KR101605521B1 - 인플루엔자 바이러스에 대해 범용면역성을 갖는, 재조합 헤마글루티닌 ha5 항원 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 H1N1, H1N2, H2N2, H9N2, H5N1, H3N2 또는 H7N7형 인플루엔자 바이러스에 의한 감염 질환을 치료 또는 예방하기 위한, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA) 및 상기 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌의 N-말단에 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 저온 유도 단백질(cold shock protein, CSP)을 포함하는 융합단백질을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 조성물은 다양한 아변종 인플루엔자 바이러스 주에 대한 범용면역성을 갖는 범용백신으로 활용될 수 있다.

Description

인플루엔자 바이러스에 대해 범용면역성을 갖는, 재조합 헤마글루티닌 HA5 항원 및 이의 용도 {A hetero-subtypic immunity against influenza virus, recombinant hemagglutinin HA5 antigens and their uses}

본 발명은 H1N1, H1N2, H2N2, H9N2, H5N1, H3N2 또는 H7N7형 인플루엔자 바이러스에 의한 감염 질환을 치료 또는 예방하기 위한, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA) 및 상기 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌의 N-말단에 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 저온 유도 단백질(cold shock protein, CSP)을 포함하는 융합단백질을 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 매년 겨울철 유행하는 호흡기 감염성 질환으로 인구의 10-20%가 감염되며, 노인 및 만성질환자 등의 고위험군에 속하는 환자군에서는 합병증의 발생과 사망을 초래할 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 크게 A, B 및 C 3가지 형으로 구분되며, 표면 항원인 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)과 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA)의 변화에 따른 항원 변이(Antigenic drift 또는 shift)를 통하여 인구집단에서 기존의 인플루엔자 바이러스에 형성되어 있던 면역을 회피하여 유행을 초래하게 된다. 이에 따라, 세계 각국에서는 신종 및 변종 인플루엔자 바이러스 대유행에 효과적, 적극적으로 대응하기 위하여 백신의 연구개발이 활발히 이루어지고 있고, 궁극적으로는 다양한 아변종의 인플루엔자 바이러스에 대한 면역원성을 갖는 백신의 개발이 절실히 필요하다. 즉, 하나의 백신에 의해 유도된 면역반응에 의해 여러 인플루엔자 주들에 대해서도 면역력과 감염에 대한 방어력을 획득하는 범용면역성(hetero-subtypic immunity)을 갖는 백신의 개발이 필요하다.

인플루엔자 범용 면역백신을 개발하기 위하여, 인플루엔자 바이러스의 아형들(subtypes)의 유전정보를 분석하여 비교적 변이가 적은 내부 단백질(internal protein)들인 M2e, NS 또는 NP 단백질이 이용되고 있다. 예를 들어, 이들 단백질에서, 인플루엔자 바이러스 아형간에 진화적 동일성(evolutional homologue)이 있는 영역들을 타겟으로 항원을 디자인하고, 이로부터 다양한 백신 제형(platform)을 이용하여 범용백신으로 적용하고자 하는 많은 시도와 연구들이 있다. 이 중 특히 M2 단백질의 엑토도메인(ectodomain)이 인플루엔자에 대한 범용 백신으로 많이 연구되어 있다.

또한, 인플루엔자 바이러스의 표면 항원단백질인 헤마글루티닌을 이용한 범용백신 개발 연구도 이루어지고 있는데, 헤마글루티닌은 크게 면역우성(Immuno-Dominant) 영역인 HA1 (Head 또는 Globular 영역)과 그 외 영역인 HA2(줄기: Stalk 영역)으로 나뉜다. HA1 영역이 아형간(Subtype)에 상당한 다양성 및 변이를 나타내며(아형간에 30%이하의 유사성) 변이에 의해 항원의 대변이(Antigenic shift)를 일으키는 항원 영역인 반면, HA2영역은 진화학적으로 안정화된(Evolutionary Stable) 영역으로 아형간에 상당한 유사성(homologue)을 나타내며 낮은 빈도의 변이를 나타낸다(인플루엔자 아형간에 60~80%의 유사성). 이러한 HA2 영역의 단백질을 이용하여, 범용 면역성을 나타내며 다양한 아형의 인플루엔자 바이러스에 친화력을 갖는 항체 또는 범용백신을 제조하는 것이 가능하다(Journal of General Virology (1996), 77, 1483-1487).

본 발명의 목적은 H1N1, H1N2, H2N2, H9N2, H5N1, H3N2 또는 H7N7형 인플루엔자 바이러스에 의한 감염 질환을 치료 또는 예방하기 위한, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA) 및 상기 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌의 N-말단에 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 저온 유도 단백질(cold shock protein, CSP)을 포함하는 융합단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 일 구체예에서, H1N1, H1N2, H2N2, H9N2, H5N1, H3N2 또는 H7N7형 인플루엔자 바이러스에 의한 감염 질환을 치료 또는 예방하기 위한, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌 (hemagglutinin, HA) 및 상기 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌의 N-말단에 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 저온 유도 단백질(cold shock protein, CSP)을 포함하는 융합단백질을 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 일 구체예에서, 상기 융합 단백질은 서열번호 6으로 구성된 것일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 일 구체예에서, 저온 유도 단백질(CSP)이 삽입된 재조합 인플루엔자 HA을 포함하는 면역원성 조성물은 대장균에서 발현 후 정제한 것일 수 있다. 본 발명에 따른 일 구체예에서, 인플루엔자 헤마글루티닌은 H1N1pdm09 virus-A/Korea/01/2009로부터 유래한 것일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 인플루엔자 헤마글루티닌은 A/Puerto Rico/1934 또는 A/Hong Kong/1/1968로부터 유래한 것일 수 있다.

본 발명에 따른 일 구체예에서, H1N1형 인플루엔자 바이러스는 H1N1-A/Brevig Mission/1918, H1N1-A/Puerto Rico/8/1934, H1N1-A/Solomon Islands/3/2006, H1N1-A/Brisbane/59/2007 또는 H1N1-A/California/07/2009일 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, H1N2형 인플루엔자 바이러스는 H1N2-A/Swine/Guangxi/13/2006일 수 있고, H2N2형 인플루엔자 바이러스는 H2N2-A/Japan/305/1957일 수 있으며, H9N2형 인플루엔자 바이러스는 H9N2-A/Hong Kong/1073/99일 수 있고, H5N1형 인플루엔자 바이러스는 H5N1-A/VietNam/1194/2004, H5N1-A/Anhui/1/2005 또는 H5N1-A/Chicken/IS/2006일 수 있으며, H3N2형 인플루엔자 바이러스는 H3N2-A/Brisbane/10/2007일 수 있고, H7N7형 인플루엔자 바이러스는 H7N7-A/Netherlands/219/03일 수 있다.

본 발명에 따른 일 구체예에서, 면역원성 조성물은 근육 내 경로로 투여될 수 있으며, 면역원성 조성물은 알룸 애주번트를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 일 구체예에서, 면역원성 조성물은 비강 내 경로로 투여될 수 있으며, 면역원성 조성물은 콜레라 독소 애주번트를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 일 구체예에서, (a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 인플루엔자 헤마글루티닌으로부터 60 내지 291번째 아미노산을 제거하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 생성된 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌의 N-말단에 저온 유도 단백질을 삽입하는 단계를 포함하는, H1N1, H1N2, H2N2, H9N2, H5N1, H3N2 또는 H7N7형 인플루엔자 바이러스에 의한 감염 질환을 예방하기 위한 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 일 구체예에서, 상기 저온 유도 단백질은 서열번호 7로 구성될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "인플루엔자 바이러스"는 인플루엔자를 유발할 수 있는 바이러스로서, 이에 한정되지는 않지만, A형, B형 및 C형 인플루엔자 바이러스를 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "범용면역성(hetero-subtypic immunity, HSI)"이란 하나의 인플루엔자 바이러스 아형에 대해 유도된 면역반응에 의해 다른 인플루엔자 바이러스 아형에 대하여 면역력을 획득하게 되는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "인플루엔자 바이러스 감염 질환"이란 인플루엔자 바이러스의 감염으로 유발되는 질환으로, 발작적 천식, 중이염, 기관지염, 폐렴, 설사 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서, HA 단백질을 포함하는 아형의 예는 H1N1-A/Brevig Mission/1/1918, H1N1-A/Puerto Rico/8/1934, H1N1-A/Solomon Islands/3/2006, H1N1-A/Brisbane/59/2007, H1N1-A/California/07/2009, H1N2-A/Swine/Guangxi/13/2006, H2N2-A/Japan/305/1957, H9N2-A/Hong Kong/1073/99, H5N1-A/VietNam/1194/2004, H5N1-A/Anhui/1/2005, H3N2-A/Brisbane/10/2007, 및 H7N7-A/Netherlands/219/03를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 당업자에게 공지된 하나 이상의 투여경로, 비경구, 경피 또는 점막, 비강 내, 근육 내, 복강 내, 피내, 정맥 또는 피하 경로 등으로 피험자에게 투여될 수 있으며, 그에 따라 제제화할 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 액상제제로서 근육 내, 복강 내, 표피, 정맥, 동맥 또는 피하 경로를 통한 주사, 또는 호흡기 점막 주사로 투여할 수 있다. 주사용 액상 제제는 용액 또는 그와 같은 종류를 포함한다.

