CN102614508B - 一种人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解灭活方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解灭活方法，属于生物制药领域，将梯密度离心纯化后的H1N1型、H3N2型或B型单价流感全病毒采取先纯化裂解，然后再灭活的方法，可提高病毒裂解效果，缩短灭活时间，提高灭活效率，明显降低灭活剂的用量，简化灭活操作步骤，降低染菌风险，减少灭活所需厂房、设施和能耗，增加灭活的均一性和稳定性。

Description

一种人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解灭活方法
技术领域
本发明属于生物制药领域，尤其是指一种人用流感病毒裂解疫苗生产中流感病毒单价原液的裂解灭活方法。
背景技术
流行性感冒(简称流感)是由流行性感冒病毒(Influenza virus)引起的急性呼吸道传染病,它的特点是爆发突然、传染性强，能引起较高的发病率，并可迅速传播造成大面积流行，历史上已经记载了4次世界性大流行，而近几年禽流感（Avian influenza）的不断爆发，2009年甲型H1N1 新型流感的爆发，进一步加大了各国卫生防疫的压力，引起人们的恐慌。流感是第一个实现全球性监测的传染病，但对其治疗却无特效药物，疫苗接种是预防流感流行的有效措施。流感病毒是有包膜病毒，病毒颗粒内部为核衣壳，由核蛋白、聚合酶和病毒的基因组RNA组成；包膜由双层类脂膜、糖蛋白突起和基质蛋白组成。流感病毒包膜由来自宿主细胞的双层类脂膜和流感病毒糖蛋白突起组成，流感病毒糖蛋白突起主要包括血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）。HA的抗体能抑制血凝素并能中和病毒，是最主要的保护性抗体。NA的抗体虽不能中和病毒，但能抑制病毒的繁殖，减轻症状。目前市场上流感疫苗主要有裂解灭活苗、亚单位疫苗等，其中裂解疫苗免疫效果较好，副作用较小，应用最广。
 目前国内外流感病毒的灭活从灭活剂使用上大体可分为以下几种：
一、β-丙内酯灭活：多为国外流感厂家所使用；
二、乙醚灭活：国内2家流感疫苗生产企业及日本某些流感疫苗生产企业所使用；
三、甲醛灭活：国内大多数流感疫苗企业及巴斯德所使用，是最早被使用的灭活剂；
而单就以甲醛为灭活剂的灭活方法，其灭活方式又可分为：
一、前灭活：是将流感病毒接种鸡胚，收获尿囊液后即加入甲醛灭活，该灭活方式为最传统也是国内使用最广的灭活方式。
二、浓缩液阶段灭活:是先将流感病毒超滤浓缩后，再加入甲醛灭活。
目前，传统前灭活工艺中存在如下问题：加入甲醛后，易产生病毒聚团现象，病毒裂解的均匀度不高，病毒裂解效果不佳；灭活时间长，灭活效率低；甲醛的使用量大；灭活操作步骤多，染菌风险高；所需厂房、人力和能耗较大；灭活的均一性和稳定性差。
发明内容
本发明提供一种人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解灭活方法，以解决目前传统前灭活工艺中存在的病毒裂解效果差、灭活时间长、灭活效率低、灭活剂的用量大、灭活操作步骤多，染菌风险增加、灭活所需厂房、设施和能耗增加、灭活的均一性和稳定性差的问题。
本发明采取的技术方案是： 
（一）、将梯密度离心纯化后的H1N1型、H3N2型或B型单价流感全病毒置于密闭容器中、其蛋白含量控制在2.0-3.0 mg/ml，加入作用浓度为0.7%-0.9%浓度的裂解剂Triton X-100或作用浓度范围为0.7-1.2%的Triton N-101；置20℃-25℃，振荡裂解；
（二）、采用震荡装置进行震荡，震荡时间为采用Triton X-100 震荡1.5-2.5h,或采用Triton N-101震荡4-5h，超滤去除裂解剂；
