JP2531729B2 - 組み換えアビポックスウイルス - Google Patents
組み換えアビポックスウイルスInfo
- Publication number
- JP2531729B2 JP2531729B2 JP63057947A JP5794788A JP2531729B2 JP 2531729 B2 JP2531729 B2 JP 2531729B2 JP 63057947 A JP63057947 A JP 63057947A JP 5794788 A JP5794788 A JP 5794788A JP 2531729 B2 JP2531729 B2 JP 2531729B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- avipoxvirus
- hybrid plasmid
- promoter
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組み換えアビポツクスウイルスに関し、さら
に詳しくは、アビポツクスウイルスの増殖に非必須なDN
A領域に外来性DNAが組み込まれた組み換えアビポツクス
ウイルスならびにその製造方法に関する。
に詳しくは、アビポツクスウイルスの増殖に非必須なDN
A領域に外来性DNAが組み込まれた組み換えアビポツクス
ウイルスならびにその製造方法に関する。
（従来の技術） 近年、ワクチニアウイルスに外来性DNAを組み込んだ
組み換えワクチニアウイルスの構築法が考案され、外来
性DNAとして、例えば感染症抗原コードDNAを用いた組み
換えワクチニアウイルスを生ワクチンとして利用する方
法が提案されるようになつた（例えば特開昭58−129971
号、特公表昭60−500518号、特公表昭61−501957号な
ど）。この方法によれば、目的に応じて種々の外来性DN
Aを組み込むことが可能であり、新しい生ワクチンの製
法として有望視されている。
組み換えワクチニアウイルスの構築法が考案され、外来
性DNAとして、例えば感染症抗原コードDNAを用いた組み
換えワクチニアウイルスを生ワクチンとして利用する方
法が提案されるようになつた（例えば特開昭58−129971
号、特公表昭60−500518号、特公表昭61−501957号な
ど）。この方法によれば、目的に応じて種々の外来性DN
Aを組み込むことが可能であり、新しい生ワクチンの製
法として有望視されている。
しかしながら、ワクチニアウイルスはその宿主領域が
限定されているため、例えば、鶏用生ワクチンの製造に
組み換えワクチニアウイルスの手法を応用することはほ
とんど不可能の状態にあり、鶏用生ワクチンの製造のた
めには、ワクチニアウイルスに代えてフアウルポツクス
ウイルスに外来性DNAを組み込む方法が有力との示唆が
なされている（Avian Diseases Vol. 30、No. 1、24〜2
7）。しかし、ワクチニアウイルスとフアウルポツクス
ウイルスとでは前者がポツクスウイルス、後者がアビポ
ツクスウイルスと属が違う上に、ゲノムの長さも前者が
約180Kb、後者が260〜270Kbと約1.5倍もの隔りがある。
また、ワクチニアウイルスはそのゲノムDNA構造の解明
が著しく進んでいるのに対し、フアウルポツクスウイル
スはわずかにゲノムDNAの制限酵素切断パターンが知ら
れているに過ぎず（J.gen.Virol.（1977）、38、135〜1
47）、ゲノムDNAの機能に至つてはわずかにチミジンキ
ナーゼ遺伝子の存在が証明されているに過ぎない（J.ge
n.Virol.（1986）、67、1591〜1600）。従つて前記組み
換えワクチニアウイルス構築法を属の異なるアビポツク
スウイルスに適用することには多大の困難が伴うことが
予想され、かつ、外来性DNAがゲノムDNA中に組み込まれ
た増殖可能な組み換えアビポツクスウイルスが首尾良く
構築できるかどうかについてはまつたく不明の状態にあ
つた。
限定されているため、例えば、鶏用生ワクチンの製造に
組み換えワクチニアウイルスの手法を応用することはほ
とんど不可能の状態にあり、鶏用生ワクチンの製造のた
めには、ワクチニアウイルスに代えてフアウルポツクス
ウイルスに外来性DNAを組み込む方法が有力との示唆が
なされている（Avian Diseases Vol. 30、No. 1、24〜2
7）。しかし、ワクチニアウイルスとフアウルポツクス
ウイルスとでは前者がポツクスウイルス、後者がアビポ
ツクスウイルスと属が違う上に、ゲノムの長さも前者が
約180Kb、後者が260〜270Kbと約1.5倍もの隔りがある。
また、ワクチニアウイルスはそのゲノムDNA構造の解明
が著しく進んでいるのに対し、フアウルポツクスウイル
スはわずかにゲノムDNAの制限酵素切断パターンが知ら
れているに過ぎず（J.gen.Virol.（1977）、38、135〜1
47）、ゲノムDNAの機能に至つてはわずかにチミジンキ
ナーゼ遺伝子の存在が証明されているに過ぎない（J.ge
n.Virol.（1986）、67、1591〜1600）。従つて前記組み
換えワクチニアウイルス構築法を属の異なるアビポツク
スウイルスに適用することには多大の困難が伴うことが
予想され、かつ、外来性DNAがゲノムDNA中に組み込まれ
た増殖可能な組み換えアビポツクスウイルスが首尾良く
構築できるかどうかについてはまつたく不明の状態にあ
つた。
（発明が解決しようとする問題点） そこで本発明者らは、かかる従来技術の下で外来性DN
AがゲノムDNA中に組み込まれた増殖可能な組み換えアビ
ポツクスウイルスの構築を目指し鋭意検討を進めた結
果、アビポツクスウイルスの増殖に非必須なDNA領域を
同定し、該領域に外来性DNAを組み込めば増殖可能な組
み換えアビポツクスウイルスが得られることを見い出し
本発明を完成するに至つた。
AがゲノムDNA中に組み込まれた増殖可能な組み換えアビ
ポツクスウイルスの構築を目指し鋭意検討を進めた結
果、アビポツクスウイルスの増殖に非必須なDNA領域を
同定し、該領域に外来性DNAを組み込めば増殖可能な組
み換えアビポツクスウイルスが得られることを見い出し
本発明を完成するに至つた。
（問題点を解決するための手段） かくして本発明によれば、第１の発明として、アビポ
ツクスウイルスの増殖に非必須なDNA領域に外来性DNAが
組み込まれた組み換えアビポツクスウイルスが提供さ
れ、第２の発明として少なくとも前記非必須DNA領域の
一部分が組み込まれたプラスミドベクターが提供され、
第３の発明として、酵素活性が容易に検知できる酵素を
コードするDNA、または、宿主及びウイルスDNAと相同性
を有しないDNAを利用する方法でアビポツクスウイルス
の増殖に非必須なDNA領域を検索同定し、該DNAを利用し
て外来性DNAを組み込むことを特徴とする組み換えアビ
ポツクスウイルスの製造方法が提供される。
ツクスウイルスの増殖に非必須なDNA領域に外来性DNAが
組み込まれた組み換えアビポツクスウイルスが提供さ
れ、第２の発明として少なくとも前記非必須DNA領域の
一部分が組み込まれたプラスミドベクターが提供され、
第３の発明として、酵素活性が容易に検知できる酵素を
コードするDNA、または、宿主及びウイルスDNAと相同性
を有しないDNAを利用する方法でアビポツクスウイルス
の増殖に非必須なDNA領域を検索同定し、該DNAを利用し
て外来性DNAを組み込むことを特徴とする組み換えアビ
ポツクスウイルスの製造方法が提供される。
本発明において外来性DNAを組み込むために供される
ウイルスはアビポツクスウイルスに分類される限りいか
なる株でもよいが、鶏、七面鳥、アヒルなどの家禽類の
細胞中で増殖可能なものが好ましく、その具体例として
ATCC VR−251、ATCC VR−250、ATCC VR−229、ATCC
VR−249、ATCC VR−228、西ケ原株、泗水株などのご
ときフアウルポツクスウイルスやフアウルポツクスウイ
ルスと近縁のウイルスであつて、NP株（鶏胎化鳩痘毒中
野系株）などのように鶏痘生ワクチン株として使用され
るウイルスなどが例示される。
ウイルスはアビポツクスウイルスに分類される限りいか
なる株でもよいが、鶏、七面鳥、アヒルなどの家禽類の
細胞中で増殖可能なものが好ましく、その具体例として
ATCC VR−251、ATCC VR−250、ATCC VR−229、ATCC
VR−249、ATCC VR−228、西ケ原株、泗水株などのご
ときフアウルポツクスウイルスやフアウルポツクスウイ
ルスと近縁のウイルスであつて、NP株（鶏胎化鳩痘毒中
野系株）などのように鶏痘生ワクチン株として使用され
るウイルスなどが例示される。
本発明を実施するに当つては、まずアビポツクスウイ
ルスゲノム中の任意のDNA断片を挿入した第１のハイブ
リツドプラスミドと、プロモーターの支配下に検出容易
な酵素をコードするDNAを連結した第２のハイブリツド
プラスミド（第２図参照）、あるいは、宿主細胞ゲノム
DNA及びアビポツクスウイルスゲノムDNAの双方と実質的
に相同性を有しないDNA断片（以下、非相同性DNA断片と
いうことである）を挿入した第５のハイブリツドプラス
ミド（第３図参照）が作製される。
ルスゲノム中の任意のDNA断片を挿入した第１のハイブ
リツドプラスミドと、プロモーターの支配下に検出容易
な酵素をコードするDNAを連結した第２のハイブリツド
プラスミド（第２図参照）、あるいは、宿主細胞ゲノム
DNA及びアビポツクスウイルスゲノムDNAの双方と実質的
に相同性を有しないDNA断片（以下、非相同性DNA断片と
いうことである）を挿入した第５のハイブリツドプラス
