배 희석액 시리즈를 사용하여 FluorImager 상에서 측정한 결과의 직선 범위를 측정한다. 또한, 순수한 JL2 바이러스 RNA를 음성 대조군으로 사용하고 순수한 JL5 바이러스 RNA를 양성 대조군으로 사용한다. 순수한 JL5 샘플은 BssH II 효소의 효율을 측정하기 위한 대조군으로서의 역할을 한다. MAPREC 분석 및 정량을 재현하기 위해 3회 반복한다. 결과를 3회 실험에 걸쳐 평균을 낸다. 도 13은 대표적인 스캐닝된 겔 이미지를 도시한다. 절단 및 비절단 산물을 화살표로 표시하였다. 비절단 산물은 JL2에 상응하며, 254 염기쌍 길이인 반면에, 절단 산물은 JL5에 상응하며 120 염기쌍 길이이다. 각각의 스캐닝된 겔에 대한 상대적 풍부성을 정량하기 위해, 값을 먼저 백그라운드 형광에 대해 및 순수한 JL5 대조 샘플내 비분해 DNA의 양에 대 해 보정한다. 분해된 DNA의 양을 분해 및 비분해 DNA의 총량으로 나누고, 그 값에 100%를 곱함으로써 % JL5 값을 측정한다. 각각의 실험에 대해, 혼합된 JL5 및 JL2 바이러스 세트로부터의 RNA를 사용하여 표준 곡선을 생성시킨다. 백신 샘플에 대한 기술된 계산의 결과를 표준 곡선 상에 작도하여 표 9에 나타낸 값을 수득한다. 최종 칼럼에, 각 백신 샘플에 대한 평균이 3회 실험에 대해 주어졌다. 10개의 백신 샘플에 대한 전체 평균은 최종 칼럼내 결과를 평균하여 생성되며 표의 바닥에 나타내었다.
표 9는 당해 분석에 사용된 Mumpsvax의 10개의 백신 바이얼에 대한 결과를 요약한다. 이들 샘플에 대한 백신내 두 변이체의 상대적 풍부성은 73.1% JL5/26.9% JL2 내지 76.1% JL5/23.9% JL2 범위내에 있었다. 모든 3가지 실험에 대한 모든 10개의 백신 샘플에 대한 전체 평균은 73.9% JL5/26.1% JL2였다.
Mumpsvax 샘플내 JL5 및 JL2의 상대적 풍부성
Mumps Vax 샘플 실험 1 (% JL5/% JL2) 실험 2 (% JL5/% JL2) 실험 3 (% JL5/% JL2) 평균 (% JL5/% JL2)
1 73.7/26.3 72.5/27.5 74.5/25.5 73.6/26.4
2 74.1/25.9 72.0/28.0 73.3/26.7 73.1/26.9
3 73.0/27.0 76.8/23.2 73.3/26.7 74.4/25.6
4 73.9/26.1 75.1/24.9 71.2/28.8 73.4/26.6
5 74.6/25.4 73.9/26.1 70.9/29.1 73.1/26.9
6 76.0/24.0 76.3/23.7 69.8/30.3 74.0/26.0
7 77.2/22.8 75.9/24.1 70.4/29.6 74.5/25.5
8 76.2/23.8 74.8/25.2 68.7/31.3 73.2/26.8
9 79.1/20.9 72.1/27.9 77.0/23.0 76.1/23.9
10 78.8/21.2 73.0/27.0 69.7/30.3 73.8/26.2
전체 평균: 73.9/26.1

하기에 본원에서 인용되는 참조문헌을 수록한다.
