ES2527503T3 - Virus influenza reordenantes - Google Patents

Abstract

Virus influenza reordenante 6:2, en el que dicho virus comprende 6 segmentos de genoma internos de uno o más virus donadores distintos de A/Ann Arbor/6/60 y 2 segmentos de genoma de antígeno de superficie, en el que los segmentos de genoma de antígeno de superficie codifican para un polipéptido de HA y uno de NA, en el que el segmento de genoma de antígeno de superficie que codifica para el polipéptido de HA produce un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83

Description

Virus influenza reordenantes

Antecedentes de la invención

Las vacunas contra cepas de influenza diversas y en evolución son importantes desde un punto de vista de salud comunitaria, así como comercial, puesto que cada año numerosos individuos se infectan con diferentes cepas y tipos de virus influenza. Los lactantes, los ancianos, las personas sin asistencia sanitaria adecuada y las inmunocomprometidas corren un riesgo especial de muerte debido a tales infecciones. El problema de las infecciones por influenza se ve agravado porque las cepas de influenza novedosas evolucionan fácilmente y pueden propagarse entre diversas especies, haciendo así que sea necesaria la producción continua de nuevas vacunas.

Se han producido numerosas vacunas que pueden producir una respuesta inmunitaria protectora específica para diferentes virus/cepas de virus influenza durante más de 50 años e incluyen vacunas de virus completos, vacunas de virus divididos, vacunas de antígenos de superficie y vacunas de virus vivos atenuados. Sin embargo, aunque formulaciones apropiadas de cualquiera de estos tipos de vacuna pueden producir una respuesta inmunitaria sistémica, las vacunas de virus vivos atenuados tienen la ventaja de poder estimular también la inmunidad de la mucosa local en las vías respiratorias. Se ha realizado un trabajo considerable en la producción de virus influenza, y fragmentos de los mismos, para la producción de vacunas por los presentes inventores y colaboradores; véanse, por ejemplo, la solicitud estadounidense n.º 60/420.708, presentada el 23 de octubre de 2002, la solicitud estadounidense n.º 10/423.828, presentada el 25 de abril de 2003 y la solicitud estadounidense n.º 60/574.117, presentada el 24 de mayo de 2004, todas tituladas “Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus”.

Debido a la aparición (o reaparición) continua de diferentes cepas de influenza, se desean continuamente nuevas vacunas contra la gripe. Tales vacunas se crean normalmente usando restos antigénicos de las cepas de virus de aparición reciente de modo que, por tanto, son altamente deseables polipéptidos y polinucleótidos de cepas de virus novedosas, de aparición reciente o de reaparición reciente (especialmente secuencias de genes antigénicos). Además, también son altamente deseables tales secuencias dentro de vectores preferidos.

La presente invención proporciona variantes de hemaglutinina y neuraminidasa de influenza nuevas y/o recientemente aisladas, opcionalmente dentro de vectores preferidos, que pueden usarse en la producción de numerosos tipos de vacunas así como en investigación, diagnóstico, etc. Otros numerosos beneficios resultarán evidentes tras la revisión de lo siguiente.

Sumario de la invención

En algunos aspectos en el presente documento, la invención comprende un virus influenza reordenante 6:2, en el que dicho virus comprende 6 segmentos de genoma internos de uno o más virus donadores distintos de A/Ann Arbor/6/60 y 2 segmentos de genoma de antígeno de superficie, en el que los segmentos de genoma de antígeno de superficie codifican para un polipéptido HA y uno de NA, en el que el segmento de genoma de antígeno de superficie que codifica para el polipéptido de HA produce un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83.

La invención proporciona un virus influenza reordenante que incluye un polipéptido de HA que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83. Se proporciona un virus influenza reordenante según la reivindicación 1 para su uso en métodos para estimular el sistema inmunitario de un individuo para producir una respuesta inmunitaria protectora frente a virus influenza, a través de la administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de tal virus influenza recombinante en un portador fisiológicamente aceptable, también son parte de la invención. Tal virus puede comprender opcionalmente un virus reordenante 6:2 con 6 genes que codifican para regiones de uno o más virus donadores (por ejemplo A/AA/6/60, B/Ann Arbor/1/66, A/Puerto Rico/8/34, que se conoce más comúnmente como PR8), B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 o B/England/2608/76 y 2 regiones codificantes génicas que codifican para HA y NA, por ejemplo SEQ ID NO:35. Composiciones inmunogénicas que comprenden tal virus reordenante (recombinante) también son características de la invención.

Los virus de reordenamiento (opcionalmente virus vivos) de la invención pueden incluir virus donadores que son uno

o más de, por ejemplo, sensibles a la temperatura (ts), adaptados al frío (ca) o atenuados (att). Por ejemplo, los virus de reordenamiento pueden comprender, por ejemplo, A/Ann Arbor/6/60, B/Ann Arbor/1/66, A/Puerto Rico/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 o B/England/2608/76, etc. En muchas realizaciones, los virus producidos son virus vivos (por ejemplo, que van a usarse en vacunas, etc.). Otras realizaciones incluyen virus muertos o inactivados (por ejemplo, que también pueden usarse en vacunas, etc.). Células que comprenden cualquiera de los virus anteriores también son productos de la invención.

Métodos de producción de virus influenza reordenante/recombinante a través del cultivo de una célula huésped que alberga un virus influenza en un medio de cultivo adecuado en condiciones que permiten la expresión de ácido

nucleico; y aislamiento y recuperación del virus influenza recombinante de uno o más de la célula huésped o el medio también son parte de la invención. Por tanto, la introducción de una pluralidad de vectores que tienen un genoma de virus influenza en una población de células huésped en la que los vectores comprenden al menos 6 segmentos de genoma internos de una primera cepa de influenza (de nuevo, por ejemplo, B/AA/1/66, A/PR/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 o B/England/2608/76, etc.) y al menos uno (y preferiblemente dos) segmentos de genoma se seleccionan de una segunda cepa de influenza, segmentos de genoma que comprenden el polinucleótido de SEQ ID NO: 35 o un polinucleótido que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83. Preferiblemente, la primera cepa de virus está adaptada al frío y/o es sensible a la temperatura y/o está atenuada. También preferiblemente, tales virus son adecuados para su administración como parte de una formulación de vacuna intranasal. Por supuesto, otras realizaciones son adecuadas para su administración como formulaciones de vacunas desactivadas o inactivadas, formulaciones de vacunas no nasales vivas/atenuadas, etc. Los vectores en tales métodos pueden comprender virus influenza A y/o virus influenza B. Las células huésped para tales métodos pueden comprender opcionalmente, por ejemplo, células Vero, células PerC6, células MDCK, células 293T, células COS, etc. Las realizaciones típicas no comprenden virus auxiliares en el método y aún otras realizaciones típicas comprenden vectores de ocho plásmidos que contienen el genoma de influenza.

En otras realizaciones en el presente documento, la invención comprende composiciones inmunogénicas que tienen una cantidad inmunológicamente eficaz del virus influenza recombinante descrito anteriormente (por ejemplo, un virus vivo). Otras realizaciones incluyen virus para su uso en métodos para estimular el sistema inmunitario de un individuo para que produzca una respuesta inmunitaria protectora frente a virus influenza administrando al individuo una cantidad inmunológicamente eficaz del virus influenza recombinante descrito anteriormente (opcionalmente en un portador fisiológicamente eficaz).

Otros aspectos de la invención incluyen métodos de producción de un polipéptido aislado o recombinante cultivando cualquier célula huésped anterior, en un medio de cultivo adecuado en condiciones que permiten la expresión de ácido nucleico, y aislando el polipéptido de uno o más de la célula huésped o el medio en el que se hace crecer.

También están incluidos en la invención métodos de producción de una vacuna de virus influenza. Por ejemplo, la invención incluye introducir una pluralidad de vectores (por ejemplo, vectores de plásmido) que comprenden un genoma de influenza (por ejemplo, influenza A o B) en una población de células huésped que pueden soportar la replicación de tal virus, cultivar las células, recuperar una pluralidad de virus influenza y proporcionar uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables con tal virus a un individuo (por ejemplo, uno que necesita tal tratamiento). Tales virus pueden estar opcionalmente adaptados al frío y/o ser sensibles a la temperatura y/o estar atenuados y preferiblemente son adecuados para su administración en una formulación de vacuna intranasal. Tales métodos pueden incluir aquéllos en los que los vectores tienen al menos 6 segmentos de genoma internos de una primera cepa de influenza y al menos un segmento de genoma (y preferiblemente 2 segmentos) de otra cepa de influenza (por ejemplo, con una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 1-48 o de cepas similares a las mismas, etc.) segmento que codifica opcionalmente para un antígeno de superficie de influenza inmunogénico de la segunda cepa de influenza.

Virus para su uso en métodos de producción de respuestas inmunogénicas en un sujeto a través de la administración de una cantidad eficaz de cualquiera de los virus anteriores a un sujeto también están dentro de la invención actual. Adicionalmente, virus para su uso en métodos de tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección viral (por ejemplo, gripe viral) en un sujeto a través de la administración de uno o más virus descritos anteriormente en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunogénica frente a la infección viral también son parte de la invención actual. Los sujetos para tal tratamiento pueden incluir mamíferos (por ejemplo, seres humanos). Tales métodos también pueden comprender la administración in vivo al sujeto así como la administración in vitro o ex vivo a una o más células del sujeto. Adicionalmente, tales métodos pueden comprender también la administración de una composición del virus y un excipiente farmacéuticamente aceptable que se administra al sujeto en una cantidad eficaz para tratar profiláctica o terapéuticamente la infección viral.

La invención también comprende polinucleótidos que codifican para un polinucleótido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 y un virus donador maestro seleccionado, normalmente en los que la secuencia de polinucleótido anterior y el virus donador maestro comprenden un reordenamiento 6:2, es decir, la HA y NA en el presente documento reordenadas con los otros seis genes de influenza del virus donador. Tales virus donadores son normalmente las cepas de influenza ca, att, ts. Por ejemplo, las cepas donadoras normalmente pueden incluir, por ejemplo, A/Ann Arbor/6/60, B/Ann Arbor/1/66, A/Puerto Rico/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 o B/England/2608/76 y variantes de las mismas. Los expertos en la técnica apreciarán que las cepas donadoras normalmente pueden variar de reordenante a reordenante. Por tanto, esas variaciones también están abarcadas dentro de la invención actual. Otro elemento de la invención comprende una o más vacunas contra la gripe vivas atenuadas que comprenden tales composiciones, por ejemplo, las que tienen secuencias en el presente documento reordenadas de una manera 6:2 con un virus donador maestro seleccionado.

Otros aspectos de la invención incluyen composiciones de materia que comprenden un polinucleótido de hemaglutinina y/o un polinucleótido de neuraminidasa reordenado con uno o más virus donadores maestros, de

nuevo normalmente un virus influenza ca, att, ts, en los que la secuencia de polinucleótido de HA comprende SEQ ID NO: 35. Tal polinucleótido de hemaglutinina y/o neuraminidasa se determina normalmente que está “dentro de la misma cepa” cuando produce un título que está dentro de un intervalo de cuatro veces de otro virus (por ejemplo, los que tienen las secuencias enumeradas en el presente documento) tal como se mide mediante un ensayo de inhibición de hemaglutinina. Sin embargo, tal como se describe a continuación, también pueden utilizarse otros ensayos comunes para determinar si los polinucleótidos (es decir, virus que comprenden los mismos) están dentro de la misma cepa.

Estos y otros objetos y características de la invención resultarán más completamente evidentes más cuando se lea la siguiente descripción detallada conjuntamente con las figuras y reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 presenta las secuencias de ácido nucleico y polipéptido de la hemaglutinina variante de la invención.

La figura 2 presenta identificadores de secuencia y el nombre de la cepa de las secuencias de hemaglutinina variante tal como se encuentran en la figura 1.

Descripción detallada

La presente invención incluye secuencias de polinucleótido y polipéptido de hemaglutinina de influenza para su uso en virus, vacunas, composiciones y similares que comprenden tales secuencias y métodos para su uso. Se describen características adicionales de la invención en más detalle en el presente documento.

DEFINICIONES

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece la invención. Las siguientes definiciones complementan a aquéllas en la técnica y se refieren a la solicitud actual y no deben imputarse necesariamente a cualquier caso relacionado o no relacionado, por ejemplo, a cualquier solicitud o patente de titularidad conjunta. Aunque puede usarse en la práctica cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento para someter a prueba la presente invención, en el presente documento se describen los materiales y métodos preferidos. Por consiguiente, la terminología usada en el presente documento es para el fin de describir realizaciones particulares sólo, y no pretende ser limitativa. Se definen y describen a lo largo de todo el documento términos adicionales.

Tal como se usan en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un/o”, “una” y “el/la” incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “un virus” incluye una pluralidad de virus; la referencia a una “célula huésped” incluye mezclas de células huésped, y similares.

Los términos “ácido nucleico”, “polinucleótido”, “secuencia de polinucleótido” y “secuencia de ácido nucleico” se refieren a polímeros de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos monocatenarios o bicatenarios, quimeras o análogos de los mismos, o a una sucesión de caracteres que representan a los mismos, dependiendo del contexto. Tal como se usa en el presente documento, el término incluye opcionalmente polímeros de análogos de nucleótidos que se producen de manera natural que tienen la naturaleza esencial de nucleótidos naturales porque se hibridan con ácidos nucleicos monocatenarios de manera similar a nucleótidos que se producen de manera natural (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos). A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular de esta invención abarca opcionalmente secuencias complementarias además de la secuencia indicada explícitamente. A partir de cualquier secuencia de polinucleótido especificada, puede determinarse o bien el ácido nucleico dado o bien la secuencia de polinucléotido complementaria (por ejemplo, el ácido nucleico complementario).

El término “ácido nucleico” o “polinucleótido” también abarca cualquier sucesión física de unidades monoméricas que puede corresponderse con una sucesión de nucleótidos, incluyendo un polímero de nucleótidos (por ejemplo, un polímero de ADN o ARN típico), PNA, oligonucleótidos modificados (por ejemplo, oligonucleótidos que comprenden bases que no son típicas para ARN o ADN biológico en disolución, tales como oligonucleótidos metilados en 2’-O), y similares. Un ácido nucleico puede ser, por ejemplo, monocatenario o bicatenario.

Una “subsecuencia” es cualquier parte de una secuencia entera, hasta e incluyendo la secuencia completa. Normalmente, una subsecuencia comprende menos que la secuencia de longitud completa. Una “subsecuencia única” es una subsecuencia que no se encuentra en ninguna secuencia de polipéptido o polinucleótido de influenza determinada previamente. La fase “sustancialmente idéntico”, en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos (por ejemplo, ADN que codifican para una molécula de HA o NA, o la secuencia de aminoácidos de una molécula de HA o NA) se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen una identidad de residuos de aminoácido o nucleótido de al menos aproximadamente el 90%, preferiblemente el 91%, lo más preferiblemente el 92%, el 93%, el

94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 98,5%, el 99%, el 99,1%, el 99,2%, el 99,3%, el 99,4%, el 99,5%, el 99,6%, el 99,7%, el 99,8%, el 99,9% o más, cuando se comparan y alinean para obtener una correspondencia máxima, tal como se mide usando un algoritmo de comparación de secuencias o mediante inspección visual.

El término “variante” con respecto a un polipéptido se refiere a una secuencia de aminoácidos que está alterada en uno o más aminoácidos con respecto a una secuencia de referencia. La variante puede tener cambios “conservativos”, en los que un aminoácido sustituido tiene propiedades químicas o estructurales similares, por ejemplo, reemplazo de leucina por isoleucina. Alternativamente, una variante puede tener cambios “no conservativos”, por ejemplo, reemplazo de una glicina por un triptófano. La variación minoritaria análoga también puede incluir deleción o inserción de aminoácidos, o ambas. Puede encontrarse orientación sobre la determinación de qué residuos de aminoácido pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin eliminar la actividad biológica o inmunológica usando programas informáticos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el software DNASTAR. En el presente documento también se describen ejemplos de sustituciones conservativas.

El término “gen” se usa ampliamente para referirse a cualquier ácido nucleico asociado con una función biológica. Por tanto, los genes incluyen secuencias codificantes y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. El término “gen” se aplica a una secuencia genómica específica, así como a un ADNc o a un ARNm codificado por esa secuencia genómica.

Los polipéptidos de “neuraminidasa” de la invención muestran reactividad cruzada inmunológica con una o más moléculas de neuraminidasa conocidas de un virus influenza. La bibliografía está repleta de tales neuraminidasas conocidas (por ejemplo, en GenBank, en publicaciones del CDC, etc.). De manera similar, los polipéptidos de “hemaglutinina” de la invención muestras reactividad cruzada inmunológica con una o más moléculas de hemaglutinina conocidas de un virus influenza. De nuevo, la bibliografía está repleta de ejemplos de tales moléculas de hemaglutinina conocidas.

Los genes también incluyen segmentos de ácido nucleico no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Las secuencias reguladoras no expresadas incluyen “promotores” y “potenciadores”, a los que se unen proteínas reguladoras tales como factores de transcripción, dando como resultado la transcripción de secuencias adyacentes o cercanas. Un promotor o potenciador “específico de tejido” es uno que regula la transcripción en un tipo de célula o tipo de tejido específico, o tipos.

La “expresión de un gen” o la “expresión de un ácido nucleico” significa normalmente la transcripción de ADN en ARN (incluyendo opcionalmente la modificación del ARN, por ejemplo, corte y empalme) o la transcripción de ARN en ARNm, la traducción de ARN en un polipéptido (incluyendo posiblemente la modificación posterior del polipéptido, por ejemplo, modificación postraduccional), o tanto transcripción como traducción, tal como esté indicado por el contexto.

Un “marco de lectura abierto” u “ORF” es un posible marco de lectura traduccional de ADN o ARN (por ejemplo, de un gen), que puede traducirse en un polipéptido. Es decir, el marco de lectura no está interrumpido por codones de terminación. Sin embargo, debe observarse que el término ORF no indica necesariamente que el polipéptido, de hecho, se traduce en un polipéptido.

El término “vector” se refiere a los medios mediante los cuales puede propagarse y/o transferirse un ácido nucleico entre organismos, células o componentes celulares. Los vectores incluyen plásmidos, virus, bacteriófagos, provirus, fagémidos, transposones, cromosomas artificiales, y similares, que se replican de manera autónoma o pueden integrarse en un cromosoma de una célula huésped. Un vector también puede ser un polinucleótido de ARN desnudo, un polinucleótido de ADN desnudo, un polinucleótido compuesto tanto por ADN como por ARN dentro de la misma hebra, un ADN o ARN conjugado con poli-lisina, un ADN o ARN conjugado con péptidos, un ADN conjugado con liposomas, o similares, que no son de replicación autónoma. En muchas, pero no todas, las realizaciones comunes, los vectores de la presente invención son plásmidos.

