EA021095B1

EA021095B1 - Process for preparing inactivated intact virion hydroxide aluminium vaccine against a/h1n1 influenza

Info

Publication number: EA021095B1
Application number: EA201100823A
Authority: EA
Inventors: Жайлаубай Кыдырбаевич КЫДЫРБАЕВ; Сейдигапбар Мамадалиевич МАМАДАЛИЕВ; Берик Мухитович ХАЙРУЛЛИН; Нурлан Тамамбаевич САНДЫБАЕВ; Кайсар Казыбаевич ТАБЫНОВ; Ольга Викторовна Червякова; Шолпан Жанбырбаевна Рыскельдинова; Нурика Нарынбековна Асанжанова; Еркин Муратханович Кожамкулов; Дулат Амангельдиевич Инкарбеков; Муратбай Мамбеталиев; Кайрат Казыбаевич ТАБЫНОВ
Priority date: 2011-06-22
Filing date: 2011-06-22
Publication date: 2015-04-30
Also published as: EA201100823A1

Abstract

The invention relates to medical biotechnology and provides a process for preparing inactivated intact virion vaccine against A/H1N1 influenza with aluminium hydroxide from recombinant strain NIBRG-121xp, produced by an inverse genetics method in National Institute of biologic standards and control (NIBSC, Great Britain) and presented by NIIPBB KN MON RK through the World Health Organization for developing pandemic vaccine. The invention essence is characterized by that for preparing inactivated intact virion vaccine against A/H1N1 influenza with aluminium hydroxide the recombinant strain NIBRG-121xp of influenza virus is used which is cultivated in 10-11-day chick embryos, subjected to chemical inactivation, combined purification scheme and concentration and sterilizing filtration adding aluminium hydroxide. The invention provides to prepare a pandemic vaccine for preventing A/H1N1 influenza virus with high virus purification efficiency and, accordingly, with enhanced safety and immunogenicity, the process of producing of which is technological and economical.

Description

(57) Изобретение относится к медицинской биотехнологии и представляет собой способ получения инактивированной цельновирионной вакцины против вируса гриппа Α/Η1Ν1 с гидроокисью алюминия из рекомбинантного штамма ΝΙΒΚΟ-121χρ, полученного методом обратной генетики в Национальном институте биологических стандартов и контроля (№В§С, Великобритания) и представленного по линии Всемирной организации здравоохранения НИИНЬБ КН МОН РК для разработки пандемической вакцины. Сущность изобретения заключается в том, что для получения инактивированной цельновирионной вакцины против вируса гриппа Α/Η1Ν1 с гидроокисью алюминия используется рекомбинантный штамм ΝΙΒΚΟ-121χρ вируса гриппа, который культивируется в 10-11-суточных куриных эмбрионах, подвергается химической инактивации, комбинированной схеме очистки и концентрирования и стерилизующей фильтрации с добавлением гидроокиси алюминия. Изобретение обеспечивает получение пандемической вакцины для профилактики вируса гриппа Α/Η1Ν1 с высокой степенью очистки вируса и соответственно с улучшенной безопасностью и иммуногенностью, процесс изготовления которой является технологичным и экономичным.(57) The invention relates to medical biotechnology and is a method for producing an inactivated whole virus vaccine Α / Η1Ν1 influenza virus with aluminum hydroxide from a recombinant strain ΝΙΒΚΟ-121χρ obtained by the reverse genetics method at the National Institute of Biological Standards and Control (No. В§С, United Kingdom ) and submitted by the World Health Organization NIINB KN MON RK for the development of a pandemic vaccine. The essence of the invention lies in the fact that to obtain an inactivated whole-virus vaccine against influenza virus Α / Η1Ν1 with aluminum hydroxide, a recombinant strain ΝΙΒΚΟ-121χρ of the influenza virus is used, which is cultivated in 10-11-day-old chicken embryos, subjected to chemical inactivation, a combined cleaning and concentration scheme and sterilizing filtration with the addition of aluminum hydroxide. The invention provides a pandemic vaccine for the prevention of influenza virus Α / Η1Ν1 with a high degree of purification of the virus and, accordingly, with improved safety and immunogenicity, the manufacturing process of which is technological and economical.

Изобретение относится к медицинской биотехнологии и представляет собой способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа А/ΗΙΝΙ из рекомбинантного штамма ΝΙΒΚΟ-121χρ, полученного методом обратной генетики в Национальном институте биологических стандартов и контроля (ΝΙΒδϋ, Великобритания) и представленного по линии Всемирной организации здравоохранения НИИПББ НЦБ КН МОН РК для разработки пандемической вакцины.The invention relates to medical biotechnology and is a method of producing an inactivated all-virion hydroxyaluminium vaccine against influenza A / ΗΙΝΙ from a recombinant strain ΝΙΒΚΟ-121χρ obtained by the reverse genetics method at the National Institute of Biological Standards and Control (ϋδϋ, United Kingdom) and presented through the World Health Organization NIIPBB NCB KN MON RK for the development of a pandemic vaccine.