참조문헌
Figure 112002003496918-pct00004
Figure 112002003496918-pct00005
Figure 112002003496918-pct00006
Figure 112002003496918-pct00007
Figure 112002003496918-pct00008
Figure 112002003496918-pct00009
<110> American Home Products Corporation Clarke, David K Johnson, Erik J Mohinderjit, Sidhu S Udem, Stephen A <120> Rescue of Mumps Virus from cDNA <130> AM100070-PCT (SEQ) <140> not assigned <141> 2000-08-02 <150> 60/146664 <151> 1999-08-02 <150> 60/213654 <151> 2000-06-23 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15384 <212> DNA <213> Mumps virus <400> 1 accaagggga gaatgaatat gggatattgg tagaacaaat agtgtaagaa acagtaagcc 60 cggaagtggt gttttgcgat ttcgaggccg agctcgatcc tcaccttcca tcgtcgctag 120 ggggcatttt gacactacct ggaaaatgtc atctgtgctc aaggcatttg agcggttcac 180 gatagaacag gaacttcaag acaggggtga ggagggttca attccaccgg agactttaaa 240 gtcagcagtc aaagtcttcg ttattaacac acccaatccc accacacgct atcagatgct 300 aaacttttgc ttaagaataa tctgcagtca aaatgctagg gcatctcaca gggtaggtgc 360 attgataaca ttattctcac ttccctcagc aggcatgcaa aatcatatta gattagcaga 420 tagatcaccc gaagctcaga tagaacgctg tgagattgat ggttttgagc ctggtacata 480 taggctgatt ccaaatgcac gcgccaatct tactgccaat gaaattgctg cctatgcttt 540 gcttgcagat gacctccctc caaccataaa taatggaact ccttacgtac atgcagatgt 600 tgaaggacag ccatgtgatg agattgagca gttcctggat cggtgttaca gtgtactaat 660 ccaggcttgg gtaatggtct gtaaatgtat gacagcgtac gaccaacctg ccgggtctgc 720 tgatcggcga tttgcgaaat accagcagca aggtcgcctt gaggcaagat acatgctgca 780 accggaggcc caaaggttga ttcaaactgc catcaggaaa agtcttgttg ttagacagta 840 ccttaccttc gaactccagt tggcgagacg gcagggattg ctatcaaaca gatactatgc 900 aatggtgggt gacatcggaa agtacattga gaattcaggc cttactgcct tctttctcac 960 tctcaaatat gcactaggga ccaaatggag tcctctatca ttggctgcat tcaccggtga 1020 actcaccaag ctccgatcct tgatgatgtt atatcgaggt ctcggagaac aagccagata 1080 ccttgctctg ttagaggctc cccaaataat ggactttgca cccgggggct acccattgat 1140 attcagttat gctatgggag tcggtacagt cctagatgtt caaatgcgaa attacactta 1200 tgcacgacct ttcctaaacg gttattattt ccagattggg gttgagaccg cacgaagaca 1260 acaaggcact gttgacaaca gagtagcaga tgatctgggc ctgactcctg agcaaagaac 1320 tgaggtcact cagcttgttg acaggcttgc aaggggaaga ggtgctggga taccaggtgg 1380 gcctgtgaat ccttttgttc ctccggttca acagcaacaa cctgctgccg tatatgagga 1440 cattcctgca ttggaggaat cagatgacga tggtgatgaa gatggaggcg caggattcca 1500 aaatggagta caattaccag ctgtaagaca gggaggtcaa actgacttta gagcacagcc 1560 tttgcaagat ccaattcaag cacaactttt catgccatta tatcctcaag tcagcaacat 1620 gccaaataat cagaatcatc agatcaatcg catcgggggg ctggaacacc aagatttatt 1680 acgatacaac gagaatggtg attcccaaca agatgcaagg ggcgaacacg taaacacttt 1740 cccaaacaat cccaatcaaa acgcacagtt gcaagtggga gactgggatg agtaaatcac 1800 tgacatgatc aaactaaccc caatcgcaac aatcccagga caatccagcc acagctaact 1860 gcccaaatcc actacattcc attcatattt agtctttaag aaaaaattag gcccggaaag 1920 aattaggtcc acgatcacag gcacaatcat ttttatcgtg tttctttccg ggcaagccat 1980 ggatcaattt ataaaacagg atgagaccgg tgatttaatt gagacaggaa tgaatgttgc 2040 gaatcatttc ctatccaccc caattcaggg aaccaattcg ctgagcaagg cctcaatcct 2100 ccctggtgtt gcacctgtac tcattggcaa tccagagcaa aagaacattc agcaccctac 2160 cgcatcacat cagggatcca agacaaaggg cagaggctca ggagtcaggt ccatcatagt 2220 ctcaccctcc gaagcaggca atggagggac tcagattcct gagccccttt ttgcacaaac 2280 aggacagggt ggtatagtca ccacagttta ccaggatcca actatccaac caacaggttc 2340 ataccgaagt gtggaattgg cgaagatcgg aaaagagaga atgattaatc gatttgttga 2400 gaaacctaga acctcaacgc cggtgacaga atttaagagg ggggccggga gcggctgctc 2460 aaggccagac aatccaagag gagggcatag acgggaatgg agcctcagct gggtccaagg 2520 agaggtccgg gtctttgagt ggtgcaaccc tatatgctca cctatcactg ccgcagcaag 2580 attccactcc tgcaaatgtg ggaattgccc