본 발명의 조성물은 단회 투여 용량 바이얼, 다회 투여 용량 바이얼 또는 프리필드시린지 형태로 제제화할 수 있다. 액상 제제에 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체에는 수성 또는 비수성 용매, 현탁액, 에멀젼, 오일이 있다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸 올레이트가 있다. 수성 담체는 물, 알코올/수성 용매, 에멀젼 또는 현탁액, 생리식염수, 버퍼 용액을 포함한다. 오일의 예로는 식물성 또는 동물성 오일, 피넛 오일, 대두유, 올리브 오일, 해바라기 오일, 간유, 수산유지(marine oil)와 같은 합성 오일, 우유나 달걀에서 얻은 지질이 있다. 약제학적 조성물은 등장성, 고장성 또는 저장성일 수 있다. 하지만 주입(infusion)이나 주사로 투여되는 약제학적 조성물은 기본적으로 등장성이 바람직하다. 따라서 등장성이나 고장성이 조성물의 저장에 유리할 수 있다. 약제학적 조성물이 고장성일 경우, 투여 전에 등장성이 되도록 희석할 수 있다. 등장화제는 염과 같은 이온성 등장화제이거나 탄수화물과 같은 비이온성 등장화제일 수 있다. 이온성 등장화제에는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화칼륨, 염화마그네슘 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 비이온성 등장화제에는 솔비톨, 글리세롤 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 최소한 한 가지의, 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함한다. 예를 들면, 약제학적 조성물이 주입제(infusion)나 주사제일 경우 pH 4 내지 10, 예를 들어, 5 내지 9, 6 내지 8에서 완충능을 가지는 완충액으로 구성되는 것이 바람직하다. 완충액은 TRIS, 아세테이트, 글루타메이트, 락테이트, 말리에이트, 타트레이트, 포스페이트, 시트레이트, 카보네이트, 글리시네이트, 히스티딘, 글리신, 석시네이트, 트리에탄올아민 완충액으로 구성된 group에서 선택할 수 있다.

특히 약제학적 조성물이 비경구 투여를 목적으로 할 경우, 완충액은 USP에 적합한 완충액 중에서 선택할 수 있다. 예를 들면, 완충액은 아세트산, 벤조산, 글루콘산, 글리세르산, 젖산과 같은 일염기산; 아코니트산, 아디프산(adipic), 아스코르빈산, 탄산(carbonic), 글루타민산, 말산, 석신산, 주석산과 같은 이염기산; 시트르산, 인산과 같은 다염기산; 암모니아, 다이에탄올아민, 글리신, 트리에탄올아민, TRIS와 같은 염기로 구성된 군에서 선택할 수 있다. 비경구적 투여 시 비히클(피하, 정맥 내, 동맥 내, 근육 내 주사)에는 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose) 용액, 덱스트로스와 염화나트륨, 락테이티드 링거(lactated Ringer's) 용액 및 불휘발성유(fixed oils)가 포함된다. 정맥 내 투여용 비히클에는 링거 덱스트로스(Ringer's dextrose) 용액 또는 이와 같은 용액을 기본으로 한 수액과 영양 보충제와 전해질 보충제가 포함된다. 계면활성제와 약제학적으로 적합한 애주번트가 첨가되거나 혹은 첨가되지 않은 물과 오일 같은 멸균된 액체가 그 예이다. 일반적으로, 물, 생리식염수, 덱스트로스 용액, 관련 당 용액, 프로필렌 글리콜이나 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜, 폴리소르베이트 80이 특히 주사액에 적합하다. 오일의 예로는 동물성 및 식물성 오일, 피넛 오일, 대두유, 올리브 오일, 해바라기 오일, 간유, 수산유지(marine oil)와 같은 합성 오일, 우유나 달걀에서 얻은 지질이 있다.

본 발명의 제제(formulation)는 계면활성제를 포함할 수 있다. 바람직하게는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(보통 Tweens이라고 불리는) 중 특히 폴리소르베이트 20과 폴리소르베이트 80; 에틸렌 옥시드(EO), 프로필렌 옥시드(PO), 부틸렌 옥시드(BO)의 공중합체(예: DOWFAXTM); 에톡시(oxy-1,2-ethanediyl) 그룹의 반복 수가 서로 다른 옥스톡시놀류, 특히 오스톡시놀-9(Triton-100); 에틸페녹시폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630/NP-40); 레시틴과 같은 인지질; TergitolTM NP 시리즈와 같은 노닐페놀 에톡시레이트; 라우릴, 세틸, 스테아릴, 올레일 알코올에서 유도된 폴리옥시에틸렌 지방산 에테르(Brij 계면활성제), 특히 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르(Brij 30); SPANs으로 알려진 소르비탄 에테르, 특히 소르비탄 트리올레이트(Span 85)와 소르비탄 모노라우레이트와 같은 계면활성제를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. Tween 80는 에멀젼에 포함되기에 바람직하다.

본 발명에 따른 면역원성 조성물은 다양한 아변종 인플루엔자 바이러스 주에 대한 범용면역성을 갖는 범용백신으로 활용될 수 있고, 백신생산 시설에 도입하여 인플루엔자 바이러스 범용 백신을 제공할 수 있다.

도 1은 인플루엔자바이러스의 헤마글루티닌(HA)에서 HA1의 일부 영역을 제거하고, 이에 저온 유도 단백질(cold-shock protein, CSP)이 삽입된 재조합 헤마글루티닌(HA5) 단백질의 제조과정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시 예에 따른 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌인 HA5의 제조과정을 모식화하여 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌인 HA5의 DNA 및 아미노산 서열이다.
도 4a는 대장균에서 발현된 HA5 단백질을 포함하는 세포 배양액을 SDS-PAGE를 통하여 확인한 것이다.
도 4b는 IMAC(immobilized metal affinity chromatography)를 이용하여 100mM 내지 500mM의 농도 기울기의 이미다졸로 정제한 HA5를 확인한 것이다.
도 5는 HA5 단백질의 면역원성 확인하기 위하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과이다.
도 6a, 6b 및 6c는 다양한 인플루엔자 아형의 HA 항원과 HA5 면역항원을 면역한 마우스에서 생성된 항체의 교차-반응성을 ELISA를 통해 확인한 결과이다.
도 7은 HA5 면역항원 면역에 의한 마우스에서의 인플루엔자바이러스 감염의 방어를 확인한 결과이다. (A)는 HA5 면역항원을 2회 접종 후 2주 후에 A/Korea/01/2009 (H1N1pdm09) 바이러스를　5x10⁴ pfu로 감염하여 체중의 증감 및 생존율을 측정한 결과이고, (B)는 HA5 면역항원을 2회 접종 후 2주 후에 A/Puerto Rico/8/1934(H1N1) 바이러스를 5xmLD50로 감염하여 체중의 증감 및 생존율을 측정한 결과이며, (C)는 HA5 면역항원을 2회 접종 후 2주 후에 A/Chicken/IS/2006(H5N1) 바이러스를 5xmLD50로 감염하여 체중의 증감 및 생존율을 측정한 결과이다.
도 8은 HA5 면역항원을 기반으로 한 인플루엔자 백신의 면역원성(A) 및 백신효능평가를 위한 동물실험 일정(B)을 도시한 것이다.
도 9는 HA5를 근육 내 및 비강 내 경로 면역 후, 인플루엔자 바이러스 접종에 의한 마우스에서의 백신효능 평가한 결과이다.
도 10은 Headless HA 면역항원 HA5의 면역경로(비강 내 경로/근육 내 경로)에 따른 기관지점막 연관림프조직(Bronchus-Associated Lymphoid Tissue: BALT)에서의 인플루엔자바이러스 HA에 대한 항체 IgG/IgA 생성량 비교실험 결과이다(코의 유체(nasal fluid) 사용).
도 11은 Headless HA 면역항원 HA5의 면역경로(비강 내 경로/근육 내 경로)에 따른 BALT에서의 인플루엔자바이러스 HA에 대한 항체 IgG/IgA 생성량 비교실험 결과이다(기관지점막 연관림프조직(BAL) 유체 사용)
도 12는 HA5 면역경로(비강 내 경로/근육 내 경로)에 따른 장관연관림프조직(Gut associated Lymphoid Tissue: GALT) 분변 추출물(fecal extracts)에서의 IgG/IgA를 확인한 결과이다.
도 13은 HA5의 비강 내 면역 후, A/Korea/01-2-9/2009(pdmH1N1) 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 폐조직 병변 분석 결과이다.
도 14는 HA5의 비강 내 면역 후, A/Puerto Rico/8/1934(PR8, H1N1) 감염에 대한 폐조직 병변 분석 결과이다.
도 15는 HA5의 비강 내 면역 후, A/Chicken/IS/2006(H5N1) 감염에 대한 폐조직 병변 분석 결과이다.
도 16은 HA5 면역항원의 비강 내 / 근육 내 경로 면역 후 인플루엔자바이러스 감염 특이적 세포성 면역 반응을 측정한 결과이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. HA5 발현 벡터의 제작