Известен способ получения пандемической вакцины СеКарап (Вах1ег, Чешская Республика/Австрия), инактивированной цельновирионной против гриппа Α/Η1Ν1 из вируса дикого типа А/Са1йогша/7/2009 (Η1Ν1)ν, где вирусная биомасса нарабатывается в перевиваемой линии клеток Уего (клетки почки зеленой мартышки), далее инактивируется формалином в конечной концентрации 0,05%, при температуре и рН реакционной среды 37°С и 7,0-7,6 соответственно, в течение 3 суток с последующим ультрафиолетовым облучением. После чего инактивированная вирусная суспензия подвергается очистке и концентрированию посредством ультрацентрифугирования на линейном градиенте сахарозы 10-50%, ультра/диафильтрации и стерилизации через фильтры диаметром пор 0,22 мкм. Полученный очищенный концентрат в зависимости от весового содержания гемагглютинина (реакция одиночной радиальной иммунодиффузии) разводится буферным солевым раствором (БСР, рН 7,2) со стабилизатором до вакцинных параметров. Адъювант и консервирующее вещество в вакцину не добавляют.A known method for the preparation of the pandemic vaccine CeKarap (Bax1eg, Czech Republic / Austria), inactivated all-virionic against influenza Α / Η1Ν1 from wild-type virus A / Ca1yogsh / 7/2009 (Η1Ν1) ν, where the viral biomass is produced in the transplanted cell line of Ugo (kidney cells green monkey), then inactivated by formalin at a final concentration of 0.05%, at a temperature and pH of the reaction medium of 37 ° C and 7.0-7.6, respectively, for 3 days, followed by ultraviolet irradiation. Then the inactivated viral suspension is purified and concentrated by ultracentrifugation on a linear sucrose gradient of 10-50%, ultra / diafiltration and sterilization through 0.22 μm filters. The obtained purified concentrate, depending on the weight content of hemagglutinin (single radial immunodiffusion reaction), is diluted with buffered saline (BDS, pH 7.2) with a stabilizer to vaccine parameters. Adjuvant and preservative are not added to the vaccine.

Приготовленная вышеизложенным способом вакцина с содержанием гемагглютинина 2 мкг/0,2 мл у двукратно подкожно привитых мышей интервалом в 21 день формирует иммунитет напряженностью титров антител в РТГА с гомологичным антигеном 1:145. [К1к1пет О., Но^атй К., δρπιΐΐι М. е! а1. Се11 си1!иге (Уето) йегАей \\Но1е νίπικ (Η5Ν1) \'ассте Ьакей оп \уПй-1уре νίπικ кПат шйисек сто88-рго1ес1Ае 1ттипе гек]эопкек //Уассше. - 2007. - Уо1. 25(32).-Р. 6028-6036].The vaccine prepared by the above method with a hemagglutinin content of 2 μg / 0.2 ml in twice subcutaneously inoculated mice with an interval of 21 days forms immunity by the intensity of antibody titers in rtga with a homologous antigen of 1: 145. [K1k1pet O., But ^ aty K., δρπιΐΐι M. e! a1. Se11 si1! Ig (Ueto) yegai \\ No1e νίπικ (Η5Ν1) \ 'asste bakey op \ uPy-1ure νίπικ kPat syyisek sto88-rgo1es1Ae 1type gek] eopkek // Wasshe. - 2007. - Yo1. 25 (32) .- P. 6028-6036].

Наиболее значимый недостаток представленного способа заключается в использовании патогенного для людей производственного вируса, требующего соблюдения максимального уровня биологической безопасности на производстве, сложного процесса инактивации вируса и отсутствии в препарате адъюванта, необходимого для формирования быстрого и продолжительного иммунитета у привитых людей в период пандемии.The most significant drawback of the presented method is the use of a production virus pathogenic for humans, which requires compliance with the maximum level of biological safety in production, the complex process of inactivation of the virus and the absence of the adjuvant in the preparation necessary for the formation of quick and lasting immunity in vaccinated people during a pandemic.