cgcaaagtgc gatcagtgcg aacgagatta 2640 tggacctcct tagggggatg gatgctcgcc tgcaacatct tgaacaaaag gtggacaagg 2700 tgcttgcaca gggcagcatg gtgacccaaa taaagaatga attatcaaca gtaaagacaa 2760 cattagcaac aattgaaggg atgatggcaa cagtaaagat catggatcct ggaaatccga 2820 caggggtccc agttgatgag cttagaagaa gttttagtga tcacgtgaca attgttagtg 2880 gaccaggaga tgtgtcgttc agctccagtg aaaaacccac actgtatttg gatgagctgg 2940 cgaggcccgt ctccaagcct cgtcctgcaa agcagacaaa atcccaacca gtaaaggart 3000 tagcaggaca gaaagtgatg attaccaaaa tgatcactga ttgtgtggct aatcctcaaa 3060 tgaagcaggc gttcgagcaa cgattggcaa aggccagcac cgaggatgct ctgaacgata 3120 tcaagagaga catcatacga agcgccatat gaattcacca ggagcaccag actcaaggaa 3180 aaatctatga actgagagcc acaatgattc cctattaaat aaaaaataag cacgaacaca 3240 agtcaaatcc aaccatagca gaaatggcag gatcacagat caaaattcct cttccaaagc 3300 cccccgattc agactctcaa agactaaatg ccttccctgt catcatggct caagaaggca 3360 aaggacgact ccttagacaa atcaggctta ggaaaatatt atcaggggat ccgtctgatc 3420 agcaaattac atttgtgaat acatatggat tcatccgtgc cactccagaa acatccgagt 3480 tcatctctga atcatcacaa caaaaggtaa ctcctgtagt gacagcgtgc atgctgtcct 3540 ttggtgccgg accagtgcta gaagatccac aacatatgct caaggctctt gatcagacag 3600 acattagggt tcggaaaaca gcaagtgata aagagcagat cttattcgag atcaaccgca 3660 tccccaatct attcaggcat tatcaaatat ctgcggacca tctgattcag gccagctccg 3720 ataaatatgt caaatcacca gcaaaattga ttgcaggagt aaattacatc tactgtgtta 3780 cattcttatc tgtgacagtt tgttctgcct cactcaagtt tcgagttgcg cgcccattgc 3840 ttgctgcacg gtccagatta gtaagagcag ttcagatgga aattttgctt cgggtaactt 3900 gcaaaaaaga 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taactcaata caataagacc ttgagtaatt tgctccttcc aattgcagaa 4800 aacataaaca atattgcatc gccctcactt gggtcaagac gtcataaacg gtttgctggc 4860 attgccattg gcattgctgc gctcggtgtt gcgaccgcag cacaagtgac tgccgctgtc 4920 tcattagttc aagcacagac aaatgcacgt gcaatagcag cgatgaaaaa ttcaatacag 4980 gcaactaatc gggcagtctt cgaagtgaag gaaggcaccc aacagttagc tatagcggta 5040 caagcaatac aagaccatat caatactatt atgagcaccc aattgaacaa tatgtcttgt 5100 cagatccttg ataaccaact tgcaacctcc ctaggattat acctaacaga attaacaaca 5160 gtgtttcagc cacaattaat taatccagca ttgtcaccga ttagtataca agccttgagg 5220 tctttgcttg gaagtatgac gcctgcagtg gttcaagcaa cattatctac ttcaatttct 5280 gctgctgaga tactaagtgc cggtctaatg gagggtcaga tagtttctgt tctgctagat 5340 gagatgcaga tgatagttaa gataaacatt ccaactattg tcacacaatc aaatgcattg 5400 gtgattgact tctactcaat ttcgagcttt attaataatc aagaatccat aattcaattg 5460 ccagacagga tcttggagat cgggaacgaa caatggcgct atccagctaa gaattgtaag 5520 ttgacaagac accacatgtt ctgccaatac aatgaggcag agaggctgag cctagaaaca 5580 aaactatgcc ttgcaggcaa tattagtgcc tgtgtgttct cacctatagc agggagttat 5640 atgaggcgat ttgtagcact ggatggaaca attgttgcaa actgccggag tctaacatgt 5700 ctatgtaaga gtccatctta tcctatatac caacctgacc atcatgcagt cacgaccatt 5760 gatctaacat catgtcaaac attgtccttg gacggactgg atttcagcat tgtctcgcta 5820 agcaatatca cttacactga gaatcttact atttcattgt ctcagacaat caatacccaa 5880 cccattgata tatcaactga gctgagtaag gttaatgcat cccttcaaaa tgccgttaaa 5940 tacataaaag aaagcaacca tcaactccaa tcctttagtg tgggttctaa aatcggagct 6000 ataattgtat cagccttggt tttgagcatc ctgtcgatta tcatttcgct attgttttgc 6060 tgctgggctt acattgcgac taaagaaatc agaagaatca acttcaaaac aaatcatatc 6120 aacacaatat caagtagtgt cgatgatctc atcaggtact aatcttagat tggtgattcg 6180 tcctgcaatt ttaaaagatt tagaaaaaaa ctaaaataag aatgaatctc ctagggtcgt 6240 aacgtctcgt gaccctgccg tcgcactatg ccggcaatcc aacctccctt atacctaaca 6300 tttctagtgc taatccttct ctatctcatc ataaccctgt atgtctggac tatattgact 6360 attaactata agacggcggt gcgatatgca gcactgtacc agcgatcctt ctctcgctgg 6420 ggttttgatc actcactcta gaaagatccc caattaggac aagtcccgat ccgtcacgct 6480 