（三）、病毒灭活：灭活采用pH值7.2、用磷酸盐缓冲液PBS终浓度为0.1 M/L、EDTA终浓度为0.5mM/L的调配流感病毒灭活溶液,裂解后病毒液的蛋白浓度0.5-1.0mg/ml，加入终浓度为200ug/ml的甲醛，2-8℃震荡灭活，灭活时长：4-5天。
本发明所述的流感病毒灭活溶液是通过下列方法得到的：
（1）2M/L 磷酸盐缓冲液PBS的配制：
称取1600g NaCl、40g KCl、288g Na2HPO4和48g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.2，最后加蒸馏水定容至1L即可；
在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌40分钟，保存于室温或4℃冰箱中；
（2）100mM/L EDTA溶液的配制：
称取37.224gEDTA溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.2，最后加蒸馏水定容至1L即可；
在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌40分钟，保存于室温或4℃冰箱中；
 （3）流感病毒灭活溶液的调配：
流感病毒灭活前，将2M/L 磷酸盐缓冲液（PBS）20倍稀释，100mM/L EDTA溶液200倍稀释后混合，最终配成pH值7.2，PBS终浓度为0.1 M/L、EDTA终浓度为0.5mM/L的流感病毒灭活溶液。
本发明一种实施方式还包括：裂解后纯化步骤：
采用柱色谱法进行病毒裂解后的再纯化， 色谱介质为Sepherose 4FF，每次上样量不超过柱体积的5%，以磷酸盐缓冲液PBS0.01 mol/L，pH7.2为洗脱液，流速为 300ml/分钟，在监测波长为280nm的条件下，收集全部第一蛋白峰。
本发明选用符合疫苗生产的海兰白种蛋孵化的9-11日龄鸡胚，使用流感病毒工作种子，进行病毒的规模化扩增，收获病毒液。
在本发明中，我公司研究用毒种为WHO推荐北半球季节性人用流感疫苗生产用毒株，来自英国NIBSC。
毒种传代和制备用鸡胚，来自无外源性禽白血病病毒、无外源性禽腺病毒I型和III型的SPF鸡群，并选用9-11日龄无畸形、血管清晰、活动的健康鸡胚。
本发明的目标是开发一种新的季节性人用流感疫苗的生产工艺，本工艺中其主要特征及创新点在于开发了一种流感单价原液先裂解后灭活的工艺流程，该流程可：1、减少传统前灭活工艺加入甲醛后所导致的病毒聚团现象，提高病毒裂解的均匀度，提高病毒裂解效果；2、缩短灭活时间，提高灭活效率；3、减少甲醛的使用量；4、简化灭活操作步骤，降低染菌风险；5、减少所需厂房、人力和能耗；6、增加灭活的均一性和稳定性。
该发明是利用WHO推荐的三型流感病毒毒株，建立主代种子及工作代种子库，在鸡胚上进行流感病毒培养，收获尿囊液，通过纯化、裂解、灭活等一系列工艺过程，分别获得三型流感病毒单价原液，再将三型单价原液稀释合并、除菌过滤制成疫苗。
本发明的优点是：一方面解决了加甲醛灭活之后裂解所导致的流感病毒聚合的问题，使流感病毒裂解得更加均匀和彻底，提高了疫苗的裂解效果；另一方面解决了前灭活工艺中尿囊液容易染菌、灭活剂添加不均匀、大量尿囊液存放需要大面积4℃冷库的问题。因此，将传统前灭活方式改为先纯化裂解，然后再灭活的方法，可提高病毒裂解效果，缩短灭活时间，提高灭活效率，明显降低灭活剂的用量，简化灭活操作步骤，降低染菌风险，减少灭活所需厂房、设施和能耗，增加灭活的均一性和稳定性。
附图说明
图1 流感病毒电镜照片（全病毒 放大4万倍）；
图2 灭活后流感病毒采用裂解剂Triton N-101裂解后电镜照片（放大4万倍）；
图3 未经灭活流感病毒采用裂解剂Triton N-101裂解后电镜照片（放大4万倍）；
图4 未经灭活流感病毒采用裂解剂Triton X-100裂解后电镜照片（放大4万倍）。
具体实施方式
本发明所述的流感病毒灭活溶液是通过下列方法得到的：
（1）2M/L 磷酸盐缓冲液PBS的配制：