Существуют также способ получения пандемической вакцины Κ1ι.ινί·ι1 Р (ОтпнкекБ Венгрия), инактивированной цельновирионной сорбированной против гриппа Α/Η1Ν1 из рекомбинантного штамма ΝΙΒΚΟ-121χρ, полученного в Национальном институте биологических стандартов и контроля (ΝΙΒδΟ Великобритания) методом обратной генетики из эпидемического вируса А/СаП£отша/7/2009 (Η1Ν1) и высокорепродуктивного штамма А/РК/8/34 (Η1Ν1). Согласно указанному способу вирусная суспензия нарабатывается в 10-11-суточных куриных эмбрионах, очищается и концентрируется посредством осветления через картонные фильтры, ультрацентрифугирования на линейном градиенте сахарозы и стерилизующей фильтрации на мембранных фильтрах диаметром пор 0,22 мкм. Полученный очищенный концентрат инактивируется формалином в конечной концентрации 0,025%, при температуре и рН реакционной среды 4°С и 7,0-7,6 соответственно в течение 7 суток. Далее инактивированный вирусный концентрат разводится в зависимости от весового содержания гемагглютинина (δΌδ-РАОЕ) буферным солевым раствором (БСР, рН 7,2) до вакцинных параметров, объединяется с раствором фосфата алюминия таким образом, чтобы концентрация ионов алюминия (А1+³) в препарате составляла 0,33 мг/0,5 мл и перемешивается для сорбции при 4-6°С в течение 1 ч. В качестве консервирующего вещества в вакцину вносится тиомерсал (мертиолят) из расчета 0,1 мг/мл.There is also a method for producing the pandemic vaccine Κ1ι.ιν Р · ι1 P (OttnekekB Hungary), inactivated whole-virionic adsorbed against influenza Α / Η1Ν1 from the recombinant strain ΝΙΒΚΟ-121χρ, obtained at the National Institute of Biological Standards and Control (ΝΙΒδΟ Great Britain) by the reverse genetics virus method from reverse genetics from the reverse genetics virus method A / CaP £ from / 7/2009 (Η1Ν1) and highly reproductive strain A / PK / 8/34 (Η1Ν1). According to the specified method, the viral suspension is produced in 10-11-day-old chicken embryos, purified and concentrated by clarification through cardboard filters, ultracentrifugation on a linear sucrose gradient and sterilizing filtration on membrane filters with a pore diameter of 0.22 μm. The obtained purified concentrate is inactivated by formalin at a final concentration of 0.025%, at a temperature and pH of the reaction medium of 4 ° C and 7.0-7.6, respectively, for 7 days. Next, the inactivated viral concentrate is diluted depending on the weight content of hemagglutinin (δΌδ-RAOE) with buffered saline (BDS, pH 7.2) to vaccine parameters, combined with aluminum phosphate solution so that the concentration of aluminum ions (A1 + ³ ) in the preparation is 0.33 mg / 0.5 ml and stirred for sorption at 4-6 ° C for 1 h. As a preservative, thiomersal (thiolate) is added to the vaccine at the rate of 0.1 mg / ml.

Приготовленная по вышеизложенному способу вакцина с содержанием гемагглютинина 2,5 мкг/0,2 мл у двукратно подкожно привитых мышей с интервалом в 21 день формирует иммунитет напряженностью титров антител в реакции торможении гемагглютинации (РТГА) с гомологичным антигеном 1:460 ЦоНапкеп К., №со11 А., С1апсю Β.Ο, Кгатаг/ Р. Рапйетю тЛиеп/а А(ШМ) 2009 тсстек ш (Не Еигореап Ишоп// Еиго ЗшуеШ. - 2009. - Уо1. 14 (41).-Р. 19361-68].The vaccine prepared according to the above method with a hemagglutinin content of 2.5 μg / 0.2 ml in twice-subcutaneously inoculated mice with an interval of 21 days forms immunity by the intensity of antibody titers in the hemagglutination inhibition reaction (RTGA) with homologous antigen 1: 460 TsoNapkep K., No. co11 A., C1apsyu Β.Ο, Kgatag / R. Rapyetu tLiep / a A (ShM) 2009 tstek sh (Ne Eigoreap Ishop // Eigo ZshueSh. - 2009. - Uo1. 14 (41) .- P. 19361-68 ].

Существенным недостатком способа является низкая производительность использованного метода очистки и концентрирования вируса и несовершенность метода сорбции.A significant disadvantage of this method is the low productivity of the used method of purification and concentration of the virus and the imperfection of the sorption method.

