CN1250725C - 从克隆的核苷酸序列制备减毒副流感病毒疫苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明由分离的聚核苷酸分子提供重组的PIV基因组和反基因组，用于产生重组PIV疫苗。重组基因组或反基因组可以与核蛋白N，磷蛋白P和大聚合酶蛋白L一起表达，产生分离的感染性PIV颗粒。可以修饰重组PIV基因组和反基因组，以加入生物学方法产生的PIV突变株的减毒突变，或创建嵌合PIV克隆，以产生减毒的免疫原性病毒，用于疫苗。

Description

从克隆的核苷酸序列制备减毒副流感病毒疫苗的方法
                           相关申请
本申请是，根据第35条规定，1997年5月23日提交的US临时申请No.60/047,575和1997年9月19日提交的临时申请No.60/059,385的部分继续申请。所述的两项临时申请都在此作为本发明的参考。
                           发明背景
人副流感病毒(HPIV)，HPIV1、HPIV2和HPIV3是造成婴儿和小儿支气管炎、哮吼和肺炎的重要原因。Karron等， J.Infect.Dis.172：1445-50(1995)；Collins等，“副流感病毒”p.1205-1243，B.N.Fields等编的 Fields Virology，第3版，第1卷，Lippincott-Raven Publ.，Philadelphia(1996)；Murphy等， Virus Res.11：1-15(1988)。这种病毒感染在3岁以下儿童中造成很高的发病率，并且，在因呼吸道疾病住院的幼婴和儿童中约20％是因为这种感染。
虽然已经为开发有效的抗HPIV疫苗疗法进行了大量努力，但还没有得到可抗各种HPIV毒株和缓解HPIV相关疾病的获准疫苗。迄今，特别受到关注的只有两种侯选PIV减毒活疫苗。其中之一是牛PIV(BPIV)毒株，其抗原性与HPIV3相关，已经证明它可保护动物抗HPIV3。BPIV3被减毒，在人婴儿和儿童中遗传稳定并具有免疫原性(Karron等， J.Inf.Dis 171：1107-14(1995a)；Karron等， J.Inf.Dis 172：1445-1450(1995b))。第二种侯选PIV3疫苗，JS cp45是HPIV3的JS野生型(wt)的冷适应突变株(Karron等，(1995b)同上；Belshe等， J.Med，Virol.10：235-42(1982))。这种活减毒冷传代(cp)PIV3侯选疫苗对温度敏感(ts)、冷适应(ca)并被减毒(att)，这些表型在病毒体内复制后保持稳定。cp45在实验动物中具有抗人PIV3攻击的保护作用并被减毒，在血清阴性的人婴儿和儿童中遗传稳定并具有免疫原性(Hall等， Virus Res.22：173-184(1992)；Karron等，(1995b)，同上)。
HIPV3是单负病毒(Mononegavirales)目副粘病毒科副粘病毒属的成员之一。其基因组是一条15462核苷酸(nt)的负义RNA单链(Galinski等， Virology 165：499-510，(1988)；Stokes等， Virus Res.25：91-103(1992))，编码至少8种蛋白质(Collins等， 同上，(1996)；Galinski 同上，(1991)；Spriggs & Collins， J.Gen.Virol.67：2705-2719(1986))。其中3种蛋白质与RNA基因组结合形成核衣壳；即核衣壳蛋白N、磷蛋白P和大聚合酶亚基L。另3种蛋白与包膜结合，即据说介导病毒结合与释放的基质蛋白M、血凝素-神经氨酸酶蛋白HN和融合蛋白F。另两种蛋白，HN和F，是PIV的中和保护抗原(Collins等， Fields Virology，第3版，1：1205-43(1996))。不同PIV的这两种保护抗原具有明显的序列差异，这是抗病原保护性免疫力种特异性的基础。
PIV的另一种蛋白，C蛋白，由P蛋白mRNA的重叠开放读码框(ORF)编码(Springgs & Collins，1986)，对P蛋白顺反子的RNA编辑产生D蛋白(Galinski等， Virology186：543-50(1992))。P mRNA还有一个内部ORF，它能够编码一段被称为V的富半胱氨酸结构域。其它副粘病毒中也存在V ORF，而且通常是由RNA编辑产生的，但在PIV中并非如此。目前，尚不知道PIV V ORF是否表达。
PIV的病毒基因组还含有基因外前导序列和尾序列，其中包含病毒复制和转录所需的启动子。这样，PIV的基因图谱可以表示为：3’前导序列-N-P/C/D-M-F-HN-L-尾序列。转录从3’端开始，按基因边界处保守性短基序引导的序列性终止-起始机制进行。各基因的上游末端含有一个基因起始(GS)信号，指导相应mRNA转录的启动。各基因的下游末端含有一个基因结束(GE)基序，指导聚腺苷酸化和终止。
因为多种原因，人们对鉴定cp45和其它PIV3侯选疫苗中的减毒突变很感兴趣。具体地说，这将有助于理解减毒作用的基因基础和描述减毒HPIV3株的分子病毒学和病理学，从而提供临床可用疫苗，用于抵抗各种副粘病毒，尤其是HPIV1和HPIV2，两者额外造成7％的儿科住院治疗。为了达到上述及相关目的，需要一种由cDNA产生具有野生表型的病毒的方法，用这种病毒来确定cp45中哪些突变造成ts、ca和att表型，BPIV3的哪些基因造成减毒表型。
PIV3毒株原型、JS wt HPIV3和cp45株的完整核苷酸序列是已知的(Stokes等，同上(1992)；Stocks等， Virus Res.30：43-52(1993))。这些研究显示，与亲代JS wt HPIV3毒株相比，cp45毒株至少有17处核苷酸取代，其中8处与病毒蛋白改变有关。但是，迄今还没有说明已鉴定的这些突变中哪些造成例如ts、ca和att等所需的表型。最近报道，通过共表达47885 wt PIV3毒株内L基因的cDNA克隆能够补偿cp45使之在非许可性温度下生长(Ray等， J.Virol.70：580-584(1996))，这提示：L基因可能包含造成cp45 ts表型的一种或多种突变。但是，该研究的结果受以下事实的干扰：47885毒株与cp45 JS亲代并不是同基因的(例如，这两种病毒在核苷酸水平上有4％的差异，L蛋白有41处氨基酸差异；Stokes等在Virus Res.27：96(1993)；Virus Res.25：91-103中公开了这些错码。而且，这种补偿方法没有提供L基因突变对cp45总体ts表型相对贡献的明确尺度。
PIV3和其它RNA病毒内减毒突变的恢复与分析需要操纵特定的感兴趣病毒cDNA的有效方法。尽管鉴定PIV cDNA已经获得许多进展，操纵各种负义RNA病毒基因组RNA仍然很难。障碍之一是：裸露的这些病毒的基因组RNA是非感染性的。
直到最近才开发出指导非节段负链RNA病毒基因组操纵的成功方法(有关综述参见Conzelmann， J.Gen.Virol.77：381-89(1996)；Palese等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：11354-58，(1996))。已经通过胞内共表达分开转染的携T7 RNA聚合酶启动子并编码基因组或反基因组RNA以及N、P、L蛋白的质粒成功地产生了功能性核衣壳。这种胞内cDNA表达受T7 RNA聚合酶驱动，这种酶由牛痘重组病毒共转染产生。这种方法最早被用于确定转录和复制所需的cDNA编码的最小复制子。用此类方法在核衣壳N、磷蛋白P和大聚合酶亚基L存在下从cDNA编码的反基因组RNA拯救感染性狂犬病病毒、疱疹性口炎病毒(VSV)、麻疹病毒和仙台病毒已经获得了一定的成功(Garcin等， EMBO J.14：6087-6094(1995)；Lawson等， Proc.Natl.Acad. Sci.USA.92：4477-81(1995)；Radecke等， EMBO J.，14：5773-5784(1995)；Schnell等， EMBOJ.13：4195-203(1994)；Whelan等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA.92：8388-82(1995))。已经从cDNA编码的反基因组复原了呼吸道合胞病毒(RSV)，但这需要另外转染以编码M2ORF1转录延伸因子的质粒(Collins等，1995)。
拯救感染性PIV病毒和其它单负病毒成员因为它们的非节段负链RNA基因组的缘故而变得复杂。分节段基因组病毒(例如流感病毒)的基因组核糖核蛋白复合物(RNP)通常较小而且结构松散，可以由RNA和所需的病毒蛋白体外组装。但是，PIV和其它单负病毒成员的RNP却大得多而且结构紧密得多，难以在体外结合而具有功能。而且，HPIV3 P mRNA编码能力因共转录“RNA编辑”而被复杂化(Galinski等， Virology 186：543-50(1992)。编辑造成的读码框移动会牵涉到内部ORF，表达为与P的N末端部分融合的嵌合蛋白。此外，如前所述，HPIV3表达嵌合V蛋白，因而不同于大多数副粘病毒。HPIV3编辑产生的对应蛋白组还没有被鉴定过，HPIV3的内部V ORF与编辑位点被许多翻译终止密码子隔开(Galinski等，(1992，同上))。另一复杂化因素是BPIV3和HPIV3编辑产生嵌合蛋白D，其中P的上游半部分与接着的内部ORF编码的一结构域融合(Pelet等， EMBO J.10：443-448(1991)：Galinski等， 同上(1992))。其它副粘病毒中没有与D蛋白相当的蛋白。
综上所述，本领域迫切需要一种工具和方法来制造安全而有效的疫苗，用于减轻PIV造成的严重的健康问题，尤其是HPIV3在婴幼儿中造成的疾病。十分出人意料的是，本发明满足了上述以及相关需求。
                              发明概述
本发明为将确定的、预定的结构和表型改变引入感染性PIV提供了新的工具和方法。本发明实施方式之一提供了一种分离的聚核苷酸分子，它包含操作性连接的转录启动子、一段编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列和转录终止子。
PIV基因组或反基因组可以是人或非人PIV序列，或是他们的重组版。实施方式之一中，聚核苷酸序列编码嵌合基因组或反基因组，包含与非人PIV序列(例如牛PIV(BPIV)的基因或基因节段)重组连接的人PIV序列。在其它实施例中，聚核苷酸编码非人PIV和至少一种人或非人源PIV形成的嵌合序列。
在其它实施方式中，本发明提供一种分离的感染性PIV颗粒，它包含重组PIV(rPIV)基因组或反基因组。分离的感染性PIV颗粒可以是病毒或亚病毒颗粒。本发明中的亚病毒颗粒表示缺少完整病毒(例如，包括完整基因组或反基因组、核衣壳和包膜的组装病毒粒子)内某一结构元件(例如基因节段、基因蛋白或蛋白功能结构域)的各种感染性PIV颗粒。所以，本发明亚病毒颗粒实例之一是包含基因组或反基因组以及N、P和L基因的感染性核衣壳。部分或完全缺失或取代非必需基因和/或其产物(例如F、HN、M或C)以及其它非必需结构元件而产生的其它亚病毒颗粒。
分离的感染性PIV颗粒以人PIV为佳，人PIV3(HPIV3)则更好。本发明还提供来自牛或鼠PIV(BPIV或MPIV)的分离的感染性颗粒，以及包含两种或两种以上不同PIV基因组形成的嵌合序列的颗粒，例如包含HPIV3和HPIV1聚核苷酸序列，HPIV3和HPIV2序列或包含HPIV3和BPIV序列的颗粒。
在本发明的相关内容中提供了如下分离感染性PIV颗粒：含有HPIV3与至少一种异源PIV序列(例如HPIV1、HPIV2、HPIV3或MPIV)连接而成的核苷酸序列。例如，完整的HPIV3基因可以被其它形式PIV中与之相当的基因(例如PIV1或PIV2的HN或F糖蛋白基因)取代。或者，选定的基因节段，例如HPIV1或HPIV2的HN或F的胞质尾、跨膜结构域或胞外结构域，可以取代HPIV3基因中的对应基因节段来得到编码嵌合蛋白(例如PIV3的胞质尾和/或跨膜结构域与PIV1或PIV2的胞外域融合而成的融合蛋白)的结构。或者，可以添加(即，不是取代)来自异源PIV的基因或基因节段，在得到的克隆中产生新的免疫原性。
在某PIV基因组或反基因组中引入选来编码所需表型变化的核苷酸插入、重排、缺失或取代可以产生其它修饰作用，例如造成减毒、温度敏感、冷适应性、小噬菌斑、宿主范围限制、体外生长改善或PIV某免疫原性表位内改变的修饰作用。本发明内容之一鉴定了发生于生物学方法产生的减毒PIV内的修饰，并将它们单独或组合后引入一个全长PIV克隆。这些修饰一般是生物学方法产生的突变病毒相对野生型PIV表现出的单氨基酸改变，例如PIV突变株表现出的具有ts、ca或att表型的改变。将这些来自生物学方法产生的突变PIV的改变引入重组PIV克隆，在所得的病毒中产生所需的特征。突变范例包括造成HPIV3毒株JS cp45内减毒表型的氨基酸改变。此类突变例还包括发生在聚合酶基因L内导致ts、ca或att表型的突变，例如发生于JS野生型PIV毒株Tyr942、Leu992和/或Thr1558处的氨基酸取代。具体地说，减毒重组PIV中，Tyr942被His取代，Leu992被Phe取代，Thr1558被Ile取代。
本发明还提供如下重组PIV：包含多重、表型特异性突变，这些突变以选定的组合形式引入感染性克隆的基因组或反基因组，产生包括减毒、温度敏感、冷适应、小噬菌斑、宿主范围限制等所需特征。例如，提供了一种PIV克隆，它含有至少两种选自某生物学方法产生的PIV突变株的非相关突变，例如来自HPIV3 JScp45的两种ts突变。由此，从已鉴定的病损“菜单”中选取突变，将这些突变以各种组合形式引入，将疫苗病毒的减毒作用、免疫原性和稳定性调校到所需的水平，可以制得多重减毒的病毒。
在其它实施方式中，本发明用涉及相同或不同基因的其它类型突变为生物学方法产生的PIV的一种或多种突变(例如ts、ca或att突变)提供补充。本文中，突变的目标基因包括核衣壳蛋白N、磷蛋白P、大聚合酶亚基L、基质蛋白M、血凝素-神经氨酸酶蛋白HN、融合蛋白F和C、D、V ORF的产物。较好的是，嵌合重组PIV含有生物学方法产生的PIV的减毒突变，例如，具有来自HPIV3和HPIV1两种病毒，或来自HPIV和BPIV两种病毒的核苷酸序列的重组PIV。
在其它实施方式中，本发明提供了从编码PIV基因组或反基因组的一种或多种分离聚核苷酸分子产生感染性PIV颗粒(例如病毒或亚病毒颗粒)的方法(参见本发明参考的1997年5月23日提交的待批美国临时申请No.60/047575)。为了按这些方法产生感染性PIV颗粒，包含编码PIV N、P、L蛋白的一种或多种分离聚核苷酸分子的表达载体与包含编码PIV基因组或反基因组的分离聚核苷酸分子的表达载体在细胞或无细胞系统中共表达，从而产生感染性PIV颗粒。
PIV基因组或反基因组与N、P、L蛋白可以用同一表达载体或不同表达载体共表达。在其它的实施方式中，N、P、L蛋白各自由不同的表达载体编码。
在上述方法中，编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子可以对应于人、牛、鼠PIV的基因组或反基因组序列。或者，编码PIV的聚核苷酸可以是人PIV基因组域反基因组序列与至少一种非人PIV基因组或反基因组序列的嵌合分子。在产生感染性PIV的其它方法中，编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸是两种或两种以上人PIV基因组，例如人PIV1和人PIV2的嵌合。例如含HPIV3序列的聚核苷酸与人PIV(例如人PIV1或人PIV2)的一种或多种相关形式的序列连接。人PIV3各单独基因可以被异源PIV中对应的基因(例如PIV1或PIV2的HN和F糖蛋白基因)取代，产生编码嵌合PIV的修饰基因组或反基因组。或者，选定异源基因节段(例如HPIV1或HPIV2 HN或F的胞质尾、跨膜域或胞外域)可以取代不同PIV型或不同基因中的对等基因节段(例如HPIV3的HN或F)，产生编码嵌合蛋白(例如PIV3的胞质尾和/或跨膜域与PIV1或PIV2胞外域融合而成的融合蛋白)的结构。
产生感染性PIV的其它方法中，PIV基因组或反基因组经修饰产生人PIV基因组或反基因组序列与至少一种非人PIV序列的嵌合体，例如包含人和牛PIV序列的聚核苷酸。
产生感染性PIV的其它方法中，PIV基因组或反基因组用选来编码所需表型改变的核苷酸插入、重排、缺失或取代(例如造成减毒、温度敏感、冷适应、小噬菌斑、宿主范围限制或PIV免疫原性表位改变等)来修饰。或者，可以将编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子修饰成编码非PIV分子(例如细胞因子、T辅助表位、限制型位点标记、或能够在目标宿主内引发保护性免疫应答的不同微生物病原蛋白(例如病毒、细菌或真菌))。实施方式之一中，PIV基因组或反基因组被修饰成编码人RSV或麻疹病毒的蛋白。
本发明其它实施方式提供了一种细胞或无细胞系统(例如无细胞裂解液)，其中含有的表达载体包含编码PIV基因组或反基因组的分离聚核苷酸分子，并包含一种或多种编码PIV N、P、L蛋白的分离聚核苷酸分子。一旦表达，基因组或反基因组与N、P、L蛋白共同形成感染性PIV颗粒(例如病毒或亚病毒颗粒)。编码PIV基因组或反基因组的分离聚核苷酸分子与编码PIV N、P、L蛋白的一个或多个分离聚核苷酸分子可由同一载体表达，或者，基因组与N、P、L蛋白中一种或多种可结合在两个或两个以上载体内。
                              附图简述
图1显示了编码HPIV3基因组RNA完整拷贝的质粒p218(131)的结构。左上方p218(A*A’CC’D*E)的图显示与HPIV3基因组第1核苷酸相邻的T7终止子和δ核酶。右上方p(E*FF’GHIJKL*)的图显示与HPIV3基因组第15462核苷酸相邻的7个带星号的测序标记(见图2)和T7启动子。两质粒外的字母表示用于构建全长基因组cDNA的15个重叠克隆。独特的NgoMI和XhoI限制性位点用来克隆编码完整的HPIV3负义基因组RNA的p218(131)，图底部展示了该质粒。p218(131)中使重组JS区别于野生JS的各测序标记部位都以星号表示。
图2显示编码的HPIV3 NH(1)和L(2)基因的基因组RNA的cDNA内的序列标记。给出的是负义序列，突变用方框表示。
1)7903处的非编码核苷酸(nt)取代去除了JS wt中的一个HgaI位点。JS cDNA内7913和7915处的核苷酸取代产生了一个ScaI位点，并将370位的脯氨酸变成了苏氨酸，消除了由mAb170/7和423/6识别的抗体表位。而且，还发现HN基因含有过去没有被发现的位于7593核苷酸的另一处点突变。该突变使得HN蛋白内第263位的苏氨酸变成了异亮氨酸。
2)JS cDNA L基因内在质粒构建或组装过程中发生的3处随机非编码突变用方框表示。
图3包括PIV3-CAT cDNA的图(未按比例绘制)(上方，画成环形质粒)和它编码的最小基因组RNA(下方，画成3’到5’的单链负义RNA)。
质粒：转录取向的黑色箭头表示T7启动子。图中显示了δ核酶、T7转录终止子、插入的牛痘(Vaccinia)病毒转录终止子(T7CT和T5AT)、限制性酶位点和所编码的最小基因组中各结构域的编码序列的位置。
最小基因组RNA：最小基因组的5’(右)末端是T7 RNA聚合酶的启动子，因它而延伸了2个非病毒G残基。它们不计算在长度之内。3’末端是核酶，没有任何异源核苷酸。PIV-3特异性结构域用空心方框表示。CAT ORF以底纹表示，并列出了转录起始密码子(UAC)和转录终止密码子(AUU)的负义互补序列。根据最短的898-核苷酸最小基因组指示核苷酸位置。特异性区域的核苷酸长度在括号内。图的底部显示了第90位至124位的序列(3’到5’的负义序列)；PIV3-特异性序列以下划线表示，牛痘病毒转录终止子的互补序列以上划线表示，XbaI位点的互补序列以斜体表示，CAT ORF转录起始密码子的互补序列以黑体表示。图中显示了因插入0至6个G残基而产生PIV3-CAT 0至+6的位点。缩写：GS，转录基因起点基序；GE，转录基因终点的终止/聚腺苷酸化基序；NT，非翻译基因序列。
图4是最小基因组PIV3-CAT 0至+6的CAT酶表达。细胞被编码PIV3-CAT最小基因组和N、P、L蛋白的质粒转染，并同时用表达T7RNA聚合酶的重组牛痘病毒vTF7-3感染。感染后48小时制备裂解液，取相当于3000个细胞的样品分析CAT活性。以相对于+2最小基因组的活性乘以6作为100。在上述条件下测定，删除L质粒的样品没有CAT活性。
图5A和图5B显示PIV3-CAT最小基因组0至+6最小反基因组RNA的合成。细胞的转染与感染与图4相同，所不同的是以N质粒(泳道1)或L质粒(泳道2)缺省作为对照。图中列出了各种转染情况的PIV3-CAT最小基因组。转染后48小时制备细胞裂解液：取一份用微球菌核酸酶处理(经处理)，另取一份进行假处理(未处理)，然后进行RNA纯化加工。用负义CAT核探针(riboprobe)对RNA进行Northern印迹杂交分析。作为核酸酶处理的标记物和对照，RSV-CAT C2最小基因组(Grosfeld等， J.Virol.69：5677-5686(1995)，本发明在此引用参考)用PSV N、P和L蛋白补全，并接受相同的处理(泳道10)。图5A显示杂交印迹的放射性自显影图。图5B显示磷光造影(phosphorimager)分析，分析中分别计算了经处理样品与未处理样品相对+2最小基因组的杂交量。
图6A和图6B显示由PIV3-CAT最小基因组0至+6合成聚腺苷酸化的mRNA。使用与图5A和5B同一实验产生的样品份，在转染后48小时收获全部胞内RNA，经寡聚(dT)层析，分离成结合和不结合的流份，然后用负义CAT核探针进行Northern印迹杂交分析。图6A显示杂交印迹的放射性自显影图。图6B显示磷光造影分析，分析中将杂交量校准为相对+2基因组的结合RNA流份的相对值，分别计算了结合和不结合流份的该值。
图7显示编码PIV3-CAT最小基因组0至+6引起的胞内最小基因组积累。这是图5A和图5B所示实验的继续。所以，在转染后48小时，收获已经转染了编码最小基因组和N、P、L蛋白的质粒并感染了vTF7-3的细胞，并制成细胞裂解液。取1份裂解液用微球菌核酸酶处理(经处理)，另1份接受假处理(未处理)，然后进行RNA纯化加工。用正义CAT核探针进行RNA的Northern印迹分析，但图5A中的探针是负义的。图7显示杂交印迹的放射性自显影图。图7B显示磷光造影分析，分析中分别计算了经处理样品和未处理样品相对+2最小基因组的杂交量。
图8至10显示p3/7(131)2G的构建。p3/7(131)2G编码完整的HPIV3反基因组，并含有位于T7启动子和反基因组第1核苷酸之间的2个G残基。所述的构建包括分别修饰编码负义基因组的cDNA218(131)的左右两半。用相同的方法构建另一种cDNA，p3/7(131)，它与p3/7(131)2G的区别仅在于没有那2个G残基。
图8显示p(左+2G)的构建，是用包含2个G残基的T7启动子代替p218(A*A’CC’D*E)的核酶和T7转录终止子。以p218(A*A’CC’D*E)作为模板，用引导T7启动子的左手PCR引物，PCR扩增HPIV3基因组的左手1224个核苷酸(即标为“PIV3seq”的黑色矩形)。将这段PCR片段克隆到p218(A*A’CC’D*E)的MluI-PmlI窗内，得到p(左+2G)。
图9显示p(右+)的构建，使用正义链(反基因组)内的核酶和比邻PIV3第15642核苷酸T7终止子代替p(E*FF’GHIHKL*)的T7启动子。以p(E*FF’GHIHKL*)作为模板，用添加δ核酶部分的一段突变寡核苷酸(其中包含一个天然RsrII位点)，PCR扩增HPIV3基因组的右手649个核苷酸(即标为“PIV3seq”的黑色矩形)。将这段PCR产物克隆到p3/7的RsrII-BssHII窗内，得到pPIV3-3/7，由此构建成一个以T7终止子为侧翼的完整核酶。将pPIV3-3/7的SwaI-NgoMI片段克隆到p(E*FF’GHIHKL*)的SwaI-NgoMI窗内，得到p(右+)。7个序列标记的位置用星号表示。
图10显示p3/7(131)2G的构建。将p(右+)的NgoMI-XhoI片段克隆到p(左+2G)的NgoMI-XhoI窗内，得到p3/7(131)2G。图中显示了HPIV3基因的位置(未按比例)。序列标记的位置用星号表示。
图11显示对负义重组PIV3的序列确认。RT-PCR扩增来自感染细胞的RNA产生包含7903、7913和7915处突变的一段1379bp片段(核苷酸7334至8713)，然后进行循环测序分析。重组PIV区别于JS wt的突变以箭头表示。靠近凝胶边缘处列出了从核苷酸7879至7922的完整序列，其中3处核苷酸差异用粗体表示。
图12是质粒pTM(L)942/992/1558的图，它包含L蛋白序列中具有942、992和1558处氨基酸取代的PIV3 L cDNA。图中显示了各编码改变的位置，和有意改变成标记的氨基酸差异和天然限制性位点。图中显示了用于克隆的限制性位点(SphI、PinAI、BamHI和NheI)。箭头表示L蛋白编码序列的方向，以及根据氨基酸位置的编号。
图13表示带有本发明各种代表性突变的重组PIV3病毒。
图14A和14B显示编码嵌合PIV3-PIV1反基因组的cDNA的构建，其中，PIV3的HN和F ORF被PIV1的取代。首先(从底行左端开始)从全长PIV3 cDNA克隆p3/7(131)2G(分图A)中亚克隆PIV3的F和NH基因(BspE-II-XhoI和EcoR I-Spe I片段)，分别产生pLit.PIV3.F3a和pLit.PIV3.HN4(分图B)。进行PCR突变(分图C)，删除PIV3F和HN基因的完整编码区，并引入新的限制性位点(以方框表示)。从被感染细胞的RNA经RT-PCR制备PIV1 F和HN cDNA，克隆到pLITMUS28内(分图D)。这些克隆，pLit.1Fwt和pLit.1HNwt被作为模板用于修饰PIV1 F和HN基因的起始和终止密码子，以引入与PIV3缺失所引入的限制性位点相容的新的限制性位点(分图E)。将PIV1编码区插入PIV3缺失，产生pLit.PIV3-1 Fhc和pLit.PIV3-1.HNhc，构建成嵌合的F基因和HN基因(分图F)。将嵌合的F和HN组装在一起成为pSE.PIV3-1.hc(分图G)。以F和HN嵌合节段取代全长PIV3克隆p3/7(131)2G的BspE I-Sph I片段而引入其中，生成pFLC.2G+.hc(分图H)。基因之间的小方框表示基因末端、基因间和基因起始区，直线表示非编码区。有底纹的表示来自PIV1，空心方框表示来自PIV3。黑色箭头指示T7启动子，黑框指示肝炎δ病毒(HDV)核酶。
图15A平行显示了嵌合rVIP3-1(中间)，rPIV3JS(上；本文中又称rJS和JS wt r PIV3)以及PIV1/Wash64(下)的嵌合HN和F基因。含有从PIV3到PIV1序列转换的4个连接区用方框表示并编号为I至IV。基因之间的各个小方框表示基因末端、基因间和基因起始区，直线表示非编码区。图14A和14B使用的RT-PCR引物，即PIV3 M和L基因特异性引物(上方的引物对A)和PIV1 M和HN基因特异性引物(下方的引物对B)，以箭头表示。
图15B是对用毒粒RNA(vRNA)为模板和图14A和14B所用PIV3-或PIV1特异性引物产生的RT-PCR产物的评价。如图所示，在各模板的平行实验中省略了逆转录步骤，以确认PCR产物是否衍生自RNA。就rPIV3-1而言，PIV3-特异性引物对A产生预计的4.6kb产物，而rPIV3-1中没有的PVI-1序列的特异性引物对B则不生成产物。平行显示的是用rPIV3/JS(标记为rPIV3)或PIV1/Wash64(标记为PIV1)vRNA的阳性对照。
图16显示测定所得图14A和14B中rPIV3-1的RT-PCR产物中PIV3-PIV1连接区的序列。图中RT-PCR产物的平行测定显示了4个连接区(I至IV区)的序列，并与rPIV3/JS(上一行)和PIV1/Wash64(下一行)的对应区对齐。垂直短线表示序列相同，加框区表示引入的突变和限制性位点。嵌合F基因内Gln到Glu的密码子改变以带底纹的方框表示。以下划线表示起始和终止密码子。
图17A-17B显示rPIV3-1的RT-PCR产物的III区(左)和IV区(右)与rPIV3(左)或PIV1(右)比较的测序凝胶。起始和终止密码子用方框表示，限制性位点用箭头表示。
图18显示亲代和嵌合PIV在组织培养中的多轮生长。LLC-MK2细胞单层以0.01的MOI接种病毒，被病毒感染的细胞在胰蛋白酶存在下32℃培养。每隔24小时收获组织培养清液，冷冻，使用与血细胞吸附试验相同的TCID50作分析以鉴定被病毒感染的培养物。各点表示3份独立培养物的平均效价，并显示了S.E.。水平虚线表示病毒检测的下限。
图19显示在pFLC.2G+.hc(嵌合病毒rPIV3-1的反基因组cDNA克隆)内引入cp45的3处L基因突变。pTM(L)942/992/1558(A)是带有cp45内3处突变的L基因质粒克隆。PIV3L蛋白内第942位氨基酸突变是tyr(wt)被取代(cp45)，消除了临近的一个Eae I位点来标记这一位点。同样，992突变是leu变成phe，同时消除一个Bsr I位点，1558突变是thr变成ile，同时消除一个AvaII位点。将pTM(L)942/992/1558内的2.9kb SphI-NheI片段导入pFLC.2G+.hc(B)，该质粒带有rPIV3-1的全长cDNA克隆，由此得到pFLC+.hc.cp45L(C)。对(B)和(C)中的结构而言，黑框表示丁肝病毒核酶和T7终止子的位置，底纹区是PIV1的HN和F ORF。空心方框代表PIV3衍生的序列。pFLC+2G.hc.cp45L在转染中用于产生减毒嵌合重组病毒rPIV3-1.cp45L。
                     具体实施方式的说明
本发明提供了从分离的聚核苷酸分子，最好是cDNA，生产和修饰感染性PIV的组合物和方法。感染性PIV颗粒由一重组表达系统产生，该系统允许在感染性PIV内引入指定的改变。这些修饰具有广泛的用途，包括开发带有预先设定的减毒突变的减毒活疫苗。
本发明感染性PIV由一种或多种编码PIV基因组或反基因组RNA的分离聚核苷酸分子与一种或多种编码核衣壳转录、复制必需病毒蛋白的聚核苷酸经胞内或无细胞共表达而产生。用于共表达产生感染性PIV的病毒蛋白中，包括主要核衣壳蛋白(N)，核衣壳磷蛋白(P)，大聚合酶蛋白(L)，融合蛋白(F)，血凝素-神经氨酸酶糖蛋白(HN)和基质蛋白(M)。本发明还用到PIV C、D和V ORF的产物。
本发明构建了编码PIV基因组或反基因组的cDNA，用于在胞内或体外与必需病毒蛋白共表达形成感染性PIV。“PIV反基因组”指分离的正义聚核苷酸分子，被用作合成子代PIV基因组的模板。较好的是构建如下cDNA，它是对应于复制中间体RNA的PIV基因组正义链，或者是反基因组，所以就最不可能与编码核衣壳转录、复制必需蛋白的互补序列的正义转录产物杂交。
在本发明部分实施方案中，重组PIV(rPIV)基因组或反基因组只需含有使得所编码的病毒或亚病毒颗粒具有感染性的那些基因或它们的一部分。而且，这些基因或它们的一部分可以由一个以上聚核苷酸分子提供，即一个基因可以通过互补等形式来自另一个核苷酸分子。在另一实施方式中，PIV基因组或反基因组编码病毒生长、复制和感染所必需的全部功能，不需要辅助病毒参与，也不需要质粒或辅助细胞系提供的病毒功能。
“重组PIV”表示PIV或PIV样病毒或亚病毒颗粒，直接或间接由重组表达系统衍生得到，或由上述系统产生的病毒或亚病毒颗粒繁殖得到。重组表达系统将采用包含操作性连接了转录单元的重组表达载体，所述转录单元包含至少一个基因元件或对PIV基因表达具有调节作用的元件，例如启动子、转录成PIV RNA的结构或编码序列，以及合适的转录起始和终止序列。
要从cDNA表达的PIV基因组或反基因组产生感染性PIV，基因组或反基因组需与PIV的N、P和L蛋白共表达，这些蛋白为以下目的所必需：(i)产生能够进行RNA复制的核衣壳，和(ii)为RNA复制和转录提供子代核衣壳。基因组核衣壳的转录提供了其它PIV蛋白，启动了生产性感染(productive infection)。或者，生产性感染所需的其它PIV蛋白可以由共表达提供。
也可以体外(无细胞)一起合成PIV反基因组或基因组和上述病毒蛋白，例如，联合的转录和翻译反应，然后转染到细胞内。或者，可以体外合成反基因组或基因组RNA，然后转染到表达PIV蛋白的细胞内。
在本发明的某些实施例中，编码产生转录、复制性PIV核衣壳所必需蛋白的互补序列是由一个或多个辅助病毒提供的。这些辅助病毒可以是野生型或突变株。较好的是，辅助病毒能够在表型上区别于PIV cDNA所编码的病毒。例如，希望有一种单克隆抗体，它与辅助病毒发生免疫反应但不与PIV cDNA所编码的病毒反应。这类抗体可以是中和抗体。在有些实施例中，抗体可用于亲和性层析将辅助病毒与重组病毒分离。为了获得这类抗体，可以在PIV cDNA内引入突变以提供辅助病毒的抗原多样性，例如引入HN或F糖蛋白基因内。
在本发明其它实施例中，N、P、L以及其它所需PIV蛋白由一个或多个与编码基因组或反基因组的载体相同或不同的非病毒表达载体编码。还可以根据需要包含其它蛋白，这些蛋白由自己的载体编码，或由编码N、P、L以及其它所需PIV蛋白、或完整基因组或反基因组的载体所编码。可以如下实现由转染质粒表达基因组或反基因组和蛋白质，例如：各cDNA处于T7 RNA聚合酶启动子调控下，该启动子则来自于T7 RNA聚合酶表达系统(例如表达T7 RNA聚合酶的重组牛痘病毒MVA)(Wyatt等， Virology，210：202-205(1995)，本发明在此引用参考)的感染、转染或转导。病毒蛋白和/或T7 RNA聚合酶也可以通过转化哺乳动物细胞或预制mRNA或蛋白的转染获得。
可以如下构建PIV反基因组用于本发明，例如：通过PIV mRNA或基因组RNA的逆转录拷贝经聚合酶链反应等(PCR，参见美国专利4,683,195和4,683,202；PCRProtocols：A Guide to Methonds and Application，Innis等编，Academic Press，SanDiego(1990))将各克隆cDNA节段组装起来，共同代表一个完整的反基因组。例如，产生的第一结构所含的cDNA包含反基因组的左端，开始于一个合适的启动子(例如T7 RNA聚合酶启动子)，将该结构组装到合适的表达载体内，例如质粒、粘粒、噬菌体或DNA病毒载体中。可以通过诱变和/或插入合成多接头来修饰载体，所述的多接头含有为协助组装而设计的独特限制性位点。为了方便N、P、L和其它所需PIV蛋白的制备，它们可以组装在一个载体或多个不同载体内。反基因组的右端可以根据需要包含其它序列，例如侧翼核酶或串联T7转录终止子。核酶可以是榔头型的(例如Grosfeld等，(1995)，同上)，此时将产生一个包含单个非病毒核苷酸的3’端，核酶还可以是任何其它合适的核酶(例如丁肝病毒的核酶(Perrotta等， Nature350：434-436(1991)，本发明引用参考))，此时将产生没有非PIV核苷酸的3’端。然后，左端和右端通过一常规限制性位点连接。
在构建cDNA过程中或之后，可在PIV基因组或反基因组内形成多种核苷酸插入、缺失和重排。例如，可以合成特定的所需核苷酸序列，利用常规限制性位点将其插入cDNA内合适的区域。或者，可以用例如定点诱变、丙氨酸扫描、PCR诱变或其它本领域熟知的技术将突变引入cDNA。
构建编码基因组或反基因组的cDNA的其它方法包括改进PCR条件后进行逆转录PCR(例如Cheng等在 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5695-5699(1994)中所述，本文应用参考)，用以将cDNA亚单位组分减少到一至二段。在另一种实施方式种可用不同的启动子(如T3或SP6)或使用不同核酶(例如丁肝病毒的核酶)。可用其它DNA载体(例如粘粒)来扩增以便更好地容纳更大的基因组或反基因组。
可通过转染、电穿孔、机械插入、转导等将编码基因组或反基因组的分离的聚核苷酸(例如cDNA)插入合适的宿主细胞，所述的宿主细胞能够支持生产性PIV感染，例如HEp-2、FRhL-DBS2，LLC-MK2、MRC-5和Vero细胞。可将分离的聚核苷酸序列转染到培养细胞内，例如通过磷酸钙介导的转染(Wigler等， Cell14：725(1978)；Corsaro & Pearson， Somatic Cell Genetics 7：603(1981)；Graham & Van der Eb，Virology 52：456(1973))、电穿孔(Neumann等， EMBO J.1：841-845(1982))、EDAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等， Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc。，NY(1987))、阳离子脂质体介导的转染(Hawley-Nelson等， Focus 15：73-79(1993))或例如LipofectACE(Life Technologies，Gaithersburg，MD)等市售转染试剂，本发明引用参考了所有以上文献。
如前所述，在本发明部分实施例中，N、P、L和其它所需PIV蛋白是由一个或多个辅助病毒编码的，这些辅助病毒在表型上区别于编码基因组或反基因组的病毒。N、P、L和其它所需PIV蛋白也可以由编码基因组或反基因组的同一个载体或另外的载体编码，或者是上述载体各种形式的组合。根据需要可以包含其它蛋白，它们由自己的载体编码，或由编码N、P、L和其它所需PIV蛋白中一个或多个或编码完整基因组或反基因组的载体编码。
本发明的组合物和方法允许对PIV分子生物学和病理机制进行分析和操纵，例如用特定突变改变选定PIV蛋白的功能或表达来进行。使用这些方法和组合物能够方便地区分引起所需表型变化的突变和沉默的偶发突变，能够选择表型特异性突变以便插入重组PIV基因组或反基因组用于生产疫苗。
本发明所提供的PIV修饰是为了生产改良的疫苗病毒，例如为了加强病毒的减毒和疫苗的免疫原性，为了消除与不良免疫病理相关的表位，为了包容抗原性漂移(drift)等。为了达到上述及其它目的，本分明的组合物和方法允许在PIV基因组或反基因组内引入多种修饰以便结合成感染性重组PIV。例如，可在PIV克隆内加入编码保护性抗原或表位的外源基因或基因节段，以产生能够诱导抗PIV和另一病毒或保护性抗原来源的致病因子的免疫力的PIV病毒株。或者，可以插入全部或部分外源基因，它们编码诸如细胞因子等免疫系统调节剂，以加强疫苗病毒的免疫原性。
本发明PIV克隆可包含的其它突变包括例如以异源基因或基因节段(例如编码糖蛋白胞质尾的基因节段)取代PIV克隆内对应的基因或基因节段。或者，可以改变PIV克隆内基因的相对位置，可用其反基因组的对应序列或选定的失能基因(例如引入终止密码子阻止基因的表达来消除功能)取代PIV基因组启动子。还可在PIV内进行其它修饰来协助操纵，例如在各非编码区或编码区或其它区域插入独特限制性位点。此外，可以将非翻译基因序列删除以提高供插入外源序列的容量。
这样，通过提供感染性PIV克隆，本发明允许在PIV基因组(或反基因组)内重组产生广泛的改变来得到针对所需表型变化的特定突变。“感染性克隆”指这样的合成或其它来源的cDNA或其RNA产物：它们能够直接进入感染性病毒，转录成基因组或反基因组RNA，这些RNA能够作为模板生产出感染性病毒或亚病毒颗粒的基因组。如前所述，可用多种常规技术(例如定点诱变)在基因组或反基因组的cDNA拷贝内引入指定突变。本文所述用基因组或反基因组cDNA次级片段组装完整基因组或反基因组cDNA的优点在于：可以对各区域分别进行操纵，小的cDNA对象比大的cDNA对象更易于操纵，也就更易于组装成完整的cDNA。这样，就可用完整的反基因组或基因组cDNA或其选定的次级片段作为模板进行寡核苷酸引导的诱变。这可以通过单链噬菌粒形式的中间体实现，例如使用Bio-RadLaboratories(Richmond，CA)的MUTA-gen试剂盒；或采取直接以双链质粒作为模板的方法，例如Strategene(La Jolla，CA)的Chameleon诱变试剂盒；或使用含目的突变的寡核苷酸引物或模板进行的PCR。然后可将突变后的次级片段组装到完整反基因组或基因组cDNA内。还有其它已知的诱变技术，它们都适合在本发明所述的PIV反基因组或基因组cDNA内产生所需的突变。
所以，在实施例之一中，突变是用Bio-Rad Laboratories的MUTA-gen噬菌粒体外诱变试剂盒引入的。简而言之，将编码PIV基因组或反基因组的cDNA克隆入质粒pTZ18U，用于转化CJ236细胞(Life Technologies)。根据供应商的说明制备噬菌粒制剂。改变基因组或反基因组内所需位置的核苷酸，设计用于诱变的寡核苷酸。然后扩增含有基因组或反基因组发生了遗传改变的质粒。
突变可从单核苷酸改变直到包含一个或多个基因或基因组节段的大cDNA节段的插入、缺失或取得，各不相同。基因组节段可对应于结构和/或功能性结构域，例如蛋白质的胞质、跨膜或胞外结构域，活性位点(例如介导与其它蛋白质结合或其它生物化学反应的位点，例如刺激抗体结合和/或体液免疫或细胞介导的免疫应答等的表位位点)。就此而言，可用的基因组节段长约15至35个核苷酸(如编码表位等蛋白质功能小结构域的基因组节段)，直至50、75、100、200-500和500-1,500或更多个核苷酸。
