CN102406931A - 大流行流感病毒裂解疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大流行流感病毒裂解疫苗及其制备方法，所述方法采用WHO推荐的NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5N1))株毒种，经接种鸡胚(产量高、操作容易)、培养、收获病毒液、灭活病毒、蔗糖密度区带离心纯化、Triton X-100裂解、再纯化和氢氧化铝吸附、分装等工艺制备得到大流行流感病毒裂解疫苗。本发明在大流行流感疫苗(全病毒)的基础，通过采用二乙烯亚胺和辅料甲醛组合更彻底地灭活病毒，同时采用裂解剂裂解和新的纯化方法，去除副反应源——病毒内脂膜，最终能够以较高的浓缩效率和回收率制备得到杂质含量更少，HA含量更高的保持较高免疫原性的大流行流感病毒裂解疫苗，所述疫苗不含硫柳汞，接种更安全；接种人群更广泛，而且灭活疫苗更加安全、可靠。

Description

大流行流感病毒裂解疫苗

技术领域：

本发明属于生物医学技术领域，本发明涉及利用WHO推荐的NIBRG-14株毒株，在大流行流感全病毒疫苗的基础上，增加裂解工艺，制备成大流行流感病毒裂解疫苗，用于预防大流行流感。

背景技术：

人禽流行性感冒(Human-avian Influenza)简称人禽流感或大流行流感(PandemicInfluenza)，是指A型禽流感病毒由于种种原因突破种属屏障而感染人，引起的一种急性高度致死性禽类传染病，其感染人类的事件最先发生于中国香港。1997年5月9日，香港一名3岁男童体内分离出一株A型流感病毒，同年8月确诊为全球首例由A型禽流感病毒(H5N1)引起的人间病例。根据2005年WHO对流感大流行预警期的划分，当前全球正处在预警期的第三阶段，即以散发病例和有限的人传人疫情为特征。据世界卫生组织(WHO)报道，截止2008年4月3日，14个国家报告378例A型禽流感(H5N1)确诊病人，其中238人死亡，病死率为62.96％。

H5N1型禽流感病毒带来了全球性的威胁。H5N1亚型流感病毒具有H5亚型血凝素和Nl亚型神经氨酸酶，它能在人体内复制并引起严重的疾病。H5N1亚型病毒对现有的每一个人的免疫系统来说都是新的抗原，因此人类具有普遍的易感性，被认为是最有可能引起下一次流感大流行的病毒。

最大的担忧是，H5N1禽流感病毒继续进化成不同的抗基因突变体，感染除人之外的哺乳动物宿主，其传染范围扩大，从家禽至迁移鸟类，而通过鸟类传播，30多个国家暴发了禽流感疫情。

疫苗作为控制流感大流行的一种主要手段，受到各个国家的重视。安全有效的疫苗很可能是减小大流行疾病、维护公众健康的唯一手段。因此，发展H5N1疫苗被认为是主要的策略。

目前在研制的大流行流感疫苗包括全病毒灭活疫苗和裂解疫苗。美国巴斯德公司、法国巴斯德公司、澳大利亚CSL公司、匈牙利Onminvest公司和中国北京科兴公司等5家机构研究出产品，获得生产大流行流感疫苗的能力。

美国巴斯德公司采用美国CDC制备的重配株进行的H5N1裂解无佐剂疫苗的研究结果。他们于2005年4月至10月在451人中进行了临床试验，测试了90，45，15，7.5微克四个不同剂量的疫苗效果。结果显示，两针90微克的疫苗产生了最高的免疫反应，抗体阳性率为58％。后续试验将给部分I期的受试者加强1针，观察免疫持久性结果。

随后，法国巴斯德公司的H5N1裂解铝佐剂疫苗的临床试验结果，该试验于2005年5-7月在法国进行，疫苗株使用的是由世界卫生组织英国中心实验室NIBSC提供的NIBRG-14毒株。300名受试者分别接种30，15，7.5微克有铝或无铝佐剂裂解疫苗。其中两针30微克铝佐剂疫苗产生的抗体阳性率最高，为67％。

澳大利亚CSL公司也于2005年10月进行了H5N1裂解铝佐剂疫苗临床试验，共400名受试者参加。结果两针15微克铝佐剂疫苗的抗体阳性率为67％，并随后将继续在更大规模的人群中进行试验，也包括老年人和儿童。