Un “vector de expresión” es un vector, tal como un plásmido, que puede promover la expresión, así como la replicación de un ácido nucleico incorporado en el mismo. Normalmente, el ácido nucleico que va a expresarse está “operativamente unido” a un promotor y/o potenciador, y se somete al control de regulación de la transcripción por el promotor y/o potenciador.

Un “vector de expresión bidireccional” normalmente se caracteriza por dos promotores alternativos orientados en sentidos opuestos en relación con un ácido nucleico situado entre los dos promotores, de manera que puede iniciarse la expresión en ambas orientaciones dando como resultado, por ejemplo, la transcripción de ARN tanto de hebra positiva (+) o sentido, como de hebra negativa (-) o antisentido.

Una “secuencia de aminoácidos” es un polímero de residuos de aminoácido (una proteína, polipéptido, etc.) o una sucesión de caracteres que representan un polímero de aminoácido, dependiendo del contexto.

Un “polipéptido” es un polímero que comprende dos o más residuos de aminoácido (por ejemplo, un péptido o una

proteína). El polímero puede comprender opcionalmente modificaciones tales como glicosilación o similares. Los residuos de aminoácido del polipéptido pueden ser naturales o no naturales y pueden estar no sustituidos, no modificados, sustituidos o modificados.

En el contexto de la invención, el término “aislado” se refiere a un material biológico, tal como un virus, un ácido nucleico o una proteína, que está sustancialmente libre de componentes normalmente lo acompañan o interaccionan con el mismo en el entorno en que se produce de manera natural. El material biológico aislado comprende opcionalmente material adicional no encontrado con el material biológico en su entorno natural, por ejemplo, una célula o un virus de tipo natural. Por ejemplo, si el material está en su entorno natural, tal como una célula, el material puede haberse colocado en esa ubicación en la célula (por ejemplo, genoma o elemento genético) no nativa para tal material encontrado en ese entorno. Por ejemplo, un ácido nucleico que se produce de manera natural (por ejemplo, una secuencia codificante, un promotor, un potenciador, etc.) se aísla si se introduce por medios que no se producen de manera natural en un locus del genoma (por ejemplo, un vector, tal como un plásmido o vector viral, o amplicón) no nativo para ese ácido nucleico. Tales ácidos nucleicos también se denominan ácidos nucleicos “heterólogos”. Un virus aislado, por ejemplo, está en un entorno (por ejemplo, un sistema de cultivo celular, o purificado a partir de cultivo celular) distinto del entorno nativo del virus de tipo natural (por ejemplo, la nasofaringe de un individual infectado).

El término “quimérico” o “quimera”, cuando se hace referencia a un virus, indica que el virus incluye componentes genéticos y/o de polipéptido derivados de más de una fuente o cepa viral parental. De manera similar, el término “quimérico” o “quimera”, cuando se hace referencia a una proteína viral, indica que la proteína incluye componentes de polipéptido (es decir, subsecuencias de aminoácidos) derivados de más de una fuente o cepa viral parental. Tal como resultará evidente en el presente documento, tales virus quiméricos son normalmente virus reordenantes/recombinantes. Por tanto, en algunas realizaciones, una quimera puede incluir opcionalmente, por ejemplo, una secuencia (por ejemplo, de HA y/o NA) de un virus influenza A colocada en una estructura principal compuesta por, o construida/derivada de un virus influenza B (por ejemplo, B/AA/1/66, etc.) o una secuencia de virus influenza B colocada en una estructura principal de virus influenza A (es decir, virus donador) tal como, por ejemplo, A/AA/6/60, etc.

El término “recombinante” indica que el material (por ejemplo, un ácido nucleico o una proteína) se ha alterado artificial o sintéticamente (de manera no natural) mediante intervención humana. La alteración puede realizarse en el material dentro de, o retirado de, su estado o entorno natural. Específicamente, por ejemplo, un virus influenza es recombinante cuando se produce mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante. Por ejemplo, un “ácido nucleico recombinante” es uno que se prepara recombinando ácidos nucleicos, por ejemplo, durante la clonación, el intercambio de ADN u otros procedimientos, o mediante mutagénesis química u otra; un “polipéptido recombinante”

o “proteína recombinante” es un polipéptido o una proteína que se produce mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante; y un “virus recombinante”, por ejemplo, un virus influenza recombinante, se produce mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante.

El término “reordenante”, cuando se hace referencia a un virus (normalmente en el presente documento, un virus influenza), indica que el virus incluye componentes genéticos y/o de polipéptido derivados de más de una fuente o cepa viral parental. Por ejemplo, un reordenante 6:2 incluye 6 segmentos genómicos, lo más comúnmente los 6 genes internos de un primer virus parental y dos segmentos complementarios, por ejemplo, SEQ ID NO: 83 de hemaglutinina y neuraminidasa, a partir de uno o más virus parentales diferentes. Los virus reordenantes también pueden denominarse, dependiendo del contexto en el presente documento, “químéricos” y/o “recombinantes”.

El término “introducido” cuando se hace referencia a un ácido nucleico heterólogo o aislado se refiere a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, en el que el ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plastidio o ADN mitocondrial), puede convertirse en un replicón autónomo o puede expresarse de manera transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado). El término incluye métodos tales como “infección”, “transfección”, “transformación” y “transducción”. En el contexto de la invención, puede emplearse una variedad de métodos para introducir ácidos nucleicos en células, incluyendo electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por lípidos (lipofección), etc.

El término “célula huésped” significa una célula que contiene un ácido nucleico heterólogo, tal como un vector o un virus, y que soporta la replicación y/o expresión del ácido nucleico. Las células huésped pueden ser células procariotas tales como E. coli, o células eucariotas tales como células de levaduras, insectos, anfibios, aves o mamíferos, incluyendo células humanas. Las células huésped a modo de ejemplo pueden incluir, por ejemplo, células Vero (de riñón de mono verde africano), células BHK (de riñón de cría de hámster), células primarias de riñón de pollo (PCK), células de riñón canino Madin-Darby (MDCK), células de riñón bovino Madin-Darby (MDBK), células 293 (por ejemplo, células 293T) y células COS (por ejemplo, células COS1, COS7), etc. En otras realizaciones, las células huésped pueden incluir opcionalmente huevos (por ejemplo, huevos de gallina, huevos de gallina embrionados, etc.).

Una “cantidad inmunológicamente eficaz” de virus influenza es una cantidad suficiente para potenciar la respuesta inmunitaria propia de un individuo (por ejemplo, de un ser humano) frente a una exposición posterior a virus

influenza. Los niveles de inmunidad inducida pueden monitorizarse, por ejemplo, midiendo las cantidades de anticuerpos séricos y/o secretores neutralizantes, por ejemplo, mediante el ensayo de neutralización de placas, de fijación del complemento, de inmunoabsorción ligado a enzimas o de microneutralización.

Una “respuesta inmunitaria protectora” frente a virus influenza se refiere a una respuesta inmunitaria presentada por un individuo (por ejemplo, un ser humano) que es protectora frente a la enfermedad cuando el individuo se expone posteriormente a y/o se infecta con virus influenza de tipo natural. En algunos casos, el virus influenza de tipo natural (por ejemplo, circulante de manera natural) puede provocar todavía infección, pero no puede provocar una infección grave o potencialmente moral. Normalmente, la respuesta inmunitaria protectora da como resultados niveles detectables de anticuerpos secretores y séricos engendrados por el huésped que pueden neutralizar virus del mismo subgrupo y/o cepa (y posiblemente también de un subgrupo y/o cepa diferente, no de vacuna) in vitro e in vivo.

Tal como se usa en el presente documento, un “anticuerpo” es una proteína que comprende uno o más polipéptidos sustancial o parcialmente codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen los genes de región constante kappa, lambda, alfa, gamma, delta, épsilon y mu, así como miles de genes de región variable de inmunoglobulina. Las cadenas ligeras se clasifican como o bien kappa o bien lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon, que definen a su vez las clases de inmunoglobulinas, IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Una unidad estructural de inmunoglobulina (anticuerpo) típica comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, teniendo cada par una cadena “ligera” (de aproximadamente 25 kD) y una “pesada” (de aproximadamente 50-70 kD). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 aminoácidos o más, responsable principalmente del reconocimiento del antígeno. Los términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligera y pesada respectivamente. Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como varios fragmentos bien caracterizados producidos mediante digestión con diversas peptidasas. Por tanto, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo por debajo de las uniones disulfuro en la región bisagra para producir F(ab)’2, un dímero de Fab que en sí mismo es una cadena ligera unida a VH-CH1 por un enlace disulfuro. El F(ab)’2 puede reducirse en condiciones suaves para romper la unión disulfuro en la región bisagra convirtiendo de ese modo el dímero (Fab’)2 en un monómero Fab’. El monómero Fab’ es esencialmente un Fab con parte de la región bisagra (véase Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999) para una descripción más detallada de otros fragmentos de anticuerpo). Aunque se definen diversos fragmentos de anticuerpo en cuanto a la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que tales fragmentos Fab’ pueden sintetizarse de novo o bien químicamente o bien utilizando metodología de ADN recombinante. Por tanto, el término anticuerpo, tal como se usa en el presente documento, incluye anticuerpos o fragmentos o bien producidos mediante la modificación de anticuerpos completos o bien sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante. Los anticuerpos incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos de cadena sencilla o múltiple, incluyendo anticuerpos Fv de cadena sencilla (sFv o scFv) en los que se unen entre sí una cadena ligera variable y una pesada variable (directamente o a través de un ligador peptídico) para formar un polipéptido continuo, y anticuerpos humanizados o quiméricos.

VIRUS INFLUENZA

Los polipéptidos y polinucleótidos de la invención son variantes de HA de influenza. En general, los virus influenza están constituidos por un núcleo de ribonucleoproteína interno que contiene un genoma de ARN monocatenario segmentado y una envuelta de lipoproteína externa revestida por una proteína de matriz. El genoma de virus influenza está compuesto por ocho segmentos de ácido ribonucleico (ARN) de hebra (-) lineal, que codifica para las proteínas hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) inmunogénicas, y seis polipéptidos de núcleo interno: la nucleoproteína de la nucleocápsida (NP); proteínas de la matriz (M); proteínas no estructurales (NS); y 3 proteínas ARN polimerasa (PA, PB1, PB2). Durante la replicación, el ARN viral genómico se transcribe en ARN mensajero de hebra (+) y ARNc genómico de hebra (-) en núcleo de la célula huésped. Cada uno de los ocho segmentos genómicos se empaqueta para dar complejos de ribonucleoproteína que contienen, además del ARN, NP y un complejo de polimerasa (PB1, PB2 y PA). La molécula de hemaglutinina consiste en una glicoproteína de superficie y actúa uniéndose a ácido N-acetilneuramínico (NeuNAc), también conocido como ácido siálico, en receptores de superficie de la célula huésped. En algunas realizaciones en el presente documento, los polipéptidos de la invención (y polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la invención) pueden actuar uniéndose a NeuNAc ya sea in vitro o in vivo. Tal acción también puede realizarse en algunas realizaciones por fragmentos de hemaglutinina que conservan la actividad de hemaglutinina. La hemaglutinina está constituida por dos subunidades, HA1 y HA2 y la estructura entera tiene aproximadamente 550 aminoácidos de longitud y aproximadamente 220 kD. Las moléculas de neuraminidasa escinden residuos de ácido siálico terminales de receptores de superficie celular de virus influenza, liberando de ese modo viriones desde células infectadas. La neuraminidasa también elimina ácido siálico de moléculas de hemaglutinina y neuraminidasa recién producidas. En algunas realizaciones en el presente documento, los polipéptidos de la invención (y polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la invención) pueden actuar escindiendo residuos de ácido siálico ya sea in vitro o in vivo. Esta acción también puede realizarse en algunas realizaciones por fragmentos de neuraminidasa que conservan la actividad de neuraminidasa. Los polipéptidos de neuraminidasa de la invención muestran reactividad cruzada inmunológica con una o más moléculas de neuraminidasa conocidas de un virus influenza. La bibliografía está repleta de ejemplos de tales neuraminidasas

conocidas (por ejemplo, en GenBank, en publicaciones del CDC, etc.). De manera similar, los polipéptidos de hemaglutinina de la invención muestran reactividad cruzada inmunológica con una o más moléculas de hemaglutinina conocidas de un virus influenza. De nuevo, la bibliografía está repleta de ejemplos de tales moléculas de hemaglutinina conocidas.

Influenza se agrupa comúnmente en las categorías influenza A e influenza B, así como una categoría influenza C normalmente menos importante. Los virus influenza A e influenza B contienen cada uno ocho segmentos de ARN monocatenario con polaridad negativa. El genoma de influenza A genoma codifica para once polipéptidos. Los segmentos 1-3 codifican para tres polipéptidos, constituyendo una ARN polimerasa dependiente de ARN. El segmento 1 codifica para la proteína PB2 del complejo de polimerasa. Las proteínas de polimerasa restantes PB1 y PA están codificadas por el segmento 2 y el segmento 3, respectivamente. Además, el segmento 1 de algunas cepas de influenza codifica para una proteína pequeña, PB1-F2, producida a partir de un marco de lectura alternativo dentro de la región codificante de PB1. El segmento 4 codifica para la glicoproteína de superficie hemaglutinina (HA) implicada en la unión y la entrada celulares durante la infección. El segmento 5 codifica para el polipéptido de nucleoproteína de la nucleocápsida (NP), el principal componente estructural asociado con ARN viral. El segmento 6 codifica para una glicoproteína de la envuelta neuraminidasa (NA). El segmento 7 codifica para dos proteínas de la matriz, designadas como M1 y M2, que se traducen a partir de ARNm cortados y empalmados de manera diferencial. El segmento 8 codifica para NS1 y NS2, dos proteínas no estructurales, que se traducen a partir de variantes de ARNm cortadas y empalmadas de manera alternativa. Los ocho segmentos de genoma de influenza B codifican para 11 proteínas. Los tres genes más grandes codifican para componentes de la ARN polimerasa, PB1, PB2 y PA. El segmento 4 codifica para la proteína HA. El segmento 5 codifica para NP. El segmento 6 codifica para la proteína NA y la proteína NB. Ambas proteínas, NB y NA, se traducen a partir de marcos de lectura solapantes de un ARNm bicistrónico. El segmento 7 de influenza B también codifica para dos proteínas: M1 y BM2. El segmento más pequeño codifica para dos productos: NS1 se traduce a partir del ARN de longitud completa, mientras que NS2 se traduce a partir de una variante de ARNm cortada y empalmada.

Los tipos de influenza A y B están asociados normalmente con brotes de gripe en poblaciones humanas. Sin embargo, influenza de tipo A también infecta a otras criaturas además, por ejemplo, aves, cerdos y otros animales. Los virus de tipo A se clasifican en subtipos basándose en diferencias dentro de sus antígenos de glicoproteína de superficie de hemaglutinina y neuraminidasa. La hemaglutinina en virus de tipo A tiene 14 subtipos conocidos y la neuraminidasa tiene 9 subtipos conocidos. En seres humanos, actualmente sólo se conocen aproximadamente 3 subtipos de hemaglutinina diferentes y 2 de neuraminidasa diferentes, por ejemplo, H1, H2, H3, N1 y N2. En particular, dos subtipos principales de influenza A han estado activos en seres humanos, concretamente, H1N1 y H3N2. Sin embargo, H1N2 ha causado preocupación recientemente. Los virus influenza B no se dividen en subtipos basándose en sus proteínas hemaglutinina y neuraminidasa.

Las cepas de influenza diferentes pueden clasificarse basándose en, por ejemplo, la capacidad de influenza para aglutinar glóbulos rojos (RBC o eritrocitos). Anticuerpos específicos para cepas de influenza particulares pueden unirse al virus y, por tanto, impedir tal aglutinación. Los ensayos que determinan tipos de cepas basándose en tal inhibición se conocen normalmente como ensayos de inhibición de hemaglutinina (ensayos de HI o ensayos de HAI) y son métodos convencionales y bien conocidos en la técnica para caracterizar cepas de influenza. Por supuesto, los expertos en la técnica estarán familiarizados con otros ensayos, por ejemplo, ELISA, ensayos de anticuerpos fluorescentes indirectos, inmunohistoquímica, ensayos de inmunotransferencia de tipo Western, etc. con los que caracterizar cepas de influenza y el uso de y la discusión en el presente documento de ensayos de HI no debe interpretarse necesariamente como limitativos.

En resumen, en ensayos de HI típicos, se añaden sueros que van a usarse para el tipado o la clasificación, que se producen a menudo en hurones, a muestras de eritrocitos en diversas diluciones, por ejemplo, de 2 veces, etc. Se realiza entonces la determinación óptica de si los eritrocitos están agrupados entre sí (es decir, aglutinados) o están suspendidos (es decir, no aglutinados). Si las células no están agrupadas, entonces no se produjo aglutinación debido a la inhibición por los anticuerpos en los sueros que son específicos para ese virus influenza. Por tanto, se define que los tipos de virus influenza están dentro de la misma cepa. En algunos casos, se describe que una cepa es “similar” a la otra, por ejemplo, la cepa x es una cepa “similar a y”, etc. Por ejemplo, si dos muestras están dentro de cuatro veces el título de otra tal como se mide mediante un ensayo de HI, entonces puede describirse que pertenecen a la misma cepa (por ejemplo, que pertenecen ambas a la cepa “New Caledonia” o que son ambas cepas “similares a Moscow”, etc.). En otras palabras, las cepas se clasifican normalmente basándose en su perfil inmunológico o antigénico. Un título de HAI se define normalmente como la mayor dilución de un suero que inhibe completamente la hemaglutinación. Véase, por ejemplo, Schild, et al., Bull. Wld Hlth Org., 1973, 48:269-278, etc. De nuevo, los expertos en la técnica estarán bastante familiarizados con la categorización y clasificación de virus influenza en cepas y los métodos para hacer esto.