将指定突变引入感染性PIV的能力具有许多用途，包括操纵PIV的病理和免疫原性机制。例如，通过插入消除或降低蛋白表达水平或产生突变蛋白的突变，可以操纵N、P、M、F、HN和L以及C、D和V ORF产物等PIV蛋白的功能。在这类修饰之一中，可修饰F蛋白剪切位点处的一段序列，并可在实验动物内常规测定该修饰对所得PIV在组织培养物中的生长、感染和病理方面的作用。
本发明的方法和组合物还可以方便地操纵诸如启动子、基因内区域和转录信号等各种基因组RNA结构特征。反式作用蛋白和顺式作用RNA序列的作用很容易测定，例如，在使用PIV最小基因组的平行试验中使用完整的反基因组cDNA(Dimock等， J.Virol.67：2772-8(1993)，本文引用参考)，它的拯救依赖性可用于鉴定非复制依赖性感染病毒内因抑制性太强而无法恢复的那些突变。
本发明还提供工具和方法以便区分沉默偶发突变与引起表型变化的突变的工具和方法，例如将可疑突变(例如负责诸如温度敏感性和在选定宿主内复制等一种或多种表型)单独或以各种组合形式引入感染性野生型PIV基因组或反基因组。这一方法能够鉴定出负责所需疫苗表型特征的突变，所述表型特征例如减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬菌斑、宿主范围限制等。然后可将由此鉴定得到的突变以各种组合形式引入，以修饰病毒减毒到所需的适当水平。而且，本发明还能够将来自不同毒株的突变组合在同一疫苗株内。
如前所述，可根据它们改变某选定PIV蛋白的表达和/或功能的能力来选择引入重组改变的PIV克隆内的突变，从而得到所需的表型变化或达到多种其它目的。
所需的表型变化包括例如培养物中病毒生长的变化、温度敏感性、噬菌斑大小、减毒性和免疫原性。例如，可通过核苷酸插入、重排、缺失或取得来修饰编码基因组或反基因组的聚核苷酸序列，从而得到减毒性、温度敏感性、冷适应性、小噬菌斑、宿主范围限制、基因表达改变、或免疫原性表位改变。
本发明内容之一中，鉴定了生物学方法产生的减毒PIV内发生的突变，将它们单独或组合引入全长PIV克隆，测定了含有引入突变的获救重组病毒的表型。在实施例中，将由生物学方法产生的突变病毒所展示的不同于野生型PIV的氨基酸改变(例如具有ts、ca或att表型的PIV突变体所展示的改变)结合到重组PIV克隆内。来自生物学方法产生的突变PIV的这些改变在重组克隆内造成所需的特征，例如，来自HPIV3突变株JS cp45的某突变造成减毒表型。较好的是，利用不同于对应的野生型或生物学方法产生的突变序列的两至三个核苷酸改变来引入这些突变，这样能够使突变稳定而不至于发生遗传回复。
本发明还提供感染性克隆基因组或反基因组内以选定组合方式引入了多重、特异表型突变的重组PIV。这一方法与表型评价相联合，提供了具有诸如减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬菌斑、宿主范围限制等所需特征的重组突变PIV。这样，在此公开的PIV克隆实施例包含一个或多个，以至少2个为佳，减毒突变，例如来自诸如JS cp45等生物学方法产生的突变PIV的ts、ca或att突变。在本发明中，在重组PIV内引入生物学方法产生的突变的靶基因包括核衣壳蛋白N，磷蛋白P，大聚合酶亚基L，基质蛋白M，血凝素-神经氨酸酶蛋白HN，融合蛋白F和C、D、V ORF产物的基因。靶基因还包括基因外序列，例如PIV基因组3’前导序列或尾序列内的序列，以N基因起始信号为例的基因起始或基因终点序列等顺式作用元件内的序列。在此，重组PIV内结合的突变包括例如造成聚合酶L基因内氨基酸改变(例如Tyr942、Leu992和/或Thr1558)的一个或多个核苷酸取代。例如，在此公开的PIV重组体内，Tyr94被His取代，Leu992被Phe取代，Thr1558被Ile取代。这些突变已经成功地被包含在本发明例举的多种PIV重组体内，包括后文实施例中的r942，r992，r1558，r942/992，r992/1558，r942/1558或r942/992/1558重组体。取自生物学方法产生的PIV突变株的其它突变例包括N蛋白内的一处或多处突变，包括对应于JS cp45中残基Val96或Ser389处的特异性突变。更具体地说，所述突变是Val96变成Ala或Ser389变成Ala。后文实施例还公开了编码C蛋白内一处氨基酸取代的重组PIV，例如对应于JS cp45内Ile96处的突变，以Ile96取代成Thr为佳。取自生物学方法产生的PIV突变株的其它突变例包括F蛋白内的一处或多处突变，包括取自JS cp45，对应于其残基Ile420或Ala450处的突变，以Ile420取代成Val或Ala450取代成Thr为佳。本发明的其它PIV重组体在HN蛋白内引入了一处或多处氨基酸取代，后文例举了一种具有对应于JS cp45内Val384处的突变的重组PIV，以Val384取代成Ala为佳。本发明这方面的其它实施例还包括在基因组外序列(例如重组PIV基因组或反基因组的3’前导序列)内包含一处或多处突变的重组PIV 。这方面的突变实例包括位于3’前导序列内发生在对应于JS cp45第23、24和/或28位核苷酸处的一处或多处突变，例如第23位核苷酸处的T变成C，第24位核苷酸处的C变成T，或第28位核苷酸处的G变成T。其它基因外突变还包括N基因起始序列内的一处或多处突变，例如后文例举的N基因起始序列内对应于JS cp45第62位核苷酸处的突变，以A变成T为佳。在后文实施例中，对以上例举的取自生物学方法产生的突变PIV的突变进行了评价，并以单独和/或组合方式并入重组PIV，得到新的减毒侯选疫苗，例如本发明例举的rcp45、rcp45 3’NCMFHN、rcp45 3’NL、、rcp45 3’N和rcp45F。本发明范围内的其它PIV重组体将包含以上例举的重组体内的一种或多种突变直至它们的全部，还包括根据本发明所述在生物学方法产生的其它PIV突变株内鉴定到和引入重组PIV的突变。
用本发明方法鉴定到的突变被编成一张“菜单”，以各种组合形式引入，以将疫苗病毒校准到选定的减毒、免疫原性和稳定性水平。在优选实施例中，本发明以涉及相同或不同基因的其它类型突变对取自生物学方法产生的PIV内一种或多种突变(例如ts、ca或att突变)提供了补充。其中，突变的靶基因包括核衣壳蛋白N、磷蛋白P、大聚合酶亚基L、基质蛋白M、血凝素-神经氨酸酶蛋白HN、融合蛋白F和C、D、V ORF的产物。内容之一，本发明提供如下重组PIV，其中至少一处减毒突变发生在PIV聚合酶基因L内，所涉及的核苷酸取代造成生物学方法产生的PIV突变株(例如JS cp45)的ts或att表型。在此公开的HPIV3重组体实例包括后文实施例所述的r942，r992，r1558，r942/992，r992/1558，r942/1558或r942/992/1558重组体。例举的这些PIV克隆含有一处或多处核苷酸取代，造成聚合酶基因内的氨基酸改变，例如Tyr942、Leu992和/或Thr1558处的改变。在公开的PIV重组体中，His取代了Tyr942，Phe取代了Leu992，和/或Ile取代了Thr1558。较好的是，两到三处突变包含在造成减毒突变的同一密码子内，从而提高抗表型回复的稳定性。
在其它方面的内容中，可在重组PIV基因组或反基因组内制造多种其它基因改变，用于将生物学方法产生的突变PIV中的一种或多种减毒突变单独或一起结合到感染性重组PIV内。可以完整或部分方式插入或取代以异源基因(例如来自不同PIV毒株或RSV或麻疹病毒等非PIV来源的基因)，可改变基因的顺序，可消除基因重叠，可用反基因组的对应序列取代PIV基因组启动子，甚至可删除全部的非必需基因。内容之一中，选定的PIV基因，例如C、D或V ORF被功能性地删除，得到具有新表型(例如加强了体外生长和/或体内减毒)的重组PIV。本发明的感染性PIV克隆还可以经基因工程改造加强其免疫原性并诱导强于天然感染所产生的保护作用，或消除与不良免疫病理反应相关的表位。本发明疫苗的加强免疫原性解决了调控PIV的最大障碍之一即突然感染所诱导免疫力的不完全性。
就此而言，可将其它基因或基因节段插入PIV基因组或反基因组之内或附近，将其置于公用或独立的一套转录信号调控之下。感兴趣的基因包括编码细胞因子(例如IL-2到IL-15，尤其是IL-2、IL-6和IL-12等)和富含T辅助细胞表位的蛋白质的基因。其它蛋白可以表达为独立的蛋白，也可以与HN等PIV蛋白之一的另一拷贝经基因工程表达为嵌合蛋白。这样，就能够定量和定性地修饰和改善抗PIV免疫应答。
可用于本发明的其它突变涉及用反基因组内的对应序列取代基因组的3’端，这涉及RNA复制和转录的改变。此外，可以缩短或加长基因间区域或改变序列含量(sequece content)。另外，用于配制疫苗的PIV可方便地修饰成可包容循环病毒内的抗原性漂移。修饰通常位于HN和F蛋白内。例如，选定的完整HN或F基因的反基因形式或编码它们的特定免疫原性区域的节段结合到PIV基因组或反基因组cDNA内，这可通过取代感染性克隆内对应区域，或添加一个或一个以上基因拷贝使得所得克隆内包含多份反基因形式来实现。然后，将修饰后PIV cDNA产生的子代病毒用于疫苗接种以抵抗出现的毒株。
用于本发明感染性PIV的其它突变包括：在PIV最小基因突变分析中鉴定到的位于顺式作用信号内的突变。例如，对前导序列、尾序列和侧翼序列的插入和缺失分析鉴定得病毒启动子和转录信号，并提供了一系列与RNA复制或转录减弱程度相关的突变。这些顺式作用信号的饱和诱变(每个位置都依次修饰成其它3种核苷酸)还鉴定出减弱或加强RNA复制或转录的突变。这些突变都可以如前所述插入完整的基因组或反基因组内。
在PIV克隆内还可以进行其它修饰来协助操纵，例如在各基因间区域或其它区域插入独特限制性位点。还可以删除非翻译序列来增加外源基因插入容量。
我们在本发明重组PIV内制造了一些与相同或不同PIV或其它来源的“对应”基因或基因节段具有结构或功能关联的某些基因或基因节段取代、插入、缺失或重排(例如，取代编码选定蛋白或蛋白区域的某基因节段，例如胞质尾、跨膜区或胞外区，表位或表位区，结合位点或区域，活性位点或包含活性位点的区域等)。这类修饰产生的新重组体与野生型或亲代PIV或其它毒株相比具有所需表型变化。例如，这类重组体可表达某PIV的胞质尾和/或跨膜区与另一PIV的胞外区融合而成的嵌合蛋白。这类重组体的其它实例能表达双份蛋白区域，例如双份免疫原性区域。
“对应”基因、基因节段、蛋白或蛋白区在此通常具有为异种来源(例如，来自不同PIV基因，或代表不同PIV型或毒株内的相同基因或基因节段(即同源或等位)。本发明所选的典型对应部分具有大致相同的结构特征，例如对应部分编码对等的蛋白或蛋白结构域，例如胞质区、跨膜区、胞外区、结合位点或区域、表位位点或区域等。对应结构域及其编码的基因节段包含具有相同生物活性的多种大小和序列差异。例如，由本发明对应基因节段编码的两选定蛋白结构域具有性质基本相同的活性，例如提供跨膜功能，特异性结合活性，免疫识别位点等。更典型的是，对应部分(例如选定蛋白节段或蛋白)之间共有的特定生物活性在量上也基本相当，即，两者相关活性水平的量性差异不超过30％，不超过20％更好，不超过5-10％则还要好。
用于产生本发明重组PIV的对应基因和基因节段及其它聚核苷酸宜具有与选定聚核苷酸“参比序列”(例如另一选定对应序列)基本一致的序列。“参比序列”在此是用作序列比较基准的一段确定序列，例如某全长cDNA或基因的一个节段，或一段完整的cDNA或基因序列。通常，参比序列至少长20个核苷酸，较多的是至少25个核苷酸，经常，至少50个核苷酸。由于两段聚核苷酸可能分别(1)包含两聚核苷酸彼此相同的一段序列(即完整聚核苷酸序列的一部分)，(2)还包含两聚核苷酸彼此不同的序列，所以，比较两段或两段以上聚核苷酸通常是通过比较“比较窗”内两聚核苷酸的序列，以确定和比较序列类似的局部区域。“比较窗”在此指至少包含20个相邻核苷酸位的一段概念性节段，就两序列的最佳排列而言，比较窗内的聚核苷酸序列部分可包含与参比序列相比不超过20％的增加或缺失(即缺口)。为了对齐比较窗，可采用Smith & Waterman  Adv.Appl.Math，2：482(1981)的局部同源算法进行最佳序列排列，Needleman & Wunsch， J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源排列算法，Pearson & Lipman， Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85：2444(1988)的相似性检索法(本发明参考了以上各文献)，采用以上算法的机算形式(Wisconsin遗传软件包第7.0版种的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 ScienceDr.Madison，WI，本发明参考了以上各文献)，或采用检查法，由此，用各种选定方法得到最佳排列(即使得比较窗内的序列一致性百分比最高)。“序列一致性”表示两段聚核苷酸序列在比较窗内的序列全同(一个一个核苷酸地比较)。“序列一致性百分比”是通过比较比较窗内两最佳排列序列而算得的，确定两序列内出现相同核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)位置的数量，得出匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗内位置总数(即窗的大小)，将结果乘以100，得到序列一致性百分比。“基本一致”在此表示聚核苷酸序列的如下特征，即在至少20位核苷酸(通常至少25-50个核苷酸)的比较窗内，该聚核苷酸所含序列与参比序列具有至少85％的序列一致性，至少90％-95％更好，更多的情况下具有至少99％的序列一致性，所述的序列一致性百分比是通过在比较窗内将参比序列与所含缺失或增加总量不超过参比序列之20％的聚核苷酸进行比较而算得的。参比序列可以是一段大序列的亚序列。
除上述聚核苷酸序列关系外，本发明重组PIV编码的蛋白质或蛋白质区域也常选具有保守性关联的，即与选定参比多肽相比具有基本相同或相似的序列。对多肽而言，“序列一致性”表示各肽在对应位置具有相同的氨基酸。“序列相似性”表示各肽在对应位置具有相同或相似(即保守性取代)的氨基酸。“序列基本相同”的两肽在最佳排列(例如用默认缺口重量(gap weights)的GAP或BESTFIT程序)时具有至少80％的序列一致性，以至少90％为佳，至少95％或以上则更好(例如99％序列一致性)。“基本相似”表示两肽具有与序列相似性相应的百分比。较好的是，不完全相同的残基位置是由保守性氨基酸取代造成的。保守性氨基酸取代指侧链类似的残基之间的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷胺酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的一组氨基酸是半光氨酸和甲硫氨酸。较好的保守性氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸，天冬酰胺-谷胺酰胺。本发明采用20种天然氨基酸的常规缩写(Immunology-A Synthesis(第2版，E.S.Golub & D.R.Gren，编，Sinauer Associates，Sunderland，MA，1991)，本文参考了该文献)。20种常规氨基酸的立体异构体，α-α二硫代氨基酸、N-烷基氨基酸等非天然氨基酸，乳酸以及其它非常规氨基酸也可能是本发明多肽的合适组分。非常规氨基酸的例子包括：4-羟基脯氨酸，γ-羧基谷氨酸，ε-N，N，N-三甲基赖氨酸，ε-N-乙酰基赖氨酸，O-磷酸丝氨酸，N-乙酰基丝氨酸，N-甲酰胺甲硫氨酸，3-甲基组氨酸，5-羟基赖氨酸，ω-N-甲基精氨酸和其它类似的氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟基脯氨酸)。此外，氨基酸可通过糖基化或磷酸化等来修饰。
由cDNA表达的基因组或反基因组产生的感染性PIV可以是任何一种PIV或PIV样毒株，例如人的、牛的、鼠的等。为了产生保护性免疫应答，PIV毒株可以是被免疫者的内源毒株，例如用于免疫人的人PIV。但是，可以将基因组或反基因组修饰成表达异源PIV基因或基因节段，或表达其它异源基因或基因节段，例如RSV或麻疹病毒的。所以，意在给人使用的感染性PIV可以是经修饰而包含来自牛或鼠PIV的基因或基因节段的人PIV，以达到减毒目的。BPIV3具有宿主范围突变，使得它只能在猕猴(rhesus monkey)和人中复制(Karron等， 同上，1995a；vanWyke Coelingh等，1988，本发明全面参考了该文献)。通过取代本发明rPIV内对应序列将鉴定出造成所需表型(例如宿主范围限制)的BPIV3基因、突变和顺式作用元件，并将它们结合到进一步修饰后的rPIV中形成更有用的疫苗。还以类似方法鉴定了向猕猴提供非ts宿主范围减毒突变的JS cp45的突变，并结合到本发明的经修饰rPIV中。或者，可以修饰牛PIV，使之包含编码能引发抗人PIV感染保护的蛋白或免疫原性表位的基因。例如，可用人PIV的糖蛋白基因取代对应的牛糖蛋白基因，使得牛PIV在人体内引发抗人PIV毒株的保护性免疫应答。
在实施例中，各基因、基因节段、或者某PIV的单个或多个核苷酸被来自异源PIV或其它来源的对应序列取代。例如，用异源的某PIV内选定蛋白的基因节段(例如编码胞质尾、跨膜区或胞外区，表位或表位区，结合位点或结合区、活性位点或包含活性位点的活性区，等)取代另一PIV内的对应基因节段得到新的重组体，例如表达某PIV的胞质尾和/或跨膜区与另一PIV的胞外区融合而成的嵌合蛋白。就此而言，较好的基因组节段约含15-35个核苷酸(如编码蛋白质功能的小域，例如表位位点的基因节段)，直至含约50，75、100、200-500、或500-1,500或更多(如果是编码大结构域或蛋白区的基因节段)核苷酸。
在本发明内容之一中，某PIV毒株的HN和/或F蛋白的选定区域通过取代进入某异源PIV克隆形成重组病毒，该病毒能够在免疫宿主内激发抗两种PIV毒株的交叉保护免疫应答。另一方面，本发明提供一种经修饰的PIV克隆，它包含PIV基因组或反基因组序列和至少一种非人PIV序列形成的嵌合体，例如包含来自人和牛PIV的序列的聚核苷酸。用对应的牛或鼠PIV序列取代人PIV编码序列或非编码序列(例如启动子、基因终点、基因起点、或基因间或其它顺式作用元件)得到具有多种可能减毒效应的重组体。例如，在其它有用的减毒效应中，在人细胞内无效的异源PIV基因，异源序列或蛋白与生物反应性人PIV序列或蛋白(例如一般与被取代序列或蛋白合作来进行病毒转录、翻译和组装等的序列或蛋白)的不相容性，常会产生宿主范围效应。在本发明另一部分内容中，外源基因或基因节段(有时是非编码核苷酸序列)插入PIV基因组造成所需的基因组延长，继而产生更为需要的表型效应。基因组延长可能弱化所得PIV克隆的毒性，这取决于插入片段的长度。此外，由插入重组PIV内的基因表达某些蛋白将因为蛋白的作用而导致病毒减毒。已知，牛痘病毒内表达的IL-2是这样(参见，Flexner等， Nature，33：259-62(1987))，估计，γ-干扰素也一样。
与本发明重组PIV内完整病毒基因或基因节段改变有关的缺失、插入、取代及其它突变产生了高度稳定的侯选疫苗，这对于免疫抑制个体来说尤为重要。这类突变中许多会弱化所得疫苗株的毒性，另一些则造成不同的所需表型变化。例如，已知某些病毒基因编码特异性干扰宿主免疫力的蛋白(参见，Kato等， EMBO.J.，16：578-87(1997)，本发明参考了该文献)。在疫苗株内消除这类基因估计能够降低毒性和致病性和/或改善免疫原性。
本发明中较好的是，经修饰的PIV克隆代表两种或更多种人PIV基因组的嵌合体，例如，包含HPIV3的聚核苷酸序列与另一种或多种异源人PIV(例如HPIV1和HPIV2)的序列连接而成的克隆。这样，人PIV3的各基因或基因节段可被来自HPIV1或HPIV2的对应基因或基因节段取代或补充，反之亦然。在后文实施例之一中，本发明提供了PIV克隆，rPIV3-1，在其中用HPIV1的HN和F糖蛋白基因取代了在HPIV3背景下各自的对应基因，得到了具有亲代毒株双方免疫特征的嵌合病毒。
在本发明另一方面内容中，具有其它前述基因或基因节段改变的嵌合PIV或PIV克隆通过引入一个或多个取自生物学方法产生的突变PIV(例如HPIV3 JS cp45)的减毒突变，获得减毒、进一步减毒的嵌合突变衍生物。例如，可如前所述用异源人PIV、牛PIV或鼠PIV的对应序列取代一段或多段人PIV编码或非编码聚核苷酸，这一改变又可与一种或多种取自生物学方法产生的减毒PIV突变株的造成例如ts、ca或att表型的突变相结合，从而获得减毒或(与嵌合克隆或生物学方法产生的亲代病毒相比)进一步减毒的疫苗病毒。或者，某非必需基因或基因节段(例如C、D、V ORF)的功能性缺失可在重组PIV内与一种或多种取自生物学方法产生的PIV突变株的造成ts、ca或att表型的突变相结合，产生减毒疫苗株。因为不同的选定突变的组合效应，这些组合修饰得到的重组PIV具有如下所需表型特征，例如病毒得率提高，强化减毒和/或对减毒表型回复突变具有遗传抗性。
在一种组合突变设计中提供了一种经修饰PIV，它含有人PIV基因组或反基因组序列与至少一段非人PIV序列的嵌合体，例如包含人和牛PIV序列的聚核苷酸，它还可以包含取自生物学方法产生的PIV的一种或多种突变，例如一种或多种天然发生的ts、ca或att突变。或者，经修饰PIV可以是两种或更多种人PIV基因组的嵌合体，例如包含来自HPIV3的序列与来自一种或多种异源人PIV(例如HPIV1和HPIV2)的序列连接而成的聚核苷酸，它还包含取自生物学方法产生的PIV(例如取自JS cp45等生物学方法产生的突变PIV的造成s、ca或att表型的核苷酸取代)的一种或多种ts、ca、att或其它选定突变。更具体地说，某克隆中，人PIV3的某基因或基因节段被来自HPIV1或HPIV2的对应基因或基因节段取代或补充，反之亦然，该克隆因大聚合酶L基因内编码提供ts突变的氨基酸取代的核苷酸改变而被减毒或进一步减毒。例如，本发明提供如下PIV克隆：HPIV3背景中的对应基因被HPIV1的HN和/或F糖蛋白基因取代，所得嵌合克隆的表型被N、P、L、M、HN、F、C、D和V基因其中之一或多个内编码的ts、ca或att突变进一步修饰。根据在此公开的可能突变菜单可进行多种组合，从而将疫苗病毒调校到选定的减毒、免疫原性和稳定性水平，以获得减毒效果和免疫原性满意，兼具多种PIV毒株免疫特征的嵌合病毒。本发明内容之一提供了如下重组PIV：在嵌合PIV背景中包含至少一个发生在PIV聚合酶基因L内的一处减毒突变(例如后文实施例中的重组r942、r992、r1558、r942/992、r942/1558、r992/1558或r942/992/1558)。例如，这方面有用的嵌合PIV重组体中，一个或多个来自例如HPIV1的HN和/或F糖蛋白基因或基因节段取代了异源背景内例如HPIV3克隆内的对应基因，并进一步包含一个或多个减毒突变，例如来自生物学方法产生的突变PIV的聚合酶基因内造成氨基酸改变(例如第942位的Tyr变成His，第992位的Leu变成Phe，第1558位的Thr变成Ile)的核苷酸取代。后文列举的这类嵌合减毒重组体之一是rPIV3-1.cp45L，它是rPIV 3-1的衍生物，包含了上述JS cp45中全部三处L基因突变。
为开发疫苗可包含在嵌合PIV背景中的其它突变将选自其它基因内生物学方法产生的突变，或在重组基因组内用标准定点诱变或其它纯重组诱变方法来重新创造。本发明重组PIV内容纳生物学方法产生的突变或创新突变的靶基因包括核衣壳蛋白N、磷蛋白P、大聚合酶亚基L、基质蛋白M、血凝素-神经氨酸酶蛋白HN、融合蛋白F和C、D、F ORF的产物。靶基因还包括基因外序列，例如PIV基因组3’前导序列或尾区内的序列。以上例举的已鉴定、非嵌合重组PIV内的突变可方便地结合在同一嵌合PIV背景内，例如rPIV3-1。例举的这些突变包括N蛋白内的一处或多处突变，其中包括对应于JS cp45内Val96或Ser389处的特定突变。更具体地说，所述突变是Val96变成AIa，Ser389变成AIa。希望包含在嵌合PIV重组体内的还有C蛋白内的突变，例如对应于JS cp45内Ile96处的突变，以Ile96变成Thr为佳。包含在嵌合PIV背景内的其它突变还有例如F蛋白内的一处或多处突变，例如对应于JS cp45内Ile420或Ala450处的突变，例如Ile420被Val取代或Ala450被Thr取代。本发明的其它嵌合PIV重组体包含HN蛋白内的一处或多处氨基酸取代，例如对应于JS cp45内Val384处的突变，例如Val384取代成Ala。其它嵌合重组体包含基因外序列例如重组基因组或反基因组3’前导序列内的突变。这类突变例如3’前导序列内发生在对应于JS cp45内第23、24、28和/或45位核苷酸处的突变，例如第23位的T变成C，第24位的C变成T，第28位的G变成T，或第45位的T变成A。包含在嵌合PIV背景内的基因外突变还包括N基因起始序列内的一处或多处突变，例如本发明中N基因起始序列内对应于JS cp45第62位核苷酸处的突变，例如A变成T。例举的这些突变在后文被评价并组合到重组PIV中，利用本发明的方法和工具，可方便地将它们结合到一个嵌合PIV重组体内，并单独和/或以组合方式造成所需的表型变化，从而得到本发明进一步减毒的嵌合疫苗。
在另一组合突变设计中，本发明提供了如下修饰的PIV：它包含来自生物学方法衍生PIV或重组产生于本分明PIV克隆内的前述ts、ca或att突变其中之一或多种，还含有本发明公开的其它不同突变(例如PIV N、P、L、M、HN、F、C、D或V基因或基因节段，或诸如RSV或麻疹病毒等其它来源基因或基因节段的缺失、增加或重排)。此时，还可以根据本发明公开的突变菜单进行多种组合，从而调校疫苗病毒至选定水平的减毒性、免疫原性和稳定性。这样，本发明提供了如下重组PIV，它们表现出生物学方法衍生PIV突变株的至少一种减毒突变(例如JScp45内PIV聚合酶基因L内的突变)或重组产生的突变，它们还包含一种或多种其它改变，这些改变选自例如代之以或引入从非PIV来源的异源基因或基因节段(例如免疫原性RSV或麻疹基因或表位，或编码细胞因子的基因)，改变表达水平的病毒基因顺序变化，去除基因重叠，用反基因组对应序列取代PIV基因组启动子，缩短、延长或删除基因间区域(例如为了增加插入外源序列的容量)，减弱或加强RNA复制或转录的顺式作用信号内的突变，插入独特的限制性位点，或删除甚至全部非必需基因，等等。
就疫苗用途而言，根据本发明产生的病毒可直接用于疫苗制剂，或根据需要用公知的方法低温干燥。冻干病毒通常保持在约4℃。如后文所述，在临用前将冻干病毒再生在含有或不含佐剂的稳化溶液(例如盐水或含有SPG、Mg++和HEPES)中。
本发明PIV疫苗包含作为活性成分的免疫有效量的本发明所产PIV。可用生理学认可的运载体或佐剂将经修饰病毒引入宿主。可用的运载体在本领域众所周知，包括例如水、缓冲水溶液、0.4％的盐水、0.3％的甘油、透明质酸等。所得的水溶液可以原样包装或低温干燥待用，如前所述，冻干制剂需在临用前与无菌溶液混合。组合物可包含模拟生理条件所需的药学认可的辅助物质，例如pH调节剂或缓冲剂，张力调节剂，润湿剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、去水山梨醇月桂酸酯、油酸三乙醇酸胺等。认可的佐剂包括不完全Freund佐剂，MPLTM(3-o-去乙酰单磷酰基脂质体A；RIBI ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT)和IL-12(Genetics Institute，Cambridge MA)，以及本领域公知的其它合适佐剂。
用在此公开的PIV组合物经气溶胶剂、滴剂、口服、局部或其它途径免疫后，宿主的免疫系统通过产生针对PIV病毒蛋白(例如F和HN糖蛋白)的特异性抗体对疫苗产生应答。用免疫有效量的本发明PIV接种的结果是：宿主变得对PIV感染具有至少部分或完全免疫力，或对发展成中度或严重PIV感染有抵抗力，尤其是对下呼吸道感染。
接受疫苗的宿主可以是被疑感染了PIV或其密切相关病毒的各种哺乳动物，和能够对接种用毒株的抗原产生保护性免疫应答的宿主。所以，本发明提供了制造各种人用或兽用疫苗的方法。
将包含本发明PIV的疫苗组合物给予被疑或可能感染PIV的宿主以加强宿主自身的免疫应答能力。这样的量被称为“免疫有效量”。在这种用途中，欲在有效剂型中给予的精确PIV量取决于宿主的健康状态和体重，给予方式，制剂性质等，但一般为每宿主约103至约106噬斑形成单位(PFU)病毒或更多，更常用的是每宿主约104至约105PFU病毒。不论何时，疫苗制剂所提供的本发明经修饰PIV量都应足以有效保护宿主患者抵抗严重或危及生命的PIV感染。
根据本发明产生的PIV可以与其它PIV血清型病毒或毒株组合，以获得抗多种PIV血清型或毒株的保护。或者，如本发明所述，可通过基因工程将多种PIV血清型或毒株的保护性表位组合到同一病毒内，由此获得抗多种PIV血清型或毒株的保护。通常，当给予不同病毒时，它们是同时混合和同时给予的，但也可以分别给予。单株疫苗免疫将保护宿主抵抗相同或不同血清型的毒株。
有时，可能需要将本发明PIV疫苗与诱导针对其它病原因子(尤其是其它小儿病毒)的保护性应答的疫苗组合。在本发明另一方面内容中，PIV可以用作其它病原(例如呼吸道合疱病毒(RSV)或麻疹病毒)的保护性抗原的载体，这是通过将编码那些保护性抗原的序列结合到本发明所述用于产生感染性PIV的PIV基因组或反基因组内实现的。与本发明有关的RSV cDNA克隆以及其它公开内容可参见待批美国专利申请08/534,768，60/021,773，08/720,132，60/046,141，60/047,634和08/892,403，以及PCT专利申请PCT/US97/12269，本文参考了以上文献。
可以一次或多次给予本发明疫苗组合物。在新生儿或婴儿中，可能需要多次给药来引发足够水平的免疫。给药应在出生头一个月内开始，并根据维持抗天然(野生型)PIV和/或其它所述病毒感染的充分保护所需，以2个月、6个月、1年或2年为间隔贯穿整个儿童期。同样，特别容易发生重复或严重PIV感染的成人(例如看护工、日间看护工、小儿的家庭成员、老人和心肺功能衰弱者)可能需要多次免疫来形成和/或维持保护性免疫应答。
本发明疫苗诱导的免疫力的水平可以通过测定中和性分泌性血清抗体的量来监测。根据这些测量结果，可调节疫苗的剂量，或根据需要重复接种来维持所需的保护水平。而且，不同的疫苗病毒对不同受体群具有不同的优点。例如，表达T细胞表位内富含的某蛋白的PIV基因工程株可能对成人比对婴儿更好。
本发明另一方面内容中，PIV被用作呼吸道瞬时基因疗法的载体。根据这一实施例，重组PIV基因组或反基因组包含一段编码感兴趣的基因产物的序列。感兴趣的基因产物受控制PIV表达的同一启动子调控，或受另外的启动子调控。将重组PIV基因组或反基因组与N、P、L以及其它所需PIV蛋白共表达产生的，且包含编码感兴趣的基因产物的序列的感染性PIV给予患者。给药通常通过气溶胶剂、喷雾剂或其它局部使用方法给于受治患者的呼吸道。重组PIV的给予量足以表达治疗或预防水平的所需基因产物。在此方法中可给予的代表性基因产物最好适合于瞬时表达，例如白介素-2，白介素-4，γ干扰素，GM-CSF，G-CSF，促红细胞生成素，其它细胞因子，葡糖脑苷酯酶，苯丙氨酸羟化酶，囊性成纤维跨膜电导调节剂(CFTR)，次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶，细胞毒素，肿瘤抑制基因，负义RNA和疫苗抗原。
以下实施例是对本发明的说明而非限定。
                             实施例I
             构建编码负义PIV基因组RNA的质粒p218(131)
构建称为p218(131)的全长cDNA克隆(根据布达佩斯条约保存在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，USA.保藏号为97991)，它编码HPIV3 JS毒株基因组序列全部15462个核苷酸。将肝炎δ核酶毗连在基因组序列的3’端，这样，自切割将产生HPIV3的3’端(Perrotta & Been， Nature 350：434-436(1991)，本发明参考了该文献)。将T7转录终止子置于δ核酶之后。T7启动子与基因组序列的5’端毗连，这样，首先合成的是HPIV3基因组的5’末端核苷酸。在这种构型中，cDNA编码PIV3基因组RNA完整的负义拷贝，包含正确的基因组终止子，不含其它异源核苷酸。
蔗糖梯度离心纯化病毒粒子，从中分离出RNA，经逆转录(RT)和聚合酶链反应(PCR)构建了14个重叠亚克隆(A*-L，括弧中的字母代表单个质粒而不是特定的病毒基因)，由这些亚克隆组装成HPIV3 cDNA(Stokes等， 同上，1992；。Stokes等，同上，1993；本文参考了上述文献)。亚克隆覆盖了以下基因组RNA的核苷酸(编号以3’端为1)：1-2058(A*)，1874-3111(A’)，3086-5140(C)，4348-5276(C’)，5072-6695(D*)，5904-8532(E)，7806-9898(F)，9632-10740(F’)，9760-10955(G)，10862-11925(H)，11835-12868(I)，12426-13677(J)，13630-14496(K)和14467-15462(L)。用常规克隆技术将各片段克隆到pBluescript KSII(Strategene，La Jolla，CA)中，并进行完全测序。
然后按MUTA-GENE方法(BioRad，Hercules，CA)，用单链DNA中间体对质粒p(L)进行定点诱变，引入T7启动子。T7启动子的位置使得转录准确地开始于HPIV3基因组的5’端，所用的负义诱变引物是：5’-AATACGACTCACTAT A * ACCAAACAAGAGAA C-3’(SEQ ID NO：2；T7序列以斜体表示，HPIV3特异性序列以下划线表示，HPIV3的5’末端核苷酸即基因组第15462位核苷酸用星号表示)。这一修饰后的p(L)称为p(L*)。用负义诱变寡核苷酸5’-CCAAGTACTA TGAGATGCTTGATT-3’(SEQ ID NO：3)，以相同的方法修饰质粒p(E)称为p(E*)，在HPIV3的第7903，7913，7915位向HN基因内插入3处核苷酸取代(下划线)(图1)。这些取代消除了一个HgaI位点，插入了一个ScaI位点，并修饰了所编码的HN蛋白的第370位氨基酸，消除了被单克隆抗体(mAb)423/6和170/7识别的表位(van Wyke Coelingh等， J.Virol.61：1473-1477，(1987)，本文参考了上述文献)。一步一步将亚克隆p(E*)至p(K)组装到p(L*)质粒内，得到p(E*FF’GHIJKL*)(图1A)。该质粒包含HPIV3的核苷酸5904-15462，T7启动子与核苷酸15462连接位于基因组的5’末端。亚克隆p(A*)至p(E)组装成另一重叠亚克隆p(A*A’CC’D*E)，其中包含HPIV3的核苷酸1-8532。
对亚克隆p(E*FF’GHIJKL*)和p(A*A’CC’D*E)都进行了完全测序。除上述引入的点突变之外，cDNA与原JS HPIV3序列(Stock等， 同上，1992)的区别还在于第1615位N基因内的单核苷酸取代，它造成了所编码蛋白第506位氨基酸处的取代。还在L基因内第10355，11333和15248位发现了另外三处核苷酸取代，它们不改变所编码的蛋白(图2)。这三处非编码改变被保留，用作鉴定cDNA衍生重组病毒(rPIV)的附加序列标记，N基因内的突变则如后文所述被更正。
然后修饰亚克隆p(A*A’CC’D*E)，在HPIV3的1位旁插入丁肝病毒δ核酶和T7终止子。过去构建过一个HPIV3最小基因组，其中，通过侧翼的肝炎δ病毒反基因核酶的自切割而产生HPIV3基因组的3’端( GGT↓GGG)(下划线)(Dimock & Collins， J. Virol.67：2772-2778(1993)；Perrotta & Been， 同上，(1991)，本发明参考了上述文献)。核酶之后是T7转录终止子。该最小基因组cDNA作为模板用于PCR，将核酶切割位点旁的序列修饰成Smal位点(CCC↓GGG)，并在T7终止子的下游一侧插入一个Apal位点(GGGCC↓C)。将PCR产物克隆到经BssHII消化的pKSII中，并补平成为钝端，由此得到p218。
将P218设计成：任何序列都能够通过钝端连接引入打开的SmaI位点，而且其RNA转录产物将在δ核酶切割位点(NNN↓GGG)被剪切。用HgaI和SalI(8533)消化亚克隆p(A*A’CC’D*E)，由此释放出HPIV cDNA，用dTNP和T4 DNA聚合酶补平成钝端。HgaI位点在HPIV3第1位上游10核苷酸处，在被消化和补平时留下一个开始于HPIV3第1位的钝端。凝胶纯化经修饰的HgaI-SalI片段，将其克隆到p218的SmaI位点内。用Kunkel诱变(Kunkel等， Methods Enzymol.154：367-382(1987)，本发明参考了该文献)将N基因内的突变(第1615位的T核苷酸)更正为JS wt序列(第1615位的A核苷酸)(见GeneBank登录号#Z11575，本文纳为参考)。该质粒称为p218(A*A’CC’D*E)(图1)。
将p(E*FF’GHIJKL*)内含有T7启动子和HPIV3 cDNA从7438至15462位核苷酸的XhoI-Ngo MI片段克隆到p218(A*A’CC’D*E)的XhoI-Ngo MI窗内(图1)。由此在HPIV3第7438位核苷酸处将两段HPIV3 cDNA片段连接起来，得到包含全长HPIV3 cDNA的质粒，它编码负义基因组RNA，并含有上述HN基因内3处需要的突变和L基因内3处偶发突变。最终结构称为p218(131)(图1；SEQ ID NO：1)，在NCI Frederick CancerResearch and Development Center(Frederick，MD)，用Taq DYE脱氧终止剂循环测序试剂盒(ABI，Foster City，CA)对它进行了自动完全测序。由此鉴定到HN基因内的另一处改变，即HN基因内第7593位的C变成了T，这使得第263位氨基酸由苏氨酸变成了异亮氨酸，参见图2。
                          实施例II
                   HPIV3的转录和RNA复制系统
本实施例说明用于产生3型人副流感病(HPIV3)毒重建(reconstituted)转录和RNA复制系统的组合物和方法。用重组牛痘病毒T7 RNA聚合酶驱动转染质粒胞内表达的组分形成了这一典型系统。该系统以HPIV3基因组RNA的负义类似物为基础，其中的病毒基因被删除，代之以编码细菌氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的聚核苷酸。由共转染的质粒表达N、P和L蛋白，用于指导有效的转录和RNA复制。本实施例的转录产生亚基因组聚腺苷酸化mRNA，这可以方便地通过寡聚(dT)层析来分离。本实施例的RNA复制产生最小反基因组和最小子代基因组，根据它们对微球菌核酸酶消化的抗性证明它们被衣壳化。
A) 病毒与细胞
根据Fuerst等所述( Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，83：8122-8126，1986，本发明全面参考了该文献)得到表达噬菌体T7 RNA聚合酶的重组牛痘病毒，vTF7-3。用补充了2％胎牛血清(FBS)、50μg/ml硫酸庆大霉素和2mM谷胺酰胺的OptiMEM1(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)将HEp-2单层培养物维持在37℃，5％CO2中。
B)cDNA
将对应于HPIV3 JS毒株(GenBank #Z11575；Stokes等，1992)的N、P和L基因ORF的cDNA分别克隆到质粒pTM-1的NcoI-SalI窗内，其中的转录由T7 RNA聚合酶介导，翻译则由外源ORF前的内部核糖进入位点介导(Elory-Stein等， Proc.Natl. Acad.Sci.USA.86：6126-6130(1989)，本发明全面参考了该文献)。先用PCR修饰各基因，在转录起始位点设置一个NcoI或NcoI兼容位点，在下游末端设一个SalI位点。
与p218相似但没有肝炎δ病毒核酶的质粒p(131)在各次PCR中用作模板。扩增N ORF的引物是CCCTATAATTTCAACATGTTGAGCCTATTTG(SEQ ID NO：4；相对正义链的正向引物)和GATTAAAATGTTGGTCGACTTAGTTGCTTCC(SEQ ID NO：5；斜体表示限制性酶切位点，粗体表示翻译启始位点)。PCR产物是一段两侧为AflIII和SalI位点的1578bp片段，将它克隆到pTM-1的NcoI-SalI窗内，得到pTM(N)。
用于扩增PIV3磷蛋白(P)ORF的引物是5’-CCATAGAGAGTCCATGGAAAGCGACGCTAAAAACTATC-3’(SEQ ID NO：6；正向引物)和5’-CGGTGTCGTTTCTTTGTCGACTCATTGGCAATTGTTG-3’(SEQ ID NO：7；反向引物)。将基因组RNA JS毒株的全长cDNA用作PCR的模板。所得的PCR产物是一段两侧为NcoI和SalI限制性位点(斜体)的1851bp片段。然后将PCR产物克隆到pTM-1的NcoI-SalI窗内，得到pTM(P)。
