MX2008013314A - Vacuna de virus de influenza. - Google Patents
Vacuna de virus de influenza.Info
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Abstract
La invención se relaciona a vacunas de virus de influenza, y en particular a un virus de influenza reclasificante que tiene por lo menos su gen hemaglutinina derivado de un virus de influenza no patogénico o de baja patogenicidad, y sus otros genes derivados de una cepa donadora. En una modalidad el virus de influenza es un reclasificante 7:1, en el cual solamente el gen hemaglutinina se deriva de un virus de influenza no patogénico. El virus es útil para la producción de vacunas contra influenza, incluyendo influenza causada por cepas de virus de influenza altamente patogénicas.
Description
VACUNA DE VIRUS DE INFLUENZA CAMPO Esta invención se relaciona a vacunas contra virus de influenza, y en particular a vacunas contra virus de influenza aviar altamente patogénico. En una modalidad la invención proporciona cepas de virus de influenza útiles en la producción de una vacuna intranasal atenuada viva o una vacuna de influenza inactivada parenteral. ANTECEDENTES Todas las referencias, incluyendo cualquiera de las patentes o solicitudes de patentes, citadas en esta especificación son incorporadas en la presente por referencia para permitir el entendimiento completo de la invención. No obstante, tales referencias no van a ser leídas como que constituyen una admisión de que cualquiera de estos documentos forma parte del conocimiento general común en la técnica, en Australia o en cualquier otro país. La discusión de las referencias establece lo que sus autores afirman, y los solicitantes se reservan el derecho de. impugnar la precisión y pertinencia de los documentos citados. Los brotes repetidos del virus H5NI de influenza aviar altamente patogénico (HPAI) en aves domésticas y aves silvestres en Asia continúan presentando una amenaza pandémica a la salud humana. Los virus HPAI del serotipo H5NI fueron primero reconocidos que causan enfermedad respiratoria
en humanos en Hong Kong en 1997, cuando los virus de aves infectadas causaron 18 casos humanos documentados, incluyendo seis fatalidades. En el 2003, el virus H5NI reemergió en humanos para infectar dos miembros de familia en Hong Kong, dando por resultado la muerte de una persona. Desde fines del 2003, números no precedentes de brotes de H5N1 de HPAI en aves ha ocurrido en muchos países Asiáticos, Europeos y Africanos, dando por resultado más de 220 casos humanos confirmados en laboratorio en Hong Kong, Vietnam, Tailandia, Camboya e Indonesia, con una proporción de fatalidad de mayor que 50%. Hasta ahora la infección se ha transmitido de aves o animales a humanos; no ha existido ningún caso confirmado de transmisión de humano-humano significante, diferente quizás entre parientes inmediatos. Sin embargo, si el virus desarrolla la habilidad para pasar de humano a humano una pandemia podría desarrollarse rápidamente. A pesar de los intentos rigurosos por las autoridades de la salud, grupos locales y granjeros en muchos países para contener los brotes de la influenza aviar entre las aves de corral al exterminar las aves infectadas y al inocular aquellas sanas, existen algunos países donde hay el potencial para que los brotes se dispersen y sean transmitidos a los humanos. Así hay todavía el peligro de una epidemia o pandemia-. Los subtipos HlNl y H3N2 del virus de influenza que
son actualmente utilizados para vacunación contra la influenza A epidémica o estacional no pueden generar una fuerte reacción protectora en el caso de un brote a gran escala causado por los virus del subtipo H5N1, al cual la mayoría de la población no es inmune. Las vacunas de influenza inactivadas (HV) intramusculares actualmente disponibles son efectivas en inducir anticuerpos de suero neutralizantes relativamente específicos de cepa, pero son menos efectivos en inducir IgA secretorio en los fluidos de lavados nasales. En contraste las vacunas de influenza atenuadas vivas (LAIV) suministradas intranasalmente (i.n.) inducen respuestas inmunes sistémicas y mucosales así como inmunidad mediada por célula. Puesto que las respuestas de IgA mucosales se han mostrado que exhiben reactividad cruzada heterotípica, LAIV puede ofrecer protección más amplia contra cepas heterólogas. Desde 1997, los virus H5N1 de HPAI de las aves se han sometido a evolución genética rápida. Los virus aislados de humanos han reflejado esta variación genética, con variación antigénica concomitante. Los virus H5NI desde el 2004 al 2005 comprenden dos clases de virus genéticamente distintos, ambos de los cuales son antigénicamente distintos de los aislados humanos del 2003, que a su vez fueron antigénicamente distintos de aquellos aislados de los humanos en 1997. Una vez reconocido que causa enfermedad humana,
nuevas cepas de vacuna candidatas deben ser generadas para cada variante antigénica de H5N1. Debido a esta heterogeneidad antigénica, las vacunas que proporcionan inmunidad protectora cruzada más amplia contra virus H5NI antigénicamente distintos son altamente deseables. Un número de diferentes estrategias se han aplicado para generar candidatos de vacuna contra los virus H5N1 de HPAI, incluyendo el uso de virus no patogénicos antigénicamente relacionados para producir una IIV, y el uso de la proteina hemaglutinina (HA) recombinante purificada. Ambos de estos procedimientos se han evaluado clínicamente, con resultados subóptimos, más recientemente, las técnicas de genética inversa se han optimizado para permitir la generación de cepas reclasificantes de vacuna que poseen HA con el sitio de segmentación multibásico modificado que está asociado con la virulencia en aves, y genes internos derivados de una cepa donadora de vacuna humana. Este procedimiento permite la inclusión de una proteína HA, aunque modificada, que es antigénicamente de manera estrecha relacionada a aquella encontrada en el virus H5N1 de HPAI circulante . El desarrollo de una LAIV para la preparabilidad pandémica tiene ciertas ventajas sobre otras estrategias de vacuna, puesto que LAIV puede proporcionar protección efectiva contra una gama más amplia de variantes, una
igualación exacta entre la cepa de vacuna y los virus circulantes puede menos critica. Como un ejemplo, LAIV se mostró que proporciona una protección altamente efectiva en niños preescolares sanos contra una variante desplazada de influenza A (H3N2) en un experimento clínico de LAIV en los Estados Unidos. Datos similares se han obtenido en Rusia, la eficacia heterotípica de la LAIV puede ser por lo menos en parte debido a la inducción de respuestas de anticuerpo IgA aumentadas en el tracto respiratorio comparadas con aquellas inducidas por IIV. Además, puesto que la vacuna será el suministro corto durante una pandemia, múltiples opciones de producción de vacuna pueden ser importantes. Aunque un número de diferentes vacunas contra la influenza aviar están en desarrollo pre-clinico o en experimento clínico en humanos, hasta ahora solamente una se ha aprobado para uso en los Estados Unidos. Sin embargo, esta vacuna, producida por Sanofi-Aventis SA, induce una respuesta inmune protectora en solamente 54% de adultos quienes reciben la vacunación, comparado con la protección de 75-90% contra las cepas de influenza estacionales normales conferidas por vacunas estacionales. Los resultados mostraron que los sujetos quienes recibieron dos inyecciones de la dosis más alta, 90 iq , solamente 45% desarrollaron niveles de anticuerpos suficientes para ser considerados protectores contra el virus.
La mayoría de las vacunas contra la influenza aviar que están actualmente en desarrollo se preparan de cepas H51N de HPAI, y por lo tanto requieren el uso de instalaciones de contención de alto nivel y precauciones rigurosas para asegurar que la vacuna no contenga virus patogénico viable. Esto contribuye sustancialmente a la dificultad y costo del desarrollo de la vacuna. Por lo tanto hay una necesidad por vacunas alternativas que puedan proporcionar un nivel más grande de protección contra la influenza aviar. En particular el desarrollo de vacunas humanas seguras, económicas de dosis y efectivas contra la influenza H5N1 es una alta prioridad para la salud pública global. BREVE DESCRIPCIÓN En un primer aspecto, la invención proporciona una vacuna de virus de influenza atenuada viva que comprende un virus de influenza reclasificante que tiene a) por lo menos un gen hemaglutinina derivado de un virus de influenza aviar no patogénico, en el cual el virus de influenza no patogénico o de baja patogenicidad tiene el mismo tipo de hemaglutinina como aquel de un virus de influenza altamente patogénico, y b) otros genes derivados de una cepa donadora que tiene un tipo de hemaglutinina diferente de aquel del virus de influenza altamente patogénico. En algunas modalidades el virus de influenza no
patogénico o de baja patogenicidad es un virus aviar. En algunas modalidades el virus es un reclasificante 7:1, en el cual solamente el gen hemaglutinina se deriva de un virus de influenza no patogénico. En un segundo aspecto, la invención proporciona un virus de influenza reclasificante que comprende a) un gen hemaglutinina derivado de un virus de influenza no patogénico o de baja patogenicidad, en el cual el virus de influenza no patogénico o de baja patogenicidad tiene el mismo tipo de hemaglutinina como aquel de un virus de influenza altamente patogénico, y b) otros genes derivados de una cepa donadora que tiene un tipo de hemaglutinina diferente de aquel del virus de influenza altamente patogénico. En un tercer aspecto, la invención proporciona un método para hacer un virus de influenza reclasificante , que comprende a) un gen hemaglutinina derivado de un virus de influenza aviar no patogénico, y b) otros genes derivados de una cepa donadora, que comprende la etapa de someter un virus de influenza no patogénico o de baja patogenicidad que tiene el mismo tipo de hemaglutinina como aquel del virus de influenza altamente patogénico para la reclasificación con una cepa donadora que tiene un diferente tipo de hemaglutinina de aquel del virus de influenza altamente patogénico . En algunas modalidades la vacuna proporciona
protección cruzada y/o una respuesta inmune reactiva cruzada contra una cepa de virus de influenza altamente patogénica. Los inventores han preparado una ' vacuna reclasificante 7:1 pandémica H5 candidata de un H5N2 de influenza de aviar no patogénica antigénicamente relacionada y una cepa donadora de influenza adaptada al frío (ca) A/Leningradl3 /17 /57 (H2N2; Lenl7) utilizando técnicas de reclasificación clásicas. Esta vacuna candidata se ha evaluado por su eficacia protectora contra las cepas H5N1 de HPAI antigénicamente heterólogas. El candidato de vacuna pandémica H5 (Len 17/H5) deriva su HA del virus A/Duck/Potsdam/1402-6/86 (H5N2; Pot/86) no patogénico y todos sus otros genes de Lenl7 (reclasificante 7:1) . El virus Pot/86 es antigénicamente similar a los virus H5N1 de 1997 aislados de los humanos. Los inventores compararon la inmunidad reactiva cruzada de H5 y la eficacia protectora contra una cepa H5N1 contemporánea A/Vietnam/1203/2004 (VN/1203) inducida por LAV e IIV preparada de este virus reclasificante , o mediante de una IIV generada contra otra cepa H5N1, A/Hong Kong/213/2003 (HK213), que tiene la HA y el donador de NA para el candidato de vacuna H5N1 de 2003. Lenl7/H5 demostró los fenotipos ca y ts in vitro similares a aquellos de la cepa donadora Lenl7 ca, cultivada a altos títulos en huevos embrionados, y compartió similitud antigénica con los virus H5N1 aislados de humanos en 1997.
Los inventores demostraron en la presente que el virus Lenl7/H5 reclasificante es atenuado en ratones y no infeccioso para pollos, y efectivamente protege a los ratones contra la infección de H5N1 de HPAI heteróloga cuando se utiliza ya sea como una LAIV o IIV. El candidato de vacuna Lenl7/H5 también presentó las propiedades de alto crecimiento en huevos embrionados que son deseables para la producción de IIV. Como una LAIV, una sola dosis de Lenl7/H5 indujo respuesta de anticuerpo IgA específicos de virus H5 superiores en el tracto respiratorio, mientras que una sola dosis de IIV de Lenl7/H5 indujo mejores respuestas neutralizantes de suero reactivas cruzadas y de anticuerpo IgG al HA de virus HK/156. De manera sorprendente, una sola dosis de Lenl7/H5 administrada ya sea como una LAIV o IIV indujo inmunidad protectora en ratones contra virus H5N1 tanto relacionados como antigénicamente variantes. Estos resultados sugieren una estrategia de vacuna pandémica que no requiere tecnología de genética inversa, precauciones de bio-seguridad rigurosas, o una igualación antigénica precisa para la generación de la cepa de vacuna, pero puede ofrecer protección contra un virus heterólogo en la fase temprana de una pandemia. El uso de un virus H5 no patogénico para generar la cepa de vacuna Lenl7/115 por los métodos de reclasificación tradicionales puede ser una
ventaja en países quienes tienen capacidad de laboratorio de contención limitadas o acceso a la tecnología de genética inversa patentada requerida para derivar cepas de vacuna de los virus H5 de HPAI. Los virus reclasificantes de acuerdo con la invención se pueden producir por métodos clásicos, y por lo tanto evitan la necesidad de reclasificar las estrategias de genética inversa. Además, la falta de replicación del virus o inducción de anticuerpo específico de virus en pollos inoculados con Lenl7/H5 sugiere que la manufactura a gran escala de una cepa de vacuna reclasificante H5 no patogénica no presentaría ninguna amenaza a la industria de aves de corral. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra las respuestas de anticuerpo específicas de HA de anti-HK/156 en ratones inmunizados con la vacuna H5. Los ratones se infectaron i.n. con una dosis de 300 MID50 de LAIV de Lenl7/H5 o se inyectaron i.m. con una dosis de 10 pg de IIV de Lenl7/H5. Dos grupos de ratones se infectaron i.n. con ya sea 300 MID50 de Pot/86 de tipo silvestre o 100 MID50 del virus HK/213 como controles positivos. Los ratones recibieron PBS como un control negativo. El suero (A), pulmón (B) y lavados nasales (C) se recolectaron 6 semanas después de la vacunación o infección, y se probaron por ELISA para la presencia de anticuerpo IgG e IgA, utilizando una proteína HA recombinante HK/156
purificada como antigeno. Los valores son la media (logio) c S. D. de títulos de punto de extremo recíprocos de cinco ratones por grupo. *p<0.05 comparado con el grupo IIV de Lenl7/H5 o †p<0.05 comparado con el grupo LAIV de Lenl7/H5. La Figura 2 muestra las respuestas de anticuerpo específicas de HA de anti-VN/1203 en ratones vacunados con H5. Cinco ratones por grupo se inmunizaron una vez con LAIV o IIV de Lenl7/H5 o Lenl7 (H2N2), o se inocularon i . n .. con el virus HK/213 vivo o PBS. Suero (A) y lavados nasales (B) se recolectaron 6 semanas después de la vacunación o infección y se probaron mediante ELISA para la presencia de (A) IgGl, IgG2a, o (B) anticuerpo IgG e IgA, utilizando la proteína rHA de VN/1203 purificada como antígeno. Los valores son la media (logio) ±S.D. de títulos de punto de extremo recíprocos de cinco ratones por grupo. *p<0.05 comparado con el grupo de PBS. La Figura 3 muestra la inducción de las citoquinas específicas de virus H5NI de influenza mediante LAIV o IIV. Cinco ratones por grupo se inmunizaron una vez con Lenl7/H5 o Lenl7 (H2N2) LAIV o HV, o se inocularon i.n. con el virus HK/213 vivo o PBS. Seis semanas después, suspensiones de células únicas del bazo se estimularon con ya sea cinco HAU del virus completo H5N1 inactivado o 250 ng de rHA de H5. Los sobrenadantes del cultivo se recolectaron después de 5 días, y las citoquinas se detectaron utilizando el ensayo Bio-Plex.