A partir de lo anterior se apreciará que la invención actual no sólo comprende las secuencias específicas enumeradas en el presente documento, sino también tales secuencias dentro de diversos vectores (por ejemplo, los usados para el rescate y reordenamiento de plásmidos, véase a continuación) así como secuencias de hemaglutinina y neuraminidasa dentro de las mismas cepas que las secuencias enumeradas en el presente documento. Además, también están incluidos esas mismas cepas que están dentro de diversos vectores (por

ejemplo, normalmente los usados para el rescate y reordenamiento de plásmidos tales como B/Ann Arbor/1/66, A/Puerto Rico/8/34, B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55 o B/England/2608/76, etc.).

Tal como se usa en el presente documento, el término “cepa similar” debe adoptarse para indicar que un primer virus influenza es de la misma cepa o una relacionada que un segundo virus influenza. En realizaciones típicas tal relación se determina comúnmente a través del uso de un ensayo de HAI. Virus influenza que se encuentran dentro de cuatro veces el título de otro en un ensayo de HAI son, por tanto, de una “cepa similar”. Sin embargo, los expertos en la técnica estarán familiarizados con otros ensayos, etc., para determinar cepas similares, por ejemplo, FRID, ensayos de neutralización, etc. La invención actual también comprende tales cepas similares (es decir, cepas similares a las presentes en la lista de secuencias en el presente documento) en los diversos plásmidos, vectores, virus, métodos, etc. en el presente documento. Por tanto, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, las descripciones en el presente documento de secuencias particulares (por ejemplo, aquéllas en la lista de secuencias)

o fragmentos de las mismas también debe considerarse que incluyen secuencias de cepas similares a esas (es decir, cepas similares a las cepas que tienen las secuencias en esos plásmidos, vectores, virus, etc. en el presente documento). Además, se apreciará que los polipéptidos de NA y HA dentro de tales cepas similares son, por tanto, “polipéptidos similares” cuando se comparan entre “cepas similares”.

VACUNAS DE VIRUS INFLUENZA

Las secuencias, composiciones y métodos en el presente documento se refieren principalmente, pero no sólo, a la producción de virus influenza para vacunas. Históricamente, se han producido vacunas de virus influenza principalmente en huevos de gallina embrionados usando cepas de virus seleccionadas o basadas en predicciones empíricas de cepas relevantes. Más recientemente, se han producido virus reordenantes que incorporan antígenos de hemaglutinina y/o neuraminidasa seleccionados en el contexto de una cepa maestra aprobada atenuada, sensible a la temperatura. Tras el cultivo del virus a través de múltiples pases en huevos de gallina, se recuperan los virus influenza y, opcionalmente, se inactivan, por ejemplo, usando formaldehído y/o β-propiolactona (o alternativamente se usan en vacunas vivas atenuadas). Por tanto, se apreciará que las secuencias de HA y NA (como en la invención actual) son bastante útiles en la construcción de vacunas contra la gripe.

Los intentos de producir vacunas recombinantes y reordenantes en cultivo celular se han visto dificultados por la incapacidad de algunas de las cepas aprobadas para la producción de vacunas para crecer eficazmente en condiciones de cultivo celular convencionales. Sin embargo, el trabajo previo de los inventores y sus colaboradores proporcionó un sistema de vectores, y métodos para producir virus recombinantes y reordenantes en cultivo, por tanto, haciendo posible producir rápidamente vacunas que corresponden a una o muchas cepas de virus antigénicas seleccionadas, por ejemplo, cepas o bien A o bien B, diversos subtipos o subcepas, etc., por ejemplo, que comprenden las secuencias de HA y NA en el presente documento. Véanse la solicitud estadounidense n.º 60/420.708, presentada el 23 de octubre de 2002, la solicitud estadounidense n.º 10/423.828, presentada el 25 de abril de 2003 y la solicitud estadounidense n.º 60/574.117, presentada el 24 de mayo de 2004, tituladas todas “Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus”. Normalmente, los cultivos se mantienen en un sistema, tal como un incubador de cultivo celular, bajo CO2 y humedad controlados, a temperatura constante usando un regulador de temperatura, tal como un termostato para garantizar que la temperatura no supera los 35ºC. Pueden obtenerse fácilmente virus influenza reordenantes introduciendo un subconjunto de vectores correspondientes a segmentos genómicos de un virus influenza maestro, en combinación con segmentos complementarios derivados de cepas de interés (por ejemplo, variantes antigénicas de HA y NA en el presente documento). Normalmente, las cepas maestras se seleccionan basándose en propiedades deseables relevantes para la administración de vacunas. Por ejemplo, para la producción de vacunas, por ejemplo, para la producción de una vacuna viva atenuada, la cepa de virus donador maestro puede seleccionarse por un fenotipo atenuado, adaptación al frío y/o sensibilidad a la temperatura. Tal como se explica en otra parte en el presente documento y, por ejemplo, en la solicitud de patente estadounidense n.º 10/423.828, etc., diversas realizaciones de la invención utilizan la cepa de influenza B/Ann Arbor/1/66 o A/Puerto Rico/8/34, o B/Leningrad/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/Leningrad/179/86, B/Leningrad/14/55, o B/England/2608/76 como “estructura principal” sobre la que añadir genes de HA y/o NA (por ejemplo, tales como las secuencias enumeradas en el presente documento, etc.) para crear virus reordenantes deseados. Por tanto, por ejemplo, en un reordenante 6:2, 2 genes (es decir, NA y HA) serían de la(s) cepa(s) de influenza frente a las que se desea una reacción inmunogénica, mientras que los otros 6 genes serían de otra cepa de estructura principal, etc. Por supuesto, se apreciará que las secuencias de HA y NA en el presente documento pueden reordenarse con varios otros genes de virus o tipos de virus (por ejemplo, varias “estructuras principales” diferentes tales como A/Puerto Rico/8/34, etc., que contienen los otros genes de influenza presentes en un reordenante, concretamente, los genes distintos de HA y distintos de NA). En los Estados Unidos, se autorizaron recientemente vacunas de virus influenza A vivas, atenuadas. Véase anteriormente. Tales vacunas son virus H1N1 y H1N2 reordenantes en los que los genes de proteínas internas de virus adaptado al frío (ca) A/Ann Arbor (AA)/6/60 (H2N2) confieren los fenotipos adaptado al frío, de atenuación y sensible a la temperatura del virus ca AA en los virus reordenantes (es decir, los que tienen los genes de hemaglutinina y neuraminidasa de la cepa distinta de Ann Arbor). Solo la HA o la NA no es de la cepa MDV o de estructura principal. Se ha notificado trabajo previo con cepas de virus donadores de estructura principal adecuadas que opcionalmente están dentro de diversas realizaciones de la invención actual. Véanse, por ejemplo, la solicitud estadounidense n.º 60/420.708, presentada el 23 de octubre de

2002, la solicitud estadounidense n.º 10/423.828, presentada el 25 de abril de 2003 y la solicitud estadounidense n.º 60/574.117, presentada el 25 de mayo de 2004, todas tituladas “Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus”; Maassab et al., J. of Inf. Dis., 1982, 146:780-790; Cox, et al., Virology, 1988, 167:554-567; Wareing et al., Vaccine, 2001, 19:3320-3330; Clements, et al., J Infect Dis., 1990, 161(5):869-77, etc.

En algunas realizaciones, las secuencias en el presente documento pueden tener opcionalmente regiones específicas eliminadas (en ambas de o en o bien la secuencia de ácido nucleico o bien la secuencia de aminoácidos). Por ejemplo, para las moléculas que tienen un sitio de escisión polibásico, tales sitios pueden eliminarse opcionalmente. Tales sitios de escisión, en algunas realizaciones en el presente documento, están, por ejemplo, modificados o alterados en sus secuencias en comparación con las secuencias de tipo natural de las que se derivan tales secuencias (por ejemplo, para inutilizar la escisión o reducir la escisión en las mismas, etc.). Tales modificaciones/alteraciones pueden ser diferentes en diferentes cepas o secuencias debido a las diversas secuencias de los sitios de escisión en las secuencias de partida. Por ejemplo, normalmente se eliminan 4 residuos polibásicos (RRKK) en algunas secuencias de HA (en comparación con el tipo natural). En diversas realizaciones, tales sitios de escisión polibásicos pueden modificarse de varios modos (todos los cuales están contenidos dentro de la invención). Por ejemplo, puede eliminarse un aminoácido del sitio de escisión polibásico de una vez (por ejemplo, un R eliminado, dos R eliminados, RRK eliminados o RRKK eliminados). Adicionalmente, también puede eliminarse

o alterarse un residuo de aminoácido directamente en el sentido de 5’ del sitio de escisión (por ejemplo, de un R a un T, etc.); además, también pueden modificarse los nucleótidos que codifican para el residuo de aminoácido directamente tras el sitio de escisión. Los expertos en la técnica estarán familiarizados con diversos métodos de eliminación de tales regiones específicas. Las secuencias acortadas resultantes también están contenidas dentro de la invención actual. Véase, por ejemplo, Li et al., J. of Infectious Diseases, 179:1132-8, 1999.

Los términos “sensible a la temperatura”, “adaptado al frío” y “atenuado” tal como se aplican a virus (usados normalmente como vacunas o para la producción de vacunas) que abarcan opcionalmente las secuencias actuales, se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, el término “sensible a la temperatura” (ts) indica, por ejemplo, que el virus presenta una reducción de 100 veces o mayor en el título a 39ºC en relación con 33ºC para cepas de influenza A, y que el virus presenta una reducción de 100 veces o mayor en el título a 37ºC en relación con 33ºC para cepas de influenza B. Por ejemplo, el término “adaptado al frío” (ca) indica que el virus presenta crecimiento a 25ºC dentro de 100 veces su crecimiento a 33ºC, mientras que el término “atenuado” (att) indica que el virus se replica en las vías respiratorias altas de hurones pero no es detectable en sus tejidos pulmonares, y no produce enfermedad pseudogripal en el animal. Se entenderá que los virus con fenotipos intermedios, es decir, virus que presentan reducciones del título inferiores a 100 veces a 39ºC (para virus de cepa A) o 37ºC (para virus de cepa B), o que presentan crecimiento a 25ºC que es más de 100 veces su crecimiento a 33ºC (por ejemplo, dentro de 200 veces, 500 veces, 1000 veces, 10.000 veces menos), y/o presentan crecimiento reducido en los pulmones en relación con el crecimiento en las vías respiratorias altas de hurones (es decir, parcialmente atenuado) y/o enfermedad pseudogripal reducida en el animal, también son virus útiles y pueden usare conjuntamente con las secuencias de HA y NA en el presente documento.

Por tanto, la presente invención puede utilizar el crecimiento, por ejemplo, en condiciones de cultivo apropiadas, de cepas de virus (virus influenza tanto de cepa A como de cepa B) con propiedades deseables en relación con la producción de vacunas (por ejemplo, fenotipo o patogenicidad atenuado, adaptación al frío, sensibilidad a la temperatura, etc.) in vitro en células en cultivo. Pueden producirse virus influenza introduciendo una pluralidad de vectores que incorporan segmentos de genoma viral clonados en células huésped, y cultivando las células a una temperatura que no supera los 35ºC. Cuando se transfectan vectores que incluyen un genoma de virus influenza, pueden recuperarse virus recombinantes adecuados como vacunas mediante procedimientos de purificación convencionales. Usando el sistema de vectores y los métodos de la invención, pueden producirse rápida y eficazmente en cultivo tisular virus reordenantes que incorporan los seis segmentos génicos internos de una cepa seleccionada por sus propiedades deseables con respecto a la producción de vacunas, y los segmentos de HA y NA inmunogénicos de una cepa seleccionada, por ejemplo, patógena tales como aquéllos en la lista de secuencias en el presente documento. Por tanto, el sistema y los métodos descritos en el presente documento son útiles para la producción rápida en cultivo celular de virus influenza A y B recombinantes y reordenantes, incluyendo virus adecuados para su uso como vacunas, incluyendo vacunas vivas atenuadas, tales como vacunas adecuadas para la administración intranasal.

En tales realizaciones, normalmente, se selecciona una única cepa de virus donador maestro (MDV) para cada uno de los subtipos A y B. En el caso de una vacuna viva atenuada, la cepa de virus donador maestro se elige normalmente por sus propiedades favorables, por ejemplo, sensibilidad a la temperatura, adaptación al frío y/o atenuación, en relación con la producción de vacunas. Por ejemplo, las cepas donadoras maestras a modo de ejemplo incluyen tales cepas sensibles a la temperatura, atenuadas y adaptadas al frío cepas de B/Ann Arbor/1/66, así como otras mencionadas a lo largo de todo el documento.

Por ejemplo, un virus donador maestro de tipo A (MDV-A), o virus donador maestro de tipo B (MDV-B) seleccionado se produce a partir de una pluralidad de ADNc virales clonados que constituyen el genoma viral. Las realizaciones incluyen aquéllas en las que se producen virus recombinantes a partir de ocho ADNc virales clonados. Se clonan opcionalmente ocho ADNc virales que representan las secuencias seleccionadas de o bien MDV-A o bien MDVB de

PB2, PB1, PA, NP, HA, NA, M y NS en un vector de expresión bidireccional, tal como un plásmido (por ejemplo, pAD3000), de manera que el ARN genómico viral puede transcribirse a partir de un promotor de ARN polimerasa I (pol I) a partir de una hebra y los ARNm virales pueden sintetizarse a partir de un promotor de ARN polimerasa II (pol II) a partir de la otra hebra. Opcionalmente, puede modificarse cualquier segmento génico, incluyendo el segmento de HA (por ejemplo, para eliminar el sitio de escisión multibásico (también conocido como sitio de escisión polibásico)).

Entonces pueden recuperarse virus MDV-A o MDV-B recombinantes infecciosos tras la transfección de plásmidos que llevan los ocho ADNc virales en células huésped apropiadas, por ejemplo, células Vero, células MDCK/293T o MDCK/COS7 cocultivadas. Usando los plásmidos y métodos descritos en el presente documento y, por ejemplo, en la solicitud estadounidense n.º 60/420.708, presentada el 23 de octubre de 2002, la solicitud estadounidense n.º 10/423.828, presentada el 25 de abril de 2003 y la solicitud estadounidense n.º 60/574.117, presentada el 24 de mayo de 2004, tituladas todas “Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus”; Hoffmann, E., 2000, PNAS, 97(11):6108-6113; la solicitud de patente estadounidense publicada n.º 20020164770 concedida a Hoffmann; y la patente estadounidense n.º 6.544.785 concedida el 8 de abril de 2003 a Palese, et al., la invención es útil, por ejemplo, para generar vacunas contra la gripe de reordenante 6:2 mediante cotransfección de los 6 genes internos (PB1, PB2, PA, NP, M y NS) del virus seleccionado (por ejemplo, MDV-A, MDV-B) junto con la HA y NA derivadas de virus influenza de tipo correspondiente diferente (A o B) por ejemplo, tal como se muestra en las listas de secuencias en el presente documento. Por ejemplo, el segmento de HA se selecciona favorablemente de una cepa H1, H3 o B relevante desde el punto de vista patógeno, tal como se realiza de manera rutinaria para la producción de vacunas. De manera similar, el segmento de HA puede seleccionarse de una cepa con relevancia emergente como cepa patógena tal como aquéllas en la lista de secuencias en el presente documento. Se apreciará, y tal como se detalla a lo largo de todo el documento, que las moléculas de la invención pueden combinarse opcionalmente en cualquier combinación deseada. Por ejemplo, las secuencias de HA y/o NA en el presente documento pueden colocarse, por ejemplo, en una estructura principal reordenante tal como B/AA/1/66, A/Puerto Rico/8/34 (es decir, PR8), etc., en reordenantes 6:2, etc. Por tanto, tal como se explica más completamente a continuación, habría 6 regiones génicas de estructura principal del virus donador y 2 regiones génicas de una segunda cepa (por ejemplo, una cepa de tipo natural, no el virus donador de estructura principal). Tales 2 regiones génicas son preferiblemente los genes de HA y NA. Además, se apreciará que las secuencias en el presente documento pueden combinarse de varios modos en diferentes realizaciones en el presente documento. Por tanto, cualquiera de las secuencias en el presente documento puede presentarse con otra secuencia de la invención en un reordenante 6:2. Dentro de tales reordenantes 6:2, cualquiera de las secuencias de la invención puede presentarse opcionalmente con cualquier otra secuencia de la invención. Sin embargo, las realizaciones típicas y preferidas comprenden HA y NA de las mismas cepas de tipo natural originales (o cepas de tipo natural modificadas tales como aquéllas con sitios de escisión polibásicos modificados). Por ejemplo, las realizaciones típicas pueden comprender un reordenante 6:2 que tiene 6 regiones génicas de un virus donador de estructura principal y las regiones génicas de HA y NA de la misma cepa tal como A/Shandong/9/93 ca o tanto HA como NA de A/Wuhan/395/95 ca o tanto HA como NA de B/Ann Arbor/1/94 ca (que normalmente, pero no de manera exclusiva, estaría presente dentro de un virus donador de estructura principal de influenza B tal como B/Ann Arbor/1/66, etc.), etc.

De nuevo, las secuencias de HA y NA de la invención actual se utilizan opcionalmente en tales vacunas de reordenamiento de plásmidos (y/o en otras vacunas y virus ts, cs, ca y/o att). Sin embargo, debe indicarse que las secuencias de HA y NA, etc. de la invención no se limitan a composiciones de vacuna o métodos de producción específicos, y, por tanto, pueden utilizarse en sustancialmente cualquier tipo de vacuna o método de producción de vacunas que utilice antígenos de HA y NA específicos de cepa (por ejemplo, las secuencias de la invención).

FLUMIST™

Tal como se mencionó anteriormente, existen numerosos ejemplos y tipos de vacuna contra la gripe. Una vacuna contra la gripe a modo de ejemplo es FluMist™ (MedImmune Vaccines Inc., Mt. Vista, CA) que es una vacuna viva, atenuada que protege a niños y adultos frente a la enfermedad de la gripe (Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children, N Engl J Med 338:1403-12; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial JAMA 282:137-44). En realizaciones típicas y preferidas, los métodos y las composiciones de la invención actual están preferiblemente adaptados/se usan con la producción de la vacuna FluMist™. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que las secuencias, los métodos, las composiciones, etc. en el presente documento también pueden adaptarse a la producción de vacunas virales similares o incluso diferentes.