범용면역반응(Hetero-subtypic immunity)을 극대화시키고, 단형(monotypic) 면역반응을 최소화시키기 위해 면역우성 부위인 HA의 HA1 영역중 일부를 제거하였으며(도 1), 단백질 발현 및 용해도를 증대시키기 위해 cold-shock 발현 벡터인 pCold TF 벡터(TAKARA)에 클로닝하여, HA5 면역항원을 제작하였다(도 2). pCold 벡터는 저온 유도 단백질(cold-shock protein)인 cspA 유전자에서 유래된 벡터로, 단백질 발현 유도시 발현 온도를 15℃까지 낮추어 다른 시스템에서 발현되지 않은 단백질의 발현 및 용해도를 높이는 데 사용된다. 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질 Headless HA의 N-말단에 저온 유도 단백질을 융합하였으며, N,C-말단에 6개의 히스티딘을 태깅(tagging)하였다. 본원발명에 따른 HA5를 제작하는 과정을 도 1 및 도 2에, 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌 영역 및 저온 유도 단백질의 서열을 도 3에 도시하였다.

실시예 2. HA5 단백질의 발현

실시예 1에서 제조한 HA5로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)에서 단백질 발현을 유도한 결과, 저온 유도 단백질(55kDa) 및 Headless HA(32.4kDa)를 포함하는 약 87kDa 크기의 가용성 단백질이 발현되었다(도 4a). 대장균에서 발현된 HA5 단백질을 IMAC(immobilized metal affinity chromatography)을 이용하여 정제하였으며, 100mM~500mM의 농도 기울기의 이미다졸로 용리하였다. 정제된 단백질은 최적 버퍼인 50mM Tris-HCl(pH 8.0)으로 투석하였다(도 4b). HA5 단백질이 인플루엔자바이러스에 대한 범용백신 면역항원으로 기능할 수 있는 지를 확인하기 위하여, 인플루엔자 바이러스 HA에 대한 항체와 HA5 단백질의 상호작용 여부를 웨스턴 블롯 시험을 수행하였다. 그 결과, PR8(A/Puerto Rico/8/1934)의 HA에 대한 pAb 및 H1N1pdm09의 HA에 대한 pAb가 HA5 단백질에 특이적으로 결합하였다(도 5).

실시예 3. ELISA 에 의한 여러 인플루엔자 아형의 HA 항원과 HA1 도메인의 일부가 제거되고 CSP이 결합된 HA5 를 면역한 마우스에서 생성된 항체의 교차 반응성

HA5 면역항원을 마우스에서 2차 면역 후 채혈한 혈장을 이용하여 면역원의 접종에 대한 면역반응이 일어나는지를 확인하기 위하여 ELISA를 수행하였다. 실험동물로는 6주령 암컷 Balb/c 마우스를 사용하였으며, 면역항원으로는 HA5를 사용하였다. 양성대조군을 위한 면역항원으로 불활성화된 A/Korea/01/2009(H1N1pdm09) 및 A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)를 사용하였다.

도 1,2,3,4,5에 따른 HA5 면역항원 및 불활성화된 인플루엔자 모두 근육 내 경로로 1회 면역시 50μg의 면역항원과 알룸(alum: 포타슘 알루미늄 설페이트) 애주번트를 50μL 첨가하여 100μL로 면역하였다. 항원에 대한 면역반응이 생겼는 지 여부를 실험하기 위해 면역 전, 1차 면역 후, 2차 면역 후 각각 채혈을 실시하여 혈청을 분리하였다. 2회 면역화된 마우스의 안화후총(retroorbital plexus)에서 헤파린 처리 미세관(heparinized capilliary tube)을 통해 혈액을 채취하여 원심분리를 통해 혈청을 얻었다. 상기 수득한 혈청이 이질아형 면역성을 나타내는지를 확인하기 위해, 다양한 인플루엔자 바이러스 HA 항원(H1N1/A/Brevig Mission/1/1918, H1N1/A/Puerto Rico/8/1934, H1N1/A/Solomon Islands/3/2006, H1N1/A/Brisbane/59/2007, H1N1/A/California/07/2009, H1N2/A/Swine/Guangxi/13/2006, H2N2/A/Japan/305/1957, H9N2/A/Hongkong/1073/99, H5N1/A/VietNam/1194/2004, H5N1/A/Anhui/1/2005 및 H3N2/A/Brisbane/10/2007, H7N7/A/Netherlands/219/03)을 이용하여 ELISA를 수행하였다.

96-웰 플레이트에 2μg/mL의 항원(A~L: 하기 각 아형에 대한 명명 참조)을 코팅하고, 하룻밤 동안 4℃에 두었다. 이후, 5% 탈지유/PBS(phosphate buffered saline)로 2시간 블로킹한 후, 2회 면역에서 얻어진 혈청을 1:50의 최종농도로 2배씩 연속 희석하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 이후, PBST(Phosphate buffered saline-Tween 20)로 3번 세척 후, 항-마우스-HRP 항체를 1:2,000으로 희석하여, 1시간 동안 반응시켰다. 이후, PBST로 5회 세척한 후, TMB 및 OPD로 발색시키고, 1M H₃PO₄로 반응을 중단시킨 후, 450nm(TMB), 490nm(OPD)에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, H1N1-A/Brevig Mission/1/1918(A), H1N1-A/Puerto Rico/8/1934(B), H1N1/A/Solomon Islands/3/2006(C), H1N1-A/Brisbane/59/2007(D), H1N1-A/California/07/2009(E), H5N1-A/VietNam/1194/2004(I) 및 H5N1-A/Anhui/1/2005 (J) 아형 항원에 대해서는 양성대조군인 pdmH1N1 또는 PR8이 HA5 면역항원보다 면역원성이 높게 나타나거나, 거의 비슷한 면역원성을 나타냈으나, H1N2-A/Swine/Guangxi/13/2006(F), H2N2-A/Japan/305/1957(G), H9N2-A/Hongkong/1073/99(H), H3N2-A/Brisbane/10/2007(K) 및 H7N7-A/Netherlands/219/03(L)의 항원에 대해서는, 양성대조군보다, HA5를 면역한 혈청이 월등히 높게 상호작용하였다. 또한, 항원(A~J)는 인플루엔자 HA의 Stalk 도메인에 따른 분루기준으로 그룹 1 서브타입이며, 항원(K,L)은 그룹 2 서브타입임에도, HA5 면역항원 혈청은 서브타입에 상관없이 반응하였다. 이로부터, HA5 면역항원은 이질아형에 들에 대한 면역성을 나타냄을 확인하였다(도 6a 내지 6c).

실시예 4. HA5 면역항원의 근육 내(I.M.) 면역에 의한 실험동물에서의 백신효능 평가(인플루엔자바이러스 감염실험)

HA5 면역항원이 실제 인플루엔자 백신으로 효능을 갖는지를 확인하기 위하여 HA5 면역항원 면역 후, 인플루엔자바이러스로 실험동물을 감염시키고 체중 및 생존율을 관찰하는 실험을 수행하였다.