DESCRIPCIÓN DETALLADA El virus de influenza altamente patogénico contra el cual la vacuna proporciona protección cruzada puede ser de cualquier tipo de hemaglutinina , incluyendo Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 o H16. El virus de influenza altamente patogénico puede ser uno de cualquier subtipo, incluyendo pero no limitado a H5N1, H5N2, H5N8, H5N9, H7N3, H7N7 y H9N2. Cualquier virus de influenza no patogénico o de baja patogenicidad puede ser utilizado, con la condición de que tenga el mismo tipo de hemaglutinina como aquel del virus de influenza altamente patogénico. En algunas modalidades, el virus de influenza no patogénico o de baja patogenicidad es un virus aviar. En una modalidad, el virus de influenza aviar no patogénico o de baja patogenicidad es A/Duck/Potsdam/1042-6/86 (H5N2) A/Vietnam/119 /04 (H5N1), A/Duck/Singapore/97 (H5N3), A/Duck/Hokkaido/67/96 (H5N4) o
A/Mallard/Netherlands/12/00 (H7N3) . El virus de influenza aviar no patogénico o de baja patogenicidad puede ser aislado de cualquier ave silvestre o domesticada, incluyendo pero no limitado a pollos, pavos, patos, gansos, cisnes y otras aves acuáticas. La cepa donadora debe ser de un tipo de hemaglutinina que sea diferente de aquel del virus de influenza no patogénico, debido que si es del mismo tipo de
hemaglutinina es muy difícil identificar reclasificantes . En algunas modalidades la cepa donadora es de un tipo H2N2 o H1N1. Es ventajoso desde el punto de vista de seguridad y de regulación usar una cepa donadora que sea una cepa de vacuna completamente caracterizada, y en algunas modalidades ésta puede ser una cepa adaptada al frió o sensible a la temperatura. En algunas modalidades la cepa donadora es adaptada al frío y sensible a la temperatura. Las cepas donadoras adecuadas incluyen A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) A/Leningrad/134/47/57 (H2N2) A/Leningrad/134/17/K7/57 (H2N2) A/Moscow/21/65 (H2N2) A/Moscow/21/17/65 (H2N2) A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) A/Puerto Rico/8/59/1 (H1N1) En algunas modalidades, el primer aspecto de la invención se dirige a una nueva variante antigénica de una cepa de vacuna de virus de influenza que usa A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) como un donador de atenuación adaptado al frío y un virus no patogénico A/Duck/Potsdam/1402-6/86 (H5N2) de influenza aviar como una fuente de antígenos de superficie. El donador de atenuación
A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) es una cepa sensible a la temperatura adaptada al frío del virus de influenza aprobado en Rusia para la producción de vacunas de influenza intranasales para adultos y niños (Alexandrova , 1986) . Por ejemplo, las cepas de vacuna ?/17/New Caledonia/99/145 (H1N1) (patente Rusa No. 2183672, publicada el 20 de Junio del 2002) y A/17/Panama/99/242 (H3N2) (patente Rusa No. 2248935, publicada el 20 de Marzo del 2005) también son adecuadas para el uso como donadores de atenuación. Los inventores han preparado una cepa donadora maestra adaptada al frío que es designada virus de influenza A/PR/8/59/1. Éste tiene mutaciones en los genes PB2, PA, NA y M, distinto a aquellos en otros virus de influenza de cepa donadora maestra de los inventores A/Len/134/47/57 (H2N2), y los inventores han usado esta cepa para desarrollar reclasificantes tal como el virus de influenza A/F/2/82 (H3N2) y A/Len/234/84 (H1N1) para el uso en LAIV y vacunas inactivadas (Alexandrova, 1989) . Las cepas Leningrad y Moscow referidas en lo anterior son adaptadas al frió y sensibles a la temperatura, y se han utilizado extensivamente en Rusia para la producción de LAIVs. Las cepas PR y Ann Arbor se han utilizado para la producción de IIVs y LAIVs respectivamente en los Estados Unidos . Los virus para la reclasificación se pueden
, cultivar en cualquier hospedero adecuado. El crecimiento en huevos de pollo embrionados es muy ampliamente utilizado. Alternativamente los virus pueden ser cultivados en cultivos de células. Una amplia variedad de células hospederas es adecuada, incluyendo lineas de células mamiferas tal como las células de riñon canino Madin-Darby (células MDCK) células Vero (células de riñon de mono verde Africano) , células BHK (riñon de hámster bebé), células de riñon de pollo primario (PCK), células de Riñon Bovino Madin-Darby ( MDBK ) , células 293 (por ejemplo, células 293T) y células COS (por ejemplo, células COSI o COS7) . Ver, por ejemplo, WO 97/37000, WO 97/37001 y WO 2005/10779. Las células PBS-1 (HepaLife Technologies, Inc) se ha reportado que proporcionan rendimientos superiores del virus de influenza aviar; ver la patente norteamericana 5,989,805 ("Immortal Avian Cell Line To Grow Avian and Animal Viruses To Produce Vaccines") , la patente norteamericana 5,827,738, la patente norteamericana 5,833,980, la patente norteamericana '5,866,117 y la patente norteamericana 5,874,303. Las lineas de células aviares tales como células EBx™ (Vivalis, Nantes, Prance) o fibroblastos de pollo también pueden ser utilizadas. El reclasificante se puede preparar por métodos convencionales, tal como aquel de Ghendon y colaboradores (1984), o se puede preparar mediante el método de genética inversa divulgado en WO 91/03552 y la patente norteamericana
5166057. Las técnicas de genética inversa basadas en plásmidos se divulgan en O 00/60050, O 01/04333 y US 6649372, y los métodos anti-sentido se divulgan en WO 00/53786. La vacuna puede ser de cualquier clase, incluyendo pero no limitada a vacuna atenuada viva (LAIV) , vacuna inactivada (IIV; vacunas de virus exterminado), subunitaria (vacuna dividida), vacuna de sub-virión; vacuna de proteina purificada; o vacuna de DNA. Los métodos para la producción de todos estos tipos de vacuna son muy bien conocidos en la técnica . En algunas modalidades la vacuna puede estar en una formulación adecuada para la administración intranasal. La vacuna también puede comprender (a) uno o más virus de influenza adicionales, y/o (b) una proteina de neuraminidasa de influenza sustancialmente pura y/o proteina de hemaglutinina de influenza. Los otros virus de influenza pueden ser cepas estacionales actuales, de la clase utilizada en las vacunas de influenza convencionales. Por ejemplo dos cepas de tipo A y una cepa de tipo B se puede utilizar además de los virus de la invención. En una modalidad las proteínas neuraminidasa. y hemaglutinina son las proteínas glicosiladas maduras, y pueden ser ya sea aisladas de viriones de influenza o producidas por métodos recombinantes, por ejemplo, como es descrito en la patente norteamericana
US6485729. La vacuna opc'ionalmente también comprende un adyuvante. Los adyuvantes adecuados que sé han utilizado en vacunas de influenza previas para humanos incluyen alumbre, composiciones de emulsión de aceite tal como MF59 (escualeno al 5%, Tween 80 al 0.5%, Span 85 al 0.5%; ver WO90/14387), saponinas tal como ISCOMs, o un copolimero de bloque tal como CRL 1005 (Katz y colaboradores, 2000) y RNA de doble hebra, tal como Ampligen® Hemisperx Biopharma, Inc) . Los adyuvantes para el uso con vacunas de influenza también se discuten en WO2005/10797 y WO2006/0 189. En algunas modalidades la vacuna induce una respuesta IgG, una respuesta IgA y/o una respuesta de célula T. En otras modalidades la vacuna induce una respuesta IgA, IgG y una respuesta de célula T. Los portadores adecuados son bien conocidos en la técnica. En algunas modalidades de una LAIV de acuerdo con la invención el portador es uno que permite que la vacuna sea almacenada a temperatura refrigerador de modo que no es requerida la liofilización de la vacuna. Tales formulaciones son conocidas para una variedad de virus, incluyendo influenza, y típicamente contiene un azúcar, un aminoácido y una solución reguladora, y también pueden incluir una proteína tal como gelatina o caseína, o un derivado de la misma. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No.
4338335; Yannarell y colaboradores, 2002; Ikizler y Wright, 2002; WO2006/04819; y WO 2005/014862. En algunas modalidades el virus de influenza altamente patogénico contra el cual la vacuna proporciona protección cruzada es del tipo de hemaglutinina Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 o H16. En algunas modalidades el virus de influenza altamente patogénico contra el cual la vacuna proporciona protección cruzada es del tipo H5N1, H5N2, H5N8, H5N9, H7N3, H7N7 o H9N2. Mientras que es particularmente contemplado que las vacunas de la invención adecuadas para el uso en el tratamiento médico de humanos, ellas también son aplicables para el tratamiento veterinario, incluyendo el tratamiento de primates no humanos o monos. Los métodos y portadores farmacéuticos para la preparación de vacunas son bien conocidos en la técnica, como es expuesto en los libros de texto tal como Remington' s Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, Williams & Wilkins, Pennsylvania, USA. Los compuestos y composiciones de la invención se pueden administrar mediante cualquier ruta adecuada, y la persona experta en la técnica fácilmente será capaz de determinar la ruta más adecuada y la dosis para la condición a ser tratada. Las dosificaciones a ser utilizadas para la
inmunización dependerá ínter alia de la vacuna individual, la ruta de inmunización y la edad del recipiente, y pueden ser fácilmente determinados en el curso del experimento clínico de rutina. Las dosificaciones utilizadas con vacunas de influenza estacionales pueden ser utilizadas como una guía. El portador o diluyente, y otros excipientes, dependerán de la ruta de administración, y nuevamente la persona experta en la técnica fácilmente será capaz de determinar la formulación mucho más adecuada para cada caso particular . Las vacunas de influenza mucho más comunes actualmente utilizadas son las vacunas inactivadas, que pueden estar comprendidas de partículas de virus completo (viriones), viriones que se han sometido a tratamiento con agentes que disuelven lípidos (vacunas "divididas") o glicoproteínas virales purificadas ("vacunas subunitarias" ) . Estas vacunas inactivadas principalmente protegen al inducir la producción de anticuerpos dirigidos contra la hemaglutinina . La evolución antigénica del virus de influenza por mutación da por resultado modificaciones en HA y NA. Consecuentemente esas vacunas inactivadas solamente protegen contra cepas que tienen glicoproteínas de superficie que comprenden epítopes idénticos o reactivos cruzados. Para proporcionar un espectro antigénico suficiente, las vacunas convencionales comprenden componentes
de varias cepas virales; ellas generalmente contienen dos cepas de tipo A y una cepa de tipo B. La elección de las cepas para el uso en las vacunas se ha revisado anualmente para cada año particular y es predicho sobre recomendaciones proporcionadas por la Organización Mundial de la Salud y la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos
(FDA). Estas recomendaciones reflejan observaciones epidemiológicas internacionales. Las cepas virales pueden ser obtenidas de fuentes tal como el National Institute for Biological Standards and Control, London, UK, el World Influenza Centre, London, UK, el Centers for Disease Control, Atlanta, USA, y el Center for Biologies Evaluation and Research, Washington, USA. Los viriones de influenza consisten de un núcleo de ribonucleoproteina interno (una nucleocápsida helicoidal) que contiene el genoma de RNA de una sola hebra, y una envoltura de lipoproteina externa revestida interiormente por una proteina de matriz (M) . El genoma segmentado de la influenza A consiste de ocho moléculas de RNAs de una sola hebra, de polaridad negativa lineales que codifican diez polipéptidos , incluyendo las proteínas de RNA polimerasas dirigidas a RNA
(PB2, PBl y PA) y nucleoproteína (NP) que forma la nucleocápsida; las proteínas de matriz (MI, M2 ) ; dos glicoproteínas de superficie, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) , que se proyectan de la envoltura de
lipoproteina ; y proteínas no estructurales cuya función es desconocida (NS1 y NS2). La transcripción y replicación del genoma toma lugar en el núcleo, y el ensamble ocurre por la vía del brote sobre la membrana de plasma. La glicoproteína de envoltura de hemaglutinina está involucrada en la unión celular y la entrada durante la infección. La glicoproteína de envoltura de neuraminidasa es requerida para la liberación de partículas de virus fijas de la célula hospedera. Los virus de influenza pueden reclasificar genes cuando los virus de dos o más diferentes cepas infectan una célula hospedera individual u organismo. Las dos glicoproteinas de superficie mayores, HA y NA, son altamente inmunogénicas , y se someten a la evolución continua y secuencial dentro de poblaciones inmunes o parcialmente inmunes. Cuando NA está presente en forma inmunogénica en la vacuna o en el virión intacto, este es un componente minoritario, y por lo tanto subsiguiente a la competición antigénica continua con el HA inmunodominante . El anticuerpo inducido por el HA directamente neutraliza la infectividad del virus; el anticuerpo al NA, mientras que no neutralizante, limita la replicación viral en una infección de multiciclo y puede reducir la replicación viral por debajo de un umbral patogénico. Sin embargo, NA puede aumentar sinergísticamente HA, cuando la NA está presente en cantidad suficiente. Se ha reportado en la patente norteamericana US
6485729 que la composición antigénica entre HA y NA puede' ser eliminada completamente o sustancialmente al presentar la HA y NA como proteínas purificadas separadas en una vacuna que comprende virus de influenza inactivada convencional. Las cepas de vacuna actualmente utilizadas para la preparación de vacunas de influenza vivas (LIV) se obtienen por el método de reclasificación de virus de influenza epidémicos contemporáneos con cepas donadoras de virus de influenza adaptadas al frío (ca) con el fin de generar reclasificantes con un genoma mezclado. Los genes que codifican hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) son heredados de la cepa epidémica, mientras que los seis genes que codifican proteínas internas y no estructurales (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) se derivan de un donador de atenuación de HA no perjudicial. Así estas cepas de vacuna convencionales son reclasificantes 6:2. Definiciones La influenza es una enfermedad altamente infecciosa, aguda causada por el virus de influenza. La infección ocurre por la vía del tracto respiratorio, y con recuperación de cepas estacionales es usualmente muy rápida. Sin embargo, particularmente en pacientes de edad avanzada o debilitada, varias complicaciones pueden resultar de la infección secundaria. Las cepas epidémicas o pandémicas, a las cuales hay poca o ninguna inmunidad natural, puede causar