称取1600g NaCl、40g KCl、288g Na2HPO4和48g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.2，最后加蒸馏水定容至1L即可；
在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌40分钟，保存于室温或4℃冰箱中；
（2）100mM/L EDTA溶液的配制：
称取37.224gEDTA溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.2，最后加蒸馏水定容至1L即可；
在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌40分钟，保存于室温或4℃冰箱中；
 （3）流感病毒灭活溶液的调配：
流感病毒灭活前，将2M/L 磷酸盐缓冲液（PBS）20倍稀释，100mM/L EDTA溶液200倍稀释后混合，最终配成pH值7.2，PBS终浓度为0.1 M/L、EDTA终浓度为0.5mM/L的流感病毒灭活溶液。
实施例1  H1N1型流感病毒单价原液的生产
1）生产用鸡胚 
毒种传代和制备用鸡胚应来源于SPF鸡群；疫苗生产用鸡胚应来源于封闭式房舍内饲养的健康鸡群，并选用9～11日龄无畸形、血管清晰、活动的鸡胚。
2）病毒接种和培育
用PBS（0.01 mol/L，pH7.2）稀释工作种子批毒种，H1N1型毒种稀释至4.0LgEID50/ml。接种鸡胚尿囊腔，每胚接种0.2ml。33-35℃培养44-48小时。工作种子批毒种融化后若一次未使用完，不得再冻结继续使用。
3） 病毒收获
筛选活鸡胚，置2～8℃冷胚12-18小时后，收获尿囊液于容器内，逐容器取样进行尿囊收获液检定。
4）浓缩及纯化
将单价病毒收获液进行连续流离心（转速为10000转/分钟、流速为1000ml/分钟）初步澄清后，上清用截留分子量300kD的膜包进行超滤浓缩，采用蔗糖密度区带离心法进行纯化，采用的蔗糖浓度为A液30%±2%和C液55%±2%，进样转数为2000-3000r/分钟，进样时泵流速为100ml/分钟，离心条件为30000r/min,离心时间3小时，在紫外监测波长为280nm的条件下，收集糖度范围30%-50%的病毒峰，梯度样用PBS以截留分子量300kD膜包超滤透析除糖。
5）病毒裂解
将除糖后的病毒液，蛋白含量在2.0 mg/ml，加入Triton X-100 使其终浓度为0.7% ，置20℃，振荡裂解1.5小时。
6）裂解后纯化
采用柱色谱法进行病毒裂解后的再纯化， 色谱介质为Sepherose 4FF。每次上样量不超过柱体积的5%，以PBS（0.01 mol/L，pH7.2）液为洗脱液，流速为 300ml/分钟左右，在监测波长为280nm的条件下，收集全部第一蛋白峰。
7）病毒灭活
将裂解纯化后的病毒液（蛋白浓度控制在0.5mg/ml）加入流感病毒灭活溶液，使其溶液所含的PBS终浓度为0.1 M/L、EDTA终浓度为0.5mM/L、pH值为7.2，然后加入甲醛，使其终浓度为200μg/ml，置2-8℃灭活5天，病毒灭活到期后每个病毒灭活容器应立即取样分别进行病毒灭活验证试验和细菌内毒素含量检测，细菌内毒素含量应小于10EU/ml。
灭活后的病毒液用0.01 M/L PBS做为缓冲液，以截留分子量为50KD的膜包，超滤透析除甲醛，即为病毒灭活液。
8）除菌过滤
    病毒灭活液经除菌过滤后，即为单价原液。
另外，对步骤5）和7）也可采取下面的方法：
5）病毒裂解
将除糖后的病毒液，蛋白含量在2.5 mg/ml，加入Triton X-100 使其终浓度为0.8% ，置23℃，振荡裂解2小时；
7）病毒灭活
将裂解纯化后的病毒液（蛋白浓度控制在0.75mg/ml）加入流感病毒灭活溶液，使其溶液所含的PBS终浓度为0.1 M/L、EDTA终浓度为0.5mM/L、pH值为7.2，然后加入甲醛，使其终浓度为200μg/ml，置2-8℃灭活5天，病毒灭活到期后每个病毒灭活容器应立即取样分别进行病毒灭活验证试验和细菌内毒素含量检测，细菌内毒素含量应小于10EU/ml。