在我国北京科兴与中国疾病预防控制中心共同研发的H5N1全病毒铝佐剂疫苗的临床试验于2006年6月初揭盲。疫苗在全部的受试者中表现出良好的安全性和免疫原性，仅两针10微克的全病毒疫苗就产生了78％的抗体阳性率。

巴斯德公司的大流行流感裂解疫苗在2007起为美国政府采购储备，作为高危人群使用，匈牙利已在2008年大流行流感疫苗上市；我国北京科兴在2008年奥运会生产大流行流感灭活疫苗国家政府采购储备。

大流行流感病毒裂解疫苗的优点是：①制备工艺成熟，免疫原性较高，培养的病毒含量达到滴度要求即可进行大量生产；②由于不存在活病毒颗粒，没有感染问题，安全性好；③保存方便，一般无需冻干保存；④适用人群较广，尤其适用于不能运用全病毒疫苗的人群，如12岁以下的儿童和老年人。

发明内容：

本发明的目的之一是提供一种副反应更小，免疫原性更高，接种更安全，接种人群更广泛的新疫苗。

本发明的另一目的是提供一种能高效低成本大量制备大流行流感裂解疫苗的制备方法。

本发明的大流行流感裂解疫苗包括大流行流感免疫抗原及疫苗佐剂，其中所述的大流行流感免疫抗原为WHO推荐的NIBRG-14株毒种的血凝素HA，其内毒素含量为低于70EU/ml，HA含量为40ug/ml，所述的疫苗佐剂为氢氧化铝。

为实现本发明的第二个目的，本发明的技术方案是采用WHO推荐的NIBRG-14株毒种，在大流行流感疫苗(全病毒)的基础，通过裂解剂裂解，去除副反应源——病毒内脂膜，减少副反应，保持较高免疫原性，接种更安全，接种人群更广泛。本发明制品不含硫柳汞，以减少汞积累造成危害性，在生产、疫苗接种过程更安全。

本发明的大流行流感裂解疫苗的制备方法，包括NIBRG-14病毒的接种培养、灭活病毒、病毒液澄清和浓缩、层析纯化病毒、Triton X-100裂解病毒、超滤膜二次纯化、除菌过滤、氢氧化铝吸附、分装冻干制成疫苗成品的步骤，其中采用毒性弱且可自行分解的烷化剂二乙烯亚胺和辅料甲醛组合形成灭活剂对病毒进行灭活，二乙烯亚胺和辅料甲醛终浓度为1比4000，在20-25℃作用6小时灭活病毒。NIBRG-14病毒的接种培养按照如下步骤进行，将大流行流感疫苗株工作种子批毒种用灭菌生理盐水稀释为10-5稀释度，尿囊腔接种10日龄健康SPF鸡胚，病毒接种量为0.2ml/枚，将接种病毒的鸡胚放在37.5℃，相对湿度60％下培养，于接种病毒后56小时取鸡胚放置于4℃冷胚18小时后，收获病毒尿囊液。病毒液澄清和浓缩包括滤网过滤、滤膜过滤，超滤和衡滤浓缩，具体步骤是将各批单型别的病毒原液分别用盖有120目滤网合并过滤，添加柠檬酸钠和EDTA去除尿囊液中的卵黄蛋白等杂质并取样检测pH值达到7.8后再添加0.5mol/L的磷酸盐溶液PB，取样检测使pH值达7.2±0.2，将无菌试验和灭活试验合格的尿囊液进行澄清过滤，即经10um滤膜粗滤后，再经两次0.45um滤膜过滤，最后用相对分子质量1000KD的膜进行超滤浓缩，0.01M pH 7.2的PBS进行8倍体积的衡滤作最后浓缩，浓缩液中再加入0.25mol/L的PB回收病毒液。病毒纯化采用分子筛凝胶层析系统。具体使用的分子筛凝胶层析系统为Amersham的BPG200.750；凝胶为Sepharose 4FF，凝胶过滤介质是4％琼脂糖的高度交联体，层析柱凝胶装量为14L，使用的平衡盐溶液为0.01MpH 7.2的PBS，流速为150ml/min，样品上样量为700ml。Triton X-100裂解是用0.01M pH7.2的PBS将裂解剂Triton X-100稀释至浓度为0.5％，与大流行流感裂解疫苗病毒纯化液等量混合，于室温20-25℃作用2小时。超滤膜再纯化选用截留分子量为100kD的超滤膜，超滤缓冲液用0.01mol/L的PBS(pH＝7.2)，进液压力在50psi左右，回流压力为0-10psi，采用PBS超滤10倍体积，用于Triton X-100去除工艺。