agaacaagct gcattcaaat gaagctgtgc taccatgaga cataaagaaa aaagcaagcc 6540 agaacaaacc taggatcata acacaataca gaatattagc tgctatcaca actgtgttcc 6600 ggccactaag aaaatggagc cctcgaaact atttataatg tcggacaatg ccacctttgc 6660 acctggacct gttgttaatg cggctggtaa gaagacattc cgaacctgtt tccgaatatt 6720 ggtcctatct gtacaagcag ttatccttat attggttatt gtcactttag gtgagcttat 6780 taggatgatc aatgatcaag gcttgagcaa tcagttgtct tcaattacag acaagataag 6840 agaatcagct gctgtgattg catctgctgt gggagtaatg aatcaagtta ttcatggagt 6900 aacggtatcc ttacctctac aaattgaggg taaccaaaat caattattat ccacacttgc 6960 tacaatctgc acaaacagaa atcaagtctc aaactgctcc acaaacatcc ccttaattaa 7020 tgaccttagg tttataaatg gaatcaataa attcatcatt gaagattatg caacccatga 7080 tttctccatc ggccatccac ttaacatgcc tagctttatc cccactgcaa cctcacccaa 7140 tggttgcacg agaattccat ccttttcttt aggtaagaca cactggtgtt acacacataa 7200 tgtaattaat gccaactgca aggatcatac ttcatccaac caatatgttt ccatggggat 7260 tcttgctcaa accgcgtcag ggtatcccat gttcaaaacc ctaaaaatcc aatatctcag 7320 tgatggcctg aatcggaaaa gctgctcaat tgcaacagtc cctgatggtt gcgcgatgta 7380 ctgttacgtt tcaactcaac ttgaaaccga cgactatgcg gggtccagcc cacctaccca 7440 gaaacttatc ctgttattct ataatgacac catcacagaa aggacaatat ctccatctgg 7500 tcttgaaggg aattgggcta ctttggtgcc aggagtgggg agtggaatat atttcgaaaa 7560 taagttgatc tttcctgcat acgggggtgt attgcccaat agtacactag gagttaaatt 7620 agcaagagaa tttttccggc ccgttaatcc atataatcca tgttcaggac cacaacaaga 7680 gttagatcag cgtgctttga gatcatattt cccaagttac ttctctagtc gacgggtaca 7740 gagtgcattt ctggtctgtg cttggaatca gatcctagtt acaaattgcg agctagttgt 7800 cccctcaaac aatcagacac tgatgggtgc agaaggaaga gttttattga tcaacaatcg 7860 actattatat tatcagagga gtactagctg gtggccgtat gaactcctct atgagatatc 7920 attcacattt acaaactacg gtcaatcatc tgtgaatatg tcctggatac ctatatattc 7980 attcactcgt cctggttcgg gccactgcag tggtgaaaat gtatgcccaa tagtctgtgt 8040 atcaggagtt tatcttgatc cctggccatt aactccatac agacaccaat caggcattaa 8100 cagaaatttc tatttcacag gtgcactgct aaattcaagc acaaccaggg tgaatcctac 8160 actttatgtc tctgccctta ataatcttaa agtactagcc ccatatggta ctcaaggatt 8220 gtttgcttca tacaccacaa ccacctgctt tcaagatacc ggcgacgcca gtgtgtattg 8280 tgtctatatt atggaactgg catcgaatat tgttggggaa ttccaaattc tacctgtgct 8340 agccagattg accatcactt gagttgtagt gaatgtagca ggaagcttta cgggcgtgtc 8400 tcatttctta ttgattatta agaaaaaaca ggccagaatg gcgggcctaa atgagatact 8460 cctacccgaa gtacatttaa actcccccat cgttagatat aagcttttct actatatatt 8520 gcatggccag ttaccaaatg acttggagcc ggatgacttg ggcccattag caaatcagaa 8580 ttggaaggca attcgagctg aagaatcaca ggttcatgca cgtttaaaac agatcagagt 8640 agaactcatt gcaaggattc ctagtctccg gtggacccga tctcaaagag agattgccat 8700 actcatttgg ccaagaatac ttccaatact gcaagcatat gatcttcggc aaagtatgca 8760 attgcccaca gtgtgggaga aactgactca atccacggtt aatcttataa gtgacggtct 8820 agaacgggtt gtattacaca tcagcaatca actaacaggc aagcctaact tgtttaccag 8880 atctcgagcc ggacaagaca caaaagatta ctcaattcca tccactagag agctatctca 8940 aatatggttc aacaatgagt ggagtgggtc tgtaaagacc tggcttatga ttaaatatag 9000 aatgaggcag ctaatcacaa atcaaaagac aggtgagtta acagatctag taaccattgt 9060 ggatactagg tccactctat gcattattac tccagaatta gtcgctttat actccagtga 9120 gcacaaagca ttaacgtacc tcacctttga aatggtatta atggtcactg atatgttaga 9180 gggacggctg aatgtttctt ctctgtgcac agctagtcat tatctgtccc ctttaaaaaa 9240 gagaatcgaa gttctcctga cattagttga tgaccttgca ctactcatgg gggataaagt 9300 atacggtatt gtctcttcac ttgagagttt tgtttacgcc caattacagt atggtgatcc 9360 tgttatagac attaaaggta cattctatgg atttatatgt aatgagattc tcgacctact 9420 gactgaagac aacatcttta ctgaagaaga ggctaataag gttcttctgg acttaacatc 9480 acaatttgac aatctatccc ctgatttaac tgctgagctc ctctgcatta tgagactttg 9540 gggccatccc accttaactg