另一次PCR是扩增PIV3的磷蛋白P ORF，不包括C ORF。仍然用p131作为模板cDNA。使用另一正向引物和相同的反向引物来扩增不包括C的PIV3 P ORF：5’-CCATAGAGAG TCCATGGAAA GCGA CGCTAA AAACTATC-3’(SEQ ID NO：74；正向引物)和5’-CGGTGTCGTT TCTTTGTCGACTCATTGGCAATTGTTG-3’(SEQ ID NO：7；反向引物)。所得的PCR产物是一段两侧为NcoI和SalI限制性位点(斜体)的1851bp片段。正向引物内有下划线的核苷酸代表P ORF内的一处沉默核苷酸取代，但是它使得CORF的启始密码子变成了苏氨酸。C ORF的下一个启始密码子在下游400核苷酸开外。所以只产生P蛋白。然后将PCR产物克隆到pTM-1的NcoI-SalI窗内，得到另一质粒pTM(P无C)。
HPIV3的L ORF分三段克隆到pTM-1中：末端来自PCR产物，主体是来自p218(131)的一段限制性片段。用引物GCAAAGCGTGCCCGGGCCATGGACACTGAATCTAACAATGGC(SEQ ID NO：8)和GAAATTCCTTAATCGATTCTCTAGATTC(SEQ lD NO：9)扩增LORF的上游末端。由此得到1,020bp的PCR产物L1，其中，全长基因组中第8625-9645位的两侧是上游末端的SmaI和NcoI位点和下游末端的一个ClaI位点(都以斜体表示)。用引物CCCATCAACTGTAACATACGTAAGAAAGAC(SEQ ID NO：10)和GGTTAGGATATGTCGACATTGTATTTATG(SEQ ID NO：11)扩增LORF的下游末端。由此得到1,733bp的PCR产物L2，其中全长基因组第13,645-15,378位的两侧是SnaBI和ScaII位点(斜体)。用ClaI和PstI消化质粒p(131)，得到包含全长基因组第9,630-14,120位的4,487bp L中段。L1和L中段在共有ClaI位点连接，克隆到pBluescript的SmaI-PstI窗内，得到p(L1+L中段)。然后将L2片段克隆到p(L1+L中段)的PstI-SalI窗内，得到两侧为NcoI和SalI的完整L ORF。然后将它克隆到pTM-1的NcoI-SalI窗内，得到pTM(L)。用双脱氧核苷酸测序法证实了PCR产生的pTM(N)(SEQ NINO：20)、pTM(P)(SEQ NI NO：21)和pTM(L)(SEQ NI NO：22)区段的序列。
为了提高T7的转录效率，对一段编码负义PIV最小基因组的cDNA即PIV3-CAT(-)进行了某些修饰(Dimock & Collins， J.Virol.67：2772-2778(1993)，本发明全面参考了该文献)。PIV3-CAT(-)包括HPIV3基因组3’端的111个核苷酸和5’端的115个核苷酸，它们与CAT ORF的负义拷贝融合。该cDNA被设计成：经HgaI线性化并用T7RNA聚合酶转录后得到具有正确的HPIV3基因组末端的最小基因组。用在cDNA末端增加后续延长段的诱变寡核苷酸，进行连续两轮PCR，以肝炎δ核酶取代HgaI位点(Perotta & Been， Nature 350：434-436(1991)，本发明全面参考了该文献)，由此通过自切割产生正确的HPIV3基因组3’末端。紧接在核酶之后插入一个T7转录终止信号(图3)，由此得到PIV3-CAT-δ。
用PCR诱变修饰PIV3-CAT-δcDNA，利用尾序列和T7启动子两侧的限制性位点在T7启动子和最小基因组5’末端之间插入1、2或3个G残基。这一修饰提高了T7转录的效率。在初步实验中，包含两个G残基的最小基因组PIV3-CAT-GG在下述重建转录和复制系统中表达CAT最活跃，因此被用于此后所有的衍生物。
如下所述，用重叠PCR诱变进一步修饰PIV3-CAT-GG cDNA，同时在两个位点引入修饰。第一，在正义cDNA的δ核酶与T7转录终止子之间插入序列T7CT，该序列包含串联的牛痘病毒早期RNA聚合酶(T5NT)转录终止基序(Yuen & Moss， Proc. Natl.Acad.Sci.USA.84：6417-6421(1987)，本发明全面参考了其中内容)(图1)。加入该基序和后文所述的第二基序，以避免牛痘病毒早期RNA聚合酶不加区别地转录CAT基因。第二，在N非翻译区与CAT基因的连接处修饰最小基因组cDNA插入片段，使之包含(i)插入在正义cDNA链内相对于编码最小基因组第103位至109位的第二牛痘病毒终止基序(T5AT)，和(ii)在最小基因组第112位插入0至6个G残基(负义)(图3)。重叠PCR诱变包括如下进行的三组反应(PCR1、2和3)。PCR1是一组7个平行反应(PCR1(0)至(+6))，以PIV3-CAT-GG cDNA为模板，以下两段诱变寡核苷酸为引物：正向引物是111GGGGTTATGCTACTGCAGGCTTTTTTTCTCCCTTAGCCATCCG-62(SEQ ID NO：12)；反向引物是124CTC CATTCTAGA(N)TTATAAAAATTATAGAGTTCCC90(SEQ ID NO：13)。第一段寡核苷酸中的粗体表示上游的串联牛痘终止子，第二段寡核苷酸内的粗体表示第二终止子。该反应扩增核酶和相邻的前导序列，并插入上述突变。PCR2是单独一个反应，用PIV3-CAT-GG cDNA作为模板，用在NgoMI位点上游的质粒序列内杂交的正向引物(图3)和与反应1正向引物互补的反向引物。所以，PCR1和PCR2的产物在后一段序列处是重叠的。凝胶纯化PCR1)(0)至(+6)和PCR2的产物。将PCR1(0)至(+6)的产物分别与各份PCR2产物混合，在第三反应中扩增(PCR3(0)至(+6))，该反应也包含PCR2的正向引物和PCR1的反向引物。用在质粒特异性序列内切割的NgoMI和在CAT基因上游末端处切割的XbaI消化PCR3(0)至(+6)产物(图3)，然后克隆到PIV3-CAT-GG的NgoMI-XbaI窗内。由此得到一组编码最小基因组的cDNA，根据插入G残基的数量，命名为PIV3-CAT-0至PIV3-CAT+6。用双脱氧核苷酸测序法验证PCR产生的各DNA区域的结构。
C) 转染
HEp-2细胞在6格培养板上生长到90％铺满率。给6格板的每一格(1.5×106个细胞)转染以0.4μg pTM(P)，0.4μg pTM(N)，0.05μg pTM(L)，和0.4μg最小基因组质粒。将质粒加入0.1ml OptiMEM(Life Technologies)，与含12μl LipofectACE(LifeTechnologies)的0.1ml OptiMEM混合。室温孵育约15分钟后，各格加入含2％胎牛血清和1.5×107pfu vTF7-3的0.8ml OptiMEM1。培养板37℃孵育12小时，然后用含2％胎牛血清的新鲜OptiMEM1替换培养基。然后37℃培育细胞共48小时，收获细胞，进行RNA分析和CAT试验。各最小基因组一式三份(三格)，将它们刮到培养基中并合并。
D) CAT试验
取1份代表3.33％(1.5×105个细胞)的各如前收获细胞合并样品进行CAT试验。以1,000rpm离心样品5分钟，弃清液。用1ml 40mM Tris，pH7.5，1m MEDTA，150mMNaCl洗涤细胞悬液，重悬在50μl 0.25M Tris，pH7.5中。用3次冻融循环制备裂解液，8,000rpm离心5分钟进行澄清。取1μl裂解液，用常规试验方法(Corman等， Mol.Cell. Biol.2：1044-1051(1982)，本发明全面参考了其中内容)测试其将D-苏氨酸-[二氯乙酰基1-14C]氯霉素乙酰化的能力。用薄层层析法显示乙酰化作用，用磷造影剂分析法(phosphoimager analysis)定量(Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA)。
E) RNA分析
将各合并样品的其余收获细胞分成3等份，用于分离核衣壳内的RNA，总RNA和mRNA。3份样品1,000rpm离心5分钟，弃清液。将2份细胞重悬在50μl含1％Triton X-100，0.5％DOC的RSB(10mM NaCl，10mM Tris，pH7.5，1.5mM MgCl2)中。然后向其中一份添加50μl 10mM Tris pH7.5，1mM CaCl2和20μg(1mg/ml贮备液)微球菌核酸酶，另一份中添加不含微球菌核酸酶的上述混合物(Baker & Moyer， J.Virol.62：834-838(1988)，本发明全面参考了其中内容)。加微球菌核酸酶的目的是破坏非衣壳化RNA，在预备试验中对所用条件进行优化。混合物在30℃孵育30分钟，根据供应商的说明Trizol(Life Technologies)分离RNA。第3份细胞悬液用Trizol纯化其中的RNA，纯化后的RNA用寡聚(dT)纤维素层析分离成聚腺苷酸化流份和非聚腺苷酸化流份(Grosfeld等， J.Virol.69：5677-5686(1995)，本发明全面参考了其中内容)。RNA样品在含0.44M甲醛的1.5％琼脂糖凝胶上电泳，转移到硝酸纤维素膜上(Chomczynski， Anal.Biochem 201：134-139(1992)，本发明全面参考了其中内容)，与标准特异性核探针杂交，用磷造影剂检测法定量。
                              实施例III
                   经修饰的PIV3最小基因组的构建和表达
在本实施例中，构建了一组cDNA来编码PIV3最小基因组，其差别在于长度相差1个核苷酸。在这种重建的系统中，长度为6的偶数倍的最小基因组的转录和RNA复制效率最高。其中，副粘病毒属和麻疹病毒属的成员一般遵循“六倍数规则”，即，基因组(或最小基因组)只有当它们的长度是6的倍数时(这被认为是与衣壳化NP蛋白相关的核苷酸残基要求的准确间隔)才会有效复制。但是，最近的发现显示：长度比6的偶数倍多或少1个核苷酸的最小基因组惊人的活跃，尤其在RNA的复制中。
构建了1组7个cDNA，编码7种PIV3-CAT最小基因组，称之为PIV3-CAT 0至+6，它们只在长度上相差1个核苷酸(图3)。每个最小基因组都是HPIV3基因组RNA的一段短负义类似物，其中病毒基因已被删除并代之以CAT ORF的负义拷贝。CAT ORF的两侧是基因组RNA的N和L基因的非翻译节段，N GS和L GE转录基序，以及3’前导序列和5’尾基因外终止子。以T7 RNA聚合酶毗连的启动子作为各PIV3-CAT最小基因组的5’末端。构建该启动子是为了如前所述在所编码最小基因组的5’末端增加2个非病毒G残基。毗连T7启动子非转录核心的附加G残基的存在提高了其转录效率，预备工作显示：在后文所述的重建系统中，2个G残基的存在产生的了最高的活性。这2个G残基不计算在最小基因组的长度内。最小基因组3’末端是由相邻肝炎δ病毒核酶自切割产生的，这种切割将产生正确的3’末端核苷酸。这7种PIV3-CAT最小基因组只因为在N非翻译区和CAT基因间插入了0至6个残基而在长度上相差1个核苷酸(图3)，它们的长度为898至904个核苷酸。唯有PIV3-CAT+2的长度是6的偶数倍(必需指出的是，每个最小基因组都在T7启动子的5’末端包含3个附加非病毒G残基，但它们可能在HPIV3介导的胞内RNA复制过程中丢失。
将各种PIV3-CAT cDNA转染到已经感染了vTF7-3的HEp-2细胞内，vTF7-3是表达T7 RNA聚合酶的一种重组牛痘病毒。以相同的方式转染以编码受T7启动子调空的编码N、P和L蛋白的质粒。如前所述对P cDNA进行定点诱变，去除C ORF的翻译起始位点。感染后48小时收获细胞。取1份细胞悬液进行CAT酶试验(图4)。其余细胞分成三等份，如前所述进行RNA分析。
进一步修饰最小基因组cDNA，使之在正义质粒链内包含PIV3-CAT插入点上游的两个串联牛痘病毒早期转录终止基序(T7NT)和该链内紧邻CAT ORF上游的第三基序(T5NT)(图3)。这是为了防止牛痘病毒聚合酶对CAT ORF的不加区别地转录(Grosfeld等，(1995)，同上)。当各PIV3-CAT最小基因组被N、P和L质粒补足时，可重复测得CAT的表达(图4)，CAT的检测依赖于所有这3种PIV蛋白。但是，PIV3-CAT+2的表达要高得多，该结构的核苷酸长度是6的偶数倍。最小基因组和支持质粒的优选比例和用量取决于CAT酶的表达。
                           实施例IV
                    用PIV最小基因组合成正义RNA
通过检测两过程的RNA产物来确认PIV最小基因组的转录与复制。如以上实施例所述，用三份相同的细胞悬液进行RNA分析。其中一份如下所述用于寡聚(dT)分析。另两份用除垢剂裂解，与微球菌核酸酶一起孵育或进行假处理。然后甲醛琼脂糖凝胶电泳分离出RNA，转移到硝酸纤维素膜上，通过与负义CAT核探针的杂交进行分析。图5A的上下分图分别显示微球菌处理和假处理的裂解液的RNA。
对假处理裂解液的RNA分析显示：N、P和L质粒对各最小基因组的补充合成了一种RNA，其大小与931-核苷酸RSV-CAT C2最小基因组表达的RNA所构成的标记物(Grosfeld等，(1995)，同上)极其相似。图5B显示了磷造影分析。当N或L质粒被缺失时，极少或没有RNA被测得，这证明：这些RNA是重构的PIV3聚合酶的产物。
每个PIV3-CAT最小基因组预计编码两种正义RNA，即最小反基因组和亚基因组CAT mRNA。每个最小反基因组据估计都与其最小基因组准确互补，长度为898-904个核苷酸。用GS和GE信号界定了估计的亚基因组mRNA，估计其长度为804个核苷酸，且包含100至200核苷酸长度的聚A尾。
图5A中检测到单独一条正义RNA凝胶条带(下分图)，这说明凝胶电泳不能分辨反基因组和mRNA。所以，用微球菌核酸酶处理来鉴定反基因组RNA，因为只有反基因组(和基因组)将被衣壳化从而抗消化，而mRNA则不。微球菌核酸酶的这一用途是公知的(Baker & Moyer(1988)， 同上)，选用的条件经RSV最小复制子验证显示能完全降解HEp-2细胞裂解液所含的mRNA。纯化留下的RNA，用负义核探针进行Northern印迹分析(图5A，上分图)，用磷造影定量(图5B，注意：在该分析中，对微球菌处理和非处理RNA的量分别进行了校正)。以上研究揭示存在着一群受保护的RNA，它们对应于被衣壳化的正义最小反基因组。在数次实验中，这种受保护RNA占正义RNA的约3％至15％。
就总RNA和抗微球菌RNA而言，最高累积都出现在+2最小基因组例中，该最小基因组长900个核苷酸，所以是6的倍数。但是，当最小基因组的长度不是6的倍数时，也有大量RNA积累，尤其是比+2最小基因组长或短1个核苷酸的+1和+3最小基因组。实际上，+1和+3最小基因组产生的衣壳化反基因组量是+2最小基因组产量的85％和72％(图5B)。即使是效率最低的+5最小基因组，根据对累积衣壳化RNA的测定，其活性也达到+2最小基因组的20％。在测定正义RNA总量时，+1和+3最小基因组产生的总RNA约为+2最小基因组的52％和45％。
为了证实存在着亚基因组mRNA，用最后一份收获细胞悬液纯化RNA。然后对其进行寡聚(dT)层析。对不能结合和结合后被低盐缓冲液洗脱的RNA进行Northern印迹杂交分析(图6A)和磷造影(图6B；注意：此时，结合和非结合RNA-起相对+2最小基因组的结合RNA进行了校正)。以上分析显示：如同对亚基因组mRNA的估计，约64％的正义RNA被聚腺苷酸化。+2最小基因组的mRNA累积最大。但是，其它最小基因组也有大量mRNA累积。+1和+3最小基因组合成的mRNA约分别为+2最小基因组的30％和20％，活性最低的最小基因组约为其13％。
                                实施例V
                        用PIV最小基因组合成负义RNA
以上各实施例中各种PIV3-CAT最小基因组指导mRNA和衣壳化正义最小基因组的合成，后者是RNA复制的第一步。RNA复制的第二步是由最小反基因组产物合成衣壳化的子代基因组。为了评价这后一过程，对前一实施例所述的假处理和核酸酶处理裂解液用正义CAT核探针进行Northern印迹杂交分析(图7A)，并用磷造影定量(图7B)。
对假处理裂解液的RNA分析显示(图7A上图)各样品，包括N或L支持质粒被缺失的阴性对照都胞内累积了相当数量的最小基因组。图5A-B和图6A-B所示的分析显示，在上述条件下，正义RNA的合成不明显。所以，N或L缺失时观察到的最小基因组可能不是由重构HPIV3聚合酶介导的RNA复制的产物，而一定是转染质粒T7转录的产物。
据估计，重构HPIV3聚合酶产生的最小基因组是衣壳化的，而T7RNA聚合酶产生的最小基因组则是非衣壳化的。所以，用图5A-B同一微球菌核酶处理样品的RNA制备与正义CAT核探针杂交的第二印迹(图7A，上分图)。结果显示：正如估计的那样，无N蛋白时累积的最小基因组RNA全被降解(图7A，上分图，泳道1)。无L时累积的最小基因组也基本上都对降解作用敏感(图7A，上分图，泳道2)。无L，仅有N和P时，没有有效合成的质粒衍生的最小基因组。
当一组三种支持质粒都存在时，每个最小基因组都累积大量抗微球菌核酸酶的最小基因组RNA(图7A，上分图)。和正义RNA的情况相同，+2最小基因组的子代最小基因组最多。+1和+3最小基因组次之，基因组RNA量约为+2最小基因组的67％和42％。
以上实施例显示，HPIV3 N、P和L蛋白是转录和RNA复制的必要充分条件。重构PIV3聚合酶介导的转录和RNA复制这一牢固特性证实了所编码蛋白的功能。我们进而估计，表达系统中包括其它病毒蛋白将增强或修饰这些过程。在本发明组合物和方法中共表达PIV C、D，可能还有V，将可用于(例如)增强和/或修饰RNA的复制。为此，可根据前述方法构建和试验质粒，实现上述元件之一或多种的共表达，确定它们对PIV转录和RNA复制的作用，以及它们在合适的感染模型中对PIV表型的作用。
                              实施例VI
                       由cDNA构建感染性重组PIV
以下实施例说明的是通过4种由质粒携带的cDNA的胞内共表达来产生感染性重组PIV(rPIV)。这些cDNA分别编码完整的HPIV3基因组，HPIV3核衣壳蛋白N，磷蛋白P和聚合酶蛋白L。
A) 病毒和细胞
根据Wyatt等， Virol.210：202-205，1995(本发明全面参考了该其中内容)所述修饰表达噬菌体T7 RNA聚合酶的牛痘毒株Ankara(MVA)，一种重组牛痘病毒。用补充以2％FBS、50μg/ml硫酸庆大霉素和2mM谷氨酰胺的OptiMEM1(Life Technologies)将Hep-2单层培养物维持在37℃，5％CO2中。如本发明全面参考的Hall等， Virus Res，22：173-184(1992)所述，在LLC-MK2细胞种繁殖HPIV3的JS野生毒株及其减毒ts衍生株JS cp45。
B) cDNA
如前所述构建编码完整HPIV3基因组序列的全长cDNA克隆p218(131)(图1，SEQ ID NO：1)。构建编码HPIV3完整的反基因组序列的第二种cDNA克隆p3/7(131)(SEQ ID NO：14)(根据布达佩斯条约保藏在ATCC，保藏号为97990)。p3/7(131)与p218(131)的区别在于T7启动子和核酶/T7终止子相对HPIV3 cDNA插入片段的位置被互换。这样，p3/7(131)中合成的第一个核苷酸是反基因组的5’末端，即基因组1位的正义互补核苷酸，由核酶切割确定的3’反基因组末端则是基因组第15462位的互补核苷酸。还构建了与p3/7(131)类似的第三种克隆p3/7(131)2G(SEQ ID NO：15)(根据布达佩斯条约保藏在ATCC，保藏号为97989)，所不同的是在反基因组5’末端和T7启动子之间插入了2个G残基。
为了构建p3/7(131)2G和p3/7(131)，修饰并连接质粒p(A*A’CC’D*E)和p(E*FF’GHIJKL*)，编码完整的HPIV3正义反基因组。首先，用PCR以T7启动子取代p(A*A’CC’D*E)内毗邻HPIV3 3’末端的T7终止子和δ核酶(参见图8)。正义引物5’-GGCCCGTCGACGCGTAATACGACTCACTATAGG ACCAAACAAGAG-3’(SEQ ID NO：18)使T7启动子(粗体)与HPIV3的前导序列毗连(加下划线的是HPIV3的序列)，两元件之间插有2个G残基以改善转录。为了克隆，将独特的MiuI位点(斜体)置于T7启动子的上游(图8)。负义引物5’-1224CGGCATCACGTGCTAC1209-3’(SEQ ID NO：19)跨越HPIV3 N基因的第1209-1224核苷酸，并包含天然HPIV3序列内的一个独特PmlI位点(斜体)。PCR产物和亲代模板p218(A*A’CC’D*E)都用MluI和PmlI消化，然后将PCR产物克隆到MluI-PmlI窗内。第二次PCR用相同的负义引物和在T7启动子与HPIV3 3’末端之间没有插入2G残基的正义引物进行。以上质粒称为p(左+2G)和p(左+)。p(左+2G)的构建见图8，p(左+)的构建遵循相同的方法。
PCR修饰质粒p(E*FF’GHIJKL*)，使δ核酶和T7终止子与HPIV3的5’末端相连(图9)。正义引物5’-GGATTTGCGCGC14813 AATTTAAATCATCTGG 14828-3’(SEQ ID NO：16)紧靠L基因内独特SwaI位点(斜体加下划线)上游引入了一个独特的BssH IT位点(斜体)。负义引物5’-CCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCAGCCC15462 ACCAAAACAAGAGA AGAACTCTGTTTGG 15435-3’(SEQ ID NO：17)在毗邻HPIV3基因组的5’末端(加下划线的是负义序列)旁引入包含天然的独特RsrII位点(斜体)的δ核酶的部分序列(粗体)。用BssHII和RsrII消化这一PCR产物，并克隆到p3/7质粒的BssHII-RsrII窗内(图9)。质粒p3/7与p218的区别仅在于δ核酶和T7终止子的取向相反。含有上述插入的p3/7质粒称为pPIV3-3/7，并包含与HPIV3 5’末端第651位核苷酸相连的完整δ核酶和T7终止子。然后分离质粒pPIV3-3/7的SwaI-NogMI片段，并克隆到p(E*FF’GHIJKL*)的SwaI和NgoMI窗内。所得的质粒p(右+)使得完整的δ核酶和T7终止子与HPIV3 5’末端相连(图9)。将p(右+)的XhoI-NgoMI片段克隆到p(左+)和p(左+2G)的XhoI-NgoMI中，分别得到质粒p3/7(131)(SEQ ID NO：14)和p3/7(131 2G)(SEQ ID NO：15)(图10)。它们都编码HPIV3反基因组RNA的完整正义类似物，后一种cDNA包含2个与T7启动子相连的G残基从而提高了转录效率。
C) 转染
Hep-2细胞在6格测试板种生长至90％铺满率。每一格(1.5×106)用三种支持质粒：0.4μg pTM(P)，0.4μg pTM(N)，0.05μg pTM(L)，和5μg全长基因组或反基因组HPIV3cDNA转染。将这些质粒加入0.2ml含12μl LipofectACE(Life Technologies)的OptiMEM1(Life Technologies)中。室温孵育约15分钟后，每格加入0.8ml含2％胎牛血清和1.5×107pfu MVA-T7的OptiMEM1。培养物在32℃孵育12小时，然后培养基换以新鲜的含2％胎牛血清的OptiMEM1。。培养物再在32℃孵育3天，然后收获并传代到新鲜的Hep-2单层上(第1代)。第1代培养物在32℃孵育5天，收获培养物中的病毒，在LLC-MK2培养物种传代1次，用血凝素-抑制作用(HAI)(van Wykecoelingh等， Virol 143：569-582，(1985)，本发明全面参考了其中内容)进行鉴定，确定它是否遗传单克隆抗体抗性突变(MARM)，这是回收自cDNA的病毒的标志。
D) 重组病毒的测序
从回收病毒中分离RNA，用RT-PCR确定HN和L基因内是否存在核苷酸序列标记。用200μl 25％聚乙二醇冰上孵育1小时沉淀1ml rPIV(1×107pfu/ml，第2代)，并12,000g离心15分钟。根据供应商推荐的方法用TRIzol试剂(Life Technologies)纯化RNA。根据供应商推荐的方法用Superscript试剂盒(Life Technologies)进行RT-PCR。对照反应仅省略了反应中的逆转录酶，为的是确定PCR产物是否只来自病毒RNA而不是可能的污染性cDNA质粒。用4对引物产生了核苷酸7334-8715、9364-10854、10939-15392和13623-15392的PCR产物。然后用循环双脱氧核苷酸序列分析法(New England Biolabs，Beverly，MA)测定所得PCR产物的序列。
                           实施例VII
              从编码负义基因组RNA的cDNA恢复重组病毒
用质粒p218(131)和3种支持质粒pTM(N)、pTM(P)、pTM(L)转染具有表达T7 RNA聚合酶的MVA的HEp-2细胞。对照组pTM(N)、pTM(P)、pTM(L)和MVA用来共转染不含p218(131)的HEp-2细胞。第4天，收获，并传代到新鲜HEp-2单层上培养5天，再在LLC-MK2培养物中传代5天(第2代)。然后对第2代收获物中的病毒进行HAI鉴定。来自接受3种支持质粒但不含全长基因组克隆p218(131)的培养物不产生HPIV3。rPIV恢复病毒被证实是HPIV3，因为它在HAI试验中与mAb77/5、101/1和454/11反应，这些抗体具有对HPIV3的特异性(表1)。鉴定后可假设它来自cDNA，因为它不与mAb170/7和423/6反应，这符合已经引入cDNA的MARM。
                            表1
        rJS-NS含有引入p218(131)全长负义cDNA中的MARM突变
            血凝素抑制作用   抗体效价                  所示mAb的倒数
  病毒   77/51   101/11   454/111   170/12   423/62
  JS wt3rJS-NS4   8003200   640025,600   64006400   25,600≤25   25,600≤25
1mAb77/5识别抗体表位IIB，mAb101/1和454/11识别HN糖蛋白的抗体表位IIIA，在p218(131)中，它们都不改变。
2都识别JS wt的抗体表位I的mAb170/7和423/6因为该位点的MARM突变不能识别rJS。
3生物学方法产生的野生型HPIV3 JS。
4负义基因组cDNA衍生的重组JS病毒。
为了确认rPIV的确恢复自cDNA，用侧接7处插入标记突变的4对引物，用野生型JS毒株HPIV3进行了平行的RT-PCR分析。每一种PCR产物的获得都依赖于包括RT，这表明它们都来自RNA而不是cDNA。对4种PCR产物的循环测序证实，rPIV序列包含所有7种标记，图11显示其中3种标记的测序结果。rPIV与JS在HN基因内有序列差异，包括核苷酸7903、7913和7915，很明显。对第7593、10355、11333和15248处的其它4处标记进行了类似的测序，rPIV包含全部突变。
以上结果显示从编码负义基因组RNA的cDNA成功恢复了感染性rPIV。这与大多数有关恢复非节段负义链RNA病毒的报道不同，区别在于恢复病毒所用的cDNA被设计成编码正义反基因组RNA(Baron & Barrett， 同上，1997；Collins等， 同上，1995；Conzelmann， 同上，1996；Garcin等， 同上，1995；Lawxon等， 同上，1995；Radeck等， 同上，1995；Whelan等， 同上，1995)。过去只报道过从编码基因组RNA的cDNA恢复感染性仙台病毒，但回收效率比用编码反基因组RNA的cDNA低得多(Kato等，1996)。在大多数其它研究中，是用反基因组cDNA而不是基因组cDNA恢复病毒(Lawson等，1995；Whelan等，1995)。人们已经注意到大量潜在问题可能解释这些难以控制的结果，所述的结果包括cDNA编码的RNA与支持质粒产生的mRNA的退火结合；产生无活性的杂交体(Conzelman， 同上，1996；Lawson等， 同上，1995)。人们已经注意到，T7 RNA聚合酶似乎倾向于在基因组RNA的基因连接处终止，这可能是因为GE信号的寡聚U段类似于T7 RNA聚合酶的天然转录终止信号(Whelan等， 同上，1995)。
                               实施例VII
                 从编码正义反基因组RNA的cDNA恢复重组病毒
根据以上详细说明，我们构建了p3/7(131)和p3/7(131)2G来编码产生重组PIV的正义反基因组。质粒p/3(131)2G与p3/7(131)的区别仅在于T7启动子和反基因组第一核苷酸之间多了2个G残基。在T7启动子和p3/7(131)2G的第一HPIV3核苷酸之间添加2个G残基是基于前述实施例已经证明：多这2个G残基(而不是多0、1或3个G残基)显著提高最小复制子的复制水平。
和用于p218(131)质粒的方法相同，分别将这两个反基因组cDNA[p3/7(131)和p3/7(131)2G]与N、P和L支持质粒一起转染到细胞内，并同时用MVA-T7重组病毒感染。回收各反基因组cDNA产生的感染性病毒，根据其不能与mAbs423/6和170/7的反应推定它来自cDNA。
对各反基因组cDNA都评价了它们相对基因组cDNA p218(131)的病毒恢复率。用负义基因组cDNA p218(131)(SEQ ID NO：1)进行了12个转染反应，并平行地用正义反基因组cDNA p3/7(131)2G(SEQ ID NO：15)进行了12个转染反应，比较两种cDNA的病毒恢复率。取每格中1ml转染收获物用LLC-MK2细胞测定效价，其余2ml(第一代)传代到新鲜LLC-MK2细胞上。第5天，收获第一代，如前测定效价。用p3/7(131)2G转染的12格中都恢复了重组病毒，但用p218(131)转染的12格中只有4格恢复了重组病毒。正义反基因组传代病毒培养物的平均效价为105.0，约比负义基因组的104.1高10倍。但是，再多一次扩增，则效价变得相当。
                               表2
         从编码基因组或反基因组RNA恢复cDNA的重组病毒的效率比较
                   (反基因组在T7启动子中含有2个G残基)
  实验#   转染的cDNA   所编码的RNA链   拯救率1   恢复病毒的平均效价(log10pfu/ml)2
  1   p3/7(131)2G3p218(131)   反基因组基因组   12/12(100％)4/12(33％)   5.0±0.274.1±0.27
  2   p3/7(131)2G3p3/7(131)p218(131)   反基因组反基因组基因组   6/6(100％)12/12(100％)5/5(100％)   6.6±0.185.5±0.124.9±0.19
1.产生rJS的转染培养物的数量/被测数量。
2.平均效价±标准误差，转染收获物在LC-MK2细胞内传代1次5天后测定的。
3.在T7启动子和反基因组5’末端之间含2个G残基。
接着，测试了从编码基因组或反基因组HPIV3RNA的3种全长质粒恢复重组病毒的效率，为的是(i)确定基因组或反基因组cDNA产生重组病毒是否更有效和(ii)2个附加的5’末端G残基对重组病毒得率的影响(表2)。不幸的是，不可能用噬斑滴定法来直接测定转染收获物的效价，因为残留的MVA-T7干扰rJS在LLC-MK2细胞单层培养物上的噬斑形成。所以，我们首先比较了不同转染中恢复rJS的效率，和其它实验一样，从用p3/7(131)2G转染的培养物中恢复rJS的频率比用p218(131)高。因为包括用p218(131)在内的其它实验中，各转染收获物都产生rJS，所以不能用这种方法来比较产生重组病毒的相对效率。所以，我们根据转染培养物一次传代后的病毒量来估计转染培养物种病毒的相对量(表2)。由于各质粒都被设计成产生相同的病毒(rJS)，所以认为后代病毒的效价差异反映了转染收获物中病毒的效价差异。在以上实验中，含有2个5’末端G残基的结构产生rJS是最有效的。这显示增加的这两个G残基的确提高恢复效率，但是这一效率少量提高的机制尚不清楚。以上发现显示了以p3/7(131)2G作为底物用于以后将突变引入HPIV3cDNA的实验具有一个小但可测知的优点。用p3/7(131)2G的重组病毒回收率高这一小优点对于恢复具有体外限制性复制的减毒突变的病毒可能尤其必要。虽然，已经从具有3个5’末端G残基的反基因组cDNA回收得到了VSV，该结构恢复病毒的效率不能与没有所述附加残基的相同结构相比(Whelan等， Proc.Natl.Acad.Sci. USA 92：8388-8392(1995)，本发明全面参考了其中内容)。与用仙台病毒和麻疹病毒相反，反基因组5’端的附加病毒G残基对恢复重组病毒显然没有不利影响，实际上似乎是有利的(Garcin等， 同上，1995；Radecke等， 同上，1995；Kato等，1996)。没有这两个5’末端胍残基的基因组和反基因组质粒在产生重组病毒方面的效率相同。这与过去的报道相反，过去的报道称：基因组cDNA产生重组病毒的效率比反基因组cDNA低(Whelan，1995；Kato等，1996)。
在与上述相似的实验中比较了从p3/7(131)(SEQ ID NO：14)恢复病毒的效率和从p3/7(131)2G(SEQ ID NO：15)及p218(131)(SEQ ID NO：1)恢复病毒的效率。从p3/7(131)恢复病毒的效率与p217(131)相当。两种包含附加G残基的反基因组cDNA的恢复率都更恒定更有效。
                                   实施例VII
                       许可和限制性温度下rPIV的噬斑形成率
如现有文献所述(Hall等， Virus Res.22：173-184，(1992)，本发明全面参考了其中内容)，进行后文所述的修改，在32℃、37℃、39℃和40℃，在LLC-MK2单层培养物内测定了对照病毒和p218(131)和p3/7(131)2G衍生的rPIV体外复制的温度敏感性。将病毒以10倍连续稀释接种到24格测试板上的LLC-MK2单层上，室温下吸附1小时。然后在培养物上覆盖以1ml补充了2mM谷胺酰胺和0.8％甲基纤维素的L-15，测试板然后在上述温度孵育5天。去除甲基纤维素覆盖层，细胞单层用80％甲醇4℃固定1小时。用先前所述对鼠抗体特异性染色的免疫过氧化物酶染色法(Murphy等， Vaccine 8：497-502(1990)，本发明全面参考了其中内容)，用两种HPIV3特异性抗HN-鼠mAb101/1和66/4的1∶500腹水稀释液或混合液对出现在单层内的病毒噬斑评分。
在32℃、37℃、39℃和40℃，用噬斑试验鉴定正义或负义cDNA衍生的重组病毒，确定它们的表型是否与JS野生型病毒相似。就39℃和40℃这样较高温度下的复制水平而言，正义和负义rPIV都与JS wt相当(表3)。这与ts突变株JS cp45相反，后者在37℃的效价降低了30倍，而且不能在39℃或40℃形成噬斑。
       表3：rJS在限制性温度(39℃-40℃)的复制水平
        与生物学方法产生的亲代JS野生型病毒相似
                                                病毒效价(log10pfu/ml)
  病毒   32℃   37℃   39℃   40℃
  rJS-PS1rJS-NS2JScp453JS野生型   6.16.96.36.5   6.17.14.36.8   6.17.1＜0.76.6   6.67.0＜0.76.7
1.负义基因组克隆p3/7(131)2G产生的重组病毒
2.正义基因组克隆p218(131)产生的重组病毒
3.JScp45是JS野生株产生的温度敏感株
已经测定了JScp45的完整序列(Stokes等， 同上1993)，并鉴定了前导序列、N、P、M、HN和L基因内的突变。但是，还不知道是哪个(些)突变造成ca、att或ts表型。因为本发明实施例中的rPIV显示出与JS野生亲本一样的ts表型，所以可以将PIV的cp45突变以及其它已知或未知的突变单独或组合引入全长cDNA，以确定这些突变单独或组合后的效果，例如通过在较高温度评价包含了感兴趣的突变的重组病毒的复制。可以如后文所述，将由此鉴定的突变引入有效的减毒疫苗中。可以进一步优化包含在重组病毒中的上述及其它突变，例如通过诱变造成单个密码子中2个或更多个核苷酸取代，从而产生遗传稳定性比生物学方法产生的突变株更高的重组病毒。
                         实施例VIII
                     rPIV在仓鼠内的复制
将36个16周龄的金色叙利亚仓鼠分成4组，每组9只，鼻接种0.1ml含105.5pfu来自负义cDNA和来自正义cDNA的rPIV、JS cp45或野生JS病毒。在第4天，杀死仓鼠，获取肺和鼻甲。将肺均匀分散在含2.5μg/ml两性霉素B(Gaithersburg，MD)、200μg/ml pipericillin(Lederle Laboratories，Pearl River，NY)和50μg/ml庆大霉素的20％w/vL-15悬浮液(Quality Biologicals)中。用相同的方法将鼻甲匀浆化在10％w/v L-15悬浮液中。匀浆化后，将样品等分，并在干冰-乙醇浴中快速冷冻。第二天，在32℃，在LLC-MK2细胞96格测试板中测定样品中病毒的效价，在接种后第5天和第7天评价CPE。计算每组9只仓鼠log10TCID50/gm的平均值。
表4显示，自负义cDNA恢复的rPIV和自正义cDNA恢复的rPIV在仓鼠上呼吸道和下呼吸道中的复制水平与野生JS基本相同。这与在各位点都减毒的JScp45相反。
    表4：rJS在仓鼠上呼吸道和下呼吸道中的复制水平
      与其生物学方法产生的亲本JS野生型病毒相同
                                   平均病毒效价(log10TCID50/g)5
  病毒   鼻甲   肺
  rJS-PS1rJS-NS2JScp453JS野生型4   6.6±0.26.4±0.14.2±0.26.3±0.2   4.1±0.34.2-0.2≤1.4±0.04.6±0.3
1.用编码正义HPIV3反基因组的p3/7(131)2G恢复的重组病毒
2.用编码负义HPIV3基因组的p218(131)恢复的重组病毒
3.生物学方法产生的ts突变株
4.生物学方法产生的亲代病毒
5.每组9只仓鼠的平均效价±标准误差
这样，本发明的实施例rPIV能够在仓鼠体内保留生物学方法产生的JS野生亲代毒株所表现的复制能力，因此，可以鉴定出突变(例如JS cp45候选疫苗中局限在仓鼠及其它宿主，包括人和非人灵长动物中复制的突变)，并如后文实施例所述，将突变引入经修饰的rPIV病毒。
                        实施例IX
          鉴定造成减毒表型的HPIV-3中的氨基酸取代，以及
                将减毒突变引入感染性减毒PIV克隆
从cDNA产生感染性PIV的能力推动了减毒活副流感病毒疫苗的发展。更具体地说，使用本发明的方法和工具可方便地确定PIV候选疫苗减毒的遗传基础，还可以将cDNA产生的感染性PIV疫苗设计成可精确调校减毒性和免疫原性水平。
此外，本发明的工具和方法可用于发展所有3种重要的致病人副流感病毒，HPIV1、HPIV2和HPIV3的疫苗。例如，为了在本发明中选择有效的HPIV3疫苗，可以鉴定出与生物学方法产生的HPIV3候选疫苗或减毒BPIV3病毒中的所需表型相关联的突变(例如减毒突变)，并将它们结合到rPIV中。用这些方法，可以在一个候选突变大菜单的减毒突变中进行选择和组合，以产生在减毒和免疫原性之间具有良好平衡而且在人体内复制后仍保留减毒表型的rPIV。
在本实施例中说明了PIV3 JS cp45活减毒病毒温度敏感性(ts)和体内减毒(att)表型的遗传基础。从全长反基因组cDNA恢复了7种实施例重组PIV3病毒(3个单损伤病毒、3个二损伤病毒和1个三损伤病毒)，并分析了它们的ts和att表型。这些重组体含有一处或多处JS cp45(在此又称cp45)L基因内的氨基酸取代，它们被容纳在一个JS野生亲代cDNA中。这3处生物学方法产生的突变例全部存在于生长在Vero细胞内的一个JS cp45代表性毒株中，该毒株名称为JS cp45 Vero，1997年8月21日在美国典型培养物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland20825，USA)根据布达佩斯条约进行了保藏，保藏号为ACTT VR2588.
