CN102068692A - 一种流感病毒裂解疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种流感裂解疫苗及其制备方法，该流感裂解疫苗中每剂含H1N1、H3N2和B型三种流感血凝素、CpG ODN佐剂、铝佐剂。本发明还提供了该流感疫苗的制备方法，包括以下步骤：鸡胚增值流感疫苗，超滤浓缩，离心纯化，裂解，二次纯化，灭活，稀配分装。本发明提供的流感病毒裂解疫苗可以降低流感病毒抗原用量、降低流感疫苗生产成本，适宜在全球大流感流行威胁下迅速提高流感疫苗供应能力。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种含CpG ODN和铝佐剂的流感病毒裂解疫苗及其制备方法。
背景技术
流感是由流感病毒引起的全球流行的呼吸道传播疾病，接种流感疫苗是预防流感的有效手段。
传统的流感病毒疫苗包括流感全病毒灭活疫苗、流感病毒裂解疫苗和流感亚单位疫苗，这些疫苗均采用肌肉注射方法，不含佐剂。
CpG ODN(oligodeoxynucleotides，ODN)是一种含有非甲基化CpG二核苷酸序列的单链寡核苷酸，CpG ODN可以被免疫细胞上Toll样受体9(Toll-like receptor 9，TLR-9)所识别，并增强免疫反应。美国Dynavax公司以CpG ODN为佐剂的重组乙肝疫苗在三期临床研究中显示了优于普通乙肝疫苗的免疫效果，接种两针后抗体阳转率达到95％，而普通乙肝疫苗接种三针后阳转率为81％。
铝佐剂于1926年研制成功并普遍应用至今。由于铝佐剂可以吸附抗原，对抗原起到缓释作用，被普遍应用于蛋白类疫苗的生产。其作用主要是刺激Th2有关抗体产生，增强体液免疫应答，但近年研究结果表明铝佐剂对于增强细胞免疫应答的作用不是很明显。
传统的流感病毒疫苗为流感病毒灭活全病毒疫苗或流感病毒裂解疫苗，成人剂量是含每型血凝素15微克，儿童剂量是含每型血凝素7.5微克，由于传统疫苗不含佐剂，而利用本专利制备的含CpG ODN和铝佐剂的注射型流感病毒裂解疫苗，可以降低抗原用量，增加疫苗供应能力。
以CpG ODN佐剂和铝佐剂制备的流感病毒裂解疫苗目前国内外未见文献报道。
发明内容
本发明克服了传统流感疫苗的缺陷，提供了一种免疫效果好、可以降低流感病毒抗原用量的注射型流感病毒裂解疫苗，且可以应付流感大流行。
本发明的一种流感病毒裂解疫苗，含有H1N1、H3N2和B型流感血凝素、CpG ODN佐剂和铝佐剂。
优选地，所述流感病毒裂解疫苗，每剂含H1N1、H3N2和B型流感血凝素各2-10μg、CpG ODN佐剂10-100μg、铝佐剂100-1000μg。
本发明还提供了一种制备上述流感病毒裂解疫苗的方法，包括：鸡胚增值流感疫苗，超滤浓缩，离心纯化，裂解，二次纯化，灭活，稀配分装。
更具体地，该制备方法包括下述步骤：
1)鸡胚增值流感疫苗：将H1N1、H3N2、B型流感病毒工作种子分别接种于10日龄健康鸡胚尿囊腔中，增值流感病毒；
2)超滤浓缩：分别收集H1N1、H3N2、B型流感病毒尿囊液，用截留分子量为100-300kD的超滤膜进行超滤浓缩；
3)离心纯化：将超滤浓缩后的流感病毒液样品经蔗糖密度梯度离心纯化，通过280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液为纯化的H1N1、H3N2、B型流感病毒液；
4)裂解：收集纯化的病毒液，经Triton X-100裂解纯化，得到H1N1、H3N2、B型流感病毒裂解液；
5)二次纯化：
流感病毒裂解液再经蔗糖密度梯度离心纯化，通过280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液为二次纯化液；
6)灭活：
流感病毒二次纯化液经甲醛灭活，得到H1N1、H3N2、B型流感病毒原液；
7)稀配分装：
根据H1N1和H3N2和B型流感病毒单价病毒液的血凝素浓度测定值，按每剂含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各2-10μg、CpG单链脱氧核苷酸佐剂10-100μg、铝佐剂100-1000μg的配比，分装到预填充注射器，即获得含CpG ODN佐剂的流感裂解疫苗。
其中CpG ODN佐剂含有5’-GACGTT-3’和/或5’-GTCGTT-3’的特征序列，其中所述特征序列5’-GACGTT-3’和5’-GTCGTT-3’为非甲基化，并且全硫代修饰。