ミド（第３図参照）が作製される。
第１のハイブリツドプラスミドは、上記のアビポツク
スウイルスゲノムを適当な制限酵素により切断して得ら
れる任意のDNA断片を、常法に従つてプラスミドに組み
込むことによつて作製される。ここで用いられるプラス
ミドは前記DNA断片を挿入しうるものであればにずれで
もよく、その具体例として、例えばpBR322、pBR325、pB
R327、pBR328、pUC7、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19などが
例示される。
スウイルスゲノムを適当な制限酵素により切断して得ら
れる任意のDNA断片を、常法に従つてプラスミドに組み
込むことによつて作製される。ここで用いられるプラス
ミドは前記DNA断片を挿入しうるものであればにずれで
もよく、その具体例として、例えばpBR322、pBR325、pB
R327、pBR328、pUC7、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19などが
例示される。
また第２図に示される第２のハイブリツドプラスミド
は、プロモーター機能を有するDNA（単にプロモーター
と称することがある）と酵素活性が容易に検知できる酵
素をコードするDNAを常法に従つてプラスミドに組み込
むことによつて作製される。
は、プロモーター機能を有するDNA（単にプロモーター
と称することがある）と酵素活性が容易に検知できる酵
素をコードするDNAを常法に従つてプラスミドに組み込
むことによつて作製される。
本発明で言うプロモーター機能を有するDNAとは、合
成・天然を問わずアビポツクスウイルスが保有する転写
の系でプロモーターとして有効に機能し得るものなら如
何なる塩基配列のものでも良く、チミジンキナーゼをコ
ードするアビポツクスウイルス遺伝子のプロモーターな
どアビポツクスウイルス固有のプロモーターはもちろん
のこと、アビポツクスウイルス以外のウイルス由来のDN
Aや真核生物もしくは原核生物由来のDNAであつても上記
条件を満す限り当然本発明に使用可能である。これらプ
ロモーターの具体例としては、例えばJournal of Virol
ogy,Sept.1984、P662〜669に例示されるようなワクチニ
アウイルスのプロモーター、具体的には7.5Kポリペプチ
ドをコードするワクチニアウイルス遺伝子のプロモータ
ー、19Kポリペプチドをコードするワクチニアウイルス
遺伝子のプロモーター、42Kポリペプチドをコードする
ワクチニアウイルス遺伝子のプロモーター、チミジンキ
ナーゼをコードするワクチニアウイルス遺伝子のプロモ
ーター、28Kポリペプチドをコードするワクチニアウイ
ルス遺伝子のプロモーターなどが例示される。
成・天然を問わずアビポツクスウイルスが保有する転写
の系でプロモーターとして有効に機能し得るものなら如
何なる塩基配列のものでも良く、チミジンキナーゼをコ
ードするアビポツクスウイルス遺伝子のプロモーターな
どアビポツクスウイルス固有のプロモーターはもちろん
のこと、アビポツクスウイルス以外のウイルス由来のDN
Aや真核生物もしくは原核生物由来のDNAであつても上記
条件を満す限り当然本発明に使用可能である。これらプ
ロモーターの具体例としては、例えばJournal of Virol
ogy,Sept.1984、P662〜669に例示されるようなワクチニ
アウイルスのプロモーター、具体的には7.5Kポリペプチ
ドをコードするワクチニアウイルス遺伝子のプロモータ
ー、19Kポリペプチドをコードするワクチニアウイルス
遺伝子のプロモーター、42Kポリペプチドをコードする
ワクチニアウイルス遺伝子のプロモーター、チミジンキ
ナーゼをコードするワクチニアウイルス遺伝子のプロモ
ーター、28Kポリペプチドをコードするワクチニアウイ
ルス遺伝子のプロモーターなどが例示される。
また酵素活性が容易に検知できる酵素をコードするDN
Aとは、プロモーターの支配下にアビポツクスウイルス
の増殖に非必須なゲノム領域に組み込まれた場合、組み
換えウイルスの増殖と連動して酵素蛋白が生産され、し
かもその酵素活性が容易に検知できる種類のDNAを指
し、酵素活性の検知の成否によつて容易に組み換えウイ
ルスの検出、ひいてはアビポツクスウイルスの増殖に非
必須なゲノム領域の同定に利用し得る酵素をコードする
DNAを指す。これら酵素の具体例としては、パーオキシ
ダーゼ、グリコースオキシダーゼ、アルカリフオスフオ
ターゼ、グリコース−６−リン酸脱水素酵素、β−ガラ
クトシダーゼなどが挙げられ、これらは特異的な基質の
添加により敏感に酵素活性を検知することができる。
Aとは、プロモーターの支配下にアビポツクスウイルス
の増殖に非必須なゲノム領域に組み込まれた場合、組み
換えウイルスの増殖と連動して酵素蛋白が生産され、し
かもその酵素活性が容易に検知できる種類のDNAを指
し、酵素活性の検知の成否によつて容易に組み換えウイ
ルスの検出、ひいてはアビポツクスウイルスの増殖に非
必須なゲノム領域の同定に利用し得る酵素をコードする
DNAを指す。これら酵素の具体例としては、パーオキシ
ダーゼ、グリコースオキシダーゼ、アルカリフオスフオ
ターゼ、グリコース−６−リン酸脱水素酵素、β−ガラ
クトシダーゼなどが挙げられ、これらは特異的な基質の
添加により敏感に酵素活性を検知することができる。
さらにまた第３図に示される第５のハイブリツドプラ
スミドは、宿主細胞ゲノムDNA及びアビポツクスウイル
スゲノムDNAと実質的に相同性を有しない非相同性DNA断
片を常法に従つてプラスミドに組み込むことによつて作
製される。
スミドは、宿主細胞ゲノムDNA及びアビポツクスウイル
スゲノムDNAと実質的に相同性を有しない非相同性DNA断
片を常法に従つてプラスミドに組み込むことによつて作
製される。
本発明で言う非相同性DNA断片とは、該DNA断片をニツ
クトランスレーシヨン法等の手段により放射性同位元素
でラベルしてプローブとし、アビポツクスウイルスのプ
ラークとハイブリダイゼーシヨン処理を実施した場合、
オートラジオグラフイーの測定結果がネガテイブとなる
DNA断片を言う。
クトランスレーシヨン法等の手段により放射性同位元素
でラベルしてプローブとし、アビポツクスウイルスのプ
ラークとハイブリダイゼーシヨン処理を実施した場合、
オートラジオグラフイーの測定結果がネガテイブとなる
DNA断片を言う。
また本発明で言う宿主細胞とは、アビポツクスウイル
スが感染可能な細胞であれば如何なるものでも良く、具
体例としては鶏胎児細胞（鶏胚腺維芽細胞）などの鶏由
来培養細胞が挙げられ、また、鶏卵漿尿膜なども宿主細
胞の範疇に当然含まれる。
スが感染可能な細胞であれば如何なるものでも良く、具
体例としては鶏胎児細胞（鶏胚腺維芽細胞）などの鶏由
来培養細胞が挙げられ、また、鶏卵漿尿膜なども宿主細
胞の範疇に当然含まれる。
これら第２のハイブリツドプラスミドあるいは第５の
ハイブリツドプラスミドの作製に用いられるプラスミド
は格別制限されず、第１のハイブリツドプラスミドの場
合と同様のものを使用することができる。
ハイブリツドプラスミドの作製に用いられるプラスミド
は格別制限されず、第１のハイブリツドプラスミドの場
合と同様のものを使用することができる。
本発明では、次に第２のハイブリツドプラスミドから
プロモーターおよび酵素をコードするDNAを完全に含むD
NA断片、あるいは、第５のハイブリツドプラスミドから
前記非相同性DNA断片を調製し、第１のハイブリツドプ
ラスミドのウイルスDNA部分に挿入することにより第３
のハイブリツドプラスミドあるいは第６のハイブリツド
プラスミドが得られる。
プロモーターおよび酵素をコードするDNAを完全に含むD
NA断片、あるいは、第５のハイブリツドプラスミドから
前記非相同性DNA断片を調製し、第１のハイブリツドプ
ラスミドのウイルスDNA部分に挿入することにより第３
のハイブリツドプラスミドあるいは第６のハイブリツド
プラスミドが得られる。
本発明においては、次いで予めアビポツクスウイルス
を感染させた宿主細胞に第３又は第６のハイブリツドプ
ラスミドを移入することによつて、第１又は第３の組み
換えアビポツクスウイルスの形成の有無を確認する。宿
主細胞へのプラスミドの移入方法は常法に従えばよく、
例えばリン酸カルシウム法、リポソーム法、マイクロイ
ンジエクシヨン法、エレクトロポレーシヨン法などによ
つて行うことができる。
を感染させた宿主細胞に第３又は第６のハイブリツドプ
ラスミドを移入することによつて、第１又は第３の組み
換えアビポツクスウイルスの形成の有無を確認する。宿
主細胞へのプラスミドの移入方法は常法に従えばよく、
例えばリン酸カルシウム法、リポソーム法、マイクロイ
ンジエクシヨン法、エレクトロポレーシヨン法などによ
つて行うことができる。
第１の組み換えアビポツクスウイルスが上記一連の操
作によつて構築されたかどうかの選択は常法に従つて行
えばよく、例えば酵素をコードするDNAとしてβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子を用いた場合には、組み換えアビポ
ツクスウイルスのプラーク形成用培地にプラークが認め
られた後にクロロフエノールレツド−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド（CPRG）を含むアガロース培地を重層し、37
℃インキユベーシヨンにより赤く染まつてくるプラーク
を選択すれば良い。
作によつて構築されたかどうかの選択は常法に従つて行