对后文PIV重组体例的分析显示，L基因内的这三种突变(Tyr294变成His，Leu992变成Phe，Thr1558变成Ile)各自都对cp45的ts和att表型有贡献，对产生重组疫苗毒株都是有用的。
病毒和细胞
按照已知方法(Hall等， Virus Res.22：173-184(1992)，本发明全面参考了其中内容)将PIV3 JS野生株和cp45病毒培养在LLC-MK2细胞中。Fuerst等在Virology225：419-422，(1996)中说明了vTF7-3重组牛痘病毒，Wyatt等在Virology 210：202-205(1995)(本发明参考了以上两文献的内容)说明了表达T7聚合酶的修饰牛痘病毒Ankara(MVA)。将HEp-2(ATCC CCL 23)和LLC-MK2(ATCC CCL 7.1)细胞维持在补充了2％FBS和硫酸庆大霉素(50μg/ml)的OptiMEM(Life Technologies)中。
在PIV3的L基因内构建点突变
为了通过定点诱变将点突变引入L基因，修饰pUC19以接受一段JS野生株PIV的L基因。首先，将含有一个NheI限制性位点的一对互补寡核苷酸(5’-GATCGATGCTAGCCC-3’(SEQ ID NO：23)和5’-GATCGGGCTAGCATC-3’(SEQ ID NO：24))连接到pUC19的HindIII位点中，由此在pUC19中引入一个独特NheI限制性位点，生成pUC19(N)。pTM(L)的SphI(PIV3的第11317位核苷酸)-NheI(PIV3的第14087位核苷酸)片段包含了发生在cp45内3处编码改变的位置，而且可以直接被引入全长PIV3 cDNA(见下文)，将该片段克隆到pUC19(N)的SphI和NheI位点，从而产生pUCL(N-S)。用诱变寡核苷酸和Transformer诱变试剂盒(Clonetech，Palo Alto，CA)将点突变引入pUCL(N-S)，为的是(i)产生单独或组合的，L蛋白第942、992个1558位的氨基酸取代，和(ii)消除靠近各密码子取代作为标记的特异性天然限制性酶位点(见表5)。
               表5：引入rPIV3的编码cp45L蛋白基因氨基酸取代、作为标记、
                       消除天然限制性酶位点的核苷酸取代
  RPIV3名称  氨基酸取代(cp45野生株)   野生株的序列a   突变株的序列   被消除的限制性酶位点
  r942  Tyr-942变成His   11468-T TACATGGC CAT(SEQ ID NO：25)   11468-T CACATGGC GAT(SEQ ID NO：26)   EaeI
  r992  Leu-992变成Phe   11618-TTT TGA TTGGGC(SEQ ID NO：27)   11618-TTT TGA TTGGGC(SEQ ID NO：28)   BsrI
  r1558  Thr-1558变成Ile   13307-TGG TCCTAATA CTG(SEQ ID NO：29)   13307-TGG GCCTAATA CTG(SEQ ID NO：30)   AvaII
a：表中显示了三个突变区各自周围的核苷酸序列。各处序列中的第一个核苷酸根据其在完整反基因组RNA中的位置编号。各氨基酸取代涉及的密码子用粗体表示。被消除以作为突变标记的野生型序列中的天然限制性酶位点以斜体表示。产生氨基酸取代或消除限制性位点的核苷酸用下划线表示。
用对质粒DNA的双脱氧核苷酸测序来验证引入pUCL(N-S)的突变。将包含cp45各L基因突变的pUCL(N-S)的SphI-BamHI(核苷酸13733)片段亚克隆到pTM(L)的SphI-BamHI位点，产生pTM(L)-942、-992、-942/992和-1558；另外的二联突变和三联突变用PinAI和NheI位点来组装(图12)。在许可温度(32℃)测定各突变pTM(L)质粒在包含质粒编码的最小基因组RNA和N、P和L蛋白的最小复制子系统内指导氯霉素乙酰基转移酶表达的能力(Durbin等，Virology 234：74-78(1997)，本发明全面参考了其中内容)。各种突变L质粒支持标记基因的表达水平达野生株L基因的75-106％，这表明基因工程获得的cDNA都没有明显的假突变(未显示)。然后将各突变pTM(L)质粒的SphI-NheI片段亚克隆到全长PIV3 JS反基因组cDNA p3/7(131)2G的SphI-NheI窗内，生成代表三种取代所有可能的组合形式的7种全长PIV3 cDNA克隆。
带有一种、两种或三种cp45L蛋白取代的重组PIV3(r PIV3)的恢复。
如前所述，用LipofectACE(Life Technologies)和MVA-T7将各种带有一种或多种cp45L基因突变和pTM(N)、pTM(P)和pTM(L)三种支持质粒的全长反基因组cDNA转染到6格测试板上的HEp-2细胞内。32℃孵育4天，将转染收获物传代到6格测试板上的HEp-2细胞上，32℃孵育4天。收获第一代的清液，并传代到T-25瓶中的LLC-MK2细胞中，32℃孵育5至6天。收获第二代的清液，用抗HN单克隆抗体(mAb)77/5和423/6进行病毒噬斑的免疫过氧化物酶染色初步确认重组病毒的存在，77/5单克隆抗体能结合生物学方法产生的JS PIV3和重组JS PIV3，Mab423/6因为表位被消除而作为标记不结合来自cDNA的病毒的。如前所述，对第一代中的病毒在LLC-MK2细胞上进行2或3次噬斑纯化。生物学方法克隆的各重组病毒在LLC-MK2细胞内32℃扩增两次，以产生用于以后鉴定的病毒。从澄清化的培养基中用聚乙二醇沉淀法浓缩病毒，用Trizol试剂(Life Technologies)抽提病毒RNA(vRNA)。用Superscript II试剂盒和6核苷酸随机引物(Life Technologies)进行vRNA的逆转录。优秀的cDNA PCR试剂盒(Clonetech，Palo Alto，CA)和PIV3 L基因特异性正义5’-nt11190-GCATTATCTAGATGTGTCTTCTGGTCAGAG-3’nt-11219(SEQ ID NO：31)和负义5’-nt14140-CCTGAATTATAATAATTAACTGCAGGTCCT-3’nt-14111(SEQ ID NO：32)引物来扩增跨越SphI-NheI片段的区域。用各限制性内切酶消化分析PCR片段，内切酶的识别位点在插入L基因内3种cp45突变的过程中被消除(表5)。
带有一种、两种或三种cp45L蛋白氨基酸取代的重组rPIV3在许可和限制性温度下的噬斑形成效率(EOP)
在LLC-MK2单层培养物中测定了对照和重组病毒在32℃、37℃、38℃、39℃、40℃和41℃提外噬斑形成的温度敏感性，去除甲基纤维素覆盖层后，用豚鼠红细胞吸附反应来计算噬斑。或者，用两PIV3-特异性抗HN鼠mAb101/1和454/11的1∶500混合物进行免疫过氧化物酶染色来鉴定细胞单层中的噬斑(Murphy等， 同上，(1990))。
仓鼠研究
4至16周龄的金色叙利亚仓鼠每6个1组，每个鼻接种含105.5pfu rPIV3 JS野生株、PIV3 cp45病毒或含有一个或多个cp45 L蛋白取代的rPIV3之一的0.1mlOptiMEM1。在感染后第4天，杀死仓鼠，获取肺和鼻甲，如前所述测定病毒的量。计算每组6个仓鼠的平均log10TCID50/g。
                               结果
           将PIV3 cp45 L蛋白氨基酸取代引入野生型JS rPIV3。
如前所述，cp45 L蛋白内的3种氨基酸取代被单独或以选定的组合方式引入编码野生型亲代PIV3JS毒株的反基因组cDNA。用基因工程法用一个沉默突变标记每一个引入的突变，所述沉默突变消除附近的一个天然限制性核酸内切酶位点，以便协助检测所恢复rPIV3内的突变(表5，图12)。第1558位氨基酸处的编码改变被设计成包含r1558中的两个核苷酸改变，与cp45内的一个核苷酸取代相比较，以便减少体外或体内复制中该位点的回复突变。
通过将各反基因组cDNA与pTM(N)、pTM(P)、pTM(L)支持质粒的共转染和牛痘病毒MVA/T7pol重组体(Wyatt等， 同上(1995))的共感染，在组织培养物种回收带有cp45内1种、2种或全部3种氨基酸取代的7种rPIV3。各rPIV3都具有预先经基因工程改造反基因组cDNA特地引入HN基因的Mab抗性标记。通过2或3轮噬斑到噬斑传代来生物学方法克隆rPIV3，以便保证每一病毒制剂的基因是相同的。注意这一点是因为，牛痘病毒能够介导反基因组cDNA和支持质粒之间的重组。
为了确认7种rPIV3中每一种都含有L基因内的基因工程化突变，从病毒沉淀中纯化RNA，复制成cDNA，用RT-PCR扩增。对照反应显示RT步骤是产生RT-PCR产物所必需的，这表明产生RT-PCR产物所必需的是RNA模板而不是杂cDNA。用三种限制性酶消化TR-PCR产物，这些酶的识别序列已被消除，作为插入编码改变的标记。和估计的一样，三种酶种的每一种都对JS野生rPIV3的RT-PCR产物进行了相应次数的切割，但r942/992/1558在产生各cp45编码改变过程中则没有被消除的这3个位点。其它rPIV3都没有确切的限制性位点，这表明存在着引入的突变。
带有cp45L突变的rPIV3在32℃、37℃、38℃、39℃、40℃和41℃的噬斑形成率
在LLC-MK2细胞单层上测试带有cp45 L蛋白氨基酸取代各种组合形式的7种rPIV3在32℃、37℃、38℃、39℃、40℃和41℃形成噬斑的能力。如表6所示，带有1处cp45氨基酸取代的rPIV3是ts的，但是野生JS rPIV3亲代在各测试温度下的噬斑形成都不受限制。r942、r992和r1558噬斑形成的关闭温度是40℃。r942在40℃的噬斑形成减少了700倍，说明其复制在这一限制性温度显著降低。但是，r942的噬斑在40℃也显著缩小，说明其复制在此限制性温度与野生JS相比也受到限制。r942的复制在41℃完全被限制(数据未显示)。40℃时，r992和r1558的噬斑形成受到严重限制(减少1,000,000倍以上)。以上结果表明，三种cp45 L基因突变都各自造成ts表型，但是r942突变的限制性比较低。双联突变病毒r942/1558和三联突变病毒r942/992/1558的关闭温度为39℃，r942/992和cp45的关闭温度为38℃。与r992单突变相比，双突变r992/1558的ts较弱。与r942一样，r992/1558的噬斑形成在41℃完全被限制。双联和三联突变表现出的温度敏感性水平来自于三种突变的rPIV微妙相互作用，这种作用是无法由单突变的温度敏感性推断的。而且，由于r942/992/1558的ts比cp45略低，L基因外的其它突变也可能对cp45的ts表型有贡献，所以，它们代表着本发明的其它感兴趣的突变。
            表6：带有一、二或三种cp45L蛋白氨基酸取代的rPIV3
            在32℃、37℃、38℃、39℃、40℃和41℃的噬斑形成率
  病毒a                                   病毒效价(log10pfu/ml)
  32℃   37℃   38℃   39℃ 40℃
  r942   6.8   6.8b   6.6b   6.5b 4.3 b
  r992   6.9   6.8b   6.7b   6.1b ＜ 0.7
  r1558   6.6b   6.6b   6.4b   5.0b ＜ 0.7
  r942/992   6.7   6.5b   4.5 b   3.0b ＜0.7
  r942/1558   5.2   5.0b   4.0b   1.0b ＜0.7
  r992/1558   6.7   6.7b   6.5b   5.9a 5.1
  r942/992/1558   6.6   6.2b   6.2b   2.7 b ＜0.7
  cp45b   6.6   4.8   4.5 b   ＜0.7 ＜0.7
  rPIV3 JS   8.3   8.4   8.5   8.5 8.3
a.cp45是生物学方法产生的病毒，其它测试病毒是重组的。
b.噬斑的大小接近针尖。
c.带下划线的数字表示噬斑形成的关闭温度，即效价比32℃时降低100倍的最低温度。
在仓鼠内的生长。给每组6个金色叙利亚仓鼠鼻接种野生JS rPIV3、生物学方法产生的cp45或和含有一个或多个cp45L蛋白氨基酸取代的rPIV3，并测定肺和鼻甲内的病毒复制。该实验(表7)中，带有单氨基酸取代的rPIV3在上下呼吸道内的复制都受到抑制(表7)。但是，ts最低的r942的复制只在第二实验中在上下呼吸道中的复制受到显著限制。以上结果显示，以单损伤重组病毒存在时，三种氨基酸取代中的两种造成了att表型。但是，942突变却确实对减毒作用有贡献(例如，r942/992的减毒程度比单突变的r992更高)。所以，每个L内的氨基酸突变不论是单独作用或者与其它L氨基酸取代协同，都对att有贡献。两种双突变都是减毒性的，这表明体内复制后丢失3种L基因取代的任何一种仍然会产生减毒病毒。这可以作为先前观察到的cp45在体内复制后的ts表型稳定性提高的部分解释。三突变r942/992/1558复制在上下呼吸道内受到的限制和cp45一样，这表明L蛋白内的三处氨基酸取代是cp45的att表型的主要原因。
   表7：带有cp45L蛋白内1、2或3种氨基酸取代的rPIV3，与JS野生rPIV3和cp45
              相比在仓鼠上下呼吸道内的复制水平
病毒                      病毒效价(log10TCID50/g±S.Eb)
  鼻甲   肺
  野生rPIV3r942r992r1558r942/992r942/1558r992/1558r942/992/1558cp45   7.4±0.166.6±0.174.4±0.163.8±0.40＜1.5±02.9±0.235.7±0.163.9±0.154.1±0.27   5.1±0.493.0±0.783.1±0.114.3±0.34＜1.5±01.8±0.173.2±0.57＜1.5±01.6±0.08
a.每组6个仓鼠都每只鼻接种0.1ml含105.5pfu病毒的接种物，4天后获取肺和鼻甲。
b.标准误差。
c.cp45是生物学方法得到的病毒，其它则是重组病毒。
概括以上结果，L蛋白第992位和第1558位的氨基酸取代各自造成40℃细胞培养物内噬斑形成减少1,000,000倍，第942位的取代则造成减少700倍。所以，这3种突变都各自对ts表型有贡献。具有全部三种L突变的三突变体的ts比cp45略低，这表明cp45的L基因以外还有突变对ts表型也有贡献。L基因内三种突变中的两种对仓鼠上下呼吸道内的复制抑制有贡献，这解释了cp45在体内复制中ts和att表型的稳定性。重要的是，重组疫苗毒株的体外温度敏感性水平极其相似的预计了体内减毒表型。具有全部三种突变的重组病毒在仓鼠上下呼吸道内的复制抑制与cp45突变株一样，cp45病毒内的L基因是该候选疫苗株的主要减毒成分。虽然各突变本身都造成ts表型，但是当它们在一起时却不是简单的加和而是相互作用的。三联突变体内三种突变的共同作用似乎是减弱而不是加强双联突变体内的温度敏感性水平。有趣的是，这提供了一种不曾预料到的选择压力，至少可保持部分cp45L突变，因为922或1558取代的回复丢失将提高而不是降低温度敏感性水平。综合考虑，以上发现表明，cp45病毒ts和att表型的高度稳定性来自于多个L内ts突变对att表型的贡献。这三种突变是cp45的主要减毒突变这一发现为在制造各节段和在人体内复制后监测病毒提供了基础。
更有趣的是，第942位酪胺酸变组胺酸的突变(可能是三种突变种保守性最高的突变)对温度的敏感性最低。PIV3的L聚合酶是一个大肽，长2233个氨基酸，它被认为是一种编码多个结构域的多功能蛋白，包括与P蛋白形成复合物、RNA结合、RNA聚腺苷酸化、RNA转录和RNA复制所需的结构域(Collin等， 同上(1996))。L内第942和992位的氨基酸取代靠近副流感病毒家族其它成员的高度保守结构域(Blumberg等， Virology 164：487-497(1982)；Galinski等， Virology 165：499-510(1988))。第1558位的突变位于聚合酶区域内，该区域与其它L聚合酶的序列一致性较低。虽然尚不知道L内的三联氨基酸取代产生ts表型的机制，很可能，多个L蛋白结构域和活性受到了影响，或者存在一种影响L的多种活性的共同机制。
                            实施例X
直接鉴定生物学方法产生的减毒HPIV3型活病毒(cp45)内造成温度敏感性、冷适应
              性和减毒性的突变，并重构入重组疫苗病毒
以上实施例表明，cp45的L聚合酶蛋白内的三种氨基酸取代都提供温度敏感性(ts)和减毒(att)表型，但不提供冷适应性(ca)(参见，Skiadopoules等， J.Virol.72(3)：1762-8，1998)。cp45还包含其它蛋白(N、C、M、F和HN)和潜在顺式作用序列(前导区和N基因的转录基因起始(GS)信号)内的其它12种突变，迄今还不明确它们对上述表型的贡献。本实施例还明确了cp45 ts、ca和att表型的遗传基础，也进一步提供了有关cp45在人或非人灵长目动物中复制后上述表型高度稳定性基础的其它信息。在本研究内容之一中，用反基因系统(reverse genetics)构建了一种包含全部15种cp45特有突变的重组cp45(rcp45)病毒，发现它在噬斑大小，温度敏感性水平，冷适应性和仓鼠上下呼吸道内的复制水平方面与生物学方法产生的病毒基本上难以区别。此外，还构建了包含(1)C，M，F或HN蛋白内cp45特有突变，(2)组合的前导序列和N基因突变，或(3)cp45突变几种组合形式的重组病毒。对这些重组病毒的分析显示：分布在整个基因组内的多种cp45突变产生了ts，ca和att表型。C和F内的突变在40℃没有ts但提供att表型，所以他们是非ts的att突变。HN突变不提供ca，ts或att表型。具有3’前导序列和N突变的病毒表现出ts，但只在仓鼠下呼吸道表现出少量的减毒性。具有几种突变组合形式的重组体表现出比cp45更高的温度敏感性，但是温度敏感性的提高并没有反映在体内减毒加强上。后面的这些发现表明，cp45内的多种突变通过相互作用来影响体外复制。cp45内存在着多种ts突变和非ts减毒突变可能是其减毒和表型稳定性的原因。在此提供的有关各种cp45突变的表型的知识允许对生物学方法产生的PIV病毒进行精确的分析，并可方便地操纵重组病毒来获得大量本发明的有用重组疫苗。
病毒和细胞
如前所述(Durbin等，Virology，235：323-332，1997a；Hall等，Virus Res.22(3)：173-184(1992)；Skiadopoulos等，J.Virol.72(3)：1762-8，1998)，将以上实施例所述的rPIV3s、野生PIV3 JS和cp45病毒培养在类人猿LLC-MK2细胞(ATCC CCL7.1)内。如前所述提供经修饰的牛痘Ankara病毒。将HEp-2(ATCC CCL23)和LLC-MK2细胞维持在补充了2％胎牛血清和硫酸庆大霉素(50ug/ml)的OptiMEMI(Life Technologies)中，或维持在补充了10％FBS，硫酸庆大霉素(50mg/ml)和2mM谷胺酰胺的EMEM中。将L-132细胞(ATCC CCL 5)维持在补充了10％FBS，2mM谷胺酰胺，20mM Hepes，1mM非必需氨基酸和100单位链霉素-新霉素/ml的Eral′s MEM(Life Technologies)中。
在PIV3内构建点突变
用标准分子克隆法将前文用于恢复感染性病毒的p3/7(131)2G的亚基因组片段和野生PIV3 JS反基因组cDNA克隆(Durbin等，Virology 235：323-332，1997a；Skiadopoulos等，J.Virol.72(3)：1762-8，1998)克隆到为了接受这些片段而进行了修饰的pUC19载体内。如前所述，用转化剂诱变试剂盒(Clontech，Palo Alto，CA)引入对应于cp45内突变和产生或消除沉默的限制性酶识别序列(表8)的突变的点突变。
                      表8：引入rPIV3内的PIV3 cp45突变
  序列号   涉及区域   nt位置a   序列变化b   限制型标记c   氨基酸取代
  1   4647   3’前导序列   20   TTGTCTGGGAATTTG CCTGGGAAT   无   非编码
  2   4648   3’前导序列   20   TTGTCTGGGAATTTGT TTGGGAAT   无   非编码
  3   4649   3’前导序列   20   TTGTCTGGGAATTTGTCTGG TAAT   无   非编码
  4e   5051   3’前导序列   40   AACTTTAAATTAAACTT AAAATTA   -DraI   非编码
  5e   5253   N基因起点   60   TTAAAGACATTGTT TAAGACATTG   无   非编码
  6e   5455   N   390   GCAGATGTCAAGGCAGATG CCAAG   无   Val96-Ala
  7e   5657   N   1271   CGAATCTAAAGACGAA GCTAAAGA   无   Ser389-Ala
  8   5859   C   2076   GAAATATTGATCGAAA CATTGATC   -SspI   Ile96-Ala
  9   6061   M   4341   TCTCTACCCAACTC GTTA ACCAAC   +HpaI   Pro199-Thr
  10f   6263   F   6323   AGTACAATAGGTAGTAC TGT GGGT   +ScaI   Ile420-Val
  11   6465   F   6419   GCACTTGATCCAACACT GGATCCA   +BamHI   Ala450-Thr
  12   6667   HN   7944   CCATCATTGTTGTTGACAACCATCATTGT GG CTGACAA   +BstXI   Val384-Ala
  13   6869   L   11468   TTACATGGCCAT CACATGGC GA   -EaeI   Tyr942-His
  14   7071   L   11618   TTTGGACTGGGCTTT TGA TTGGGC   -BsrI   Leu992-Phe
  15f   7273   L   13308   GGTCCTAATACTGG GCCTAATA TC   -AvaII   Thr1558-Ile
a.PIV序列内第一核苷酸的位置。b.突变序列上方的是野生型序列。核苷酸改变用下划线表示。密码子取代用粗体表示。c.每个相关的限制性核酸内切酶识别序列都用斜体表示；(+)添加了新的限制性核酸内切酶识别序列；(-)表示消除了天然的限制性核酸内切酶识别序列。d.突变表示为：野生型的三字母氨基酸排列，后面是氨基酸的位置，再接着是cp45的排列。e.这些突变都是Joanne Tatem(未公开)鉴定的，其余来自Stokes等，Virus Res.30(1)：43-52，1993。f.在所示的密码子中有两个核苷酸被改变，为的是减少野生序列回复突变的机会。
诱变后，进行限制性核酸内切酶片段的全测序，并克隆返回到全长克隆p3/7(131)2G中。从PIV3cp45病毒RNA直接RT-PCR扩增3’前导序列和N突变，并克隆到pLeft+2G(见前文)中，或经修饰的pUC19载体内，用于以后的操作。用标准分子克隆技术来构建组合突变。测定包含cp45突变的全长质粒克隆pFLCcp45的完整序列，测定在克隆过程中是否引入了非必要突变，但没有发现。
回收重组的PIV3(rPIV3)
如前所述，用LipofectACE(Life Technologies)和MVA-T7将带有cp45突变和三种支持质粒(pTM(N)，pTM(P无C)和pTM(L))的各全长反基因组cDNA转染到6格测试板(Costar，Cambridge，MA)上的HEp-2细胞内。32℃孵育4天后，将转染收获物传代到T-25烧杯内的LLC-MK2细胞上，32℃孵育4至8天。收获的病毒称为第一代，如前所述在LLC-MK2细胞上进行3轮噬斑纯化。各生物学方法克隆的重组病毒都在32℃在LLC-MK2细胞内扩增两次，以生产用于以后鉴定的病毒。澄清培养基，用聚乙二醇沉淀法浓缩病毒(参见Mbiguino & Menezes，J.Virol.Methods31：2-3，1991本发明全面参考了其中的内容)，用Trizol试剂(Life Technologies)抽提病毒RNA(vRNA)。用Superscript II预扩增系统(Life Technologies)和6核苷酸随机引物进行vRNA的逆转录。用cDNA PCR试剂盒(Clontech)和针对PIV3基因组各部分的正义和负义引物扩增用于限制性核酸内切酶分析的片段。用在突变构建过程中已产生或消除了其识别位点的各种限制性酶消化来分析PCR片段。(表8)
带有cp45突变的rPIV3在许可和限制性温度的噬斑形成率(EOP)
如前所述(Hall等，Virus Res.22(3)：173-184，1992，本发明全面参考了其中内容)，在32℃，35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃和41℃测定了对照和重组病毒在LLC-MK2单层培养物中形成噬斑的温度敏感性水平。去除甲基纤维素覆盖层，用豚鼠的血红细胞进行红细胞吸附，由此计数噬斑，或者，用PIV3特异性抗HN的鼠mAb101/1和454/11的1∶250稀释混合液通过免疫过氧化物酶染色法来鉴定细胞单层中的噬斑(参见，Murphy等，Vaccine 8(5)：497-502，1990；van WykeCoelingh等，Virology 143(2)：569-582，1985)。
评价rPIV3突变病毒的冷适应性表型
在24格组织培养板上置备铺满的L-132细胞单层，在32℃和20℃测定重组和野生rPIV3病毒在细胞单层上的生长。2块培养板上的每2个相同格以0.01的感染复数接种0.2ml突变或野生rPIV3病毒。室温下吸附1小时后，吸去接种物，每格用1ml的PBS洗涤细胞单层。在接种后的细胞单层上覆盖补充了10％FBS，2mM谷胺酰胺，20mM Hepes，1mM非必需氨基酸和100单位链霉素-新霉素/ml的0.5mlEarl′MEM。将一块培养板密封在防水袋子(Kapak)中，然后在20℃浴中浸13天。相同的另一块板在32℃的CO2培养箱中放置3天。培养结束时，用冻融法收获病毒。用LLC-MK2细胞噬斑试验来测定自各格回收的病毒的效价，用豚鼠血红细胞吸附来显示噬斑。用两份野生和两份cp45参比储备液作为对照。
仓鼠内的研究
给5个一组的5周龄金色叙利亚仓鼠每只鼻接种0.1ml OptiMEM I，其中包含106.0pfu野生JS rPIV3，PIV3 cp45病毒，或多种突变rPIV3之一。接种后的第4天，杀死仓鼠，获取肺和鼻甲，如前所述测定病毒的量。计算每组仓鼠在32℃的平均log10TCID50/g。
                            结果
                在野生JS rPIV3中引入PIV3 cp45突变
通过定点诱变，或通过直接PCR扩增带有所需突变的cp45 cDNA的节段，将cp45 3’前导序列、N GS信号和N、C、M、F、HN和L蛋白的15种突变(表8)引入完整PIV3反基因组cDNA。产生了以下反基因组cDNA(见图13)：(i)rcp453’N，含有前导区内的4处点突变，N GS信号内的点突变，和N蛋白内的两个氨基酸改变；(ii)rcp45 C，含有C蛋白内的一个氨基酸改变；(iii)rcp45 M，含M内一个氨基酸改变；(iv)rcp45F，含F内的两个氨基酸改变；(v)rcp45 HN，含HN内的一个氨基酸改变；(vi)rcp45 L，含L内3个氨基酸改变；(vii)rcp45 3’NL，含以上i至vi诸突变；(viii)rcp45 3’NCMFHN，含除L内三种突变的全部突变；(ix)rcp45，含表8中所有15种cp45突变。大多数情况下，将各cp45突变工程改造成伴有一个或多个附近的沉默突变(此种沉默突变导入或去除限制性酶识别位点)(表8)。这些用作标记以证明cDNA和恢复的病毒种存在着突变。而且，氨基酸编码改变中有两种(表8中的第10和15)是用双核苷酸改变产生的，而不是用cp45中的单核苷酸改变产生的，这就减少了野生病毒同位点回复突变的机会。从相同于将cp45改变引入其它反基因组cDNA的诱变cDNA亚克隆组装包含表8中全部15种cp45改变的cp45cDNA；对其进行全测序，确认它只含有所需的突变。这表明，进行过诱变或PCR并进行过克隆操作的区域都具有所需的序列而没有不需要的突变。将带有一种或多种cp45突变的各全长质粒与支持质粒和MVA-T7一起转染到HEp-2细胞内，产生前述重组PIV3。如图13所示的各种重组病毒的病毒RNA扩增的包含表8中突变的PCR片段的分析确认存在着引入的突变而没有其它不需要的突变。
噬斑形态
当在LLC-MK2细胞上进行测试时，重组病毒中有几种表现出独特的噬斑形态。野生JS rPIV3噬斑的平均大小为1mm，大小上于生物学方法产生的JS PIV3难以区分。cp45和rcp45病毒的噬斑比野生病毒的大，直径平均比野生病毒的大2至3倍，而且彼此难以区分。这证明了生物学方法产生的和重组的cp45病毒就这一表型而言具有可比性。
带有cp45突变的rPIC3在许可和限制性温度下在LLC-MK2细胞中的噬斑形成率
在许可和限制性温度32℃至40℃下测定rPIV3形成噬斑的能力(表9)。对带cp45单独组分的病毒的ts表型的分析发现，rcp45 3’N和rcp45 M病毒的关闭温度为40℃，rcp45 C的关闭温度为41℃。rcp45 F和rcp45 HN突变病毒的关闭温度高于41℃。与上述结果一致的是，rcp45 L的关闭温度为39℃。如果一种病毒在40℃复制水平的降低(即，32℃的效价减40℃的效价)是该温度下野生病毒的约100倍以上，则可认为具有ts表型。根据这一定义，本实验的结果显示，cp45的至少两个区域(3’N和L)对ts表型有贡献。
       表9：重组和生物学方法产生的病毒在许可和限制性温度下的噬斑形成率(EOP)
 病毒                                      平均病毒效价(log10pfu/ml)
  32℃   35℃  36℃  37℃   38℃   39℃   40℃ 41℃   ts表型
 rcp45 3’N   7.1   ---  ---  7.0   6.4   5.4   4.2 ＜3.7   +
 rcp45 C   6.9   ---  ---  7.0   6.7   6.6   5.9 ＜3.7   -
 rcp45 M   7.7   ---  ---  7.4   7.0   6.5   5.3 ＜3.7   -
 rcp45 F   7.5   ---  ---  7.2   6.0   6.6   5.9 5.7   -
 rcp45 HN   6.4   ---  ---  6.5   6.2   6.4   4.7 4.4   -
 rcp45 L   7.3   ---  ---  7.2   6.7   4.0   ＜0.7 ＜0.7   +
 rcp45 3’NL   7.3   5.7 ＜0.7  ＜0.7   ＜0.7   ＜0.7   ＜0.7 ---   +
 rcp453’NCMFHN   7.2   5.6 ＜0.7  2.0   2.4   ＜0.7   ＜0.7 ---   +
 rcp45   8.5   7.5  7.1  6.4   6.0   2.0   ＜0.7 ＜0.7   +
 cp 45b   8.3   8.0  7.4  7.0   6.2   2.3   ＜0.7 ＜0.7   +
 野生rPIV3   7.3   7.3  7.0  7.4   7.6   7.7   6.8 6.0   -
a.在所示温度孵育6天后，用免疫过氧化物酶染色来计数噬斑。以上数值是两次实验的平均值，粗体是一次实验的值。下划线表示最低非许可温度，此时噬斑形成率比32℃时的效价降低100倍，将此定义为噬斑形成关闭温度。b.cp45是生物学方法产生的，其它病毒是重组的。c.如果病毒在40℃复制的降低(即，32℃的效价减40℃的效价)是野生病毒在40℃时的100倍以上，则认为它具有ts表型。
如表9所示，含有全部cp45突变的rcp45的关闭温度为38℃，这与生物学方法得到的cp45相同。以上结果显示，cp45的ts表型在rcp45内成功再现。而且，以上结果证实了cp45的序列分析和突变重组病毒中的重构。
与rcp45的区别仅在于没有3种L突变的rcp45 3’NCMFHN病毒的关闭温度为36℃。因为已知L突变能够单独或组合地产生温度敏感性，所以，rcp45 3’NCMFHN的ts比cp45高而不是低，这似乎有些不合理。这暗示，cp45内的突变存在着相互作用，各突变因此相互补偿而不是相互叠加产生一定水平的温度敏感性。
构建crp453’NL是为了确定L突变是否与前导序列和/或N的突变相互反应，因为据信这些元件在RNA合成过程种都相互反应。与rcp45 3’N的40℃和rcp45 L的39℃相比，该病毒的关闭温度为36℃。以上结果表示，3’N和L的突变之间存在着相互作用，结果提高了温度敏感性。以上结果还提供了另一个实例，即cp45突变一亚组产生的温度敏感性比包含全部突变的rcp45高。
带有cp45突变的rPIV3的ca表型
分析rPIV3，确定哪个cp45基因元件造成ca表型(表10)。前文表明，rcp45 L具有ts，att表型，但没有ca表型。这说明造成更高ca表型的基因元件在L外，本实施例证实了这一点。所有具有3’前导序列和N突变的rPIV都具有ca表型，只有rcp453″NCMFHN表现出中等强度的表型。这表明ca表型主要来自3’N区域内。含有3’N节段的病毒的ca水平比cp45或rcp45低，这一发现说明cp45的其它区域也对ca表型有贡献，虽然这一点在对其它区域单独进行分析时并不明显。rcp45 3’NL病毒的ca表型更强，提示L突变可能具有突出贡献。生物学方法产生的cp45病毒和rcp45病毒具有水平相当的ca表型，说明该表型，与噬斑大小和ts表型一样，在本发明的重组cp45病毒内成功再现。所以，和ts表型一样，ca表型是一种组成型表型，反映基因元件单独以及通过相互作用对整个表型的贡献。
表10：野生和突变PIV3在20℃与32℃a的生长情况比较
 病毒   20℃   30℃   ca表型
 cp45brcp45rcp45 3’NLrcp45 3’Nrcp45 3’NCMFHNrcp45 Lrcp45 Crcp45 Frcp45 HNrcp45 Mrcp45 WT   6.726.575.024.393.533.182.522.472.111.762.57   8.498.357.238.538.087.988.328.108.018.218.43   +++++/-------
a.病毒效价表示为log10PFU/ml。b.cp45是生物学方法产生的病毒，其它病毒都是重组病毒。ca表型定义为：在20℃的生长比野生病毒强10倍以上。
rcp45突变病毒在仓鼠内的生长
给5个1组的金色叙利亚仓鼠鼻接种106TCID50重组或生物学方法产生的病毒，4天后测定肺和鼻甲内的病毒复制水平(表11)。过去，对野生和cp45病毒来说，接种后第4天都是病毒在仓鼠内复制的高峰(参见Crookshanks & Belshe，J.Med.Virol 13(3)：243-9，1984，本发明全面参考了其中内容。)。rcp45病毒在鼻甲内的复制降低了约40倍，在肺内降低了1000倍，所以，减毒结果与生物学方法产生的cp45病毒一样。以上结果说明，cp45的减毒表型在其重组版中成功再现。因为每个cp45的表型都在rcp45内再现，本实施例没有包括的cp45内其它5种突变可能对cp45的特征没有什么贡献。
表11：野生型和突变型PIV3b在仓鼠a上呼吸道和下呼吸道中的复制水平
  病毒   病毒平均滴度(log10TCID50/g±S.Ec)
  鼻甲   肺
  JS wt rPIV3   6.9±0.2   5.4±0.5
  rcp45 3’N   6.5±0.2   3.9±1.1
  rcp45 C   4.8±0.3   3.1±0.7
  rcp45 Md   6.8±0.2   6.7±0.3
  rcp45 F   4.6±0.2   3.4±0.6
  rcp45 HN   6.3±0.2   5.3±1.0
  rcp45L   4.2±0.1   2.1±0.3
  rcp45 3’NL   4.7±0.2   2.1±0.3
  rcp45 3’NCMFHN   5.8±0.3   2.9±0.9
  rcp45   5.3±0.1   2.4±0.2
  cp45   4.9±0.4   1.9±0.2
a.5个1组的仓鼠每只鼻接种包含在0.1ml接种物中的106.0TCID50病毒，4天后收获鼻甲和肺。b.cp45是生物学方法产生的病毒，其它是重组病毒。c.TCID50，50％组织感染性剂量±标准误差。d.本试验使用的病毒混合物被发现含有混合的噬斑表型。该突变体内的减毒表型还将用其它病毒制剂进行再评价。
如上所示，cp45 L基因内的突变造成该病毒的大部分减毒表型。在本实施例中，对L基因外cp45突变的贡献进行了分组检测。rcp45 3’NCMFHN突变体在鼻甲内的复制仅略微降低，但在肺内则降低了100倍以上，这说明在L蛋白之外还存在着其它减毒突变。重要的是，如果rcp45的3种L基因内突变的一种回复成了野生型序列，所得病毒rcp45 3’NCMFHN仍保留有减毒表型。rcp45 M和rcp45 HN突变病毒在仓鼠的呼吸道内复制没有缺陷，rcp45 3’N病毒只在下呼吸道表现出复制的少许降低。这说明3’前导序列内，N基因其始位点内和N、M及HN蛋白内的突变本身没有减毒作用。但是，这些突变在其它cp45突变存在下，对cp45的总体减毒可能是有贡献的。而且，3’N区域内的各单独突变是有作用的，这种作用在将突变成组一起分析时不明显，但是根据本发明可方便地测得所述的作用。
rcp45 C和rcp45 F突变病毒在鼻甲和肺内的复制都降低约100倍，这表明cp45的C和F蛋白内的突变能够在仓鼠提内产生减毒表型，虽然其水平不如cp45 L突变产生的高。如前所述，rcp45 C和rcp45 F突变病毒没有ts表型，所以，C和F蛋白内的突变被认为是非ts减毒突变。
                            实施例XI
                重组嵌合PIV3的恢复，其中的血凝素与
                融合糖蛋白被PIV1中对应的糖蛋白取代
本发明产生并挑选出如下嵌合rPIV病毒：含有处于不同rPIV背景中的来自某PIV的一个或多个异源基因或大聚核苷酸序列。在本发明这方面内容中，一个PIV的各基因或基因节段被来自异源PIV或其它来源的对应序列取代。在本实施例所述的一个实施方案中提供的一些工具和方法，用于将例如HPIV1或HPIV2的HN和/或F保护性抗原取代到重组的HPIV3内，形成适用于开发减毒活疫苗的嵌合重组体。
病毒与细胞
本试验所用的PIV1毒株，PIV1/华盛顿/20993/1964(PIV1/Wash64)，是1964年在华盛顿DC分离得到的，经成人志愿者体内的临床研究证实是具有毒性的野生型病毒(Murphy等，Infect.Immu.12：62-8(1975)，本发明全面参考了其中内容)。它在LLC-MK2细胞内繁殖，所述细胞培养在含50μg/ml硫酸庆大霉素，2mM谷氨酰胺和0.75μg/ml胰蛋白酶(分类号No.3741，Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ)的Opti-MEM I(Life Technologies)中。以同样的方法繁殖用在血凝抑制试验(HAI)中的人HPIV2的Greer毒株(目录号No.V-322-001-020，NIAID Repository，Rockville，MD)。如上所述繁殖人PIV3病毒的JS毒株及其具有野生型表型的来自cDNA的重组衍生体(rPIV3/JS)。表达噬菌体T7DNA聚合酶的经修饰的牛痘Ankara(MVA)重组体，参见Wyatt等，Virology 220：202-205(1995)(本发明全面参考其中内容)。
从ATCC获得HEp-2细胞(ATCC CCL 23)，维持在含有2％胎牛血清(FBS)，50μg/ml硫酸庆大霉素和2mM谷氨酰胺的Opti-MEMI(Life Technologies)中。
构建编码完全嵌合PIV3-PIV1反基因组的cDNA
如图14A和14B所示，构建PIV3 HN和F ORF被PIV1内对应序列取代的编码全长PIV3反基因组RNA的cDNA。用PIV1/Wash64野生病毒感染LLC-MK2细胞，从中抽提RNA，由此RNA制备PIV1/Wash64 HN和F基因的cDNA克隆。用SuperScript预扩增系统和6核苷酸随机引物(Life Technologies)生成cDNA。用Vent DNA聚合酶(New England Biodlabs，Beverly，MA)，用基于Genbank内同序列的基因特异性引物对扩增PIV1的F和HN cDNA。对后文的引物都进行了注解：PIV特异性序列用下划线表示，限制型位点用斜体表示，不同于野生型序列的核苷酸改变用小写表示，起始和终止密码子用粗体表示。与起始密码子上游69-97核苷酸杂交的正义PIV1 F引物是5’- GGGAAAGAATCCAGAGACAAGAACGG-3’(SFQ ID NO：33)。与F终止密码子下游36-61核苷酸杂交的负义PIV1 F引物是5’- GGTGAAGTTGTGGATcc ATTTGATTG-3’(SEQID NO：34)。PIV HN的正义引物是5’- CAACCTGTAAGGtAc CAGCATCCG-3’(SEQ IDNO：35)。它与HN起始密码子上游的核苷酸13-36杂交，并带有KpnI位点。负义PIV1 HN引物是5’- GATATGGTGTTa GGc CTTGATCTGTTC-3’(SEQ ID NO：36)。它与终止密码子最后的两个核苷酸以及再下游的25个核苷酸杂交，并带有一个StuI位点。将PIV1 F cDNA以BamHI-钝端片段的形式克隆到用BamHI和EcoRV消化的pLITMUS28(New England Biolabs)中，同时将PIV1 HN cDNA以KpnI-StuI片段的形式克隆到同一载体内。用Circumvent测序试剂盒(New England Biolabs)测定所得质粒pLit.1HNwt和pLit.1Fwt(GenBank编号：AF016280，AF016279)的核苷酸序列。用诱变PCR引物修饰这两个克隆，删除它们的非编码区，在它们起始密码子和终止密码子的两边引入新的限制型位点，为的是构建PIV3-1嵌合HN和F基因。正义和负义PIV1 F诱变引物的序列分别是5’-CgccATGg AAAAATCAGAGATCCTCTTCT-3’(SEQ IDNO：37)和5’-CTggatcct AATTGGAGTTGTTACCCATGTA-3’(SEQ ID NO：38)，引入的限制件位点是NcoI和BamHI。正义和负义PIV1 HN诱变引物的序列分别是5’-AACcATGG CTGAAAAAGGGAAAA-3’(SEQ ID NO：39)和5’-GGTGAaGCTt AAGATGTGATTTTACATATTTTA-3’(SEQ ID NO：40)，引入的限制性位点是NcoI和HindIII。