실험동물로는 6주령 암컷 Balb/c 마우스를 사용하였으며, 실험군 면역항원으로는 HA5를 사용하였고, 양성대조군을 위한 면역항원으로 불활화된 A/Korea/01/2009(H1N1), A/Puerto Rico/8/1934(H1N1), A/Chicken/Korea/IS/2006(H5N1)를 면역항원으로 사용하였다. 실험 수행 시, HA5 면역항원, 불활화된 인플루엔자 모두 근육 내(I.M.) 경로로 1회 면역시 50㎍의 면역항원과 알룸(alum: 포타슘 알루미늄 설페이트) 애주번트를 50㎕ 첨가하여 100㎕를 면역하였다. 인플루엔자바이러스의 접종은 2차 면역 후 2주 후에 A/Korea/01/2009(H1N1), A/Puerto Rico/8/1934(H1N1), A/Chicken/IS/2006 (H5N1)를 각각, 5X10⁴ pfu/마리, 5XmLD50/마리, 5XmLD50/마리로 비강 내(I.N.) 경로로 접종하여, 15일간 체중 및 마우스의 상태 변화와, 생존율을 관찰하였다 (도 7).

A/Korea/01/2009(H1N1) 인플루엔자 바이러스를 감염한 결과, HA5를 근육 내 경로로 면역한 마우스가 음성대조군(PBS 면역)에 비해 70% 높은 생존율과 낮은 체중감소가 관찰되었고(도 7의 (A)), A/Puerto Rico/8/1934(H1N1) 인플루엔자 바이러스를 감염한 결과 역시, HA5로 면역한 마우스가 양성 대조군과 비슷한 체중감소와 생존율을 보였다(도 7의 (B)). A/Chicken/IS/2006(H5N1) 인플루엔자 바이러스를 감염 결과, HA5로 면역한 마우스가 음성 대조군과 비슷한 높은 체중감소와 낮은 생존율을 보이는 것을 확인하였으며(도 7의 (C)), 이는 HA5를 근육 내 경로 면역하는 경우, H1N1형 인플루엔자바이러스에 대한 감염에 대해서는 방어능을 나타내지만, H5N1형 바이러스의 감염에 대해서는 방어하지 못하였다(도 7).

실시예 5. HA5 면역항원의 비강 내(I.N.: Intra Nasal ) 경로를 통한 이질 아형 면역 유발 동물 실험

HA5 면역항원을 이용한 실험동물 마우스에 면역 후에, H5N1형 바이러스의 HA에 대한 항체 IgG가 생성되지만, H5N1 바이러스의 감염에 대해서는 방어하지 못하는 결과가 나왔다(도 7). 이에 HA5의 면역에 의한 이질 아형 면역반응을 증가 또는 개선하기 위한 방법으로 HA5를 점막면역 경로의 하나인 I.N.(Intra Nasal)로 면역한 후 인플루엔자바이러스로 실험동물에 감염하여 체중변화 및 생존율을 관찰하는 실험을 계획 및 수행하였다(도 8).

실험동물은 6주령 암컷 Balb/c 사용하였으며, 실험군으로는 재조합 단백질 면역항원으로 HA5을 근육 내 경로와 비강 내 경로의 면역 경로를 달리한 그룹과, 양성 대조군을 위한 면역 항원으로서 불활화된 A/Korea/01-2-0/2009(H1N1pdm09), A/Puerto Rico/8/1934(PR8), A/Chicken/IS/2006 (H5N1 IS) 바이러스를 사용하여 면역하였다. 각 실험군은 10~15마리이며, 2주 간격으로 3회 면역항원을 접종하고, 면역 후 3주 후에 각각의 인플루엔자 바이러스로 감염하였다(도 8).

항원에 대한 면역반응 유무를 확인하기 위해, 면역 전, 3차 면역 후 각각 채혈을 실시하여 혈청을 분리하였다. 인플루엔자 바이러스의 접종은 3차 면역 후 3주 뒤 마우스를 A/Korea/01-2-9/2009(H1N1), A/Puerto Rico/8/1934(H1N1), A/Chicken/IS/2006 (H5N1)를 각각, 7.5x10⁴ pfu/마우스, 7.5xmLD50/마우스, 2.5xmLD50/마우스로 비강을 통해 감염하여 15일간 체중 감소 및 마우스의 상태 변화와 생존율을 측정하였다. 감염 후 4일, 6일 후 감염된 마우스의 부검을 실시하여 폐를 채취한 후, 용균반 검사(plaque assay)와 빠른 배양 검사(rapid culture assay)를 통해 폐 역가(lung titer)를 측정하였으며, 10% 중성 포르말린에 고정시킨 폐 조직은 헤마톡실린-에오신(H&E: hematoxylin-eosin) 염색 후 병리조직학적 변화를 확인하였다. 감염 후 15일, 각 그룹의 생존한 마우스의 혈청을 분리하여 혈청 내 H1N1, H5N1 바이러스에 대한 항체가를 확인하였으며, 부검을 통해 얻어진 비장(spleen)에서 비장세포(splenocyte)를 분리하여 인플루엔자바이러스 감염에 대한 세포성 면역반응을 확인하기 위한 ELISPOT(Enzyme-Linked ImmunoSpot)을 수행하였다.

(1) HA5 면역항원 면역 점막면역( Intra Nasal )에 의한 실험동물에서의 백신 효능 평가

HA5 면역항원의 점막면역에 의한 범용면역성(hetero-specific immunity: HSI) 유발의 증강 효과를 확인하기 위해, HA5를 면역원으로 이용하여 마우스에 점막면역경로인 비강 내 및 근육 내 경로로 달리하여 각각 면역하였다. 6주령 암컷 Balb/c 마우스에 근육 내 경로는 마우스의 대퇴부 근육에 50㎍의 면역항원 및 면역보조제 알룸 애주번트를 1:1 비율로 첨가하여 100㎕씩 접종하였고, 비강 내 경로는 마우스를 마취시킨 후, HA5 면역 항원 50㎍에 면역보조제로 콜레라 독소(1~2㎍/마우스)를 첨가하여 32㎕로 하여 BALB/c 마우스 비강으로 면역하였다. 실험은 모두 4가지 실험군으로 진행하였으며, 각 실험군은 12마리이며, 2주 간격으로 3회 면역항원을 접종하였다. 항원에 대한 면역반응 유무를 확인하기 위해, 면역 전, 3차 면역 후 각각 채혈을 실시하여 혈청을 분리하였다. 인플루엔자 바이러스의 접종은 3차 면역 후 3주 뒤 마우스를 마취시킨 후, A/Korea/01-2-9/2009(H1N1), A/Puerto Rico/8/1934(H1N1), A/Chicken/IS/2006(H5N1)를 각각, 7.5x10⁴ pfu, 7.5xmLD50, 2.5xmLD50로 비강 내 경로로 감염하여 15일간 체중 감소 및 마우스의 상태 변화와 생존율을 측정하였다(도 9).

A/Korea/01-2-9/2009(H1N1) 인플루엔자 바이러스를 감염한 결과, HA5를 근육 내 경로로 면역한 마우스가 음성대조군인 PBS로 면역한 마우스에 비해 높은 생존율과 낮은 체중감소가 관찰되었으나, HA5를 비강 내 경로로 면역한 마우스는 HA5를 근육 내 경로로 면역한 마우스보다 낮은 체중감소와 높은 생존율를 관찰할 수 있었다(도 9A), A/Puerto Rico/8/1934(H1N1) 인플루엔자 바이러스를 감염한 결과는 음성대조군 PBS를 면역한 마우스에 비해, 근육 내 및 비강 내 경로로 HA5를 면역한 마우스가 양성대조군인 A/Puerto Rico/8/1934(PR8)을 면역한 마우스 그룹과 거의 유사한 높은 생존율을 보였으나, HA5를 비강 내 경로로 면역한 마우스가 HA5를 근육 내 경로로 면역한 마우스 그룹에 비해 인플루엔자바이러스 감염 후 7,8,9일에 유의적으로 높은 체중을 유지하는 것으로 확인되었다(도 9B).

A/Chicken/IS/2006(H5N1) 인플루엔자 바이러스 감염 후, A/Chicken/IS/2006(H5N1 IS)을 면역한 양성대조군을 제외하고 HA5을 비강 내 경로로 면역한 마우스 군이 가장 높은 70%의 생존율과 함께 가장 낮은 체중감소가 관찰되었다. 근육 내 경로로 면역한 마우스는 음성대조군보다 생존율은 높으나, 체중변화는 음성대조군과 거의 비슷한 것을 확인할 수 있었다 (도 9C).