えばよく、例えば酵素をコードするDNAとしてβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子を用いた場合には、組み換えアビポ
ツクスウイルスのプラーク形成用培地にプラークが認め
られた後にクロロフエノールレツド−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド（CPRG）を含むアガロース培地を重層し、37
℃インキユベーシヨンにより赤く染まつてくるプラーク
を選択すれば良い。
また、非相同性DNA断片を含む第６のハイブリツドプ
ラスミドをアビポツクスウイルス感染宿主細胞に移入し
た場合は、組み換えアビポツクスウイルスのプラーク形
成用培地にプラークが認められた後、該DNAをプローブ
としてプラークハイブリダイゼーシヨンを実施し、第３
の組み換えアビポツクスウイルスを選択すれば良い。
ラスミドをアビポツクスウイルス感染宿主細胞に移入し
た場合は、組み換えアビポツクスウイルスのプラーク形
成用培地にプラークが認められた後、該DNAをプローブ
としてプラークハイブリダイゼーシヨンを実施し、第３
の組み換えアビポツクスウイルスを選択すれば良い。
このように酵素活性の検知またはプラークハイブリダ
イゼーシヨンによるポジテイブクローンの建築を選択の
手段として、組み換えアビポツクスウイルスが得られた
場合は、第１のハイブリツドプラスミドの構築に用いた
アビポツクスウイルス由来のDNA断片が増殖に非必須なD
NA領域であることを示している。
イゼーシヨンによるポジテイブクローンの建築を選択の
手段として、組み換えアビポツクスウイルスが得られた
場合は、第１のハイブリツドプラスミドの構築に用いた
アビポツクスウイルス由来のDNA断片が増殖に非必須なD
NA領域であることを示している。
本発明においては、かかる非必須DNA領域又は第２図
に示す第２のハイブリツドプラスミドにおけるプロモー
ターとその支配下に検出容易な酵素をコードするDNAの
連結断片を組み込む部位として、あるいは、第３図に示
す第６のハイブリツドプラスミドに含まれる非相同性の
DNAの連結断片を組み込む部位として利用することによ
り第４又は第７のハイブリツドプラスミドが作製され
る。このハイブリツドプラスミドは、プロモーター及び
その支配下で発現可能な外来性DNAを含有し、かつ前記
検出容易な酵素をコードするDNA、あるいは、前記非相
同性DNAを含まないか又は含まれていてもプロモーター
及びその支配下で発現可能な外来性DNAの挿入により分
断されているものである。
に示す第２のハイブリツドプラスミドにおけるプロモー
ターとその支配下に検出容易な酵素をコードするDNAの
連結断片を組み込む部位として、あるいは、第３図に示
す第６のハイブリツドプラスミドに含まれる非相同性の
DNAの連結断片を組み込む部位として利用することによ
り第４又は第７のハイブリツドプラスミドが作製され
る。このハイブリツドプラスミドは、プロモーター及び
その支配下で発現可能な外来性DNAを含有し、かつ前記
検出容易な酵素をコードするDNA、あるいは、前記非相
同性DNAを含まないか又は含まれていてもプロモーター
及びその支配下で発現可能な外来性DNAの挿入により分
断されているものである。
かかる第４あるいは第７のハイブリツドプラスミドの
作製法としては、例えば以下のような方法が例示され
る。
作製法としては、例えば以下のような方法が例示され
る。
（１） 前記非必須DNA領域の全部又は一部の断片を組
み込んだハイブリツドプラスミドにプロモーター及びそ
の支配下で発現可能な外来性DNAを挿入する方法。
み込んだハイブリツドプラスミドにプロモーター及びそ
の支配下で発現可能な外来性DNAを挿入する方法。
この方法においては、前記第１のハイブリツドプラス
ミドを利用することができ、また非必須DNA領域の全部
又は一部を有するかぎり別途作製した他のハイブリツド
プラスミドを用いてもよい。
ミドを利用することができ、また非必須DNA領域の全部
又は一部を有するかぎり別途作製した他のハイブリツド
プラスミドを用いてもよい。
（２） 前記第３のハイブリツドプラスミドの検出容易
な酵素をコードするDNA部分（第１図参照）あるいは、
前記第５のハイブリツドプラスミドの非相同性のDNA部
分（第３図参照）を利用する方法。
な酵素をコードするDNA部分（第１図参照）あるいは、
前記第５のハイブリツドプラスミドの非相同性のDNA部
分（第３図参照）を利用する方法。
この方法においては、前記DNA部分またはプロモータ
ーと前記DNA部分に代えてそれぞれ外来性DNAまたはプロ
モーターと外来性DNAを挿入する方法、前記DNA部分又は
プロモーター部分に別途プロモーター及びその支配下で
発現可能な外来性DNAを挿入する方法などが例示され
る。
ーと前記DNA部分に代えてそれぞれ外来性DNAまたはプロ
モーターと外来性DNAを挿入する方法、前記DNA部分又は
プロモーター部分に別途プロモーター及びその支配下で
発現可能な外来性DNAを挿入する方法などが例示され
る。
（３） 第２図に示される第２のハイブリツドプラスミ
ドあるいは第３図に示される第５のハイブリツドプラス
ミドの挿入断片を利用する方法。
ドあるいは第３図に示される第５のハイブリツドプラス
ミドの挿入断片を利用する方法。
この場合には、プロモーター部分、検出容易な酵素を
コードするDNA部分、あるいは非相同性DNA部分に、別
途、プロモーター及びその支配下で発現可能な外来性DN
Aを挿入する方法が例示される。
コードするDNA部分、あるいは非相同性DNA部分に、別
途、プロモーター及びその支配下で発現可能な外来性DN
Aを挿入する方法が例示される。
本発明においては、次いで第３又は第６の組み換えア
ビポツクスウイルスを感染させた宿主細胞に第４又は第
７のハイブリツドプラスミドを常法に従つて移入するこ
とによつて目的とする第２又は第４の組み換えアビポツ
クスウイルスが作製される。この操作における条件は第
１又は第３の組み換えアビポツクスウイルス作製の場合
に準じて行えばよい。
ビポツクスウイルスを感染させた宿主細胞に第４又は第
７のハイブリツドプラスミドを常法に従つて移入するこ
とによつて目的とする第２又は第４の組み換えアビポツ
クスウイルスが作製される。この操作における条件は第
１又は第３の組み換えアビポツクスウイルス作製の場合
に準じて行えばよい。
得られた第２の組み換えアビポツクスウイルスは検出
容易な酵素の活性を消失しているので、第１の組み換え
アビポツクスウイルスの選択手法において活性を示さな
いプラークを選択することによつて容易に単離すること
ができ、得られた第４の組み換えアビポツクスウイルス
については、前記外来性DNA、プロモーターもしくはそ
の双方をプローブとするプラークハイブリダイゼーシヨ
ン、該外来性DNAの挿入に基づく表現型の変化、該外来
性DNAの発現によつて生成する蛋白のイノムアツセイな
どにより組み換えアビポツクスウイルスを容易に単離す
ることができる。
容易な酵素の活性を消失しているので、第１の組み換え
アビポツクスウイルスの選択手法において活性を示さな
いプラークを選択することによつて容易に単離すること
ができ、得られた第４の組み換えアビポツクスウイルス
については、前記外来性DNA、プロモーターもしくはそ
の双方をプローブとするプラークハイブリダイゼーシヨ
ン、該外来性DNAの挿入に基づく表現型の変化、該外来
性DNAの発現によつて生成する蛋白のイノムアツセイな
どにより組み換えアビポツクスウイルスを容易に単離す
ることができる。
むろん、本発明には、第１もしくは第３の組み換えア
ビポツクスウイルスの単離により、あらかじめアビポツ
クスウイルスの増殖に非必須なDNA領域を検索同定する
工程を省略し、直接、アビポツクスウイルス由来の任意
のDNA断片にプロモーター及び外来性DNAを組み込んだプ
ラスミドを作製し、アビポツクスウイルスとの相同組み
換え操作を実施し、得られるプラークから、該外来性DN
A、プロモーター又はその双方をプローブとするプラー
クハイブリダイゼーシヨン、該外来性DNAの挿入に基づ
く表現型の変化、又は該外来性DNAの発現によつて生成
する蛋白のイムノアツセイにより直接目的とする組み換
えアビポツクスウイルスを得ることも当然本発明に含ま
れる。
ビポツクスウイルスの単離により、あらかじめアビポツ
クスウイルスの増殖に非必須なDNA領域を検索同定する
工程を省略し、直接、アビポツクスウイルス由来の任意
のDNA断片にプロモーター及び外来性DNAを組み込んだプ
ラスミドを作製し、アビポツクスウイルスとの相同組み
換え操作を実施し、得られるプラークから、該外来性DN
A、プロモーター又はその双方をプローブとするプラー
クハイブリダイゼーシヨン、該外来性DNAの挿入に基づ
く表現型の変化、又は該外来性DNAの発現によつて生成
する蛋白のイムノアツセイにより直接目的とする組み換
えアビポツクスウイルスを得ることも当然本発明に含ま
れる。
かくして本発明により得られる第２もしくは第４の組
み換えアビポツクスウイルスにおいては、その増殖と連
動して組み込まれた外来性DNAが発現することになり、
目的とするポリペプチドが産生する。従つて本発明に供
するアビポツクスウイルスを弱毒化ワクチン株とし、該
外来性DNAとして各種の感染症（例えば、マレツク症、
伝染性喉頭気管炎、伝染性コリーザ、コクシジウム症な
ど）病原体の感染防御もしくは発症防御関連抗原をコー
ドするDNAを用いた場合には、単独または複数の感染症
に対する有効な生ワクチンを提供することができる。