第二步将PIV HN和F基因修饰成以上产生的PIV1编码区的受体。分几步从全长克隆PIV3/JS，p3/7(131)2G中亚克隆出PIV3 F和HN基因，产生pLit PIV3.HN.4和pLit.PIV3.F.3a(图14)。用PCR诱变删除PIV3 F或HN编码区，代之以适合接受上述PIV1 HN和F cDNA的限制性位点。PIV3 F正义和负义诱变引物的序列分别是5’-AAATAggatcc CTACAGATCATTAGATATTAAAAT-3’(SEQ ID NO：41)和5’-CgcCATg GTGTTCAGTGCTTGTTG-3’(SEQ ID NO：42)，引入的限制性位点是BamHI和NcoI。PIV HN正义和负义诱变引物的序列分别是5’-CCACAAgCt TAATTAACCATAATATGCATCA-3’(SEQ ID NO：43)和5’-TTCCATgg ATTTGGATTTGTCTATTGGGT-3’(SEQ ID NO：44)，引入的限制性位点是HindIII和NcoI。在与诱变后的PIV1 HN盒连接时将再形成嵌合HN的终止密码子。上述PIV1 HN或PIV1 F cDNA分别以NcoI-HindIII片段(HN)或NcoI-BamHI片段(F)的形式接入，形成质粒pLit.PIV3-1.HNhc和pLit.PIV3-1.Fhc。然后将这两个cDNA连接成pSE.PIV3-1.hc，然后测定该质粒的完整序列。然后将BspEI-SphI片段插入p3/7(131)2G中形成pFLC.2G+.hc(图14)。这一含有嵌合F和HN基因的BspEI-SphI片段的序列在GenBank中(编号为AE016281)。重要的是，设计对cDNA的基因工程操作，使得最后的rPIV3-1反基因组符合6倍数规则(Durbin等，Virology 234：74-78(1997)，本发明全面参考了其中内容)。编码嵌合rPIV3-1的质粒pFLC.2G+.hc按照布达佩斯条约于1997/9/17保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC 209272)(12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20852，USA.)。
转染。将HEp-2细胞单层在6格培养板(Costar Corp，Cambridge，MA)中培养至铺满，如前所述进行转染。用MVA-T7以感染复数(MOI)3感染细胞单层，MVA-T7处于含50μg/ml庆大霉素和2mM谷胺酰胺的0.8ml无血清Opti-MEMI中，然后用3种支持质粒：0.4μg pTM(N)，0.4μg pTM(P)，0.05μg pTM(L)和5μgPIV3-1反基因组cDNA转染。将质粒混合在含12μl LipofectACE(LifeTechnologies)的0.2ml Opti-MEMI中，然后加入各格。以编码野生型PIV3/JS反基因组RNA的PIV3/JS cDNA质粒p3/7(131)2G作为阳性对照，以相同的方法进行转染。32℃孵育12小时后，用补充了50μg/ml庆大霉素的新鲜Opti-MEMI替换培养基，再32℃孵育2天。在转染后的第三天，加入胰蛋白酶，最终浓度为0.75μg/ml。在第四天收获细胞培养物清液，传代(第一代)到LLC-MK2细胞单层上。通宵吸附后，用含0.75μg/ml胰蛋白酶的新鲜Opti-MEMI替换培养基。第一代培养物在32℃孵育4天，收获扩增获得的病毒，再传代到LLC-MK2细胞上(第二代)，在0.75μg/ml胰蛋白酶存在下再32℃孵育4天。在已知的血凝-抑制试验(HAI)(van Wyke Coelingh等， 同上，(1985))中，用家兔PIV1抗血清，豚鼠PIV抗血清和两种PIV3 HN单克隆抗体鉴定回收的病毒，所不同的是，对具有PIV1HN糖蛋白的病毒使用鸡红血细胞(RBCS)，对PIV3使用豚鼠的RBC。进行HAI是为了确定rPIV3是否具有标志病毒回收自cDNA的单克隆抗体抗性突变(MARM)，或者，Rpiv3-1是否具有PIV1 HN。
核苷酸序列分析。用Circumvent测序试剂盒(New England Biolabs)测定嵌合cDNA结构pSE.PIV3-1.hc的序列，然后再最后组装成全长克隆pFLC.2G+.hc.。为了分析RNA，在含有LLC-MK2细胞的T75烧瓶中扩增相应的PIV。感染后第5天收获病毒，用聚乙二醇沉淀法浓缩(Mbigino等，J.Virol.Methods 31：161-170(1991)).从病毒沉淀中抽提病毒RNA，用于使用SupreScript预扩增系统(Life Technologies)的逆转录(RT)。用cDNA合成试剂盒(Clontech)和PIV1或PIV3特异性引物对进行RT-PCR。凝胶电泳纯化RT-PCR产物(电泳到NA45 DEAE硝酸纤维素膜上，再从上面洗脱)并测序。
PIV在LLC-MK2细胞内的复制。如前所述在LLC-MK2细胞单层上进行噬斑计数，所不同的是：如果是PIV1和rPIV3-1病毒则加入胰蛋白酶(Hall等，Virus Res.22：173-84(1992))。简而言之，将连续稀释的病毒接种到6格培养板内的LLC-MK2细胞单层上；病毒在32℃吸附1小时；在培养物上覆盖含0.8％琼脂糖另含或不含胰蛋白酶的L-15培养基(Life Technologies)，并32℃孵育6天；在去除琼脂糖覆盖层后通过用豚鼠血红细胞进行的红细胞吸附(HAD)鉴定噬斑。
用病毒以0.01的MOI感染12格培养板上的铺满LLC-MK2细胞单层，评价PIV病毒在组织培养物中的生长。32℃孵育1小时后，接种物被代之以补充了庆大霉素(50μg/ml)和胰蛋白酶(0.75μg/ml)的Opti-MEMI(1.5ml/格)，再在32℃孵育6天。每隔24小时，从每格中取出0.3ml培养基，反还0.3ml含胰蛋白酶的新鲜培养基。如前所述，用液体覆盖层，在32℃，在LLC-MK2细胞单层上进行红细胞吸附试验，由此测定病毒的效价(Hall等，Virus Res.22：173-84(1992))，将效价表示为log10TCID50/ml。
PIV在仓鼠呼吸道内的复制。金色叙利亚仓鼠以12只为1组，各自鼻接种含105pfu rPIV3/JS，rPIV3-1或rPIV1/Wash64的0.1ml L-15培养基。在接种后第4天和第5天，各组中杀6只仓鼠，收获其肺与鼻甲，将其浆化，在32℃，在LLC-MK2细胞单层上测定样品中病毒的效价。
                              结果
构建编码全长嵌合PIV3-1反基因组RNA的cDNA克隆恢复了嵌合病毒rPIV3-1。
PIV3与PIV1嵌合cDNA最后结构中JS野生型PIV3 HN和F糖蛋白基因的ORF被PIV1/Wash 64的编码序列的ORF取代(图14A和14B)，它编码15,516个核苷酸长的嵌合反基因组RNA，这符合6倍数规则(Durbin等，Virology，234：74-78(1997))。编码嵌合PIV3-1反基因组的pFLC.2G+.hc cDNA与N、P和L支持质粒一起转染到HEp-2细胞上。以相同的方式用编码野生JS PIV3反基因组的p3/7(131)2G进行转染，产生rPIV3对照亲代病毒。在LLC-MK2细胞上第二次扩增后收获各次转染的病毒，试验证实每种重组病毒都衍生自cDNA。
首先用血清型特异性抗HN的单克隆抗体或多克隆抗体进行的HAI试验，鉴定重组病毒rPIV3-1和rPIV3中是否存在PIV1或PIV3的HN糖蛋白。如表12所示，如同估计，rPIV3只与两种PIV3 mAb之一反应，但其生物学方法产生的亲代PIV3/JS与两者都反应。这证实rPIV3含有标志该病毒衍生自cDNA的引入的MARM突变。rPIV3-1病毒与PIV1 HN糖蛋白特异性抗体反应而不与PIV3或PIV2 HN特异性抗体反应显示，如同估计，该病毒含有PIV1 HN基因。
                       表12：具有PIV1 HN糖蛋白的rPIV3-1
                   所示单克隆抗体或多克隆抗血清的血凝-抑制效价a(倒数)
  病毒  PIV1b抗血清  PIV2b抗血清   α-PIV3 mAb 423/6c   α-PIV3 mAb 77/5c
  PIV1/Wash64  256  32d   ≤50   ≤50
  rPIV3-1  64  ≤2   ≤50   ≤50
  rPIV3/JS  4  ≤2   ≤50   3,200
  PIV3/JS  8  ≤2   12,800   6,400
  PIV2/Greer  8  512   ≤50   ≤50
e.鸡红血细胞(RBC)用于PIV1，PIV2和rPIV3-1的HAI试验，豚鼠RBC用于PIV3/JS和rPIV3/JS。
f.PIV1家兔抗血清购自Denka Seiken Co.Ltd.，Japan(目录号No.410-701)，PIV2豚鼠抗血清来自NIAID保藏中心，Rockville MD(目录号No.V-322-50-558)。
g.生物学方法产生的PIV3/JS含有423/6和77/5这两种mAb都识别的表位，但是rPIV3/JS经基因工程改造后丧失了与mAb423/6的反应性。
h.PIV2抗血清与PIV1病毒有一定的反应性，所以不是完全的特异性类型。
进一步证实，rPIV3-1病毒具有基因工程改造的嵌合PIV3-1 HN和F基因。如同所设计的，rPIV3-1的基因结构在4个连接区有区别于亲代PIV1/Wash64或rPIV3/JS的独特性(图15A中用方框表示)。这些区域是序列从PIV3非编码区切换到PIV1编码区，再从PIV1编码区切换回PIV3非编码区的过度位点。用PIV3 M和L的特异性引物对A，或PIV1 M和HN基因3’末端的特异性引物对B，产生RT-PCR产物一衍生自rPIV3-1、rPIV3/JS和PIV1/Wash64的病毒RNA。对照反应显示，RT步骤是产生RT-PCR产物所必需的，这说明产生RT-PCR产物所必需的是RNA模板而不是DNA模板。早期rPIV3-1的确是嵌合病毒的提示来自只有PIV3特异性引物对A产生预计的跨越F和HN基因的4.6kb cDNA产物这一发现(图15B)。所以，rPIV3-1只含HPIV1特异性HN糖蛋白(表12)的同时，非编码区具有PIV3特异性。相对而言，PIV1特异性引物对B从PIV1对照扩增得到大小正确的产物，但不能从rPIV3-1获得。限制型消化也表明rPIV3-1的RT-PCR产物具有区别于rPIV3/JS和PIV1/Wash64的独特限制型模式，并符合其预计序列。
测定了rPIV3-1的4.6kb RT-PCR产物内4个区域(图15A)的核苷酸序列，并与rPIV3/JS和PIV1/Wash64的进行了比较(图16)。rPIV3-1的序列与其源cDNA完全一致。对三种RT-PCR产物的I-IV区域序列排列比较检测显示rPIV3-1含有PIV1 F和HN糖蛋白的ORF，但其始和终止密码子被改变，且两侧为PIV3的5’和3’非编码区。评价了序列梯实施例，该序列梯跨越rPIV3-1的I-IV区(图17)，并与rPIV3/JS或PIV1/Wash64进行了比较，该分析证实：rPIV3-1是重组嵌合病毒，其结构与其源cDNA完全一致。
rPIV3-1在体外的胰蛋白酶依赖性和细胞致病性。
PIV1与仙台病毒一样，与PIV3相反，为了在连续的组织培养细胞系上进行多轮复制，需要胰蛋白酶来切割其F糖蛋白(Frank等，J.Clin.Microbiol.10：32-6(1979))。此外，PIV1是一种非细胞致病性病毒，但PIV3则很容易产生大量的CPE(Collins等，Fields Virology第3版，1：1205-43(1996))。rPIV3-1，rPIV3和PIV1/Wash64的比较是以这些特性为基础的。与PIV1/Wash64一样，rPIV3-1在用鸡RBC而不是豚鼠RBC时具有较高的HA效价。与其PIV1/Wash64亲代一样，rPIV3-1需要胰蛋白酶在具有液体覆盖层的培养物中才能有效复制以及有效形成噬斑。rPIV3-1在32℃，37℃或40℃形成噬斑的效率相近。这可以证明rPIV3-1具有PIV1亲代病毒的F糖蛋白，而且没有温度敏感性。另一方面，被病毒感染的细胞单层中，细胞的变圆(rounding)和脱落说明细胞产生CPE的能力几乎与其PIV3亲代一样，这说明这一生物学特性是HN和F编码区外PIV3基因的功能。所以，rPIV3-1具有来自亲代双方的生物学特性，这符合以上发现，说明它是嵌合病毒。本发明的这例重组嵌合病毒根据布达佩斯条约于1998/5/21保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC VR-2610)(12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 220852，USA).
              表13：亲代与嵌合PIVa的HA效价，感染性和细胞致病性比较
  病毒   用所示RBC的HA效价   以CPE或HAD作为终点的感染效价b(Log10TCID50/ml)   PFU/mlc(Log10)
  鸡   豚鼠           CPE            HAD        胰蛋白酶
       胰蛋白酶          胰蛋白酶
  -   +   -   +   -   +
  PIV1/Wash64rPIV3-1rPIV3/JS   16640   8168   ≤2.5≤2.54.5   ≤2.55.87.3   4.8d5.5d5.0d   6.37.87.5   ≤0.7e≤0.7e5.0   5.87.16.2
a.将病毒储备液培养在LLC-MK2细胞中，所述细胞接受0.01 MOI的感染，在有0.75μ/ml胰蛋白酶(PIV1/Wash64，rPIV3-1)或没有其(rPIV3/JS)存在下培养6天。在有或没有胰蛋白酶存在下用后文所述的试验测试所得的病毒储备液。
b.TCID50是在第6天通过直接显示CPE或通过红细胞吸附(HAD)来读取的。
c.在培养6天后，通过HAD来展示噬斑。
d.PIV3感染的细胞单层的HAD非常明显，但PIV1和rPIV3-1感染的只有在显微镜下才能看到，只观察到吸附RBC的单细胞。
e.病毒的最低可测水平是100.7/ml。
rPIV3-1与其亲代在LLC-MK2细胞和在仓鼠体内复制水平的比较
在以0.01的MOI接种给LLC-MK2组织培养细胞后，评价rPIV3，rPIV3-1和PIV1/Wash64病毒的多轮复制(图18)。可以看到，这三种病毒复制的动力学和强度都很相似。这说明用PIV1的HN和F基因取代PIV3的对应基因没有减弱病毒在体外的复制。接着确定rPIV3-1在体内是否被减毒，尤其是在仓鼠上下呼吸道内的复制(表14)。结果发现，rPIV3-1在仓鼠上下呼吸道内的复制与亲代双方相似，也可能略高。
              表14：亲代和嵌合PIV在仓鼠a上下呼吸道内复制水平
  病毒                           所示组织内的病毒效价(平均log10TCID50/g±S.E.)
                       鼻甲                         肺
  第4天   第5天   第4天   第5天
  PIV1/Wash64   5.2±0.24   5.2±0.12   5.0±0.31   5.0±0.38
  rPIV3-1   4.9±0.23   6.2±0.17   5.8±0.15   6.0±0.09
  rPIV3/JS   4.5±0.09   5.0±0.18   5.1±0.26   5.0±0.32
a.仓鼠鼻感染了105.0TCID/个的所示病毒，在感染后第4天或第5天收获鼻甲和肺。效价上一天内6个动物的平均值，表示为log10TCID50/g±标准误差。
概括地说，本实施例证明，PIV1 HN和F糖蛋白的ORF被rPIV3的所取代的rPIV3-1嵌合病毒的成功恢复。该嵌合病毒的体外体内复制与其野生型的PIV1和PIV3亲代病毒相同，说明糖蛋白ORF取代没有造成rPIV3-1的减毒。含有PIV1 HN和F糖蛋白的重组PIV3的成功恢复是出人意料的，因为这两种代表不同血清型的病毒并非密切相关。特别值得注意的是，该嵌合重组体的生长与其亲代一样的好。值得注意的是，还恢复了具有糖蛋白基因取代的嵌合重组疱疹性口炎病毒(VSV)(Lawson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4477-81(1995))。具体地说，Inidana血清型的VSV G糖蛋白基因被New Jersey血清型的取代，两者氨基酸序列的一致性为50％。与rPIV3-1相反，嵌合重组VSV1/NJ的复制水平仅为重组VSV1或生物学方法产生的VSV的10％。
在本实施例中，PIV1与PIV3之间的的HN和F糖蛋白序列一致性分别为43％和47％。当然，两者的一同转移将消除糖蛋白-糖蛋白的不相容性(Tanabayashi，K.&Compans，R.W.J.Virol.70：6112-18(1996))。另一方面，一般认为，糖蛋白通过它们的胞质(CT)或跨膜(TM)结构域与M蛋白(PIV1与PIV3的一致性为63％)反应，这一反应对病毒的形态和结构来说是十分重要的。因此，两血清型之问各自HN和F蛋白的TM和CT结构域的序列一致性实际上很低：两蛋白TM结构域的一致性分别为30％和2％，CT结构域的分别为9％和11％。基于如此低的序列相关性，我们还设想了类似的构建嵌合糖蛋白的战略，其中各糖蛋白的PIV1胞外区与PIV3的TM和CT结构域融合。就与M蛋白及其它胞内蛋白反应的可能性而言，保守性结构，例如带电氨基酸的云集，可能比保守性序列更重要。或者，糖蛋白TM和CT结构域与胞内蛋白之间的反应可能并不象过去所认为的那么重要。用本发明提供的工具和方法能够更准确地研究这些因素。例如，使用上述构建带PIV2 HN和F的PIV3病毒的方法而取得的工作进展，可以进一步说明这些因素。
据估计，rPIV3-1在组织培养物内的有效复制需要胰蛋白酶，因为这是一个由PIV1 F糖蛋白提供的特性，结果发现的确如此。但有趣的是，rPIV3-1产生的CPE与PIV3亲代病毒的更相似，说明造成这一表型的是HN或F之外的PIV3基因。用本发明提供的方法和工具互换非细胞致病性PIV1和细胞致病性PIV3的其它基因，进一步说明的以上作用。
                               实施例XII
       编码PIV3内部蛋白和PIV1表面糖蛋白的活减毒嵌合重组PIV的恢复
本实施例显示，带有活减毒cp45 PIV3候选疫苗病毒L基因内3种温度敏感性和减毒氨基酸编码改变的rPIV3-1的衍生病毒rPIV3-1 cp45 L表现出温度敏感性表型，具有38C的关闭温度，与具有同样的3种突变的重组rPIV3 cp45 L相同。r PIV3-1cp45 L在仓鼠呼吸道内的减毒程度与r PIV3 cp45 L的相同。用rPIV3-1 cp45 L感染的仓鼠产生中等水平的抗野生型PIV1抑血凝性抗体，并诱导对野生型PIV攻击的完全抗性。这表明，本发明的减毒嵌合PIV能够诱导高效的抗PIV1免疫应答。这一发现还确认了前述信息，表明副流感病毒的表面糖蛋白足以诱导抗同源病毒攻击的高水平抗性。出人意料的是，用带有PIV1表面糖蛋白基因和PIV3内部基因的重组嵌合毒株rPIV3-1 cp45 L或rPIV3 cp45 L进行的感染，也诱导抗PIV3攻击病毒复制的中度抗性。这说明，PIV3的内部基因能够在鼠体内独立诱导抗PIV3的保护性免疫。所以，本发明所述PIV3的反基因系统成功产生了在认可的模型中被减毒并具有保护作用的候选减毒PIV1活疫苗。
病毒与细胞
本试验所用的野生型PIV毒株是PIV1/Washington/20993/1964(PIV1/Wash64)(参见Murphy等，Infect.Immun.12：62，1975，本发明全面参考了其中内容)。如前文以及Tao等在J.Virol.72：2955，1998(本发明全面参考了其中内容)所述，在从PIV3 cDNA恢复的嵌合rPIV3-1中，PIV3 HN和F的ORF被PIV1/Wash64的所取代。这些病毒在LLC-MK2细胞(ATCC CCL7.1)内繁殖，细胞处于含50μg/ml硫酸庆大霉素和0.75μg/ml胰蛋白酶(目录号No.3741，Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ)的Opti-MEM I(Life Technologies)中。包含胰蛋白酶是因为：当在上述条件下生长于细胞培养物中时，PIV1(但不是PIV3)的F糖蛋白依赖于外源胰蛋白酶来剪切。如上所述或如Durbin等在Virology 235：323，1997(本发明全面参考了其中内容)中所述，繁殖人PIV3病毒的野生JS毒株及其来自cDNA的重组衍生体(rPIV3/JS)。如上所述或如Skiadopoulos等在J.Virol.72：1762，1998(本发明全面参考了其中内容)中所述繁殖野生PIV3/JS的减毒衍生体cp45(参见前文；以及Karron等，J.Infect.Dis.171：1107，1995，本发明全面参考了其中内容)和带有cp45 L基因内3种ts突变的重组PIV3即rPIV3cp45L。经修饰的重组牛痘Ankara(MVA)表达T7 RNA聚合酶，参见Virology210：202，1995(本发明全面参考了其中内容)。
转染所用的HEp-2细胞来自ATCC(ATCC CCL 23)，将其维持在含2％胎牛血清(FBS)和50μg/ml硫酸庆大霉素的Opti-MEM I中。
将L突变引入rPIV3-1反基因组cDNA中
将前述质粒pTM(L)942/992/1558中的cp45的3种L突变(Skiadopoulos等，J.Virol.72：1762，1998)以2.8kb SphI-NheI片段(PIV3反基因组cDNA内第11313至14092位核苷酸)引入嵌合cDNA pFLC.2G+.hc(参见前文，或Tao等，J.Virol.72：2955，1998)，产生带有PIV1 F和HN ORF以及3种cp45L基因突变的全长pFLC.2G+.hc.cp45 L(图19)。图19的图例中指明了pTM(L)942/992/1558中的具体突变。
转染。在6格培养板上将HEp-2细胞培养至铺满，如前所述进行转染(参见Tao等，J.Virol.72：2955，1998)。在转染后的第3天加入胰蛋白酶，最终浓度为0.75μg/ml，然后在第4天收获。将细胞培养物的清液澄清化，传代(第一代)到新鲜的LLC-MK2细胞单层上。通宵吸附后，用含0.75μg/ml胰蛋白酶的新鲜Opti-MEM I替换培养基。第一代培养物在32℃孵育4天，收获清液中的病毒，在相同的条件下再次传代(第二代)。通过前述血凝-抑制试验(HAI)(还可参见Tao等，J.Virol.72：2955，1998)测定第二代的收获物中有否PIV1 HN蛋白。
不同温度下，PIV在LLC-MK2细胞内的复制
如前所述在LLC-MK2细胞单层上进行噬斑计数，在PIV1，rPIV3-1和rPIV3-1.cp45L的琼脂糖覆盖层中加入0.75μg/ml胰蛋白酶(参见Tao等，J.Virol.72：2955，1998)。在各种温度孵育6天后，去除琼脂糖覆盖层，通过用豚鼠红细胞(RBC)的红细胞吸附(HAD)鉴定噬斑。
PIV在仓鼠呼吸道内的复制
给5个1组的仓鼠鼻接种0.1ml含106噬斑形成单位(PFU)rPIV3/JS，rPIV3 cp45L，cp45，PIV1/Wash64，rPIV3-1或rPIV3-1.cp45L的L15培养基。在感染后第4天将仓鼠杀死，收获它们的鼻甲和肺并制成匀浆。如前文或如Tao等，J.Virol.72：2955，1998中所述，在LLC-MK2细胞单层上测定组织样品中病毒的效价。效价表达为每组的倒数平均值即平均log10TCID50/g组织。
仓鼠体内的免疫和攻击试验。
如前所述，给10个1组的仓鼠鼻接种106PFU病毒。在感染前和感染后第33天收集血清，用于HAI试验。以PIV1/Wash64和PIV3/JS作为抗原测定10个1组仓鼠血清中的HAI抗体水平，并将测得的HAI效价表达为log2的平均值(也可参见Tao等，J.Virol.72：2955，1998)。
免疫后35天，每组取5只仓鼠用106PFU的PIV1/Wash64或PIV3/JS进行鼻攻击。攻击后4天收获鼻甲和肺。如前文或如Tao等，J.Virol.72：2955，1998中所述，在LLC-MK2细胞单层上测定组织样品中病毒的效价。效价表达为每组的倒数平均值即平均log10TCID50/g组织。
                            结果
               重组嵌合病毒rPIV3-1.cp45L的恢复与鉴定
如前所述通过引入3种氨基酸编码改变(根据L蛋白内的氨基酸位置称为942，992和1558)(经鉴定位于cp45L基因内且为彼此独立的ts和减毒突变)来修饰cDNA克隆pFLC.2G+.hc(PIV3的全长反基因组cDNA，其中编码F和HN糖蛋白的ORF被PIV1的取代)(图19；也可参见Skiadopoulos等，J.Virol.72：1762，1998)。每种编码改变都用共导入消除天然限制型位点的比邻转录沉默核苷酸取代来标记(图19；表)。最后的全长质粒结构pFLC.2G+.hc.cp45L(图19)编码长15516个核苷酸的PIV3-1嵌合反基因组RNA，并符合6倍数规则(参见Durbin等，Virology 234：74，1997，本发明全面参考其中内容)。通过合适限制性酶消化来确认pFLC.2G+.hc.cp45L的正确性。如前文或Tao等，J.Virol.72：2955，1998所述，将pFLC.2G+.hc.cp45L cDNA与PIV3N、P和L支持质粒一起转染到HEp-2细胞内，并用MVA-T7感染。在LLC-MK2细胞上传代2次后恢复的病毒称rPIV3-1.cp45L，用噬斑到噬斑到噬斑传代法进行生物学方法克隆，分析扩增所得的病毒确认具有PIV1的糖蛋白和引入L内的3处突变。首先，如前文或Tao等在J.Virol.72：2955，1998中所述，在HAI试验中，根据与PIV1特异性抗体的反应性确认rPIV3-1.cp45L内有PIV1 HN蛋白。如前文或Tao等在J.Virol.72：2955，1998中所述，用限制型酶消化或用对病毒RNA的TR-PCR产物的核苷酸序列分析来确认rPIV3-1.cp45L基因组RNA内有嵌合PIV3-1 HN和F基因以及引入的L基因突变。以上结果确认rPIV3-1.cp45L是带有cp45 L基因内3处密码子取代的重组嵌合病毒。
rPIV3-1.cp45L是温度敏感性的
如前所述，cp45的3处L基因突变在引入野生PIV3中时提供ts表型(也可参见Skiadopoulos等，J.Virol.72：1762，1998)。为了评价它们在嵌合病毒中的有无是否具有相同的效果，在不同温度测定了rPIV3-1.cp45L的噬斑形成率。如表15所示，L基因内三处突变的确赋予嵌合病毒ts表型。cp45L突变在重组病毒rPIV3cp45L和rPIV3-1.cp45L内产生的温度敏感性水平相当(见表15)，这说明突变的效果与PIV3或PIV1的HN和F糖蛋白无关。rPIV3cp45L和rPIV3-1.cp45L的温度敏感性水平与生物学方法产生的cp45病毒的相当，尽管后者具有L基因外的突变(Stokes等，VirusRes.30：43，1993，本发明全面参考其中内容)。
           表15：重组嵌合rPIV3-1.cp45L候选疫苗病毒是温度敏感性的
病毒a                            所示温度的病毒效价b(log10PFU/ml)
  32℃   36℃   37℃   38℃   39℃   40℃
  rPIV3/JSPIV1/Wash64crPIV3-1PIV3cp45crPIV3 cp45LrPIV3-1.cp45L   7.47.57.57.47.98.1   7.27.67.56.97.48.0   7.27.57.56.87.78.2   7.27.57.24.7d5.36.1   7.27.46.0＜0.71.2＜0.7   7.27.26.1＜0.7＜0.7＜0.7
a.病毒名称：rPIV3/JS，重组野生型PIV3 JS毒株；PIV1/Wash64，生物学方法产生的野生PIV1；rPIV3-1，重组嵌合PIV3，其中的F和HN ORF被PIV1/Wash64的取代；PIV3cp45，生物学方法产生的cp45候选疫苗病毒；rPIV3cp45L含有3处cp45 L基因突变的重组PIV3；rPIV3-1.cp45L，含有3处cp45L基因突变的重组嵌合PIV3-1。
b.用12格培养板种的LLC-MK2细胞单层测定病毒效价。效价是两次试验的平均值。
c.生物学方法产生的病毒。其余都是重组病毒。
d.以粗体表示关闭温度，即各种ts病毒的病毒效价减低为2个log10时的最低限制性温度。
rPIV3-1.cp45L在仓鼠体内的复制水平
如前所述，cp45的3处L基因突变在引入野生PIV3时提供病毒在仓鼠上下呼吸道内复制的弱化(参见Skiadopoulos等，J Virology 72：1762，1998)。如表16所示，通过仓鼠鼻感染来评价它们对嵌合病毒的作用。这些发现显示，rPIV3-1.cp45L的确在两处都被弱化，而且，减毒水平与rPIV3 cp45L的相近。所以，cp45L突变提供减毒作用的能力与提供温度敏感性的能力一样都与表面糖蛋白的抗原特异性无关。
  表16：重组嵌合rPIV3-1.cp45L候选疫苗病毒在仓鼠a呼吸道内被弱化
病毒   所示组织内的病毒效价(log10TCID50/g±S.E.)
  鼻甲   肺
  rPIV3-1.cp45LrPIV3-1rPIV3 cp45LrPIV3/JS   4.6±0.36.0±0.33.0±0.35.7±0.3   1.9±0.46.3±0.4＜1.25.0±0.3
a.用所示病毒以106PFU/仓鼠的剂量对5个1组的仓鼠进行鼻感染。感染后第4天，收获组织样品进行病毒试验。
b.病毒效价表示为log10TCID50/g组织。
用含PIV3内部蛋白和PIV1糖蛋白的rPIV3-1或rPIV3-1.cp45L进行的感染在仓鼠体内提供对PIV1攻击的抵抗力
本实施例评价了嵌合rPIV3-1病毒及其减毒rPIV3-1.cp45L衍生株在仓鼠体内的免疫原性和保护效果。如表17所示，两种病毒的感染都诱导产生抗PIV1的HAI抗体，但不产生抗PIV3的HAI抗体，这证明嵌合病毒具有PIV1的HN糖蛋白，而且具有高度的免疫原性。rPIV3-1.cp45L诱导的HAI抗体水平比rPIV3-1诱导的低2倍，说明它的减毒造成其免疫原性的略微降低。同样，rPIV3和rPIV3 cp45L诱导产生抗PIV3的HAI抗体，但不产生抗PIV1的HAI抗体，减毒病毒诱导的水平低约2倍。尽管带有cp45 L突变的重组病毒在仓鼠体内的复制受到抑制，用rPIV3 cp45L或rPIV3-1.cp45L感染都诱导产生对带有同源糖蛋白的攻击病毒复制的完全抗性。
              表17：重组嵌合rPIV3.1.cp45L候选疫苗病毒在仓鼠攻击试验中
                     诱导对PIV1的完全抵抗力和对PIV3的部分抵抗力
免疫所用病毒 糖蛋白来源   接种后HAI效价(log2倒数±SE)         所示组织内的病毒效价c(log10TCID50/g±SE)
    PIV1攻击病毒的复制       PIV3攻击病毒的复制
  α-PIV1   α-PIV3   鼻甲   肺   鼻甲   肺
  对照brPIV3-1.cp45LrPIV3-1rPIV3 cp45LrPIV3/JSPIV3/cp45d PIV1PIV1PIV3PIV3PIV3   ≤16.9±0.57.9±0.4≤1≤1≤1   ≤1≤1≤19.3±0.210.3±038.9±0.4   5.0±0.3≤1.2≤1.24.6±0.24.6±0.44.9±0.2   4.6±0.5≤1.2≤1.22.8±0.72.4±0.52.5±0.8   5.4±0.41.9±0.62.9±0.3≤1.2≤1.2≤1.2   5.0±0.71.7±0.52.6±0.4≤1.2≤1.2≤1.2
a.给10个1组的仓鼠鼻免疫106PFU所示病毒。在第33天收集免疫后血清，两天后进行攻击(见c)。
b.对照组的仓鼠不接种。
c.免疫后5周，每组取5只用106PFU所示病毒鼻攻击。攻击后4天，收获组织样品。在LLC-MK2细胞单层上测定组织样品中的病毒效价，表示为log10TCID50/g组织±标准误差。
d.生物学方法产生的病毒。
rPIV3-1.cp45感染也提供PIV3抗性。
有关非PIV HN或F糖蛋白(即内部蛋白)在抗性中作用的信息很有限。本发明揭示的rPIV3-1和rPIV3-1.cp45及其用途为检测内部蛋白在抗PIV3攻击抗性中的作用提供了机会，因为免疫用和攻击用病毒相同的基因只有内部蛋白基因。预先用rPIV3-1或rPIV3-1.cp45感染明显限制了PIV3攻击病毒在仓鼠上下呼吸道内的复制(表17)。所以，以上信息表明PIV3的内部蛋白与HN和F蛋白一样，能够诱导产生对攻击用PIV3病毒复制的部分抗性。
在以上免疫原性和效力研究所得的各种发现中，特别出人意料的是，野生或减毒rPIV3感染使得PIV1攻击用病毒在肺内的复制降低了100倍。这样，某PIV血清型的感染和提供抗其异源血清型的显著保护作用。其出人意料之处在一定程度上是因为，先前的研究显示：用一种人PIV感染动物不能诱导产生显著的抗另一种人血清型PIV的异源保护作用，这符合过去的一种普遍认识即抗人PIV感染的免疫具有高度的类型特异性(参见Cook等，Amer.Jour.Hyg.77：150，1963；Ray等，J.Infect.Dis.162：746，1990，本发明全面参考其中内容。)。
本实施例成功获得了用于产生PIV3疫苗，继而快速而稳妥地开发抗PIV1减毒候选活疫苗的新方法和反应试剂。通过用编码PIV1 HN和F保护性抗原的ORF取代PIV3中的对应部分对编码感染性PIV3的cDNA进行了修饰。然后，将减毒突变，例如cp45PIV3 L基因内的3处减毒突变，结合到经修饰的这一嵌合PIV3-PIV1cDNA中。可由这一cDNA恢复获得带有PIV1的HN和F基因，PIV3的内部蛋白，和PIV3cp45的L基因突变的重组病毒。这一重组体rPIV3-1.cp45L对温度敏感，在仓鼠中被高度减毒，在仓鼠内对PIV1攻击具有高度抗性。rPIV3-1.cp45L表现出的温度敏感性水平，减毒程度和免疫原性与cp45 PIV3的相近，这说明cp45L基因突变组所造成的表型与HN和F糖蛋白无关。以上结果代表了用反基因获得的第一种减毒PIV1候选活疫苗，为发展抗PIV疫苗提供了普遍适用的成功方案。
有关副流感病毒胞内蛋白在抗同源病毒重复感染抗性中的作用知之甚少。据报道，用表达N、N内的表位或M的重组牛痘病毒进行的感染诱导对进攻病毒复制的抗性，但是，报道中抗性的强度低于带有HN或F糖蛋白的重组牛痘所诱导的(Kast等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：2283，1991；Sakaguchi等，J.Gen.Virol.74：479，1993；Thomson等，J.Immunol.157：822，1996，本发明全面参考其中内容)。这些研究显示，内部蛋白对抗重复感染抗性的贡献很小。所以，本发明内容的出人意料之处在于：预先用rPIV3-1.cp45L或rPIV3-1感染诱导造成PIV3在鼻甲和肺内的复制都降低约250至400倍。这两种嵌合重组病毒与攻击用PIV3病毒的差异在于它们具有的是PIV1而不是PIV3的HN和F糖蛋白，但是它们的其余基因都与攻击用病毒相同。PIV1 HN和F糖蛋白与PIV3的分别具有47％和43％的序列一致性。虽然可能是相同的内部蛋白介导了观察到的抗性，但也可能是PIV1与PIV之间HN和F糖蛋白中相同的蛋白质序列产生了观察到的免疫力。HN中有5段和F中2段至少长9个氨基酸残基的序列在PIV1和PIV3之间是相同的，它们可能是保护性的CTL表位。有道理认为相同的内蛋白对限制野生PIV3进攻病毒的复制有贡献，因为如此水平的交叉免疫力在过去的研究中不曾发现过(参见，Cook等，Amer.Jour.Hyg.77：150，1963；Ray等，J.Infect.Dis.162：746，1990，本发明全面参考其中内容)。
rPIV3-1和rPIV3-1.cp45L嵌合病毒的PIV3胞内蛋白提供抗PIV3攻击的抗性，这一发现说明可将PIV3的减毒衍生体用作PIV1和PIV2保护性抗原的载体。根据本发明的说明，用一种基于PIV3的活减毒疫苗病毒进行免疫，可以限制此后给予的其它基于PIV3的疫苗病毒的复制，由此降低第二病毒的免疫原性。因为PIV3和RSV一样会在幼婴中诱导严重的疾病，所以，用于2至4周龄幼婴的RSV-PIV3组合疫苗是本发明的一项重要内容(参见Collins等，Fields Virology第3版，Philadelphia：Lippincott-Raven Publishers，1205(1)，1996；Reed等，J.Infect.Dis.175：807，1997，本发明全面参考其中内容)。根据本发明这一方面的内容，宜在出生约6个月后开始用PIV1-PIV2疫苗进行免疫，因为大多数PIV1和PIV2疾病发生在6月龄。在可能的条件下，即rPIV3cp45免疫明显抑制与其具有相同内部蛋白基因的嵌合重组PIV3-1疫苗病毒的复制，用重组PIV3-1疫苗进行的成功免疫可能受到影响。此时，应同时而不是此后给予三价PIV疫苗，以避免上述抑制作用。
用疫苗或野生PIV3感染可诱导异源野生PIV1病毒肺内复制降低100倍，这一发现显然是出人意料的，这在一定程度上是因为，中和试验显示人PIV病毒具有血清学独特性，而且过去在仓鼠内的研究发现：一种类型PIV的预先感染不能诱导对高剂量不同类型PIV攻击的抗性(参见Cook等，Amer.Jour.Hyg.77：150，1963；Ray等，J.Infect.Dis.162：746，1990，Cook等，Amer.Jour.Hyg.69：250，1959，本发明全面参考其中内容)。而且，记载一种PIV预感染显著改变此后异型PIV感染的流行病学资料很少。
总而言之，本实施例显示，通过取代编码F和HN糖蛋白的ORF和将已知的减毒突变引入PIV3胞内基因可将rPIV3成功转变成抗PIV1的疫苗。所以，本发明提供的大量方法和试剂可直接用于并预计可以弱化rPIV3-1嵌合病毒的PIV3骨架，并产生减毒PIV2活疫苗株。
以上成果使得用本发明的试剂和方法来发展大量PIV及其相关疫苗成为可能。就此而言，PIV3和PIV2形成的活免疫原性嵌合病毒的恢复代表了开发一系列疫苗用PIV重组病毒的有效的新工具和方法。鉴定和特征分析天然PIV突变株即cp45和BPIV3候选疫苗减毒的基因基础，根据本发明说明，也推进了大量重组疫苗病毒和亚病毒颗粒的开发。具体地说，如以上实施例所述，通过单独或组合后引入野生型、部分减毒或嵌合的PIV背景内，可以方便地鉴定出存在于生物学方法突变病毒内的所需突变。以上发现扩大了本发明可引入PIV克隆调校重组疫苗内减毒程度和免疫原性的减毒突变例的范围。也可以将生物学方法突变引入具有不同类型突变(例如基因或基因节段的改变、删除或取代)的PIV克隆中，在本发明这方面中，提供了具有选定基因缺失、增加或取代的重组PIV，例如缺失了C、D或V ORF的rPIV。如此另行突变的克隆还可以根据本发明通过引入取自生物学方法突变PIV的造成ts、ca或att表型的一种或多种突变进行进一步的修饰，例如重组PIV：r942，r992，r1558，r942/992，r992/1558或r942/1558和r942/992/1558。在本发明另一部分内容中，生物突变将与非天然的新突变，例如缺失了C、D和/或V ORF的减毒突变相组合。本发明中提供所需表型特征的其它类型突变也可以与生物学方法产生的突变相组合，这类似于1997年7月15日的美国专利申请08/892,403所述用于重组RSV疫苗株的一系列组成型突变(本发明全面参考其中内容)。类似的突变可方便地引入例如嵌合病毒中，得到具有所需减毒程度和免疫原性水平的嵌合疫苗株。用这种方式，可以用本发明提供的突变大菜单经基因工程法产生大量减毒rPIV活疫苗，它们均具有减毒与免疫原性之间的良好平衡，而且具有其它所需的表型特征。
虽然，以上为了清楚地理解本发明，通过说明和实施例详细阐述了本发明，但是显然，在后文权利要求的范围内可进行一定的改变和修正。
                          序列表
(1)一般信息：
  (i)申请人：
    (A)姓名：美国政府
    (B)街道：Box OTT
    (C)城市：Bethesda
    (D)州：Maryland
    (E)国家：美国
    (F)邮政编码(邮编)：20892
    (G)电话：
    (H)传真：
    (I)电传：
  (ii)发明名称：从克隆的核苷酸序列制备减毒副流感病毒的方法
  (iii)序列数目：74
  (iv)计算机可`读形式：
    (A)记录介质类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容型
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.25
  (v)本申请资料：
    (A)申请号：WO
    (B)申请日：22-5-1998
    (C)分类：
  (vi)在先申请资料：
    (A)申请号：US 60/059,385
    (B)申请日：19-9-1997
  (vi)在先申请资料：
    (A)申请号：US 60/047,575
    (B)申请日：23-5-1997
  (vii)律师/代理人信息：
    (A)姓名：King，Jeffrey J.