Предлагаемый способ получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа А/ΗΙΝΙ основан на использовании рекомбинантного штамма ΝΙΒΚΟ-121χρ, полученного методом обратной генетики в НШЗС (Великобритания) из эпидемического штамма А/СаП£огша/07/2009 (Η1Ν1) и высокорепродуктивного штамма донора А/РК/8/34 (Η1Ν1) и представленного по линии ВОЗ НИИПББ НЦБ КН МОН РК для разработки пандемической вакцины.The proposed method for producing inactivated all-virion hydroxylaluminium vaccine against influenza A / ΗΙΝΙ is based on the use of the recombinant strain ΝΙΒΚΟ-121χρ obtained by reverse genetics in the NSHS (UK) from the epidemic strain A / CaP £ ogsh / 07/2009 (Η1Ν1) and a highly reproductive strain of donor A / RK / 8/34 (Η1Ν1) and submitted by WHO NIIPBB NTSB KN MON RK for the development of a pandemic vaccine.

Сущность способа заключается в том, что рекомбинантный штамм ΝΙΒΚΟ-121χρ культивируется в 10-11-суточных куриных эмбрионах при 34°С в течение 72 ч, наработанная вирусная суспензия осветляется через 8-слойные марлевые фильтры, инактивируется формалином в конечной концентрации 0,05%, вначале при 4±2°С в течение 60 ч, далее при 37±1°С в течение 12 ч при соблюдении режима постоянного перемешивания. Очистка и концентрирование инактивированной вирусной суспензии проводится поэтапно, вначале осветляется через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм, далее концентрируется на ультрафильтрационной установке МИ^оте® РеШсоп®саккейе кук!ет (Франция) и диализе про- 1 021095 тив 10 объемов буфера [1,0 М натрий хлористый; 0,01 М ФБР рН 7,4; 0,001 М ЭДТА| и 6 объемов буфера [0,15 М натрий хлористый; 0,01 М ФБР рН 7,4; 0,001 М ЭДТА]. Полученный вирусный концентрат дополнительно очищается с помощью гель-фильтрации на колонках с сефарозой СЬ-6В, после чего стерилизуется через каскад мембранных фильтров с диаметром пор АР 20 - 0,45-0,22 мкм. Далее очищенный вирусный концентрат в цельном или разведенном до вакцинных параметров виде объединяют в асептических условиях с рабочим раствором гидроокиси алюминия (содержание ионов А1+³ 2 мг/мл) в соотношении 1:1, перемешивают лабораторным гомогенизатором Т25 Ъазю иЬТКА-ТиККАХ, 1КА (Германия) в течение 3 мин при 3000 об/мин. Полученную смесь после гомогенизации переливают в специальные стаканы и инкубируют при температуре 6±2°С в течение 24 ч при постоянном перемешивании (60-80 об/мин) с помощью спиннера ТесЬие (Франция). После окончания срока инкубации смесь фасуют во флаконы нужного объема и контролируют качество на соответствие нормативному документу. Показатель полноты сорбции антигена на гидроокиси алюминия при соблюдении вышеуказанного режима составления превышает 90%.The essence of the method lies in the fact that the recombinant strain ΝΙΒΚΟ-121χρ is cultured in 10-11-day-old chicken embryos at 34 ° C for 72 hours, the accumulated viral suspension is clarified through 8-layer gauze filters, inactivated by formalin at a final concentration of 0.05% first at 4 ± 2 ° C for 60 hours, then at 37 ± 1 ° C for 12 hours, subject to continuous mixing. Purification and concentration of the inactivated virus suspension is carried out in stages, first it is clarified through membrane filters with a pore diameter of 0.45 μm, then it is concentrated on an ultrafiltration unit MI ^ éte® ReSchop® sacchey doll (France) and dialysis with 10 1095 buffer volumes [1.0 M sodium chloride; 0.01 M FBI pH 7.4; 0.001 M EDTA | and 6 volumes of buffer [0.15 M sodium chloride; 0.01 M FBI pH 7.4; 0.001 M EDTA]. The resulting viral concentrate is further purified by gel filtration on columns with Cb-6B Sepharose, and then sterilized through a cascade of membrane filters with a pore diameter of AP 20 of 0.45-0.22 microns. Next, the purified viral concentrate in whole form or diluted to vaccine parameters is combined under aseptic conditions with a working solution of aluminum hydroxide (the content of ions A1 + ³ 2 mg / ml) in a 1: 1 ratio, mixed with a laboratory homogenizer T25 Hazu ILTKA-TiKKAH, 1KA (Germany) for 3 min at 3000 rpm After homogenization, the resulting mixture is poured into special glasses and incubated at a temperature of 6 ± 2 ° C for 24 hours with constant stirring (60-80 rpm) using a Spinner (France). After the end of the incubation period, the mixture is Packed in bottles of the right volume and control the quality for compliance with the regulatory document. The completeness of sorption of antigen on aluminum hydroxide, subject to the above compilation regime, exceeds 90%.