세 가지 바이러스의 감염 결과를 종합해 보면, HA5 면역항원을 근육 내 경로로 면역한 후, 각각의 바이러스로 감염하였을 경우에도 음성대조군에 비해 높은 생존율이나 낮은 체중감소율이 차이가 나는 것을 확인할 수 있었으나, HA5를 비강 내 경로로 면역한 경우에는 각 접종의 양성대조군으로 면역한 마우스 그룹과 유사한 마우스의 생존율과 HA5를 근육 내 경로로 면역한 마우스보다 낮은 체중감소율과 높은 생존을 을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 HA5 면역항원의 비강 내 경로의 면역이 근육 내 경로의 면역보다 높은 수준의 이질 아형 면역반응을 유도한다는 것을 나타낸다.

실시예 6. 재조합 헤마글루티닌 HA5 면역항원의 면역 접종을 통한 이질 아형 면역 및 보호 유도 기전

(1) HA5 면역항원의 비강 내 면역에 의한 마우스의 코의 유체( nasal fluid)에서의 인플루엔자 바이러스 HA 에 대한 IgA 생성 확인

위 연구결과에서 HA5의 점막면역 경로의 면역(I.N.)에 의해 근육 내 경로의 면역에 의한 것보다 높은 이질 아형에 대한 보호을 나타내는 기전을 규명하기 위하여, 우선 HA5의 면역 경로에 따른 인플루엔자바이러스 HA에 대한 기관지점막 연관림프조직(Bronchus-Associated Lymphoid Tissue: BALT)에서의 인플루엔자바이러스 HA 항원에 대한 분비성(secretory) 항체 IgA의 면역반응을 확인하였다. 실험은 HA5 면역항원을 마우스에 I.M/I.N.로 면역 경로를 달리하여 3회 면역한 후, 마우스를 부검하여, 마우스의 머리의 전비공이 가장 낮게 위치하도록 한 다음 1㎖ 시린지를 삽입하여 PBS/0.1% BSA 1㎖을 천천히 주입하고 전비공으로 흘러나오는 코의 유체(Nasal fluid)를 얻었다. 원심분리한 후, 얻어진 코의 유체에서의 분비성 IgA와 IgG 역가를 ELISA 방법으로 측정하였다. 96-웰(well) ELISA 플레이트에 2㎍/㎖의 각각의 인플루엔자바이러스 HA 항원을 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 얻어진 코의 유체를 1/10 농도를 시작으로, 2배씩 연속 희석(serial dilution)하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 이후, PBS-T로 2번 세척한 후, 항-마우스-IgG-HRP 항체(1:2000)와 항-마우스-IgA-HRP(1:1000)를 희석하여, 1시간 동안 반응시켰다. 그 뒤, PBST로 5번 세척한 후, 기질인 OPD(o-phenylenediamine)로 발색시키고, 1M H₃PO₄로 발색을 멈춘 후, 490nm에서 흡광도를 측정하였다(도 10).

실험 결과, 코의 유체(Nasal fluid)의 IgG 역가를 확인하였을 경우, A/California/07/2009, A/Puerto Rico/8/1934, A/Anhui/1/2005 항원에 대한 IgG 값은 비강 내 경로를 통해 면역한 마우스와 근육 내 경로를 통해 면역한 마우스에서 거의 동등한 수준으로 나타났다(도 10의 (A)). 그러나, 인플루엔자바이러스 HA에 대한 IgA 항체가는 HA5를 근육 내 경로를 통해 면역한 마우스, 음성대조군과 양성대조군 모두 기저 수준(basal level)을 나타내는 반면, HA5를 비강 내 경로를 통해 면역한 마우스의 코의 유체는 다양한 아형의 인플루엔자바이러스(A/California/07/2009, A/Puerto Rico/8/1934, A/Anhui/1/2005, A/Solomon Islands/3/2006, A/Swine/ GuangXi/13/2006, A/Japan/305/ 1057)의 HA에 대한 항체 IgA가 생성되었다(도 10의 (B)).

(2) HA5 면역항원의 비강 내 면역에 의한 마우스 기관지폐포 세척액( Bronchoalveolar Lavage ( BAL ) Fluid )에서의 인플루엔자 바이러스 HA 에 대한 IgA 생성 확인

HA5의 비강 내 면역에 의한 기관지점막 연관림프조직 (Bronchus-Associated Lymphoid Tissue: BALT)에서의 인플루엔자바이러스 HA항원에 대한 분비성(secretory) IgA의 면역반응을 확인하기 위해, HA5 면역항원을 마우스에 근육 내 또는 비강 내로 면역 경로를 달리하여 3회 면역한 후, 마우스를 부검하여. 기관지(trachea)를 절개하여 1mL 주사기에 카테터(catheter)를 연결한 후, 연결된 카테터를 삽입하여 폐와 기관지를 1mL PBS/0.1% BSA로 3회 세척한 후, 기관지폐포 세척액(Bronchoalveolar Lavage (BAL) fluid)을 얻었다. 원심분리 후, 얻어진 기관지폐포 세척액을 1/10 농도를 시작으로, 2배씩 연속 희석하여 상기와 동일한 방법으로, 인플루엔자바이러스 HA항원에 대한 분비성 IgA와 IgG 역가를 ELISA 방법으로 측정하였다(도 11).

실험 결과, 기관지폐포 세척액의 IgG 역가를 확인하였을 경우, 코의 유체(Nasal fluid)의 경우와 마찬가지로 HA5의 비강 내 경로 및 근육 내 경로의 면역을 통해 모두 다양한 인플루엔자바이러스에 대한 높은 수준의 IgG를 생성하는 것을 확인하였다. 다만, A/California/07/2009, A/Puerto Rico/8/1934에 대한 기관지폐포 세척액의 IgG 값은 비강 내 경로를 통해 면역한 마우스보다 근육 내 경로를 통해 면역한 마우스가 약간 높게 나타났고, A/Anhui/1/2005는 비강 내 경로가 근육 내 경로보다 조금 더 높은 값이 나타났다(도 11의 (A)). 그리나, 기관지폐포 세척액에서의 IgA 항체가를 보면, 비강 내 경로를 통해 HA5로 면역한 마우스에서만 다양한 인플루엔자바이러스 HA에 대한 항체 IgA가 생성됨을 확인하였다(도 11의 (B)).

(3) HA5 면역항원의 비강 내 면역에 의한 마우스 장관연관림프조직( Gut associated Lymphoid Tissue : GALT )에서의 인플루엔자바이러스 HA 에 대한 항체 IgA 생성

HA5의 비강 내 경로 면역에 의한 인플루엔자바이러스에 대한 분비성(secretory) IgA의 항체생성이 점막면역계인 장관연관림프조직(Gut associated Lymphoid Tissue: GALT)에서 유도되는지 확인하기 위해, HA5 면역항원을 마우스에 근육 내 또는 비강 내로 면역 경로를 달리하여 3회 면역한 후 얻어진 마우스의 분변(Feces)을 이용하여 ELISA를 수행하였다. 마우스의 분변 추출물(fecal extracts)은 각각의 면역항원으로 3회 면역한 마우스의 분변을 채취하여 무게를 재고, 에펜도르프 튜브에 증류수(0.1g의 분변 당 1㎖)를 넣어 으깬 후, 13,000rpm에서 10분간 원심분리하여 그 상등액을 얻었다. 얻어진 분변 추출물을 1/50 농도를 시작으로, 2배씩 연속 희석하여 상기와 동일한 방법으로, 분비성 IgA와 IgG 역가를 ELISA 방법으로 측정하였다(도 12).

분변 추출물의 인플루엔자바이러스 HA에 대한 IgG값을 확인할 결과, 실험에 사용한 세 가지 인플루엔자바이러스 HA항원 (A/California/07/2009 H1N1pdm, A/Puerto Rico/8/1934 H1N1, A/VietNam/1194/2004 H5N1) 모두에서 기저 수준으로 나타났으며, 그룹 간 별다른 차이점을 나타내지 않았다(도 12의 (A)). 이는 장관연관림프조직에서는 HA5를 통한 면역 시 인플루엔자바이러스 HA에 대한 IgG 항체가 생성되지 않는 것을 의미한다. 그러나, 다양한 아형의 인플루엔자바이러스 HA 항원에 대한 IgA 항체가를 확인한 결과, 비강 내 경로로 HA5를 면역한 마우스의 분변 추출물에서 근육 내 경로, 음성 대조군, 양성대조군으로 면역한 마우스보다 높은 수준의 항 인플루엔자 HA에 대한 IgA가 생성되었다(도 12의 (B)).