非甲基化是指脱氧胞苷(dC)的第5位碳原子未被甲基化。
所述铝佐剂直接购买，也可由本公司自制，其有效成分为氢氧化铝。
血凝素浓度：根据国家药典标准进行检测。
本发明的有益效果是：利用CpG ODN和铝的佐剂作用，使得可以在降低流感病毒抗原用量的同时保持高的免疫效果从而可以扩大流感病毒裂解疫苗的生产量，同时本发明制备的疫苗不含硫柳汞，使用安全性更高。本发明制备的含CpG ODN和铝佐剂的流感病毒裂解疫苗，尤其适宜在全球大流感流行威胁下应急增加流感病毒疫苗生产能力，对于保证公共卫生安全具有重大意义。
附图
图1：不同佐剂流感病毒裂解疫苗免疫原性比较。HA代表H1N1、H3N2和B型流感血凝素各6μg组；HA+AL代表H1N1、H3N2和B型流感血凝素各6μg+铝佐剂600μg组；HA+CpG代表H1N1、H3N2和B型流感血凝素各6μg+CpG佐剂60μg组；HA+AL+CpG代表H1N1、H3N2和B型流感血凝素各6μg+铝佐剂600μg+CpG佐剂60μg组；AL代表600μg铝佐剂对照组；CpG代表60μgCpG对照组。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
其中实施例中CpG ODN佐剂含有5’-GACGTT-3’和/或5’-GTCGTT-3’的特征序列，其中所述特征序列5’-GACGTT-3’和5’-GTCGTT-3’为非甲基化，并且全硫代修饰。下面的实施例没有对该佐剂进行进一步的限定，但是可以为含有5’-GACGTT-3’的特征序列，或含有5’-GTCGTT-3’的特征序列，或含有5’-GACGTT-3’和5’-GTCGTT-3’的特征序列。
实施例1
1)鸡胚增值流感病毒
将H1N1、H3N2、B型流感病毒工作种子分别接种于2000枚10日龄健康鸡胚尿囊腔中，置34℃，将H1N1、H3N2、B型分别培养48、48和72小时；
2)超滤浓缩
将鸡胚置于4℃冷库过夜，分别收集H1N1、H3N2、B型流感病毒尿囊液，共得到流感病毒液23500毫升，分别将尿囊液经6000rpm离心20分钟，上清液采用截留分子量300kD的超滤膜浓缩至300毫升；
3)离心纯化：
将超滤浓缩后的流感病毒液样品经蔗糖密度梯度离心纯化，通过280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液即为一次纯化的流感病毒液，共200毫升；
4)裂解：分别将纯化的H1N1、H3N2、B型流感病毒液加入Triton X-100至终浓度为0.5％(g/ml)，震摇裂解120分钟；
5)二次纯化：
病毒裂解液再经蔗糖密度梯度离心纯化，通过280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液分别获得H1N1、H3N2、B型病毒液为二次纯化液，共250毫升；
6)灭活：
流感病毒二次纯化液加入甲醛至终浓度为50μg/ml，灭活24小时，灭活后得H1N1、H3N2、B型病毒原液，共460ml；
7)稀配分装
根据H1N1和H3N2和B型流感病毒单价病毒液的血凝素浓度测定值，按照每剂含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各2μg、CpG ODN佐剂10μg、铝佐剂100μg的配比，分装到预填充注射器中，即获得含CpGODN和铝佐剂的流感病毒裂解疫苗。
实施例2
1)鸡胚增值流感病毒
将H1N1、H3N2、B型流感病毒工作种子分别接种于2000枚10日龄健康鸡胚尿囊腔中，置34℃，将H1N1、H3N2、B型分别培养48、48和72小时；
2)超滤浓缩
将鸡胚置于4℃冷库过夜，分别收集H1N1、H3N2、B型流感病毒尿囊液，共得到流感病毒液23000毫升，分别将尿囊液经6000rpm离心20分钟，上清液采用截留分子量300kD的超滤膜浓缩至320毫升；
3)离心纯化：将超滤浓缩浓缩后的流感病毒液经蔗糖密度梯度离心纯化，通过280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液即为一次纯化的流感病毒液，共220毫升；
4)裂解：分别将纯化H1N1、H3N2、B型流感病毒液加入Triton X-100至终浓度为0.5％(g/ml)，震摇裂解120分钟；
5)二次纯化：病毒裂解液经蔗糖密度梯度离心纯化，通过280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液分别获得H1N1、H3N2、B型病毒液为二次纯化液，共230毫升；