具体制备步骤为：

(1)选用菌种：

WHO推荐的NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5N1)株毒株，NIBRG-14株(简称R1194)(英国国家生物制品检定所)。该毒株是1194株(A/Viet Nam/1194/2004H5N1)和PR8株(H1N1)二种病毒，通过反相遗传的方法改造而成，且通过HA基因修饰的方式进一步降低疫苗株的毒力，却保留其免疫原性。这种经过重配得来的疫苗株保留了原始毒株的免疫原性，具有良好的鸡胚适应性和传代的稳定性，与野毒株相比具有很好的安全性，因此适用于疫苗的生产。

(2)鉴定毒种：

a)材料：①将NIBRG-14在鸡胚中传二代(P2)。②血清：禽流感病毒H5血凝素及抗血清(英国国家生物制品检定所)；A1、A3、B型人流感病毒血凝素及抗血清(英国国家生物制品检定所)。

b)方法：

①血凝抑制试验和单向免疫扩散试验：按常规法。

②病毒滴度测定：按常规鸡胚感染法，每稀释度接种4只鸡胚。

③无菌试验和外源因子检查：按现行版《中国药典》的要求测定。

④毒种免疫源性测定：病毒经灭活、浓缩、纯化后，用不同剂量的血凝素经大腿肌肉接种20～25kg家兔4只，14d后加强1针，首针后28d采血，测定血凝抑制抗体和中和抗体。

⑤血凝素序列测定：根据H5的核酸序列，设计一对特异性引物，经RT-PCR扩增H5基因，通过T-A克隆，将其插入载体，转导大肠埃希菌，筛选阳克隆，提取质粒，测序。

⑥R1194的原始株序列：来源于美国国家生物信息中心基因库(NCBI GenBank)。

⑦电子显微镜图片。

(3)毒种库的建立

根据现行版《中国药典》三部通则中“生物制品生产和检定用菌毒种管理规程”的要求，将R1194毒种建立了三级种子库；即原代、主代和工作代。原代：引进的毒种P2作为原代。主代：原代在无致病菌(SPF)鸡胚中传2代P4作为主代。工作代：主代在无致病菌(SPF)鸡胚中传1代P5作为工作代。该工作种子批毒种病毒滴度7.7LogEID₅₀。

(4)NIBRG-14接种鸡胚、培养

将大流行流感疫苗株工作种子批毒种用灭菌生理盐水稀释为10^-5稀释度，尿囊腔接种10日龄健康SPF鸡胚，病毒接种量为0.2ml/胚，培养鸡胚，于接种病毒后56小时取鸡胚放置于4℃冷胚18小时后，收获病毒尿囊液。

(5)灭活病毒

收获的病毒尿囊液，用用毒性弱且可自行分解的烷化剂二乙烯亚胺(BinaryEthyleneImine，简称BEI)和辅料甲醛灭活病毒。两者组合灭活病毒更彻底，抗原性更高，灭活疫苗更加安全、可靠。

(6)病毒液澄清和浓缩：

将各批单型别的病毒原液分别用滤网合并过滤，添加柠檬酸钠和EDTA去除尿囊液中的卵黄蛋白等杂质并取样检测pH值达到7.8后再添加0.5mol/L的磷酸盐溶液PB，取样检测使pH值达7.2±0.2。将无菌试验和灭活试验合格的尿囊液进行澄清过滤，浓缩，浓缩液中再加入0.25mol/L的PB回收病毒液。这种方法有效地去除杂蛋白和回收HA抗原，保证病毒颗粒的完整性和主要抗原组分的存在和纯度。蛋白去除率为61.93％，体积浓缩了36倍，蛋白去除率为96.34％，HA含量收率分别为72.52％。浓缩后的病毒液血凝效价应不低于1∶10240。

(7)病毒纯化

在疫苗浓缩液中，主要的杂蛋白是鸡胚的卵清蛋白等。流感病毒的分子量至少1MD以上，远远大于大部分杂蛋白分子量，用分子筛将病毒与大部分杂蛋白分开。纯化选择的条件是：凝胶层析系统为Amersham的BPG200.750；凝胶为Sepharose 4FF；凝胶过滤介质是4％琼脂糖的高度交联体(该介质具有物理及化学稳定性好、流速快，尤其是流量大、适合大规模生产等优点)。