infección fulminante aun en individuos jóvenes y sanos. Los únicos agentes terapéuticos disponibles son los inhibidores de neuraminidasa zanamivir (Relenza®; SmithKline Glaxo) y oseltamivir (Tamiflu®; Roche) , andamantadina , que es menos efectiva. Consecuentemente el control de la enfermedad depende de la inmunización. El virus de influenza es un ortomixovirus , y hay tres tipos conocidos. La influenza A causa influenza estacional, epidémica o pandémica en humanos, y también puede causar epizoótica en aves, cerdos y caballos. La influenza B y C están asociadas con brotes esporádicos, usualmente entre niños y adultos jóvenes. Los virus de influenza se dividen en cepas o subtipos sobre la base de diferencias antigénicas en los antigenos HA y NA. Cada virus es designado por su tipo (A, B o C) , el animal del cual la cepa primero se aisló (designado solamente si no es humano) en lugar de aislamiento inicial, el número de cepa, el año de aislamiento y los antigenos HA y NA particulares (designados por H y N respectivamente, con un número de identificación) . "Influenza aviar" (AI) es causada por los virus de influenza A que ocurre naturalmente entre las aves silvestres, tales como patos, gansos y cisnes. Hasta un epizoótico en Pennsylvania en 1983-84, AI no se consideró como una enfermedad virulenta. "Influenza aviar de baja patogenicidad" (LPAI) es
común en las aves y causa pocos problemas. Las aves silvestres, principalmente las aves acuáticas y aves costeras, son el depósito natural de las cepas de baja patogenicidad del virus (LPAI). Aunque las aves de reserva típicamente no desarrollan algunos signos clínicos debido al virus LPAI, el virus puede causar brotes de enfermedad en pollos, pavos y patos domésticos. "Influenza aviar no patogénica" es causada por cepas de virus de influenza aviar que son capaces de infectar aves susceptibles, pero no causan síntomas de enfermedad o brotes de enfermedad. La "influenza aviar altamente patogénica" (HPAI) se caracteriza por inicio repentino, enfermedad severa y muerte rápida de las aves afectadas, y tienen una proporción de mortalidad que se aproxima al 100%. HPAI Es una enfermedad viral virulenta y altamente contagiosa que ocurre en aves de corral y otra aves. Éste primero se identificó en Italia a principios de los años de 1900. En ocasiones raras, la influenza aviar altamente patogénica puede dispersarse a humanos y otros animales, usualmente después del contacto directo con aves infectadas. Las cepas LPAI y HPAI de influenza aviar fácilmente se pueden distinguir por su relación de reproducción relativa, infectividad y mortalidad; HPAI tiene una relación de reproducción significativamente más alta, invariablemente infecta aves susceptibles tales
como pollos, y causa muerte de aves susceptibles infectadas dentro de aproximadamente 6 días después de la infección. Ver, por ejemplo, Van der Goot, Koch y colaboradores, (2003); Van der Goot, de Jong y colaboradores, (2003). Solamente los virus que son de ya sea el subtipo H5 o H7 se conocen que son virus de influenza aviar altamente patogénicos. Existen las dos cepas de más problema para las aves domésticas, y por su potencial para infectar humanos. Se cree que los virus de HPAI surgen de los virus H5 o H7 de LPAI que infectan pollos y pavos después de la dispersión de aves que viven libremente. Actualmente se asume que todos los virus H5 y H7 tienen este potencial, y que la mutación a la virulencia es un evento aleatorio. Por ejemplo, la cepa del virus de influenza H5N1 es altamente patogénica, causando muerte de aves domésticas, y puede ser transmitida de aves a humanos. No hay inmunidad humana contra HPAI, y no está disponible en vacuna. La influenza pandémica es la influenza humana virulenta que causa un brote global, o pandémico de seria enfermedad. Los virus de influenza A pueden someterse a cambios genéticos que dan por resultado cambios mayores en la antigenicidad de tanto la hemaglutinina como la neuraminidasa; esto es conocido como desplazamiento antigénico. El desplazamiento antigénico se cree que resulta del hecho de que la influenza A pueda afectar animales asi
como humanos. Una infección mezclada, en la cual las cepas de diferentes especies infectan un solo hospedero, puede conducir a la reclasificación que da por resultado un nuevo virus de influenza al cual la población humana - es completamente susceptible; una influenza pandémica puede resultar. Debido a que hay poca inmunidad natural, la enfermedad puede dispersarse fácilmente de persona a persona. La pandemia de influenza más seria ocurrió en 1918 ("gripe de España"), 1957 ("gripe de Asia") y 1968 ("gripe de Hong Kong") . La pandemia de influenza de 1918 mató a aproximadamente 50 a 100 millones de gentes mundialmente ; la pandemia de 1957 fue responsable por 2 millones de muertes, y el brote de 1968 causó aproximadamente 1 millón de muertes. La influenza estacional o común (influenza interpandémica) es una enfermedad respiratoria que se puede transmitir fácilmente de persona a persona. La mayoría de las personas tienen algo de inmunidad, y vacunas están disponibles. Estas pueden ser vacunas atenuadas, vivas, virus exterminado (vacunas inactivadas ) , o vacunas subunitarias ("virus dividido") . Otros tipos de vacuna están en experimento clínico. Cambios pequeños en antigenicidad de la hemaglutinina o neuraminidasa , conocido como desplazamiento antigénico ocurren frecuentemente. La población no es por más tiempo completamente inmune al virus, y ocurren brotes estacionales de influenza. Estos cambios antigénicos también
requieren la reformulación anual de vacunas de influenza. Un virus de influenza "reclasificante" es uno que tiene genes derivados de más de una cepa de virus de influenza. Usualmente dos cepas de virus de influenza, el Virus Donador Maestro (MDV) (también conocida como la cepa maestra, MS) y la cepa la cual es el objetivo para la inmunización son utilizadas. Convencionalmente, los virus reclasificantes se obtienen al clasificar partículas virales de una infección viral mezclada de huevos embrionados o células hospederas de cultivo de tejido. Métodos más recientemente de reclasificación mediante genética inversa se han desarrollado. Los reclasificantes son descritos convencionalmente con referencia al número de genes derivados de los virus donadores y objetivos respectivos. Los genes derivados del virus objetivo usualmente será el HA y el NA. Así un reclasificante 6:2 tiene dos genes, los genes HA y NA, del virus objetivo, y todos los otros genes de la MS. El reclasificante 7:1 de acuerdo con una modalidad del primer aspecto de la presente invención tiene un gen HA del mismo tipo como aquel del virus altamente patogénico objetivo, y todos los otros genes de la MS . La reclasificación, es decir la producción de reclasificantes, generalmente comprende mezclar segmentos de gen de diferentes virus, usualmente en huevos o cultivo de
células. Asi las vacunas trivalentes anuales convencionales, que reflejan las cepas de vacuna recomendadas para un año en particular, se preparan mediante el proceso de reclasificación genética 6:2. Por ejemplo, una cepa de vacunas 6:2 se produce mediante la co-infección in vitro del Virus Donador Maestro de la cepa A o B relevante (MDV) con la cepa de influenza circulante de interés, y la selección mediada por anticuerpo del reclasificante apropiado. El reclasificante 6:2 objetivo contiene genes HA y NA de la cepa circulante, y los genes restantes del MDV, que es usualmente seleccionado para alto crecimiento en huevos. El reclasificante retiene las propiedades fenotipicas del virus donador maestro. Asi la reclasificación entre dos tipos de virus se puede utilizar para producir, inter alia, virus que comprende la cepa epitope de tipo silvestre para un segmento, y una cepa atenuada adaptada al frío para los otros segmentos . Los métodos para reclasificación de cepas de virus de influenza son bien conocidos para aquellos de habilidad en la técnica. Por ejemplo, las diluciones de un MDV adaptado al frió y un virus de tipo silvestre, por ejemplo, una dilución 1:5 de cada uno sin importar la concentración de la solución respectiva, se mezclan y luego se incuban durante 24 y 48 horas a 25°C y 33°C. La reclasificación de tanto el virus de influenza A y el virus de influenza B se han utilizado tanto
en el cultivo de células y en huevos para producir cepas de virus reclasificadas . Ver Wareing y colaboradores, 2002. La reclasificación de cepas de influenza también se ha realizado con construcciones de plásmido. Ver PCT/US03/12728 presentada el 25 de Abril del 2003, PCT/US05/01773 , presentada el 20 de Mayo del 2005; y US20050186563. Desafortunadamente algunas veces números grandes de reclasificación necesitan ser realizados con el fin de preparar los reclasificantes deseados. Después de ser reclasificados , los virus se pueden seleccionar para encontrar los reclasificantes deseados. Los reclasificantes deseados luego se pueden clonar para expandir su número. Alternativamente, la co-infección de cepas, típicamente en cultivos de células puede ser seguida por la selección y clonación simultánea, nuevamente de manera típica en cultivo de células. El proceso de reclasificación se puede optimizar con el fin de reducir el número de reclasificaciones necesarias, y de esta manera incrementar el rendimiento o estabilidad del proceso de producción de vacuna, etc. Tales técnicas de optimización típicamente se realizan en cultivo de células, por ejemplo, en células CEK. Ver, por ejemplo, la solicitud de patente internacional No. PCT/US04/05697 presentada el 25 de Febrero del 2004. Si un reclasificante produce bajos rendimientos en huevos, este fácilmente se puede adaptar para el crecimiento en este medio ambiente
mediante el pasaje serial en huevos, como es descrito, por ejemplo por Rudneva y colaboradores, (2007). Una "respuesta inmune protectora cruzada" es una que protege contra la infección por una cepa de virus de influenza que no es idéntica a una utilizada para inducir la respuesta . Un "adyuvante" es una sustancia que aumenta, estimula, activa, potencializa, o modula la respuesta inmune en ya sea el nivel celular o humoral. Un adyuvante se puede adicionar a una vacuna, o se puede administrar antes de la administración de un antigeno, con el fin de mejorar la respuesta inmune, de modo que menos vacuna es necesaria para producir la respuesta inmune. Los adyuvantes ampliamente utilizados incluyen alumbre, ISCOMs que comprenden saponinas tal como Quil A, liposomas y agentes tales como Bacillus Calmette Guerin (BCG) , Corynebacterium parvum o péptidos microbacterianos que contienen antigenos bacterianos. Otros adyuvantes incluyen, pero no están limitados a, el adyuvante patentado AS04 (GlaxoSmithKline) , que está compuesto de sal de aluminio y monofosforil lipido A; surfactantes , por ejemplo, hexadecilamina , octadecilamina, lisolecitina, bromuro de di-metildioctadecilamonio, N,N-dioctadecil-n' -N-bis ( 2-hidroxietilpropano diamina), metoxihexadecil-glicerol y polioles plurónicos; polianiones, por ejemplo, pirano, sulfato de dextrano, poliinosina-
citosina, ácido poliacrilico y carbopol; péptidos, por ejemplo, muramil dipéptido, dimetilglicina y tuftsina; emulsiones de aceite; y mezclas de los mismos. Algunos de éstos actualmente son aprobados para el uso humano o veterinario; otros están en experimento clínico. En la descripción de la invención y en las reivindicaciones que siguen, excepto donde el contexto requiere de otra manera debido al lenguaje de expresión o la implicación es necesaria, la palabra "comprende" o variaciones tales como "se comprende" o "que comprende" se utiliza en un sentido inclusivo, es decir, para especificar la presencia de las características establecidas pero no para evitar la presencia o adición de características adicionales en varias modalidades de la invención. Como se utiliza en la presente, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen la referencia plural correspondiente a menos que el contexto claramente lo dicte de otra manera. Así, por ejemplo, una referencia a "una enzima" incluye una pluralidad de tales enzimas, y una referencia a "un aminoácido" es una referencia a uno o más aminoácidos . Donde un intervalo de valores es expresado, será claramente entendido que este intervalo abarca los límites superior e inferior del intervalo, y todos los valores entre estos límites.
Abreviaciones Abreviaciones utilizadas en la presente son como sigue:
CA adaptado al frió EID50 cincuenta por ciento de dosis infecciosa de huevo ELISA ensayo inmunosorbente enlazado a enzima HA hemaglutinina HAI inhibición de hemaglutinina HAU unidades de hemaglutinina HPAI influenza aviar A altamente patogénica HK/156 virus de influenza A/Hong Kong/156/97 HK/213 virus de influenza A/Hong Kong/213/03 HK/483 virus de influenza A/Hong Kong/483/97 IIV vacuna de influenza inactivada intramuscular i.n. intranasal i.m. intramuscular i.v. intravenoso LAIV vacuna de influenza atenuada viva LD50 cincuenta por ciento de dosis letal LIV vacuna de influenza viva LPAI influenza aviar A de baja patogenicidad Lenl7 virus de influenza A/Leningrad/134/17/57 MID50 cincuenta por ciento de dosis infectiva en ratón
MS cepa maestra MDV virus donador maestro NA neuraminidasa
PBS solución salina regulada con fosfato Pot/86 virus de influenza A/Duck/Potsdam/1402-6/86 PCR reacción en cadena de polimerasa p.i. post-infección ts sensible a la temperatura Se va a entender claramente que esta invención no está limitada a los materiales y métodos particulares descritos en la presente, ya que estos pueden variar. También se va a entender que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no se propone para limitar el alcance de la presente invención, que será limitada solamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado comúnmente como es comúnmente entendido por uno de habilidad ordinario en la técnica a la cual esta invención pertenece. Aunque cualquiera de los materiales y métodos similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden utilizar para practicar o probar la presente invención, se describen los materiales y métodos preferidos. Los virus H5N1 de tipo silvestre utilizados en este estudio fueron A/Hong Kong/156/97 (HK/156) , A/Hong Kong/483/97 (HK/483) y A/Hong Kong/213/03 (HK/213) .