6)灭活：流感病毒二次纯化液加入甲醛至终浓度为50μg/ml，灭活24小时，灭活后得H1N1、H3N2、B型病毒原液，共450ml；
7)稀配分装
根据H1N1和H3N2和B型流感病毒单价病毒液的血凝素浓度测定值，按照每剂含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各4μg、CpG ODN佐剂30μg、铝佐剂300μg的配比，分装到预填充注射器中，即获得含CpG ODN和铝佐剂的流感病毒裂解疫苗。
实施例3
1)鸡胚增值流感病毒
将H1N1、H3N2、B型流感病毒工作种子分别接种于2000枚10日龄健康鸡胚尿囊腔中，置34℃，将H1N1、H3N2、B型分别培养48、48和72小时；
2)超滤浓缩
将鸡胚置于4℃冷库过夜，分别收集H1N1、H3N2、B型流感病毒尿囊液，共得到流感病毒液22500毫升；分别将尿囊液经6000rpm离心20分钟，上清液采用截留分子量300kD的超滤膜浓缩至340毫升；
3)离心纯化：将超滤浓缩后的流感病毒液样品经蔗糖密度梯度离心纯化，通过280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液即为一次纯化的流感病毒液，共230毫升；
4)裂解：分别将纯化的H1N1、H3N2、B型流感病毒液加入Triton X-100至终浓度为0.5％(g/ml)，震摇裂解120分钟；
5)二次纯化：流感病毒裂解液再经蔗糖密度梯度离心纯化，通过280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液分别获得H1N1、H3N2、B型病毒液为二次纯化液，共240毫升；
6)灭活：流感病毒二次纯化液加入甲醛至终浓度为50μg/ml灭活24小时，灭活后得H1N1、H3N2、B型病毒原液，共380ml；
7)稀配分装
根据H1N1和H3N2和B型流感病毒单价病毒液的血凝素浓度测定值，按照每剂含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各6μg、CpG ODN佐剂60μg、铝佐剂600μg的配比，分装到预填充注射器中，即获得含CpG ODN和铝佐剂的流感病毒裂解疫苗。
实施例4
1)鸡胚增值流感病毒
将H1N1、H3N2、B型流感病毒工作种子分别接种于2000枚10日龄健康鸡胚尿囊腔中，置34℃，将H1N1、H3N2、B型分别培养48、48和72小时；
2)超滤浓缩
将鸡胚置于4℃冷库过夜，分别收集H1N1、H3N2、B型流感病毒尿囊液，得到流感病毒液23000毫升，分别将尿囊液经6000g离心20分钟，上清液采用截留分子量300kD的超滤膜浓缩至300毫升；
3)离心纯化：将超滤浓缩后的流感病毒液样品经蔗糖密度梯度离心纯化，通过280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液即为一次纯化的流感病毒液，共230毫升；
4)裂解：分别将纯化的H1N1、H3N2、B型流感病毒液加入Triton X-100至终浓度为0.5％(g/ml)，震摇裂解120分钟；
5)二次纯化：流感病毒裂解液再经蔗糖密度梯度离心纯化，通过280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液分别获得H1N1、H3N2、B型病毒液为二次纯化液，共240毫升；
6)灭活流感病毒二次纯化液加入甲醛至终浓度为50μg/ml灭活24小时，灭活后得H1N1、H3N2、B型病毒原液，共400ml，将以上步骤分别得到的H1N1、H3N2、B型流感病毒原液混合；
7)稀配分装
根据H1N1和H3N2和B型流感病毒单价病毒液的血凝素浓度测定值，按照每剂含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各8μg、CpG ODN佐剂80μg、铝佐剂800μg的配比，分装到预填充注射器中，即获得含CpGODN和铝佐剂的流感病毒裂解疫苗。
实施例5
1)鸡胚增值流感病毒
将H1N1、H3N2、B型流感病毒工作种子分别接种于2000枚10日龄健康鸡胚尿囊腔中，置34℃，将H1N1、H3N2、B型分别培养48、48和72小时；
2)超滤浓缩
