EA021095B1 - Способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа а/h1n1 - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и представляет собой способ получения инактивированной цельновирионной вакцины против вируса гриппа A/H1N1 с гидроокисью алюминия из рекомбинантного штамма NIBRG-121xp, полученного методом обратной генетики в Национальном институте биологических стандартов и контроля (NIBSC, Великобритания) и представленного по линии Всемирной организации здравоохранения НИИПББ КН МОН РК для разработки пандемической вакцины. Сущность изобретения заключается в том, что для получения инактивированной цельновирионной вакцины против вируса гриппа A/H1N1 с гидроокисью алюминия используется рекомбинантный штамм NIBRG-121хр вируса гриппа, который культивируется в 10-11-суточных куриных эмбрионах, подвергается химической инактивации, комбинированной схеме очистки и концентрирования и стерилизующей фильтрации с добавлением гидроокиси алюминия. Изобретение обеспечивает получение пандемической вакцины для профилактики вируса гриппа A/H1N1 с высокой степенью очистки вируса и соответственно с улучшенной безопасностью и иммуногенностью, процесс изготовления которой является технологичным и экономичным.

Description

(57) Изобретение относится к медицинской биотехнологии и представляет собой способ получения инактивированной цельновирионной вакцины против вируса гриппа Α/Η1Ν1 с гидроокисью алюминия из рекомбинантного штамма ΝΙΒΚΟ-121χρ, полученного методом обратной генетики в Национальном институте биологических стандартов и контроля (№В§С, Великобритания) и представленного по линии Всемирной организации здравоохранения НИИНЬБ КН МОН РК для разработки пандемической вакцины. Сущность изобретения заключается в том, что для получения инактивированной цельновирионной вакцины против вируса гриппа Α/Η1Ν1 с гидроокисью алюминия используется рекомбинантный штамм ΝΙΒΚΟ-121χρ вируса гриппа, который культивируется в 10-11-суточных куриных эмбрионах, подвергается химической инактивации, комбинированной схеме очистки и концентрирования и стерилизующей фильтрации с добавлением гидроокиси алюминия. Изобретение обеспечивает получение пандемической вакцины для профилактики вируса гриппа Α/Η1Ν1 с высокой степенью очистки вируса и соответственно с улучшенной безопасностью и иммуногенностью, процесс изготовления которой является технологичным и экономичным.

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и представляет собой способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа А/ΗΙΝΙ из рекомбинантного штамма ΝΙΒΚΟ-121χρ, полученного методом обратной генетики в Национальном институте биологических стандартов и контроля (ΝΙΒδϋ, Великобритания) и представленного по линии Всемирной организации здравоохранения НИИПББ НЦБ КН МОН РК для разработки пандемической вакцины.

Известен способ получения пандемической вакцины СеКарап (Вах1ег, Чешская Республика/Австрия), инактивированной цельновирионной против гриппа Α/Η1Ν1 из вируса дикого типа А/Са1йогша/7/2009 (Η1Ν1)ν, где вирусная биомасса нарабатывается в перевиваемой линии клеток Уего (клетки почки зеленой мартышки), далее инактивируется формалином в конечной концентрации 0,05%, при температуре и рН реакционной среды 37°С и 7,0-7,6 соответственно, в течение 3 суток с последующим ультрафиолетовым облучением. После чего инактивированная вирусная суспензия подвергается очистке и концентрированию посредством ультрацентрифугирования на линейном градиенте сахарозы 10-50%, ультра/диафильтрации и стерилизации через фильтры диаметром пор 0,22 мкм. Полученный очищенный концентрат в зависимости от весового содержания гемагглютинина (реакция одиночной радиальной иммунодиффузии) разводится буферным солевым раствором (БСР, рН 7,2) со стабилизатором до вакцинных параметров. Адъювант и консервирующее вещество в вакцину не добавляют.

Приготовленная вышеизложенным способом вакцина с содержанием гемагглютинина 2 мкг/0,2 мл у двукратно подкожно привитых мышей интервалом в 21 день формирует иммунитет напряженностью титров антител в РТГА с гомологичным антигеном 1:145. [К1к1пет О., Но^атй К., δρπιΐΐι М. е! а1. Се11 си1!иге (Уето) йегАей \\Но1е νίπικ (Η5Ν1) \'ассте Ьакей оп \уПй-1уре νίπικ кПат шйисек сто88-рго1ес1Ае 1ттипе гек]эопкек //Уассше. - 2007. - Уо1. 25(32).-Р. 6028-6036].