Los virus se propagaron en la cavidad alantoica de huevos de gallinas embrionarios de 10 días de edad a 34°C durante 2 días (Lenl7/H5, Lenl7 y Pot/86) o a 37°C durante 26-28 h (HK/156, HK/1483 y HK/213) . El fluido alantoico se recolectó después de 26 h (virus H5N1) o 48 h (Lenl7/H5 y Lenl7) de post-inoculación . Los extractos de virus se tomaron con alícuotas y se almacenaron a -70°C hasta el uso. Cincuenta por ciento de títulos de dosis infecciosa de huevos
(EID50) se determinaron mediante la titulación en serie de virus en huevos y se calculó por el método de Reed y Muench
(1938) . La invención ahora será descrita en detalle por medio de referencia solamente a los siguientes ejemplos no limitativos y dibujos. Ejemplo 1 Preparación de la cepa reclasificante Una estrategia similar a aquella utilizada para la producción de cepas reclasificantes derivadas del donador de atenuación A/Leningrad/134 /17 /57 (H2N2) con los virus epidémicos contemporáneos H1N1 y H3N2 se utilizó para el desarrollo de una cepa de vacuna que comprende antígenos de superficie del virus de influenza aviar subtipo H5N2. A/17/Duck/Potsdam/86/92 (H5N2) se obtuvo mediante el método de reclasificación genético clásico del virus aviar no patogénico A/17/Duck/Potsdam/1402-6/86 (H5N2) con la cepa donadora maestra sensible a la temperatura, adaptada al frío
A/Leningrad/ 134 /17 /57 (H2N2) en embriones de pollo en desarrollo, con la selección subsecuente contra la cepa donadora de atenuación A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) en la presencia de anti-suero contra la cepa donadora de atenuación. El genoma de la cepa reclasificante se analizó mediante el análisis de restricción de PCR (Klimov A.I., Cox N.J.: J. Virol. Method. 1995. No.55. p.445-446), y la secuenciación de DNA parcial o completa de genes separados se llevó a cabo. Ésto demostró que el reclasificante A/17/Duck/Potsdam/86/92 (H5N2) heredó su gen HA de un virus aviar parental del subtipo H5N2, mientras que el gen NA y seis genes que codifican proteínas no glicosiladas fueron heredados del donador de atenuación A/Leningrad/134/17/57 (H2N2). Así, éste es un reclasificante 7:1, en contraste a las cepas de vacuna convencionales, que son reclasificantes 6:2. El reclasificante se designó Lenl7/H5. La reacción de inhibición de hemaglutinina (HAI) se utilizó para confirmar que el tipo de hemaglutinina del reclasificante fue el mismo como aquel de la cepa parental, A/Duck/Potsdam/1402-6/86 (H5N2) de tipo silvestre, la cepa es sensible a la temperatura (diferencia en título es de 6.8 logEID50/ml a 33°C y 40°C) y adaptada al frío (diferencia en el título es 3.1 logEID50/ml a 33°C y 25°C). Por lo tanto la cepa de vacuna
A/17/Duck/Potsdam/86/92 (H5N2) de acuerdo con la invención tiene una combinación de propiedades útiles que son necesarias para una cepa de vacuna: (a) la especi icidad antigénica de la hemaglutinina del virus A/Duck/Potsdam/1402-6/86 (H5N2) de tipo silvestre; (b) la estructura del genoma requerida para cepas de vacuna reclasificantes ; (c) sensibilidad a la temperatura y adaptación al frío, que está correlacionada con la atenuación que es típica para la cepa donadora maestra. Una muestra de la cepa reclasificante se ha depositado en la Colección de Virus del Estado Ruso el 10 de
Febrero del 2006 bajo acceso No. 2389. La morfología de la cepa fue polimorfa, que es típica de los virus de influenza. Ejemplo 2 Evaluación de la cepa reclasificante La actividad infecciosa, como es estimada por la replicación en embriones de pollo en desarrollo incubados a
33°C durante 48 horas, fue 9.3 logEID50/ml. El titulo de hemaglut inina fue 1:512. La estabilidad genética de las características biológicas de la cepa se demostró después del pasaje intranasal en hurones.
Las características de la cepa reclasificante
A/17/Duck/Potsdam/86/92 (H5N2) se resumen enseguida. 1. Nombre de la cepa: A/17/Duck/Potsdam/86/92 (H5N2) 2. Serie: Serie 1
3. Método de producción: reclasificación; virus parentales: Virus epidémico A/Duck/Potsdam/1402-6/86 (H5N2) Donador de atenuación A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) 4. Número de pasajes en el proceso de recombinación: 7 5. Características de la cepa antes de la liofilización: Condiciones de incubación óptima para la producción: 33°C, 48 horas ; Actividad de hemaglutinina 1:512; Actividad infecciosa 8.5+0.3 logEID50/0.2 mi; Sensibilidad a los inhibidores de suero: resistente al inhibidor Diferencia en la actividad infecciosa a 33°C y 40°C: 6.8 logEID5o/ml Diferencia en la actividad infecciosa a 33°C y 25°C: 3.1 lgEID50/ml; Estructura del genoma del reclasificante : Genes de la influenza aviar no patogénica: HA Genes del donador de atenuación: PA, PB1, PB2, NP, M, NS, NA 6. Características de la cepa después de la liofilización:
Fecha de liofilización : 24.11.2005; Cantidad de material por matraz: 1 mi; Número de dosis en serie: 4. Actividad infecciosa: 7.5 logEID50/0.2 mi ; Título de Hemaglutinina: 1:256.
7. Dilución recomendada en la vacunación 1:2 8. Especificidad antigénica: Hemaglutinina : idéntica al virus A/17/Duck/Potsdam/86/92 (H5N2) como es estimado por HAI con antisuero de rata. Neuraminidasa : idéntica al virus A/Leningrad/134 /17 /57 (H2N2) como es estimado por secuenciación . 9. Seguridad para los ratones después de la administración subcutánea o intranasal: sin peligro 10. Control bacteriológico del material liofilizado: fecha -30 de Noviembre del 2005: estéril. 11. Control para virus extraños: nada de virus extraños Ejemplo 3 Patogenicidad de la cepa de vacuna candidata en pollos Los efectos de la administración intranasal e intravenosa de la cepa A/17/Duck/Potsdam/86/92 (H5N2) a pollos se estimaró^. La administración intravenosa de 0.2 mi de virus de vacuna se probó que es no peligrosa, y nada de síntomas de enfermedad se observaron en cualquiera de las ocho aves probadas. Después de la administración intranasal de 0.5 mi de virus de vacuna, no se observaron síntomas de enfermedad. El virus no se excretó de las frotaciones orofaríngeas y cloacales, y no indujo seroconversión en cualquiera de las cinco aves probadas, como es probado en la Tabla 1. Así el reclasificante A/17/Duck/Potsdam/86/92
(H5N2) demostró un alto nivel de atenuación para pollos, lo cual indicó que esta cepa fue segura para la manufactura de vacun'a en huevos y el uso en pollos.
o
Tabla 1
Seguridad de la cepa reclasificante A/17/DUCk/POtsdam/86/92 (H5N2) des ués de la administración a pollos
No patogenicidad Seguridad y adaptación en la administración en la administración intranasal intravenosa Virus Excreción del virus en el día 3 después de la infección
Morbidez Mortalidad Morbidez Mortalidad Frotaciones FrotacioConversiones orofarí'ngeas nes del suero cloacales A/17/Duck/Potsdara/86/92 (H5N2) Cepa de vacuna 0/8 0/8 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
A/Duck/Potsdam/1402-6/86 (HSN2) Virus de tipo silvestre 0/8 0/8 0/5 0/5 0/5 0/5 3/S
Ejemplo 4 Patogenicidad y efecto protector de la cepa de vacuna candidata en ratones La cepa A/17/Duck/Potsdam/86/92 (H5N2) es segura, inmunogénica y efectiva contra la infección subsecuente con virus altamente patogénico del subtipo H5N1 sobre la administración intranasal a ratones. La seguridad e inmunogenicidad de la cepa reclasificante A/17/Duck/Potsdam/86/92 (H5N2) se estudió en ratones BALB/c, utilizando la administración intranasal de 6-7 log EID50. El reclasificante se atenuó para ratones, reproducción más efectiva en pasajes nasales (3.5 log EID50/ml) que en el tejido de pulmón (1.8 log EID50/ml) , como es mostrado en la Tabla 2.
O
Tabla 2
Seguridad de la cepa reclasificante A/17/DUCk/POtSdam/86/92 (H5N2 ) después de la administraci intranasal a ratones
Replicación en Replicación en logMID50 Pérdida de peso logLD50 pulmones pasajes máxima (%) Virus nasales (log EIDso/ml) (log EIDso/ml) A/l7/Duck/Potsdam/86/92 2.1+.0 3.5±0.0 7.0 1 >7.0
(H5N2) Cepa de vacuna A/Duck/Potsdam/1 02-6/86 6.3±0.3 1.6±0.2 3.3 4 >7.0 (H5N2) Virus de tipo silvestre
La respuesta inmune humoral en el suero de los animales experimentales se estimó en 28 días después de que se administraron las preparaciones. Utilizando el ensayo de inmunoenzima , la presencia de IgG e IgA especifico contra virus del subtipo H5N1, contra el virus completo HK/213 y contra el HA recombinante purificado del virus HK/483 se detectó. Estos resultados se resumen en la Tabla 3. Tabla 3 Anticuerpos específicos de IgG e IgA a los virus H5N1 en el suero de ratones inmunizados con virus reclasificante A//17/Duck/Potsdam/86/92 (H5N2)
Los ratones inmunizados con una sola dosis de 300
MID50 de LIV preparada de la cepa A/17/Duck/Potsdam/86/92 (H5N2) fueron 100% protegidos de la infección letal por el virus HK/483 a una dosis de 50 LD50, mientras que se observó 100% de mortalidad en un grupo de control de animales. Una sola inmunización intranasal con LIV dio por resultado 100% de protección contra la estimulación subsecuente con 100 MID50 del virus HK/213, y nada de virus infeccioso se extrajo de
los pulmones de cualquiera de los cinco animales de Estos resultados se resumen en la Tabla 4. Tabla 4 Resistencia de ratones inmunizados con el virus reclasificante A/17 /Duck/Potsdam/86/92 (?5?2)· para la infección con virus del subtipo H5N1
Así los inventores han mostrado que LIV de una cepa de vacuna reclasificante que contiene HA del virus aviar no patogénico H5N2 fue segura e inmunogénica, y que una sola administración de la vacuna indujo una respuesta inmune protectora contra la estimulación subsecuente con virus altamente patogénicos del subtipo H5N1, incluyendo virus significativamente diferentes en sus propiedades antigénicas de aquellas de la cepa inmunizante..
Ejemplo 5 Comparación de las propiedades inmunogénicas de LAIV e IIV de A/17/Duck/Potsdam/86/92 (H5N2) en ratones Un examen de las propiedades infecciosas de la vacuna de virión completo preparada utilizando la cepa 17/H5 con la adición del adyuvante de hidróxido de aluminio demostró que una sola dosis de vacuna sin adyuvante no fue suficiente para proteger contra la infección subsecuente contra el virus H5N1 altamente patogénico encontrado en 2005 en Vietnam. Para proporcionar 100% de protección contra la infección con este virus, dos dosis de la vacuna con adyuvante fueron requeridas. Estos resultados se discuten en más detalle en los ejemplos 11 y 13, y se resumen en las Tablas 9 y 11. Ejemplo 6 Producción de un reclasificante inmunogénico del virus de influenza aviar H7N1 El brote de influenza aviar altamente patogénica H7N1 que emergió en los países bajos durante 2003 dio por resultado más de 80 casos humanos de conjuntivitis y enfermedades respiratorias leves, y 1 caso fatal. Para preparar vacunas de influenza vivas candidatas par la protección contra una pandemia futura potencial los inventores utilizaron la reclasificación genética con virus de aviares no patogénicos y la cepa maestra H2N2 adaptada al frío A/Leningrad/134/17/57 (Len/17) . Len/17 es actualmente
utilizada en Rusia para preparar vacunas atenuadas vivas aprobadas para adultos y niños. Los inventores mostraron en los Ejemplos 3 y 4 que un reclasificante entre Len/17 y el virus de influenza H5 no patogénico es atenuado para pollos y ratones . Los inventores evaluaron un reclasificante 6:2 entre el virus de influenza Len/17 y el virus de influenza A/ allard/Netherlands/12/00 (H7N3) . El reclasificante A/17/Mallard/Netherlands/00/84 (H7N3) (Lenl7/H7) demostró fenotipos adaptados al frió (ca) y sensibles a la temperatura (ts) similares a aquellos de Len/17. La secuencia del gen HA de Lenl7/H7 fue idéntica a aquella del virus de tipo silvestre H7N3 parental. Los resultados de una prueba de inhibición de hemaglutinación (HI) con un panel de antisuero de hurón a diferentes virus H7 aviares y humanos mostraron que el perfil antigénico del reclasificante fue similar a aquel de la cepa parental de tipo silvestre H7N3 asi como aquel de aislados H7 humanos de los países bajos, incluyendo el virus aislado de caso fatal. El reclasificante demostró alta capacidad de crecimiento en huevos de pollo embrionados a temperatura óptima (34°C), comparable con aquella de Len/17 MS parental. Por otra parte Lenl7/H7 se mostró que es atenuado para pollos, similar al parental Len/17, mientras que el virus de tipo silvestre H7N3 causó 60% de mortalidad. Similar a la
cepa maestra Len/17, Lenl7/H7 fue completamente atenuado para ¦ratones . Después de la inoculación intranasal con 105-106 EID50, Lenl7/H7 se replicó bien en pasajes nasales de ratones, pero no se replicó en el pulmón de ratón. A pesar de la carencia de replicación en el pulmón de ratón, Lenl7/H7 indujo títulos de IgG específicos de virus de suero tan altos como 3.710.8 logi0. Ejemplo 7 Evaluación de inmunogenicidad Los inventores compararon la inmunogenicidad y eficacia protectora de una LAIV preparada de un reclasificante H5N2 y dos tipos de vacunas subunitarias inactivadas utilizadas en Rusia. Ambas vacunas sub-unitarias se prepararon de H5N1 utilizando métodos genéticos inversos. Una de las vacunas sub-unitaria también contuvo un adyuvante polimérico, Polioxidonio (copolímero de 1 , -etilenpiperazina N-oxidada y bromuro de (N-carboxietil ) 1, 4-etilenpiperazina, peso molecular 100 kDa; Petrovax Pharm, Moscow, Rusia) , mientras que la otra contuvo adyuvante de alumbre. La Tabla 5 muestra los resultados obtenidos después de la estimulación con el virus H5N1 altamente patogénico. Es evidente que LAIV evoca un nivel muy alto de protección cruzada, y ésta fue 57% - 87% después de la primera y la segunda dosis.