ccagccaagc agcatccaag gtccgagagt ccatgtgcgc 9600 tcctaaggta ttagactttc aaacaataat gaagaccctg gctttctttc acgcaatcct 9660 aattaacggt tataggagga gccataatgg aatctggccg cctaccactc ttcatggcaa 9720 tgcccccaaa agcctcattg agatgcggca tgataattca gagcttaagt atgagtatgt 9780 cctcaagaat tggaaaagta tatctatgtt aagaatacac aaatgctttg atgcatcacc 9840 tgatgaagat ctcagcatat tcatgaagga taaggcaata agctgtccaa ggcaagactg 9900 gatgggagta tttaggagga gcctgattaa acagcgctat cgtgacgcga atcggcctct 9960 accacaacca tttaaccgga gactgctgtt gaattttcta gaggatgacc gattcgatcc 10020 tattaaagag cttgagtatg tcaccagtgg agaatatctt agggaccctg aattttgtgc 10080 atcttactct ctcaaggaga aggagataaa ggctacaggt cgtatatttg caaaaatgac 10140 aaagagaatg agatcgtgcc aagtaattgc agaatcattg ttagccaatc acgcaggtaa 10200 attaatgaga gagaatgggg ttgtcttaga ccagttaaaa ttaacaaaat ctttattaac 10260 tatgaaccaa attggtatta tatcagagca cagccgaaga tccaccgctg acaacatgac 10320 tttagcacac tccggttcaa ataagcacag gattaataat agtcaattca agaagaataa 10380 agacaataaa catgagatgc ctgatgatgg gtttgagata gcagcctgct tcctaacaac 10440 tgacctcaca aaatactgct tgadttagag gtaccaggtc atcatcccct ttgcgcgtac 10500 attgaattca atgtatggta taccccactt gtttgaatgg atacatttaa ggctgatgcg 10560 aagcactctt tatgtcggtg atcccttcaa tcctccatca gatcctaccc aacttgacct 10620 tgatacagcc ctcaatgatg atatatttat agtttcccct cgtggcggaa tcgagggttt 10680 atgtcaaaaa ttatggacta tgatttccat ctcaacaatc atattgtccg caactgaggc 10740 aaacactaga gtaatgagca tggttcaggg cgataaccaa gcaattgcaa tcaccactag 10800 agtagtacgt tcgctcagtc attccgagaa gaaggagcaa gcctataaag caagtaaatt 10860 attctttgaa aggcttagag ctaacaacca tggaattgga caccacttaa aagaacaaga 10920 aacaatcctt agttctgatt tcttcattta cagtaagagg gtgttttaca aaggtcgaat 10980 cttgactcaa gcgttaaaga acgtgagcaa gatgtgctta acagctgata tactggggga 11040 ttgttcacaa gcatcatgct ccaatttagc taccactgta atgcgcctga ctgagaatgg 11100 ggtcgagaaa gatttgtgtt atttcctaaa tgcattcatg acaattagac aattatgtta 11160 tgatctagta tttccccaaa ctaaatctct tagtcaggac attactaatg cttatcttaa 11220 tcatccaata cttatctcaa gattgtgtct attaccatct caattggggg gcttaaactt 11280 tctttcatgt agtcgcctgt ttaatagaaa cataggagat ccactagtgt ctgcaattgc 11340 tgatgtgaaa cgattaatta aagcgggctg tctagatatc tgggtcctgt acaacatcct 11400 tggaaggagg ccaggaaaag gtaagtggag cactctggca gctgatccct atactttaaa 11460 catagattat ttagtccctt caacaacttt tttgaagaaa catgcccaat atacattgat 11520 ggaacggagt gttaatccca tgctccgcgg agtatttagt gaaaatgcag cagaggagga 11580 agaagaactc gcacagtatc tattagatcg cgaagtagtc atgcccaggg ttgcacatgt 11640 tatacttgct cagtctagtt gcggtagaag aaaacagatc caaggttact tggattctac 11700 tagaactatt attaggtatt cactggaggt aaggccactg tcagcaaaga agctgaatac 11760 agtaatagaa tataacttat tgtacctgtc ctacaatttg gagattattg aaaaacccaa 11820 tatagtccaa ccttttttga atgcaatcaa tgttgatact tgtagcatcg atatagctag 11880 gtcccttaga aaattatcct gggcaacttt acttaatgga cgtcccatcg agggattaga 11940 aacacctgat cctattgaat tggtacatgg gtgtttaata atcgggtcag atgagtgtga 12000 gcattgcagt agtggtgatg acaaattcac ctggtttttc ctccctaagg ggataaggtt 12060 agatgatgat ccggcatcta acccacccat cagagtacct tatatcggat ccaaaacaga 12120 tgaacgaagg gttgcatcaa tggcttatat caaaggggca tcagtatcac ttaaatcagc 12180 actcagatta gcgggggtat atatatgggc tttcggagat acagaggaat catggcagga 12240 tgcctatgag ttagcttcca ctcgtgttaa tctcacacta gagcaattgc aatctctcac 12300 tcctttacca acatctgcca acttagtcca cagattggat gatggcacta ctcaattaaa 12360 atttacccca gcaagctcct atgcattctc tagctttgtt catatatcta acgactgtca 12420 aattcttgag atcgatgatc aggtaacgga ttctaacctg atttaccagc aagtcatgat 12480 tactggcctt gctctaattg agacatggaa taatcctcca atcaacttct ccgtttatga 12540 aaccacatta cacttgcaca caggctcatc ttgctgtata agacctgtcg agtcttgtgt 