Las cepas de vacuna FluMist™ contienen, por ejemplo, los segmentos génicos de HA y NA derivados de las cepas de tipo natural frente a las que se dirige la vacuna (o, en algunos casos, frente a cepas relacionadas) junto con seis segmentos génicos, PB1, PB2, PA, NP, M y NS, de un virus donador maestro (MDV) común. Las secuencias de HA y NA en el presente documento, por tanto, son parte opcionalmente de diversas formulaciones de FluMist™. Se creó el MDV para cepas de influenza A de FluMist™ (MDV-A) mediante pases en serie de la cepa de tipo natural A/Ann Arbor/6/60 (A/AA/6/60) en cultivo tisular de riñón de pollo primario a temperaturas sucesivamente inferiores (Maassab (1967) Adaptation and growth characteristics of influenza virus at 25 degrees C Nature 213:612-4). MDV-A

se replica de manera eficaz a 25ºC (ca, adaptado al frío), pero su crecimiento se restringe a 38 y 39ºC (ts, sensible a la temperatura). Adicionalmente, este virus no se replica en los pulmones de hurones infectados (att, atenuación). Se cree que el fenotipo ts contribuye a la atenuación de la vacuna en seres humanos restringiendo su replicación en todas las regiones, excepto en las más frías, de las vías respiratorias. La estabilidad de esta propiedad se ha demostrado en modelos animales y estudios clínicos. A diferencia del fenotipo ts de cepas de influenza creadas mediante mutagénesis química, la propiedad de ts de MDV-A no revertió tras el pase a través de hámsteres infectados o en aislados obtenidos de niños (para una revisión reciente, véase Murphy & Coelingh (2002) Principles underlying the development and use of live attenuated cold-adapted influenza A y B virus vaccines Viral Immunol 15:295-323).

Estudios clínicos en más de 20.000 adultos y niños que implicaron 12 cepas reordenantes 6:2 separadas han demostrado que estas vacunas son atenuadas, seguras y eficaces (Belshe et al. (1998) The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent, intranasal influenza virus vaccine in children, N Engl J Med 338:1405-12; Boyce et al. (2000) Safety and immunogenicity of adjuvanted and unadjuvanted subunit influenza vaccines administered intranasally to healthy adults, Vaccine 19:217-26; Edwards et al. (1994) A randomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines for the prevention of influenza A disease, J Infect Dis 169:68-76; Nichol et al. (1999) Effectiveness of live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial, JAMA 282:137-44). Los reordenantes que portan los seis genes internos de MDV-A y los dos segmentos génicos de HA y NA de un virus de tipo natural (es decir, un reordenante 6:2) mantienen de manera sistemática los fenotipos ca, ts y att (Maassab et al. (1982) Evaluation of a cold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets, J Infect Dis 146:780-900).

La producción de tales virus reordenados usando cepas de influenza B es más difícil; sin embargo, trabajos recientes (véanse, por ejemplo, la solicitud estadounidense n.º 60/420.708, presentada el 23 de octubre de 2002, la solicitud estadounidense n.º 10/423.828, presentada el 25 de abril de 2003 y la solicitud estadounidense n.º 60/574.117, presentada el 24 de mayo de 2004, tituladas todas “Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus”) han mostrado un sistema de ocho plásmidos para la generación de virus influenza B totalmente a partir de ADNc clonado. También se mostraron métodos para la producción de virus influenza A y B vivos atenuados adecuados para formulaciones de vacuna, tales como formulaciones de vacunas de virus vivos útiles para la administración intranasal.

El sistema y los métodos descritos anteriormente son útiles para la producción rápida en cultivo celular de virus influenza A y B recombinantes y reordenantes, incluyendo virus adecuados para su uso como vacunas, incluyendo vacunas vivas atenuadas, tales como vacunas adecuadas para la administración intranasal. Las secuencias, los métodos, etc. de la invención actual se usan opcionalmente junto con, o en combinación con, tales trabajos previos que implican, por ejemplo, virus influenza reordenados para la producción de vacunas para producir virus para vacunas.

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA LA ADMINISTRACIÓN PROFILÁCTICA DE VACUNAS

Tal como se estableció anteriormente, de manera alternativa, o además de su uso en la producción de la vacuna FluMist™, la invención actual puede usare en otras formulaciones de vacuna. En general, pueden administrarse profilácticamente virus recombinantes y reordenantes de la invención (por ejemplo, los que comprenden un polinucleótido de SEQ ID NO: 35 o un polipéptido de SEQ ID NO: 83) en una cantidad inmunológicamente eficaz y en un portador o excipiente apropiado para estimular una respuesta inmunitaria específica para una o más cepas de virus influenza tal como se determina mediante la secuencia de HA y/o NA. Normalmente, el portador o excipiente es un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril, solución salina acuosa, soluciones salinas tamponadas con fosfato, disoluciones acuosas de dextrosa, disoluciones acuosas de glicerol, etanol, líquido alantoideo de huevos de gallina no infectados (es decir, líquido alantoideo normal o NAF), o combinaciones de los mismos. La preparación de tales disoluciones garantizando su esterilidad, pH, isotonicidad y estabilidad se efectúa según protocolos establecidos en la técnica. Generalmente, se selecciona un portador o excipiente para minimizar los efectos alérgicos y otros efectos no deseados, y para adecuarse a la vía de administración particular, por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intranasal, etc.

Un aspecto relacionado de la invención proporciona virus para su uso en métodos para estimular el sistema inmunitario de un individuo para producir una respuesta inmunitaria protectora frente a virus influenza. En los métodos, se administra al individuo una cantidad inmunológicamente eficaz de un virus influenza recombinante (por ejemplo, una molécula de HA y/o una molécula de NA de la invención), una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido de la invención y/o una cantidad inmunológicamente eficaz de un ácido nucleico de la invención en un portador fisiológicamente aceptable.

Generalmente, los virus influenza de la invención se administran en una cantidad suficiente para estimular una respuesta inmunitaria específica para una o más cepas de virus influenza (es decir, frente a las cepas de HA y/o NA de la invención). Preferiblemente, la administración de los virus influenza provoca una respuesta inmunitaria protectora frente a tales cepas. Los expertos en la técnica conocen dosificaciones y métodos para provocar una respuesta inmunitaria protectora frente a una o más cepas de influenza. Véanse, por ejemplo, la patente

estadounidense n.º 5.922.326; Wright et al., Infect. Immun. 37:397-400 (1982); Kim et al., Pediatrics 52:56-63 (1973); y Wright et al., J. Pediatr. 88:931-936 (1976). Por ejemplo, se proporcionan virus influenza en el intervalo de aproximadamente 1-1000 DIH50 (dosis infecciosa humana), es decir, aproximadamente 105 -108 ufp (unidades formadoras de placas) por dosis administrada. Normalmente, la dosis se ajustará dentro de este intervalo basándose en por ejemplo, la edad, el estado físico, el peso corporal, el sexo, la dieta, el momento de administración y otros factores clínicos. La formulación de vacuna profiláctica se administra de manera sistémica, por ejemplo, mediante inyección subcutánea o intramuscular usando una aguja y una jeringa, o un dispositivo de inyección sin aguja. Alternativamente, la formulación de vacuna se administra por vía intranasal, o bien mediante gotas, aerosol de partículas grandes (mayores de aproximadamente 10 micrómetros) o bien pulverización en las vías respiratorias altas. Aunque cualquiera de las vías de administración anteriores da como resultado una respuesta inmunitaria sistémica protectora, la administración intranasal confiere el beneficio añadido de provocar inmunidad en la mucosa en el sitio de entada del virus influenza. Para la administración intranasal, a menudo se prefieren vacunas de virus vivos atenuados, por ejemplo, un virus influenza recombinante o reordenante atenuado, adaptado al frío y/o sensible a la temperatura. Véase anteriormente. Aunque se prefiere la estimulación de una respuesta inmunitaria protectora con una única dosis, pueden administrarse dosificaciones adicionales, por la misma vía o una diferente, para lograr el efecto profiláctico deseado.

Normalmente, el virus influenza recombinante atenuado de esta invención tal como se usa en una vacuna está suficientemente atenuado de manera que no se producirán síntomas de infección, o al menos síntomas de infección grave, en la mayoría de los individuos inmunizados (o infectados de otra forma) con el virus influenza atenuado. En algunos casos, el virus influenza atenuado puede ser capaz todavía de producir síntomas de enfermedad leve (por ejemplo, enfermedad leve de las vías respiratorias altas) y/o de diseminación a individuos no vacunados. Sin embargo, su virulencia está suficientemente suprimida de manera que no se producen infecciones graves de las vías respiratorias bajas en el huésped vacunado o accidental.

Alternativamente, puede estimularse una respuesta inmunitaria mediante selección como diana ex vivo o in vivo de células dendríticas con virus influenza que comprenden las secuencias en el presente documento. Por ejemplo, se exponen células dendríticas en proliferación a virus en una cantidad suficiente y durante un periodo de tiempo suficiente como para permitir la captura de los antígenos de influenza por las células dendríticas. Las células se transfieren entonces al sujeto que va a vacunarse mediante métodos de trasplante intravenoso convencionales.

Aunque se prefiere la estimulación de una respuesta inmunitaria protectora con una única dosis, pueden administrarse dosificaciones adicionales, por la misma o diferente vía, para lograr el efecto profiláctico deseado. En recién nacidos y lactantes, por ejemplo, pueden requerirse múltiples administraciones para provocar niveles de inmunidad suficientes. La administración puede continuar a intervalos a lo largo de toda la infancia, según sea necesario para mantener niveles de protección suficientes frente a la infección por virus influenza de tipo natural. De manera similar, los adultos que son particularmente susceptibles a la infección por virus influenza repetida o grave, tales como, por ejemplo, profesionales sanitarios, trabajadores de guarderías, miembros de la familia de niños pequeños, los ancianos e individuos con función cardiopulmonar comprometida pueden requerir múltiples inmunizaciones para establecer y/o mantener respuestas inmunitarias protectoras. Pueden monitorizarse los niveles de inmunidad inducida, por ejemplo, midiendo las cantidades de anticuerpos séricos y secretores neutralizantes, y ajustarse las dosificaciones o repetirse las vacunaciones según sea necesario para provocar y mantener niveles deseados de protección.

Opcionalmente, la formulación para la administración profiláctica de los virus influenza también contiene uno o más adyuvantes para potenciar la respuesta inmunitaria frente a los antígenos de influenza. Los adyuvantes adecuados incluyen: adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, saponina, geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite o hidrocarburo, bacilo de Calmette-Guerin (BCG), Corynebacterium parvum y los adyuvantes sintéticos QS-21 y MF59.

Si se desea, la administración de vacuna profiláctica de virus influenza puede realizarse conjuntamente con la administración de una o más moléculas inmunoestimuladoras. Las moléculas inmunoestimuladoras incluyen diversas citocinas, linfocinas y quimiocinas con actividades inmunoestimuladoras, inmunopotenciadoras y proinflamatorias, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); factores de crecimiento (por ejemplo, factor estimulante de colonias (CSF) de granulocitos-macrófagos (GM)); y otras moléculas inmunoestimuladoras, tales como factor inflamatorio de macrófagos, ligando de Flt3, B7.1; B7.2, etc. Las moléculas inmunoestimuladoras pueden administrarse en la misma formulación que los virus influenza, o pueden administrarse por separado. Puede administrarse o bien la proteína (por ejemplo, un polipéptido de HA y/o NA de la invención) o bien un vector de expresión que codifica para la proteína para producir un efecto inmunoestimulador.

Los métodos descritos anteriormente son útiles para tratar terapéutica y/o profilácticamente una enfermedad o trastorno, normalmente gripe, introduciendo un vector de la invención que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica para un polipéptido de HA y/o NA (o péptido) o ARN de HA y/o NA (por ejemplo, un ARN antisentido o ribozima) terapéutica o profilácticamente eficaz en una población de células diana in vitro, ex vivo o in vivo. Normalmente, el polinucleótido que codifica para el polipéptido (o péptido), o ARN, de interés está operativamente

unido a secuencias reguladoras apropiadas, por ejemplo, tal como se describe en el presente documento. Opcionalmente, se incorpora más de una secuencia codificante heteróloga en un único vector o virus. Por ejemplo, además de un polinucleótido que codifica para un ARN o polipéptido de HA y/o NA terapéutica o profilácticamente activo, el vector también puede incluir polipéptidos terapéuticos o profilácticos adicionales, por ejemplo, antígenos, moléculas coestimuladoras, citocinas, anticuerpos, etc., y/o marcadores, y similares.

Aunque la vacunación de un individuo con un virus influenza atenuado de una cepa particular de un subgrupo particular puede inducir protección cruzada frente a virus influenza de diferentes cepas y/o subgrupos, la protección cruzada puede potenciarse, si se desea, vacunando al individuo con virus influenza atenuado de al menos dos, al menos tres, o al menos cuatro cepas o subcepas de virus influenza, por ejemplo, al menos dos de las cuales pueden representar un subgrupo diferente. Por ejemplo, la vacunación de un individuo con al menos cuatro cepas o subcepas de virus influenza atenuado puede incluir la vacunación del individuo con al menos dos cepas o subcepas de virus influenza A y al menos dos cepas o subcepas de virus influenza B. La vacunación del individuo con las al menos cuatro cepas o subcepas de virus influenza atenuado puede incluir la vacunación del individuo con al menos tres cepas o subcepas de virus influenza A y al menos una cepa subcepa de virus influenza B. La vacunación del individuo con al menos cuatro cepas o subcepas de virus influenza puede requerir la administración de una única vacuna tetravalente que comprende todas de las al menos cuatro cepas o subcepas de virus influenza atenuado. La vacunación puede requerir alternativamente la administración de múltiples vacunas, cada una de las cuales comprende una, dos o tres de las cepas o subcepas de virus influenza atenuado. Adicionalmente, las combinaciones de vacunas pueden incluir opcionalmente mezclas de vacunas pandémicas y cepas no pandémicas. Las mezclas de vacunas (o vacunaciones múltiples) pueden comprender componentes de cepas humanas y/o cepas de influenza no humanas (por ejemplo, aviar y humana, etc.). De manera similar, las vacunas de virus influenza atenuados de esta invención pueden combinarse opcionalmente con vacunas que inducen respuestas inmunitarias protectoras frente a otros agentes infecciosos.

Vectores, promotores y sistemas de expresión

La presente invención incluye constructos recombinantes que incorporan una o más de las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento. Tales constructos incluyen opcionalmente un vector, por ejemplo, un plásmido, un cósmido, un fago, un virus, un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levaduras (YAC), etc., en el que se han insertado una o más de las secuencias de polinucleótido de la invención, por ejemplo, que comprenden SEQ ID NO: 35, en una orientación directa o inversa. Por ejemplo, el ácido nucleico insertado puede incluir una secuencia cromosómica viral o ADNc que incluye la totalidad o parte de al menos una de las secuencias de polinucleótido de la invención. En una realización, el constructo comprende además secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, operativamente unidas a la secuencia. Los expertos en la técnica conocen grandes números de vectores y promotores adecuados, y están disponibles comercialmente.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden estar incluidos en uno cualquiera de una variedad de vectores adecuados para generar ARN sentido o antisentido, y opcionalmente, productos de expresión de polipéptidos (o péptidos) (por ejemplo, una molécula de hemaglutinina y/o neuraminidasa de la invención, o fragmentos de hemaglutinina o neuraminidasa). Tales vectores incluyen secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; baculovirus; plásmidos de levaduras; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN viral tal como Vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, pseudorrabia, adenovirus, virus adenoasociado, retrovirus y muchos otros (por ejemplo, pCDL). Puede usarse cualquier vector que pueda introducir material genético en una célula y, si se desea replicación, que pueda replicarse en el huésped relevante.

En un vector de expresión, la secuencia de polinucleótido de HA y/o NA de interés está dispuesta físicamente en proximidad y orientación con respecto a una secuencia de control de la transcripción apropiada (por ejemplo, promotor, y opcionalmente, uno o más potenciadores) para dirigir la síntesis de ARNm. Es decir, la secuencia de polinucleótido de interés está operativamente unida a una secuencia de control de la transcripción apropiada. Los ejemplos de tales promotores incluyen: promotor de SV40 o LTR, promotor lac o trp de E. coli, promotor PL de fago lambda y otros promotores que se sabe que controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus.

Una variedad de promotores son adecuados para su uso en vectores de expresión para regular la transcripción de segmentos de genoma de virus influenza. En determinadas realizaciones, se utiliza el promotor de ARN polimerasa II (Pol II) dependiente de ADN de citomegalovirus (CMV). Si se desea, por ejemplo, para regular la expresión condicional, pueden sustituirse otros promotores que inducen la transcripción del ARN en las condiciones especificadas, o en las células o los tejidos especificados. Están disponibles numerosos promotores virales y de mamíferos, por ejemplo, humanos, o pueden aislarse según la aplicación específica contemplada. Por ejemplo, los promotores alternativos obtenidos a partir de los genomas de virus de animales y seres humanos incluyen promotores tales como los promotores de adenovirus (tales como adenovirus 2), virus del papiloma, virus de la hepatitis B, poliomavirus y virus del simio 40 (SV40), y diversos promotores retrovirales. Los promotores de mamíferos incluyen, entre muchos otros, el promotor de actina, promotores de inmunoglobulinas, promotores de choque térmico, y similares.

Diversas realizaciones de la invención actual pueden comprender varias construcciones de vectores diferentes. Tales construcciones se usan normal y preferiblemente en sistemas de rescate de plásmidos para crear virus para su uso en vacunas (por ejemplo, en vacunas vivas atenuadas, en vacunas desactivadas o inactivadas, etc.). Por tanto, la invención incluye moléculas de ADN recombinante que tienen un elemento de control de la transcripción que se une a ARN polimerasa dirigida por ADN que está operativamente unida a una secuencia de ADN que codifica para una molécula de ARN, en las que la molécula de ARN comprende un sitio de unión específico para una ARN polimerasa dirigida por ARN de un virus de ARN de hebra negativa, operativamente unida a una secuencia de ARN que comprende el complemento inverso de una secuencia codificante de ARNm de un virus de ARN de hebra negativa. Además, la invención incluye una molécula de ADN recombinante que, tras su transcripción, produce un molde de ARN que contiene una secuencia de ARN que comprende el complemento inverso de una secuencia codificante de ARNm de un virus de ARN de hebra negativa, y secuencias terminales de ARNv. La invención también incluye una molécula de ADN recombinante que, tras su transcripción, produce un molde de ARN replicable que comprende el complemento inverso de una secuencia codificante de ARNm de un virus de ARN de hebra negativa. Tales moléculas de ADN recombinante anteriores implican normalmente aquéllas en las que el virus de ARN de hebra negativa es virus influenza (por ejemplo, influenza A o B, etc.). Además, la molécula de ARN en tales realizaciones es normalmente un segmento de genoma de influenza y el molde de ARN es normalmente un segmento de genoma de influenza. Las moléculas de ADN recombinante comprenden normalmente aquéllas en las que el molde de ARN es replicable, en las que el virus de ARN de hebra negativa es virus influenza y en las que el molde de ARN es un segmento de genoma de influenza. Por tanto, los segmentos de influenza de ácidos nucleicos comprenden normalmente genes de HA y/o NA.