실시예 7. HA5 면역 항원의 비강 내 면역 후, 인플루엔자바이러스 감염에 의한 마우스 폐조직의 병리학적 변화

HA5를 면역원으로 이용하여 마우스에 비강 내 및 근육 내 경로로 면역한 후, A/Korea/01-2-9/2009(H1N1), A/Puerto Rico/8/1934(H1N1), A/Chicken/IS/2006(H5N1)를 각각, 7.5X10⁴pfu/마리, 7.5XmLD50/마리, 2.5XmLD50/마리로 감염시킨 후 폐조직에서의 음성대조군(PBS 면역) 및 양성대조군(감염 바이러스와 동일한 불활화 바이러스 면역)과 비교한 폐조직의 병리학적 차이를 관찰하였다. 인플루엔자 바이러스 접종 3일 ~ 6일 후, 감염된 마우스를 면역 그룹 별로 3마리씩 부검을 실시하여, 폐 조직을 채취하고, 폐의 무게를 잰 후, 한 쪽은 동결튜브(cryotube)에 넣어, 용균반 검사(plaque assay)와 빠른 배양 검사(rapid culture assay)시까지 -70℃에 보관하였고, 나머지 한 쪽은 병리조직학적 분석을 위해 10% 포르말린에 넣어 고정시켰다. 10% 중성 포르말린에 고정시킨 장기는 조직 처리 과정을 거쳐 파라핀으로 포매한 후 3㎛ 두께로 절편하여 슬라이드에 부착시킨 다음, 헤마톡실린-에오신(H&E: hematoxylin-eosin) 염색 후 광학현미경을 이용하여 조직에서 일어나는 병리조직학적 변화를 확인하였다(도 13 내지 도 15).

A/Korea/01-2-9/2009(H1N1pdm09)로 감염시킨 경우(도 12), 양성대조군(불활화 H1N1pdm09바이러스 면역)과 비교하여, 음성대조군(PBS 면역)에서 폐조직의 변화를 관찰하였는데, 기관지 주위의 중증도의 염증세포 침윤과 폐포강 벽이 심하게 비후되는 것을 관찰하였다. 또한, 출혈로 인해 모세기관지 및 폐포강 내에 적혈구가 심하게 침윤되는 것을 관찰하였다. HA5의 근육 내 면역의 경우, 음성대조군인 PBS보다는 병변의 정도가 덜하지만, 기관지 주위의 어느 정도의 염증세포의 침윤과 폐포벽 비후를 확인할 수 있었으며, HA5의 비강 내 면역의 경우에도, 근육 내 HA5 면역 그룹과 비슷한 정도로 폐조직 상태를 관찰할 수 있었다(도 13).

A/Puerto Rico/8/1934(PR8 H1N1)로 감염시킨 경우(도 14), 양성대조군(불활화 PR8 바이러스 면역)과 비교하여, 음성대조군(PBS 면역)의 폐조직에서는, 기관지 주위의 중증도의 염증세포 침윤과 폐포강 벽이 심하게 비후되어 있는 것을 관찰하였다. 또한, 출혈로 인해 모세기관지 및 폐포강 내에 적혈구가 심하게 침윤되는 것을 관찰하였다. HA5을 근육 내 경로로 면역한 실험동물의 경우, 음성대조군인 PBS 면역 그룹의 마우스보다는 병변의 정도가 덜하지만, 양성대조군의 폐조직 보다는 심한 기관지 주위의 염증세포의 침윤과 의 폐포벽 비후를 확인할 수 있었으며, 비강 내 HA5 면역 그룹의 경우에는 경증의 병리학적 변화를 제외하면 양성대조군과 비슷할 정도로 양호한 상태의 폐조직을 관찰하였다(도 14).

A/Chicken/IS/2006(H5N1)로 감염시킨 경우(도 15), 양성대조군 (A/Chicken/IS /2006 불활화 바이러스 면역)과 비교하여, 음성대조군(PBS 면역)에서 폐조직의 변화를 관찰하였는데, 기관지 주위의 중증도의 염증세포 침윤과 폐포강 벽이 심하게 비후되었다. 또한, 출혈로 인해 모세기관지 및 폐포강 내에 적혈구가 심하게 침윤되었다. HA5을 근육 내 경로로 면역한 그룹의 경우, 음성대조군인 PBS보다는 병변의 정도가 덜하지만, 기관지 주위의 염증세포의 침윤과 중증도의 폐포벽 비후를 확인하였으며, HA5을 비강 내 경로로 면역한 그룹의 경우에는 경증의 병리학적 변화를 제외하면 양성대조군과 비슷할 정도로 폐조직이 양호한 상태임을 확인하였다(도 15).

그리고, 폐조직에서 인플루엔자바이러스의 감염정도를 평가하기 위하여 -70℃에 보관된 폐조직을 녹인 후 1mL의 MEM/(1% 항생제 첨가)를 넣어 균질화하고, 원심분리(8,000 rpm, 5분, 4℃)하였다. 원심분리 후, 상층액을 회수하여 10:1 내지 10:6으로 희석하고 MDCK 세포에 접종하여 용균반 검사(plaque assay) 및 빠른 배양 검사(rapid culture assay를 통해 폐의 바이러스 역가를 측정하였다(표 2). 용균반 검사를 수행한 후, 폐의 바이러스 역가를 마우스의 폐 1 그람 당 바이러스 역가로 환산하여 계산하고, log10으로 치환하였다. 빠른 배양 검사(Rapid culture assay)는 각각의 마우스에서 채취한 폐 용해물(lung lysate)이 MDCK 세포에 감염되는 최대 희석배수의 역수로 표시하였다(표 1).

A/Korea/01-2-9/01/2009로 7.5x10⁵pfu/마우스로 감염한 마우스 폐조직의 바이러스 역가를 측정한 결과, 음성대조군인 PBS 면역 그룹에 비해, HA5를 근육 내 경로 및 비강 내 경로로 면역한 그룹의 폐조직에서 낮은 수준의 폐의 바이러스 역가가 적게 나타났다(표 1). 양성대조군인 불활화 바이러스로 면역한 그룹에서도 적은 농도이긴 하지만 폐의 바이러스 역가값이 나타나는 것을 보면, 7.5x10⁴pfu/마우스로 높은 농도의 감염임을 암시한다(표 1). 이러한 결과는 폐조직 병리분석 결과와 일치하며, 마우스에 A/Korea/01-2-9/01/2009 감염시 각각의 면역 그룹에 대한 체중감소 및 생존율 결과와 어느 정도 일치한다. HA5 비강 내 면역이 근육 내 면역 그룹보다 낮은 체중감소와 높은 생존율을 나타낸 결과에 대한 폐 역가나 폐조직 병변에 대한 차이로 구분되지 않았는데 이는 마우스의 감염에 사용된 인플루엔자바이러스의 역가가 A/Korea/01-2-9/01/2009가 7.5x10⁵pfu/마우스로 상당히 높은 수준으로 양성대조군 면역 그룹에서 조차 폐조직에 감염이 관찰된 것으로 보인다.

반면, 각각의 그룹별 면역 후 A/Puerto Rico/8/1934, A/Chicken/IS/2006로 감염한 마우스 폐조직에서의 빠른 배양 검사로 바이러스 역가를 측정한 결과, 음성대조군인 PBS 그룹에 비해, HA5를 근육 내 경로로 면역한 마우스의 폐 조직에서 바이러스가 더 적게 감염되어 있는 것을 확인하였다. 또한, 용균반 검사(plaque assay) 및 빠른 배양 검사(rapid culture assay)를 통해, HA5를 비강 내 경로로 면역한 마우스의 폐조직에서는 A/Puerto Rico/8/1934, A/Chicken/IS/2006 감염에 대해 모두, 폐의 바이러스 역가가 양성대조군(불활화 바이러스 면역 그룹) 다음 수준으로 낮았으며, 일부 마우스의 폐조직에서의 인플루엔자바이러스가 검출되지 않았다(표 1). 표 1에 나타난 바와 같이, HA5를 점막면역계인 비강 내 경로로 면역하면 다양한 인플루엔자바이러스에 대해 교차면역반응을 나타내는 IgA와 같은 항체가 생성되어 A/Puerto Rico/8/1934 바이러스 7.5xmLD50/마리와, A/Chicken/IS/2006 바이러스, 2.5xmLD50/마리의 감염에 대한 살균면역(Sterilizing Immunity)이 유도되어 양성대조군과 거의 유사한 양호한 폐조직 병변이 나타났으며 바이러스 역가가 낮은 수준으로 나타나거나 검출되지 않는 것으로 보인다. 이는 실험동물을 바이러스로 감염 후 체중 및 생존율에서 HA5를 비강 내 경로로 면역한 그룹이 양성대조군과 유사한 수준의 높은 생존율과 낮은 체중감소를 나타나는 결과와 일치하는 결과이다.