12600 agtaaatccg cctttacttc ctgtccctct cattaatgtt cctcaaatga ataaatttgt 12660 atatgatcct gaaccactta gtttgttaga aatggaaaaa attgaggata ttgcttatca 12720 aaccagaatt ggtggtttag atcaaatccc gcttctggaa aaaataccct tactagctca 12780 ccttaccgcc aagcagatgg taaatagcat cactgggctt gatgaagcaa catctataat 12840 gaatgatgct gtagttcaag cagactatac tagcaattgg attagtgaat gctgctatac 12900 ttacattgac tctgtgtttg tttactccgg ctgggcatta ttattggaac tttcatacca 12960 aatgtattac ctaagaattc aaggcataca aggaatccta gactatgtgt atatgacctt 13020 gaggaggata ccaggaatgg ccataacagg catctcatcc acaattagtc accctcgtat 13080 actcagaaga tgcatcaatt tggatgtcat agccccaatc aattctccac acatagcttc 13140 actggattac acaaaattga gcatagatgc agtaatgtgg ggaaccaagc aggtgttgac 13200 caacatttcg caaggtatcg attatgagat agttgttcct tctgaaagcc aacttacact 13260 cagtgataga gtcctaaatc tagttgctcg aaaattatca ctactggcaa tcatctgggc 13320 caattacaac tatcctccga aggttaaagg tatgtcacct gaagacaaat gtcaggcttt 13380 aactacacat ctactccaaa ctgttgaata tgtcgagtac attcagattg aaaagacaaa 13440 catcaggagg atgattattg agccaaaatt aactgcctac cctagtaatt tgttttacct 13500 ctctcgaaag ctgcttaatg ctattcgaga ctcagaagaa ggacaattcc tgattgcatc 13560 ctattataac agttttggat atctggaacc gatattaatg gaatctaaaa tattcaatct 13620 gagttcatcc gaatcagcat ctcttacaga atttgatttc atcctcaact tggaattgtc 13680 cgacgccagc cttgagaaat actctctccc aagtttgctt atgacggctg agaatatgga 13740 taacccattt cctcaacccc cacttcatca cgttctcaga ccactaggtt tgtcatccac 13800 ctcatggtat aaaacaatca gtgttttaaa ttatattagc catatgaaga tatctgacgg 13860 tgcccatcta tacttggcag agggaagtgg agcctctatg tcacttatag aaactttctt 13920 gcccggggaa acaatatggt 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gccaaataat cagaatcatc agatcaatcg catcgggggg ctggaacacc aagatttatt 1680 acgacacaac gagaatggtg attcccaaca agatgcaagg ggcgaacacg taaacacttt 1740 cccaaacaat cccaatcaaa acgcacagtt gcaagtggga gactgggatg agtaaatcac 1800 tgacatgatc aaactaaccc caatcgcaac aatcccagga caatccagcc acagctaact 1860 gcccaaatcc actacattcc attcatattt agtctttaag aaaaaattag gcccggaaag 1920 aattaggtcc acgatcacag gcacaatcat ttttatcgtg tttctttccg ggcaagccat 1980 ggatcaattt ataaaacagg atgagaccgg tgatttaatt gagacaggaa tgaatgttgc 2040 gaatcatttc ctatccaccc caattcaggg aaccaattcg ctgagcaagg cctcaatcct 2100 ccctggtgtt gcacctgtac tcattggcaa tccagagcaa aagaacattc agcaccctac 2160 cgcatcacat cagggatcca agacaaaggg cagaggctca ggagtcaggt ccatcatagt 2220 ctcaccctcc gaagcaggca atggagggac tcagattcct gagccccttt ttgcacaaac 2280 aggacagggt ggtatagtca ccacagttta ccaggatcca actatccaac caacaggttc 2340 ataccgaagt gtggaattgg cgaagatcgg aaaagagaga atgattaatc gatttgttga 2400 gaaacctaga acctcaacgc cggtgacaga atttaagagg ggggccggga gcggctgctc 2460 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agaacgggtt gtattacaca tcagcaatca attaacaggc aagcctaact tgtttaccag 8880 atctcgagct ggacaagaca caaaagatta ctcaattcca tccactagag agctatctca 8940 aatatggttt aacaatgagt ggagtgggtc tgtgaagacc tggcttatga ttaaatatag 9000 aatgaggcag ctaatcacaa atcaaaagac aggtgagtta acagatttag taaccattgt 9060 ggatactagg tctactctat gcattattac cccagaatta gtcgctttat actccaatga 9120 gcacaaagca ttaacgtacc tcacctttga aatggtatta atggtcactg atatgttaga 9180 gggaagactg aatgtttctt ctctgtgcac agctagtcat tatctgtccc ctttaaagaa 9240 gcgaatcgaa gttctcctga cattagttga tgaccttgct ctactcatgg gggataaagt 9300 atacggtatt gtctcttcac ttgagagttt tgtttacgcc caattacagt atggtgatcc 9360 tgttatagac attaaaggta cattctatgg atttatatgt aatgagattc tcgacctact 9420 gactgaaggc aacatcttta ctgaagaaga ggcaaacaag gttcttctgg acttgacgtc 9480 acagtttgac aatctatccc ctgatttaac agctgagctc ctctgcatta tgagactttg 9540 gggccatccc accttaactg ccagccaagc agcatccaag gtccgagagt ccatgtgcgc 9600 