O
Tabla 5 Evaluación de inmunogenicidad y protección en ratones después de la inmunización con candidatos de vacuna H5
Vacunas H5N1 que contienen 15 ug de HA se generaron déla cepa NIBRG-14 obtenida de NIBSC UK; *2 dosis en un intervalo de 21 días ¦**2 dosis de 106.4 EID50/0.05 mi en un intervalo de 10 días ,
Ejemplo 8 Patogenicidad e infectividad en pollos Para la determinación de patogenicidad, ocho pollos por grupo se inocularon intravenosamente (i.v.) con 0.2 mi de una dilución 1CT1 de cada virus, y se observaron diariamente durante 14 días para los signos clínicos y muerte. Para determinar la efectividad, cinco pollos se inocularon intranasalmente (i.n.) con 106 EID50 de cada virus en 0.1 mi. En el día 3 de post-inoculación (p.i.), frotaciones orofaríngeas y cloacales se recolectaron de cada pollo y la replicación del virus se estimó en huevos de pollo embrionados. Los pollos se observaron para signos clínicos de enfermedad y muerte durante 21 días, tiempo en el cual las muestras de suero se recolectaron y se probaron para la presencia de anticuerpos por la prueba de inmunodifusión de gel de agar (AGID) . Los dos virus Lenl7/H5 parental y reclasificante se administraron a pollos libres de patógeno específico (SPF) para determinar su riesgo potencial para la producción animal. Esto incluyó la estimación de la habilidad para causar morbidez y mortalidad después de la inoculación i.v. (patogenicidad) y el nivel de replicación específica de tejido después de la exposición natural simulada (inoculación i.n.). Con la inoculación i.v. o i.n., no se observaron signos de enfermedad clínicos o muertes en los pollos con cualquiera de los tres virus durante el período de
observación de 14 o 21 días, respectivamente, como es mostrado en la Tabla 6. Para el grupo inoculado i.n. en el día 3 p.i., que es el tiempo de replicación pico para los virus de influenza aviar de baja patogenicidad, el virus no se aisló del tracto respiratorio (frotación orofaringea) o intestinal (frotación cloacal), pero anticuerpos a las proteínas virales de influenza aviar de detectaron en pollos inoculados con el virus parental Pot/86 aviar.
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Tabla 6
Patogenicidad e infectividad del reclasif cante Lenl7/H5 y virus parentales en pollos
Virus patogenicidad i . . patogenicidad e infectividad i . n . Morbidez Mortalidad Morbidez Mortalidad Detección del virus en frotaciones Seroconversión (enfermo/total) (muerto/total) (enfermo/total) (muerto/total) Orofaringeas Cloacales (AGID)
0/8 0/8 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
Lenl7 0/8 0/8 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 Pot/86 0/8 0/8 0/5 0/5 0/5 0/5 3/5
¦ Grupos de ocho pollos se infectaron i.v. con 0.2 mi dilución 1:10 de cada virus y se observaron diariamente por 14 dias para signos clínicos y- muerte b Grupos de cinco pollos se infectaron i.n. con 0.1 mi de 10° EID50 de cada virus. Las frotaciones orofaringeas y cloacales se recolectaron 3 dias p.i. y se titularon en huevos para estimar la replicacion viral.
Los pollos se observaron para signos clínicos de enfermedad y muerte por 21 días. Para determinar la infectividad, los sueros se recolectaron 21 dias p.i. y se probaron para la presencia de anticuerpos por la prueba de inmunodifusión de gel de agar (AGID) .
Los datos combinados de los dos experimentos sugieren que dos virus Lenl7/H5 parental y reclasificante no fueron altamente patogénicos para los pollos. Después de la exposición natural simulada, el virus parental Pot/86 aparentemente se replicó pobremente en pollos; la evidencia de infección fue solamente detectada por la presencia de anticuerpos, y no por la detección real del virus en el tracto respiratorio intestinal. Una resistencia similar a la infección se ha reportado después de la inoculación de pollos con virus aislados de aves acuáticas silvestres - (Jones y Swayne, 2004). Además, Lenl7/H5 reclasificante no logró replicarse en pollos después de la exposición natural simulada mediante inoculación i.n. Estas observaciones sugieren que el uso del Lenl7/H5 reclasificante en la manufactura de vacunas humanas no presentará una amenaza a la industria de aves de corral. Ejemplo 9 Patogenicidad e infectividad de la vacuna en ratones Ratones BALB/c hembras de diez semanas de edad (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine, USA) se anestesiaron ligeramente con C02, y 50 µ? de 101 a 107 EID50 de Lenl7/H5, Lenl7 o Pot/86 diluido en solución salina regulada con fosfato (PBS) se inoculó i.n. Una dosis infecciosa de ratón de 50% ( ID50) se utilizó para determinar infectividad y una dosis letal de 50% (LD50) se utilizó para determinar la
patogenicidad, como es descrito por Lu y colaboradores, (1999) . Para evaluar la replicación de Lenl7/H5 y los dos virus parentales, los ratones se infectaron i.n. con 106 EID50 de estos virus. Muestras de órganos se recolectaron en el día 3 (pulmón y nariz) y el día 6 (cerebro) p.i. y se titularon para el virus infeccioso en huevos. Como se muestra en la Tabla 7, Lenl7/H5 reclasificante y dos virus parentales todos no fueron letales para ratones (LD50 > 107 EID50) . Similar a la cepa donadora Lenl7 Ca H2N2, el virus Lenl7/H5 tuvo MID50 10 veces más alta comparada con el virus Pot/86 parental. La replicación del virus Lenl7/H5 reclasificante en el tracto respiratorio superior e inferior de ratones se evaluó como una medida de la atenuación. Los ratones se infectaron i.n. con 106 EID50 de los virus parental y reclasificante , y los títulos del virus presentes en la nariz y los pulmones se determinaron 3 días p.i.
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Tabla 7 Patogenicidad, infectividad y replicación del reclasificante Lenl7/H5 y virus parentales en ratones
Virus a Patogenicidad e infectividad * Pérdida de peso Títulos de virus medios Número de infectados/ media máxima (%)B número total" MIDso LDso Pulmón Nariz Pulmón Nariz
Lenl7/H5 4.3 >7 1 2.1 ± 1 .0 3.5 + 0. ,0 1/3 3/3
Lenl7 4.8 >7 • 1 2.3 + 0 .5 2.7 + 0. 2 3/3 3/3
Pot/86 3.3 >7 4 6.3 ± 0 .3 1.6 ± 0. .2 3/3 1/3
Ratones se infectaron i.n. con 10' a 10'EIDS0 de cada virus. Tres días después, tres ratones de cada dilución se eutanizaron; el pulmón y la nariz se recolectaron y se titularon para la infectividad del virus en huevos . Los cinco ratones restantes en cada dilución se verificaron diariamente para signos de enfermedad, pérdida de peso y muerte por 14 días p/i. Los títulos de virus del pulmón se usaron para la determinación de MIDs» de Pot/86 y los títulos de virus de la nariz se usaron para la determinación de MID50 de los virus Lenl7/H5 y Lenl7. MID50y LD ,0 se expresan como el log1()EIDs0 requerido para dar un MIDJ0 o un LDS0. Pérdida de peso media máxima (%) se determinó en el grupo de ratones infectados i.n. con 10'EID5í de cada virus. Ratones se infectaron i.n. con ??' EID„de cada virus - Tejidos de pulmón y nariz se recolectaron en 3 días p. i. y se titularon en huevos para estimar la replicación viral. Los títulos de virus se expresan como la media log„ EID¡0 /ml_+S.D. de tres ratones por grupo. El límite de detección de virus fue lO1' EIDJ0/ml. Los tejidos en los cuales no se detectó virus se les dió un valor de 1?' ! EID 50 /mi para el cálculo del título medio . Los ratones se consideraron infectados si el virus se detectó en 0.1 mi de dilución 1:10 de homogenado de tejido.
El virus Pot/86 parental replicó eficientemente en pulmones de ratón, pero pobremente en la nariz. En contraste, el reclasificante Lenl7/H5 replicó bien en la nariz pero pobremente en los pulmones, como lo hizo la cepa Lenl7 de ca para el cual el virus se recuperó de solamente de tres pulmones de ratón (titulo = 103"3 EID50/ml) . Ninguno de los virus se detectó en los cerebros de cualquier ratón infectado en el día 6 p.i. (datos no mostrados) . Estos resultados indicaron que el virus Lenl7/H5 reclasificante replicó predominantemente en el tracto respiratorio superior y se atenuó en ratones. Ejemplo 10 Inmunogenicidad y respuesta de anticuerpo reactiva cruzada en ratones Enseguida, los inventores evaluaron la inmunogenicidad de Lenl7/H5 inoculado in. como una LAIV en una sola dosis de 300 MID50 o i.m. como una IIV (una dosis de 10 µg de virus completo) en ratones. El virus Lenl7/H5 de alto crecimiento se concentró del fluido alantoico y se purificó sobre un gradiente de sacarosa utilizando el método de Cox y colaboradores, (1984), y se preparó como IIV al tratar el virus purificado con formalina al 0.025% a 4°C durante 3 dias. Un grupo de ratones se inyectó intramuscularmente (i.m.) con una dosis de 10 de IIV (*3 \xq de proteina HA) en un volumen de 0.1 mi. Los ratones se inocularon i.n. con una dosis de 300
MID50 (~107 EID50) de LAIV o se inyectaron intramuscularmente (i.m.) con una o dos dosis de 10 g (~3 de proteina HA) de IIV, con o sin adyuvante de alumbre (Li y colaboradores, 1999) . Algunos ratones recibieron dos inoculaciones en un intervalo de 4 semanas. Grupos de ratones BALD/c de hembras de 8 semanas de edad se inmunizaron i.n. con una dosis de 300 MID5o de Lenl7/H5 ( =107 EID50) o Lenl7 (=107'3 EID50) LAIV. Los ratones se infectaron i.n. con ya sea 300 MID50 de Pot/86 ( =105'7 EID50) o 100 ID50 de virus HK/213 (=103'8 EID50) como controles positivos y recibieron PBS como un control negativo. Seis semanas después i.n. o i.m. de inmunización, la sangre y muestras de lavado de pulmón y nasales se recolectaron de cinco ratones por grupo, como es descrito previamente (Katz y colaboradores, 1997). Los sueros se trataron con enzima que destruye receptor (neuraminidasa) de Vibrio cholerae ( Denka-Seiken, Tokio, Japón) antes de probar para la presencia de anticuerpos específicos de H5 (Kendal y colaboradores, 1982) . Los títulos de anticuerpo neutralizantes se determinaron utilizando un ensayo de microneutralización como es descrito previamente (Rowe y colaboradores, 1999) . Los títulos de anticuerpo neutralizantes se expresan como el recíproco de la dilución más alta del suero que dio 50% de neutralización de 100 TCID50 del virus en Células de Riñon Canino en Madin - Darby.