표 1

실시예 8. HA5 면역항원 비강 내 면역 후, 인플루엔자바이러스 감염에 대한 감염 특이적 세포성 면역반응

HA5를 비강 내 경로로 면역한 그룹이, HA5를 근육 내 경로로 면역한 그룹에 비하여 낮은 수준의 인플루엔자 바이러스에 대한 감염이 일어나는지를 확인하기 위하여 인플루엔자바이러스 감염 특이적으로 생성되는 세포성 면역반응을 측정하는 실험을 수행하였다(도 16).

HA5 면역항원을 비강 내 경로로 면역 후 인플루엔자바이러스 감염에 의해 일어나는 세포성 면역 반응을 확인하기 위해, 각각의 인플루엔자바이러스 감염 15일 후, 마우스를 각 면역 그룹 별로 3~4마리씩 부검하여 ELISPOT(Enzyme-linked Immunospot)을 수행하였다. ELISPOT 플레이트에 정제된 항-마우스 IFN-γ 캡쳐 항체(capture antibody)를 각 웰 당 10㎍씩 첨가한 후 4℃에서 12시간 프리-코팅(pre-coating)하였다. 부검한 마우스에서 비장을 분리한 후, 셀 스트레이너(cell strainer)를 이용하여 비장의 면역세포를 갈아준 후, 전체 림프구(whole lymphocyte)를 분리하였다. 분리된 전체 림프구를 각 웰에 1X10⁶개를 추가하고 여기에 인플루엔자바이러스 감염 특이적인 세포성 면역반응을 측정할 수 있는 에피토프 펩타이드인 NP-155(2㎍/㎖) 및 불활화된 pdm09, PR8, H5N1 IS (6㎍/㎖), 음성대조군인 DMSO와 양성대조군인 콘카나발린 A(Concanavalin A)를 추가하여 최종 200㎕가 되도록 하고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 각 웰에 2차 항체인 비오티닐화된 항-마우스 IFN-γ(최종 농도 2㎍/㎖) 및 효소 컨쥬게이트인 스트렙타비딘-horseradish peroxidase(HRP)를 반응시킨 후, 3-아미노-9-에틸-카르바졸(AEC) 기질을 처리하여 발색시켜 스폿(spot)을 확인하고 IFN-γ를 분비하는 T세포의 수를 측정하였다.

그 결과, A/Korea/01-2-9 인플루엔자 바이러스로 감염한 경우에는 면역 그룹 모두에서 IFN-γ 스폿이 일정 수준 이상 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 반면, A/Puerto Rico/8/1934, A/ Chicken/IS/2006 인플루엔자바이러스로 감염한 후의 마우스의 림프구를 이용한 실험 결과, 음성 대조군인 PBS 그룹에서 NP-155에 의한 면역반응을 나타내는 IFN-γ 스폿이 일정수준 이상 생겼고, 마찬가지로 HA5를 근육 내 경로로 면역한 마우스 그룹에서도 음성대조군 마우스의 림프구에서 나타난 것과 비슷한 정도의 IFN-γ 스폿을 확인하였다. 그러나 HA5을 비강 내 경로로 면역한 마우스 그룹에서는 양성 대조군(불활화바이러스 면역: 면역한 바이러스에 대한 살균 면역반응 유도) 마우스와 비슷한 수준으로 IFN-γ 스폿이 거의 생기지 않는 것을 확인할 수 있었다. 이는 NP-155가 인플루엔자바이러스 감염에 특이적인 에피토프 펩타이드임을 감안할 때, HA5를 비강 내 경로로 면역한 마우스는 양성 대조군으로 면역한 마우스와 마찬가지로 인플루엔자바이러스에 대한 감염이 거의 일어나지 않거나 낮은 수준으로 일어났다는 것을 보여준다. 상기 실시예에 따른 결과인, HA5 I.M 경로로 면역한 마우스에서의 인플루엔자 바이러스 감염시 폐조직에서의 낮은 폐의 바이러스 역가 수준이 낮은 상기 결과를 뒷받침한다.