将鸡胚置于4℃冷库过夜，分别收集H1N1、H3N2、B型流感病毒尿囊液，共得到流感病毒液22800毫升；分别将尿囊液经6000rpm离心20分钟，上清液采用截留分子量300kD的超滤膜浓缩至300毫升；
3)离心纯化：将超滤浓缩后的流感病毒液样品经蔗糖密度梯度离心纯化，通过280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液即为一次纯化的流感病毒液，共220毫升；
4)裂解：分别将纯化的H1N1、H3N2、B型流感病毒液加入Triton X-100至终浓度为0.5％(g/ml)，震摇裂解120分钟；
5)二次纯化：流感病毒裂解液再经蔗糖密度梯度离心纯化，通过280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液分别获得H1N1、H3N2、B型病毒液为二次纯化液，共230毫升；
6)灭活：流感病毒二次纯化液加入甲醛至终浓度为50μg/ml，灭活24小时，灭活后得H1N1、H3N2、B型病毒原液，共380ml；
7)稀配分装
根据H1N1和H3N2和B型流感病毒单价病毒液的血凝素浓度测定值，按照每剂含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各10μg、CpG ODN佐剂100μg、铝佐剂1000μg的配比，分装到预填充注射器中，即获得含CpG ODN和铝佐剂的流感病毒裂解疫苗。
实施例6-9
1)鸡胚增值流感病毒
将H1N1、H3N2、B型流感病毒工作种子分别接种于2000枚10日龄健康鸡胚尿囊腔中，置34℃，将H1N1、H3N2、B型分别培养48、48和72小时；
2)收获流感病毒，超滤浓缩
将鸡胚置于4℃冷库过夜，分别收集H1N1、H3N2、B型流感病毒尿囊液，共得到流感病毒液22500毫升；尿囊液经6000rpm离心20分钟，上清液采用截留分子量300kD的超滤膜浓缩至340毫升；
3)离心纯化：将超滤浓缩后的流感病毒液样品经蔗糖密度梯度离心纯化，通过280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液即为一次纯化的流感病毒液，共230毫升；
4)裂解：分别将纯化H1N1、H3N2、B型流感病毒液加入Triton X-100至终浓度为0.5％(g/ml)，震摇裂解120分钟；
5)二次纯化：流感病毒裂解液再经蔗糖密度梯度离心纯化，通过280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液分别获得H1N1、H3N2、B型病毒液为二次纯化液，共240毫升；
6)灭活：流感病毒二次纯化液加入甲醛至终浓度为50μg/ml，灭活24小时，灭活后得H1N1、H3N2、B型病毒原液，共380ml；
7)稀配分装
根据H1N1和H3N2和B型流感病毒单价病毒液的血凝素浓度测定值，按照下列配比稀配流感病毒裂解疫苗：
①每剂含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各6μg；
②每剂含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各6μg、铝佐剂600μg；
③每剂含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各6μg、CpG ODN佐剂60μg；
④每剂含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各6μg、CpG ODN佐剂60μg、铝佐剂600μg。
将稀配的样品分装到预填充注射器中，即获得不含或含不同佐剂的流感病毒裂解疫苗。
实验例1：免疫原性检测
1、流感病毒疫苗的动物免疫原性检测
采用SPF级小鼠作为动物模型，对实施例1-5制备的流感病毒裂解疫苗与市售的流感病毒裂解疫苗进行了小鼠免疫原性比较，试验设计如下：
实施例1-5制备的流感病毒裂解疫苗与市售的流感病毒裂解疫苗对小鼠采用腹腔接种的方式，每组10只小鼠，0.2ml/只接种，于接种后21天采血分离血清，测定小鼠免疫前免疫后血清中对H1N1、H3N2、B型流感病毒的血凝抑制抗体滴度，计算每只小鼠(免后血凝抑制抗体/免前血凝抑制抗体)的比值，并计算每组小鼠(免后血凝抑制抗体/免前血凝抑制抗体)比值的几何平均滴度。
表1：流感病毒疫苗小鼠免疫原性结果比较