Los anticuerpos IgG e IgA específicos de influenza H5 se detectaron mediante un ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA) como es descrito previamente (Katz y colaboradores, 1997), excepto que 2 pg/ml de H5 expresado en baculovirus purificado (HK/156) de proteína HA recombinante (Protein Sciences Corporation, Meriden, CT, USA) se utilizó para recubrir las placas. Los títulos de ELISA de punto final se expresaron como la dilución más alta que produjo una densidad -óptica (CD) mayor que dos veces la CD media más desviación estándar (S.D.) de muestras de control similarmente diluidas. Seis semanas después de la inmunización, los sueros, lavados de pulmón y nasales se recolectaron y se probaron para los anticuerpos específicos del virus H5 mediante el ensayo de microneutralización o ELISA (Katz y colaboradores, 1997; Rowe y colaboradores, 1999). Como se muestra en la Tabla 8, los anticuerpos neutralizantes contra el virus Pot/86 homólogo se detectaron en el suero de ratones que reciben Lenl7/H5 LAIV, pero anticuerpos neutralizantes reactivos cruzados contra el virus HPAI H5N1 HK/156 o HK/213 no se detectaron . Tabla 8 Respuestas de anticuerpo neutralizantes de ratones inmunizados i.n. o i.m. con las vacunas de influenza H5
Grupo de vacuna Titulo de anticuerpo neutralizante contra (ruta) a Pot/86 Lenl7 HK/156C HK/213
Lenl7/H5 (i.n.) 80 20 20 20
Lenl7/H5 (i.m.) 1 60 20 80 20
Pot/86 (i.n.) 1 60 20 80 .40
Lenl7 (i.n. ) 20 1 60 20 20
HK/213 (i.n.) 20 20 20 640
PBS (i.n.) 20 20 20 20
Los valores en cursivas representan títulos al virus homólogo a Ratones BALB/c fueron ya sea infectados i.n. Con una dosis de 300 MID50 de LAIV o inyectados i.m. con una dosis de 10 xq de Lenl7/H5 IIV. Dos grupos de ratones se infectaron i.n. con ya sea 300 MID50 del virus de tipo silvestre Pot/86 o 100 MID50 del virus HK/213 como controles positivos. Otro grupo de ratones recibió PBS como un control negativo. Los sueros se recolectaron 6 semanas después de la vacunación o infección y se acumularon cinco ratones por grupo para probar los anticuerpos neutralizantes de pre-estimulación contra los virus H5 y H2. Virus HK/156 antigénicamente relacionados se utilizó en lugar del virus de estimulación HK/483 debido a que este último virus es menos sensible al ensayo de microneutralización (dato no mostrado) . Sin embargo, como es mostrado en la Figura 1,
niveles sustanciales de IgG de suero especifico de virus H5N1 e IgA de tracto respiratorio se detectaron mediante ELISA. Como es esperado el virus parental Lenl7 ca H2N2 no indujo ninguno de ¦ los anticuerpos neutralizantes reactivos cruzados detectables contra los virus H5, pero un bajo nivel de IgG de suero reactivo cruzado con H5 HA que fue 20 a 100 veces menor (p<0.01) que la respuesta de IgG especifica del subtipo inducida por Lenl7/H5 como una vacuna viva o exterminada, respectivamente, se detectó. De manera interesante, la Figura 1 también muestra que el virus parental Lenl7 ca indujo títulos de IgA nasales reactivos cruzados de H5 que no fueron significativamente diferentes a aquellos inducidos por Lenl7/H5 LAIV, sugiriendo que la respuesta IgA local fue generalmente más reactiva cruzada con el subtipo que la respuesta de anticuerpo IgG de suero. Cuando se utilizó como una vacuna inactivada con formalina, Lenl7/H5 indujo títulos de anticuerpo neutralizantes similares (160 y 80, respectivamente) al virus Pot/86 homólogo y el virus HK/156 antigénicamente relacionado, pero anticuerpos neutralizantes que reaccionaron cruzadamente con el virus HK/213 no fueron detectados (Tabla 8) . Como se muestra en la Figura 1, la vacuna de Lenl7/H5 inactivada también indujo niveles significantes de IgG específico de HA de HK/156 en el suero, el pulmón y
lavados nasales. Los anticuerpos IgA y/o IgG que reaccionaron cruzadamente con el virus HK/213 en el suero, el pulmón y los lavados nasales también se observaron en ratones que reciben ya sea Lenl7/H5 LAIV o Lenl7/H5 IIV. En resumen, IIV inoculado mediante la ruta i.m. indujo mejor neutralización del suero reactiva cruzada y respuesta de anticuerpo IgG (p<0.05) al virus HA de HK/156 comparado con la LAIV Lenl7/H5, mientras que esta última vacuna indujo respuestas de anticuerpo IgA especificas de HA H5 superiores en lavados de tracto respiratorio. Ejemplo 11 Eficacia protectora cruzada de la vacuna Lenl7/H5 reclasificante en ratones La eficacia protectora de Lenl7/H5 como una LAIV o IIV se evaluó en ratones estimulados con virus H5N1 aislados de humanos en Hong Kong en 1997 (HK/483) y 2003 (HK/213) . HK/483 se seleccionó para representar los virus H5N1 de 1997, puesto que se ha mostrado previamente que altamente letal para ratones BALB/c naive (Lu y colaboradores, 1999) . El virus H5N1 antigénicamente variante, HK/213, no fue letal para ratones, pero se replicó a altos títulos en pulmones de ratón. Seis semanas después de la inmunización i.n. o i.m., los ratones vacunados se estimularon i.n. con 50 µ? de 100 MID50 de HK/213 o 50 LD50 de HK/483. Tres o 6 días después de la estimulación, cinco animales por grupo se eutanizaron y
los tejidos se recolectaron y se almacenaron a -70°C. Los tejidos descongelados se homogenizaron en 1 mi de PBS frío y se titularon para infectividad de virus en huevos embrionados de 10 días- de edad, como es descrito previamente (Lu y colaboradores, 1999) . Los títulos de punto final de virus se expresaron como la media logioEID50/ml ± S.D. Los ocho ratones en cada grupo que se estimularon i.n. con el virus HK/483 altamente patogénicos se observaron diariamente para signos de enfermedad, pérdida de peso y muerte durante 14 días después de la estimulación. El significado estadístico de los resultados se determinó utilizando la prueba t del Estudiante de dos extremos. En el primer experimento, grupos de ratones vacunados (n = 13) se infectaron i.n. con 50 LD5o de HP HK/483. Ocho ratones por grupo se monitorearon diariamente para la pérdida de peso y muerte durante 14 días. Los ratones restantes en cada grupo se eutanizaron en el día 6 p.i. para determinar los niveles de replicación viral en el tracto respiratorio inferior (pulmón) y superior (nariz), el cerebro y el timo. El día 6 se eligió para evaluar la protección cruzada, debido a que los inventores han encontrado que los ratones naive tienen títulos sustanciales de virus HK/483 en el pulmón y en la nariz, y tienen un pico de replicación viral en el cerebro y el timo en este punto de tiempo. Los resultados se resumen en la Tabla 9.
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Tabla 9 Eficacia protectora de las vacunas de influenza H5 contra infecciones con virus H5N1 de 1997 ? 2003
Ratones BALB/c se infectaron i.n. con una dosis de 300 MID!0 de LAIV o se inyectaron i.m. con una dosis de lOug de Lenl7/H5 IIV. Los ratones se infectaron i.n. con 300 MID!0 de virus Pot/86 de tipo silvestre como un control positivo o recibieron PBS como un control negativo . Ratones (n=13/grupo) se estimularon i.n. 6 semanas después con 50 LDS0 (=1000 MIDS0) de virus HK/483 y ocho ratones por grupo se observaron diariamente para pérdida de peso y muerte por 14 días . Los títulos de virus se determinaron en el el día 6 p.i. y represéntala media de log10 EIDS0_+S .D . de cinco ratones por grupo. El límite de detección de virus fue ??' EIDso/ral para pulmones y 10 EID50/ml para otros órganos. Los tejidos en los cuales no se detectó virus se les dieron un valor de ??' ' EIDs„/ml (pulmón) " o 10°" EID„/ml (otros tejidos) para el cálculo del título medio. Ratones (n=5-10/grupo) se estimularon i.n. 6 semanas después con 100 MXD50 de virus ??/2?3. Los títulos de virus de de pulmón medios y la protección de la infección se determinaron en el día 3 p.i.. Los títulos representan medias logt0EIDS0_+s.D. de cinco ratones por grupo. El límite de detección de virus fue 10lsEID!0/ml para pulmones . p<0.01 comparado con el grupo de PBS.
Todos los ratones de control no vacunados que recibieron PBS murieron 5-9 días después de una estimulación con HK/483, que tienen una pérdida de peso máxima media de 22% y altos títulos de virus en el pulmón, nariz, cerebro y timo en el día 6 p.i. En contraste, los ratones que se inocularon i.n. con el virus Pot/86 parental de tipo silvestre no exhibieron signos de enfermedad durante el período experimental completo, y no se detectó virus en cualquier órgano en el día 6 p.i. Los ratones que reciben el virus Lenl7 parental ca (H2N2) mostraron enfermedad severa, con una pérdida de peso máxima media de 19%, pero demostraron un incremento moderado en la supervivencia comparada con el grupo no vacunado. Consistente con esta observación hubo una reducción moderada, pero no significante en los títulos virales de pulmón HK/483 en estos ratones. Por otra parte, los títulos virales en el ' tracto respiratorio superior, cerebro y timo, fueron significativamente menores en ratones que recibieron el virus Lenl7 (H2N2) parental comparado con aquellos, que recibieron PBS solamente. La protección heterosubtípica similar contra los virus H5N1 se ha observado previamente (Tumpey y colaboradores, 2001). En contraste, todos los ratones que reciben la LAIV Lenl7/H5 sobrevivieron a una estimulación letal con el virus HP HK/483, pero exhibieron enfermedad leve, como es medido por una pérdida de peso moderada observada entre el día 3 y 5
p.i. (dato no mostrado). Solamente bajos títulos de virus se detectaron en pulmones de dos de cinco ratones vacunados con LAIV de Lenl7/H5 (102·3 y 102'5 EID50/ml) en el día 6 p.i., y no se detectó virus en cualquiera de los otros órganos probados, indicando que estos ratones fueron efectivamente protegidos de la estimulación con HP HK/483. Cuando se suministró como una IIV, Lenl7/H5 protegió siete de ocho ratones de la enfermedad de virus HK/483 letal, aunque los ratones experimentaron pérdida de peso moderada. Mientras que no se detectó virus en los pulmones o timos de ratones vacunados con Lenl7/H5 IIV, bajos títulos de virus se aislaron de la nariz de uno de cinco ratones (101'6 EIDso/ml) , y los cerebros de dos de cinco ratones (101-6 y 101·8 EID50/ml) en el día 6 p.i. En un segundo experimento, cinco ratones en cada grupo de vacuna se estimularon i.n. con 100 MID50 del virus HK/213 2003 y los títulos de pulmón virales en el día 3 p.i. se determinaron. A los ratones que se les dio solamente PBS tuvieron altos títulos de virus en los pulmones en el día 3 p.i. Los títulos virales del pulmón en los ratones inmunizados con Lenl7 fueron ligeramente menores que aquellos de los ratones de PBS no vacunados pero la diferencia no fue significante. Como es observado con la estimulación de HK/483, no se detectó virus en los pulmones de cualquier ratón inoculado con el virus H5N2 Pot/86 parental de tipo
silvestre 3 días después de la estimulación con el virus HK/213. Nueve de 10 ratones que reciben la LAIV de Lenl7/H5 y todos los ratones que reciben IIV de Lenl7/H5 carecieron de virus HK/213 detectable en los pulmones en el día 3 p.i., lo cual representó por lo menos una reducción de 3000 veces en el titulo comparado con los ratones que reciben PBS solamente . Estos resultados demostraron que una dosis de Lenl7/H5 administrada ya sea como una LAIV o IIV proporcionó protección sustancial de la infección, enfermedad severa y muerte después de la estimulación con el virus HP HK/483. Adicionalmente , ambas vacunas protegieron a los ratones contra la replicación del virus HK/213 antigénicamente variante . Ejemplo 12 Inmunogenicidad y respuestas celulares de anticuerpo reactivas cruzadas inducidas por LAIV e IIV de H5 Las vacunas de virus completo inactivadas se prepararon de Lenl7/H5 y HK/213 como es descrito previamente (Subbarao y colaboradores, 2003) . Una suspensión al 2% de alumbre se mezcló con un volumen igual de vacuna en PBS antes de la inmunización. Los ratones BALB/c hembras de ocho semanas de edad, (Jackson Laboratories, Bar Harbor, MA, USA) se utilizaron en estos experimentos. Los ratones se inmunizaron una vez
mediante inoculación i.n. con Lenl7/H5 o Lenl7 (H2N2) como un control, o se inmunizaron mediante la inoculación i.m. con IIV preparada del virus Lenl7/H5 o HK/213, administrado con o sin adyuvante de alumbre. Los sueros y lavados nasales inmunes se recolectaron como es descrito previamente (Katz y colaboradores, 1999) . Los sueros se trataron con la enzima que destruye receptor de Vibrio cholerae ( Denka-Seiken, Tokio, Japón) antes de probarlo para la presencia de anticuerpos específicos de H5 (Kendal, 1982). Los títulos de anticuerpo neutralizantes se determinaron como es descrito previamente (Rowe y colaboradores, 1999) . Un ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA) se utilizó para la detección de anticuerpos IgG, IgGl, IgG2a, e IgA en el suero y/o lavados nasales (Katz y colaboradores, 1999), excepto que 1 pg/ml de hemaglutinina H5 recombinante expresada en baculovirus purificada (rHA; Protein Sciences Corporation, eriden, CT, USA) se utilizó para recubrir las placas. Los títulos de punto final de ELISA se expresaron como la dilución más alta que produjo una densidad óptica (OD) mayor que dos veces la OD media más S.D. de muestras de control negativas similarmente diluidas. Suspensiones de células de bazo individuales se prepararon y se estimularon con cinco unidades hemaglutinantes (HAU) del virus H5 completo (HK/213) inactivado con formalina o 250 ng de HA
recombinante (HK/156) a una concentración de 5 x 106 células/ml (Lu y colaboradores, 2002). Los sobrenadantes de cultivo se recolectaron después de 5 días de cultivo. Interleucina (IL)-2, interferona (IFN)-y, IL-4 e IL-10 se detectaron en sobrenadantes de cultivo mediante el ensayo Bio-Plex (BioRad Laboratories, Hércules, CA) , utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El significado estadístico de los datos se determinó utilizando la prueba t del Estudiante. Los sueros recolectados de ratones 1 mes después de la vacunación se probaron para la presencia de anticuerpos neutralizantes reactivos cruzados contra virus H5N1 representativos aislados de humanos de 1997 a 2004. Como se muestra en la Tabla 10, los anticuerpos neutralizantes contra el virus homólogo se detectaron en sueros de ratones que reciben LAIV de Lenl7 H5 inoculados mediante la ruta i.n., pero anticuerpos neutralizantes reactivos cruzados contra los virus heterólogos HK/156, HK/213 y VN/1203 no se detectaron.
O
Tabla 10 Respuestas de anticuerpo neutralizante de suero de ratones inmunizados con vacunas H5
Grupo de vacuna" Ruta Títulos de anticuerpo neutralizante" Lenl7 Lenl7/H5 HK/156 HK/213 VN/1203
PBS i .n. <40c <40 <40 <40 <40
Lenl7 i.n. 80d <40 <40 <40 <40
Lenl7/H5 i .n. <40 80 <40 <40 <40
Lenl7/H5 i.m. <40 160 40 <40 <40
Lenl7/H5+alumbre i .m. <40 640 320 160 <40
HK/213 i.m. <40 <40 <40 320 <40
??/213+alumbre i.m. <40 40 80 5120 20
• Los ratones fueron ya sea infectados i.n. con una do¡sis de 300 MID„ de LAIV o inyectados i .m. con una dosis de 10 ug de IIV. Los sueros se recolectaron 1 mes después de la vacunación y se acumularon de 10 ratones por grupo para probar los anticuerpos neutralizantes contra los virus H5 y H2. Los títulos representan el reciproco de la dilución más altaide suero que da 50% de neutralización de 100TCID de virus. Un título de <40 representa el límite inferior de detección. Los valores en el texto en negritas representan títulos al virus homólogo.
Como es esperado, el virus Lenl7 ca H2N2 no indujo anticuerpo neutralizante reactivo cruzado detectable contra cualquier virus H5. Comparado con H5 LAIV, Lenl7/H5 o HK/213 IIV indujo anticuerpos neutralizantes de suero dos veces más alto contra el virus homólogo, pero poco si cualquier anticuerpo reactivo cruzado que podría neutralizar los virus H5N1 de humano 1997 y 2004 heterologos. Sin embargo, la adición de alumbre a ya sea Lenl7/H5 o HK/213 IIV aumentó los títulos de anticuerpo. homólogos por 4—16 veces y consecuentemente, también aumentó la respuesta de anticuerpos neutralizantes reactivas cruzadas a virus H5N1 heterologos. Los niveles de IgG de suero anti-H5 de IgG e IgA de lavado nasal se determinaron mediante ELISA, y los resultados se ilustran en la Figura 2. Niveles sustanciales de IgGl e IgG2a que reaccionaron cruzadamente con HA VN/1203 fueron inducidos por tanto Lenl7/H5 LAIV e IIV, aunque anticuerpos neutralizantes contra el virus VN/1203 no se detectaron. Solamente las vacunas LAIV administradas mediante la ruta i.n. indujeron respuestas de IgA nasales. De manera interesante, ambos de Lenl7/H5 y Lenl7 (H2N2) LAIV indujeron respuestas de IgA nasales que reaccionaron a títulos similares con H5 HA. En contraste, solamente Lenl7/H5 LAIV indujo IgG de lavado nasal específico de H5 a niveles que fueron moderadamente más altos que aquellos inducidos por Lenl7/H5 IIV.