み換えアビポツクスウイルスにおいては、その増殖と連
動して組み込まれた外来性DNAが発現することになり、
目的とするポリペプチドが産生する。従つて本発明に供
するアビポツクスウイルスを弱毒化ワクチン株とし、該
外来性DNAとして各種の感染症（例えば、マレツク症、
伝染性喉頭気管炎、伝染性コリーザ、コクシジウム症な
ど）病原体の感染防御もしくは発症防御関連抗原をコー
ドするDNAを用いた場合には、単独または複数の感染症
に対する有効な生ワクチンを提供することができる。
（発明の効果） かくして本発明によれば、アビポツクスウイルスの増
殖に非必須なDNA領域に外来性DNAが組み込まれた組み換
えアビポツクスウイルス、その作成のために有効なアビ
ポツクスウイルスの増殖に非必須なDNA領域を含むプラ
スミドベクターをそれぞれ得ることができ、さらには、
増殖に非必須なDNA領域を利用する組み換えアビポツク
スウイルスの効率的な製造法が提供される。
殖に非必須なDNA領域に外来性DNAが組み込まれた組み換
えアビポツクスウイルス、その作成のために有効なアビ
ポツクスウイルスの増殖に非必須なDNA領域を含むプラ
スミドベクターをそれぞれ得ることができ、さらには、
増殖に非必須なDNA領域を利用する組み換えアビポツク
スウイルスの効率的な製造法が提供される。
（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例１ アビポツクスウイルスゲノムDNAの調製 75cm2培養フラスコに培養された鶏胎児細胞に、アビ
ポツクスウイルスNP株（鶏胎化鳩痘毒中野株、日本フア
ーマシー社製）を1p.f.u./細胞になるように接種した。
37℃、５％CO2インキユベーターで２時間培養後に、10
％トリプトースホスフエイトブロース（Tryptose phosp
hate broth）（デイフコ社）、0.03％Ｌ−グルタミン加
イーグル（Eagle）MEM培地15ml加えた。その後４日間、
37℃、５％CO2インキユベーターで培養後、培養上清を3
000回転で10分間遠心し、上清を回収した。その上清を2
5000回転（約98000×ｇ）１時間遠心し、沈査を回収し
た。沈査を培養上清の1/10容量のDNase反応バツフアー
（50mMトリスpH7.5、1mM MgCl2）に懸濁し、DNase I
（ベーリンガー・マンハイム社）を９μg/mlになるよう
に加え、37℃、30分間反応させた。反応後、25mM EDTA
・2Naを加え、室温で30分間おいたのち、プロテイナー
ゼＫ（ベーリンガー・マンハイム社）を500μg/ml、ド
デシル硫酸ナトリウム（SDS）を１％になるように加
え、37℃で一晩反応させた。これをおだやかにフエノー
ル・クロロホルム処理後、エタノール沈殿し、ウイルス
DNAを0.5μｇ得た。
ポツクスウイルスNP株（鶏胎化鳩痘毒中野株、日本フア
ーマシー社製）を1p.f.u./細胞になるように接種した。
37℃、５％CO2インキユベーターで２時間培養後に、10
％トリプトースホスフエイトブロース（Tryptose phosp
hate broth）（デイフコ社）、0.03％Ｌ−グルタミン加
イーグル（Eagle）MEM培地15ml加えた。その後４日間、
37℃、５％CO2インキユベーターで培養後、培養上清を3
000回転で10分間遠心し、上清を回収した。その上清を2
5000回転（約98000×ｇ）１時間遠心し、沈査を回収し
た。沈査を培養上清の1/10容量のDNase反応バツフアー
（50mMトリスpH7.5、1mM MgCl2）に懸濁し、DNase I
（ベーリンガー・マンハイム社）を９μg/mlになるよう
に加え、37℃、30分間反応させた。反応後、25mM EDTA
・2Naを加え、室温で30分間おいたのち、プロテイナー
ゼＫ（ベーリンガー・マンハイム社）を500μg/ml、ド
デシル硫酸ナトリウム（SDS）を１％になるように加
え、37℃で一晩反応させた。これをおだやかにフエノー
ル・クロロホルム処理後、エタノール沈殿し、ウイルス
DNAを0.5μｇ得た。
実施例２ アビポツクスウイルスゲノム断片を含む第１のハイブリ
ツドプラスミドの作製（第４図参照） （１） アビポツクスウイルスNP株DNAの約5.0Kb EcoR
I−Hind III断片を含むプラスミド（pNZ180）の作製 ２μｇのpUC18（フアルマシア社製）をEcoR IとHind
IIIで消化した後、フエノール・クロロホルム（1:1）で
抽出し、エタノール沈殿により開裂したpUC18を回収し
た。５′−末端リン酸をアルカリフオスフアターゼ処理
により除去し、DNAを再びフエノール・クロロホルム抽
出後、エタノール沈殿によつて回収した。開裂した0.2
μｇのpUC18と１μｇの精製アビポツクスウイルス（NP
株）DNAのEcoR IとHind IIIの消化物をリガーゼにより
連結し、コンピテントな大腸菌JM103を形質転換し、５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド0.003％、イソプロピル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド0.03mM、40μg/mlアンピシリン加のLB寒
天培地で15時間、37℃で培養した。寒天培地上に生育し
た形質転換大腸菌のうち白コロニーを40μg/mlアンピシ
リン加のLB液体培地で37℃、15時間培養し、ビルンボイ
ムとドーリーの方法［ヌクレイツク・アシツド・リサー
チ、７、1513〜（1979）］でプラスミドを抽出し、EcoR
IとHind IIIで消化後、0.6％アガロース電気泳動によ
つてもとのアビポツクスウイルスDNA EcoR I−Hind II
I断片と同じ長さの断片を持つハイブリツドプラスミド
を検出し、これをpNZ180と命名した。なお、約5.0KB E
coR I−Hind III断片の制限酵素地図は第１図（ａ）に
示すとおりである。pNZ180は本発明における第一のプラ
スミドである。
ツドプラスミドの作製（第４図参照） （１） アビポツクスウイルスNP株DNAの約5.0Kb EcoR
I−Hind III断片を含むプラスミド（pNZ180）の作製 ２μｇのpUC18（フアルマシア社製）をEcoR IとHind
IIIで消化した後、フエノール・クロロホルム（1:1）で
抽出し、エタノール沈殿により開裂したpUC18を回収し
た。５′−末端リン酸をアルカリフオスフアターゼ処理
により除去し、DNAを再びフエノール・クロロホルム抽
出後、エタノール沈殿によつて回収した。開裂した0.2
μｇのpUC18と１μｇの精製アビポツクスウイルス（NP
株）DNAのEcoR IとHind IIIの消化物をリガーゼにより
連結し、コンピテントな大腸菌JM103を形質転換し、５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド0.003％、イソプロピル−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシド0.03mM、40μg/mlアンピシリン加のLB寒
天培地で15時間、37℃で培養した。寒天培地上に生育し
た形質転換大腸菌のうち白コロニーを40μg/mlアンピシ
リン加のLB液体培地で37℃、15時間培養し、ビルンボイ
ムとドーリーの方法［ヌクレイツク・アシツド・リサー
チ、７、1513〜（1979）］でプラスミドを抽出し、EcoR
IとHind IIIで消化後、0.6％アガロース電気泳動によ
つてもとのアビポツクスウイルスDNA EcoR I−Hind II
I断片と同じ長さの断片を持つハイブリツドプラスミド
を検出し、これをpNZ180と命名した。なお、約5.0KB E
coR I−Hind III断片の制限酵素地図は第１図（ａ）に
示すとおりである。pNZ180は本発明における第一のプラ
スミドである。
（２） アビポツクスウイルスNP株DNの約4.0Kb BamH
I断片を含むプラスミド（pNZ160）の作製 （１）で用いたベクターのpUC18をpUC9に変更するこ
と、またEcoR I−Hind III断片の代わりにNP株DNAの約
4.0Kb BamH I断片を用いること以外は（１）と同様に
してハイブリツドプラスミドを得、それをpNZ160と命名
した。なお、約4.0Kb BamH I断片の制限酵素地図は第
１図（ｂ）に示すとおりであり、pNZ160は本発明におけ
る第一のプラスミドである。
I断片を含むプラスミド（pNZ160）の作製 （１）で用いたベクターのpUC18をpUC9に変更するこ
と、またEcoR I−Hind III断片の代わりにNP株DNAの約
4.0Kb BamH I断片を用いること以外は（１）と同様に
してハイブリツドプラスミドを得、それをpNZ160と命名
した。なお、約4.0Kb BamH I断片の制限酵素地図は第
１図（ｂ）に示すとおりであり、pNZ160は本発明におけ
る第一のプラスミドである。
（３） アビポツクスウイルスNP株DNAの約3.3Kb BamH
I断片を含むプラスミド（pNZ163）の作製 （１）で用いたベクターのpUC18をpUC9に変更するこ
と、またEcoR I−Hind III断片の代わりにNP株の約3.3K
b BamH I断片を用いること以外は（１）と同様にハイ
ブリツドプラスミドを得、それをpNZ163と命名した。な
お、約3.3Kb BamH I断片の制限酵素地図は第１図
（ｃ）に示すとおりである。pNZ163は本発明における第
一のプラスミドである。