结果显示：本发明制备的含CpG ODN和铝佐剂的流感病毒裂解疫苗的免疫原性优于市售的流感病毒裂解疫苗的免疫原性，说明本发明制备的含CpG ODN和铝佐剂的流感病毒裂解疫苗适宜于预防流行性感冒。
2、不同佐剂流感病毒裂解疫苗佐剂作用比较
采用SPF级小鼠作为动物模型，对实施例6-9制备的含不同佐剂的流感病毒裂解疫苗的佐剂作用进行了小鼠免疫原性比较，试验设计如下：
实施例6-9制备的不同佐剂流感病毒裂解疫苗对小鼠采用腹腔接种的方式，每组10只小鼠，0.2ml/只接种，于接种后21天采血分离血清，测定小鼠免疫前免疫后血清中对H1N1、H3N2、B型流感病毒的血凝抑制抗体滴度，计算每只小鼠(免后血凝抑制抗体/免前血凝抑制抗体)的比值，并计算每组小鼠(免后血凝抑制抗体/免前血凝抑制抗体)比值的几何平均滴度，同时设60μg CpG ODN佐剂对照组和600μg铝佐剂对照组。
试验结果显示：以CpG ODN和铝佐剂为双佐剂的流感病毒裂解疫苗的免疫原性明显优于以CpG ODN为佐剂或以铝为佐剂或不加佐剂的流感病毒裂解疫苗的免疫原性。
实验例2：流感病毒疫苗的动物安全性检测
采用清洁级豚鼠作为动物模型，对实施例1-5制备的流感病毒裂解疫苗进行了豚鼠安全性检查，试验设计如下：
(1)实施例1-5制备的流感病毒裂解疫苗、PBS阴性对照和胎牛血清阳性对照对豚鼠隔日每只每次腹腔注射0.5ml，共3次，进行致敏，每组6只。
(2)首次致敏和激发前称量并记录每只动物体重，然后将其分为2组，每组3只，分别在首次注射后第14日和第21日，由静脉每只注射供试品1ml进行激发。观察激发后30分钟内动物有无过敏反应，记录抓鼻、竖毛、呼吸困难、痉挛、抽搐、大小便失常、休克、死亡等过敏症状。
2、流感病毒疫苗豚鼠过敏原性检测结果
表2：过敏原性检测实验结果
结果显示：本发明制备的含CpG ODN和铝佐剂的流感病毒裂解疫苗具有较好的安全性，说明本发明制备的含CpG ODN和铝佐剂的流感病毒裂解疫苗更适宜于预防流行性感冒。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种流感病毒裂解疫苗，其特征在于，该流感病毒裂解疫苗含有H1N1、H3N2和B型三种流感血凝素、CpG ODN佐剂和铝佐剂。
2.根据权利要求1所述的流感病毒裂解疫苗，其特征在于，所述流感病毒裂解疫苗每剂含有H1N1、H3N2和B型流感血凝素各2-10μg、CpG ODN佐剂10-100μg、铝佐剂100-1000μg。
3.根据权利要求1或2所述的流感病毒裂解疫苗，其特征在于，所述CpG ODN佐剂含有5’-GACGTT-3’和/或5’-GTCGTT-3’特征序列，其中特征序列5’-GACGTT-3’和5’-GTCGTT-3’为非甲基化，并且全硫代修饰。
4.根据权利要求3所述的流感病毒裂解疫苗，其特征在于，所述非甲基化是指脱氧胞苷的第5位碳原子未被甲基化。
5.一种制备权利要求1-4任一项所述的流感病毒裂解疫苗的方法，包括以下步骤：鸡胚增值流感疫苗，超滤浓缩，离心纯化，裂解，二次纯化，灭活，稀配分装。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)鸡胚增值流感疫苗：将H1N1、H3N2、B型流感病毒工作种子分别接种于10日龄健康鸡胚尿囊腔中，增值流感病毒；
2)超滤浓缩：分别收集H1N1、H3N2、B型流感病毒尿囊液，用截留分子量100-300kD的超滤膜进行超滤浓缩；
3)离心纯化：将超滤浓缩后的流感病毒液样品经蔗糖密度梯度离心纯化，通过280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液为纯化的H1N1、H3N2、B型流感病毒液；
4)裂解：收集纯化的病毒液，经Triton X-100裂解纯化，得到H1N1、H3N2、B型流感病毒裂解液；
5)二次纯化：流感病毒裂解液再经蔗糖密度梯度离心纯化，通过280nm紫外监测，收集有病毒峰的病毒液为二次纯化液；
6)灭活：流感病毒二次纯化液经甲醛灭活，得到H1N1、H3N2、B型病毒原液；
7)稀释分配：根据H1N1和H3N2和B型流感病毒单价病毒液的血凝素浓度测定值，按照每剂含H1N1和H3N2和B型流感血凝素各2-10μg、CpGODN佐剂10-100μg、铝佐剂100-1000μg的配比，分装到预填充注射器即获得含CpG ODN和铝佐剂的流感裂解疫苗。
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