    (B)登记号：38，515
    (C)参考/案卷号：17634-000320PC
  (viii)通讯信息：
    (A)电话：206-467-9600
    (B)传真：415-576-0300
(2)SEQ ID NO：1的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：15669碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：cDNA
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
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GCAAATGTTC CAAGCGAGAT ATCAGGAAGT GATGACATAT TTACAACAGA ACAAAGTAGA    2520
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GTTGTTACTG CTGCAACACC AGATGATGAA GAAGAAATAC TAATGAAAAA TAGTAGGACA    2640
AAGAAAAGTT CTTCAACACA TCAAGAAGAT GACAAAAGAA TTAAAAAAGG GGGAAAAGGG    2700
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TCCACATCAA AAGGGCAGAA GAAAATCTCA AAGACAACAA CCACCAACAC CGACACAAAG    2820
GGGCAAACAG AAATACAGAC AGAATCATCA GAAACACAAT CCTCATCATG GAATCTCATC    2880
ATCGACAACA ACACCGACCG GAACGAACAG ACAAGCACAA CTCCTCCAAC AACAACTTCC    2940
AGATCAACTT ATACAAAAGA ATCGATCCGA ACAAACTCTG AATCCAAACC CAAGACACAA    3000
AAGACAAATG GAAAGGAAAG GAAGGATACA GAAGAGAGCA ATCGATTTAC AGAGAGGGCA    3060
ATTACTCTAT TGCAGAATCT TGGTGTAATT CAATCCACAT CAAAACTAGA TTTATATCAA    3120
GACAAACGAG TTGTATGTGT AGCAAATGTA CTAAACAATG TAGATACTGC ATCAAAGATA    3180
GATTTCCTGG CAGGATTAGT CATAGGGGTT TCAATGGACA ACGACACAAA ATTAACACAG    3240
ATACAAAATG AAATGCTAAA CCTCAAAGCA GATCTAAAGA AAATGGACGA ATCACATAGA    3300
AGATTGATAG AAAATCAAAG AGAACAACTG TCATTGATCA CGTCACTAAT TTCAAATCTC    3360
AAAATTATGA CTGAGAGAGG AGGAAAGAAA GACCAAAATG AATCCAATGA GAGAGTATCC    3420
ATGATCAAAA CAAAATTGAA AGAAGAAAAG ATCAAGAAGA CCAGGTTTGA CCCACTTATG    3480
GAGGCACAAG GCATTGACAA GAATATACCC GATCTATATC GACATGCAGG AGATACACTA    3540
GAGAACGATG TACAAGTTAA ATCAGAGATA TTAAGTTCAT ACAATGAGTC AAATGCAACA    3600
AGACTAATAC CCAAAAAAGT GAGCAGTACA ATGAGATCAC TAGTTGCAGT CATCAACAAC    3660
AGCAATCTCT CACAAAGCAC AAAACAATCA TACATAAACG AACTCAAACG TTGCAAAAAT    3720
GATGAAGAAG TATCTGAATT AATGGACATG TTCAATGAAG ATGTCAACAA TTGCCAATGA    3780
TCCAACAAAG AAACGACACC GAACAAACAG ACAAGAAACA ACAGTAGATC AAAACCTGTC    3840
AACACACACA AAATCAAGCA GAATGAAACA ACAGATATCA ATCAATATAC AAATAAGAAA    3900
AACTTAGGAT TAAAGAATAA ATTAATCCTT GTCCAAAATG AGTATAACTA ACTCTGCAAT    3960
ATACACATTC CCAGAATCAT CATTCTCTGA AAATGGTCAT ATAGAACCAT TACCACTCAA    4020
AGTCAATGAA CAGAGGAAAG CAGTACCCCA CATTAGAGTT GCCAAGATCG GAAATCCACC    4080
AAAACACGGA TCCCGGTATT TAGATGTCTT CTTACTCGGC TTCTTCGAGA TGGAACGAAT    4140
CAAAGACAAA TACGGGAGTG TGAATGATCT CGACAGTGAC CCGAGTTACA AAGTTTGTGG    4200
CTCTGGATCA TTACCAATCG GATTGGCTAA GTACACTGGG AATGACCAGG AATTGTTACA    4260
AGCCGCAACC AAACTGGATA TAGAAGTGAG AAGAACAGTC AAAGCGAAAG AGATGGTTGT    4320
TTACACGGTA CAAAATATAA AACCAGAACT GTACCCATGG TCCAATAGAC TAAGAAAAGG    4380
AATGCTGTTC GATGCCAACA AAGTTGCTCT TGCTCCTCAA TGTCTTCCAC TAGATAGGAG    4440
CATAAAATTT AGAGTAATCT TCGTGAATTG TACGGCAATT GGATCAATAA CCTTGTTCAA    4500
AATTCCTAAG TCAATGGCAT CACTATCTCT ACCCAACACA ATATCAATCA ATCTGCAGGT    4560
ACACATAAAA ACAGGGGTTC AGACTGATTC TAAAGGGATA GTTCAAATTT TGGATGAGAA    4620
AGGCGAAAAA TCACTGAATT TCATGGTCCA TCTCGGATTG ATCAAAAGAA AAGTAGGCAG    4680
AATGTACTCT GTTGAATACT GTAAACAGAA AATCGAGAAA ATGAGATTGA TATTTTCTTT    4740
AGGACTAGTT GGAGGAATCA GTCTTCATGT CAATGCAACT GGGTCCATAT CAAAAACACT    4800
AGCAAGTCAG CTGGTATTCA AAAGAGAGAT TTGTTATCCT TTAATGGATC TAAATCCGCA    4860
TCTCAATCTA GTTATCTGGG CTTCATCAGT AGAGATTACA AGAGTGGATG CAATTTTCCA    4920
ACCTTCTTTA CCTGGCGAGT TCAGATACTA TCCTAATATT ATTGCAAAAG GAGTTGGGAA    4980
AATCAAACAA TGGAACTAGT AATCTCTATT TTAGTCCGGA CGTATCTATT AAGCCGAAGC    5040
AAATAAAGGA TAATCAAAAA CTTAGGACAA AAGAGGTCAA TACCAACAAC TATTAGCAGT    5100
CACACTCGCA AGAATAAGAG AGAAGGGACC AAAAAAGTCA AATAGGAGAA ATCAAAACAA    5160
AAGGTACAGA ACACCAGAAC AACAAAATCA AAACATCCAA CTCACTCAAA ACAAAAATTC    5220
CAAAAGAGAC CGGCAACACA ACAAGCACTG AACACAATGC CAACTTCAAT ACTGCTAATT    5280
ATTACAACCA TGATCATGGC ATCTTTCTGC CAAATAGATA TCACAAAACT ACAGCACGTA    5340
GGTGTATTGG TCAACAGTCC CAAAGGGATG AAGATATCAC AAAACTTTGA AACAAGATAT    5400
CTAATTTTGA GCCTCATACC AAAAATAGAA GACTCTAACT CTTGTGGTGA CCAACAGATC    5460
AAGCAATACA AGAAGTTATT GGATAGACTG ATCATCCCTT TATATGATGG ATTAAGATTA    5520
CAGAAAGATG TGATAGTAAC CAATCAAGAA TCCAATGAAA ACACTGATCC CAGAACAAAA    5580
CGATTCTTTG GAGGGGTAAT TGGAACCATT GCTCTGGGAG TAGCAACCTC AGCACAAATT    5640
ACAGCGGCAG TTGCTCTGGT TGAAGCCAAG CAGGCAAGAT CAGACATCGA AAAACTCAAA    5700
GAAGCAATTA GGGACACAAA CAAAGCAGTG CAGTCAGTTC AGAGCTCCAT AGGAAATTTA    5760
ATAGTAGCAA TTAAATCAGT CCAGGATTAT GTTAACAAAG AAATCGTGCC ATCGATTGCG    5820
AGGCTAGGTT GTGAAGCAGC AGGACTTCAA TTAGGAATTG CATTAACACA GCATTACTCA    5880
GAATTAACAA ACATATTTGG TGATAACATA GGATCGTTAC AAGAAAAAGG AATAAAATTA    5940
CAAGGTATAG CATCATTATA CCGCACAAAT ATCACAGAAA TATTCACAAC ATCAACAGTT    6000
GATAAATATG ATATCTATGA TCTGTTATTT ACAGAATCAA TAAAGGTGAG AGTTATAGAT    6060
GTTGACTTGA ATGATTACTC AATCACCCTC CAAGTCAGAC TCCCTTTATT AACTAGGCTG    6120
CTGAACACTC AGATCTACAA AGTAGATTCC ATATCATATA ACATCCAAAA CAGAGAATGG    6180
TATATCCCTC TTCCCAGCCA TATCATGACG AAAGGGGCAT TTCTAGGTGG AGCAGACGTC    6240
AAAGAATGTA TAGAAGCATT CAGCAGCTAT ATATGCCCTT CTGATCCAGG ATTTGTATTA    6300
AACCATGAAA TAGAGAGCTG CTTATCAGGA AACATATCCC AATGTCCAAG AACAACGGTC    6360
ACATCAGACA TTGTTCCAAG ATATGCATTT GTCAATGGAG GAGTGGTTGC AAACTGTATA    6420
ACAACCACCT GTACATGCAA CGGAATTGGT AATAGAATCA ATCAACCACC TGATCAAGGA    6480
GTAAAAATTA TAACACATAA AGAATGTAGT ACAATAGGTA TCAACGGAAT GCTGTTCAAT    6540
ACAAATAAAG AAGGAACTCT TGCATTCTAT ACACCAAATG ATATAACACT AAACAATTCT    6600
GTTGCACTTG ATCCAATTGA CATATCAATC GAGCTCAACA AGGCCAAATC AGATCTAGAA    6660
GAATCAAAAG AATGGATAAG AAGGTCAAAT CAAAAACTAG ATTCTATTGG AAATTGGCAT    6720
CAATCTAGCA CTACAATCAT AATTATTTTG ATAATGATCA TTATATTGTT TATAATTAAT    6780
ATAACGATAA TTACAATTGC AATTAAGTAT TACAGAATTC AAAAGAGAAA TCGAGTGGAT    6840
CAAAATGACA AGCCATATGT ACTAACAAAC AAATAACATA TCTACAGATC ATTAGATATT    6900
AAAATTATAA AAAACTTAGG AGTAAAGTTA CGCAATCCAA CTCTACTCAT ATAATTGAGG    6960
AAGGACCCAA TAGACAAATC CAAATTCGAG ATGGAATACT GGAAGCATAC CAATCACGGA    7020
AAGGATGCTG GTAATGAGCT GGAGACGTCT ATGGCTACTC ATGGCAACAA GCTCACTAAT    7080
AAGATAATAT ACATATTATG GACAATAATC CTGGTGTTAT TATCAATAGT CTTCATCATA    7140
GTGCTAATTA ATTCCATCAA AAGTGAAAAG GCCCACGAAT CATTGCTGCA AGACATAAAT    7200
AATGAGTTTA TGGAAATTAC AGAAAAGATC CAAATGGCAT CGGATAATAC CAATGATCTA    7260
ATACAGTCAG GAGTGAATAC AAGGCTTCTT ACAATTCAGA GTCATGTCCA GAATTACATA    7320
CCAATATCAT TGACACAACA GATGTCAGAT CTTAGGAAAT TCATTAGTGA AATTACAATT    7380
AGAAATGATA ATCAAGAAGT GCTGCCACAA AGAATAACAC ATGATGTAGG TATAAAACCT    7440
TTAAATCCAG ATGATTTTTG GAGATGCACG TCTGGTCTTC CATCTTTAAT GAAAACTCCA    7500
AAAATAAGGT TAATGCCAGG GCCGGGATTA TTAGCTATGC CAACGACTGT TGATGGCTGT    7560
GTTAGAACTC CGTCTTTAGT TATAAATGAT CTGATTTATG CTTATACCTC AAATCTAATT    7620
ACTCGAGGTT GTCAGGATAT AGGAAAATCA TATCAAGTCT TACAGATAGG GATAATAACT    7680
GTAAACTCAG ACTTGGTACC TGACTTAAAT CCTAGGATCT CTCATACCTT TAACATAAAT    7740
GACAATAGGA AGTCATGTTC TCTAGCACTC CTAAATATAG ATGTATATCA ACTGTGTTCA    7800
ACTCCCAAAG TTGATGAAAG ATCAGATTAT GCATCATCAG GCATAGAAGA TATTGTACTT    7860
GATATTGTCA ATTATGATGG TTCAATCTCA ACAACAAGAT TTAAGAATAA TAACATAAGC    7920
TTTGATCAAC CATATGCTGC ACTATACCCA TCTGTTGGAC CAGGGATATA CTACAAAGGC    7980
AAAATAATAT TTCTCGGGTA TGGAGGTCTT GAACATCCAA TAAATGAGAA TGTAATCTGC    8040
AACACAACTG GGTGCCCCGG GAAAACACAG AGAGACTGTA ATCAAGCATC TCATAGTACT    8100
TGGTTTTCAG ATAGGAGGAT GGTCAACTCC ATCATTGTTG TTGACAAAGG CTTAAACTCA    8160
ATTCCAAAAT TGAAAGTATG GACGATATCT ATGCGACAAA ATTACTGGGG GTCAGAAGGA    8220
AGGTTACTTC TACTAGGTAA CAAGATCTAT ATATATACAA GATCTACAAG TTGGCATAGC    8280
AAGTTACAAT TAGGAATAAT TGATATTACT GATTACAGTG ATATAAGGAT AAAATGGACA    8340
TGGCATAATG TGCTATCAAG ACCAGGAAAC AATGAATGTC CATGGGGACA TTCATGTCCA    8400
GATGGATGTA TAACAGGAGT ATATACTGAT GCATATCCAC TCAATCCCAC AGGGAGCATT    8460
GTGTCATCTG TCATATTAGA CTCACAAAAA TCGAGAGTGA ACCCAGTCAT AACTTACTCA    8520
ACAGCAACCG AAAGAGTAAA CGAGCTGGCC ATCCTAAACA GAACACTCTC AGCTGGATAT    8580
ACAACAACAA GCTGCATTAC ACACTATAAC AAAGGATATT GTTTTCATAT AGTAGAAATA    8640
AATCATAAAA GCTTAAACAC ATTTCAACCC ATGTTGTTCA AAACAGAGAT TCCAAAAAGC    8700
TGCAGTTAAT CATAATTAAC CATAATATGC ATCAATCTAT CTATAATACA AGTATATGAT    8760
AAGTAATCAG CAATCAGACA ATAGACAAAA GGGAAATATA AAAAACTTAG GAGCAAAGCG    8820
TGCTCGGGAA ATGGACACTG AATCTAACAA TGGCACTGTA TCTGACATAC TCTATCCTGA    8880
GTGTCACCTT AACTCTCCTA TCGTTAAAGG TAAAATAGCA CAATTACACA CTATTATGAG    8940
TCTACCTCAG CCTTATGATA TGGATGACGA CTCAATACTA GTTATCACTA GACAGAAAAT    9000
AAAACTTAAT AAATTGGATA AAAGACAACG ATCTATTAGA AGATTAAAAT TAATATTAAC    9060
TGAAAAAGTG AATGACTTAG GAAAATACAC ATTTATCAGA TATCCAGAAA TGTCAAAAGA    9120
AATGTTCAAA TTATATATAC CTGGTATTAA CAGTAAAGTG ACTGAATTAT TACTTAAAGC    9180
AGATAGAACA TATAGTCAAA TGACTGATGG ATTAAGAGAT CTATGGATTA ATGTGCTATC    9240
AAAATTAGCC TCAAAAAATG ATGGAAGCAA TTATGATCTT AATGAAGAAA TTAATAATAT    9300
ATCGAAAGTT CACACAACCT ATAAATCAGA TAAATGGTAT AATCCATTCA AAACATGGTT    9360
TACTATCAAG TATGATATGA GAAGATTACA AAAAGCTCGA AATGAGATCA CTTTTAATGT    9420
TGGGAAGGAT TATAACTTGT TAGAAGACCA GAAGAATTTC TTATTGATAC ATCCAGAATT    9480
GGTTTTGATA TTAGATAAAC AAAACTATAA TGGTTATCTA ATTACTCCTG AATTAGTATT    9540
GATGTATTGT GACGTAGTCG AAGGCCGATG GAATATAAGT GCATGTGCTA AGTTAGATCC    9600
AAAATTACAA TCTATGTATC AGAAAGGTAA TAACCTGTGG GAAGTGATAG ATAAATTGTT    9660
TCCAATTATG GGAGAAAAGA CATTTGATGT GATATCGTTA TTAGAACCAC TTGCATTATC    9720
CTTAATTCAA ACTCATGATC CTGTTAAACA ACTAAGAGGA GCTTTTTTAA ATCATGTGTT    9780
ATCCGAGATG GAATTAATAT TTGAATCTAG AGAATCGATT AAGGAATTTC TGAGTGTAGA    9840
TTACATTGAT AAAATTTTAG ATATATTTAA TAAGTCTACA ATAGATGAAA TAGCAGAGAT    9900
TTTCTCTTTT TTTAGAACAT TTGGGCATCC TCCATTAGAA GCTAGTATTG CAGCAGAAAA    9960
GGTTAGAAAA TATATGTATA TTGGAAAACA ATTAAAATTT GACACTATTA ATAAATGTCA   10020
TGCTATCTTC TGTACAATAA TAATTAACGG ATATAGAGAG AGGCATGGTG GACAGTGGCC   10080
TCCTGTGACA TTACCTGATC ATGCACACGA ATTCATCATA AATGCTTACG GTTCAAACTC    10140
TGCGATATCA TATGAAAATG CTGTTGATTA TTACCAGAGC TTTATAGGAA TAAAATTCAA    10200
TAAATTCATA GAGCCTCAGT TAGATGAGGA TTTGACAATT TATATGAAAG ATAAAGCATT    10260
ATCTCCAAAA AAATCAAATT GGGACACAGT TTATCCTGCA TCTAATTTAC TGTACCGTAC    10320
TAACGCATCC AACGAATCAC GAAGATTAGT TGAAGTATTT ATAGCAGATA GTAAATTTGA    10380
TCCTCATCAG ATATTGGATT ATGTAGAATC TGGGGACTGG TTAGATGATC CAGAATTTAA    10440
TATTTCTTAT AGTCTTAAAG AAAAAGAGAT CAAACAGGAA GGTAGACTCT TTGCAAAAAT    10500
GACATACAAA ATGAGAGCTA CACAAGTTTT ATCAGAGACC CTACTTGCAA ATAACATAGG    10560
AAAATTCTTT CAAGAAAATG GGATGGTGAA GGGAGAGATT GAATTACTTA AGAGATTAAC    10620
AACCATATCA ATATCAGGAG TTCCACGGTA TAATGAAGTG TACAATAATT CTAAAAGCCA    10680
TACAGATGAC CTTAAAACCT ACAATAAAAT AAGTAATCTT AATTTGTCTT CTAATCAGAA    10740
ATCAAAGAAA TTTGAATTCA AGTCAACGGA TATCTACAAT GATGGATACG AGACTGTGAG    10800
CTGTTTCCTA ACAACAGATC TCAAAAAATA CTGTCTTAAT TGGAGATATG AATCAACAGC    10860
TCTATTTGGA GAAACTTGCA ACCAAATATT TGGATTAAAT AAATTGTTTA ATTGGTTACA    10920
CCCTCGTCTT GAAGGAAGTA CAATCTATGT AGGTGATCCT TACTGTCCTC CATCAGATAA    10980
AGAACATATA TCATTAGAGG ATCACCCTGA TTCTGGTTTT TACGTTCATA ACCCAAGAGG    11040
GGGTATAGAA GGATTTTGTC AAAAATTATG GACACTCATA TCTATAAGTG CAATACATCT    11100
AGCAGCTGTT AGAATAGGCG TGAGGGTGAC TGCAATGGTT CAAGGAGACA ATCAAGCTAT    11160
AGCTGTAACC ACAAGAGTAC CCAACAATTA TGACTACAGA GTTAAGAAGG AGATAGTTTA    11220
TAAAGATGTA GTGAGATTTT TTGATTCATT AAGAGAAGTG ATGGATGATC TAGGTCATGA    11280
ACTTAAATTA AATGAAACGA TTATAAGTAG CAAGATGTTC ATATATAGCA AAAGAATCTA    11340
TTATGATGGG AGAATTCTTC CTCAAGCTCT AAAAGCATTA TCTAGATGTG TCTTCTGGTC    11400
AGAGACAGTA ATAGACGAAA CAAGATCAGC ATCTTCAAAT TTGGCAACAT CATTTGCAAA    11460
AGCAATTGAG AATGGTTATT CACCTGTTCT AGGATATGCA TGCTCAATTT TTAAGAATAT    11520
TCAACAACTA TATATTGCCC TTGGGATGAA TATCAATCCA ACTATAACAC AGAATATCAG    11580
AGATCAGTAT TTTAGGAATC CAAATTGGAT GCAATATGCC TCTTTAATAC CTGCTAGTGT    11640
TGGGGGATTC AATTACATGG CCATGTCAAG ATGTTTTGTA AGGAATATTG GTGATCCATC    11700
AGTTGCCGCA TTGGCTGATA TTAAAAGATT TATTAAGGCG AATCTATTAG ACCGAAGTGT    11760
TCTTTATAGG ATTATGAATC AAGAACCAGG TGAGTCATCT TTTTTGGACT GGGCTTCAGA    11820
TCCATATTCA TGCAATTTAC CACAATCTCA AAATATAACC ACCATGATAA AAAATATAAC    11880
AGCAAGGAAT GTATTACAAG ATTCACCAAA TCCATTATTA TCTGGATTAT TCACAAATAC    11940
AATGATAGAA GAAGATGAAG AATTAGCTGA GTTCCTGATG GACAGGAAGG TAATTCTCCC    12000
TAGAGTTGCA CATGATATTC TAGATAATTC TCTCACAGGA ATTAGAAATG CCATAGCTGG    12060
AATGTTAGAT ACGACAAAAT CACTAATTCG GGTTGGCATA AATAGAGGAG GACTGACATA    12120
TAGTTTGTTG AGGAAAATCA GTAATTACGA TCTAGTACAA TATGAAACAC TAAGTAGGAC    12180
TTTGCGACTA ATTGTAAGTG ATAAAATCAA GTATGAAGAT ATGTGTTCGG TAGACCTTGC    12240
CATAGCATTG CGACAAAAGA TGTGGATTCA TTTATCAGGA GGAAGGATGA TAAGTGGACT    12300
TGAAACGCCT GACCCATTAG AATTACTATC TGGGGTAGTA ATAACAGGAT CAGAACATTG    12360
TAAAATATGT TATTCTTCAG ATGGCACAAA CCCATATACT TGGATGTATT TACCCGGTAA  12420
TATCAAAATA GGATCAGCAG AAACAGGTAT ATCGTCATTA AGAGTTCCTT ATTTTGGATC  12480
AGTCACTGAT GAAAGATCTG AAGCACAATT AGGATATATC AAGAATCTTA GTAAACCTGC  12540
AAAAGCCGCA ATAAGAATAG CAATGATATA TACATGGGCA TTTGGTAATG ATGAGATATC  12600
TTGGATGGAA GCCTCACAGA TAGCACAAAC ACGTGCAAAT TTTACACTAG ATAGTCTCAA  12660
AATTTTAACA CCGGTAGCTA CATCAACAAA TTTATCACAC AGATTAAAGG ATACTGCAAC  12720
TCAGATGAAA TTCTCCAGTA CATCATTGAT CAGAGTCAGC AGATTCATAA CAATGTCCAA  12780
TGATAACATG TCTATCAAAG AAGCTAATGA AACCAAAGAT ACTAATCTTA TTTATCAACA  12840
AATAATGTTA ACAGGATTAA GTGTTTTCGA ATATTTATTT AGATTAAAAG AAACCACAGG  12900
ACACAACCCT ATAGTTATGC ATCTGCACAT AGAAGATGAG TGTTGTATTA AAGAAAGTTT  12960
TAATGATGAA CATATTAATC CAGAGTCTAC ATTAGAATTA ATTCGATATC CTGAAAGTAA  13020
TGAATTTATT TATGATAAAG ACCCACTCAA AGATGTGGAC TTATCAAAAC TTATGGTTAT  13080
TAAAGACCAT TCTTACACAA TTGATATGAA TTATTGGGAT GATACTGACA TCATACATGC  13140
AATTTCAATA TGTACTGCAA TTACAATAGC AGATACTATG TCACAATTAG ATCGAGATAA  13200
TTTAAAAGAG ATAATAGTTA TTGCAAATGA TGATGATATT AATAGCTTAA TCACTGAATT  13260
TTTGACTCTT GACATACTTG TATTTCTCAA GACATTTGGT GGATTATTAG TAAATCAATT  13320
TGCATACACT CTTTATAGTC TAAAAATAGA AGGTAGGGAT CTCATTTGGG ATTATATAAT  13380
GAGAACACTG AGAGATACTT CCCATTCAAT ATTAAAAGTA TTATCTAATG CATTATCTCA  13440
TCCTAAAGTA TTCAAGAGGT TCTGGGATTG TGGAGTTTTA AACCCTATTT ATGGTCCTAA  13500
TACTGCTAGT CAAGACCAGA TAAAACTTGC CCTATCTATA TGTGAATATT CACTAGATCT  13560
ATTTATGAGA GAATGGTTGA ATGGTGTATC ACTTGAAATA TACATTTGTG ACAGCGATAT  13620
GGAAGTTGCA AATGATAGGA AACAAGCCTT TATTTCTAGA CACCTTTCAT TTGTTTGTTG  13680
TTTAGCAGAA ATTGCATCTT TCGGACCTAA CCTGTTAAAC TTAACATACT TGGAGAGACT  13740
TGATCTATTG AAACAATATC TTGAATTAAA TATTAAAGAA GACCCTACTC TTAAATATGT  13800
ACAAATATCT GGATTATTAA TTAAATCGTT CCCATCAACT GTAACATACG TAAGAAAGAC  13860
TGCAATCAAA TATCTAAGGA TTCGCGGTAT TAGTCCACCT GAGGTAATTG ATGATTGGGA  13920
TCCGGTAGAA GATGAAAATA TGCTGGATAA CATTGTCAAA ACTATAAATG ATAACTGTAA  13980
TAAAGATAAT AAAGGGAATA AAATTAACAA TTTCTGGGGA CTAGCACTTA AGAACTATCA  14040
AGTCCTTAAA ATCAGATCTA TAACAAGTGA TTCTGATGAT AATGATAGAC TAGATGCTAA  14100
TACAAGTGGT TTGACACTTC CTCAAGGAGG GAATTATCTA TCGCATCAAT TGAGATTATT  14160
CGGAATCAAC AGCACTAGTT GTCTGAAAGC TCTTGAGTTA TCACAAATTT TAATGAAGGA  14220
AGTCAATAAA GACAAGGACA GGCTCTTCCT GGGAGAAGGA GCAGGAGCTA TGCTAGCATG  14280
TTATGATGCC ACATTAGGAC CTGCAGTTAA TTATTATAAT TCAGGTTTGA ATATAACAGA  14340
TGTAATTGGT CAACGAGAAT TGAAAATATT TCCTTCAGAG GTATCATTAG TAGGTAAAAA  14400
ATTAGGAAAT GTGACACAGA TTCTTAACAG GGTAAAAGTA CTGTTCAATG GGAATCCTAA  14460
TTCAACATGG ATAGGAAATA TGGAATGTGA GAGCTTAATA TGGAGTGAAT TAAATGATAA  14520
GTCCATTGGA TTAGTACATT GTGATATGGA AGGAGCTATC GGTAAATCAG AAGAAACTGT  14580
TCTACATGAA CATTATAGTG TTATAAGAAT TACATACTTG ATTGGGGATG ATGATGTTGT  14640
TTTAGTTTCC AAAATTATAC CTACAATCAC TCCGAATTGG TCTAGAATAC TTTATCTATA  14700
TAAATTATAT TGGAAAGATG TAAGTATAAT ATCACTCAAA ACTTCTAATC CTGCATCAAC  14760
AGAATTATAT CTAATTTCGA AAGATGCATA TTGTACTATA ATGGAACCTA GTGAAATTGT  14820
TTTATCAAAA CTTAAAAGAT TGTCACTCTT GGAAGAAAAT AATCTATTAA AATGGATCAT  14880
TTTATCAAAG AAGAGGAATA ATGAATGGTT ACATCATGAA ATCAAAGAAG GAGAAAGAGA  14940
TTATGGAATC ATGAGACCAT ATCATATGGC ACTACAAATC TTTGGATTTC AAATCAATTT  15000
AAATCATCTG GCGAAAGAAT TTTTATCAAC CCCAGATCTG ACTAATATCA ACAATATAAT  15060
CCAAAGTTTT CAGCGAACAA TAAAGGATGT TTTATTTGAA TGGATTAATA TAACTCATGA  15120
TGATAAGAGA CATAAATTAG GCGGAAGATA TAACATATTC CCACTGAAAA ATAAGGGAAA  15180
GTTAAGACTG CTATCGAGAA GACTAGTATT AAGTTGGATT TCATTATCAT TATCGACTCG  15240
ATTACTTACA GGTCGCTTTC CTGATGAAAA ATTTGAACAT AGAGCACAGA CTGGATATGT  15300
ATCATTAGCT GATACTGATT TAGAATCATT AAAGTTATTG TCGAAAAACA TCATTAAGAA  15360
TTACAGAGAG TGTATAGGAT CAATATCATA TTGGTTTCTA ACCAAAGAAG TTAAAATACT  15420
TATGAAATTG ATCGGTGGTG CTAAATTATT AGGAATTCCC AGACAATATA AAGAACCCGA  15480
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AAACATGTAA TATATATATA CCAAACAGAG TTCTTCTCTT GTTTGGTTAT AGTGAGTCGT  15660
ATTACAATC         15669
(2)SEQ ID NO：2的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：31碱基对
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ACCTCAATCA TCCATAATTC AATATGCCTG GGCAGAAGGA AATAGAAGCG ATGATCAGAC    1500
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AAACAAGAGA CTCAACGACA AGAAGAAACA AAGCAGTCAA CCACCCACTA ATCCCACAAA    1620
CAGAACAAAC CAGGACGAAA TAGATGATCT GTTTAACGCA TTTGGAAGCA ACTAATCGAA    1680
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CATTCATGTC CAGATGGATG TATAACAGGA GTATATACTG ATGCATATCC ACTCAATCCC    8280
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TCAGCTGGAT ATACAACAAC AAGCTGCATT ACACACTATA ACAAAGGATA TTGTTTTCAT    8460
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ATTCCAAAAA GCTGCAGTTA ATCATAATTA ACCATAATAT GCATCAATCT ATCTATAATA     8580
CAAGTATATG ATAAGTAATC AGCAATCAGA CAATAGACAA AAGGGAAATA TAAAAAACTT     8640
AGGAGCAAAG CGTGCTCGGG AAATGGACAC TGAATCTAAC AATGGCACTG TATCTGACAT     8700
ACTCTATCCT GAGTGTCACC TTAACTCTCC TATCGTTAAA GGTAAAATAG CACAATTACA     8760
CACTATTATG AGTCTACCTC AGCCTTATGA TATGGATGAC GACTCAATAC TAGTTATCAC     8820
TAGACAGAAA ATAAAACTTA ATAAATTGGA TAAAAGACAA CGATCTATTA GAAGATTAAA     8880
ATTAATATTA ACTGAAAAAG TGAATGACTT AGGAAAATAC ACATTTATCA GATATCCAGA     8940
AATGTCAAAA GAAATGTTCA AATTATATAT ACCTGGTATT AACAGTAAAG TGACTGAATT     9000
ATTACTTAAA GCAGATAGAA CATATAGTCA AATGACTGAT GGATTAAGAG ATCTATGGAT     9060
TAATGTGCTA TCAAAATTAG CCTCAAAAAA TGATGGAAGC AATTATGATC TTAATGAAGA     9120
AATTAATAAT ATATCGAAAG TTCACACAAC CTATAAATCA GATAAATGGT ATAATCCATT     9180
CAAAACATGG TTTACTATCA AGTATGATAT GAGAAGATTA CAAAAAGCTC GAAATGAGAT     9240
CACTTTTAAT GTTGGGAAGG ATTATAACTT GTTAGAAGAC CAGAAGAATT TCTTATTGAT     9300
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TGAATTAGTA TTGATGTATT GTGACGTAGT CGAAGGCCGA TGGAATATAA GTGCATGTGC     9420
TAAGTTAGAT CCAAAATTAC AATCTATGTA TCAGAAAGGT AATAACCTGT GGGAAGTGAT     9480
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ACTTGCATTA TCCTTAATTC AAACTCATGA TCCTGTTAAA CAACTAAGAG GAGCTTTTTT     9600
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TCCAGAATTT AATATTTCTT ATAGTCTTAA AGAAAAAGAG ATCAAACAGG AAGGTAGACT    10320
CTTTGCAAAA ATGACATACA AAATGAGAGC TACACAAGTT TTATCAGAGA CCCTACTTGC    10380
AAATAACATA GGAAAATTCT TTCAAGAAAA TGGGATGGTG AAGGGAGAGA TTGAATTACT    10440
TAAGAGATTA ACAACCATAT CAATATCAGG AGTTCCACGG TATAATGAAG TGTACAATAA    10500
TTCTAAAAGC CATACAGATG ACCTTAAAAC CTACAATAAA ATAAGTAATC TTAATTTGTC    10560
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TGAATCAACA GCTCTATTTG GAGAAACTTG CAACCAAATA TTTGGATTAA ATAAATTGTT    10740
TAATTGGTTA CACCCTCGTC TTGAAGGAAG TACAATCTAT GTAGGTGATC CTTACTGTCC    10800
TCCATCAGAT AAAGAACATA TATCATTAGA GGATCACCCT GATTCTGGTT TTTACGTTCA    10860
TAACCCAAGA GGGGGTATAG AAGGATTTTG TCAAAAATTA TGGACACTCA TATCTATAAG    10920
TGCAATACAT CTAGCAGCTG TTAGAATAGG CGTGAGGGTG ACTGCAATGG TTCAAGGAGA    10980
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ACCTGCTAGT GTTGGGGGAT TCAATTACAT GGCCATGTCA AGATGTTTTG TAAGGAATAT    11520
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AGACCGAAGT GTTCTTTATA GGATTATGAA TCAAGAACCA GGTGAGTCAT CTTTTTTGGA    11640
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GGTAGACCTT GCCATAGCAT TGCGACAAAA GATGTGGATT CATTTATCAG GAGGAAGGAT    12120
GATAAGTGGA CTTGAAACGC CTGACCCATT AGAATTACTA TCTGGGGTAG TAATAACAGG    12180
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TTTACCCGGT AATATCAAAA TAGGATCAGC AGAAACAGGT ATATCGTCAT TAAGAGTTCC    12300
TTATTTTGGA TCAGTCACTG ATGAAAGATC TGAAGCACAA TTAGGATATA TCAAGAATCT    12360
TAGTAAACCT GCAAAAGCCG CAATAAGAAT AGCAATGATA TATACATGGG CATTTGGTAA    12420
TGATGAGATA TCTTGGATGG AAGCCTCACA GATAGCACAA ACACGTGCAA ATTTTACACT    12480
AGATAGTCTC AAAATTTTAA CACCGGTAGC TACATCAACA AATTTATCAC ACAGATTAAA    12540
GGATACTGCA ACTCAGATGA AATTCTCCAG TACATCATTG ATCAGAGTCA GCAGATTCAT    12600
AACAATGTCC AATGATAACA TGTCTATCAA AGAAGCTAAT GAAACCAAAG ATACTAATCT    12660
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AGAAACCACA GGACACAACC CTATAGTTAT GCATCTGCAC ATAGAAGATG AGTGTTGTAT    12780
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GGATTATATA ATGAGAACAC TGAGAGATAC TTCCCATTCA ATATTAAAAG TATTATCTAA    13260
TGCATTATCT CATCCTAAAG TATTCAAGAG GTTCTGGGAT TGTGGAGTTT TAAACCCTAT    13320
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ATTGAGATTA TTCGGAATCA ACAGCACTAG TTGTCTGAAA GCTCTTGAGT TATCACAAAT    14040
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TGGGAATCCT AATTCAACAT GGATAGGAAA TATGGAATGT GAGAGCTTAA TATGGAGTGA    14340
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TATAACTCAT GATGATAAGA GACATAAATT AGGCGGAAGA TATAACATAT TCCCACTGAA    15000
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AGTTAAAATA CTTATGAAAT TGATCGGTGG TGCTAAATTA TTAGGAATTC CCAGACAATA    15300
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TTAAAACATA AATACAATGA AGATATATCC TAACCTTTAT CTTTAAGCCT AGGAATAGAC  15420
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  (i)序列特征：
    (A)长度：15666碱基对
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ACTGAGCAAG CTACAGAATC TGACAATATC AAGACCGAAC AACAAAACAT CAGAGACAGA    1560
CTAAACAAGA GACTCAACGA CAAGAAGAAA CAAAGCAGTC AACCACCCAC TAATCCCACA    1620
AACAGAACAA ACCAGGACGA AATAGATGAT CTGTTTAACG CATTTGGAAG CAACTAATCG    1680
AATCAACATT TTAATCTAAA TCAATAATAA ATAAGAAAAA CTTAGGATTA AAGAATCCTA    1740
TCATACCGGA ATATAGGGTG GTAAATTTAG AGTCTGCTTG AAACTCAATC AATAGAGAGT    1800
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CCCAAGAAGA CTTATCGGAA AACGACACAA TCAACACAAG AACCCAGCAA CTCAGTGCCA    1980
CCATCTGTCA ACCAGAAATC AAACCAACAG AAACAAGTGA GAAAGATAGT GGATCAACTG    2040
ACAAAAATAG ACAGTCTGGG TCATCACACG AATGTACAAC AGAAGCAAAA GATAGAAATA    2100
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AGACTGTGGT CTCTGGAGGA ATCCCCAGAA GCATCACAGA TTCTAAAAAT GGAACCCAAA    2220
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AAATGCGACA ATCTGCAAAT GTTCCAAGCG AGATATCAGG AAGTGATGAC ATATTTACAA    2340
CAGAACAAAG TAGAAACAGT GATCATGGAA GAAGCCTGGA ATCTATCAGT ACACCTGATA    2400
CAAGATCAAT AAGTGTTGTT ACTGCTGCAA CACCAGATGA TGAAGAAGAA ATACTAATGA    2460
AAAATAGTAG GACAAAGAAA AGTTCTTCAA CACATCAAGA AGATGACAAA AGAATTAAAA    2520
AAGGGGGAAA AGGGAAAGAC TGGTTTAAGA AATCAAAAGA TACCGACAAC CAGATACCAA    2580
CATCAGACTA CAGATCCACA TCAAAAGGGC AGAAGAAAAT CTCAAAGACA ACAACCACCA    2640
ACACCGACAC AAAGGGGCAA ACAGAAATAC AGACAGAATC ATCAGAAACA CAATCCTCAT    2700
CATGGAATCT CATCATCGAC AACAACACCG ACCGGAACGA ACAGACAAGC ACAACTCCTC    2760
CAACAACAAC TTCCAGATCA ACTTATACAA AAGAATCGAT CCGAACAAAC TCTGAATCCA    2820
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TAGATTTATA TCAAGACAAA CGAGTTGTAT GTGTAGCAAA TGTACTAAAC AATGTAGATA    3000
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CAGGAGATAC ACTAGAGAAC GATGTACAAG TTAAATCAGA GATATTAAGT TCATACAATG    3420
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AACGTTGCAA AAATGATGAA GAAGTATCTG AATTAATGGA CATGTTCAAT GAAGATGTCA    3600
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CCATTACCAC TCAAAGTCAA TGAACAGAGG AAAGCAGTAC CCCACATTAG AGTTGCCAAG    3900
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GAATGCTGTT CAATACAAAT AAAGAAGGAA CTCTTGCATT CTATACACCA AATGATATAA    6420
CACTAAACAA TTCTGTTGCA CTTGATCCAA TTGACATATC AATCGAGCTC AACAAGGCCA    6480
AATCAGATCT AGAAGAATCA AAAGAATGGA TAAGAAGGTC AAATCAAAAA CTAGATTCTA    6540
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ATACCAATGA TCTAATACAG TCAGGAGTGA ATACAAGGCT TCTTACAATT CAGAGTCATG    7140
TCCAGAATTA CATACCAATA TCATTGACAC AACAGATGTC AGATCTTAGG AAATTCATTA    7200
GTGAAATTAC AATTAGAAAT GATAATCAAG AAGTGCTGCC ACAAAGAATA ACACATGATG    7260
TAGGTATAAA ACCTTTAAAT CCAGATGATT TTTGGAGATG CACGTCTGGT CTTCCATCTT    7320
TAATGAAAAC TCCAAAAATA AGGTTAATGC CAGGGCCGGG ATTATTAGCT ATGCCAACGA    7380