tcctaaggtg ttagatttcc aaacaataat gaaaaccctg gctttctttc acgcaatcct 9660 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tcagtatcac ttaaatcagc 12180 actcaggttg gcgggggtat atatctgggc tttcggagat acagaggaat catggcagga 12240 tgcctatgag ttagcttcca ctcgtgttaa tctcacacta gagcaattgc aatcgcttac 12300 tcctttacca acatctgcca acctagtcca cagattggat gatggcacta ctcaattaaa 12360 atttacccct gcaagctcct atgcattctc tagctttgtt catatatcta acgactgtca 12420 aattcttgag atcgatgatc aggtaacgga ttctaacctg atttaccagc aagttatgat 12480 tactggcctt gctttaattg agacatggaa taatcctcca atcaacttct ccgtttatga 12540 aactacatta cacttgcata caggctcatc ttgctgtata aggcctgtcg agtcttgtgt 12600 agtaaatccg cctttacttc ctgtcccttt cattaatgtt cctcaaatga ataaatttgt 12660 atatgaccct gaaccactta gtttgctaga aatggaaaaa attgaggata ttgcttatca 12720 aaccagaatt ggtggtttag atcaaatccc gcttctggaa aaaataccct tactagctca 12780 ccttaccgcc aaacagatgg tgaatagcat cactgggctt gatgaagcaa catctataat 12840 gaatgatgct gtagttcaag cagactatac tagcaattgg attagtgaat gctgctacac 12900 ttacattgac tctgtgtttg tttactctgg ctgggcattg ttattggaac tttcatacca 12960 aatgtattac ctaagaattc aaggcataca 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gtgttttgaa ttatattagc catatgaaga tatctgacgg 13860 tgcccatcta tacttggcag agggaagtgg agcctctatg tcacttatag agactttctt 13920 gcccggggaa accatatggt acaacagcct gttcaatagt ggtgagaatc cccctcaacg 13980 taatttcgcc cctttgccca cccagtttat tgaaagtgtc ccctatagat tgattcaagc 14040 aggtatagca gcaggaaatg gtatagtgca aagtttctat ccactctgga acggaaacag 14100 cgatataact gacttaagca ctaaaactag tgttgaatac attatccaca aggtaggagc 14160 tgatacttgt gcattagttc atgtggattt ggaaggtgtc cctggctcaa tgaacagcat 14220 gttggagaga gctcaagtac acgcactact aatcacagtc actgtactga aaccaggcgg 14280 cttactaatc ttgaaagctt catgggaacc ctttaatcga ttttcctttt tactcacagt 14340 actctggcaa ttcttttcca caataaggat cttgcgatct tcatactccg acccgaataa 14400 tcacgaggtt tacataatag ccacattggc agttgatccc actacatcct cctttacaac 14460 tgctctgaat agggcacgca ccctgaatga acagggcttt tcactcatcc cacctgaatt 14520 agtaagtgag tactggagga agcgtgttga acaaggacag attatacagg actgtataga 14580 taaagttata tcagagtgtg tcagagatca atatctggca gacaacaaca ttatcctcca 14640 ggcgggaggt 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Claims (46)

  1. 적어도 하나의 숙주 세포에서,
    (i) 서열번호 1, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 그룹 중에서 선택된 멈프스 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 전사벡터, 및
    (ii) 캡시드화, 전사 및 복제에 필요한 트랜스-작용 단백질(NP, P 및 L)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 분리된 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 발현벡터
    를 포함하는 구제 조성물을, 상기 벡터의 동시 발현 및 재조합 바이러스의 생산을 허용하기에 충분한 조건하에, 배지에서 형질감염 또는 형질전환시키는 단계
    를 포함하는, 재조합 멈프스 바이러스의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 멈프스 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 하나 이상의 게놈 또는 안티-게놈원의 키메라인 방법.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 멈프스 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 감쇠 바이러스 또는 바이러스의 감염형을 암호화하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 멈프스 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 바이러스의 감염형을 암호화하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 멈프스 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 감쇠된 바이러스를 암호화하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 멈프스 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 분리된 핵산 분자가 감염성의 감쇠된 바이러스를 암호화하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 숙주세포가 진핵 세포인 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 1 항의 방법으로부터 제조되고,
    서열번호 1, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 그룹 중에서 선택된 멈프스 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 멈프스 바이러스.