La invención también incluye métodos de preparación de una molécula de ARN que comprende transcribir una molécula de ADN recombinante con una ARN polimerasa dirigida por ADN, en los que la molécula de ADN comprende un elemento de control de la transcripción que se une a una ARN polimerasa dirigida por ADN que está operativamente unida a una secuencia de ADN que codifica para una molécula de ARN, en los que la molécula de ARN comprende un sitio de unión específico para una ARN polimerasa dirigida por ARN de un virus de ARN de hebra negativa, operativamente unida a una secuencia de ARN que comprende el complemento inverso de una secuencia codificante de ARNm de un virus de ARN de hebra negativa. La invención también incluye un método de preparación de una molécula de ARN que comprende transcribir una molécula de ADN recombinante con una ARN polimerasa dirigida por ADN, en el que la molécula de ADN recombinante produce, tras su transcripción, una molécula de ARN que contiene una secuencia de ARN que comprende el complemento inverso de una secuencia codificante de ARNm de un virus de ARN de hebra negativa, y secuencias terminales de ARNv. Además, la invención incluye un método de preparación de una molécula de ARN que comprende transcribir una molécula de ADN recombinante con una ARN polimerasa dirigida por ADN, en el que la molécula de ADN recombinante produce, tras su transcripción, una molécula de ARN replicable que comprende el complemento inverso de una secuencia codificante de ARNm de un virus de ARN de hebra negativa. Tales métodos comprenden normalmente aquéllos en los que el virus de ARN de hebra negativa es virus influenza, y en los que la molécula de ARN es un segmento de genoma de influenza. Tales métodos incluyen preferiblemente aquéllos en los que la ARN polimerasa dirigida por ADN es pol I, pol II, polimerasa de T7, polimerasa de T3 o polimerasa Sp6. Por tanto, de nuevo, los segmentos de ácido nucleico de influenza comprenden normalmente genes de HA y/o NA tal como se describe a lo largo de todo el documento.

Otros métodos dentro de la invención incluyen métodos de construcción de una molécula de ADN que comprende un elemento de control de la transcripción que se une a una ARN polimerasa dirigida por ADN que está operativamente unida a una secuencia de ADN que codifica para una molécula de ARN, en los que la molécula de ARN comprende un sitio de unión específico para una ARN polimerasa dirigida por ARN de un virus influenza, operativamente unida a una secuencia de ARN que comprende el complemento inverso de una secuencia codificante de ARNm de un virus influenza, en los que la secuencia de ADN comprende un ácido nucleico correspondiente a una o más de SEQ ID NO: 1-48 o un fragmento de las mismas o de una o más secuencias de ácido nucleico de una cepa similar (por ejemplo, una cepa similar a tales cepas que tienen las secuencias encontradas en las secuencias de la figura 1, etc.). Además, la invención incluye un método de construcción de una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que, tras su transcripción, produce un molde de ARN que contiene una secuencia de ARN que comprende el complemento inverso de una secuencia codificante de ARNm de un virus influenza, y secuencias terminales de ARNv, en el que la secuencia de ADN comprende un ácido nucleico correspondiente a SEQ ID NO: 35. Tales métodos también incluyen aquéllos en los que el molde de ARN es replicable. Otros métodos de la invención incluyen los de construcción de una molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que, tras su transcripción, produce un molde de ARN replicable que comprende el complemento inverso de una secuencia codificante de ARNm de un virus influenza. Estos métodos de la invención incluyen normalmente aquéllos en los que la molécula de ARN es un segmento de genoma de influenza, en los que la ARN polimerasa dirigida por ADN es pol I, pol II, polimerasa de T7, polimerasa de T3 o polimerasa Sp6.

La transcripción se aumenta opcionalmente incluyendo una secuencia potenciadora. Los potenciadores son normalmente elementos de ADN cortos, por ejemplo, de 10-500 pb, de acción en cis que actúan conjuntamente con un promotor para aumentar la transcripción. Se han aislado muchas secuencias potenciadoras a partir de genes de mamíferos (hemoglobina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína e insulina), y virus de células eucariotas. El

potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector en una posición en 5’ o 3’ con respecto a la secuencia codificante heteróloga, pero normalmente se inserta en un sitio en 5’ con respecto al promotor. Normalmente, el promotor y, si se desea, secuencias potenciadoras de la transcripción adicionales se eligen para optimizar la expresión en el tipo de célula huésped en la que va a introducirse el ADN heterólogo (Scharf et al. (1994) Heat stress promoters and transcription factors Results Probl Cell Differ 20:125-62; Kriegler et al. (1990) Assembly of enhancers, promoters, and splice signals to control expression of transferred genes Methods in Enzymol 185: 51227). Opcionalmente, el amplicón también puede contener un sitio de unión al ribosoma o un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) para la iniciación de la traducción.

Los vectores de la invención también incluyen favorablemente secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm, tales como un sitio de poliadenilación o una secuencia de terminación. Tales secuencias están disponibles comúnmente a partir de las regiones no traducidas en 5’ y, ocasionalmente, en 3’ de ADN o ADNc eucariotas o virales. En una realización, las secuencias de señal de poliadenilación de SV40 pueden proporcionar un sitio de poliadenilación bidireccional que aísla la transcripción de moléculas de ARNm de hebra (+) del promotor PolI que inicia la replicación del genoma viral de hebra (-).

Además, tal como se describió anteriormente, los vectores de expresión incluyen opcionalmente uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células huésped transformadas, además de los genes enumerados anteriormente, marcadores tales como dihidrofolato reductasa o resistencia a neomicina son adecuados para la selección en cultivo celular eucariota.

El vector que contiene la secuencia de ácido nucleico apropiada tal como se describió anteriormente, así como una secuencia de control o promotora apropiada, puede emplearse para transformar una célula huésped que permite la expresión de la proteína. Aunque los vectores de la invención pueden replicarse en células bacterianas, lo más frecuentemente será deseable introducirlos en células de mamíferos, por ejemplo, células Vero, células BHK, células MDCK, células 293, células COS, o similares, para el fin de expresión.

Tal como se describe en otra parte, las secuencias de HA y NA en el presente documento, en diversas realizaciones, pueden estar comprendidas dentro de plásmidos implicados en el reordenamiento por rescate de plásmidos. Véanse, por ejemplo, la solicitud estadounidense n.º 60/420.708, presentada el 23 de octubre de 2002, la solicitud estadounidense n.º 10/423.828, presentada el 25 de abril de 2003 y la solicitud estadounidense n.º 60/574.117, presentada el 24 de mayo de 2004, tituladas todas “Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus”; Hoffmann, E., 2000, PNAS, 97(11):6108-6113; la solicitud de patente estadounidense publicada n.º 20020164770 concedida a Hoffmann; y la patente estadounidense n.º 6.544.785 concedida el 8 de abril de 2003 a Palese, et al. Los reordenantes producidos pueden incluir los genes de HA y NA dispuestos con los otros 6 genes de influenza de la cepa donadora A/Ann Arbor/6/60, la cepa donadora B/Ann Arbor/1/66 (y/o derivados y modificaciones de la misma), la cepa donadora A/Puerto Rico/8/34, etc.

Elementos de expresión adicionales

De la manera más común, el segmento genómico que codifica para la proteína HA y/o NA de virus influenza incluye cualquier secuencia adicional necesaria para su expresión, incluyendo la traducción para dar una proteína viral funcional. En otras situaciones, puede emplearse un minigén, u otro constructo artificial que codifica para las proteínas virales, por ejemplo, una proteína HA y/o NA. De nuevo, en tal caso, a menudo es deseable incluir señales de iniciación específicas que ayudan en la traducción eficaz de la secuencia codificante heteróloga. Estas señales pueden incluir, por ejemplo, el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Para garantizar la traducción de toda el inserto, se inserta el codón de iniciación en el marco de lectura correcto en relación con la proteína viral. Los codones de iniciación y elementos de transcripción exógenos pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión puede potenciarse mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso.

Si se desea, pueden incorporarse en el vector secuencias de polinucleótido que codifican para elementos expresados adicionales, tales como secuencias señal, secuencias de secreción o localización, y similares, habitualmente, en marco con la secuencia de polinucleótido de interés, por ejemplo, para dirigir la expresión del polipéptido a un compartimento celular, membrana u orgánulo deseado, o para dirigir la secreción del polipéptido al espacio periplasmático o a los medios de cultivo celular. Tales secuencias las conocen los expertos e incluyen péptidos líder de secreción, secuencias de direccionamiento a orgánulos (por ejemplo, secuencias de localización nuclear, señales de retención en el ER, secuencias de tránsito mitocondrial), secuencias de localización/anclaje en la membrana (por ejemplo, secuencias de detención de la transferencia, secuencias de anclaje a GPI), y similares.

Cuando se desea la traducción de un polipéptido codificado por una secuencia de ácido nucleico de la invención, señales de iniciación específicas de la traducción adicionales pueden mejorar la eficacia de traducción. Estas señales pueden incluir, por ejemplo, un codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes, una región IRES, etc. En algunos casos, por ejemplo, moléculas de ADNc de longitud completa o segmentos cromosómicos que incluyen una secuencia codificante que incorpora, por ejemplo, una secuencia de polinucleótido de la invención (por ejemplo, como en las secuencias en el presente documento), un codón de iniciación de la traducción y elementos de

secuencia asociados se insertan en el vector de expresión apropiado simultáneamente con la secuencia de polinucleótido de interés. En tales casos, frecuentemente no se requieren señales de control de la traducción adicionales. Sin embargo, en los casos en los que sólo se inserta una secuencia que codifica para polipéptido, o una parte de la misma, se proporcionan a menudo señales de control de la traducción exógenas, incluyendo, por ejemplo, un codón de iniciación ATG, para la expresión de la secuencia relevante. El codón de iniciación se coloca en el marco de lectura correcto para garantizar la transcripción de la secuencia de polinucleótido de interés. Los codones de iniciación y elementos de transcripción exógenos pueden ser de diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de expresión puede potenciarse mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema celular en uso (véanse, por ejemplo, Scharf D. et al. (1994) Results Probl Cell Differ 20:125-62; Bittner et al. (1987) Methods in Enzymol 153:516-544).

Producción de virus recombinante

Pueden modificarse por ingeniería genética virus de ARN de hebra negativa y recuperarse usando un enfoque de genética inversa recombinante (patente estadounidense n.º 5.166.057 concedida a Palese et al.). Tal método se aplicó originariamente para modificar por ingeniería genética genomas de virus influenza (Luytjes et al. (1989) Cell 59:1107-1113; Enami et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11563-11567), y se ha aplicado satisfactoriamente a una amplia variedad de virus de ARN de hebra negativa segmentados y no segmentados, por ejemplo, virus de la rabia (Schnell et al. (1994) EMBO J. 13: 4195-4203); VEV (Lawson et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 44774481); virus del sarampión (Radecke et al. (1995) EMBO J. 14:5773-5784); virus de la peste bovina (Baron & Barrett (1997) J. Virol. 71: 1265-1271); virus parainfluenza humano (Hoffman & Banerjee (1997) J. Virol. 71: 3272-3277; Dubin et al. (1997) Virology 235:323-332); SV5 (He et al. (1997) Virology 237:249-260); virus del moquillo canino (Gassen et al. (2000) J. Virol. 74:10737-44); y virus Sendai (Park et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 55375541; Kato et al. (1996) Genes to Cells 1:569-579). Los expertos en la técnica estarán familiarizados con estas técnicas y similares para producir virus influenza que comprende las secuencias de HA y NA de la invención. Los virus influenza recombinantes producidos según tales métodos también son una característica de la invención, como los son los virus influenza recombinantes que comprenden uno o más ácidos nucleicos y/o polipéptidos de la invención. Por supuesto, tal como apreciarán los expertos en la técnica, los virus influenza en general (y también los de la invención) son virus de ARN de hebra negativa. Por tanto, cuando la presente invención describe los virus influenza, ha de entenderse que normalmente significan la versión de ARN de hebra negativa correspondiente de las secuencias. La secuencia de nucleótidos en la figura 1 comprende versiones de ADN (por ejemplo, secuencia codificante más sentido, etc.) de los genes (junto con algunas regiones no traducidas en las secuencias de nucleótidos). Los expertos en la técnica pueden convertir fácilmente entre secuencias de ARN y ADN (por ejemplo, el cambio de U a T, etc.), y entre secuencias de nucleótidos complementarias (ya sean ARN o ADN), etc. Por tanto, por ejemplo, los expertos en la técnica pueden convertir fácilmente de una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, una facilitada en la figura 1, es decir, SEQ ID NO: 35) a la secuencia de aminoácidos correspondiente o a una secuencia complementaria correspondiente (ya sea ADN o ARN), etc. Además, tal como resultará evidente, cuando tales secuencias de HA y/o NA se describen dentro de vectores de ADN, por ejemplo, plásmidos, etc., entonces ha de entenderse normalmente la versión de ADN correspondiente de las secuencias. De nuevo, los ácidos nucleicos de la invención incluyen las secuencias explícitas en las listas de secuencias en el presente documento, así como los complementos de tales secuencias (tanto ARN como ADN), la forma bicatenaria de las secuencias en las listas de secuencias, las formas de ARN correspondientes de las secuencias en las listas de secuencias (o bien como el complemento de ARN de la secuencia explícita en la lista de secuencias o bien como la versión de ARN de la secuencia en la lista de secuencias, por ejemplo, del mismo sentido, pero que se componen de ARN, con U en lugar de T, etc.). Por tanto, dependiendo del contexto en el presente documento, las secuencias de ácido nucleico de la invención pueden comprender las versiones de ARN de SEQ ID NO: 1-48 (o bien en sentido de hebra positiva o bien en sentido de hebra negativa).

Huéspedes de expresión y cultivo celular

La presente invención también se refiere a células huésped que se introducen (se transducen, se transforman o se transfectan) con vectores de la invención, y a la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes. Las células huésped se modifican por ingeniería genética (es decir, se transducen, se transforman o se transfectan) con un vector, tal como un vector de expresión, de esta invención. Tal como se describió anteriormente, el vector puede estar en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. Los ejemplos de huéspedes de expresión apropiados incluyen: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fúngicas, tales como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Neurospora crassa; o células de insecto tales como Drosophila y Spodoptera frugiperda.

Lo más comúnmente, se usan células de mamífero para cultivar las moléculas de HA y NA de la presente invención. Las células huésped adecuadas para la replicación de virus influenza (por ejemplo, con las secuencias de HA y/o NA en el presente documento) incluyen, por ejemplo, células Vero, células BHK, células MDCK, células 293 y células COS, incluyendo células 293T, células COS7 o similares. Comúnmente, se emplean cocultivos que incluyen dos de las líneas celulares anteriores, por ejemplo, células MDCK y o bien células 293T o bien células COS a una razón, por ejemplo, de 1:1, para mejorar la eficacia de replicación. Normalmente, las células se cultivan en un medio de cultivo comercial convencional, tal como medio de Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero (por

ejemplo, suero bovino fetal al 10%), o en medio libre de suero, a concentración de CO2 y humedad controladas, adecuado para mantener el pH tamponado neutro (por ejemplo, a pH de entre 7,0 y 7,2). Opcionalmente, el medio contiene antibióticos para evitar el crecimiento bacteriano, por ejemplo, penicilina, estreptomicina etc., y/o nutrientes adicionales, tales como L-glutamina, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales, complementos adicionales para promover características de crecimiento favorables, por ejemplo, tripsina, β-mercaptoetanol, y similares.

Las células huésped modificadas por ingeniería pueden cultivarse en medios de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar las secuencias de polinucleótido insertadas, por ejemplo, a través de la producción de virus. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son normalmente las usadas previamente con la célula huésped particular seleccionada para la expresión, y resultarán evidentes para los expertos en la técnica y en las referencias citadas en el presente documento, incluyendo por ejemplo, Freshney (1983) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, 3ª edición, Wiley-Liss, Nueva York y las referencias citadas en ese documento. Otras referencias útiles incluyen, por ejemplo, Paul (1975) Cell and Tissue Culture, 5ª ed., Livingston, Edinburgh; Adams (1980) Laboratory Techniques in Biochemis and Molecular Biology-Cell Culture para Biochemists, Work and Burdon (eds.) Elsevier, Ámsterdam. Los detalles adicionales en cuanto a procedimientos de cultivo tisular de particular interés en la producción de virus influenza in vitro incluyen, por ejemplo, Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures para vaccine preparation. En Cohen and Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines, que se incorpora en el presente documento en su totalidad para todos los fines. Adicionalmente, se determinan fácilmente variaciones en tales procedimientos adaptados a la presente invención a través de experimentación de rutina y los expertos en la técnica estarán familiarizados con ello.

Pueden cultivarse células para la producción de virus influenza (por ejemplo, que tienen las secuencias de Ha y/o NA de la invención) en medio que contiene suero o libre de suero. En algunos casos, por ejemplo, para la preparación de virus purificados, normalmente es deseable hacer crecer las células huésped en condiciones libres de suero. Las células pueden cultivarse a pequeña escala, por ejemplo, menos de 25 ml de medio, en tubos o frascos de cultivo o en grandes frascos con agitación, en botellas giratorias o en perlas microportadoras (por ejemplo, perlas microportadoras de DEAE-Dextrano, tales como Dormacell, Pfeifer & Langen; Superbead, Flow Laboratories; perlas de copolímero de estireno-trimetilamina, tales como Hillex, SoloHill, Ann Arbor) en frascos, botellas o cultivos en reactor. Las perlas microportadoras son pequeñas esferas (en el intervalo de 100-200 micrómetros de diámetro) que proporcionan una gran área superficial para el crecimiento celular adherente por volumen de cultivo celular. Por ejemplo, un solo litro de medio puede incluir más de 20 millones de perlas microportadoras que proporcionan más de 8000 centímetros cuadrados de superficie de crecimiento. Para la producción comercial de virus, por ejemplo, para la producción de vacunas, a menudo es deseable cultivar las células en un biorreactor o fermentador. Los biorreactores están disponibles en volúmenes de desde menos de 1 litro hasta más de 100 litros, por ejemplo, biorreactor Cyto3 (Osmonics, Minnetonka, MN); biorreactores NBS (New Brunswick Scientific, Edison, N.J.); biorreactores a escala de laboratorio y comercial de B. Braun Biotech International (B. Braun Biotech, Melsungen, Alemania).