另外，对步骤5）和7）也可采取下面的方法：
5）病毒裂解
将除糖后的病毒液，蛋白含量在3.0 mg/ml，加入Triton X-100 使其终浓度为0.9% ，置25℃，振荡裂解2.5小时；
7）病毒灭活
将裂解纯化后的病毒液（蛋白浓度控制在1.0mg/ml）加入适宜的流感病毒灭活溶液，使其溶液所含的PBS终浓度为0.1 M/L、EDTA终浓度为0.5mM/L、pH值为7.2，然后加入甲醛，使其终浓度为200μg/ml，置2-8℃灭活5天，病毒灭活到期后每个病毒灭活容器应立即取样分别进行病毒灭活验证试验和细菌内毒素含量检测，细菌内毒素含量应小于10EU/ml。
另外，对步骤5）也可采取下面的方法：
5）病毒裂解
将除糖后的病毒液，蛋白含量在2.0 mg/ml，加入Triton N-101 使其终浓度为0.7% ，置20℃，振荡裂解4小时；
或：
5）病毒裂解
将除糖后的病毒液，蛋白含量在2.5mg/ml，加入Triton N-101 使其终浓度为0.95% ，置23℃，振荡裂解4.5小时；
或：
5）病毒裂解
将除糖后的病毒液，蛋白含量在3.0 mg/ml，加入Triton N-101 使其终浓度为1.2% ，置25℃，振荡裂解5小时；
实施例2 H3N2 型流感病毒单价原液的生产
1）生产用鸡胚            
毒种传代和制备用鸡胚应来源于SPF鸡群；疫苗生产用鸡胚应来源于封闭式房舍内饲养的健康鸡群，并选用9～11日龄无畸形、血管清晰、活动的鸡胚。
2）病毒接种和培育
用PBS（0.01 mol/L，pH7.2）稀释工作种子批毒种，H3N2型毒种稀释至4.0LgEID50/ml，接种鸡胚尿囊腔，每胚接种0.2ml，33-35℃培养44-48小时，工作种子批毒种融化后若一次未使用完，不得再冻结继续使用。
3） 病毒收获
筛选活鸡胚，置2～8℃冷胚12-18小时后，收获尿囊液于容器内，逐容器取样进行尿囊收获液检定。
4）浓缩及纯化
将单价病毒收获液进行连续流离心（转速为10000转/分钟、流速为1000ml/分钟）初步澄清后，上清用截留分子量300kD的膜包进行超滤浓缩，采用蔗糖密度区带离心法进行纯化， 采用的蔗糖浓度为A液30%±2%和C液55%±2%，进样转数为2000-3000r/分钟，进样时泵流速为100ml/分钟，离心条件为30000r/min,离心时间3小时，在紫外监测波长为280nm的条件下，收集糖度范围30%-50%的病毒峰，梯度样用PBS以截留分子量300kD膜包超滤透析除糖。
5）病毒裂解
将除糖后的病毒液（蛋白含量控制在2.0mg/ml），加入Triton X-100 使其终浓度为0.7% ，置20℃，振荡裂解1.5小时,用PBS以截留分子量50kD膜包超滤透析除裂解剂；
6）裂解后纯化
采用柱色谱法进行病毒裂解后的再纯化， 色谱介质为Sepherose 4FF。每次上样量不超过柱体积的5%，以PBS（0.01 mol/L，pH7.2）液为洗脱液，流速为 300ml/分钟左右，在监测波长为280nm的条件下，收集全部第一蛋白峰。
7）病毒灭活
将裂解纯化后的病毒液（蛋白浓度控制在0.5mg/ml）加入适宜的流感病毒灭活溶液，使其溶液所含的PBS终浓度为0.1 M/L、EDTA终浓度为0.5mM/L、pH值为7.2，然后加入甲醛，使其终浓度为200μg/ml，置2-8℃灭活5天，病毒灭活到期后每个病毒灭活容器应立即取样分别进行病毒灭活验证试验和细菌内毒素含量检测，细菌内毒素含量应小于10EU/ml。
灭活后的病毒液用0.01 M/L PBS做为缓冲液，以截留分子量为50KD的膜包，超滤透析除甲醛，即为病毒灭活液。
8）除菌过滤
    病毒灭活液经除菌过滤后，即为单价原液。
另外，对步骤5）和7）也可采取下面的方法：
5）病毒裂解
将除糖后的病毒液，蛋白含量在2.5 mg/ml，加入Triton X-100 使其终浓度为0.8% ，置23℃，振荡裂解2小时；
7）病毒灭活