CTGTTGATGG CTGTGTTAGA ACTCCGTCTT TAGTTATAAA TGATCTGATT TATGCTTATA    7440
CCTCAAATCT AATTACTCGA GGTTGTCAGG ATATAGGAAA ATCATATCAA GTCTTACAGA    7500
TAGGGATAAT AACTGTAAAC TCAGACTTGG TACCTGACTT AAATCCTAGG ATCTCTCATA    7560
CCTTTAACAT AAATGACAAT AGGAAGTCAT GTTCTCTAGC ACTCCTAAAT ATAGATGTAT    7620
ATCAACTGTG TTCAACTCCC AAAGTTGATG AAAGATCAGA TTATGCATCA TCAGGCATAG    7680
AAGATATTGT ACTTGATATT GTCAATTATG ATGGTTCAAT CTCAACAACA AGATTTAAGA    7740
ATAATAACAT AAGCTTTGAT CAACCATATG CTGCACTATA CCCATCTGTT GGACCAGGGA    7800
TATACTACAA AGGCAAAATA ATATTTCTCG GGTATGGAGG TCTTGAACAT CCAATAAATG    7860
AGAATGTAAT CTGCAACACA ACTGGGTGCC CCGGGAAAAC ACAGAGAGAC TGTAATCAAG    7920
CATCTCATAG TACTTGGTTT TCAGATAGGA GGATGGTCAA CTCCATCATT GTTGTTGACA    7980
AAGGCTTAAA CTCAATTCCA AAATTGAAAG TATGGACGAT ATCTATGCGA CAAAATTACT    8040
GGGGGTCAGA AGGAAGGTTA CTTCTACTAG GTAACAAGAT CTATATATAT ACAAGATCTA     8100
CAAGTTGGCA TAGCAAGTTA CAATTAGGAA TAATTGATAT TACTGATTAC AGTGATATAA     8160
GGATAAAATG GACATGGCAT AATGTGCTAT CAAGACCAGG AAACAATGAA TGTCCATGGG     8220
GACATTCATG TCCAGATGGA TGTATAACAG GAGTATATAC TGATGCATAT CCACTCAATC     8280
CCACAGGGAG CATTGTGTCA TCTGTCATAT TAGACTCACA AAAATCGAGA GTGAACCCAG     8340
TCATAACTTA CTCAACAGCA ACCGAAAGAG TAAACGAGCT GGCCATCCTA AACAGAACAC     8400
TCTCAGCTGG ATATACAACA ACAAGCTGCA TTACACACTA TAACAAAGGA TATTGTTTTC     8460
ATATAGTAGA AATAAATCAT AAAAGCTTAA ACACATTTCA ACCCATGTTG TTCAAAACAG     8520
AGATTCCAAA AAGCTGCAGT TAATCATAAT TAACCATAAT ATGCATCAAT CTATCTATAA     8580
TACAAGTATA TGATAAGTAA TCAGCAATCA GACAATAGAC AAAAGGGAAA TATAAAAAAC     8640
TTAGGAGCAA AGCGTGCTCG GGAAATGGAC ACTGAATCTA ACAATGGCAC TGTATCTGAC     8700
ATACTCTATC CTGAGTGTCA CCTTAACTCT CCTATCGTTA AAGGTAAAAT AGCACAATTA     8760
CACACTATTA TGAGTCTACC TCAGCCTTAT GATATGGATG ACGACTCAAT ACTAGTTATC     8820
ACTAGACAGA AAATAAAACT TAATAAATTG GATAAAAGAC AACGATCTAT TAGAAGATTA     8880
AAATTAATAT TAACTGAAAA AGTGAATGAC TTAGGAAAAT ACACATTTAT CAGATATCCA     8940
GAAATGTCAA AAGAAATGTT CAAATTATAT ATACCTGGTA TTAACAGTAA AGTGACTGAA     9000
TTATTACTTA AAGCAGATAG AACATATAGT CAAATGACTG ATGGATTAAG AGATCTATGG     9060
ATTAATGTGC TATCAAAATT AGCCTCAAAA AATGATGGAA GCAATTATGA TCTTAATGAA     9120
GAAATTAATA ATATATCGAA AGTTCACACA ACCTATAAAT CAGATAAATG GTATAATCCA     9180
TTCAAAACAT GGTTTACTAT CAAGTATGAT ATGAGAAGAT TACAAAAAGC TCGAAATGAG     9240
ATCACTTTTA ATGTTGGGAA GGATTATAAC TTGTTAGAAG ACCAGAAGAA TTTCTTATTG     9300
ATACATCCAG AATTGGTTTT GATATTAGAT AAACAAAACT ATAATGGTTA TCTAATTACT     9360
CCTGAATTAG TATTGATGTA TTGTGACGTA GTCGAAGGCC GATGGAATAT AAGTGCATGT     9420
GCTAAGTTAG ATCCAAAATT ACAATCTATG TATCAGAAAG GTAATAACCT GTGGGAAGTG     9480
ATAGATAAAT TGTTTCCAAT TATGGGAGAA AAGACATTTG ATGTGATATC GTTATTAGAA     9540
CCACTTGCAT TATCCTTAAT TCAAACTCAT GATCCTGTTA AACAACTAAG AGGAGCTTTT     9600
TTAAATCATG TGTTATCCGA GATGGAATTA ATATTTGAAT CTAGAGAATC GATTAAGGAA     9660
TTTCTGAGTG TAGATTACAT TGATAAAATT TTAGATATAT TTAATAAGTC TACAATAGAT     9720
GAAATAGCAG AGATTTTCTC TTTTTTTAGA ACATTTGGGC ATCCTCCATT AGAAGCTAGT     9780
ATTGCAGCAG AAAAGGTTAG AAAATATATG TATATTGGAA AACAATTAAA ATTTGACACT     9840
ATTAATAAAT GTCATGCTAT CTTCTGTACA ATAATAATTA ACGGATATAG AGAGAGGCAT     9900
GGTGGACAGT GGCCTCCTGT GACATTACCT GATCATGCAC ACGAATTCAT CATAAATGCT     9960
TACGGTTCAA ACTCTGCGAT ATCATATGAA AATGCTGTTG ATTATTACCA GAGCTTTATA    10020
GGAATAAAAT TCAATAAATT CATAGAGCCT CAGTTAGATG AGGATTTGAC AATTTATATG    10080
AAAGATAAAG CATTATCTCC AAAAAAATCA AATTGGGACA CAGTTTATCC TGCATCTAAT    10140
TTACTGTACC GTACTAACGC ATCCAACGAA TCACGAAGAT TAGTTGAAGT ATTTATAGCA    10200
GATAGTAAAT TTGATCCTCA TCAGATATTG GATTATGTAG AATCTGGGGA CTGGTTAGAT    10260
GATCCAGAAT TTAATATTTC TTATAGTCTT AAAGAAAAAG AGATCAAACA GGAAGGTAGA    10320
CTCTTTGCAA AAATGACATA CAAAATGAGA GCTACACAAG TTTTATCAGA GACCCTACTT    10380
GCAAATAACA TAGGAAAATT CTTTCAAGAA AATGGGATGG TGAAGGGAGA GATTGAATTA    10440
CTTAAGAGAT TAACAACCAT ATCAATATCA GGAGTTCCAC GGTATAATGA AGTGTACAAT    10500
AATTCTAAAA CCCATACAGA TGACCTTAAA ACCTACAATA AAATAAGTAA TCTTAATTTG    10560
TCTTCTAATC AGAAATCAAA GAAATTTGAA TTCAAGTCAA CGGATATCTA CAATGATGGA    10620
TACGAGACTG TGAGCTGTTT CCTAACAACA GATCTCAAAA AATACTGTCT TAATTGGAGA    10680
TATGAATCAA CAGCTCTATT TGGAGAAACT TGCAACCAAA TATTTGGATT AAATAAATTG    10740
TTTAATTGGT TACACCCTCG TCTTGAAGGA AGTACAATCT ATGTAGGTGA TCCTTACTGT    10800
CCTCCATCAG ATAAAGAACA TATATCATTA GAGGATCACC CTGATTCTGG TTTTTACGTT    10860
CATAACCCAA GAGGGGGTAT AGAAGGATTT TGTCAAAAAT TATGGACACT CATATCTATA    10920
AGTGCAATAC ATCTAGCAGC TGTTAGAATA GGCGTGAGGG TGACTGCAAT GGTTCAAGGA    10980
GACAATCAAG CTATAGCTGT AACCACAAGA GTACCCAACA ATTATGACTA CAGAGTTAAG    11040
AAGGAGATAG TTTATAAAGA TGTAGTGAGA TTTTTTGATT CATTAAGAGA AGTGATGGAT    11100
GATCTAGGTC ATGAACTTAA ATTAAATGAA ACGATTATAA GTAGCAAGAT GTTCATATAT    11160
AGCAAAAGAA TCTATTATGA TGGGAGAATT CTTCCTCAAG CTCTAAAAGC ATTATCTAGA    11220
TGTGTCTTCT GGTCAGAGAC AGTAATAGAC GAAACAAGAT CAGCATCTTC AAATTTGGCA    11280
ACATCATTTG CAAAAGCAAT TGAGAATGGT TATTCACCTG TTCTAGGATA TGCATGCTCA    11340
ATTTTTAAGA ATATTCAACA ACTATATATT GCCCTTGGGA TGAATATCAA TCCAACTATA    11400
ACACAGAATA TCAGAGATCA GTATTTTAGG AATCCAAATT GGATGCAATA TGCCTCTTTA    11460
ATACCTGCTA GTGTTGGGGG ATTCAATTAC ATGGCCATGT CAAGATGTTT TGTAAGGAAT    11520
ATTGGTGATC CATCAGTTGC CGCATTGGCT GATATTAAAA GATTTATTAA GGCGAATCTA    11580
TTAGACCGAA GTGTTCTTTA TAGGATTATG AATCAAGAAC CAGGTGAGTC ATCTTTTTTG    11640
GACTGGGCTT CAGATCCATA TTCATGCAAT TTACCACAAT CTCAAAATAT AACCACCATG    11700
ATAAAAAATA TAACAGCAAG GAATGTATTA CAAGATTCAC CAAATCCATT ATTATCTGGA    11760
TTATTCACAA ATACAATGAT AGAAGAAGAT GAAGAATTAG CTGAGTTCCT GATGGACAGG    11820
AAGGTAATTC TCCCTAGAGT TGCACATGAT ATTCTAGATA ATTCTCTCAC AGGAATTAGA    11880
AATGCCATAG CTGGAATGTT AGATACGACA AAATCACTAA TTCGGGTTGG CATAAATAGA    11940
GGAGGACTGA CATATAGTTT GTTGAGGAAA ATCAGTAATT ACGATCTAGT ACAATATGAA    12000
ACACTAAGTA GGACTTTGCG ACTAATTGTA AGTGATAAAA TCAAGTATGA AGATATGTGT    12060
TCGGTAGACC TTGCCATAGC ATTGCGACAA AAGATGTGGA TTCATTTATC AGGAGGAAGG    12120
ATGATAAGTG GACTTGAAAC GCCTGACCCA TTAGAATTAC TATCTGGGGT AGTAATAACA    12180
GGATCAGAAC ATTGTAAAAT ATGTTATTCT TCAGATGGCA CAAACCCATA TACTTGGATG    12240
TATTTACCCG GTAATATCAA AATAGGATCA GCAGAAACAG GTATATCGTC ATTAAGAGTT    12300
CCTTATTTTG GATCAGTCAC TGATGAAAGA TCTGAAGCAC AATTAGGATA TATCAAGAAT    12360
CTTAGTAAAC CTGCAAAAGC CGCAATAAGA ATAGCAATGA TATATACATG GGCATTTGGT    12420
AATGATGAGA TATCTTGGAT GGAAGCCTCA CAGATAGCAC AAACACGTGC AAATTTTACA    12480
CTAGATAGTC TCAAAATTTT AACACCGGTA GCTACATCAA CAAATTTATC ACACAGATTA    12540
AAGGATACTG CAACTCAGAT GAAATTCTCC AGTACATCAT TGATCAGAGT CAGCAGATTC    12600
ATAACAATGT CCAATGATAA CATGTCTATC AAAGAAGCTA ATGAAACCAA AGATACTAAT    12660
CTTATTTATC AACAAATAAT GTTAACAGGA TTAAGTGTTT TCGAATATTT ATTTAGATTA    12720
AAAGAAACCA CAGGACACAA CCCTATAGTT ATGCATCTGC ACATAGAAGA TGAGTGTTGT    12780
ATTAAAGAAA GTTTTAATGA TGAACATATT AATCCAGAGT CTACATTAGA ATTAATTCGA    12840
TATCCTGAAA GTAATGAATT TATTTATGAT AAAGACCCAC TCAAAGATGT GGACTTATCA    12900
AAACTTATGG TTATTAAAGA CCATTCTTAC ACAATTGATA TGAATTATTG GGATGATACT    12960
GACATCATAC ATGCAATTTC AATATGTACT GCAATTACAA TAGCAGATAC TATGTCACAA    13020
TTAGATCGAG ATAATTTAAA AGAGATAATA GTTATTGCAA ATGATGATGA TATTAATAGC    13080
TTAATCACTG AATTTTTGAC TCTTGACATA CTTGTATTTC TCAAGACATT TGGTGGATTA    13140
TTAGTAAATC AATTTGCATA CACTCTTTAT AGTCTAAAAA TAGAAGGTAG GGATCTCATT    13200
TGGGATTATA TAATGAGAAC ACTGAGAGAT ACTTCCCATT CAATATTAAA AGTATTATCT    13260
AATGCATTAT CTCATCCTAA AGTATTCAAG AGGTTCTGGG ATTGTGGAGT TTTAAACCCT    13320
ATTTATGGTC CTAATACTGC TAGTCAAGAC CAGATAAAAC TTGCCCTATC TATATGTGAA    13380
TATTCACTAG ATCTATTTAT GAGAGAATGG TTGAATGGTG TATCACTTGA AATATACATT    13440
TGTGACAGCG ATATGGAAGT TGCAAATGAT AGGAAACAAG CCTTTATTTC TAGACACCTT    13500
TCATTTGTTT GTTGTTTAGC AGAAATTGCA TCTTTCGGAC CTAACCTGTT AAACTTAACA    13560
TACTTGGAGA GACTTGATCT ATTGAAACAA TATCTTGAAT TAAATATTAA AGAAGACCCT    13620
ACTCTTAAAT ATGTACAAAT ATCTGGATTA TTAATTAAAT CGTTCCCATC AACTGTAACA    13680
TACGTAAGAA AGACTGCAAT CAAATATCTA AGGATTCGCG GTATTAGTCC ACCTGAGGTA    13740
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AATGATAACT GTAATAAAGA TAATAAAGGG AATAAAATTA ACAATTTCTG GGGACTAGCA    13860
CTTAAGAACT ATCAAGTCCT TAAAATCAGA TCTATAACAA GTGATTCTGA TGATAATGAT    13920
AGACTAGATG CTAATACAAG TGGTTTGACA CTTCCTCAAG GAGGGAATTA TCTATCGCAT    13980
CAATTGAGAT TATTCGGAAT CAACAGCACT AGTTGTCTGA AAGCTCTTGA GTTATCACAA    14040
ATTTTAATGA AGGAAGTCAA TAAAGACAAG GACAGGCTCT TCCTGGGAGA AGGAGCAGGA    14100
GCTATGCTAG CATGTTATGA TGCCACATTA GGACCTGCAG TTAATTATTA TAATTCAGGT    14160
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TTAGTAGGTA AAAAATTAGG AAATGTGACA CAGATTCTTA ACAGGGTAAA AGTACTGTTC    14280
AATGGGAATC CTAATTCAAC ATGGATAGGA AATATGGAAT GTGAGAGCTT AATATGGAGT    14340
GAATTAAATG ATAAGTCCAT TGGATTAGTA CATTGTGATA TGGAAGGAGC TATCGGTAAA    14400
TCAGAAGAAA CTGTTCTACA TGAACATTAT AGTGTTATAA GAATTACATA CTTGATTGGG    14460
GATGATGATG TTGTTTTAGT TTCCAAAATT ATACCTACAA TCACTCCGAA TTGGTCTAGA    14520
ATACTTTATC TATATAAATT ATATTGGAAA GATGTAAGTA TAATATCACT CAAAACTTCT    14580
AATCCTGCAT CAACAGAATT ATATCTAATT TCGAAAGATG CATATTGTAC TATAATGGAA    14640
CCTAGTGAAA TTGTTTTATC AAAACTTAAA AGATTGTCAC TCTTGGAAGA AAATAATCTA    14700
TTAAAATGGA TCATTTTATC AAAGAAGAGG AATAATGAAT GGTTACATCA TGAAATCAAA    14760
GAAGGAGAAA GAGATTATGG AATCATGAGA CCATATCATA TGGCACTACA AATCTTTGGA    14820
TTTCAAATCA ATTTAAATCA TCTGGCGAAA GAATTTTTAT CAACCCCAGA TCTGACTAAT    14880
ATCAACAATA TAATCCAAAG TTTTCAGCGA ACAATAAAGG ATGTTTTATT TGAATGGATT  14940
AATATAACTC ATGATGATAA GAGACATAAA TTAGGCGGAA GATATAACAT ATTCCCACTG  15000
AAAAATAAGG GAAAGTTAAG ACTGCTATCG AGAAGACTAG TATTAAGTTG GATTTCATTA  15060
TCATTATCGA CTCGATTACT TACAGGTCGC TTTCCTGATG AAAAATTTGA ACATAGAGCA  15120
CAGACTGGAT ATGTATCATT AGCTGATACT GATTTAGAAT CATTAAAGTT ATTGTCGAAA  15180
AACATCATTA AGAATTACAG AGAGTGTATA GGATCAATAT CATATTGGTT TCTAACCAAA  15240
GAAGTTAAAA TACTTATGAA ATTGATCGGT GGTGCTAAAT TATTAGGAAT TCCCAGACAA  15300
TATAAAGAAC CCGAAGACCA GTTATTAGAA AACTACAATC AACATGATGA ATTTGATATC  15360
GATTAAAACA TAAATACAAT GAAGATATAT CCTAACCTTT ATCTTTAAGC CTAGGAATAG  15420
ACAAAAAGTA AGAAAAACAT GTAATATATA TATACCAAAC AGAGTTCTTC TCTTGTTTGG  15480
TGGGTCGGCA TGGCATCTCC ACCTCCTCGC GGTCCGGACC TGGGCATCCG AAGGAGGACG  15540
CACGTCCACT CGGATGGCTA AGGGAGAGCC TGCAGTAGCA TAACCCCTTG GGGCCTCTAA  15600
ACGGGTCTTG AGGGGTTTTT TGCTGAAAGG AGGAACTATA TACGCGTCGA CGGGCCCCGC  15660
GCTCAC            15666
(2)SEQ ID NO：16的信息：
  (i)序列特征：
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(2)SEQ ID NO：17的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：70碱基对
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    (C)链型：单链
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  (i)序列特征：
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(2)SEQ ID NO：19的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：16碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
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(2)SEQ ID NO：20的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：6843碱基对
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    (C)链型：单链
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  (ii)分子类型：cDNA
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ATGTTGAGCC TATTTGATAC ATTTAATGCA CGTAGGCAAG AAAACATAAC AAAATCAGCC      60
GGTGGAGCTA TCATTCCTGG ACAGAAAAAT ACTGTCTCTA TATTCGCCCT TGGACCGACA     120
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GCCAATCCAG AGCTCTACCT AACAACAAAT GGAAGTAATG CAGATGTCAA GTATGTCATA     300
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AGAGATGCAG GTCTCGCTTC ATTCTTCAAT ACAATCAGAT ATGGAATTGA GACCAGAATG     840
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TTCCAGCTAG GACAAGCAGT AGCACGTGAT GCCGAAGCTC AAATGAGCTC AACACTGGAA    1140
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GCTACAGAAT CTGACAATAT CAAGACCGAA CAACAAAACA TCAGAGACAG ACTAAACAAG    1440
AGACTCAACG ACAAGAAGAA ACAAAGCAGT CAACCACCCA CTAATCCCAC AAACAGAACA    1500
AACCAGGACG AAATAGATGA TCTGTTTAAC GCATTTGGAA GCAACTAAGT CGACGATCCG    1560
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GCATAACCCC TTGGGGCCTC TAAACGGGTC TTGAGGGGTT TTTTGCTGAA AGGAGGAACT    1680
ATATCCGGAT CGAGATCAAT TCTGTGAGCG TATGGCAAAC GAAGGAAAAA TAGTTATAGT    1740
AGCCGCACTC GATGGGACAT TTCAACGTAA ACCGTTTAAT AATATTTTGA ATCTTATTCC    1800
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CTAAAAATAA ACATTGATTA AATTTTAATA TAATACTTAA AAATGGATGT TGTGTCGTTA    2040
GATAAACCGT TTATGTATTT TGAGGAAATT GATAATGAGT TAGATTACGA ACCAGAAAGT    2100
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TTATTTTTTC TTAGTAAGTT ACAGCGACAC GGTATATTAG ATGGTGCCAC CGTAGTGTAT    2220
ATAGGATCTG CTCCCGGTAC ACATATACGT TATTTGAGAG ATCATTTCTA TAATTTAGGA    2280
GTGATCATCA AATGGATGCT AATTGACGGC CGCCATCATG ATCCTATTTT AAATGGATTG    2340
CGTGATGTGA CTCTAGTGAC TCGGTTCGTT GATGAGGAAT ATCTACGATC CATCAAAAAA    2400
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TTAAACCCCG TGGCGTCTAG TCTTAAATGG AGATGCCCGT TTCCAGATCA ATGGATCAAG    2580
GACTTTTATA TCCCACACGG TAATAAAATG TTACAACCTT TTGCTCCTTC ATATTCAGGG    2640
CCGTCGTTTT ACAACGTCGT GACTGGGAAA ACCCTGGCGT TACCCAACTT AATCGCCTTG    2700
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CCCAACAGTT GCGCAGCCTG AATGGCGAAT GGCGCGACGC GCCCTGTAGC GGCGCATTAA    2820
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GCCCTTTGAC GTTGGAGTCC ACGTTCTTTA ATAGTGGACT CTTGTTCCAA ACTGGAACAA    3120
CACTCAACCC TATCTCGGTC TATTCTTTTG ATTTATAAGG GATTTTGCCG ATTTCGGCCT    3180
ATTGGTTAAA AAATGAGCTG ATTTAACAAA AATTTAACGC GAATTTTAAC AAAATATTAA    3240
CGTTTACAAT TTCCCAGGTG GCACTTTTCG GGGAAATGTG CGCGGAACCC CTATTTGTTT    3300
ATTTTTCTAA ATACATTCAA ATATGTATCC GCTCATGAGA CAATAACCCT GATAAATGCT    3360
TCAATAATAT TGAAAAAGGA AGAGTATGAG TATTCAACAT TTCCGTGTCG CCCTTATTCC    3420
CTTTTTTGCG GCATTTTGCC TTCCTGTTTT TGCTCACCCA GAAACGCTGG TGAAAGTAAA    3480
AGATGCTGAA GATCAGTTGG GTGCACGAGT GGGTTACATC GAACTGGATC TCAACAGCGG    3540
TAAGATCCTT GAGAGTTTTC GCCCCGAAGA ACGTTTTCCA ATGATGAGCA CTTTTAAAGT    3600
TCTGCTATGT GGCGCGGTAT TATCCCGTAT TGACGCCGGG CAAGAGCAAC TCGGTCGCCG    3660
CATACACTAT TCTCAGAATG ACTTGGTTGA GTACTCACCA GTCACAGAAA AGCATCTTAC    3720
GGATGGCATG ACAGTAAGAG AATTATGCAG TGCTGCCATA ACCATGAGTG ATAACACTGC    3780
GGCCAACTTA CTTCTGACAA CGATCGGAGG ACCGAAGGAG CTAACCGCTT TTTTGCACAA    3840
CATGGGGGAT CATGTAACTC GCCTTGATCG TTGGGAACCG GAGCTGAATG AAGCCATACC    3900
AAACGACGAG CGTGACACCA CGATGCCTGT AGCAATGGCA ACAACGTTGC GCAAACTATT    3960
AACTGGCGAA CTACTTACTC TAGCTTCCCG GCAACAATTA ATAGACTGGA TGGAGGCGGA    4020
TAAAGTTGCA GGACCACTTC TGCGCTCGGC CCTTCCGGCT GGCTGGTTTA TTGCTGATAA    4080
ATCTGGAGCC GGTGAGCGTG GGTCTCGCGG TATCATTGCA GCACTGGGGC CAGATGGTAA    4140
GCCCTCCCGT ATCGTAGTTA TCTACACGAC GGGGAGTCAG GCAACTATGG ATGAACGAAA    4200
TAGACAGATC GCTGAGATAG GTGCCTCACT GATTAAGCAT TGGTAACTGT CAGACCAAGT    4260
TTACTCATAT ATACTTTAGA TTGATTTAAA ACTTCATTTT TAATTTAAAA GGATCTAGGT    4320
GAAGATCCTT TTTGATAATC TCATGACCAA AATCCCTTAA CGTGAGTTTT CGTTCCACTG    4380
AGCGTCAGAC CCCGTAGAAA AGATCAAAGG ATCTTCTTGA GATCCTTTTT TTCTGCGCGT    4440
AATCTGCTGC TTGCAAACAA AAAAACCACC GCTACCAGCG GTGGTTTGTT TGCCGGATCA    4500
AGAGCTACCA ACTCTTTTTC CGAAGGTAAC TGGCTTCAGC AGAGCGCAGA TACCAAATAC    4560
TGTCCTTCTA GTGTAGCCGT AGTTAGGCCA CCACTTCAAG AACTCTGTAG CACCGCCTAC    4620
ATACCTCGCT CTGCTAATCC TGTTACCAGT GGCTGCTGCC AGTGGCGATA AGTCGTGTCT    4680
TACCGGGTTG GACTCAAGAC GATAGTTACC GGATAAGGCG CAGCGGTCGG GCTGAACGGG    4740
GGGTTCGTGC ACACAGCCCA GCTTGGAGCG AACGACCTAC ACCGAACTGA GATACCTACA    4800
GCGTGAGCTA TGAGAAAGCG CCACGCTTCC CGAAGGGAGA AAGGCGGACA GGTATCCGGT    4860
AAGCGGCAGG GTCGGAACAG GAGAGCGCAC GAGGGAGCTT CCAGGGGGAA ACGCCTGGTA    4920
TCTTTATAGT CCTGTCGGGT TTCGCCACCT CTGACTTGAG CGTCGATTTT TGTGATGCTC    4980
GTCAGGGGGG CGGAGCCTAT GGAAAAACGC CAGCAACGCG GCCTTTTTAC GGTTCCTGGC    5040
CTTTTGCTGG CCTTTTGCTC ACATGTTCTT TCCTGCGTTA TCCCCTGATT CTGTGGATAA    5100
CCGTATTACC GCCTTTGAGT GAGCTGATAC CGCTCGCCGC AGCCGAACGA CCGAGCGCAG    5160
CGAGTCAGTG AGCGAGGAAG CGGAAGAGCG CCCAATACGC AAACCGCCTC TCCCCGCGCG    5220
TTGGCCGATT CATTAATGCA GCTGGCACGA CAGGTTTCCC GACTGGAAAG CGGGCAGTGA    5280
GCGCAACGCA ATTAATGTGA GTTAGCTCAC TCATTAGGCA CCCCAGGCTT TACACTTTAT    5340
GCTTCCGGCT CGTATGTTGT GTGGAATTGT GAGCGGATAA CAATTTCACA CAGGAAACAG    5400
CTATGACCAT GATTACGCCA AGCTTTTGCG ATCAATAAAT GGATCACAAC CAGTATCTCT    5460
TAACGATGTT CTTCGCAGAT GATGATTCAT TTTTTAAGTA TTTGGCTAGT CAAGATGATG    5520
AATCTTCATT ATCTGATATA TTGCAAATCA CTCAATATCT AGACTTTCTG TTATTATTAT    5580
TGATCCAATC AAAAAATAAA TTAGAAGCCG TGGGTCATTG TTATGAATCT CTTTCAGAGG    5640
AATACAGACA ATTGACAAAA TTCACAGACT TTCAAGATTT TAAAAAACTG TTTAACAAGG    5700
TCCCTATTGT TACAGATGGA AGGGTCAAAC TTAATAAAGG ATATTTGTTC GACTTTGTGA    5760
TTAGTTTGAT GCGATTCAAA AAAGAATCCT CTCTAGCTAC CACCGCAATA GATCCTGTTA    5820
GATACATAGA TCCTCGTCGC AATATCGCAT TTTCTAACGT GATGGATATA TTAAAGTCGA    5880
ATAAAGTGAA CAATAATTAA TTCTTTATTG TCATCATGAA CGGCGGACAT ATTCAGTTGA    5940
TAATCGGCCC CATGTTTTCA GGTAAAAGTA CAGAATTAAT TAGACGAGTT AGACGTTATC    6000
AAATAGCTCA ATATAAATGC GTGACTATAA AATATTCTAA CGATAATAGA TACGGAACGG    6060
GACTATGGAC GCATGATAAG AATAATTTTG AAGCATTGGA AGCAACTAAA CTATGTGATG    6120
TCTTGGAATC AATTACAGAT TTCTCCGTGA TAGGTATCGA TGAAGGACAG TTCTTTCCAG    6180
ACATTGTTGA ATTGATCTCG ATCCCGCGAA ATTAATACGA CTCACTATAG GGAGACCACA    6240
ACGGTTTCCC TCTAGCGGGA TCAATTCCGC CCCTCTCCCT CCCCCCCCCC TAACGTTACT    6300
GGCCGAAGCC GCTTGGAATA AGGCCGGTGT GCGTTTGTCT ATATGTTATT TTCCACCATA    6360
TTGCCGTCTT TTGGCAATGT GAGGGCCCGG AAACCTGGCC CTGTCTTCTT GACGAGCATT    6420
CCTAGGGGTC TTTCCCCTCT CGCCAAAGGA ATGCAAGGTC TGTTGAATGT CGTGAAGGAA    6480
GCAGTTCCTC TGGAAGCTTC TTGAAGACAA ACAACGTCTG TAGCGACCCT TTGCAGGCAG    6540
CGGAACCCCC CACCTGGCGA CAGGTGCCTC TGCGGCCAAA AGCCACGTGT ATAAGATACA    6600
CCTGCAAAGG CGGCACAACC CCAGTGCCAC GTTGTGAGTT GGATAGTTGT GGAAAGAGTC    6660
AAATGGCTCT CCTCAAGCGT ATTCAACAAG GGGCTGAAGG ATGCCCAGAA GGTACCCCAT    6720
TGTATGGGAT CTGATCTGGG GCCTCGGTGC ACATGCTTTA CATGTGTTTA GTCGAGGTTA    6780
AAAAACGTCT AGGCCCCCCG AACCACGGGG ACGTGGTTTT CCTTTGAAAA ACACGATAAT    6840
ACC                6843
(2)SEQ ID N0：21的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：7107碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
  (ii)分子类型：cDNA
  (xi)序列描述：SEQ ID NO：21：
ATGGAAAGCG ACGCTAAAAA CTATCAAATC ATGGATTCTT GGGAAGAGGA ATCAAGAGAT     60
AAATCAACTA ATATCTCCTC GGCCCTCAAC ATCATTGAAT TCATACTCAG CACCGACCCC    120
CAAGAAGACT TATCGGAAAA CGACACAATC AACACAAGAA CCCAGCAACT CAGTGCCACC    180
ATCTGTCAAC CAGAAATCAA ACCAACAGAA ACAAGTGAGA AAGATAGTGG ATCAACTGAC    240
AAAAATAGAC AGTCCGGGTC ATCACACGAA TGTACAACAG AAGCAAAAGA TAGAAATATT    300
GATCAGGAAA CTGTACAGAG AGGACCTGGG AGAAGAAGCA GCTCAGATAG TAGAGCTGAG    360
ACTGTGGTCT CTGGAGGAAT CCCCAGAAGC ATCACAGATT CTAAAAATGG AACCCAAAAC    420
ACGGAGGATA TTGATCTCAA TGAAATTAGA AAGATGGATA AGGACTCTAT TGAGGGGAAA    480
ATGCGACAAT CTGCAAATGT TCCAAGCGAG ATATCAGGAA GTGATGACAT ATTTACAACA    540
GAACAAAGTA GAAACAGTGA TCATGGAAGA AGCCTGGAAT CTATCAGTAC ACCTGATACA    600
AGATCAATAA GTGTTGTTAC TGCTGCAACA CCAGATGATG AAGAAGAAAT ACTAATGAAA    660
AATAGTAGGA CAAAGAAAAG TTCTTCAACA CATCAAGAAG ATGACAAAAG AATTAAAAAA    720
GGGGGAAAAG GGAAAGACTG GTTTAAGAAA TCAAAAGATA CCGACAACCA GATACCAACA    780
TCAGACTACA GATCCACATC AAAAGGGCAG AAGAAAATCT CAAAGACAAC AACCACCAAC    840
ACCGACACAA AGGGGCAAAC AGAAATACAG ACAGAATCAT CAGAAACACA ATCCTCATCA     900
TGGAATCTCA TCATCGACAA CAACACCGAC CGGAACGAAC AGACAAGCAC AACTCCTCCA     960
ACAACAACTT CCAGATCAAC TTATACAAAA GAATCGATCC GAACAAACTC TGAATCCAAA    1020
CCCAAGACAC AAAAGACAAA TGGAAAGGAA AGGAAGGATA CAGAAGAGAG CAATCGATTT    1080
ACAGAGAGGG CAATTACTCT ATTGCAGAAT CTTGGTGTAA TTCAATCCAC ATCAAAACTA    1140
GATTTATATC AAGACAAACG AGTTGTATGT GTAGCAAATG TACTAAACAA TGTAGATACT    1200
GCATCAAAGA TAGATTTCCT GGCAGGATTA GTCATAGGGG TTTCAATGGA CAACGACACA    1260
AAATTAACAC AGATACAAAA TGAAATGCTA AACCTCAAAG CAGATCTAAA GAAAATGGAC    1320
GAATCACATA GAAGATTGAT AGAAAATCAA AGAGAACAAC TGTCATTGAT CACGTCACTA    1380
ATTTCAAATC TCAAAATTAT GACTGAGAGA GGAGGAAAGA AAGACCAAAA TGAATCCAAT    1440
GAGAGAGTAT CCATGATCAA AACAAAATTG AAAGAAGAAA AGATCAAGAA GACCAGGTTT    1500
GACCCACTTA TGGAGGCACA AGGCATTGAC AAGAATATAC CCGATCTATA TCGACATGCA    1560
GGAGATACAC TAGAGAACGA TGTACAAGTT AAATCAGAGA TATTAAGTTC ATACAATGAG    1620
TCAAATGCAA CAAGACTAAT ACCCAAAAAA GTGAGCAGTA CAATGAGATC ACTAGTTGCA    1680
GTCATCAACA ACAGCAATCT CTCACAAAGC ACAAAACAAT CATACATAAA CGAACTCAAA    1740
CGTTGCAAAA ATGATGAAGA AGTATCTGAA TTAATGGACA TGTTCAATGA AGATGTCAAC    1800
AATTGCCAAT GAGTCGACGA TCCGGCTGCT AACAAAGCCC GAAAGGAAGC TGAGTTGGCT    1860
GCTGCCACCG CTGAGCAATA ACTAGCATAA CCCCTTGGGG CCTCTAAACG GGTCTTGAGG    1920
GGTTTTTTGC TGAAAGGAGG AACTATATCC GGATCGAGAT CAATTCTGTG AGCGTATGGC    1980
AAACGAAGGA AAAATAGTTA TAGTAGCCGC ACTCGATGGG ACATTTCAAC GTAAACCGTT    2040
TAATAATATT TTGAATCTTA TTCCATTATC TGAAATGGTG GTAAAACTAA CTGCTGTGTG    2100
TATGAAATGC TTTAAGGAGG CTTCCTTTTC TAAACGATTG GGTGAGGAAA CCGAGATAGA    2160
AATAATAGGA GGTAATGATA TGTATCAATC GGTGTGTAGA AAGTGTTACA TCGACTCATA    2220
ATATTATATT TTTTATCTAA AAAACTAAAA ATAAACATTG ATTAAATTTT AATATAATAC    2280
TTAAAAATGG ATGTTGTGTC GTTAGATAAA CCGTTTATGT ATTTTGAGGA AATTGATAAT    2340
GAGTTAGATT ACGAACCAGA AAGTGCAAAT GAGGTCGCAA AAAAACTGCC GTATCAAGGA    2400
CAGTTAAAAC TATTACTAGG AGAATTATTT TTTCTTAGTA AGTTACAGCG ACACGGTATA    2460
TTAGATGGTG CCACCGTAGT GTATATAGGA TCTGCTCCCG GTACACATAT ACGTTATTTG    2520
AGAGATCATT TCTATAATTT AGGAGTGATC ATCAAATGGA TGCTAATTGA CGGCCGCCAT    2580
CATGATCCTA TTTTAAATGG ATTGCGTGAT GTGACTCTAG TGACTCGGTT CGTTGATGAG    2640
GAATATCTAC GATCCATCAA AAAACAACTG CATCCTTCTA AGATTATTTT AATTTCTGAT    2700
GTGAGATCCA AACGAGGAGG AAATGAACCT AGTACGGCGG ATTTACTAAG TAATTACGCT    2760
CTACAAAATG TCATGATTAG TATTTTAAAC CCCGTGGCGT CTAGTCTTAA ATGGAGATGC    2820
CCGTTTCCAG ATCAATGGAT CAAGGACTTT TATATCCCAC ACGGTAATAA AATGTTACAA    2880
CCTTTTGCTC CTTCATATTC AGGGCCGTCG TTTTACAACG TCGTGACTGG GAAAACCCTG    2940
GCGTTACCCA ACTTAATCGC CTTGCAGCAC ATCCCCCTTT CGCCAGCTGG CGTAATAGCG    3000
AAGAGGCCCG CACCGATCGC CCTTCCCAAC AGTTGCGCAG CCTGAATGGC GAATGGCGCG    3060
ACGCGCCCTG TAGCGGCGCA TTAAGCGCGG CGGGTGTGGT GGTTACGCGC AGCGTGACCG    3120
CTACACTTGC CAGCGCCCTA GCGCCCGCTC CTTTCGCTTT CTTCCCTTCC TTTCTCGCCA    3180
CGTTCGCCGG CTTTCCCCGT CAAGCTCTAA ATCGGGGGCT CCCTTTAGGG TTCCGATTTA    3240
GTGCTTTACG GCACCTCGAC CCCAAAAAAC TTGATTAGGG TGATGGTTCA CGTAGTGGGC    3300
CATCGCCCTG ATAGACGGTT TTTCGCCCTT TGACGTTGGA GTCCACGTTC TTTAATAGTG    3360
GACTCTTGTT CCAAACTGGA ACAACACTCA ACCCTATCTC GGTCTATTCT TTTGATTTAT    3420
AAGGGATTTT GCCGATTTCG GCCTATTGGT TAAAAAATGA GCTGATTTAA CAAAAATTTA    3480
ACGCGAATTT TAACAAAATA TTAACGTTTA CAATTTCCCA GGTGGCACTT TTCGGGGAAA    3540
TGTGCGCGGA ACCCCTATTT GTTTATTTTT CTAAATACAT TCAAATATGT ATCCGCTCAT    3600
GAGACAATAA CCCTGATAAA TGCTTCAATA ATATTGAAAA AGGAAGAGTA TGAGTATTCA    3660
ACATTTCCGT GTCGCCCTTA TTCCCTTTTT TGCGGCATTT TGCCTTCCTG TTTTTGCTCA    3720
CCCAGAAACG CTGGTGAAAG TAAAAGATGC TGAAGATCAG TTGGGTGCAC GAGTGGGTTA    3780
CATCGAACTG GATCTCAACA GCGGTAAGAT CCTTGAGAGT TTTCGCCCCG AAGAACGTTT    3840
TCCAATGATG AGCACTTTTA AAGTTCTGCT ATGTGGCGCG GTATTATCCC GTATTGACGC    3900
CGGGCAAGAG CAACTCGGTC GCCGCATACA CTATTCTCAG AATGACTTGG TTGAGTACTC    3960
ACCAGTCACA GAAAAGCATC TTACGGATGG CATGACAGTA AGAGAATTAT GCAGTGCTGC    4020
CATAACCATG AGTGATAACA CTGCGGCCAA CTTACTTCTG ACAACGATCG GAGGACCGAA    4080
GGAGCTAACC GCTTTTTTGC ACAACATGGG GGATCATGTA ACTCGCCTTG ATCGTTGGGA    4140
ACCGGAGCTG AATGAAGCCA TACCAAACGA CGAGCGTGAC ACCACGATGC CTGTAGCAAT    4200
GGCAACAACG TTGCGCAAAC TATTAACTGG CGAACTACTT ACTCTAGCTT CCCGGCAACA    4260
ATTAATAGAC TGGATGGAGG CGGATAAAGT TGCAGGACCA CTTCTGCGCT CGGCCCTTCC    4320
GGCTGGCTGG TTTATTGCTG ATAAATCTGG AGCCGGTGAG CGTGGGTCTC GCGGTATCAT    4380
TGCAGCACTG GGGCCAGATG GTAAGCCCTC CCGTATCGTA GTTATCTACA CGACGGGGAG    4440
TCAGGCAACT ATGGATGAAC GAAATAGACA GATCGCTGAG ATAGGTGCCT CACTGATTAA    4500
GCATTGGTAA CTGTCAGACC AAGTTTACTC ATATATACTT TAGATTGATT TAAAACTTCA    4560
TTTTTAATTT AAAAGGATCT AGGTGAAGAT CCTTTTTGAT AATCTCATGA CCAAAATCCC    4620
TTAACGTGAG TTTTCGTTCC ACTGAGCGTC AGACCCCGTA GAAAAGATCA AAGGATCTTC    4680
TTGAGATCCT TTTTTTCTGC GCGTAATCTG CTGCTTGCAA ACAAAAAAAC CACCGCTACC    4740
AGCGGTGGTT TGTTTGCCGG ATCAAGAGCT ACCAACTCTT TTTCCGAAGG TAACTGGCTT    4800
CAGCAGAGCG CAGATACCAA ATACTGTCCT TCTAGTGTAG CCGTAGTTAG GCCACCACTT    4860
CAAGAACTCT GTAGCACCGC CTACATACCT CGCTCTGCTA ATCCTGTTAC CAGTGGCTGC    4920
TGCCAGTGGC GATAAGTCGT GTCTTACCGG GTTGGACTCA AGACGATAGT TACCGGATAA    4980
GGCGCAGCGG TCGGGCTGAA CGGGGGGTTC GTGCACACAG CCCAGCTTGG AGCGAACGAC    5040
CTACACCGAA CTGAGATACC TACAGCGTGA GCTATGAGAA AGCGCCACGC TTCCCGAAGG    5100