Independientemente del volumen de cultivo, en muchos aspectos deseados de la presente invención, es importante que los cultivos se mantengan a una temperatura apropiada, para garantizar la recuperación eficaz del virus influenza recombinante y/o reordenante usando sistemas de múltiples plásmidos dependientes de la temperatura (véanse, por ejemplo, la solicitud estadounidense n.º 60/420.708, presentada el 23 de octubre de 2002, la solicitud estadounidense n.º 10/423.828, presentada el 25 de abril de 2003 y la solicitud estadounidense n.º 60/574.117, presentada el 24 de mayo de 2004, todas tituladas “Multi-Plasmid System for the Production of Influenza Virus”), calentamiento de disoluciones virales para filtración, etc. Normalmente, se emplea un regulador, por ejemplo, un termostato, u otro dispositivo para detectar y mantener la temperatura del sistema de cultivo celular y/u otra disolución, para garantizar que la temperatura está en el nivel correcto durante el periodo apropiado (por ejemplo, replicación del virus, etc.).

En algunas realizaciones en el presente documento (por ejemplo, en las que van a producirse virus reordenados a partir de segmentos en vectores), se introducen vectores que comprenden segmentos de genoma de influenza (por ejemplo, se transfectan) en células huésped según métodos bien conocidos en la técnica para introducir ácidos nucleicos heterólogos en células eucariotas, incluyendo, por ejemplo, coprecipitación con fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección y transfección empleando reactivos de transfección de poliamina. Por ejemplo, pueden transfectarse vectores, por ejemplo, plásmidos, en células huésped, tales como células COS, células 293T o combinaciones de células COS o 293T y células MDCK, usando el reactivo de transfección de poliamina TransIT-LT1 (Mirus) según las instrucciones del fabricante para producir virus reordenados, etc. Por tanto, en un ejemplo, se introduce aproximadamente 1 µg de cada vector en una población de células huésped con aproximadamente 2 µl de TransIT-LT1 diluidos en 160 µl de medio, preferiblemente medio libre de suero, en un volumen total de 200 µl. Se incuban las mezclas de ADN:reactivo de transfección a temperatura ambiente durante 45 minutos seguido por la adición de 800 µl de medio. Se añade la mezcla de transfección a las células huésped, y se cultivan las células tal como se describe mediante otros métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por consiguiente, para la producción de virus recombinantes o reordenados en cultivo celular, se mezclan vectores que incorporan cada uno de los 8 segmentos de genoma, (PB2, PB1, PA, NP, M, NS, HA y NA, por ejemplo, de la

invención) con aproximadamente 20 µl de TransIT-LT1 y se transfectan en células huésped. Opcionalmente, se reemplaza el medio que contiene suero antes de la transfección por medio libre de suero, por ejemplo, Opti-MEM I, y se incuba durante 4-6 horas.

Alternativamente, puede emplearse electroporación para introducir tales vectores que incorporan segmentos de genoma de influenza en células huésped. Por ejemplo, se introducen favorablemente vectores de plásmido que incorporan un virus influenza A o influenza B en células Vero usando electroporación según el siguiente procedimiento. En resumen, se resuspenden aproximadamente 5 x 106 células Vero, por ejemplo, hechas crecer en medio de Eagle modificado (MEM) complementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) en 0,4 ml de OptiMEM y se colocan en una cubeta de electroporación. Se añaden veinte microgramos de ADN en un volumen de hasta 25 µla las células en la cubeta, que entonces se mezcla suavemente mediante ligeros golpes. Se realiza la electroporación según las instrucciones del fabricante (por ejemplo, aparato BioRad Gene Pulser II con Capacitance Extender Plus conectado) a 300 voltios, 950 microfaradios con una constante de tiempo de entre 28-33 ms. Se vuelven a mezclar las células mediante ligeros golpes y aproximadamente 1-2 minutos tras la electroporación se añaden 0,7 ml de MEM con FBS al 10% directamente a la cubeta. Entonces se transfieren las células a dos pocillos de una placa de cultivo tisular de 6 pocillos convencional que contiene 2 ml de MEM, FBS al 10%. Se lava la cubeta para recuperar cualquier célula restante y se divide la suspensión de lavado entre los dos pocillos. El volumen final es de aproximadamente 3,5 ml. Entonces se incuban las células en condiciones permisivas para el crecimiento viral, por ejemplo, a aproximadamente 33ºC para cepas adaptadas al frío.

En células huésped de mamífero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión, tales como sistema basados en virus. En los casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, se liga opcionalmente una secuencia codificante en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que consiste en el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral dará como resultado un virus viable que puede expresar los polipéptidos de interés en células huésped infectadas (Logan y Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci 81:3655-3659). Además, pueden usarse potenciadores de la transcripción, tales como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (VSR), para aumentar la expresión en células huésped de mamífero.

Una cepa de células huésped se elige opcionalmente por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada del modo deseado. Tales modificaciones de la proteína incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento postraduccional, que escinde una forma precursora para dar una forma madura, de la proteína es importante a veces para la inserción, el plegamiento y/o la función correctos. Adicionalmente la ubicación apropiada dentro de una célula huésped (por ejemplo, en la superficie celular) también es importante. Diferentes células huésped tales como COS, CHO, BHK, MDCK, 293, 293T, COS7, etc. tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para tales actividades postraduccionales y pueden elegirse para garantizar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína foránea, introducida actual.

Para la producción con alto rendimiento, a largo plazo de proteínas recombinantes codificadas por, o que tienen subsecuencias codificadas por, los polinucleótidos de la invención, se usan opcionalmente sistemas de expresión estables. Por ejemplo, se transfectan líneas celulares, que expresan de manera estable un polipéptido de la invención, usando vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales o elementos de expresión endógenos y un gen de marcador seleccionable. Por ejemplo, tras la introducción del vector, se permite que crezcan las células durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de cambiarse a medios selectivos. El fin del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de células que expresan satisfactoriamente las secuencias introducidas. Por tanto, pueden proliferar agrupaciones resistentes de células transformadas de manera estable, por ejemplo, derivadas de un único tipo de célula, usando técnicas de cultivo tisular apropiadas para el tipo de célula.

Se cultivan opcionalmente células huésped transformadas con una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de la invención en condiciones adecuadas para la expresión y la recuperación de la proteína codificada del cultivo celular. Las células que expresan dicha proteína pueden clasificarse, aislarse y/o purificarse. La proteína o fragmento de la misma producido mediante una célula recombinante puede secretarse, unirse a la membrana o retenerse de manera intracelular, dependiendo de la secuencia (por ejemplo, dependiendo de las proteínas de fusión que codifican para una señal de retención en la membrana o similar) y/o el vector usado.

También pueden producirse productos de expresión correspondientes a los ácidos nucleicos de la invención en células que no son de animales tales como de plantas, levaduras, hongos, bacterias y similares. Además de Sambrook, Berger y Ausubel, todos citados anteriormente, pueden encontrarse detalles referentes al cultivo celular en Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, NY; Gamborg y Phillips (eds.) (1995) Plant Cell. Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heidelberg Nueva York) y Atlas y Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.

En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse varios vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para el producto expresado. Por ejemplo, cuando son necesarias grandes cantidades de un polipéptido o fragmentos del

mismo para la producción de anticuerpos, se emplean favorablemente vectores que dirigen la expresión de alto nivel de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores de clonación y expresión de E. coli multifuncionales tales como BLUESCRIPT (Stratagene), en los que la secuencia codificante de interés, por ejemplo, secuencias que comprenden las que se encuentran en el presente documento, etc., pueden ligarse en el vector en marco con secuencias para la metionina de iniciación de la traducción aminoterminal y los 7 residuos posteriores de beta-galactosidasa produciendo una proteína de fusión de betagalactosidasa catalíticamente activa; vectores pIN (Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264:5503-5509); vectores pET (Novagen, Madison WI); y similares. De manera similar, en la levadura Saccharomyces cerevisiae, pueden usarse varios vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles tales como factor alfa, alcohol oxidasa y PGH para la producción de los productos de expresión deseados. Para revisiones, véanse Ausubel, citado anteriormente, y Grant et al., (1987); Methods in Enzymology 153:516-544.

Clonación, mutagénesis y expresión de biomoléculas de interés

Los textos generales que describen técnicas de biología molecular, que son aplicables a la presente invención, tales como clonación, mutación, cultivo celular y similares, incluyen Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning -A Laboratory Manual (3ª ed.), vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 2000 (“Sambrook”) y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, una empresa conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (con suplementos hasta 2002) (“Ausubel”)). Estos textos describen la mutagénesis, el uso de vectores, promotores y muchos otros temas relevantes relacionados con, por ejemplo, la generación de moléculas de HA y/o NA, etc.

Diversos tipos de mutagénesis se usan opcionalmente en la presente invención, por ejemplo, para producir y/o aislar, por ejemplo, moléculas de HA y/o NA novedosas o recién aisladas y/o para modificar/mutar adicionalmente los polipéptidos (por ejemplo, moléculas de HA y NA) de la invención. Incluyen pero no se limitan a mutagénesis dirigida al sitio, puntual al azar, recombinación homóloga (intercambio de ADN), mutagénesis usando moldes que contienen uracilo, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, mutagénesis de ADN modificado con fosforotioato, mutagénesis usando ADN dúplex discontinuo o similar. Los métodos adecuados adicionales incluyen reparación de apareamiento erróneo puntual, mutagénesis usando cepas huésped de reparación deficiente, restricción-selección y restricción-purificación, mutagénesis por deleción, mutagénesis mediante síntesis génica total, reparación de roturas de la doble cadena, y similares. La mutagénesis, por ejemplo, que implica constructos quiméricos, también está incluida en la presente invención. En una realización, la mutagénesis puede estar guiada por información conocida de la molécula que se produce de manera natural o molécula que se produce de manera natural alterada o mutada, por ejemplo, secuencia, comparaciones de secuencias, propiedades físicas, estructura cristalina o similar.

Los textos y ejemplos anteriores encontrados en el presente documento describen estos procedimientos así como las siguientes publicaciones (y referencias citadas en las mismas): Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001); Ling et al., Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the fosforotioate method, Methods Mol Biol 57:369-374 (1996);

I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res 23, 3067-8 (1995); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Fritz et al., Oligonucleotidedirected construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl Acids Res 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl Acids Res 16: 7207 (1988); Sakamar y Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl Acids Res 14: 6361-6372 (1988); Sayers et al., Y-T Exonucleases in phosphorotioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl Acids Res 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorotioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in presence of etidium bromide, (1988) Nucl Acids Res 16: 803-814; Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol 154: 382-403 (1987); Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol 154:350-367 (1987); Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, en Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. y Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlín)) (1987); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without fenotypic selection, Methods in Enzymol 154, 367-382 (1987); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol 154:329-350 (1987); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem J 237:1-7 (1986); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl Acids Res 14: 5115 (1986); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc Natl Acad Sci USA, 83:7177-7181 (1986); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorotioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl Acids Res 14: 9679-9698 (1986); Wells et al., Importance of hidrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil Trans R Soc Lond A 317: 415-423 (1986); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201(1985); Carter et al., Improved oligonucleotide sitedirected mutagenesis using M13 vectors, Nucl Acids Res 13: 4431-4443 (1985); Grundström et al., Oligonucleotidedirected mutagenesis by microscale ’shot-gun’ gene synthesis, Nucl Acids Res 13: 3305-3316 (1985); Kunkel, Rapid

and efficient site-specific mutagenesis without fenotypic selection, Proc Natl Acad Sci USA 82:488-492 (1985); Smith, In vitro mutagenesis, Ann Rev Genet 19:423-462(1985); Tailor et al., The use of phosphorotioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl Acids Res 13: 8749-8764 (1985); Tailor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorotioate-modified DNA, Nucl Acids Res 13: 8765-8787 (1985); Wells et al., Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl Acids Res 12: 9441-9456 (1984); Kramer et al., Point Mismatch Repair, Cell 38:879-887 (1984); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol 100:468-500 (1983); y Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucl Acids Res 10:6487-6500 (1982). Pueden encontrarse detalles adicionales sobre muchos de los métodos anteriores en Methods in Enzymol volumen 154, que también describe controles útiles para la resolución de problemas con diversos métodos de mutagénesis, aislamiento génico, expresión, y otros.

Normalmente se sintetizan químicamente los oligonucleótidos, por ejemplo, para su uso en mutagénesis de la presente invención, por ejemplo, mutando bibliotecas de las moléculas de HA y/o NA de la invención, o alterando tales, según el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letts 22(20):1859-1862, (1981) por ejemplo, usando un sintetizador automático, tal como se describe en Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res, 12:6159-6168 (1984).

Además, esencialmente cualquier ácido nucleico puede pedirse por encargo o de manera convencional a cualquiera de una variedad de fuentes comerciales, tales como The Midland Certified reagent Company (mcrc@oligos.com), The Great American Gene Company (www.genco.com), ExpressGen Inc. (www.expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) y muchas otras. De manera similar, pueden pedirse por encargo péptidos y anticuerpos de cualquiera de una variedad de fuentes, tales como PeptidoGenic (disponible en pkim@ccnet.com), HTI Bio-products, Inc. (www.htibio.corn), BMA Biomedicals Ltd. (U.K.), Bio.Synthesis, Inc., y muchas otras.

La presente invención también se refiere a células huésped y organismos que comprenden una molécula de HA y/o NA u otro polipéptido y/o ácido nucleico de la invención o tales secuencias de HA y/o NA u otras dentro de diversos vectores tales como virus influenza reordenantes 6:2, plásmidos en sistemas de rescate de plásmidos, etc. Las células huésped se modifican por ingeniería genética (por ejemplo, se transforman, se transducen o se transfectan) con los vectores de esta invención, que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una bacteria, un virus, un polinucleótido desnudo o un polinucleótido conjugado. Los vectores se introducen en células y/o microorganismos mediante métodos convencionales incluyendo electroporación (véase, From et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 5824 (1985), infección mediante vectores virales, penetración balística a alta velocidad mediante pequeñas partículas con el ácido nucleico

o bien dentro de la matriz de pequeñas perlas o partículas, o bien en la superficie (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)). Berger, Sambrook, y Ausubel proporcionan una variedad de métodos de transformación apropiados. Véase anteriormente.

Están disponibles varios métodos bien conocidos de introducción de ácidos nucleicos diana en células bacterianas, cualquiera de los cuales puede usarse en la presente invención. Estos incluyen: fusión de las células receptoras con protoplastos bacterianos que contienen el ADN, electroporación, bombardeo con proyectiles e infección con vectores virales, etc. Pueden usarse células bacterianas para amplificar el número de plásmidos que contienen constructos de ADN de esta invención. Se hacen crecer las bacterias hasta la fase logarítmica y pueden aislarse los plásmidos dentro de las bacterias mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook). Además, están disponibles comercialmente una multitud de kits para la purificación de plásmidos a partir de bacterias, (véanse, por ejemplo, EasyPrep™, FlexiPrep™, ambos de Pharmacia Biotech; StrataClean™, de Stratagene; y QIAprep™ de Qiagen). Los plásmidos aislados y purificados se manipulan entonces adicionalmente para producir otros plásmidos, se usan para transfectar células o se incorporan en vectores relacionados para infectar organismos. Los vectores típicos contienen terminadores de la transcripción y traducción, secuencias de iniciación de la transcripción y traducción y promotores útiles para la regulación de la expresión del ácido nucleico diana particular. Los vectores comprenden opcionalmente casetes de expresión genéricos que contienen al menos una secuencia de terminador independiente, secuencias que permiten la replicación del casete en eucariotas o procariotas, o ambas, (por ejemplo, vectores lanzadera) y marcadores de selección para sistemas tanto procariotas como eucariotas. Los vectores son adecuados para la replicación e integración en procariotas, eucariotas, o preferiblemente ambos. Véanse, Giliman & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987); Schneider, B., et al., Protein Expr Purif 6435:10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (todos citados anteriormente). Se proporciona un catálogo de bacterias y bacteriófagos útiles para clonación, por ejemplo, por la ATCC, por ejemplo, The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds.) publicado por la ATCC. También se encuentran procedimientos básicos adicionales para secuenciación, clonación y otros aspectos de la biología molecular y consideraciones teóricas subyacentes en Watson et al. (1992) Recombinant DNA, segunda edición, Scientific American Books, NY. Véase anteriormente.

PRODUCCIÓN Y RECUPERACIÓN DE POLIPÉPTIDOS

En algunas realizaciones, tras la transducción de una cepa o línea de células huésped adecuada y el crecimiento de las células huésped hasta una densidad celular apropiada, se induce un promotor seleccionado mediante medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y se cultivan las células durante un periodo adicional. En algunas realizaciones, se recupera entonces un producto de polipéptido secretado, por ejemplo, un polipéptido de HA y/o NA como en una forma de proteína de fusión secretada, etc., del medio de cultivo. En otras realizaciones, se produce una partícula viral que contiene uno o más polipéptidos de HA y/o NA de la invención desde la célula. Alternativamente, pueden recogerse células mediante centrifugación, alterarse mediante medios físicos o químicos, y conservarse el extracto en bruto resultante para su purificación adicional. Las células eucariotas

o microbianas empleadas en la expresión de proteínas pueden alterarse mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica o el uso de agentes de lisis celular, u otros métodos, que se conocen bien por los expertos en la técnica. Adicionalmente, pueden utilizarse células que expresan un producto de polipéptido de HA y/o NA de la invención sin separar el polipéptido de la célula. En tales situaciones, el polipéptido de la invención se expresa opcionalmente en la superficie celular y se examina por tanto (por ejemplo, al tener moléculas de HA y/o NA, o fragmentos de las mismas, por ejemplo, que comprenden proteínas de fusión o similares) en anticuerpos que se unen a la superficie celular, etc. Tales células son también características de la invención.

Pueden recuperarse los polipéptidos expresados y purificarse de los cultivos celulares recombinantes mediante cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad (por ejemplo, usando cualquiera de los sistemas de marcaje con etiqueta conocidos por los expertos en la técnica), cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina. Pueden usarse etapas de replegamiento de proteínas, según se desee, para completar la configuración de la proteína madura. Además, puede emplearse cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) en las etapas de purificación final. Además de las referencias indicadas en el presente documento, una variedad de métodos de purificación se conocen bien en la técnica, incluyendo, por ejemplo, los expuestos en Sandana (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; y Bollag et al. (1996) Protein Methods. 2ª edición Wiley-Liss, NY; Walquer (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris y Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, Inglaterra; Harris y Angal Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, Inglaterra; Scopes (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3ª edición Springer Verlag, NY; Janson y Ryden (1998) Protein Purification: Principles. High Resolution Methods and Applications, segunda edición Wiley-VCH, NY; y Walquer (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ.