I断片を含むプラスミド（pNZ163）の作製 （１）で用いたベクターのpUC18をpUC9に変更するこ
と、またEcoR I−Hind III断片の代わりにNP株の約3.3K
b BamH I断片を用いること以外は（１）と同様にハイ
ブリツドプラスミドを得、それをpNZ163と命名した。な
お、約3.3Kb BamH I断片の制限酵素地図は第１図
（ｃ）に示すとおりである。pNZ163は本発明における第
一のプラスミドである。
（４） アビポツクスウイルスNP株DNAの約5.2Kb Hind
III断片を含むプラスミド（pNZ124）の作製 （１）で用いたベクターのpUC18をpUC9に変更するこ
と、またEcoR I−Hind III断片の代わりにNP株の約5.2K
b Hind III断片を用いること以外は（１）と同様にハ
イブリツドプラスミドを得、それをpNZ124と命名した。
なお約5.2Kb Hind III断片の制限酵素地図は第１図
（ｄ）に示すとおりである。pNZ124は本発明における第
一のプラスミドである。
III断片を含むプラスミド（pNZ124）の作製 （１）で用いたベクターのpUC18をpUC9に変更するこ
と、またEcoR I−Hind III断片の代わりにNP株の約5.2K
b Hind III断片を用いること以外は（１）と同様にハ
イブリツドプラスミドを得、それをpNZ124と命名した。
なお約5.2Kb Hind III断片の制限酵素地図は第１図
（ｄ）に示すとおりである。pNZ124は本発明における第
一のプラスミドである。
（５） アビポツクスウイルスNP株DNAの約7.3Kb EcoR
I断片を含むプラスミド（pNZ131）の作製 NP株の約7.3Kb EcoR I断片を用い（１）と同様にハ
イブリツドプラスミドを得、それをpNZ131と命名した。
なお、約7.3Kb EcoR I断片の制限酵素地図は第１図
（ｅ）に示すとおりである。pNZ131は本発明における第
一のプラスミドである。
I断片を含むプラスミド（pNZ131）の作製 NP株の約7.3Kb EcoR I断片を用い（１）と同様にハ
イブリツドプラスミドを得、それをpNZ131と命名した。
なお、約7.3Kb EcoR I断片の制限酵素地図は第１図
（ｅ）に示すとおりである。pNZ131は本発明における第
一のプラスミドである。
（６） アビポツクスウイルスNP株DNAの約7.3Kb EcoR
I断片を含むプラスミド（pNZ133）の作製 NP株の約7.3Kb EcoR I断片を用い（１）と同様にハ
イブリツドプラスミドを得、それをpNZ133と命名した。
なお、約7.3kB EcoR I断片の制限酵素地図は第１図
（ｆ）に示すとおりである。pNZ133は本発明における第
一のプラスミドである。
I断片を含むプラスミド（pNZ133）の作製 NP株の約7.3Kb EcoR I断片を用い（１）と同様にハ
イブリツドプラスミドを得、それをpNZ133と命名した。
なお、約7.3kB EcoR I断片の制限酵素地図は第１図
（ｆ）に示すとおりである。pNZ133は本発明における第
一のプラスミドである。
（７） アビポツクスウイルスNP株DNAの約6.5Kb EcoR
I断片を含むプラスミド（pNZ134）の作製 NP株の約6.6Kb EcoR I断片を用い（１）と同様にハ
イブリツドプラスミドを得、それをpNZ134と命名した。
なお、約6.5Kb EcoR I断片の制限酵素地図は第１図
（ｇ）に示すとおりである。pNZ134は本発明における第
一のプラスミドである。
I断片を含むプラスミド（pNZ134）の作製 NP株の約6.6Kb EcoR I断片を用い（１）と同様にハ
イブリツドプラスミドを得、それをpNZ134と命名した。
なお、約6.5Kb EcoR I断片の制限酵素地図は第１図
（ｇ）に示すとおりである。pNZ134は本発明における第
一のプラスミドである。
（８） アビポツクスウイルスNP株DNAの約8.5Kb EcoR
I断片を含むプラスミド（pNZ135）の作製 NP株の約8.5Kb EcoR I断片を用い（１）と同様にハ
イブリツドプラスミドを得、それをpNZ135と命名した。
なお、約8.5Kb EcoR I断片の制限酵素地図は第１図
（ｈ）に示すとおりである。pNZ135は本発明における第
一のプラスミドである。
I断片を含むプラスミド（pNZ135）の作製 NP株の約8.5Kb EcoR I断片を用い（１）と同様にハ
イブリツドプラスミドを得、それをpNZ135と命名した。
なお、約8.5Kb EcoR I断片の制限酵素地図は第１図
（ｈ）に示すとおりである。pNZ135は本発明における第
一のプラスミドである。
（９） アビポツクスウイルスNP株DNAの約6.6Kb EcoR
I断片を含むプラスミド（pNZ137）の作製 NP株の約6.6Kb EcoR I断片を用い（１）と同様にハ
イブリツドプラスミドを得、それをpNZ137と命名した。
なお、約6.6Kb EcoR I断片の制限酵素地図は第１図
（ｉ）に示すとおりである。pNZ137は本発明における第
一のプラスミドである。
I断片を含むプラスミド（pNZ137）の作製 NP株の約6.6Kb EcoR I断片を用い（１）と同様にハ
イブリツドプラスミドを得、それをpNZ137と命名した。
なお、約6.6Kb EcoR I断片の制限酵素地図は第１図
（ｉ）に示すとおりである。pNZ137は本発明における第
一のプラスミドである。
（10） アビポツクスウイルスNP株DNAの約4.1Kb EcoR
I断片を含むプラスミド（pNZ142）の作製 NP株の約4.1Kbp EcoR I断片を用い（１）と同様にハ
イブリツドプラスミドを得、それをpNZ142と命名した。
なお、約4.1Kb EcoR I断片の制限酵素地図は第１図
（ｊ）に示すとおりである。pNZ142は本発明における第
一のプラスミドである。
I断片を含むプラスミド（pNZ142）の作製 NP株の約4.1Kbp EcoR I断片を用い（１）と同様にハ
イブリツドプラスミドを得、それをpNZ142と命名した。
なお、約4.1Kb EcoR I断片の制限酵素地図は第１図
（ｊ）に示すとおりである。pNZ142は本発明における第
一のプラスミドである。
（11） アビポツクスウイルスNP株DNAの約5.5Kb EcoR
I断片を含むプラスミド（pNZ144）の作製 NP株の約5.5Kb EcoRI断片を用い（１）と同様にハイ
ブリツドプラスミドを得、それをpNZ144と命名した。な
お、約5.5Kb EcoR I断片の制限酵素地図は第１図
（ｋ）に示すとおりである。pNZ144は本発明における第
一のプラスミドである。
I断片を含むプラスミド（pNZ144）の作製 NP株の約5.5Kb EcoRI断片を用い（１）と同様にハイ
ブリツドプラスミドを得、それをpNZ144と命名した。な
お、約5.5Kb EcoR I断片の制限酵素地図は第１図
（ｋ）に示すとおりである。pNZ144は本発明における第
一のプラスミドである。
（12） アビポツクスウイルスNP株DNAの約4.9Kb EcoR
I断片を含むプラスミド（pNZ145）の作製 NP株の約4.4Kb EcoR I断片を用い（１）と同様にハ
イブリツドプラスミドを得、それをpNZ145と命名した。
なお、約4.9Kb EcoR I断片の制限酵素地図は第１図
（ｌ）に示すとおりである。pNZ145は本発明における第
一のプラスミドである。
I断片を含むプラスミド（pNZ145）の作製 NP株の約4.4Kb EcoR I断片を用い（１）と同様にハ
イブリツドプラスミドを得、それをpNZ145と命名した。
なお、約4.9Kb EcoR I断片の制限酵素地図は第１図
（ｌ）に示すとおりである。pNZ145は本発明における第
一のプラスミドである。
（13） アビポツクスウイルスNP株DNAの約5.8Kb EcoR
I断片を含むプラスミド（pNZ147）の作製 NP株の約5.8Kb EcoR I断片を用い（１）と同様にハ
イブリツドプラスミドを得、それをpN147と命名した。
なお、約5.8Kb EcoR I断片の制限酵素地図は第１図
（ｍ）に示すとおりである。pNZ147は本発明における第
一のプラスミドである。
I断片を含むプラスミド（pNZ147）の作製 NP株の約5.8Kb EcoR I断片を用い（１）と同様にハ
イブリツドプラスミドを得、それをpN147と命名した。
なお、約5.8Kb EcoR I断片の制限酵素地図は第１図
（ｍ）に示すとおりである。pNZ147は本発明における第
一のプラスミドである。
実施例３ プロモーター及びその支配下に検出容易な酵素をコー
ドするDNAを連結した第２のハイブリツドプラスミド（p
NZ76）の作製（第５図参照） （１） ワクチニアウイルス7.5Kダルトンペプチドをコ
ードする遺伝子のプロモーターを含むプラスミド（pUWP
−１）の作製 ワクチニアウイルスWR株の7.5Kダルトンペプチドをコ
ードするDNAのプロモーターを含むSal I〜Rsa I断片約
0.26kbp［Cell,125、805〜813（1981）］をpUC9のSal I
〜Sma I部分に組みこんだプラスミドをpUWP−１と命名
した。
ドするDNAを連結した第２のハイブリツドプラスミド（p
NZ76）の作製（第５図参照） （１） ワクチニアウイルス7.5Kダルトンペプチドをコ
ードする遺伝子のプロモーターを含むプラスミド（pUWP
−１）の作製 ワクチニアウイルスWR株の7.5Kダルトンペプチドをコ
ードするDNAのプロモーターを含むSal I〜Rsa I断片約
0.26kbp［Cell,125、805〜813（1981）］をpUC9のSal I