(7)Triton X-100裂解：

将裂解剂Triton X-100与大流行流感裂解疫苗病毒纯化液等量混合，于室温(20-25℃)作用2小时。

(8)再纯化

超滤膜法去除Triton X-100，去除率在90％以上。

(9)除菌过滤

将上述收集的病毒纯化液用0.2um的膜进行过滤除菌。

(10)氢氧化铝吸附

配置13mg/ml的氢氧化铝，高压灭菌，将氢氧化铝用生理盐水稀释至24mg/ml，加入HA(NIBRG-14病毒表面的糖蛋白血凝素)含量为120ug/ml的疫苗稀释原液，于20-25℃搅拌吸附4小时，配制成大流行流感病毒裂解疫苗的半成品。

(11)分装冻干制成疫苗成品

上述半成品采用洗烘灌联动机组分装，冻干、真空压塞和轧盖、透视检查及贴签；完成贴签的制品即冻干疫苗成品，送2～8℃冷库保存。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、选用WHO推荐的NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5N1)株毒株，NIBRG-14株。疫苗株的毒力低，保留的免疫原性高，具有良好的鸡胚适应性和传代的稳定性，与野毒株相比具有很好的安全性，适用于疫苗的生产。

2、烷化剂二乙烯亚胺(BinaryEthyleneImine，简称BEI)和辅料甲醛的组合灭活剂在终浓度1比40000.02％，20-25℃，6小时灭活病毒。灭活病毒更彻底，抗原性更高，灭活疫苗更加安全、可靠。

3、经过2此纯化，采用新的纯化方法，所含杂质更少，得到的HA含量更高。

4、病毒滴度高，平均1.5个鸡胚就能生产出1人份疫苗。

5、浓缩效率及回收率好。

具体实施方式：

具体实施方式例1

筛选和确定灭活病毒的最佳条件

灭活时，以1比1000、1比2000、1比4000、1比8000加入甲醛溶液，于20-25℃条件下灭活病毒，采用1比1000、1比2000甲醛灭活大流行流感疫苗株病毒，24小时病毒即可被完全灭活，采用1比4000、甲醛灭活大流行流感疫苗株病毒，48小时病毒即可被完全灭活，采用1比8000、甲醛灭活大流行流感疫苗株病毒，96小时病毒即可被完全灭活。甲醛具有较强的还原作用，高浓度的甲醛对疫苗抗原的生产有影响，因此，综合考虑，用1比4000、甲醛灭活大流行流感疫苗株病毒。

具体实施方式例2

制备大流行流感裂解疫苗成品

(1)将大流行流感疫苗株工作种子批毒种用灭菌生理盐水稀释为10^-5稀释度，尿囊腔接种10日龄健康SPF鸡胚，病毒接种量为0.2ml/枚(即100EID50/枚)。将接种病毒的鸡胚放在37.5℃，相对湿度60％下培养，于接种病毒后56小时取鸡胚放置于4℃冷胚18小时后，收获病毒尿囊液。

(2)灭活病毒

收获的病毒尿囊液，用用毒性弱且可自行分解的烷化剂二乙烯亚胺

(BinaryEthyleneImine，简称BEI)和辅料甲醛的组合灭活剂在终浓度1比4000 0.02％，20-25℃，6小时灭活病毒。

(3)病毒液澄清和浓缩

将各批单型别的病毒原液分别用盖有120目滤网合并过滤，添加柠檬酸钠和EDTA去除尿囊液中的卵黄蛋白等杂质并取样检测pH值达到7.8后再添加0.5mol/L的磷酸盐溶液PB，取样检测使pH值达7.2±0.2。将无菌试验和灭活试验合格的尿囊液进行澄清过滤，即经10um滤膜粗滤后，再经两次0.45um滤膜过滤，最后用相对分子质量1000KD的膜包进行超滤浓缩，0.01MpH 7.2的PBS进行8倍体积的衡滤作最后浓缩，浓缩液中再加入0.25mol/L的PB回收病毒液。

(4)病毒纯化

在疫苗浓缩液中，主要的杂蛋白是鸡胚的卵清蛋白等。流感病毒的分子量至少1MD以上，远远大于大部分杂蛋白分子量，用分子筛将病毒与大部分杂蛋白分开。纯化选择的条件是：凝胶层析系统为Amersham的BPG200.750；凝胶为Sepharose 4FF；凝胶过滤介质是4％琼脂糖的高度交联体(该介质具有物理及化学稳定性好、流速快，尤其是流量大、适合大规模生产等优点)；层析柱凝胶装量为14L，使用的平衡盐溶液为0.01M pH 7.2的PBS，流速为150ml/min，样品上样量为700ml。