Приготовленная по предлагаемому способу вакцина с содержанием гемагглютинина 3 мкг/0,2 мл при двукратной внутрибрюшинной вакцинации мышей с интервалом 7 суток формирует у них иммунитет напряженностью 1:425 в РТГА. При контрольном заражении (интраназально под легким эфирным наркозом) вакцинированных мышей эпидемическим вирусом А/СаПГопиа/07/2009 (Η1Ν1), адаптированного мышам в дозе 15 ЬП₅₀/0,03, все животные оставались живыми и не проявляли признаков какой-либо болезни в течение 14-дневного срока наблюдения.Prepared by the proposed method, a vaccine with a hemagglutinin content of 3 μg / 0.2 ml with double intraperitoneal vaccination of mice with an interval of 7 days forms their immunity with a strength of 1: 425 in rtga. During the control infection (intranasally under mild ether anesthesia) of the vaccinated mice with the epidemic virus A / CaPGopia / 07/2009 (Η1Ν1), adapted to mice at a dose of 15 bp ₅₀ / 0.03, all animals remained alive and did not show signs of any disease in during the 14-day observation period.

Предлагаемый способ отличается от аналогов, в том числе от прототипа тем, что в технологии изготовления вакцины применяются оптимальные режимы формалиновой инактивации вируса, составления вакцины, комбинированная схема очистки и концентрирования вируса посредством хроматографических и фильтрационных методов.The proposed method differs from analogues, including the prototype in that the vaccine manufacturing technology employs the optimal modes of formalin inactivation of the virus, preparation of the vaccine, a combined scheme for cleaning and concentrating the virus by chromatographic and filtration methods.

Изобретение выполнимо в условиях научно-производственных объединений при наличии рекомбинантного штамма ΝΙΒΚΟ-121χρ вируса гриппа, соответствующего технологического оборудования и соблюдения предлагаемого режима приготовления вакцины.The invention is feasible in conditions of scientific and industrial associations in the presence of a recombinant strain ΝΙΒΚΟ-121χρ of the influenza virus, the corresponding technological equipment and compliance with the proposed regimen for the preparation of the vaccine.

Эффективность и воспроизводимость предлагаемого способа получения инактивированной цельновирионной гидроокисьалюминиевой вакцины против гриппа Α/Η1Ν1 из рекомбинантного штамма ΝΙΒΚΟ-121χρ вируса гриппа подтверждена при приготовлении трех производственноэкспериментальных серий этого препарата в НИИПББ НЦБ КН МОН РК, в последующем прошедших с положительными результатами доклинические испытания специфической активности и безопасности в РГП Национальный центр экспертизы лекарственных средств, г. Алматы, Республика Казахстан, и Научно-исследовательском институте гриппа СЗО РАМН РФ, г. Санкт-Петербург, Российская Федерация.The effectiveness and reproducibility of the proposed method for the production of inactivated all-virion hydroxide-aluminum vaccine against influenza Α / из1Ν1 from the recombinant strain ΝΙΒΚΟ-121χρ of the influenza virus was confirmed by the preparation of three production experimental series of this drug at the Scientific Research Institute for the Safety of Bioorganic Chemistry, National Clinical Hospital of the Ministry of Education and Science of the Republic of Kazakhstan, and subsequently carried out safety tests with positive results in RSE National Center for Expertise of Medicines, Almaty, Republic of Kazakhstan, and Scientific Research Institute of Influenza RAMS Russian Federation, Saint Petersburg, Russian Federation.

Claims

CLAIM

A process for preparing an inactivated whole virus vaccines against the virus Α / Η1Ν1 influenza aluminum hydroxide, comprising culturing the recombinant strain ΝΙΒΚΟ-121χρ influenza virus in 10-11-day-old chick embryos, chemical inactivation, concentration and combined purification scheme sterilizing filtration of the virus, the addition of aluminum hydroxide, characterized in that prior to the purification step the clarified allantoic suspension of the vaccine virus is inactivated with formalin at a final concentration of 0.05%, first at a temperature of from 2 to 6 ° C for 60 hours, then at a temperature of from 36 to 38 ° C for 12 hours, after which the resulting slurry was purified on a membrane filter and concentrated using a ultra / diafiltration, tangential flow against 10 volumes of buffer comprising 1.0 M sodium chloride; 0.01 M PBS pH 7.4; 0.001 M EDTA and 6 volumes of buffer containing 0.15 M sodium chloride; 0.01 M PBS pH 7.4; 0.001 M EDTA, as well as gel filtration on columns with sepharose.