Наиболее значимый недостаток представленного способа заключается в использовании патогенного для людей производственного вируса, требующего соблюдения максимального уровня биологической безопасности на производстве, сложного процесса инактивации вируса и отсутствии в препарате адъюванта, необходимого для формирования быстрого и продолжительного иммунитета у привитых людей в период пандемии.

Существуют также способ получения пандемической вакцины Κ1ι.ινί·ι1 Р (ОтпнкекБ Венгрия), инактивированной цельновирионной сорбированной против гриппа Α/Η1Ν1 из рекомбинантного штамма ΝΙΒΚΟ-121χρ, полученного в Национальном институте биологических стандартов и контроля (ΝΙΒδΟ Великобритания) методом обратной генетики из эпидемического вируса А/СаП£отша/7/2009 (Η1Ν1) и высокорепродуктивного штамма А/РК/8/34 (Η1Ν1). Согласно указанному способу вирусная суспензия нарабатывается в 10-11-суточных куриных эмбрионах, очищается и концентрируется посредством осветления через картонные фильтры, ультрацентрифугирования на линейном градиенте сахарозы и стерилизующей фильтрации на мембранных фильтрах диаметром пор 0,22 мкм. Полученный очищенный концентрат инактивируется формалином в конечной концентрации 0,025%, при температуре и рН реакционной среды 4°С и 7,0-7,6 соответственно в течение 7 суток. Далее инактивированный вирусный концентрат разводится в зависимости от весового содержания гемагглютинина (δΌδ-РАОЕ) буферным солевым раствором (БСР, рН 7,2) до вакцинных параметров, объединяется с раствором фосфата алюминия таким образом, чтобы концентрация ионов алюминия (А1+³) в препарате составляла 0,33 мг/0,5 мл и перемешивается для сорбции при 4-6°С в течение 1 ч. В качестве консервирующего вещества в вакцину вносится тиомерсал (мертиолят) из расчета 0,1 мг/мл.

Приготовленная по вышеизложенному способу вакцина с содержанием гемагглютинина 2,5 мкг/0,2 мл у двукратно подкожно привитых мышей с интервалом в 21 день формирует иммунитет напряженностью титров антител в реакции торможении гемагглютинации (РТГА) с гомологичным антигеном 1:460 ЦоНапкеп К., №со11 А., С1апсю Β.Ο, Кгатаг/ Р. Рапйетю тЛиеп/а А(ШМ) 2009 тсстек ш (Не Еигореап Ишоп// Еиго ЗшуеШ. - 2009. - Уо1. 14 (41).-Р. 19361-68].

Существенным недостатком способа является низкая производительность использованного метода очистки и концентрирования вируса и несовершенность метода сорбции.

Предлагаемый способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа А/ΗΙΝΙ основан на использовании рекомбинантного штамма ΝΙΒΚΟ-121χρ, полученного методом обратной генетики в НШЗС (Великобритания) из эпидемического штамма А/СаП£огша/07/2009 (Η1Ν1) и высокорепродуктивного штамма донора А/РК/8/34 (Η1Ν1) и представленного по линии ВОЗ НИИПББ НЦБ КН МОН РК для разработки пандемической вакцины.