(5)Triton X-100裂解

用0.01M pH7.2的PBS将裂解剂Triton X-100稀释至浓度为0.5％，与大流行流感裂解疫苗病毒纯化液等量混合，于室温(20-25℃)作用2小时。

(6)再纯化

超滤膜法去除Triton X-100，选用截留分子量为100kD的超滤膜超滤膜，超滤缓冲液用0.01mol/L的PBS(pH＝7.2)，进液压力在50psi左右，回流压力为0-10psi，采用PBS超滤10倍体积，用于Triton X-100去除工艺，去除率在90％以上。

(7)除菌过滤

将上述收集的病毒纯化液用0.2um的膜包进行过滤除菌。

(8)氢氧化铝吸附

配置13mg/ml的氢氧化铝，高压灭菌，将氢氧化铝用生理盐水稀释至24mg/ml，加入HA(NIBRG-14病毒表面的糖蛋白血凝素)含量为120ug/ml的疫苗稀释原液，于20-25℃搅拌吸附4小时，配制成大流行流感病毒裂解疫苗的半成品。

(9)分装冻干制成疫苗成品

上述半成品采用洗烘灌联动机组分装，玻璃管制注射剂瓶盛装，分装规格为0.5ml/瓶，分装过程中自动加卤化丁基橡胶塞，分装完成后，在分装后6小时内冻干；冻干完成即进行真空压塞和轧盖；完成轧盖的制品进行透视检查及贴签；完成贴签的制品即冻干疫苗成品，送2～8℃冷库保存。

具体实施方式例3

成品检定

(1)鉴别试验

取通过本发明的具体实施方式例2制备得到的大流行流感裂解疫苗成品待检样品，加入TritonX一100和二乙醇胺解吸附，离心上清液，加入羊抗A/VIETNAM/1194/04(H5N1)血清的琼脂糖凝胶平板孔中，把凝胶平板放于湿盒中，室温放置18-24h，经PBS浸泡30min，0.5％考马斯亮兰染色，双蒸水脱色后观察。所有样品孔均出现沉淀环，这证明待检样品抗原性与禽流感A/VIETNAM/1194/04(H5NI)株型相一致。

(2)外观

对制各的大流行流感裂解疫苗成品进行灯检，为白色混悬液体，摇动后未发现异物和块状物，外观检定合格。

(3)pH测定

将大流行流感裂解疫苗成品多支混合后，使用pH计测定，三批疫苗检定结果为7.2，在6.5～7.5标准之内，pH检定合格。

(4)效力试验

取大流行流感裂解疫苗成品，分别肌肉注射免疫体重18-20g Balb/c小鼠10只，免疫剂量分别是7.5ug、15ug、30ug，免疫2次，间隔14天。第1次免疫后28天采血，分离血清，采用血凝抑制检测中和抗体效价。大流行流感裂解疫苗成品都产生了良好的中和抗体效价，效力检定合格。

(6)游离甲醛含量

取大流行流感裂解苗供试品lml，用水稀释至甲醛含量约为0.005％，即为供试品溶液，取供试品溶液lml，置50ml比色管中，加注射用水4ml，加品红亚硫酸溶液10ml，混合酸10ml，摇匀，在25″C放置3小时，用590nm波长测定吸光度。精确量取0.005％的甲醛对照品溶液0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml，置50ml比色管中，同法操作，测定吸光度。以甲醛对照品溶液的浓度对相应的吸光度

作线性回归分析，计算样品含量。结果显示大流行流感裂解疫苗成品游离甲醛含量分别为5、5、6ug/ml，低于30ug/ml的质量标准，游离甲醛含量合格。

(7)铝含量

我们对制备的大流行流感裂解疫苗进行了铝含量测定。结果为1.4、1.4、1.4ug/ml，在1.0-1.5ug/ml的质量标准之内，铝含量合格。

(8)无菌试验

我们对制备的大流行流感裂解疫苗成品进行了无菌试验检定。将疫苗样品接种硫乙醇酸盐培养基，25℃放置增菌培养3天，之后转种硫乙醇酸盐培养基、改良马丁培养基、以及琼脂斜面培养基各两支，取琼脂斜面培养基和硫乙醇酸盐培养基各一支于35℃培养，其余培养基于25℃培养，培养14天。在整个观察期间大流行流感裂解疫苗成品所有的培养基均没有细菌、真菌生长，无菌试验合格。