将裂解纯化后的病毒液（蛋白浓度控制在0.75mg/ml）加入适宜的流感病毒灭活溶液，使其溶液所含的PBS终浓度为0.1 M/L、EDTA终浓度为0.5mM/L、pH值为7.2，然后加入甲醛，使其终浓度为200μg/ml，置2-8℃灭活5天，病毒灭活到期后每个病毒灭活容器应立即取样分别进行病毒灭活验证试验和细菌内毒素含量检测，细菌内毒素含量应小于10EU/ml。
另外，对步骤5）和7）也可采取下面的方法：
5）病毒裂解
将除糖后的病毒液，蛋白含量在3.0 mg/ml，加入Triton X-100 使其终浓度为0.9% ，置25℃，振荡裂解2.5小时；
7）病毒灭活
将裂解纯化后的病毒液（蛋白浓度控制在1.0mg/ml）加入适宜的流感病毒灭活溶液，使其溶液所含的PBS终浓度为0.1 M/L、EDTA终浓度为0.5mM/L、pH值为7.2，然后加入甲醛，使其终浓度为200μg/ml，置2-8℃灭活5天，病毒灭活到期后每个病毒灭活容器应立即取样分别进行病毒灭活验证试验和细菌内毒素含量检测，细菌内毒素含量应小于10EU/ml。
另外，对步骤5）也可采取下面的方法：
5）病毒裂解
将除糖后的病毒液，蛋白含量在2.0 mg/ml，加入Triton N-101 使其终浓度为0.7% ，置20℃，振荡裂解4小时；
或：
5）病毒裂解
将除糖后的病毒液，蛋白含量在2.5mg/ml，加入Triton N-101 使其终浓度为0.95% ，置23℃，振荡裂解4.5小时；
或：
5）病毒裂解
将除糖后的病毒液，蛋白含量在3.0 mg/ml，加入Triton N-101 使其终浓度为1.2% ，置25℃，振荡裂解5小时；
实施例3  B型流感病毒单价原液的生产
1）生产用鸡胚            
毒种传代和制备用鸡胚应来源于SPF鸡群；疫苗生产用鸡胚应来源于封闭式房舍内饲养的健康鸡群，并选用9～11日龄无畸形、血管清晰、活动的鸡胚。
2）病毒接种和培育
用PBS（0.01 mol/L，pH7.2）稀释工作种子批毒种，B型毒种稀释至病毒量为和3.0 LgEID50/ml，接种鸡胚尿囊腔，每胚接种0.2ml，置33-35℃培养66-72小时，工作种子批毒种融化后若一次未使用完，不得再冻结继续使用。
3） 病毒收获
筛选活鸡胚，置2～8℃冷胚12-18小时后，收获尿囊液于容器内，逐容器取样进行尿囊收获液检定。
4）浓缩及纯化
将单价病毒收获液进行连续流离心（转速为10000转/分钟、流速为1000ml/分钟）初步澄清后，上清用截留分子量300kD的膜包进行超滤浓缩，采用蔗糖密度区带离心法进行纯化，采用的蔗糖浓度为A液30%±2%和C液55%±2%，进样转数为2000-3000r/分钟，进样时泵流速为100ml/分钟，离心条件为30000r/min,离心时间3小时，在紫外监测波长为280nm的条件下，收集糖度范围30%-50%的病毒峰，梯度样用PBS以截留分子量300kD膜包超滤透析除糖。
5）病毒裂解
将除糖后的病毒液，蛋白含量在2.0 mg/ml，加入Triton X-100 使其终浓度为0.7% ，置20℃，振荡裂解1.5小时。
6）裂解后纯化
采用柱色谱法进行病毒裂解后的再纯化， 色谱介质为Sepherose 4FF。每次上样量不超过柱体积的5%，以PBS（0.01 mol/L，pH7.2）液为洗脱液，流速为 300ml/分钟左右，在监测波长为280nm的条件下，收集全部第一蛋白峰。
7）病毒灭活
将裂解纯化后的病毒液（蛋白浓度控制在0.5mg/ml）加入适宜的流感病毒灭活溶液，使其溶液所含的PBS终浓度为0.1 M/L、EDTA终浓度为0.5mM/L、pH值为7.2，然后加入甲醛，使其终浓度为200μg/ml，置2-8℃灭活5天，病毒灭活到期后每个病毒灭活容器应立即取样分别进行病毒灭活验证试验和细菌内毒素含量检测，细菌内毒素含量应小于10EU/ml。
灭活后的病毒液用0.01 M/L PBS做为缓冲液，以截留分子量为50KD的膜包，超滤透析除甲醛，即为病毒灭活液。
8）除菌过滤
    病毒灭活液经除菌过滤后，即为单价原液。
另外，对步骤5）和7）也可采取下面的方法：
5）病毒裂解