Сущность способа заключается в том, что рекомбинантный штамм ΝΙΒΚΟ-121χρ культивируется в 10-11-суточных куриных эмбрионах при 34°С в течение 72 ч, наработанная вирусная суспензия осветляется через 8-слойные марлевые фильтры, инактивируется формалином в конечной концентрации 0,05%, вначале при 4±2°С в течение 60 ч, далее при 37±1°С в течение 12 ч при соблюдении режима постоянного перемешивания. Очистка и концентрирование инактивированной вирусной суспензии проводится поэтапно, вначале осветляется через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм, далее концентрируется на ультрафильтрационной установке МИ^оте® РеШсоп®саккейе кук!ет (Франция) и диализе про- 1 021095 тив 10 объемов буфера [1,0 М натрий хлористый; 0,01 М ФБР рН 7,4; 0,001 М ЭДТА| и 6 объемов буфера [0,15 М натрий хлористый; 0,01 М ФБР рН 7,4; 0,001 М ЭДТА]. Полученный вирусный концентрат дополнительно очищается с помощью гель-фильтрации на колонках с сефарозой СЬ-6В, после чего стерилизуется через каскад мембранных фильтров с диаметром пор АР 20 - 0,45-0,22 мкм. Далее очищенный вирусный концентрат в цельном или разведенном до вакцинных параметров виде объединяют в асептических условиях с рабочим раствором гидроокиси алюминия (содержание ионов А1+³ 2 мг/мл) в соотношении 1:1, перемешивают лабораторным гомогенизатором Т25 Ъазю иЬТКА-ТиККАХ, 1КА (Германия) в течение 3 мин при 3000 об/мин. Полученную смесь после гомогенизации переливают в специальные стаканы и инкубируют при температуре 6±2°С в течение 24 ч при постоянном перемешивании (60-80 об/мин) с помощью спиннера ТесЬие (Франция). После окончания срока инкубации смесь фасуют во флаконы нужного объема и контролируют качество на соответствие нормативному документу. Показатель полноты сорбции антигена на гидроокиси алюминия при соблюдении вышеуказанного режима составления превышает 90%.

Приготовленная по предлагаемому способу вакцина с содержанием гемагглютинина 3 мкг/0,2 мл при двукратной внутрибрюшинной вакцинации мышей с интервалом 7 суток формирует у них иммунитет напряженностью 1:425 в РТГА. При контрольном заражении (интраназально под легким эфирным наркозом) вакцинированных мышей эпидемическим вирусом А/СаПГопиа/07/2009 (Η1Ν1), адаптированного мышам в дозе 15 ЬП₅₀/0,03, все животные оставались живыми и не проявляли признаков какой-либо болезни в течение 14-дневного срока наблюдения.

Предлагаемый способ отличается от аналогов, в том числе от прототипа тем, что в технологии изготовления вакцины применяются оптимальные режимы формалиновой инактивации вируса, составления вакцины, комбинированная схема очистки и концентрирования вируса посредством хроматографических и фильтрационных методов.

Изобретение выполнимо в условиях научно-производственных объединений при наличии рекомбинантного штамма ΝΙΒΚΟ-121χρ вируса гриппа, соответствующего технологического оборудования и соблюдения предлагаемого режима приготовления вакцины.

Эффективность и воспроизводимость предлагаемого способа получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа Α/Η1Ν1 из рекомбинантного штамма ΝΙΒΚΟ-121χρ вируса гриппа подтверждена при приготовлении трех производственноэкспериментальных серий этого препарата в НИИПББ НЦБ КН МОН РК, в последующем прошедших с положительными результатами доклинические испытания специфической активности и безопасности в РГП Национальный центр экспертизы лекарственных средств, г. Алматы, Республика Казахстан, и Научно-исследовательском институте гриппа СЗО РАМН РФ, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация.

Claims (1)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   Способ получения инактивированной цельновирионной вакцины против вируса гриппа Α/Η1Ν1 с гидроокисью алюминия, включающий культивирование рекомбинантного штамма ΝΙΒΚΟ-121χρ вируса гриппа в 10-11-суточных куриных эмбрионах, химическую инактивацию, комбинированную схему очистки и концентрирования, стерилизующую фильтрацию вируса, добавление гидроокиси алюминия, отличающийся тем, что до этапа очистки осветленную аллантоисную суспензию вакцинного вируса инактивируют формалином в конечной концентрации 0,05% сначала при температуре от 2 до 6°С в течение 60 ч, затем при температуре от 36 до 38°С в течение 12 ч, после чего полученную суспензию очищают на мембранных фильтрах и концентрируют с помощью ультра/диафильтрации в тангенциальном потоке против 10 объемов буфера, включающего 1,0 М натрий хлористый; 0,01 М ФБР рН 7,4; 0,001 М ЭДТА и 6 объемов буфера, включающего 0,15 М натрий хлористый; 0,01 М ФБР рН 7,4; 0,001 М ЭДТА, а также гель-фильтрации на колонках с сефарозой.