지금까지 예시적인 실시 태양을 참조하여 본 발명을 기술하여 왔지만, 본 발명의 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 범주를 벗어나지 않고서도 다양한 변화를 실시할 수 있으며 그의 요소들을 등가물로 대체할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 본질적인 범주를 벗어나지 않고서도 많은 변형을 실시하여 특정 상황 및 재료를 본 발명의 교시내용에 채용할 수 있다. 따라서, 본 발명이 본 발명을 실시하는데 계획된 최상의 양식으로서 개시된 특정 실시 태양으로 국한되는 것이 아니며, 본 발명이 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 태양을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Republic of Korea <120> A hetero-subtypic immunity against influenza virus, recombinant hemagglutinin HA5 antigens and their uses <130> IPDB-50577 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1701 <212> DNA <213> Influenza virus A/Korea/01/2009 (H1N1) HA <400> 1 atgaaggcaa tactagtagt tctgctatat acatttgcaa ccgcaaatgc agacacatta 60 tgtataggtt atcatgcgaa caattcaaca gacactgtag acacagtact agaaaagaat 120 gtaacagtaa cacactctgt taaccttcta gaagacaagc ataacgggaa actatgcaaa 180 ctaagagggg tagccccatt gcatttgggt aaatgtaaca ttgctggctg gatcctggga 240 aatccagagt gtgaatcact ctccacagca agctcatggt cctacattgt ggaaacatct 300 agttcagaca atggaacgtg ttacccagga gatttcatcg attatgagga gctaagagag 360 caattgagct cagtgtcatc atttgaaagg tttgagatat tccccaagac aagttcatgg 420 cccaatcatg actcgaacaa aggtgtaacg gcagcatgtc ctcatgctgg agcaaaaagc 480 ttctacaaaa atttaatatg gctagttaaa aaaggaaatt catacccaaa gctcagcaaa 540 tcctacatta atgataaagg gaaagaagtc ctcgtgctat ggggcattca ccatccatct 600 actagtgctg accaacaaag tctctatcag 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Asn His Glu 130 135 140 Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser 145 150 155 160 Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro 165 170 175 Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val 180 185 190 Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu 195 200 205 Tyr Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser 210 215 220 Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln 225 230 235 240 Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys 245 250 255 Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe 260 265 270 Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro 275 280 285 Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn 290 295 300 Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys 305 310 315 320 Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg 325 330 335 Asn Val Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 340 345 350 Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 355 360 365 His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser 370 375 380 Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile 385 390 395 400 Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His 405 410 415 Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 420 425 430 Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn 435 440 445 Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu 450 455 460 Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly 465 470 475 480 Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val 485 490 495 Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu 500 505 510 Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr 515 520 525 Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val 530 535 540 Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly 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Phe Glu Val Tyr Pro Glu Val Glu Leu 115 120 125 Gln Gly Leu Glu Ala Ile Glu Val Glu Lys Pro Ile Val Glu Val Thr 130 135 140 Asp Ala Asp Val Asp Gly Met Leu Asp Thr Leu Arg Lys Gln Gln Ala 145 150 155 160 Thr Trp Lys Glu Lys Asp Gly Ala Val Glu Ala Glu Asp Arg Val Thr 165 170 175 Ile Asp Phe Thr Gly Ser Val Asp Gly Glu Glu Phe Glu Gly Gly Lys 180 185 190 Ala Ser Asp Phe Val Leu Ala Met Gly Gln Gly Arg Met Ile Pro Gly 195 200 205 Phe Glu Asp Gly Ile Lys Gly His Lys Ala Gly Glu Glu Phe Thr Ile 210 215 220 Asp Val Thr Phe Pro Glu Glu Tyr His Ala Glu Asn Leu Lys Gly Lys 225 230 235 240 Ala Ala Lys Phe Ala Ile Asn Leu Lys Lys Val Glu Glu Arg Glu Leu 245 250 255 Pro Glu Leu Thr Ala Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Val Glu Asp Gly 260 265 270 Ser Val Glu Gly Leu Arg Ala Glu Val Arg Lys Asn Met Glu Arg Glu 275 280 285 Leu Lys Ser Ala Ile Arg Asn Arg Val Lys Ser Gln Ala Ile Glu Gly 290 295 300 Leu Val Lys Ala Asn Asp Ile Asp Val Pro Ala Ala Leu Ile Asp Ser 305 310 315 320 Glu Ile Asp Val Leu Arg Arg Gln Ala Ala Gln Arg Phe Gly Gly Asn 325 330 335 Glu Lys Gln Ala Leu Glu Leu Pro Arg Glu Leu Phe Glu Glu Gln Ala 340 345 350 Lys Arg Arg Val Val Val Gly Leu Leu Leu Gly Glu Val Ile Arg Thr 355 360 365 Asn Glu Leu Lys Ala Asp Glu Glu Arg Val Lys Gly Leu Ile Glu Glu 370 375 380 Met Ala Ser Ala Tyr Glu Asp Pro Lys Glu Val Ile Glu Phe Tyr Ser 385 390 395 400 Lys Asn Lys Glu Leu Met Asp Asn Met Arg Asn Val Ala Leu Glu Glu 405 410 415 Gln Ala Val Glu Ala Val Leu Ala Lys Ala Lys Val Thr Glu Lys Glu 420 425 430 Thr Thr Phe Asn Glu Leu Met Asn Gln Gln Ala Ser Ala Gly Leu Glu 435 440 445 Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly 450 455 460 Gly Ile Glu Gly Arg His Met Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala 465 470 475 480 Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr 485 490 495 Val Thr His Ser Val Asn Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu 500 505 510 Cys Gly Gly Gly Gly Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala 515 520 525 Ile Asn Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly 530 535 540 Lys Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly 545 550 555 560 Leu Arg Asn Val Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 565 570 575 Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr 580 585 590 Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu 595 600 605 Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser 610 615 620 Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe 625 630 635 640 Asn His Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp 645 650 655 Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu 660 665 670 Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu 675 680 685 Tyr Glu Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly 690 695 700 Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu 705 710 715 720 Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala 725 730 735 Lys Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg 740 745 750 Ile Tyr Gln His His His His His His 755 760 <210> 7 <211> 471 <212> PRT <213> Cold-shock protein <400> 7 Met Asn His Lys Val His His His His His His Met Gln Val Ser Val 1 5 10 15 Glu Thr Thr Gln Gly Leu Gly Arg Arg Val Thr Ile Thr Ile Ala Ala 20 25 30 Asp Ser Ile Glu Thr Ala Val Lys Ser Glu Leu Val Asn Val Ala Lys 35 40 45 Lys Val Arg Ile Asp Gly Phe Arg Lys Gly Lys Val Pro Met Asn Ile 50 55 60 Val Ala Gln Arg Tyr Gly Ala Ser Val Arg Gln Asp Val Leu Gly Asp 65 70 75 80 Leu Met Ser Arg Asn Phe Ile Asp Ala Ile Ile Lys Glu Lys Ile Asn 85 90 95 Pro Ala Gly Ala Pro Thr Tyr Val Pro Gly Glu Tyr Lys Leu Gly Glu 100 105 110 Asp Phe Thr Tyr Ser Val Glu Phe Glu Val Tyr Pro Glu Val Glu Leu 115 120 125 Gln Gly Leu Glu Ala Ile Glu Val Glu Lys Pro Ile Val Glu Val Thr 130 135 140 Asp Ala Asp Val Asp Gly Met Leu Asp Thr Leu Arg Lys Gln Gln Ala 145 150 155 160 Thr Trp Lys Glu Lys Asp Gly Ala Val Glu Ala Glu Asp Arg Val Thr 165 170 175 Ile Asp Phe Thr Gly Ser Val Asp Gly Glu Glu Phe Glu Gly Gly Lys 180 185 190 Ala Ser Asp Phe Val Leu Ala Met Gly Gln Gly Arg Met Ile Pro Gly 195 200 205 Phe Glu Asp Gly Ile Lys Gly His Lys Ala Gly Glu Glu Phe Thr Ile 210 215 220 Asp Val Thr Phe Pro Glu Glu Tyr His Ala Glu Asn Leu Lys Gly Lys 225 230 235 240 Ala Ala Lys Phe Ala Ile Asn Leu Lys Lys Val Glu Glu Arg Glu Leu 245 250 255 Pro Glu Leu Thr Ala Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Val Glu Asp Gly 260 265 270 Ser Val Glu Gly Leu Arg Ala Glu Val Arg Lys Asn Met Glu Arg Glu 275 280 285 Leu Lys Ser Ala Ile Arg Asn Arg Val Lys Ser Gln Ala Ile Glu Gly 290 295 300 Leu Val Lys Ala Asn Asp Ile Asp Val Pro Ala Ala Leu Ile Asp Ser 305 310 315 320 Glu Ile Asp Val Leu Arg Arg Gln Ala Ala Gln Arg Phe Gly Gly Asn 325 330 335 Glu Lys Gln Ala Leu Glu Leu Pro Arg Glu Leu Phe Glu Glu Gln Ala 340 345 350 Lys Arg Arg Val Val Val Gly Leu Leu Leu Gly Glu Val Ile Arg Thr 355 360 365 Asn Glu Leu Lys Ala Asp Glu Glu Arg Val Lys Gly Leu Ile Glu Glu 370 375 380 Met Ala Ser Ala Tyr Glu Asp Pro Lys Glu Val Ile Glu Phe Tyr Ser 385 390 395 400 Lys Asn Lys Glu Leu Met Asp Asn Met Arg Asn Val Ala Leu Glu Glu 405 410 415 Gln Ala Val Glu Ala Val Leu Ala Lys Ala Lys Val Thr Glu Lys Glu 420 425 430 Thr Thr Phe Asn Glu Leu Met Asn Gln Gln Ala Ser Ala Gly Leu Glu 435 440 445 Val Leu Phe Gln Gly Pro Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly 450 455 460 Gly Ile Glu Gly Arg His Met 465 470

Claims (17)

1. H1N1, H1N2, H2N2, H9N2, H5N1, H3N2 또는 H7N7형 인플루엔자 바이러스에 의한 감염 질환을 치료 또는 예방하기 위한, 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA) 및 상기 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌의 N-말단에 서열번호 7의 아미노산 서열로 구성된 저온 유도 단백질(cold shock protein, CSP)을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 면역원성 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 서열번호 6으로 구성된 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 인플루엔자 헤마글루티닌이 H1N1pdm09 virus-A/Korea/01/2009로부터 유래한 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 H1N1형 인플루엔자 바이러스가 H1N1-A/Brevig Mission/1918, H1N1-A/Puerto Rico/8/1934, H1N1/A/Solomon Islands/3/2006, H1N1-A/Brisbane/59/2007 또는 H1N1-A/California/07/2009인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 H1N2형 인플루엔자 바이러스가 H1N2-A/Swine/Guangxi/13/2006인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 H2N2형 인플루엔자 바이러스가 H2N2-A/Japan/305/1957인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 H9N2형 인플루엔자 바이러스가 H9N2-A/Hongkong/1073/99인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 H5N1형 인플루엔자 바이러스가 H5N1-A/VietNam/1194/2004, H5N1-A/Anhui/1/2005 또는 H5N1-A/Chicken/IS/2006인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
9. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 H3N2형 인플루엔자 바이러스가 H3N2-A/Brisbane/10/2007인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 H7N7형 인플루엔자 바이러스가 H7N7-A/Netherlands/219/03인 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
11. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 융합 단백질이 대장균에서 발현되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
12. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 근육 내 경로로 투여되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
13. 제 12항에 있어서, 알룸 애주번트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
14. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 비강 내 경로로 투여되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
15. 제 14항에 있어서, 콜레라 독소 애주번트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
16. (a) 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 인플루엔자 헤마글루티닌으로부터 60 내지 291번째 아미노산을 제거하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 생성된 재조합 인플루엔자 헤마글루티닌의 N-말단에 저온 유도 단백질(cold-shock protein, CSP)을 삽입하는 단계를 포함하는,
    H1N1, H1N2, H2N2, H9N2, H5N1, H3N2 또는 H7N7형 인플루엔자 바이러스에 의한 감염 질환을 치료 또는 예방하기 위한 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
17. 제 16항에 있어서, 상기 저온 유도 단백질이 서열번호 7로 구성되는 것을 특징으로 하는, 방법.

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