将除糖后的病毒液，蛋白含量在2.5 mg/ml，加入Triton X-100 使其终浓度为0.8% ，置23℃，振荡裂解2小时；
7）病毒灭活
将裂解纯化后的病毒液（蛋白浓度控制在0.75mg/ml）加入适宜的流感病毒灭活溶液，使其溶液所含的PBS终浓度为0.1 M/L、EDTA终浓度为0.5mM/L、pH值为7.2，然后加入甲醛，使其终浓度为200μg/ml，置2-8℃灭活5天，病毒灭活到期后每个病毒灭活容器应立即取样分别进行病毒灭活验证试验和细菌内毒素含量检测，细菌内毒素含量应小于10EU/ml。
另外，对步骤5）和7）也可采取下面的方法：
5）病毒裂解
将除糖后的病毒液，蛋白含量在3.0 mg/ml，加入Triton X-100 使其终浓度为0.9% ，置25℃，振荡裂解2.5小时；
7）病毒灭活
将裂解纯化后的病毒液（蛋白浓度控制在1.0mg/ml）加入适宜的流感病毒灭活溶液，使其溶液所含的PBS终浓度为0.1 M/L、EDTA终浓度为0.5mM/L、pH值为7.2，然后加入甲醛，使其终浓度为200μg/ml，置2-8℃灭活5天，病毒灭活到期后每个病毒灭活容器应立即取样分别进行病毒灭活验证试验和细菌内毒素含量检测，细菌内毒素含量应小于10EU/ml。
另外，对步骤5）也可采取下面的方法：
5）病毒裂解
将除糖后的病毒液，蛋白含量在2.0 mg/ml，加入Triton N-101 使其终浓度为0.7% ，置20℃，振荡裂解4小时；
或：
5）病毒裂解
将除糖后的病毒液，蛋白含量在2.5mg/ml，加入Triton N-101 使其终浓度为0.95% ，置23℃，振荡裂解4.5小时；
或：
5）病毒裂解
将除糖后的病毒液，蛋白含量在3.0 mg/ml，加入Triton N-101 使其终浓度为1.2% ，置25℃，振荡裂解5小时；
本发明与现有技术比较的有益效果如下（以日投产80000鸡胚为例）
Figure 616299DEST_PATH_IMAGE001
实验例1:
1.材料和设备:
1)Triton X-100
2)2%甲醛
3)纯化后流感病毒液:
Figure 972587DEST_PATH_IMAGE002
4)特大恒温双层摇床:型号: HZQ-Y，厂家: 哈尔滨东联
2.方法
首先将纯化后的流感病毒液稀释至蛋白浓度为2500ug/ml左右，按终浓度0.8%加入裂解剂Triton X-100，控制温度为22℃左右，震荡裂解2h，进行裂解。裂解后纯化，采用柱色谱法进行， 色谱介质为Sepherose 4FF。每次上样量不超过柱体积的5%，以PBS（0.01 mol/L，pH7.2）液为洗脱液，流速为 300ml/分钟左右，在监测波长为280nm的条件下，收集全部第一蛋白峰。然后进行病毒灭活，将裂解纯化后的病毒液（蛋白浓度控制在0.7mg/ml）加入适宜的流感病毒灭活溶液，使其溶液所含的PBS终浓度为0.1 M/L、EDTA终浓度为0.5mM/L、pH值为7.2，加入甲醛，使其终浓度为200μg/ml，置2-8℃灭活5天，每天抽样做灭活验证试验并检测总蛋白及血凝素含量,计算总蛋白含量/血凝素含量以反映样品纯度变化,计算血凝素回收率以反映灭活的抗原损失(血凝素回收率是指对病毒液按工艺流程进行单步操作,操作后样品的总血凝素/操作前样品的总血凝素,比如病毒裂解液对应的血凝素回收率即是指：病毒裂解液总血凝素/纯化后病毒液总血凝素,而灭活液血凝素回收率即是指：灭活液总血凝素/病毒裂解液总血凝素)。
3.结果
Figure DEST_PATH_IMAGE003
实验例2:
1.材料和设备:
1)Triton N-101
2)2%甲醛
3)纯化后流感病毒液:
Figure DEST_PATH_IMAGE004
4)特大恒温双层摇床，型号: HZQ-Y，厂家: 哈尔滨东联
2.方法
首先将纯化后的流感病毒液稀释至蛋白浓度为2500ug/ml左右，按终浓度0.95%加入裂解剂Triton N-101，控制温度为22℃左右，震荡裂解4.5h，进行裂解。