(9)细菌内毒素测定

将待检的大流行流感裂解疫苗成品稀释后加入鲎试剂中，各管以封口膜封口，充分混匀，置37℃水浴1小时后观察结果。鲎试剂呈凝胶状，倒转180°不变形为阳性，鲎试剂呈液体或半固体状，倒转180°可流动为阴性。同时作阴性对照、供试品阳性对照、灵敏度的对照系列。我们对大流行流感裂解疫苗成品进行了细菌内毒素检定，阴性对照、供试品阳性对照、以及灵敏度的对照系列均成立，大流行流感裂解疫苗成品细菌内毒素含量分别为12、24、12EU/ml，低于70EU/ml质量标准，细菌内毒素检测合格。

(10)异常毒性

将大流行流感裂解疫苗成品分别注射小鼠和豚鼠，观察7天，在观察期内，小鼠和豚鼠均未死亡，体重增加。结果表明，大流行流感裂解疫苗成品异常毒性试验合格。

(11)大流行流感裂解疫苗成品检定结果汇总

通过对大流行流感裂解疫苗成品的全面检定，大流行流感裂解疫苗成品汇总检定结果见表。检定结果表明，我们制备的大流行流感裂解疫苗各项检定项目均符合规定，说明疫苗制备工艺稳定，产品质量能够保证。

Claims (10)

1.一种大流行流感病毒裂解疫苗的制备方法，其包括NIBRG-14病毒的接种培养、灭活病毒、病毒液澄清和浓缩、层析纯化病毒、Triton X-100裂解病毒、超滤膜二次纯化、除菌过滤、氢氧化铝吸附、分装冻干制成疫苗成品的步骤，其特征在于：其中采用毒性弱且可自行分解的烷化剂二乙烯亚胺和辅料甲醛组合形成灭活剂对病毒进行灭活。

2.根据权利要求1所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：二乙烯亚胺和辅料甲醛终浓度为1比4000，在20-25℃作用6小时灭活病毒。

3.根据权利要求2所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：NIBRG-14病毒的接种培养按照如下步骤进行，将大流行流感疫苗株工作种子批毒种用灭菌生理盐水稀释为10-5稀释度，尿囊腔接种10日龄健康SPF鸡胚，病毒接种量为0.2ml/枚，将接种病毒的鸡胚放在37.5℃，相对湿度60％下培养，于接种病毒后56小时取鸡胚放置于4℃冷胚18小时后，收获病毒尿囊液。

4.根据权利要求2所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于∶病毒液澄清和浓缩包括滤网过滤、滤膜过滤，超滤和衡滤浓缩。

5.根据权利要求4所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：病毒液澄清和浓缩具体步骤如下：将各批单型别的病毒原液分别用盖有120目滤网合并过滤，添加柠檬酸钠和EDTA去除尿囊液中的卵黄蛋白等杂质并取样检测pH值达到7.8后再添加0.5mol/L的磷酸盐溶液PB，取样检测使pH值达7.2±0.2，将无菌试验和灭活试验合格的尿囊液进行澄清过滤，即经10um滤膜粗滤后，再经两次0.45um滤膜过滤，最后用相对分子质量1000KD的膜进行超滤浓缩，0.01M pH 7.2的PBS进行8倍体积的衡滤作最后浓缩，浓缩液中再加入0.25mol/L的PB回收病毒液。

6.根据权利要求2所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：病毒纯化采用分子筛凝胶层析系统。

7.根据权利要求6所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：分子筛凝胶层析系统为Amersham的BPG200.750；凝胶为Sepharose 4FF，凝胶过滤介质是4％琼脂糖的高度交联体，层析柱凝胶装量为14L，使用的平衡盐溶液为0.01M pH 7.2的PBS，流速为150ml/min，样品上样量为700ml。

8.根据权利要求2所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：Triton X-100裂解是用0.01M pH7.2的PBS将裂解剂Triton X-100稀释至浓度为0.5％，与大流行流感裂解疫苗病毒纯化液等量混合，于室温20-25℃作用2小时。

9.根据权利要求2所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法，其特征在于：超滤膜再纯化选用截留分子量为100kD的超滤膜，超滤缓冲液用0.01mol/L的PBS(pH＝7.2)，进液压力在50psi左右，回流压力为0-10psi，采用PBS超滤10倍体积，用于Triton X-100去除工艺。

10.根据权利要求2所述的大流行流感裂解疫苗的制备方法制备得到的疫苗，其内毒素含量为低于70EU/ml。