Cuando los polipéptidos expresados de la invención se producen en virus, los virus se recuperan normalmente del medio de cultivo, en el que se han hecho crecer las células infectadas (transfectadas). Normalmente, se clarifica el medio en bruto antes de la concentración de los virus influenza. Los métodos comunes incluyen ultrafiltración, adsorción sobre sulfato de bario y elución, y centrifugación. Por ejemplo, el medio en bruto de cultivos infectados puede clarificarse en primer lugar mediante centrifugación a, por ejemplo, 1000-2000 x g durante un tiempo suficiente para eliminar los residuos celulares y otra materia particulada grande, por ejemplo, entre 10 y 30 minutos. Opcionalmente, el sobrenadante del medio clarificado se centrifuga entonces para sedimentar los virus influenza, por ejemplo, a 15,000 x g, durante aproximadamente 3-5 horas. Tras la resuspensión del sedimento viral en un tampón apropiado, tal como STE (Tris-HCl 0,01 M; NaCl 0,15 M; EDTA 0,0001 M) o solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4, el virus se concentra mediante centrifugación en gradiente de densidad sobre sacarosa (al 60%12%) o tartrato de potasio (al 50%-10%). Son adecuados gradientes o bien continuos o bien escalonados, por ejemplo, un gradiente de sacarosa a entre el 12% y el 60% en cuatro escalones del 12%. Los gradientes se centrifugan a una velocidad, y durante un tiempo, suficientes para que se concentren los virus en una banda visible para su recuperación. Alternativamente, y para la mayor parte de aplicaciones comerciales a gran escala, se somete el virus a elutriación a partir de gradientes de densidad usando un rotor de centrífuga zonal que funciona en modo continuo. Se proporcionan detalles adicionales suficientes para guiar a un experto a través de la preparación de los virus influenza a partir de cultivo tisular, por ejemplo, en Furminger. Vaccine Production, en Nicholson et al. (eds.) Textbook of Influenza págs. 324-332; Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, en Cohen & Shafferman (eds.) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines págs. 141-151 y la patente estadounidense n.º 5.690.937. Si se desea; los virus recuperados pueden almacenarse a -80ºC en presencia de sacarosa-fosfato-glutamato (SPG) como estabilizador.

Alternativamente, pueden emplearse sistemas de transcripción/traducción libres de células para producir polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos o subsecuencia de, por ejemplo, SEQ ID NO: 49 a SEQ ID NO: 96, codificados por las secuencias de polinucleótido de la invención. Varios sistemas de transcripción y traducción adecuados in vitro están disponibles comercialmente. Se encuentra una guía general para los protocolos de transcripción y traducción in vitro en Tymms (1995) In vitro Transcription and Translation Protocols: Methods in Molecular Biology volumen 37, Garland Publishing, NY.

Además, los polipéptidos, o subsecuencias de los mismos, por ejemplo, subsecuencias que comprenden péptidos antigénicos, pueden producirse manualmente o usando un sistema automatizado, mediante síntesis peptídica directa usando técnicas en fase sólida (véanse, Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman

Co, San Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc 85:2149-2154). Los sistemas automatizados a modo de ejemplo incluyen el sintetizador peptídico 431A de Applied Biosystems (Perkin Elmer, Foster City, CA). Si se desea, las subsecuencias pueden sintetizarse químicamente por separado, y combinarse usando métodos químicos para proporcionar polipéptidos de longitud completa.

Aminoácidos modificados

Los polipéptidos expresados de la invención pueden contener uno o más aminoácidos modificados. La presencia de aminoácidos modificados puede ser ventajosa en, por ejemplo, (a) el aumento de la semivida sérica del polipéptido,

(b) la reducción/el aumento de la antigenicidad del polipéptido, (c) el aumento de la estabilidad en almacenamiento del polipéptido, etc. Se modifica(n) aminoácido(s), por ejemplo, de manera cotraduccional o postraduccional durante la producción recombinante (por ejemplo, glicosilacion unida a N en motivos N-X-S/T durante la expresión en células de mamífero) o se modifica(n) mediante medios sintéticos (por ejemplo, mediante pegilación).

Los ejemplos no limitativos de un aminoácido modificado incluyen un aminoácido glicosilado, un aminoácido sulfatado, un aminoácido prenilado (por ejemplo, farnesilado, geranilgeranilado), un aminoácido acetilado, un aminoácido acilado, un aminoácido pegilado, un aminoácido biotinilado, un aminoácido carboxilado, un aminoácido fosforilado, y similares, así como aminoácidos modificados mediante conjugación a, por ejemplo, restos lipídicos u otros agentes de derivatización orgánicos. La bibliografía está repleta de referencias adecuadas para guiar a un experto en la modificación de aminoácidos. Se encuentran protocolos de ejemplo en Walquer (1998) Protein Protocols on CD-ROM Human Press, Towata, NJ.

Proteínas de fusión

La presente invención también proporciona proteínas de fusión que comprenden fusiones de las secuencias de la invención (por ejemplo, que codifican para polipéptidos de HA y/o NA) o fragmentos de las mismas con, por ejemplo, inmunoglobulinas (o partes de las mismas), secuencias que codifican para, por ejemplo, GFP (proteína fluorescente verde), u otros marcadores similares, etc. Secuencias de nucleótidos que codifican para tales proteínas de fusión son otro aspecto de la invención. Se usan opcionalmente las proteínas de fusión de la invención para, por ejemplo, aplicaciones similares (incluyendo, por ejemplo, aplicaciones terapéuticas, profilácticas, de diagnóstico, experimentales, etc. tal como se describe en el presente documento) como las proteínas que no son de fusión de la invención. Además de la fusión con secuencias de inmunoglobulinas y secuencias de marcadores, las proteínas de la invención también se fusionan opcionalmente con, por ejemplo, secuencias que permiten la clasificación de las proteínas de fusión y/o el direccionamiento de las proteínas de fusión a regiones, tipos de células específicos, etc.

Anticuerpos

Los polipéptidos de la invención pueden usarse para producir anticuerpos específicos para los polipéptidos facilitados en el presente documento y/o polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la invención, por ejemplo, los mostrados en el presente documento, y variantes conservativas de los mismos. Los anticuerpos específicos para los polipéptidos mencionados anteriormente son útiles, por ejemplo, para fines de diagnóstico y terapéuticos, por ejemplo, relacionados con la actividad, distribución y expresión de polipéptidos diana. Por ejemplo, tales anticuerpos pueden utilizarse opcionalmente para definir otros virus dentro de la(s) misma(s) cepa(s) que las secuencias de HA/NA en el presente documento.

Los anticuerpos específicos para los polipéptidos de la invención pueden generarse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Tales anticuerpos pueden incluir, pero no se limitan a, policlonales, monoclonales, quiméricos, humanizados, de cadena sencilla, fragmentos Fab y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab.

Los polipéptidos no requieren actividad biológica para la producción de anticuerpos (por ejemplo, no se requiere neuraminidasa o hemaglutinina funcional de longitud completa). Sin embargo, el polipéptido u oligopéptido debe ser antigénico. Los péptidos usados para inducir anticuerpos específicos tienen normalmente una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 4 aminoácidos, y a menudo de al menos 5 ó 10 aminoácidos. Pueden fusionarse tramos cortos de un polipéptido con otra proteína, tal como hemocianina de lapa californiana, y producirse anticuerpos contra la molécula quimérica.

Los expertos en la técnica conocen numerosos métodos para producir anticuerpos policlonales y monoclonales, y pueden adaptarse para producir anticuerpos específicos para los polipéptidos de la invención, y/o codificados por las secuencias de polinucleótido de la invención, etc. Véanse, por ejemplo, Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; Paul (ed.) (1998) Fundamental Immunology, cuarta edición, Lippincott-Raven, Lippincott Williams & Wilkins; Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stites et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4ª ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias citadas en esos documentos; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed.) Academic Press, Nueva York, NY; y Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495-497. Otras técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos incluyen la selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fago o vectores

similares. Véanse, Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; y Ward, et al. (1989) Nature 341: 544-546. Los antisueros y anticuerpos monoclonales y policlonales específicos se unirán habitualmente con una KD de, por ejemplo, al menos aproximadamente 0,1 µM, al menos aproximadamente 0,01 µM o mejor, y, normalmente y al menos aproximadamente 0,001 µM o mejor.

Para determinadas aplicaciones terapéuticas, son deseables anticuerpos humanizados. Pueden encontrarse métodos detallados para la preparación de anticuerpos quiméricos (humanizados) en la patente estadounidense

5.482.856. Pueden encontrarse detalles adicionales sobre la humanización y otras técnicas de modificación por ingeniería genética y producción de anticuerpos en Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering. 2ª edición Freeman and Company, NY (Borrebaeck); McCafferty et al. (1996) Antibody Engineering, A Practical Approach IRL at Oxford Press, Oxford, Inglaterra (McCafferty), y Paul (1995) Antibody Engineering Protocols Humana Press, Towata, NJ (Paul). Pueden encontrarse detalles adicionales referentes a procedimientos específicos, por ejemplo, en Ostberg et al. (1983), Hybridoma 2: 361-367, Ostberg, patente estadounidense n.º 4.634.664 y Engelman et al., patente estadounidense n.º 4.634.666.

Definición de polipéptidos mediante inmunorreactividad

Dado que los polipéptidos de la invención proporcionan una variedad de nuevas secuencias de polipéptido (por ejemplo, que comprenden moléculas de HA y NA), los polipéptidos también proporcionan nuevas características estructurales que pueden reconocerse, por ejemplo, en ensayos inmunológicos. La generación de antisueros que se unen específicamente a los polipéptidos de la invención, así como los polipéptidos a los que se unen tales antisueros, son características de la invención.

Por ejemplo, la invención incluye polipéptidos (por ejemplo, moléculas de HA y NA) que se unen específicamente a o que son específicamente inmunorreactivos con un anticuerpo o antisueros generados contra un inmunógeno que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de una o más de las secuencias facilitadas en el presente documento tal como en las SEQ ID NO: 49-96, etc. Para eliminar la reactividad cruzada con otros homólogos, se restan del anticuerpo o los antisueros las moléculas de HA y/o NA encontradas en bases de datos públicas en el momento de la presentación, por ejemplo, el/los polipéptido(s) de “control”. Cuando las otras secuencias de control corresponden a un ácido nucleico, se genera un polipéptido codificado por el ácido nucleico y se usa para fines de resta de anticuerpo/antisueros.

En un formato típico, el inmunoensayo usa un antisuero policlonal que se generó contra uno o más polipéptidos que comprenden una o más de las secuencias correspondientes a las secuencias en el presente documento, etc. o una subsecuencia sustancial de las mismas (es decir, al menos aproximadamente el 30% de la secuencia de longitud completa proporcionada). El conjunto de posibles inmunógenos de polipéptido derivados de las presentes secuencias se denominan colectivamente a continuación “los polipéptidos inmunogénicos”. Los antisueros resultantes se seleccionan opcionalmente para que tengan baja reactividad cruzada contra los homólogos de hemaglutinina y/o neuraminidasa de control y se elimina cualquiera de tal reactividad cruzada, por ejemplo, mediante inmunoabsorción, con uno o más de los homólogos de hemaglutinina y neuraminidasa de control, antes del uso del antisuero policlonal en el inmunoensayo.

Para producir antisueros para su uso en un inmunoensayo, se produce uno o más de los polipéptidos inmunogénicos y se purifica tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, puede producirse proteína recombinante en una célula recombinante. Se inmuniza una variedad consanguínea de ratones (usada en este ensayo porque los resultados son más reproducibles debido a la identidad genética virtual de los ratones) con la(s) proteína(s) inmunogénica(s) en combinación con un adyuvante convencional, tal como adyuvante de Freund, y un protocolo de inmunización de ratones convencional (véase, por ejemplo, Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York, para una descripción convencional de la generación de anticuerpos, formatos de inmunoensayo y condiciones que pueden usarse para determinar inmunorreactividad específica). También se encuentran referencias y análisis adicionales de anticuerpos en el presente documento y pueden aplicarse en este caso a la definición de polipéptidos mediante inmunorreactividad. Alternativamente, uno o más polipéptidos sintéticos o recombinantes derivados de las secuencias dadas a conocer en el presente documento se conjugan con una proteína portadora y se usan como inmunógeno.

Se recogen los sueros policlonales y se titulan frente al polipéptido inmunogénico en un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo en fase sólida con uno o más de las proteínas inmunogénicas inmovilizadas sobre un soporte sólido. Se seleccionan antisueros policlonales con un título de 106 o superior, se reúnen y se les resta(n) el/los polipéptido(s) de hemaglutinina y/o neuraminidasa de control para producir antisueros policlonales titulados reunidos restados.

Los antisueros policlonales titulados reunidos restados se someten a prueba para determinar la reactividad cruzada frente al/a los homólogo(s) de control en un inmunoensayo comparativo. En este ensayo comparativo, se determinan condiciones de unión discriminatorias para los antisueros policlonales titulados restados que dan como resultado al menos aproximadamente una razón de señal frente a ruido 5-10 veces superior para la unión de los antisueros policlonales titulados a los polipéptidos inmunogénicos en comparación con la unión a los homólogos de control. Es

decir, la rigurosidad de la reacción de unión se ajusta mediante la adición de competidores no específicos tales como albúmina o leche desnatada en polvo, y/o ajustando las condiciones salinas, la temperatura, y/o similar. Estas condiciones de unión se usan en ensayos posteriores para determinar si a un polipéptido de prueba (un polipéptido que está comparándose con los polipéptidos inmunogénicos y/o los polipéptidos de control) se unen específicamente los antisueros policlonales reunidos restados. En particular, los polipéptidos de prueba que muestran una razón de señal frente a ruido al menos 2-5 veces superior que la de los homólogos receptores de control en condiciones de unión discriminatorias, y una razón de señal frente a ruido de al menos aproximadamente ½ en comparación con el/los polipéptido(s) inmunogénico(s), comparten una similitud estructural sustancial con el polipéptido inmunogénico en comparación con el receptor conocido, etc., y es, por tanto un polipéptido de la invención.

En otro ejemplo, se usan inmunoensayos en el formato de unión competitiva para la detección de un polipéptido de prueba. Por ejemplo, tal como se indica, se eliminan los anticuerpos con reacción cruzada de la mezcla de antisueros reunidos mediante inmunoabsorción con los polipéptidos de control. El/los polipéptido(s) inmunogénico(s) se inmoviliza(n) entonces en un soporte sólido que está expuesto a los antisueros reunidos restados. Se añaden proteínas de prueba al ensayo para que compitan por la unión a los antisueros restados reunidos. La capacidad de la(s) proteína(s) de prueba para competir por la unión a los antisueros restados reunidos en comparación con la(s) proteína(s) inmovilizada(s) se compara con la capacidad del/de los polipéptido(s) inmunogénico(s) añadido(s) al ensayo para competir por la unión (los polipéptidos inmunogénicos compiten eficazmente con los polipéptidos inmunogénicos inmovilizados por la unión a los antisueros reunidos). Se calcula la reactividad cruzada en tanto por ciento para las proteínas de prueba, usando cálculos convencionales.

En un ensayo paralelo, se determina opcionalmente la capacidad de la(s) proteína(s) de control para competir por la unión a los antisueros restados reunidos en comparación con la capacidad del/de los polipéptido(s) inmunogénico(s) para competir por la unión a los antisueros. De nuevo, se calcula la reactividad cruzada en tanto por ciento para el/los polipéptido(s) de control, usando cálculos convencionales. Cuando la reactividad cruzada en tanto por ciento es al menos 5-10 veces tan alta para los polipéptidos de prueba en comparación con el/los polipéptido(s) de control y/o cuando la unión de los polipéptidos de prueba está aproximadamente en el intervalo de la unión de los polipéptidos inmunogénicos, se dice que los polipéptidos de prueba se unen específicamente a los antisueros restados reunidos.

En general, los antisueros sometidos a inmunoabsorción y reunidos pueden usarse en un inmunoensayo de unión competitiva tal como se describe en el presente documento para comparar cualquier polipéptido de prueba con el/los polipéptido(s) inmunogénico(s) y/o de control. Para realizar esta comparación, los polipéptidos inmunogénicos, de prueba y de control se someten a ensayo cada uno en un amplio intervalo de concentraciones y se determina la cantidad de cada polipéptido requerida para inhibir el 50% de la unión de los antisueros restados a, por ejemplo, una proteína inmovilizada de control, de prueba o inmunogénica usando técnicas convencionales. Si la cantidad del polipéptido de prueba requerida para la unión en el ensayo competitivo es menor que el doble de la cantidad del polipéptido inmunogénico que se requiere, entonces se dice que el polipéptido de prueba se une específicamente a un anticuerpo generado contra la proteína inmunogénica, siempre que la cantidad sea al menos aproximadamente 5-10 veces tan alta como la del polipéptido de control.

Como determinación de especificidad adicional, los antisueros reunidos se someten opcionalmente a inmunosorción completamente con el/los polipéptido(s) inmunogénico(s) (en vez del/de los polipéptido(s) de control) hasta que es detectable una pequeña cantidad o ninguna de unión de los antisueros reunidos restados de polipéptido inmunogénico al/a los polipéptido(s) inmunogénico(s) usado(s) en la inmunosorción. Estos antisueros sometidos a inmunosorción completamente se someten entonces a prueba para determinar la reactividad con el polipéptido de prueba. Si se observa poca o ninguna reactividad (es decir, no más de 2 veces la razón de señal con respecto a ruido observada para la unión de antisueros sometidos a inmunosorción completamente al polipéptido inmunogénico), entonces al polipéptido de prueba se unen específicamente los antisueros producidos por la proteína inmunogénica.

VARIANTES DE SECUENCIA DE ÁCIDO NUCLEICO Y POLIPÉPTIDO

Tal como se describe en el presente documento, la invención prevé secuencias de polinucleótido de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos de polipéptido, por ejemplo, secuencias de hemaglutinina y neuraminidasa y, por ejemplo, composiciones y métodos que comprenden dichas secuencias. Se dan a conocer ejemplos de dichas secuencias en el presente documento. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará que la invención no se limita necesariamente a las secuencias dadas a conocer en el presente documento y que la presente invención también proporciona muchas secuencias relacionadas y no relacionadas con las funciones descritas en el presente documento, por ejemplo, que codifican para una molécula de HA y/o a NA.