裂解后纯化，采用柱色谱法进行， 色谱介质为Sepherose 4FF。每次上样量不超过柱体积的5%，以PBS（0.01 mol/L，pH7.2）液为洗脱液，流速为 300ml/分钟左右，在监测波长为280nm的条件下，收集全部第一蛋白峰。然后进行病毒灭活，将裂解纯化后的病毒液（蛋白浓度控制在0.7mg/ml）加入适宜的流感病毒灭活溶液，使其溶液所含的PBS终浓度为0.1 M/L、EDTA终浓度为0.5mM/L、pH值为7.2，加入甲醛，使其终浓度为200μg/ml，置2-8℃灭活5天，每天抽样做灭活验证试验并检测总蛋白及血凝素含量,计算总蛋白含量/血凝素含量以反映样品纯度变化,计算血凝素回收率以反映灭活的抗原损失(血凝素回收率是指对病毒液按工艺流程进行单步操作后,操作后样品的总血凝素/操作前样品的总血凝素,比如病毒裂解液对应的血凝素回收率即是指：病毒裂解液总血凝素/纯化后病毒液总血凝素,而灭活液血凝素回收率即是指：灭活液总血凝素/病毒裂解液总血凝素)。
3.结果
Figure DEST_PATH_IMAGE005

Claims (3)

1.一种人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解灭活方法，其特征在于包括下列步骤：
（一）、将梯密度离心纯化后的H1N1型、H3N2型或B型单价流感全病毒置于密闭容器中、其蛋白含量控制在2.0-3.0mg/ml，加入作用浓度为0.7%-0.9%浓度的裂解剂Triton X-100或作用浓度范围为0.7-1.2%的Triton N-101；置20℃-25℃，振荡裂解；
（二）、采用震荡装置进行震荡，震荡时间为采用Triton X-100 震荡1.5-2.5h,或采用Triton N-101震荡4-5h，超滤去除裂解剂；
（三）、病毒灭活：灭活采用pH值7.2、用磷酸盐缓冲液PBS终浓度为0.1mol/L、EDTA终浓度为0.5mmol/L的调配流感病毒灭活溶液,裂解后病毒液的蛋白浓度0.5-1.0mg/ml，加入终浓度为200μg/ml的甲醛，2-8℃震荡灭活，灭活时长：4-5天。
2.根据权利要求1所述的一种人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解灭活方法，其特征在于所述的流感病毒灭活溶液是通过下列方法得到的：
（1）2mol/L 磷酸盐缓冲液PBS的配制：
称取1600g NaCl、40g KCl、288g Na2HPO4和48g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.2，最后加蒸馏水定容至1L；
在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌40分钟，保存于室温或4℃冰箱中；
（2）100mmol/L EDTA溶液的配制：
称取37.224gEDTA溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.2，最后加蒸馏水定容至1L；
在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌40分钟，保存于室温或4℃冰箱中；
（3）流感病毒灭活溶液的调配：
分别将2mol/L 磷酸盐缓冲液PBS20倍稀释，100mmol/L EDTA溶液200倍稀释后混合，最终配成pH值7.2，PBS终浓度为0.1mol/L、EDTA终浓度为0.5mmol/L的流感病毒灭活溶液。
3.根据权利要求1所述的一种人用流感病毒裂解疫苗的病毒裂解灭活方法，其特征在于还包括：裂解后纯化步骤：
采用柱色谱法进行病毒裂解后的再纯化， 色谱介质为Sepherose 4FF，每次上样量不超过柱体积的5%，以磷酸盐缓冲液PBS0.01mol/L，pH7.2为洗脱液，流速为 300ml/分钟，在监测波长为280nm的条件下，收集全部第一蛋白峰。
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