〜Sma I部分に組みこんだプラスミドをpUWP−１と命名
した。
（２） 7.5Kプロモーターにβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子が連結されたプラスミド（pNZ76）の作製（第５図参
照） 10μｇのpMA001［Shirakawaら、Gene,28、127−、（1
984）］をBamH Iで消化後、実施例１の（１）と同様の
操作によりβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（約3.3kbp）を
回収した。一方、0.3μｇのpUC19をBamH I消化後、フエ
ノール・クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により回
収し、上記で調製したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とラ
イゲーシヨンし、ハイブリツドプラスミドpNZ66を作製
した。
子が連結されたプラスミド（pNZ76）の作製（第５図参
照） 10μｇのpMA001［Shirakawaら、Gene,28、127−、（1
984）］をBamH Iで消化後、実施例１の（１）と同様の
操作によりβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（約3.3kbp）を
回収した。一方、0.3μｇのpUC19をBamH I消化後、フエ
ノール・クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により回
収し、上記で調製したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とラ
イゲーシヨンし、ハイブリツドプラスミドpNZ66を作製
した。
一方、40μｇのpUWP−１をHpa II、EcoR I消化し、1.
5％低融点アガロース電気泳動（70ボルト、６時間）に
より7.5Kプロモーターを含む約0.26kbpの断片を分離
し、実施例２の（１）と同様の操作によりDNAを回収し
た。このDNA断片の接着末端をDNAポリメレースにより平
滑末端とした。0.3μｇのpNZ66をHinc IIで消化し、フ
エノール・クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により
回収し、上記約0.26kbpの7.5Kプロモーター遺伝子をラ
イゲーシヨンし、得られたハイブリツドプラスミドをpN
Z76と命名した。pNZ76は本発明における第２のハイブリ
ツドプラスミドに相当する。
5％低融点アガロース電気泳動（70ボルト、６時間）に
より7.5Kプロモーターを含む約0.26kbpの断片を分離
し、実施例２の（１）と同様の操作によりDNAを回収し
た。このDNA断片の接着末端をDNAポリメレースにより平
滑末端とした。0.3μｇのpNZ66をHinc IIで消化し、フ
エノール・クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により
回収し、上記約0.26kbpの7.5Kプロモーター遺伝子をラ
イゲーシヨンし、得られたハイブリツドプラスミドをpN
Z76と命名した。pNZ76は本発明における第２のハイブリ
ツドプラスミドに相当する。
また、7.5Kプロモーターならびにβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝子は、宿主細胞ゲノムDNAならびにアビポツクス
ウイルスDNAとの相同性を示さないため、当然、第５の
プラスミドとしても使用可能である。
ゼ遺伝子は、宿主細胞ゲノムDNAならびにアビポツクス
ウイルスDNAとの相同性を示さないため、当然、第５の
プラスミドとしても使用可能である。
実施例４ 第１のハイブリツドプラスミドと第２のハイブリツド
プラスミドからの第３のハイブリツドプラスミドの作製
（第６図参照） （１） pNZ180中のEcoR V部位にワクチニアウイルス7.
5Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片
が挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1003）の作
製 10μｇのpNZ76をHind III、Sma Iで消化後、0.7％低
融点アガロース電気泳動（40ボルト、20時間）で約3.6k
bpの断片を分離し、エチジウムブロマイド染色によりDN
A断片を確認後、ゲルを切り出し、フエノール処理した
のち、エタノール沈殿によりDNA断片を回収した。
プラスミドからの第３のハイブリツドプラスミドの作製
（第６図参照） （１） pNZ180中のEcoR V部位にワクチニアウイルス7.
5Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片
が挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1003）の作
製 10μｇのpNZ76をHind III、Sma Iで消化後、0.7％低
融点アガロース電気泳動（40ボルト、20時間）で約3.6k
bpの断片を分離し、エチジウムブロマイド染色によりDN
A断片を確認後、ゲルを切り出し、フエノール処理した
のち、エタノール沈殿によりDNA断片を回収した。
一方、１μｇのpNZ180をEcoR Vで消化し、フェノール
・クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により回収し
た。開裂されたpNZ180 DNA0.3μｇと前記約3.6kbpの断
片（7.5KプロモーターDNAとβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子の連結断片）約0.4μｇを混合し、DNAポリメレースで
接着末端を平滑末端とし、フエノール・クロロホルム抽
出後、エタノール沈殿により回収した。回収されたDNA
をリガーゼにより連結し、コンピテントな大腸菌JM103
株を形質転換し、40μg/mlアンピシリン加のLB寒天培地
で37℃、15時間生育させた。生育した大腸菌から、実施
例２の（１）と同様な操作によりプラスミドを回収し、
BamH Iで消化し、0.5％アガロース電気泳動でβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子断片（約3.3kbp）を含むハイブリツ
ドプラスミドを選択しこれをpNZ1003と命名した。
・クロロホルム抽出し、エタノール沈殿により回収し
た。開裂されたpNZ180 DNA0.3μｇと前記約3.6kbpの断
片（7.5KプロモーターDNAとβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子の連結断片）約0.4μｇを混合し、DNAポリメレースで
接着末端を平滑末端とし、フエノール・クロロホルム抽
出後、エタノール沈殿により回収した。回収されたDNA
をリガーゼにより連結し、コンピテントな大腸菌JM103
株を形質転換し、40μg/mlアンピシリン加のLB寒天培地
で37℃、15時間生育させた。生育した大腸菌から、実施
例２の（１）と同様な操作によりプラスミドを回収し、
BamH Iで消化し、0.5％アガロース電気泳動でβ−ガラ
クトシダーゼ遺伝子断片（約3.3kbp）を含むハイブリツ
ドプラスミドを選択しこれをpNZ1003と命名した。
（２） pNZ160中のXba I部位にワクチニアウイルス7.5
Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片が
挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1004）の作製 （１）で用いたpNZ180をpNZ160に置き換え、制限酵素
EcoR VをXba Iに置き換えた他は、（１）と同様にし
て、β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.3kbp）を含
むハイブリツドプラスミドを選択し、それをpNZ1004と
命名した。
Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片が
挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1004）の作製 （１）で用いたpNZ180をpNZ160に置き換え、制限酵素
EcoR VをXba Iに置き換えた他は、（１）と同様にし
て、β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.3kbp）を含
むハイブリツドプラスミドを選択し、それをpNZ1004と
命名した。
（３） pNZ163中のKpn I部位にワクチニアウイルス7.5
Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片が
挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1005）の作製 （１）で用いたpNZ180に代えてpNZ163を、また制限酵
素EcoR Vに代えてKpn Iを夫々用いること以外は（１）
と同様にして、β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.