La producción de citoquina se evaluó en células del bazo aisladas de ratones -inmunizados con LAIV o IIV que se reestimularon in vitro con ya sea HA recombinante de H5 o virus H5N1 completo inactivado, y los resultados se muestran en la Figura 3. Las células del bazo de ratones · infectados i.n. con el virus H5N1 de HK/213 de tipo silvestre, incluido como un control positivo, produjeron ya sea citoquinas similares a Thl (IFN-?) o similares a Th2 (IL-4 e IL-10) . En todos los casos, la estimulación de las células del bazo inmunes con el virus H5N1 inactivado completo indujo respuestas de citoquina más vigorosas que la estimulación con HA recombinante de H5 purificado. Comparado con LAIV, IIV indujo la producción de IL-4 e IL-10 más fuerte cuando se estimuló con el virus H5N1 completo inactivado. A la inversa, LAIV indujo niveles más altos de IFN-? en células del bazo reestimuladas con el virus completo, aunque las diferencias fueron más moderadas. LAIV o IIV indujeron niveles similares de IL-2. Sin embargo, los ratones administrados con LAIV de Lenl7 (H2N2) produjeron principalmente IFN-?, y solamente cuando se reestimularon con el virus H5N1 completo, sugiriendo que esta respuesta celular reactiva cruzada de subtipo se dirigió contra epitopes conservados sobre las proteínas de virus de influenza A internas, en contraste, las respuestas de LAIV o IIV de H5 se dirigieron contra epitopes presentes en HA de H5 asi como contra otras proteínas
virales . Ejemplo 13 Eficacia protectora cruzada de LAIV e IIV de H5 en ratones Los inventores enseguida evaluaron la habilidad de LAIV de Lenl7/H5 o IIV, y HK/213 IIV para proteger ratones de estimulaciones letales con 200 LD50 del virus VN/1203, un virus HPAI H5N1 aislado de un caso humano fatal a principios de 2004 que es antigénicamente y genéticamente distinto de las cepas de vacuna. Para evaluar el grado de protección de las estimulaciones letales, los ratones vacunados se infectaron i.n. con 200 LD50 del virus VN/1203. Los ratones se anestesiaron ligeramente con C02 y 50 µ? de virus infeccioso diluido en PBS se inoculó i.n. Cincuenta por ciento de la dosis infecciosa de ratón (MID50) , y títulos de 50% de dosis letal (LD50) se determinaron como es descrito previamente (Lu y colaboradores, 1999) . Cinco ratones de cada grupo se eutanizaron 6 días de post infecciosa (p.i.). Los tejidos de pulmón, nariz y cerebro se recolectaron y se titularon para la infectividad del virus como es descrito previamente (Lu y colaboradores, 1999) . Los títulos de virus se expresaron como la media loglO EID50/ml ± desviación estándar (S.D.). Los ratones restantes en cada grupo se observaron diariamente durante 14 días para la pérdida de peso y supervivencia. Los grupos de ratones que reciben una y/o dos dosis
de LAIV o IIV de H5 se estimularon 3.5 meses después de la primera vacunación o 2.5 meses después de la segunda vacunación. El día 6 se eligió para evaluar el nivel de replicación viral, debido a que los inventores han encontrado que los ratones naive infectados con VN/1203 tienen títulos sustanciales de virus en el pulmón, nariz y cerebro en este punto de tiempo. Como se muestra en la Tabla 11, todos los ratones de control que recibieron solamente PBS murieron 6-9 días después de la estimulación con el virus VN/1203, que tiene una pérdida de peso máxima media de 19% y altos títulos de virus en el pulmón, nariz y cerebro en el día 6 p.i.
t o
Tabla 11 Eficacia protectora cruzada de vacunas H5 contra el virus H5N1 del 2004
Los ratones se estimularon i.n. con 200 LD,„ de un virus VN/1203 3.5 meses después de la primera vacunación o 2.5 meses después de la segunda vacunación. Los sueros se recolectaron antes de la estimulación y se probaron para anticuerpo neutralizante (Neut Ab) contra el virus VN/1203. Los títulos del .virus se determinaron 6 días p.i. y se expresan como el log EID„ /ml_+S .D . de cinco ratones por grupo . Los ratones se monitorearon diariamente para la supervivencia y pérdida de peso por 14 dias . Los ratones en el grupo de PBS murieron _< 7 días p.i. Todos los grupos excepto aquel mostrado en el texto en negritas son p<0.01 comparado con el grupo de PBS.
Aunque 80% de los ratones inmunizados con LAIV de Lenl7 H2N2 sobrevivieron, los ratones exhibieron pérdida de peso sustancial y títulos de virus de pulmón medios similares a aquellos observados en los ratones de control no vacunados. Por otra parte, los títulos virales en el tracto respiratorio inferior y el cerebro fueron significativamente menores en ratones que recibieron el virus Lenl7 (H2N2) parental, comparado con aquellos que recibieron PBS (p<0.05). Todos los ratones inmunizados con una dosis de LAIV de Lenl7/H5 sobrevivieron a la estimulación letal, y exhibieron solamente pérdida de peso moderada. El día 6 de p.i. los títulos virales del pulmón en ratones inmunizados con LAIV de Lenl7/H5 fueron más de 10,000 veces inferiores que aquellos detectados en ratones inmunizados con LAIV de Lenl7 o PBS; no se detectó virus en el tracto respiratorio superior o los cerebros de los ratones. Todos los ratones inmunizados con una y dos dosis de IIV de Lenl7/H5 o dos dosis de IIV de HK/213 sin adyuvante de alumbre sobrevivieron a la estimulación letal con el virus VN/1203, pero exhibieron una pérdida de peso moderada. Bajos niveles de virus se detectaron en el pulmón, nariz y cerebro de ratones administrados con una dosis de IIV Lenl7/H5 en los pulmones de ratones que recibieron dos dosis de IIV de HK/213. Ratones que reciben dos dosis de ya sea IIV de Lenl7/H5 o HK/213 con adyuvante de alumbre no exhibieron
signos de enfermedad, y no se aisló virus de cualquiera de los órganos en 6 días p.i. Estos resultados demostraron que Lenl7/H5 administrado ya sea como LAIV o IIV, y HK/213 administrado como una IIV proporcionó protección cruzada sustancial de la infección, enfermedad severa y muerte después de la estimulación con un virus H5N1 2004 humano heterólogo altamente letal, aunque solamente la IIV de HK/213 formulada con alumbre indujo una respuesta de anticuerpo neutralizante reactiva cruzada detectable contra el virus VN/1203. Los inventores también han demostrado que la vacuna de acuerdo con la invención indica inmunidad protectora cruzada en monos contra la infección con el virus de influenza H5N1. DISCUSIÓN La estrategia óptima para el control de la influenza pandémica es la intervención temprana con una vacuna producida de la cepa pandémica actual, o por lo menos de una cepa relacionada que es una igualación antigénica cercana. En 1003 y 2004, las cepas de vacuna inactivadas se generaron mediante genética inversa, utilizando el gen' NA y el gen HA modificado para remover la porción de sitios de segmentación multi-básico de los virus HPAI H5N1 de tipo silvestre y genes internos derivados de A/PR/8/34, una cepa donadora de alto crecimiento para la producción de vacunas en
huevos embrionados . Este procedimiento requiere el uso de un alto nivel de contención de laboratorio, seguridad, prueba de la cepa de vacuna recuperada para asegurar la atenuación adecuada para pollos y especies mamíferas, tecnología de genética inversas patentada sofisticada y una línea de células calificada para vacuna. Además, aun en el mejor escenario, esto tomaría por lo menos 6 meses para producir una vacuna pandémica antigénicamente bien igualada. En esta prueba de estudio de conceptos, los inventores evaluaron la inmunogenicidad y eficacia de un candidato LAIV H5 reclasificante 7:1 generado de una cepa H5N2 no patogénica, que es antigénicamente similar a los virus H5N1 de 1997, y la cepa donadora maestra Lenl7 ca Rusa. Debido a que el candidato de vacuna Lenl7/H5 también presentó las propiedades de alto crecimiento en huevos embrionados que son deseables para la producción de IIV, los inventores también evaluaron su utilidad como una IIV. Como una LAIV, una sola dosis de Lenl7/H5 indujo respuestas de anticuerpo IgA especificas de virus H5 superiores en el tracto respiratorio, mientras que una sola dosis de IIV Lenl7/H5 indujo mejores respuestas de anticuerpo IgG y neutralizantes de suero reactivas cruzadas mejores al virus HA de HK/156. De manera sorprendente, una sola dosis de Lenl7/H5 administrada ya sea como una LAIV o IIV indujo inmunidad protectora en ratones contra ambos virus H5N1
relacionados y antigénicaraente variantes. LAIV contra virus H5N1 fue primero desarrollada utilizando la tecnología de genética inversa para modificar el HA de las cepas HP H5N1 aisladas de humanos en Hong Kong en 1997. Dos reclasificantes 6:2 se generaron; estos contuvieron genes HA modificados, y carecieron de los genes neuraminidasa (NA) de tipo silvestre del HK/156 y HK/483, los seis segmentos internos de la cepa donadora A/Ann Arbor/6/60 sea atenuada, y el sitio de segmentación de aminoácido multi- básico asociado con virulencia en pollos. Las LAIVs H5 resultantes no fueron altamente patogénicas para pollos, pero dieron inmunidad variable y protección en pollos después de la inoculación intravenosa. Sin embargo, la eficacia de estas LAIVs de H5N1 no se evaluó en mamíferos o humanos (Li y colaboradores, 1999) . Otro procedimiento se utilizó para el desarrollo de una vacuna de antígeno de superficie derivada de un virus H5N3 no patogénico, antigénicamente relacionado con la cepa H5N1 de 1997. Cuando se evaluó en humanos dadas en dos dosis ' de la IIV H5N3 con o sin adyuvante MF-59, la IIV sin adyuvante fue pobremente inmunogénica , aun después de dos dosis de hasta 30 yg de HA, mientras que la vacuna H5N3 con adyuvante indujo títulos de anticuerpo que alcanzaron niveles protectores como es medido por el ensayo de hemolisis radial individual (Nicholson y colaboradores, 2001).
La comparación de las secuencias de aminoácidos de la subunidad HA1 demostró una identidad de 91-92% de aminoácidos entre la cepa de vacuna Lenl7/1-15 y los virus H5N1 de 1997 y 2003 utilizados en el presente estudio. No obstante, las vacunas Lenl7/H5 proporcionaron protección efectiva contra la muerte inducida por el virus H5N1, enfermedad severa y replicación del virus. Como una LAIV, el reclasificante Lenl7/H5 indujo protección efectiva de ratones contra una estimulación letal con el virus HK/483, severa enfermedad como es medido por la pérdida de peso, y títulos virales de pulmón reducidos por cinco logs a un punto de tiempo cuando los ratones de control no vacunados sucumbieron a la infección letal. En este punto de tiempo crítico, no se detectó virus en el tracto respiratorio superior o en tejidos sistémicos de ratones administrados con LAIV de Lenl7/H5. La carencia de virus en la nariz estuvo asociada con títulos significantes de IgA específicos de H5 en lavados nasales. De hecho, LAIV de Lenl7/145 indujo títulos IgA de lavado nasal y de pulmón que fueron comparables con aquellos inducidos por la infección con los virus Pot/86 o HPAI HK/213 de tipo silvestre, mientras que IIV de Lenl7/H5 no indujo respuesta de IgA del tracto respiratorio. En contraste, el anticuerpo neutralizante IgG de suero contra HK/156 fueron cuatro veces más altos en ratones que recibieron IIV de Lenl7/H5,
comparados con aquellos que recibieron LAIV. Estos resultados pueden explicar la carencia completa de virus detectable en pulmones de ratones que recibieron IIV en el dia 6 p.i. Por lo tanto, aunque LAIV o IIV de Lenl7/H5 indujo respuestas óptimas en diferentes compartimientos del anticuerpo, ambas vacunas proporcionaron protección cruzada sustancial después de las estimulaciones con los virus H5N1 humanos de 1997 y 2003. En el Ejemplo 13, los inventores han mostrado que el reclasificante Lenl7/145 proporciona protección de estimulación letal con el reciente virus A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) altamente patogénico. Mientras que. el reclasificante Lenl7/H5 es inmunogénico en hurones, el grado al cual puede replicarse y ser inmunogénico para humanos no ha sido probado todavía. Los genes NA de ambos parentales utilizados para la preparación de Lenl7/145 fueron del subtipo N2. Esto requeriría esfuerzo adicional significante para seleccionar un reclasificante 6:2 que lleva el gen NA de la cepa parental de tipo silvestres. Debido a que el tiempo es limitado si la preparación urgente de un reclasificante pandémico es necesario, los inventores estudiaron la vacuna de reclasificación 7:1 que heredó el gen NA del parental Lenl7 ca. Los resultados de los inventores han mostrado que un NA antigénicamente relacionado no fue esencial para un
efecto protector contra los virus H5N1 virulentos en ratones. Sin embargo, otros estudios hay demostrado una función para el anticuerpo especifico de NA en reducir la severidad de la enfermedad en humanos o en proteger ratones de una estimulación letal con un virus de influenza humana adaptada a ratón. Mientras que un reclasificante LAIV que posee tanto HA como NA relacionado con la cepa pandémica circulante es deseable, este no puede ser apropiado para el subtipo NI NA, puesto que algunos productos del gen NI se han mostrado que aumenta la segmentación independiente de tripsina de la molécula HA y de esta manera podrían perder potencialmente la atenuación de una vacuna viva. El uso de la LAIV en una situación pandémica se ha considerado previamente. La generación de una cepa de vacuna reclasificante H9N2 de influenza A adaptada al frío utilizando técnicas de reclasificación clásicas se ha descrito, y la evaluación clínica de tal candidato está en curso. Una consideración importante en el uso de una vacuna atenuada viva en el evento de una pandemia es el potencial para la reclasificación de la cepa de vacuna con la cepa circulante que lleva una HA novedoso. Por lo tanto LAIV puede ser mejor utilizada en una situación pandémica solamente cuando la población enfrenta enfermedad diseminada inminente debido a la cepa pandémica de tipo silvestre novedosa.