Un experto también apreciará que muchas variantes de las secuencias dadas a conocer están incluidas en la invención. Por ejemplo, están incluidas en la invención variaciones conservativas de las secuencias dadas a conocer que producen una secuencia funcionalmente idéntica. Se considera que están incluidas en la invención las variantes de las secuencias de polinucleótido de ácido nucleico, en las que las variantes se hibridan con al menos una

secuencia dada a conocer. También están incluidas en la invención subsecuencias únicas de las secuencias dadas a conocer en el presente documento, tal como se determina mediante, por ejemplo, técnicas convencionales de comparación de secuencias.

5 Variaciones silenciosas

Debido a la degeneración del código genético, se produce opcionalmente cualquiera de una variedad de secuencias de ácido nucleico que codifican para polipéptidos y/o virus de la invención, algunas de las cuales pueden portar menores niveles de identidad de secuencia con respecto a las secuencias ácido nucleico y de polipéptido de HA y

10 NA en el presente documento. A continuación se proporciona una tabla de codones típicos que especifica el código genético, que se encuentra en muchos textos de biología y bioquímica.

Tabla 1

Tabla de codones

Aminoácidos

Codón

Alanina

Ala A GCA GCC GCG GCU

Cisteína

Cys C UGC UGU

Ácido aspártico

Asp D GAC GAU

Ácido glutámico

Glu E GAA GAG

Fenilalanina

Phe F UUC UUU

Glicina

Gly G GGA GGC GGG GGU

Histidina

His H CAC CAU

Isoleucina

Ile I AUA AUC AUU

Lisina

Lys K AAA AAG

Leucina

Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

Metionina

Met M AUG

Asparagina

Asn N AAC AAU

Prolina

Pro P CCA CCC CCG CCU

Glutamina

Gln Q CAA CAG

Arginina

Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU

Serina

Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU

Treonina

Thr T ACA ACC ACG ACU

Valina

Val V GUA GUC GUG GUU

Triptófano

Trp W UGG

Tirosina

Tyr Y UAC UAU

15 La tabla de codones muestra que muchos aminoácidos están codificados por más de un codón. Por ejemplo, los codones AGA, AGG, CGA, CGC, CGG y CGU codifican todos para el aminoácido arginina. Por tanto, en cada posición en los ácidos nucleicos de la invención en la que se especifica una arginina mediante un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos anteriormente sin alterar el polipéptido

20 codificado. Se entiende que U en una secuencia de ARN corresponde a T en una secuencia de ADN.

Tales “variaciones silenciosas” son una especie de “variaciones modificadas de manera conservativa”, comentadas a continuación. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto ATG, que es habitualmente el único codón para metionina, y TTG, que es habitualmente el único codón para triptófano) puede modificarse

25 mediante técnicas convencionales para codificar para un polipéptido funcionalmente idéntico. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica para un polipéptido está implícita en cualquier secuencia descrita. La invención, por tanto, proporciona explícitamente todas y cada una de las variaciones posibles de una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la invención que podrían realizarse seleccionando combinaciones basadas en posibles elecciones de codones. Estas combinaciones se realizan según el código

30 genético de tripletes convencional (por ejemplo, tal como se expone en la tabla 1, o tal como está disponible comúnmente en la técnica) tal como se aplica a la secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de hemaglutinina o uno de neuraminidasa de la invención. Todas de tales variaciones de cada ácido nucleico en el presente documento se proporcionan específicamente y se describen mediante la consideración de la secuencia en combinación con el código genético. Un experto puede realizar por completo estas sustituciones silenciosas usando

35 los métodos en el presente documento.

Variaciones conservativas

Debido a la degeneración del código genético, “sustituciones silenciosas” (es decir, sustituciones en una secuencia

40 de ácido nucleico que no dan como resultado una alteración en un polipéptido codificado) son una característica implícita de cada secuencia de ácido nucleico de la invención que codifica para un aminoácido. De manera similar, las “sustituciones de aminoácido conservativas”, en uno o unos pocos aminoácidos en una secuencia de aminoácidos se sustituyen por aminoácidos diferentes con propiedades sumamente similares, también se identifican

fácilmente al ser sumamente similares a un constructo dado a conocer tal como los del presente documento. Tales variaciones conservativas de cada secuencia dada a conocer son una característica de la presente invención.

“Variación conservativa” de una secuencia de ácido nucleico particular se refiere a los ácidos nucleicos que codifican

5 para secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o, en las que el ácido nucleico no codifica para una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas, véase la tabla 2 a continuación. Un experto reconocerá que sustituciones, deleciones o adiciones individual que alteren, añadan o delecionen un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos (normalmente menos del 5%, más normalmente menos del 4%, el 3%, el 2% o el 1%) en una secuencia codificada son “variaciones modificadas de manera conservativa”

10 cuando las alteraciones dan como resultado la deleción de un aminoácido, la adición de un aminoácido o la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Por tanto, las “variaciones conservativas” de una secuencia de polipéptido enumerada de la presente invención incluyen sustituciones de un pequeño porcentaje, normalmente de menos del 5%, más normalmente de menos del 4%, el 3%, el 2% o el 1%, de los aminoácidos de la secuencia de polipéptido, por un aminoácido seleccionado de manera conservativa del mismo grupo de sustitución

15 conservativa. Finalmente, la adición de secuencias que no alteran la actividad codificada de una molécula de ácido nucleico, tal como la adición de una secuencia no funcional, es una variación conservativa del ácido nucleico básico.

Tabla 2 – Grupos de sustitución conservativa

1

Alanina (A) Serina (S) Treonina (T)

2

Ácido aspártico (D) Ácido glutámico (E)

3

Asparagina (N) Glutamina (Q)

4

Arginina (R) Lisina (K)

5

Isoleucina (I) Leucina (L) Metionina (M) Valina (V)

6

Fenilalanina (F) Tirosina (Y) Triptófano (W)

20 Subsecuencias únicas de polipéptido y polinucleótido

En un aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una subsecuencia única en una SEQ ID NO: 35 de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de HA. La subsecuencia única es única en comparación con un ácido nucleico correspondiente a ácidos nucleicos tales como, por ejemplo, los encontrados en GenBank u

25 otras bases de datos públicas similares en el momento de la presentación (por ejemplo, otras moléculas de ácido nucleico de hemaglutinina y/o neuraminidasa conocidas o caracterizadas). Puede realizarse la alineación usando, por ejemplo, BLAST ajustado a parámetros por defecto. Cualquier subsecuencia única es útil, por ejemplo, como sonda para identificar los ácidos nucleicos de la invención. Véase anteriormente.

30 De manera similar, la invención incluye una SEQ ID NO: 83 de polipéptido que comprende una subsecuencia única en un polipéptido seleccionado de la secuencia de moléculas de HA y NA dadas a conocer en el presente documento. En este caso, la subsecuencia única es única en comparación con un polipéptido correspondiente a, por ejemplo, el aminoácido correspondiente a secuencias de polinucleótido encontradas en, por ejemplo, GenBank u otras bases de datos públicas similares en el momento de la presentación.

35 La invención también proporciona para ácidos nucleicos diana que se hibridan en condiciones rigurosas con un oligonucleótido codificante único que codifica para una subsecuencia única en un polipéptido seleccionado de las secuencias de moléculas de HA y NA de la invención en el que la subsecuencia única es única en comparación con un polipéptido correspondiente a cualquiera de los polipéptidos de control (secuencias de, por ejemplo, los ácidos

40 nucleicos correspondientes a los encontrados en, por ejemplo, GenBank u otras bases de datos públicas similares en el momento de la presentación). Se determinan las secuencias únicas tal como se indicó anteriormente. Los polinucleótidos de la invención también comprenden versiones de ARN (tanto de sentido positivo como de sentido negativo) de las secuencias de la lista de secuencias. Véase anteriormente.

45 Adicionalmente, los kits pueden incluir uno o más sistemas de traducción tal como se indicó anteriormente (por ejemplo, una célula) con material de envasado apropiado, recipientes para contener los componentes del kit, materiales de instrucciones para poner en práctica los métodos en el presente documento y/o similares. De manera similar, pueden proporcionarse los productos de los sistemas de traducción (por ejemplo, proteínas tales como moléculas de HA y/o NA) en forma de kit, por ejemplo, con recipientes para contener los componentes del kit,

50 materiales de instrucciones para poner en práctica los métodos en el presente documento y/o similares. Además, los kits pueden comprender diversas vacunas (por ejemplo, producidas a través de protocolos de rescate de plásmidos) tales como vacunas vivas atenuadas (por ejemplo, FluMist™) que comprenden las secuencias de HA y/o NA en el presente documento.

55 Para facilitar el uso de los métodos y las composiciones de la invención, cualquiera de las composiciones y/o los componentes de vacuna, por ejemplo, virus reordenado en líquido alantoideo, etc., y componentes adicionales, tales

como tampón, células, medio de cultivo, útiles para el empaquetamiento y la infección de los virus influenza para fines de vacuna terapéutica o experimental, pueden envasarse en forma de un kit. Normalmente, el kit contiene, además de los componentes anteriores, materiales adicionales que pueden incluir, por ejemplo, instrucciones para realizar los métodos de la invención, material de envasado y un recipiente.

Lista de secuencias

<110> MedImmune, vaccines Inc.

10 <120> VARIANTES DE HEMAGLUTININA Y NEURAMINIDASA DE INFLUENZA

<130> PG430460EPA

<150> Documento US 60/659.832 15 <151>

<150> Documento US 60/479.078

<151>

20 <150> Documento US 10/870.690

<151>

<160> 96

25 <170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 1745

<212> ADN 30 <213> virus influenza A

<400> 1

<210> 2

<211> 1429

<212> ADN

<213> virus influenza A

<210> 3

<211> 1755 15 <212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 3

5 <210> 4

<211> 1354

<212> ADN

<213> virus influenza A

10 <400> 4

<210> 5

<211> 1762

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 5

<210> 6

<211> 1451

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 6

<210> 7

<211> 1762

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 7

<210> 8

<211> 1467

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 8

<210> 9

<211> 1762

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 9

<210> 10

<211> 1466

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 10

<210> 11

<211> 1762

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 11

<210> 12

<211> 1467

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 12

<210> 13 15 <211> 1778

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 13

<210> 14

<211> 1463 10 <212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 14

<210> 15

<211> 1689

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 15

<210> 16

<211> 1447

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 16

<210> 17

<211> 1775

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 17

<210> 18

<211> 1463

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 18

<210> 19

<211> 1775

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 19

<210> 20

<211> 1463

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 20

<210> 21

<211> 1879

<212> ADN

<213> virus influenza B

<400> 21

<210> 22

<211> 1554

<212> ADN

<213> virus influenza B

<400> 22

<210> 23

<211> 1881

<212> ADN

<213> virus influenza B

<400> 23

<210> 24

<211> 1557

<212> ADN

<213> virus influenza B

<400> 24

<210> 25

<211> 1882

<212> ADN

<213> virus influenza B

<400> 25

<210> 26

<211> 1557 15 <212> ADN

<213> virus influenza B

<400> 26

5 <210> 27

<211> 1879

<212> ADN

<213> virus influenza B

10 <400> 27

5 <210> 28

<211> 1554

<212> ADN

<213> virus influenza B

10 <400> 28

5 <210> 29

<211> 1885

<212> ADN

<213> virus influenza B

10 <400> 29

5 <210> 30

<211> 1544

<212> ADN

<213> virus influenza B

10 <400> 30

<210> 31

<211> 1885

<212> ADN

<213> virus influenza B

<400> 31

<210> 32

<211> 1557

<212> ADN

<213> virus influenza B

<400> 32

<210> 33

<211> 1853

<212> ADN

<213> virus influenza B

<400> 33

<210> 34

<211> 1529

<212> ADN

<213> virus influenza B

<400> 34

<210> 35

<211> 1721

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 35

<210> 36

<211> 1426

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 36

<210> 37

<211> 1736

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 37

<210> 38

<211> 1438

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 38

<210> 39

<211> 1723

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 39

<210> 40

<211> 1428

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 40

<210> 41 15 <211> 1724

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 41

<210> 42

<211> 1426

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 42

<210> 43

<211> 1724

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 43

<210> 44

<211> 1427

<212> ADN

<213> virus influenza A

<400> 44

<210> 45

<211> 1870

<212> ADN

<213> virus influenza B

<400> 45

<210> 46

<211> 1536

<212> ADN

<213> virus influenza B

<400> 46

<210> 47

<211> 1846

<212> ADN

<213> virus influenza B

<400> 47

<210> 48

<211> 1520

<212> ADN

<213> virus influenza B

<400> 48

<210> 49

<211> 566

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 49

<210> 50

<211> 436

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 50

<210> 51

<211> 566

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 51

<210> 52

<211> 451

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 52

<210> 53

<211> 566

<121> PRT

<213> virus influenza A

<210> 54

<211> 469

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 54

<210> 55

<211> 566

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 55

<210> 56

<211> 469

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 56

<210> 57

<211> 566

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 57

<210> 58

<211> 469

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 58

<210> 59

<211> 566

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 59

<210> 60

<211> 469

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 60

<210> 61

<211> 566

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 61

<210> 62

<211> 470

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 62

<210> 63

<211> 562

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 63

5 <210> 64

<211> 470

<212> PRT

<213> virus influenza A

10 <400> 64

<210> 65

<211> 565

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 65

5 <210> 66

<211> 470

<212> PRT

<213> virus influenza A

10 <400> 66

<210> 67

<211> 565

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 67

<210> 68

<211> 470 <212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 68 5 <210> 69

<211> 583

<212> PRT

<213> virus influenza B

10 <400> 69

<210> 70

<211> 465

<212> PRT

<213> virus influenza B

<400> 70

<210> 71

<211> 584 <212> PRT

<213> virus influenza B

<400> 71

<210> 72

<211> 466

<212> PRT

<213> virus influenza B

<210> 73

<211> 584

<212> PRT

<213> virus influenza B

<400> 73

<210> 74

<211> 466

<212> PRT

<213> virus influenza B

<400> 74

<210> 75

<211> 583

<212> PRT

<213> virus influenza B

<210> 76

<211> 465

<212> PRT

<213> virus influenza B

<400> 76

<210> 77

<211> 585

<212> PRT

<213> virus influenza B

<400> 77

<210> 78

<211> 466

<212> PRT

<213> virus influenza B

<400> 78

<210> 79

<211> 585

<212> PRT

<213> virus influenza B

<400> 79

5 <210> 80

<211> 466

<212> PRT

<213> virus influenza B

10 <400> 80

<210> 81

<211> 584

<212> PRT

<213> virus influenza B

<400> 81

<210> 82

<211> 466 <212> PRT

<213> virus influenza B

<400> 82 5 <210> 83

<211> 566

<212> PRT

<213> virus influenza A

10 <400> 83

<210> 84

<211> 469

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 84

<210> 85

<211> 550 <212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 85

<210> 86

<211> 469

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 86

<210> 87

<211> 550 <212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 87

<210> 88

<211> 469

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 88

<210> 89

<211> 550

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 89

<210> 90

<211> 469

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 90

<210> 91

<211> 550

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 91

<210> 92

<211> 469

<212> PRT

<213> virus influenza A

<400> 92

<210> 93

<211> 569

<212> PRT

<213> virus influenza B

<400> 93

<210> 94

<211> 466

<212> PRT

<213> virus influenza B

<400> 94

<210> 95

<211> 569

<212> PRT

<213> virus influenza B

<400> 95

<210> 96

<211> 466

<212> PRT

<213> virus influenza B

<400> 96

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Virus influenza reordenante 6:2, en el que dicho virus comprende 6 segmentos de genoma internos de uno

   o más virus donadores distintos de A/Ann Arbor/6/60 y 2 segmentos de genoma de antígeno de superficie, en el que los segmentos de genoma de antígeno de superficie codifican para un polipéptido de HA y uno de NA, en el que el segmento de genoma de antígeno de superficie que codifica para el polipéptido de HA produce un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83.

2. 2.

   Virus influenza reordenante 6:2 según la reivindicación 1, en el que dicho uno o más virus donadores comprenden uno o más de los siguientes fenotipos: sensible a la temperatura, adaptado al frío o atenuado.

3. 3.

   Virus influenza reordenante 6:2 según la reivindicación 1, en el que dicho virus donador es PR8.

4. 4.

   Composición inmunogénica que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz del virus influenza reordenante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. 5.

   Virus influenza reordenante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o composición inmunogénica según la reivindicación 4, para su uso en la estimulación del sistema inmunitario de un sujeto para producir una respuesta inmunitaria protectora frente a virus influenza, en el que el virus influenza reordenante va a administrarse al sujeto en una cantidad inmunológicamente eficaz y en un portador fisiológicamente eficaz.

6. 6.

   Virus influenza reordenante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o composición inmunogénica según la reivindicación 4, para su uso en el tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección viral en un sujeto, en el que el virus influenza reordenante va a administrarse al sujeto en una cantidad eficaz para producir una respuesta inmunogénica frente a la infección viral.

7. 7.

   Virus influenza reordenante según la reivindicación 5 ó 6, en el que dicho virus está desactivado o inactivado.

8. 8.

   Vacuna contra la gripe viva atenuada que comprende la composición inmunogénica según la reivindicación

9. 4.

10. 9.

    Método para producir un virus influenza en cultivo celular, comprendiendo el método:

    i) introducir en una población de células huésped, población de células huésped que puede soportar la replicación de virus influenza, una pluralidad de vectores que comprenden secuencias de nucleótidos que corresponden a:

    (a)

    al menos 6 segmentos de genoma internos de una cepa donadora, en el que la cepa donadora no es A/Ann Arbor/6/60; al menos un segmento de genoma que codifica para un polipéptido de antígeno de superficie de HA en el que el polipéptido de antígeno de superficie comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83; y al menos un segmento de genoma que codifica para un polipéptido de antígeno de superficie de NA; o

    (b)

    al menos 6 segmentos de genoma internos de una cepa donadora, en el que la cepa donadora no es A/Ann Arbor/6/60 y cepa donadora que comprende uno o más atributos fenotípicos seleccionados del grupo que consiste en: atenuado, adaptado al frío y sensible a la temperatura; al menos un segmento de genoma que codifica para un antígeno de superficie de HA en el que el polipéptido de antígeno de superficie comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83; y al menos un segmento de genoma que codifica para un polipéptido de antígeno de superficie de NA;

    ii) cultivar la población de células huésped a una temperatura inferior o igual a 35ºC; y

    iii) recuperar un virus influenza.