  16. (i) 제 1 항의 방법으로부터 제조되고, 서열번호 1, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 그룹 중에서 선택된 멈프스 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 멈프스 바이러스, 및
    (ii) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
  17. 제 1 항에 있어서, 전사벡터가 T7 RNA 폴리머라제 유전자를 추가로 포함하는 방법.
  18. (i) 제 1 항 또는 제 3 항에 따른 방법에 의해 생산되고, 서열번호 1, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 그룹 중에서 선택된 멈프스 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 분리되고 재조합 생산된 감쇠 멈프스 바이러스, 및
    (ii) 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 면역원 조성물.
  19. 삭제
  20. 서열번호 1, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 그룹 중에서 선택된 멈프스 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  21. 제 20 항에 있어서, 서열번호 1, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 그룹 중에서 선택된 포지티브 스트랜드 안티게놈 메시지 센스에 멈프스 바이러스 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
  22. 삭제
  23. 제 20 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열이 하나 이상의 이종 뉴클레오타이드 서열 또는 하나 이상의 이종 유전자를 추가로 포함하는 분리된 핵산 분자.
  24. 삭제
  25. 제 20 항에 따른 분리된 핵산 분자의 멈프스 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드.
  26. 삭제
  27. 제 25 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열이 하나 이상의 이종 뉴클레오타이드 서열 또는 하나 이상의 이종 유전자를 추가로 포함하는 플라스미드.
  28. 제 25 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열이 하나 이상의 이종 뉴클레오타이드 서열 또는 하나 이상의 이종 유전자를 추가로 포함하는 플라스미드.
  29. 제 25 항 또는 제 27 항에 따른 플라스미드로 형질전환된 숙주세포.
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 제 18 항에 있어서, 멈프스 바이러스 이외의 병원체에 대한 적어도 하나의 항원을 추가로 포함하는 면역원 조성물.
  33. 제 32 항에 있어서, 적어도 하나의 항원이 감쇠 RNA 바이러스인 면역원 조성물.
  34. 제 33 항에 있어서, 적어도 하나의 항원이 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스(VZV), 파라인플루엔자 바이러스(PIV), 및 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 중에서 선택된 감쇠 바이러스인 면역원 조성물.
  35. 제 32 항에 있어서, 적어도 하나의 항원이 재조합 생산되는 면역원 조성물.
  36. 삭제
  37. 제 32 항에 있어서, 멈프스 바이러스 이외의 병원체의 적어도 하나의 항원이 재조합 생산된 감쇠 멈프스 바이러스로부터 발현되는 면역원 조성물.
  38. 제 32 항에 있어서, 멈프스 바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 바리셀라 조스터 바이러스(VZV), 파라인플루엔자 바이러스(PIV), 및 호흡기 합포체 바이러스(RSV) 이외의 병원체의 적어도 하나의 항원이 재조합 생산된 감쇠 멈프스 바이러스로부터 발현되는 면역원 조성물.
  39. 제 27 항에 있어서, 이종 뉴클레오타이드 서열이 단일 전사 단위로서 멈프스 게놈 서열내에 삽입되는 플라스미드.
  40. 제 39 항에 있어서, 이종 뉴클레오타이드 서열이 하나 이상의 모노시스트론성 전사 단위로서 멈프스 게놈 서열내에 삽입되는 플라스미드.
  41. 제 39 항에 있어서, 이종 뉴클레오타이드 서열이 하나 이상의 리보솜 유입 부위를 함유할 수 있는 적어도 하나의 폴리시스트론성 전사 단위로서 멈프스 게놈 서열내에 삽입되는 플라스미드.
  42. 제 41 항에 있어서, 이종 뉴클레오타이드 서열이 폴리단백질 및 이를 절단하여 개개의 폴리펩타이드를 생성하는 프로테아제를 암호화하는 플라스미드.
  43. 제 29 항의 숙주세포에 의해 생성된 분리되고 재조합 생산된 감쇠 멈프스 바이러스, 및 생리학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
  44. 서열번호 1, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 그룹 중에서 선택된 재조합 멈프스 바이러스의 cDNA 클론 서열을 포함하는 뉴클레오타이드.
  45. (i) 서열번호 1, 서열번호 11 및 서열번호 12로 이루어진 그룹 중에서 선택된 멈프스 바이러스의 게놈 또는 안티게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 포함하는 전사벡터, 및
    (ii) 캡시드화, 전사 및 복제에 필요한 트랜스-작용 단백질(NP, P 및 L)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 분리된 핵산 분자를 포함하는 적어도 하나의 발현벡터
    를 포함하는 면역원성 조성물.
  46. 제 15 항에 있어서, 하나 이상의 이종 뉴클레오타이드 서열 또는 하나 이상의 이종 유전자를 추가로 포함하는 재조합 멈프스 바이러스.
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