Los resultados de los inventores sugieren una estrategia de vacuna pandémica novedosa que permitiría la detención de una IIV que podría ser exhibida inmediatamente en una cepa pandémica que ha sido identificada. Esto presumiblemente se envía antes de la circulación diseminada del virus, y ciertamente antes de que una vacuna basada sobre una igualación antigénica exacta esté disponible. Si la cepa pandémica se llega a establecer en la población, el uso de una LAIV generada del mismo extracto de semilla extendería la disponibilidad de la vacuna. Una LAIV puede tener la ventaja adicionada de reducir la cobertura viral del tracto respiratorio superior, que puede ser importante para reducir la transmisión en una población inmunológicamente naive, altamente susceptible. Los resultados de los inventores sugiere una estrategia general para utilizar la reclasificación genética clásica entre una cepa H2N2 ca de alto crecimiento y virus aviares no patogénicos antigénicamente relacionados para preparar vacunas atenuadas e inactivadas vivas contra múltiples subtipos de influenza A aviar con potencial pandémico. Las estrategias similares utilizando virus de influenza no patogénicos de otros orígenes se pueden aplicar a subtipos de influenza A con potencial pandémico de las especies correspondientes. Los inventores también evaluaron una estrategia alternativa, que dependió el uso de una cepa no patogénica
como el donador de gen HA H5 y la generación de un virus reclasificante atenuado con otros genes a partir de una cepa donadora maestra ca, utilizando métodos de reclasificación tradicionales. Los resultados de los inventores demuestran que una dosis de LAIV de Lenl7/H5 o dos dosis de IIV indujo un alto nivel de protección cruzada de enfermedad severa, muerte y replicación viral, aunque la vacuna y las cepas de estimulación compartieron una identidad de aminoácido subunitaria de HA1 de solamente 91%. De manera sorprendente, este efecto protector cruzado se observó en ratones con bajos o indetectables niveles de anticuerpos neutralizantes contra el virus de estimulación (Tablas 10 y 11). Sin embargo, el IgA de lavado nasal y/o IgG de suero que reaccionó cruzadamente con HA de VN/1203 se detectaron en ratones que recibieron LAIV e IIV, respectivamente (Figuras 1 y 2). Estos resultados sugieren una función protectora para anticuerpos que no son detectados por el ensayo de neutralización de suero . La inducción de células T especificas de virus que producen citoquina por cualquier vacuna también puede contribuir al efecto protector cruzado más amplio. De manera interesante, la inducción del anticuerpo IgA de lavado nasal reactivo cruzado y la respuesta' de célula T en ratones con LAIV de Lenl7 (H2N2) recibido fue asociado con la protección de la dispersión sistémica del virus y muerte, pero no con la
reducción de los títulos virales del pulmón y morbidez como es medido por la pérdida de peso. No obstante, la respuesta específica del subtipo H5 inducida por cualquiera de las vacunas H5 fue requerida para la reducción de la carga de virus en los pulmones y la morbidez reducida. Ni LAIV de Lenl7/H5 ni IIV sin adyuvante indujeron la protección cruzada completa de la infección y enfermedad, puesto que un bajo nivel de replicación viral y/o pérdida de peso se detectaron en la mayoría de los ratones en el día 6 después de la inmunización. Solamente los ratones inmunizados con IIV formulada con adyuvante se encontraron que no tienen virus detectable en cualquiera de los tejidos probados en el día 6 después de la inmunización, y esencialmente nada de morbidez. Si estos resultados realmente refleja la protección cruzada completa de la infección en el tracto respiratorio permanece que se ha establecido para determinar los títulos virales como un punto de tiempo más temprano después de la inmunización. El uso de un adyuvante con IIV también aumentó las respuestas de anticuerpo neutralizante reactivas cruzadas de H5 inducidas por tanto IIV de Lenl7/H5 como HK/213. Así el uso de un adyuvante en la formulación de vacunas pandémicas puede ser particularmente útil cuando una cepa de vacuna IIV disponible no es una igualación antigénica óptima con la cepa
pandémica circulante, o cuando los extractos de virus reclasificantes para la producción de vacuna son limitados. Los inventores han mostrado que una LAIV o IIV con adyuvante basado en una cepa H5 heteróloga puede significativamente limitar la severidad de la enfermedad y reducir la mortalidad en ratones después de la estimulación con un virus H5N1 HPAI contemporáneo. Estos resultados sugieren que LAIV heterotipica o IIV con adyuvante puede proporcionar una medida de control de salud pública para limitar la severidad de la enfermedad en las etapas tempranas de una pandemia antes de la disponibilidad de una vacuna especifica de cepa. Subsecuente a la presentación de la solicitud de prioridad, reclasificantes de virus de influenza 6:2, 7:1 y 5:3 entre A/Duck/Primorie/2621/2001 (HlNl) y A/Puerto Rico/8/34 se han reportado (Rudneva y colaboradores, 2007). Todos los tres reclasificantes fueron patogénicos para los ratones. El reclasificante 7:1 dio bajo rendimientos en huevos, pero una variante producida por el pasaje serial en huevos produjo rendimientos comparables a aquellos del reclasificante 6:2. El reclasificante 5:3, producido por el cruzamiento hacia atrás del reclasificante 6:2 con la cepa parental, produjo rendimientos más altos que cualquiera del reclasificante 6:2 o el 7:1. Solamente al reclasificar 6:2 se probó para la inmunogenicidad; esto indujo una respuesta
protectora eficiente contra una cepa H5N1 altamente patogénica. Los autores sugieren que el cruzamiento hacia atrás y la selección de variantes de alto crecimiento podrían ser útiles en la producción de cepas altamente patogénicas o reclasificantes de tales cepas, o a reclasificantes producidos utilizando la genética inversa. El uso de cepas de baja patogenicidad es sugerido con el fin de evitar la necesidad de utilizar la genética inversa. Se establece que la habilidad del reclasificante 6:2 para inducir la inmunidad protectora contra la cepa H5N1 "da esperanza de que este procedimiento puede ser utilizado para la preparación de vacunas de "barricadas". Será evidente para la persona experta en la técnica que mientras que la invención se ha descrito en algún detalle para los propósitos de claridad y entendimiento, varias modificaciones y alteraciones a las modalidades y métodos descritos en la presente se pueden hacer sin apartarse del alcance del concepto inventivo divulgado en esta especificación . Las referencias citadas en la presente se listan en las siguientes páginas, y se incorporan en la presente por esta referencia. REFERENCIAS Alexandrova GJ, Klimov AJ Live Influenza Vaccine, Leningrad 1989 pp . 67-69
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Claims (41)
- REIVINDICACIONES 1. Una vacuna de virus de influenza atenuada viva, caracterizada porque comprende un virus de influenza reclasificante que tiene a) por lo menos un gen hemaglutinina derivado de un virus de influenza aviar no patogénico, en el cual el virus de influenza no patogénico o de baja patogenicidad tiene el mismo tipo de hemaglutinina como aquel de un virus de influenza altamente patogénico, y b) otros genes derivados de una cepa donadora que tiene un diferente tipo de hemaglutinina de aquel del virus de influenza altamente patogénico.
- 2. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el virus de influenza reclasificante es un reclasificante 7:1, y en el cual solamente el gen hemaglutinina se deriva de un virus de influenza no patogénico .
- 3. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada porque el virus de influenza no patogénico o de baja patogenicidad es un virus aviar .
- 4. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el virus de influenza aviar no patogénico o de baja patogenicidad es A/Duck/Potsdam/1042-6/86 (H5N2) A/Vietnam/119 /04 (H5N1), A/Duck/Singapore/97 (H5N3) , A/Duck/Hokkaido/67/96 (?5?4) o A/Mallard/Netherlands/12/00 (H7N3) .
- 5. Una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la cepa donadora es una cepa de vacuna completamente caracterizada.
- 6. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la cepa donadora es una cepa adaptada al frío o sensible a la temperatura.
- 7. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada por que la cepa donadora es adaptada al frió y sensible a la temperatura.
- 8. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 6 o reivindicación 7, caracterizada porque la cepa donadora tiene mutaciones en los genes PB2, PA, NA y M.
- 9. Una vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la cepa donadora es A/Leningrad/134/17/57 (H2N2), A/Leningrad/13 /47 /57 (H2N2), A/Leningrad/134/17/K7/57 (H2N2) , A/Moscow/21/65 (H2N2), A/Moscow/21/17/65 (H2N2), A/Ann Arbor/6/60 (H2N2), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) o A/Puerto Rico/8/59/1 (H1N1).
- 10. Una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque el virus de influenza reclasificante se obtiene mediante reclasificación clásica .
- 11. Una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque el virus de influenza reclasificante induce una respuesta inmune protectora cruzada contra un virus de influenza altamente patogénico .
- 12. Una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada porque induce respuestas de IgA, IgG y de célula T.
- 13. Una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada porque se formula para la administración oral o intranasal.
- 14. Una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizada porque también comprende un adyuvante.
- 15. Una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizada porque también comprende uno o más agentes estabilizantes que permiten que la vacuna sea almacenada a la temperatura de refrigerador.
- 16. Una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizada porque también comprende (a) uno o más virus de influenza adicionales; y/o (b) una proteina de neuraminidasa de influenza sustancialmente pura y/o proteina de hemaglutinina de influenza .
- 17. Un método para inmunizar a un sujeto contra la infección con un virus de influenza altamente patogénico, caracterizado porque comprende la etapa de administrar una vacuna de conformidad con cualquiera de las . reivindicaciones 1 a 16 al sujeto.
- 18. Un método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la cepa de virus de influenza altamente patogénico es una cepa de virus de influenza de origen aviar.
- 19. Un método de conformidad con la reivindicación 17 o la reivindicación 18, caracterizado porque la vacuna se administra oralmente o intranasalmente .
- 20. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizado porque proporciona protección cruzada y/o una respuesta inmune reactiva cruzada contra una cepa de virus de influenza altamente patogénico.
- 21. Uso de un virus de influenza como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque es para la manufactura de una vacuna para la inmunización de un sujeto contra una cepa de virus de influenza altamente patogénica.
- 22. El uso de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la vacuna se formula para la administración oral o intranasal.
- 23. Un virus de influenza reclasificante, caracterizado porque comprende (a) un gen hemaglutinina derivado de un virus de influenza no patogénico o de baja patogenicidad, en el cual el virus de influenza no patogénico o de baja patogenicidad tiene el mismo tipo de hemaglutinina como aquel de un virus de influenza altamente patogénico, y (b) otros genes derivados de una cepa donadora que tiene un diferente tipo de hemaglutinina de aquel del virus de influenza altamente patogénico.
- 24. Un virus de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque es un reclasificante 7:1, y en el cual solamente el gen hemaglutinina se deriva de un virus de influenza no patogénico.
- 25. Un virus de conformidad con la reivindicación 23 o la reivindicación 24, caracterizado porque el virus de influenza no patogénico o de baja patogenicidad es un virus aviar .
- 26. Un virus de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el virus de influenza aviar no patogénico o de baja patogenicidad es A/Duck/Potsdam/1042-6/86 (H5N2) A/Vietnam/119 /04 (H5N1), A/Duck/Singapore/97 (H5N3), A/Duck/Hokkaido/67/96 (H5N4) o A/Mallard/Netherlands/12/00 (H7N3) .
- 27. Un virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, caracterizado porque la cepa donadora es una cepa de vacuna completamente caracterizada.
- 28. Un virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizado porque la cepa donadora es una cepa adaptada al frío o sensible a la temperatura .
- 29. Un virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 28, caracterizado porque la cepa donadora es tanto adaptada al frío como sensible a la temperatura .
- 30. Un virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 29, caracterizado porque la cepa donadora tiene mutaciones en los genes PB2, PA, NA y M.
- 31. Un virus de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la cepa donadora es A/Leningrad/134/17/57 (H2N2), A/Leningrad/134/47/57 (H2N2), A/Leningrad/134/17/K7/57 (H2N2), A/Moscow/21/65 (H2N2), A/Moscow/21/17/65 (H2N2), A/Ann Arbor/6/60 (H2N2), A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) o A/Puerto Rico/8/59/1 (H1N1).
- 32. Un virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 31, caracterizado porque se obtiene mediante reclasificación clásica.
- 33. Un virus de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 32, caracterizado porque el virus de influenza reclasificante induce una respuesta inmune protectora cruzada contra un virus de influenza altamente patogénico .
- 34. Un virus de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el virus de influenza altamente patogénico contra el cual la vacuna proporciona protección cruzada es del tipo de hemaglutinina Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15 o H16.
- 35. Un virus de conformidad con la reivindicación 33 o la reivindicación 34, caracterizado porque el virus de influenza altamente patogénico contra el cual la vacuna proporciona protección cruzada es del tipo H5N1, H5N2, H5N8, H5N9, H7N3, H7N7 o H9N2.
- 36. Un método para preparar una vacuna para la inmunización de un sujeto contra una cepa de virus de influenza altamente patogénica, caracterizado porque comprende la etapa de mezclar un virus de influenza reclasificante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 35 con un portador, y opcionalmente un adyuvante .
- 37. Un método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la vacuna también comprende uno o más agentes estabilizantes que permiten que la vacuna sea almacenada a temperatura de refrigerador.
- 38. Un método ' de conformidad con la reivindicación 36 o la reivindicación 37, caracterizado porque la vacuna también comprende (a) uno o más de otros virus de influenza, y/o (b) una proteina de neuraminidasa de influenza sustancialmente pura y/o proteina de hemaglutinina de influenza .
- 39. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36 a 38, caracterizado porque la vacuna se formula para la administración oral o intranasal.
- 40. Un método para" hacer un virus de influenza reclasificante , caracterizado porque comprende (a) un gen hemaglutinina derivado de un virus de influenza aviar no patogénico, y (b) otros genes derivados de una cepa donadora, que comprende la etapa de someter un virus de influenza no patogénico o de baja patogenicidad que tiene el mismo tipo de hemaglutinina como aquel del virus de influenza altamente patogénico a la reclasificación con una cepa donadora que tiene un diferente tipo de hemaglutinina de aquel del virus de influenza altamente patogénico.
- 41. Un método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la reclasificación es la reclasificación clásica.
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