GAGAAAGGCG GACAGGTATC CGGTAAGCGG CAGGGTCGGA ACAGGAGAGC GCACGAGGGA    5160
GCTTCCAGGG GGAAACGCCT GGTATCTTTA TAGTCCTGTC GGGTTTCGCC ACCTCTGACT    5220
TGAGCGTCGA TTTTTGTGAT GCTCGTCAGG GGGGCGGAGC CTATGGAAAA ACGCCAGCAA    5280
CGCGGCCTTT TTACGGTTCC TGGCCTTTTG CTGGCCTTTT GCTCACATGT TCTTTCCTGC    5340
GTTATCCCCT GATTCTGTGG ATAACCGTAT TACCGCCTTT GAGTGAGCTG ATACCGCTCG    5400
CCGCAGCCGA ACGACCGAGC GCAGCGAGTC AGTGAGCGAG GAAGCGGAAG AGCGCCCAAT    5460
ACGCAAACCG CCTCTCCCCG CGCGTTGGCC GATTCATTAA TGCAGCTGGC ACGACAGGTT    5520
TCCCGACTGG AAAGCGGGCA GTGAGCGCAA CGCAATTAAT GTGAGTTAGC TCACTCATTA    5580
GGCACCCCAG GCTTTACACT TTATGCTTCC GGCTCGTATG TTGTGTGGAA TTGTGAGCGG    5640
ATAACAATTT CACACAGGAA ACAGCTATGA CCATGATTAC GCCAAGCTTT TGCGATCAAT    5700
AAATGGATCA CAACCAGTAT CTCTTAACGA TGTTCTTCGC AGATGATGAT TCATTTTTTA    5760
AGTATTTGGC TAGTCAAGAT GATGAATCTT CATTATCTGA TATATTGCAA ATCACTCAAT    5820
ATCTAGACTT TCTGTTATTA TTATTGATCC AATCAAAAAA TAAATTAGAA GCCGTGGGTC    5880
ATTGTTATGA ATCTCTTTCA GAGGAATACA GACAATTGAC AAAATTCACA GACTTTCAAG    5940
ATTTTAAAAA ACTGTTTAAC AAGGTCCCTA TTGTTACAGA TGGAAGGGTC AAACTTAATA    6000
AAGGATATTT GTTCGACTTT GTGATTAGTT TGATGCGATT CAAAAAAGAA TCCTCTCTAG    6060
CTACCACCGC AATAGATCCT GTTAGATACA TAGATCCTCG TCGCAATATC GCATTTTCTA    6120
ACGTGATGGA TATATTAAAG TCGAATAAAG TGAACAATAA TTAATTCTTT ATTGTCATCA    6180
TGAACGGCGG ACATATTCAG TTGATAATCG GCCCCATGTT TTCAGGTAAA AGTACAGAAT    6240
TAATTAGACG AGTTAGACGT TATCAAATAG CTCAATATAA ATGCGTGACT ATAAAATATT    6300
CTAACGATAA TAGATACGGA ACGGGACTAT GGACGCATGA TAAGAATAAT TTTGAAGCAT    6360
TGGAAGCAAC TAAACTATGT GATGTCTTGG AATCAATTAC AGATTTCTCC GTGATAGGTA    6420
TCGATGAAGG ACAGTTCTTT CCAGACATTG TTGAATTGAT CTCGATCCCG CGAAATTAAT    6480
ACGACTCACT ATAGGGAGAC CACAACGGTT TCCCTCTAGC GGGATCAATT CCGCCCCTCT    6540
CCCTCCCCCC CCCCTAACGT TACTGGCCGA AGCCGCTTGG AATAAGGCCG GTGTGCGTTT    6600
GTCTATATGT TATTTTCCAC CATATTGCCG TCTTTTGGCA ATGTGAGGGC CCGGAAACCT    6660
GGCCCTGTCT TCTTGACGAG CATTCCTAGG GGTCTTTCCC CTCTCGCCAA AGGAATGCAA    6720
GGTCTGTTGA ATGTCGTGAA GGAAGCAGTT CCTCTGGAAG CTTCTTGAAG ACAAACAACG    6780
TCTGTAGCGA CCCTTTGCAG GCAGCGGAAC CCCCCACCTG GCGACAGGTG CCTCTGCGGC    6840
CAAAAGCCAC GTGTATAAGA TACACCTGCA AAGGCGGCAC AACCCCAGTG CCACGTTGTG    6900
AGTTGGATAG TTGTGGAAAG AGTCAAATGG CTCTCCTCAA GCGTATTCAA CAAGGGGCTG    6960
AAGGATGCCC AGAAGGTACC CCATTGTATG GGATCTGATC TGGGGCCTCG GTGCACATGC    7020
TTTACATGTG TTTAGTCGAG GTTAAAAAAC GTCTAGGCCC CCCGAACCAC GGGGACGTGG    7080
TTTTCCTTTG AAAAACACGA TAATACC                7107
(2)SEQ ID NO：22的信息：
  (i)序列特征：
    (A)长度：12011碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：
ATGGACACTG AATCTAACAA TGGCACTGTA TCTGACATAC TCTATCCTGA GTGTCACCTT      60
AACTCTCCTA TCGTTAAAGG TAAAATAGCA CAATTACACA CTATTATGAG TCTACCTCAG     120
CCTTATGATA TGGATGACGA CTCAATACTA GTTATCACTA GACAGAAAAT AAAACTTAAT     180
AAATTGGATA AAAGACAACG ATCTATTAGA AGATTAAAAT TAATATTAAC TGAAAAAGTG     240
AATGACTTAG GAAAATACAC ATTTATCAGA TATCCAGAAA TGTCAAAAGA AATGTTCAAA     300
TTATATATAC CTGGTATTAA CAGTAAAGTG ACTGAATTAT TACTTAAAGC AGATAGAACA     360
TATAGTCAAA TGACTGATGG ATTAAGAGAT CTATGGATTA ATGTGCTATC AAAATTAGCC     420
TCAAAAAATG ATGGAAGCAA TTATGATCTT AATGAAGAAA TTAATAATAT ATCGAAAGTT     480
CACACAACCT ATAAATCAGA TAAATGGTAT AATCCATTCA AAACATGGTT TACTATCAAG     540
TATGATATGA GAAGATTACA AAAAGCTCGA AATGAGATCA CTTTTAATGT TGGGAAGGAT     600
TATAACTTGT TAGAAGACCA GAAGAATTTC TTATTGATAC ATCCAGAATT GGTTTTGATA     660
TTAGATAAAC AAAACTATAA TGGTTATCTA ATTACTCCTG AATTAGTATT GATGTATTGT     720
GACGTAGTCG AAGGCCGATG GAATATAAGT GCATGTGCTA AGTTAGATCC AAAATTACAA     780
TCTATGTATC AGAAAGGTAA TAACCTGTGG GAAGTGATAG ATAAATTGTT TCCAATTATG     840
GGAGAAAAGA CATTTGATGT GATATCGTTA TTAGAACCAC TTGCATTATC CTTAATTCAA     900
ACTCATGATC CTGTTAAACA ACTAAGAGGA GCTTTTTTAA ATCATGTGTT ATCCGAGATG     960
GAATTAATAT TTGAATCTAG AGAATCGATT AAGGAATTTC TGAGTGTAGA TTACATTGAT    1020
AAAATTTTAG ATATATTTAA TAAGTCTACA ATAGATGAAA TAGCAGAGAT TTTCTCTTTT    1080
TTTAGAACAT TTGGGCATCC TCCATTAGAA GCTAGTATTG CAGCAGAAAA GGTTAGAAAA    1140
TATATGTATA TTGGAAAACA ATTAAAATTT GACACTATTA ATAAATGTCA TGCTATCTTC    1200
TGTACAATAA TAATTAACGG ATATAGAGAG AGGCATGGTG GACAGTGGCC TCCTGTGACA    1260
TTACCTGATC ATGCACACGA ATTCATCATA AATGCTTACG GTTCAAACTC TGCGATATCA    1320
TATGAAAATG CTGTTGATTA TTACCAGAGC TTTATAGGAA TAAAATTCAA TAAATTCATA    1380
GAGCCTCAGT TAGATGAGGA TTTGACAATT TATATGAAAG ATAAAGCATT ATCTCCAAAA    1440
AAATCAAATT GGGACACAGT TTATCCTGCA TCTAATTTAC TGTACCGTAC TAACGCATCC    1500
AACGAATCAC GAAGATTAGT TGAAGTATTT ATAGCAGATA GTAAATTTGA TCCTCATCAG    1560
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ACGATAATAC C      12011
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CTCTATCCAC TCTCAGACCA GATATCAATA GATTAAAAGC TTTGATGGAA CTGTATTTAT    1020
CAAAGGGACC ACGCGCTCCT TTCATCTGTA TCCTCAGAGA TCCTATACAT GGTGAGTTCG    1080
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CTGACAATAT CAAGACCGAA CAACAAAACA TCAGAGACAG ACTAAACAAG AGACTCAACG    1560
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ATCAATAATA AATAAGAAAA ACTTAGGATT AAAGAATCCT ATCATACCGG AATATAGGGT    1740
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GGGAAATGGA CACTGAATCT AACAATGGCA CTGTATCTGA CATACTCTAT CCTGAGTGTC    8700
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CTCAGCCTTA TGATATGGAT GACGACTCAA TACTAGTTAT CACTAGACAG AAAATAAAAC    8820
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GAACATATAG TCAAATGACT GATGGATTAA GAGATCTATG GATTAATGTG CTATCAAAAT    9060
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TGATATTAGA TAAACAAAAC TATAATGGTT ATCTAATTAC TCCTGAATTA GTATTGATGT    9360
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AGATGGAATT AATATTTGAA TCTAGAGAAT CGATTAAGGA ATTTCTGAGT GTAGATTACA     9660
TTGATAAAAT TTTAGATATA TTTAATAAGT CTACAATAGA TGAAATAGCA GAGATTTTCT     9720
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GTCTTGAAGG AAGTACAATC TATGTAGGTG ATCCTTACTG TCCTCCATCA GATAAAGAAC    10800
ATATATCATT AGAGGATCAC CCTGATTCTG GTTTTTACGT TCATAACCCA AGAGGGGGTA    10860
TAGAAGGATT TTGTCAAAAA TTATGGACAC TCATATCTAT AAGTGCAATA CATCTAGCAG    10920
CTGTTAGAAT AGGCGTGAGG GTGACTGCAA TGGTTCAAGG AGACAATCAA GCTATAGCTG    10980
TAACCACAAG AGTACCCAAC AATTATGACT ACAGAGTTAA GAAGGAGATA GTTTATAAAG    11040
ATGTAGTGAG ATTTTTTGAT TCATTAAGAG AAGTGATGGA TGATCTAGGT CATGAACTTA    11100
AATTAAATGA AACGATTATA AGTAGCAAGA TGTTCATATA TAGCAAAAGA ATCTATTATG    11160
ATGGGAGAAT TCTTCCTCAA GCTCTAAAAG CATTATCTAG ATGTGTCTTC TGGTCAGAGA    11220
CAGTAATAGA CGAAACAAGA TCAGCATCTT CAAATTTGGC AACATCATTT GCAAAAGCAA    11280
TTGAGAATGG TTATTCACCT GTTCTAGGAT ATGCATGCTC AATTTTTAAG AATATTCAAC    11340
AACTATATAT TGCCCTTGGG ATGAATATCA ATCCAACTAT AACACAGAAT ATCAGAGATC    11400
AGTATTTTAG GAATCCAAAT TGGATGCAAT ATGCCTCTTT AATACCTGCT AGTGTTGGGG    11460
GATTCAATCA CATGGCGATG TCAAGATGTT TTGTAAGGAA TATTGGTGAT CCATCAGTTG    11520
CCGCATTGGC TGATATTAAA AGATTTATTA AGGCGAATCT ATTAGACCGA AGTGTTCTTT    11580
ATAGGATTAT GAATCAAGAA CCAGGTGAGT CATCTTTTTT TGATTGGGCT TCAGATCCAT    11640
ATTCATGCAA TTTACCACAA TCTCAAAATA TAACCACCAT GATAAAAAAT ATAACAGCAA  11700
GGAATGTATT ACAAGATTCA CCAAATCCAT TATTATCTGG ATTATTCACA AATACAATGA  11760
TAGAAGAAGA TGAAGAATTA GCTGAGTTCC TGATGGACAG GAAGGTAATT CTCCCTAGAG  11820
TTGCACATGA TATTCTAGAT AATTCTCTCA CAGGAATTAG AAATGCCATA GCTGGAATGT  11880
TAGATACGAC AAAATCACTA ATTCGGGTTG GCATAAATAG AGGAGGACTG ACATATAGTT  11940
TGTTGAGGAA AATCAGTAAT TACGATCTAG TACAATATGA AACACTAAGT AGGACTTTGC  12000
GACTAATTGT AAGTGATAAA ATCAAGTATG AAGATATGTG TTCGGTAGAC CTTGCCATAG  12060
CATTGCGACA AAAGATGTGG ATTCATTTAT CAGGAGGAAG GATGATAAGT GGACTTGAAA  12120
CGCCTGACCC ATTAGAATTA CTATCTGGGG TAGTAATAAC AGGATCAGAA CATTGTAAAA  12180
TATGTTATTC TTCAGATGGC ACAAACCCAT ATACTTGGAT GTATTTACCC GGTAATATCA  12240
AAATAGGATC AGCAGAAACA GGTATATCGT CATTAAGAGT TCCTTATTTT GGATCAGTCA  12300
CTGATGAAAG ATCTGAAGCA CAATTAGGAT ATATCAAGAA TCTTAGTAAA CCTGCAAAAG  12360
CCGCAATAAG AATAGCAATG ATATATACAT GGGCATTTGG TAATGATGAG ATATCTTGGA  12420
TGGAAGCCTC ACAGATAGCA CAAACACGTG CAAATTTTAC ACTAGATAGT CTCAAAATTT  12480
TAACACCGGT AGCTACATCA ACAAATTTAT CACACAGATT AAAGGATACT GCAACTCAGA  12540
TGAAATTCTC CAGTACATCA TTGATCAGAG TCAGCAGATT CATAACAATG TCCAATGATA  12600
ACATGTCTAT CAAAGAAGCT AATGAAACCA AAGATACTAA TCTTATTTAT CAACAAATAA  12660
TGTTAACAGG ATTAAGTGTT TTCGAATATT TATTTAGATT AAAAGAAACC ACAGGACACA  12720
ACCCTATAGT TATGCATCTG CACATAGAAG ATGAGTGTTG TATTAAAGAA AGTTTTAATG  12780
ATGAACATAT TAATCCAGAG TCTACATTAG AATTAATTCG ATATCCTGAA AGTAATGAAT  12840
TTATTTATGA TAAAGACCCA CTCAAAGATG TGGACTTATC AAAACTTATG GTTATTAAAG  12900
ACCATTCTTA CACAATTGAT ATGAATTATT GGGATGATAC TGACATCATA CATGCAATTT  12960
CAATATGTAC TGCAATTACA ATAGCAGATA CTATGTCACA ATTAGATCGA GATAATTTAA  13020
AAGAGATAAT AGTTATTGCA AATGATGATG ATATTAATAG CTTAATCACT GAATTTTTGA  13080
CTCTTGACAT ACTTGTATTT CTCAAGACAT TTGGTGGATT ATTAGTAAAT CAATTTGCAT  13140
ACACTCTTTA TAGTCTAAAA ATAGAAGGTA GGGATCTCAT TTGGGATTAT ATAATGAGAA  13200
CACTGAGAGA TACTTCCCAT TCAATATTAA AAGTATTATC TAATGCATTA TCTCATCCTA  13260
AAGTATTCAA GAGGTTCTGG GATTGTGGAG TTTTAAACCC TATTTATGGG CCTAATATCG  13320
CTAGTCAAGA CCAGATAAAA CTTGCCCTAT CTATATGTGA ATATTCACTA GATCTATTTA  13380
TGAGAGAATG GTTGAATGGT GTATCACTTG AAATATACAT TTGTGACAGC GATATGGAAG  13440
TTGCAAATGA TAGGAAACAA GCCTTTATTT CTAGACACCT TTCATTTGTT TGTTGTTTAG  13500
CAGAAATTGC ATCTTTCGGA CCTAACCTGT TAAACTTAAC ATACTTGGAG AGACTTGATC  13560
TATTGAAACA ATATCTTGAA TTAAATATTA AAGAAGACCC TACTCTTAAA TATGTACAAA  13620
TATCTGGATT ATTAATTAAA TCGTTCCCAT CAACTGTAAC ATACGTAAGA AAGACTGCAA  13680
TCAAATATCT AAGGATTCGC GGTATTAGTC CACCTGAGGT AATTGATGAT TGGGATCCGG  13740
TAGAAGATGA AAATATGCTG GATAACATTG TCAAAACTAT AAATGATAAC TGTAATAAAG  13800
ATAATAAAGG GAATAAAATT AACAATTTCT GGGGACTAGC ACTTAAGAAC TATCAAGTCC  13860
TTAAAATCAG ATCTATAACA AGTGATTCTG ATGATAATGA TAGACTAGAT GCTAATACAA  13920
GTGGTTTGAC ACTTCCTCAA GGAGGGAATT ATCTATCGCA TCAATTGAGA TTATTCGGAA  13980
TCAACAGCAC TAGTTGTCTG AAAGCTCTTG AGTTATCACA AATTTTAATG AAGGAAGTCA  14040
ATAAAGACAA GGACAGGCTC TTCCTGGGAG AAGGAGCAGG AGCTATGCTA GCATGTTATG  14100
ATGCCACATT AGGACCTGCA GTTAATTATT ATAATTCAGG TTTGAATATA ACAGATGTAA  14160
TTGGTCAACG AGAATTGAAA ATATTTCCTT CAGAGGTATC ATTAGTAGGT AAAAAATTAG  14220
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CATGGATAGG AAATATGGAA TGTGAGAGCT TAATATGGAG TGAATTAAAT GATAAGTCCA  14340
TTGGATTAGT ACATTGTGAT ATGGAAGGAG CTATCGGTAA ATCAGAAGAA ACTGTTCTAC  14400
ATGAACATTA TAGTGTTATA AGAATTACAT ACTTGATTGG GGATGATGAT GTTGTTTTAG  14460
TTTCCAAAAT TATACCTACA ATCACTCCGA ATTGGTCTAG AATACTTTAT CTATATAAAT  14520
TATATTGGAA AGATGTAAGT ATAATATCAC TCAAAACTTC TAATCCTGCA TCAACAGAAT  14580
TATATCTAAT TTCGAAAGAT GCATATTGTA CTATAATGGA ACCTAGTGAA ATTGTTTTAT  14640
CAAAACTTAA AAGATTGTCA CTCTTGGAAG AAAATAATCT ATTAAAATGG ATCATTTTAT  14700
CAAAGAAGAG GAATAATGAA TGGTTACATC ATGAAATCAA AGAAGGAGAA AGAGATTATG  14760
GAATCATGAG ACCATATCAT ATGGCACTAC AAATCTTTGG ATTTCAAATC AATTTAAATC  14820
ATCTGGCGAA AGAATTTTTA TCAACCCCAG ATCTGACTAA TATCAACAAT ATAATCCAAA  14880
GTTTTCAGCG AACAATAAAG GATGTTTTAT TTGAATGGAT TAATATAACT CATGATGATA  14940
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GACTGCTATC GAGAAGACTA GTATTAAGTT GGATTTCATT ATCATTATCG ACTCGATTAC  15060
TTACAGGTCG CTTTCCTGAT GAAAAATTTG AACATAGAGC ACAGACTGGA TATGTATCAT  15120
TAGCTGATAC TGATTTAGAA TCATTAAAGT TATTGTCGAA AAACATCATT AAGAATTACA  15180
GAGAGTGTAT AGGATCAATA TCATATTGGT TTCTAACCAA AGAAGTTAAA ATACTTATGA  15240
AATTGATCGG TGGTGCTAAA TTATTAGGAA TTCCCAGACA ATATAAAGAA CCCGAAGACC  15300
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TGAAGATATA TCCTAACCTT TATCTTTAAG CCTAGGAATA GACAAAAAGT AAGAAAAACA  15420
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CCATAGAGAG TCCATGGAAA GCGACGCTAA AAACTATC    38

Claims (126)

1.一种分离的聚核苷酸分子，它包含操作性连接的转录启动子，一段编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列，和转录终止子，其中所述的编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列通过导入HPIV1序列，HPIV2序列，HPIV3序列，BPIV序列或MPIV序列的异源PIV序列而被修饰成嵌合的PIV基因组或反基因组。
2.根据权利要求1所述的分离的聚核苷酸分子，其中的人PIV3基因或基因节段被异源PIV的对应基因或基因节段取代。
3.根据权利要求2所述的分离的聚核苷酸分子，其中的对等基因或基因节段是HPIV1或HPIV2的HN或F糖蛋白基因或基因节段。
4.根据权利要求2所述的分离的聚核苷酸分子，其中PIV1或PIV2的HN或F糖蛋白基因被HPIV3中对应的HN或F糖蛋白基因取代。
5.根据权利要求1所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述的编码基因组或反基因组的聚核苷酸序列包含BPIV基因或基因节段。
6.根据权利要求1所述的分离的聚核苷酸分子，它包含来自RSV的异源序列。
7.根据权利要求6所述的分离的聚核苷酸分子，其中来自RSV的异源序列是G或F基因或基因节段。
8.根据权利要求1所述的分离的聚核苷酸分子，它包含来自麻疹病毒的异源序列。
9.根据权利要求8所述的分离的聚核苷酸分子，其中来自麻疹病毒的异源序列是HA或F基因或基因节段。
10.根据权利要求1所述的分离的聚核苷酸分子，它包含操作性连接的转录启动子，一段编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列，和转录终止子，其中所述的编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列选自：
i)p218(131)(SEQ ID NO：1)；
ii)p3/7(131)(SEQ ID NO：14)；
iii)p3/7(131)2G(SEQ ID NO：15)；
iv)经如下修饰的分离的聚核苷酸i)，ii)或iii)：引入选自HPIV1序列，HPIV2序列，HPIV3序列，BPIV序列或MPIV序列的异源PIV序列；或造成减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑、宿主范围限制或PIV免疫原性表位内改变这些表型改变之一的核苷酸插入，重排，删除或取代。
11.根据权利要求10所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述编码所述PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列含有多处ts突变。
12.根据权利要求10所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述编码所述PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列含有多处非ts减毒突变。
13.根据权利要求10所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述编码所述PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列含有一种或多种JS cp45的突变。
14.根据权利要求13所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述编码所述PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列编码聚合酶L蛋白内的至少一处氨基酸取代。
15.根据权利要求14所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述L蛋白内的氨基酸取代发生在相应于JS cp45的Tyr942，Leu992或Thr1558处。
16.根据权利要求10所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述编码所述PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列编码N蛋白内的至少一处氨基酸取代。
17.根据权利要求16所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述N蛋白内的氨基酸取代发生在相应于JS cp45的Val96或Ser389处。
18.根据权利要求10所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述编码所述PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列编码C蛋白内的一处氨基酸取代。
19.根据权利要求18所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述C蛋白内的氨基酸取代发生在相应于JS cp45的Ile96处。
20.根据权利要求10所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述编码所述PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列编码F蛋白内的至少一处氨基酸取代。
21.根据权利要求20所述的分离的聚核苷酸分子，其中F蛋白内的氨基酸取代发生在相应于JS cp45的lle420或Ala450处。
22.根据权利要求11所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述编码所述PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列编码HN蛋白内的一处氨基酸取代。
23.根据权利要求22所述的分离的聚核苷酸分子，其中HN蛋白内的氨基酸取代发生在相应于JS cp45的Val384处。
24.根据权利要求10所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述编码所述PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列编码至少一个3’前导序列内的突变。
25.根据权利要求24所述的分离的聚核苷酸分子，其中3’前导序列内的突变发生在相应于JS cp45的第23、24、28或45核苷酸处。
26.根据权利要求10所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述编码所述PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列包含一个N基因启始序列内的突变。
27.根据权利要求26所述的分离的聚核苷酸分子，其中N基因启始序列内的突变发生在相应于JS cp45的第62核苷酸处。
28.根据权利要求10所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述编码所述PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列包含rcp45，rcp453’NCMFHN，rcp453’NL，rcp453’N，rcp45L或rcp45F内突变的多个至全部。
29.根据权利要求10所述的分离的聚核苷酸，它是选自rcp45，rcp453’NCMFHN，rcp453’NL，rcp453’N，rcp45L，rcp45F，rcp45M，rcp45HN或rcp45C的反基因组cDNA。
30.根据权利要求10所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述编码所述PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列含有一个被稳定化的突变，该突变是因为密码子内多个核苷酸被取代而造成的。
31.根据权利要求10所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述编码所述PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列包含来自HPIV1，HPIV2，HPIV3，BPIV或MPIV的异源序列形成嵌合基因组或反基因组。
32.根据权利要求31所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述的嵌合基因组或反基因组含有一个或多个ts突变。
33.根据权利要求31所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述的嵌合基因组或反基因组含有一个或多个非ts减毒突变。
34.根据权利要求31所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述的嵌合基因组或反基因组含有一种或多种JS cp45的突变。
35.根据权利要求34所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述的一种或多种JS cp45的突变发生在选自L、M、N、C、F或HN的一个或多个PIV蛋白中，或发生在选自3’前导序列或N基因起始序列的PIC基因外序列中。
36.根据权利要求31所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述的嵌合基因组或反基因组含有多种突变，它们分别造成选自减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑或宿主范围限制之一的表型。
37.根据权利要求31所述的分离的聚核苷酸分子，其中所述的嵌合基因组或反基因组包含rcp45，rcp453’NCMFHN，rcp453’NL，rcp453’N，rcp45L或rcp45F内突变的至少一个，多至全部。
38.根据权利要求31所述的分离的聚核苷酸分子，造成表型改变：减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑、宿主范围限制或PIV免疫原性表位内改变的突变被包含嵌合PIV背景内，所述背景包含的基因组或反基因组中一个或多个PIV3HN或F糖蛋白基因被一个或多个对应的PIV1或PIV2的HN和F糖蛋白基因取代。
39.根据权利要求31所述的分离的聚核苷酸分子，其中的异源序列造成选自减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑、宿主范围限制或嵌合PIV免疫原性表位内变化的表型改变。
40.根据权利要求10所述的分离的聚核苷酸分子，它含有HPIV1，HPIV2，BPIV或MPIV的顺式作用调控序列。
41.根据权利要求10所述的分离的聚核苷酸分子，它含有来自RSV的异源序列。
42.根据权利要求41所述的分离的聚核苷酸分子，其中来自RSV的异源序列是G或F基因或基因节段。
43.根据权利要求10所述的分离的聚核苷酸分子，它含有来自麻疹病毒的异源序列。
44.根据权利要求43所述的分离的聚核苷酸分子，其中来自麻疹病毒的异源序列是HA或F基因或基因节段。
45.根据权利要求10所述的分离的聚核苷酸分子，它含有一段编码非PIV分子的聚核苷酸序列，所述的分子选自细胞因子、T辅助细胞表位、限制型位点标记或能够在哺乳动物宿主内引发保护性免疫应答的微生物病原蛋白。
46.一种细胞或无细胞组合物，它包括包含编码PIV基因组或反基因组的分离的聚核苷酸分子的表达载体，和包含一个或多个编码PIVN、P和L蛋白的分离的聚核苷酸分子的表达载体，通过所述PIV基因组或反基因组和N、P和L蛋白的表达产生感染性PIV颗粒。
47.根据权利要求46所述的细胞或无细胞组合物，其中的感染性PIV颗粒是病毒。
48.根据权利要求46所述的细胞或无细胞组合物，其中的感染性PIV颗粒是亚病毒颗粒。
49.根据权利要求46所述的细胞或无细胞组合物，其中编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸和编码PIV N、P和L蛋白的一个或多个聚核苷酸包含在同一个载体内。
50.从一种或多种编码PIV的分离的聚核苷酸分子产生感染性PIV颗粒的方法，包括：
在细胞或无细胞系统内表达包含编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子的表达载体和包含一个或多个编码N、P和L蛋白的聚核苷酸分子的表达载体，由此产生感染性PIV颗粒。
51.根据权利要求50所述的方法，其中的PIV基因组或反基因组和N、P和L蛋白是由同一表达载体表达的。
52.根据权利要求50所述的方法，其中的N、P和L蛋白由2个或3个不同的表达载体编码。
53.根据权利要求50所述的方法，至少N、P和L蛋白之一来自与PIV的共感染。
54.根据权利要求50所述的方法，其中编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子是cDNA。
55.根据权利要求50所述的方法，其中的感染性PIV颗粒是病毒。
56.根据权利要求50所述的方法，其中的感染性PIV颗粒是亚病毒颗粒。
57.根据权利要求50所述的方法，其中编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子是人、牛或鼠的PIV序列。
58.根据权利要求50所述的方法，其中编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子编码野生型PIV毒株的序列。
59.根据权利要求50所述的方法，其中编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子编码HPIV3。
60.根据权利要求50所述的方法，其中编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子含有生物学方法产生的PIV毒株的减毒突变。
61.根据权利要求50所述的方法，其中编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子含有一个或多个ts突变。
62.根据权利要求50所述的方法，其中编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子含有一个或多个非ts减毒突变。
63.根据权利要求50所述的方法，其中编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子含有至少一个JS cp45的突变。
64.根据权利要求63所述的方法，其中编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子含有多个JS cp45的突变。
65.根据权利要求63所述的方法，其中的JS cp45突变造成聚合酶L蛋白内的至少一处氨基酸取代。
66.根据权利要求65所述的方法，其中L蛋白内的氨基酸取代发生在相应于JS cp45的Tyr942，Leu992或Thr1558处。
67.根据权利要求63所述的方法，其中的JS cp45突变造成选自L、M、N、C、F或HN的PIV蛋白内的改变，或选自3’前导序列或N基因起始序列的PIV基因外序列内的改变。
68.根据权利要求50所述的方法，其中编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子包含一个被稳定化的突变，该突变是因密码子内多个核苷酸被取代而造成的。
69.根据权利要求50所述的方法，其中编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子含有存在于rcp45，rcp453’NCMFHN，rcp453’NL，rcp453’N或rcp45C内的突变中的多个直至全部。
70.根据权利要求67所述的方法，其中编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子是选自rcp45，rcp453’NCMFHN，rcp453’NL，rcp453’N，rcp45L，rcp45F，rcp45M，rcp45HN或rcp45C的反基因组cDNA。
71.根据权利要求50所述的方法，其中编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子含有一段来自HPIV1，HPIV2，HPIV3，BPIV或MPIV的异源序列，形成嵌合基因组或反基因组。
72.根据权利要求71所述的方法，其中编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子是HPIV3与HPIV1，HPIV2，BPIV或MPIV序列的嵌合体。
73.根据权利要求72所述的方法，其中编码HN或F糖蛋白的基因或基因节段的来自HPIV1或HPIV2的异源序列取代了HPIV3的对应基因或基因节段。
74.根据权利要求71所述的方法，其中的嵌合基因组或反基因组包含一个或多个ts突变。
75.根据权利要求71所述的方法，其中的嵌合基因组或反基因组包含一个或多个非ts减毒突变。
76.根据权利要求71所述的方法，其中的嵌合基因组或反基因组包含一个或多个cp45突变。
77.根据权利要求71所述的方法，其中的嵌合基因组或反基因组包含多个突变，它们各自造成的表型选自减毒，温度敏感性，冷适应性，小噬斑或宿主范围限制。
78.根据权利要求71所述的方法，造成表型改变：减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑、宿主范围限制或PIV免疫原性表位内改变的突变被包含在嵌合PIV背景内，所述背景包含的基因组或反基因组中一个或多个PIV3HN或F糖蛋白基因被一个或多个对应的PIV1或PIV2的HN和F糖蛋白基因取代。
79.根据权利要求78所述的方法，其中一个或多个JS cp45突变包含在所含基因组或反基因组的HN或F糖蛋白基因都被对应的PIV1或PIV2的HN和F糖蛋白基因取代的嵌合背景中。
80.根据权利要求79所述的方法，其中一个或多个JS cp45突变发生在选自L、M、N、C、F或HN的一个或多个PIV蛋白内，或发生在选自3’前导序列或N基因起始序列的PIV基因外序列内。
81.根据权利要求71所述的方法，其中异源序列造成的表型改变选自减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑、宿主范围限制或PIV免疫原性表位内改变。
82.根据权利要求50所述的方法，其中编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子含有来自RSV的异源序列。
83.根据权利要求82所述的方法，其中来自RSV的异源序列是G或F基因或基因节段。
84.根据权利要求50所述的方法，其中编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子含有来自麻疹病毒的异源序列。
85.根据权利要求84所述的方法，其中来自麻疹病毒的异源序列是HA或F基因或基因节段。
86.根据权利要求50所述的方法，其中所述的编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸序列选自：
i)p218(131)(SEQ ID NO：1)；
ii)p3/7(131)(SEQ ID NO：14)；
iii)p3/7(131)2G(SEQ ID NO：15)；
iv)经如下修饰的聚核苷酸i)，ii)或iii)：引入选自HPIV1序列，HPIV2序列，BPIV序列或MPIV序列的异源PIV序列，或造成减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑、宿主范围限制或PIV免疫原性表位内改变这些表型之一的核苷酸插入，重排，删除或取代。
87.根据权利要求50所述的方法，其中所述的编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子选自：
i)p218(131)(SEQ ID NO：1)；
ii)p3/7(131)(SEQ ID NO：14)；
iii)p3/7(131)2G(SEQ ID NO：15)；
iv)经如下修饰的聚核苷酸i)，ii)或iii)：引入选自HPIV1序列，HPIV2序列，BPIV序列或MPIV序列的异源PIV序列，和与所述引入异源PIV序列不同的、造成减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑、宿主范围限制或PIV免疫原性表位内改变这些表型改变的核苷酸插入，重排，删除或取代。
88.根据权利要求50所述的方法，其中所述的编码PIV基因组或反基因组的聚核苷酸分子经修饰而编码非PIV分子，所述分子选自细胞因子、T辅助细胞表位、限制型位点标记或能够在哺乳动物宿主内引发保护性免疫应答的微生物病原蛋白。
89.一种分离的感染性PIV颗粒，它包含重组PIV基因组或反基因组，N蛋白，P蛋白和L蛋白。
90.根据权利要求89所述的分离的感染性PIV颗粒，它是亚病毒颗粒。
91.根据权利要求89所述的分离的感染性PIV颗粒，它是病毒。
92.根据权利要求89所述的分离的感染性PIV颗粒，其中的重组PIV基因组或反基因组含有来自RSV或麻疹病毒的异源序列。
93.根据权利要求89所述的分离的感染性PIV颗粒，其中的重组PIV基因组或反基因组是cDNA。
94.根据权利要求89所述的分离的感染性PIV颗粒，它是人PIV。
95.根据权利要求89所述的分离的感染性PIV颗粒，其中的重组PIV基因组或反基因组是选自HPIV1，HPIV2，HPIV3，BPIV或MPIV序列的异源PIV序列的嵌合体。
96.根据权利要求89所述的分离的感染性PIV颗粒，其中的重组PIV基因组或反基因组选自：
i)p218(131)(SEQ ID NO：1)；
ii)p3/7(131)(SEQ ID NO：14)；
iii)p3/7(131)2G(SEQ ID NO：15)；
iv)经如下修饰的基因组或反基因组i)，ii)或iii)：引入选自HPIV1序列，HPIV2序列，BPIV序列或MPIV序列的异源PIV序列，或造成减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑、宿主范围限制或PIV免疫原性表位内改变这些表型改变之一的核苷酸插入，重排，删除或取代。
97.根据权利要求89所述的分离的感染性PIV颗粒，其中的重组PIV基因组或反基因组选自：
i)p218(131)(SEQ ID NO：1)；
ii)p3/7(131)(SEQ ID NO：14)；
iii)p3/7(131)2G(SEQ ID NO：15)；
iv)经如下修饰的聚核苷酸i)，ii)或iii)：引入选自HPIV1序列，HPIV2序列，BPIV序列或MPIV序列的异源PIV序列，和与所述引入异源PIV序列不同的、造成减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑、宿主范围限制或PIV免疫原性表位内改变这些表型改变之一的核苷酸插入，重排，删除或取代。
98.根据权利要求89所述的分离的感染性PIV颗粒，其中的对应基因或基因节段是HPIV1或HPIV2的HN或F糖蛋白基因或基因节段。
99.根据权利要求89所述的分离的感染性PIV颗粒，其中的重组PIV基因组或反基因组含有来自RSV或麻疹病毒的异源序列。
100.根据权利要求89所述的分离的感染性PIV颗粒，其中的重组PIV基因组或反基因组受到核苷酸插入、重排、删除或取代修饰，它们编码选自减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑、宿主范围限制或PIV免疫原性表位内改变的表型改变。
101.根据权利要求89所述的分离的感染性PIV颗粒，其中的重组PIV基因组或反基因组含有多个ts突变。
102.根据权利要求89所述的分离的感染性PIV颗粒，其中的重组PIV基因组或反基因组含有多个非ts减毒突变。
103.根据权利要求89所述的分离的感染性PIV颗粒，其中的重组PIV基因组或反基因组包含至少一个JS cp45突变。
104.根据权利要求103所述的分离的感染性PIV颗粒，其中的JS cp45突变造成聚合酶L蛋白内的氨基酸取代。
105.根据权利要求95所述的分离的感染性PIV颗粒，其中的嵌合基因组或反基因组含有一个或多个ts突变。
106.根据权利要求95所述的分离的感染性PIV颗粒，其中的嵌合基因组或反基因组含有一个或多个非ts减毒突变。
107.根据权利要求95所述的分离的感染性PIV颗粒，其中的嵌合基因组或反基因组含有一个或多个JS cp45突变。
108.根据权利要求107所述的分离的感染性PIV颗粒，其中的嵌合基因组或反基因组含有多个突变，它们各自造成选自减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑或宿主范围限制的表型。
109.根据权利要求107所述的分离的感染性PIV颗粒，其中的嵌合基因组或反基因组含有存在于rcp45，rcp453’NCMFHN，rcp453’NL，rcp453’N或rcp45F内的突变中至少一个多至全部。
110.根据权利要求89所述的分离的感染性PIV颗粒，造成表型改变：减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑、宿主范围限制或PIV免疫原性表位内改变的突变被包含嵌合PIV背景内，所述背景包含的基因组或反基因组中一个或多个PIV3HN或F糖蛋白基因被一个或多个对应的PIV1或PIV2的HN和F糖蛋白基因取代。
111.根据权利要求110所述的分离的感染性PIV颗粒，其中一个或多个JScp45突变包含在所述的嵌合背景中。
112.根据权利要求111所述的分离的感染性PIV颗粒，其中一个或多个JScp45突变发生在选自L、M、N、C、F或HN的一个或多个PIV蛋白内，或发生在选自3’前导序列或N基因起始序列的PIV基因外序列内。
113.根据权利要求89所述的分离的感染性PIV颗粒，其中的重组PIV基因组或反基因组经修饰而编码非PIV分子，所述分子选自细胞因子、T辅助细胞表位、限制型位点标记或能够在哺乳动物宿主内引发保护性免疫应答的微生物病原蛋白。
114.根据权利要求89所述的分离的感染性PIV颗粒，它还包含RSV抗原，或能在免疫宿主内引发保护性抗RSV免疫力的表位。
115.根据权利要求89所述的分离的感染性PIV颗粒，它选自r942，r992，r1558，r942/992，r992/1558，r942/1558，r942/992/1558，rcp453’N，rcp45C，rcp45M，rcp45F，rcp45HN，rcp45L，rcp453’NL，rcp453’NCMFHN和rcp45。
116.一种免疫原性组合物，它包含处于药学上认可的运载体中的免疫有效量的感染性PIV颗粒，所述的PIV颗粒包含重组PIV基因组或反基因组，N蛋白，P蛋白和L蛋白。
117.根据权利要求116所述的免疫原性组合物，其中所述的感染性PIV颗粒是亚病毒颗粒。
118.根据权利要求116所述的免疫原性组合物，其中所述的感染性PIV颗粒是病毒。
119.根据权利要求116所述的免疫原性组合物，其中的重组PIV基因组或反基因组含有来自RSV或麻疹病毒的异源序列。
120.根据权利要求116所述的免疫原性组合物，其中的重组PIV基因组或反基因组是选自HPIV1，HPIV2，HPIV3，BPIV或MPIV序列的异源PIV序列的嵌合体，形成嵌合PIV颗粒。
121.根据权利要求116所述的免疫原性组合物，其中的重组PIV基因组或反基因组编码一种人PIV，此PIV中的基因或基因节段被异源PIV的对应基因或基因节段取代。
122.根据权利要求121所述的免疫原性组合物，其中HPIV1的HN和F糖蛋白基因之一或两者取代了HPIV3的HN和F糖蛋白基因，形成感染性嵌合PIV颗粒。
123.根据权利要求121所述的免疫原性组合物，其中所述感染性嵌合PIV颗粒的重组PIV基因组或反基因组受到核苷酸插入、重排、删除或取代修饰，它们造成选自减毒、温度敏感性、冷适应性、小噬斑、宿主范围限制或PIV免疫原性表位内改变的表型改变。
124.根据权利要求123所述的免疫原性组合物，其中的重组PIV基因组或反基因组含有选自ts和非ts减毒突变的多个突变，形成减毒的感染性嵌合PIV颗粒。
125.根据权利要求116所述的免疫原性组合物，其中的重组PIV基因组或反基因组含有JS cp45突变。
126.根据权利要求116所述的免疫原性组合物，其中的重组PIV基因组或反基因组含有多个JS cp45突变。
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