3kbp）を含むハイブリツドプラスミドを選択し、これを
pNZ1005と命名した。
Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片が
挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1005）の作製 （１）で用いたpNZ180に代えてpNZ163を、また制限酵
素EcoR Vに代えてKpn Iを夫々用いること以外は（１）
と同様にして、β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.
3kbp）を含むハイブリツドプラスミドを選択し、これを
pNZ1005と命名した。
（４） pNZ124中のCla I部位にワクチニアウイルス7.5
Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片が
挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1025）の作製 （１）で用いたpNZ180をpNZ124に置き換え、制限酵素
EcoR VをCla Iに置き換えた他は、（１）と同様にし
て、β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.3kbp）を含
むハイブリツドプラスミドを選択し、それをpNZ1025と
命名した。
Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片が
挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1025）の作製 （１）で用いたpNZ180をpNZ124に置き換え、制限酵素
EcoR VをCla Iに置き換えた他は、（１）と同様にし
て、β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.3kbp）を含
むハイブリツドプラスミドを選択し、それをpNZ1025と
命名した。
（５） pNZ131中のEcoR V部位にワクチニアウイルス7.
5Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片
が挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1027）の作
製 （１）で用いたpNZ180をpNZ131に置き換え、制限酵素
EcoR Vで部分的に消化した他は、（１）と同様にして、
β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.3kbp）を含むハ
イブリツドプラスミドを選択し、それをpNZ1027と命名
した。
5Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片
が挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1027）の作
製 （１）で用いたpNZ180をpNZ131に置き換え、制限酵素
EcoR Vで部分的に消化した他は、（１）と同様にして、
β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.3kbp）を含むハ
イブリツドプラスミドを選択し、それをpNZ1027と命名
した。
（６） pNZ133中のEcoR V部位にワクチニアウイルス7.
5Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片
が挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1028、pNZ10
29）の作製 （１）で用いたpNZ180に代えてpNZ133を、また制限酵
素EcoR Vで部分的に消化した以外は、（１）と同様にし
て、β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.3kbp）を含
むハイブリツドプラスミドを選択し、それをpNZ1028お
よびpNZ1029と命名した。
5Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片
が挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1028、pNZ10
29）の作製 （１）で用いたpNZ180に代えてpNZ133を、また制限酵
素EcoR Vで部分的に消化した以外は、（１）と同様にし
て、β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.3kbp）を含
むハイブリツドプラスミドを選択し、それをpNZ1028お
よびpNZ1029と命名した。
なおpNZ1028、1029は、制限酵素｛BamH I、およびEco
R Vによる｝切断パターンの解析により決定した。
R Vによる｝切断パターンの解析により決定した。
（７） pNZ134中のEcoR V部位にワクチニアウイルス7.
5Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片
が挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1045、pNZ10
46、pNZ1047）の作製 （１）で用いたpNZ180に代えてpNZ134を、また制限酵
素EcoR Vで部分的に消化した以外は、（１）と同様にし
て、β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.3kbp）を含
むハイブリツドプラスミドを選択し、これをpNZ1045、p
NZ1046およびpNZ1047と命名した。
5Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片
が挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1045、pNZ10
46、pNZ1047）の作製 （１）で用いたpNZ180に代えてpNZ134を、また制限酵
素EcoR Vで部分的に消化した以外は、（１）と同様にし
て、β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.3kbp）を含
むハイブリツドプラスミドを選択し、これをpNZ1045、p
NZ1046およびpNZ1047と命名した。
なおpNZ1045、pNZ1046およびpNZ1047は（６）と同様
に、制限酵素BamH I、およびEcoR Vによる切断パターン
の解析により決定した。
に、制限酵素BamH I、およびEcoR Vによる切断パターン
の解析により決定した。
（８） pNZ135中のHpa I部位にワクチニアウイルス7.5
Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片が
挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1042）の作製 （１）で用いたpNZ180に代えてpNZ135を、また制限酵
素EcoR Vに代えてHpa Iをそれぞれ用いること以外は、
（１）と同様にして、β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片
（約3.3kbp）を含むハイブリツドプラスミドを選択し、
これをpNZ1042と命名した。
Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片が
挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1042）の作製 （１）で用いたpNZ180に代えてpNZ135を、また制限酵
素EcoR Vに代えてHpa Iをそれぞれ用いること以外は、
（１）と同様にして、β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片
（約3.3kbp）を含むハイブリツドプラスミドを選択し、
これをpNZ1042と命名した。
（９） pNZ137中のEcoR V部位にワクチニアウイルス7.
5Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片
が挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1030）の作
製 （１）で用いたpNZ180をpNZ137に置き換え、（１）と
同様にして、β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.3k
bp）を含むハイブリツドプラスミドを選択し、それをpN
Z1030と命名した。
5Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片
が挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1030）の作
製 （１）で用いたpNZ180をpNZ137に置き換え、（１）と
同様にして、β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.3k
bp）を含むハイブリツドプラスミドを選択し、それをpN
Z1030と命名した。
（10） pNZ142中のCla I部位にワクチニアウイルス7.5
Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片が
挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1035）の作製 （１）で用いたpNZ180に代えてpNZ142を、また制限酵
素EcoR Vに代えてCla Iをそれぞれ用いること以外は、
（１）と同様にして、β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片
（約3.3kbp）を含むハイブリツドプラスミドを選択し、
これをpNZ1305と命名した。
Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片が
挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1035）の作製 （１）で用いたpNZ180に代えてpNZ142を、また制限酵
素EcoR Vに代えてCla Iをそれぞれ用いること以外は、
（１）と同様にして、β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片
（約3.3kbp）を含むハイブリツドプラスミドを選択し、
これをpNZ1305と命名した。
（11） pNZ144中のEcoR V部位にワクチニアウイルス7.
5Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片
が挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1040）、pNZ
1050の作製 （１）で用いたpNZ180をpNZ144に置き換え、制限酵素
EcoR Vで部分的に消化した他は、（１）と同様にして、
β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.3kbp）を含むハ
イブリツドプラスミドを選択し、それをpNZ1040およびp
NZ1050と命名した。
5Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片
が挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1040）、pNZ
1050の作製 （１）で用いたpNZ180をpNZ144に置き換え、制限酵素
EcoR Vで部分的に消化した他は、（１）と同様にして、
β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.3kbp）を含むハ
イブリツドプラスミドを選択し、それをpNZ1040およびp
NZ1050と命名した。
なおpNZ1040およびpNZ1050は、（６）と同様に制限酵
素BamH I、およびEcoR Vによる切断パターンの解析によ
り決定した。
素BamH I、およびEcoR Vによる切断パターンの解析によ
り決定した。
（12） pNZ145中のEcoR V部位にワクチニアウイルス7.
5Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片
が挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1031、pNZ10
32）の作製 （１）で用いたpNZ180をpNZ145に置き換え、制限酵素
EcoR Vで部分的に消化した（１）と同様にして、β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.3kbp）を含むハイブリ
ツドプラスミドを選択し、それをpNZ1031およびpNZ1032
と命名した。
5Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片
が挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1031、pNZ10
32）の作製 （１）で用いたpNZ180をpNZ145に置き換え、制限酵素
EcoR Vで部分的に消化した（１）と同様にして、β−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.3kbp）を含むハイブリ
ツドプラスミドを選択し、それをpNZ1031およびpNZ1032
と命名した。
なおpNZ1031およびpNZ1032は、（６）と同様に制限酵
素BamH I、およびEcoR Vによる切断パターンの解析によ
り決定した。
素BamH I、およびEcoR Vによる切断パターンの解析によ
り決定した。
（13） pNZ147中のEcoR V部位にワクチニアウイルス7.
5Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片
が挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1033）の作
製 （１）で用いたpNZ180をpNZ147に置き換え、制限酵素
EcoR Vで部分的に消化した他は、（１）と同様にして、
β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.3kbp）を含むハ
イブリツドプラスミドを選択し、それをpNZ1033と命名
した。
5Kプロモーターとβ−ガラクトシダーゼDNAの連結断片
が挿入されたハイブリツドプラスミド（pNZ1033）の作
製 （１）で用いたpNZ180をpNZ147に置き換え、制限酵素
EcoR Vで部分的に消化した他は、（１）と同様にして、
β−ガラクトシダーゼ遺伝子断片（約3.3kbp）を含むハ
イブリツドプラスミドを選択し、それをpNZ1033と命名
した。
なお、これらプラスミドに含まれる7.5Kプロモーター
ならびにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、宿主細胞ゲノ
ムDNAならびにアビポツクスウイルスDNAとの相同性を示
さないため、当然第６のハイブリツドプラスミドとして
も利用できる。
ならびにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、宿主細胞ゲノ
ムDNAならびにアビポツクスウイルスDNAとの相同性を示
さないため、当然第６のハイブリツドプラスミドとして
も利用できる。
実施例５ 組み換えアビポツクスウイルスの作製 （１） DNA−リン酸カルシウム共沈法による、組み換
えアビポツクスウイルスの作製 25cm2培養フラスコに培養された鶏胎児細胞にアビポ
ツクスウイルスNP株を0.05p.f.u./細胞になるように接
種した。実施例４で得たハイブリツドプラスミド50μｇ
を、2.2mlの滅菌水に溶解し、これに１％ヘペス（GIBCO
社製）、0.6％塩化ナトリウムの混合液を2.5ml、70mMリ
ン酸水素２ナトリウム12水和物と70mMリン酸水素２ナト
リウム２水和物を等量混合した緩衝液を50μ加えた水
溶液を作製した。これを15mlのチユーブ（フアルコン社
製）にうつし、スターラーで撹拌しながら2Mの塩化カル
シウム水溶液300μをこれに滴下しDNA−リン酸カルシ
ウム共沈物を作り、その0.5mlをウイルス接種45分後の
感染鶏胎児細胞上に滴下した。37℃、５％Co2インキユ
ベーターに30分間静置し、５％牛胎児血清、0.03％Ｌ−
グルタミン、10％トリプトースフオスフエイトブロース
を含むイーグルMEM4.5mlを加えた。その３時間後、培養
液を交換し、３日間、37℃、５％CO2インキユベーター
中で培養し、培養細胞ごと３度凍結融解し、組み換え体
を含むウイルス液を得た。
えアビポツクスウイルスの作製 25cm2培養フラスコに培養された鶏胎児細胞にアビポ
ツクスウイルスNP株を0.05p.f.u./細胞になるように接
種した。実施例４で得たハイブリツドプラスミド50μｇ
を、2.2mlの滅菌水に溶解し、これに１％ヘペス（GIBCO
社製）、0.6％塩化ナトリウムの混合液を2.5ml、70mMリ
ン酸水素２ナトリウム12水和物と70mMリン酸水素２ナト
リウム２水和物を等量混合した緩衝液を50μ加えた水
溶液を作製した。これを15mlのチユーブ（フアルコン社
製）にうつし、スターラーで撹拌しながら2Mの塩化カル
シウム水溶液300μをこれに滴下しDNA−リン酸カルシ
ウム共沈物を作り、その0.5mlをウイルス接種45分後の
感染鶏胎児細胞上に滴下した。37℃、５％Co2インキユ
ベーターに30分間静置し、５％牛胎児血清、0.03％Ｌ−
グルタミン、10％トリプトースフオスフエイトブロース
を含むイーグルMEM4.5mlを加えた。その３時間後、培養
液を交換し、３日間、37℃、５％CO2インキユベーター
中で培養し、培養細胞ごと３度凍結融解し、組み換え体
を含むウイルス液を得た。
（２） エレクトロポレーシヨンによる組み換えアビポ
ツクスウイルスの作製 75cm2培養フラスコに培養された鶏胎児細胞にアビポ
ツクスウイルスNP株を0.05p.f.u./細胞になるように接
種した。37℃、５％CO2インキユベーターで２時間培養
後、５％牛胎児血清、10％トリプトースホスフエイトブ
ロース、0.03％Ｌ−グルタミンを含むイーグルMEM培地
を15ml加え、37℃、５％CO2インキユベーターでさらに
２時間培養した。感染細胞を0.05％トリブシン（トリプ
シン1:250、デイフコ社）ではがし、Saline Ｇ（0.8％
NaCl、0.04％KCl、0.0395％Na2HPO4・12H2O、0.02％K
H2PO4、0.01％MgCl2・6H2O、0.01％CaCl2、0.1％グルコ
ース、pH7.1）10mlで２回洗つてから、Saline Ｇ（同
上）800μに懸濁した。実施例４で得たハイブリツド
プラスミド10μｇを100μのSaline Ｇに溶解し、感
染細胞懸濁液に加えよく懸濁してから、キユベツト（バ
イオラツド社ジーンパルサー用）に移した。細胞エレク
トロポレーシヨンシステム（バイオラツド社ジーンパル
サー）を用いて、6kV/cm、0.1msec（３μFD）か、3kV/c
m、0.4msec（25μFD）の反応条件で、DNAの導入を行つ
た。反応後、10分間静置してから、５％牛胎児血清、10
％トリプトースホスフエイトブロース、0.03％Ｌ−グル
タミンを含むフエノールレツド不含イーグルMEM培地
（ニツスイ）5mlをあらかじめ加えた25cm2培養フラス
コに加え、３日間５％CO2インキユベーターで培養し
た。培養細胞ごと３度凍結融解し、組み換え体を含むウ
イルス液を得た。
ツクスウイルスの作製 75cm2培養フラスコに培養された鶏胎児細胞にアビポ
ツクスウイルスNP株を0.05p.f.u./細胞になるように接
種した。37℃、５％CO2インキユベーターで２時間培養
後、５％牛胎児血清、10％トリプトースホスフエイトブ
ロース、0.03％Ｌ−グルタミンを含むイーグルMEM培地
を15ml加え、37℃、５％CO2インキユベーターでさらに
２時間培養した。感染細胞を0.05％トリブシン（トリプ
シン1:250、デイフコ社）ではがし、Saline Ｇ（0.8％
NaCl、0.04％KCl、0.0395％Na2HPO4・12H2O、0.02％K
H2PO4、0.01％MgCl2・6H2O、0.01％CaCl2、0.1％グルコ
ース、pH7.1）10mlで２回洗つてから、Saline Ｇ（同
上）800μに懸濁した。実施例４で得たハイブリツド
プラスミド10μｇを100μのSaline Ｇに溶解し、感
染細胞懸濁液に加えよく懸濁してから、キユベツト（バ
イオラツド社ジーンパルサー用）に移した。細胞エレク
トロポレーシヨンシステム（バイオラツド社ジーンパル
サー）を用いて、6kV/cm、0.1msec（３μFD）か、3kV/c
m、0.4msec（25μFD）の反応条件で、DNAの導入を行つ
た。反応後、10分間静置してから、５％牛胎児血清、10
％トリプトースホスフエイトブロース、0.03％Ｌ−グル
タミンを含むフエノールレツド不含イーグルMEM培地
（ニツスイ）5mlをあらかじめ加えた25cm2培養フラス
コに加え、３日間５％CO2インキユベーターで培養し
た。培養細胞ごと３度凍結融解し、組み換え体を含むウ
イルス液を得た。
実施例６ クロロフエノールレツド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
による組み換え体の選択 10cmペトリ皿に培養された鶏胎児細胞に実施例５で得
たウイルス液を接種し、２時間後、0.8％バクトアガー
（デイフコ社製）、５％牛胎児血清、0.03％Ｌ−グルタ
ミン、10％トリプトースフオスフエイトブロースを含ん
だ、フエノールレツド不含イーグルMEMを10ml積層し、3
7℃、５％CO2インキユベーターで３日間培養し、これ
に、上記と同成分のフエノールレツド不含イーグルMEM
を10ml重層し、さらに、37℃、５％CO2インキユベータ
ーで３日間培養した。これに、0.8％バクトアガー、0.0
3％Ｌ−グルタミン、10％トリプトースフオスフエイト
ブロース、0.03％クロロフエノールレツド−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノジド（ベーリンガー・マンハイム）を含む
フエノールレツド不含イーグルMEMを10ml重層し、37
℃、５％CO2インキユベーターで６時間培養した。組み
換えウイルスはβ−ガラクトシダーゼを発現し、クロロ
フエノールレツド−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを赤変
させるので、組み換え体プラークのまわりのアガー、細
胞とも赤色に発色し、容易に非組み換え体と区別が可能
であつた。この赤色プラークから生成した組み換え体を
滅菌パスツールピペツトで単離した。得られた組み換え
体につき、それぞれ第１表に示すごとく命名した。
による組み換え体の選択 10cmペトリ皿に培養された鶏胎児細胞に実施例５で得
たウイルス液を接種し、２時間後、0.8％バクトアガー
（デイフコ社製）、５％牛胎児血清、0.03％Ｌ−グルタ
ミン、10％トリプトースフオスフエイトブロースを含ん
だ、フエノールレツド不含イーグルMEMを10ml積層し、3
7℃、５％CO2インキユベーターで３日間培養し、これ
に、上記と同成分のフエノールレツド不含イーグルMEM
を10ml重層し、さらに、37℃、５％CO2インキユベータ
ーで３日間培養した。これに、0.8％バクトアガー、0.0
3％Ｌ−グルタミン、10％トリプトースフオスフエイト
ブロース、0.03％クロロフエノールレツド−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノジド（ベーリンガー・マンハイム）を含む
フエノールレツド不含イーグルMEMを10ml重層し、37
℃、５％CO2インキユベーターで６時間培養した。組み
換えウイルスはβ−ガラクトシダーゼを発現し、クロロ
フエノールレツド−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを赤変
させるので、組み換え体プラークのまわりのアガー、細
胞とも赤色に発色し、容易に非組み換え体と区別が可能
であつた。この赤色プラークから生成した組み換え体を
滅菌パスツールピペツトで単離した。得られた組み換え
体につき、それぞれ第１表に示すごとく命名した。
実施例７ プラークハイブリダイゼーシヨンによる組み換え体の選
択 10cmのペトリ皿に培養された鶏胎児細胞に実施例５で
得たウイルス液を接種し、２時間後0.8％バクトアガ
ー、５％牛胎児血清、0.03％Ｌ−グルタミン、10％トリ
プトースフオスフエートブロースを含んだ、イーグルME
Mを10ml積層し、37℃、５％CO2インキユベーターで３日
間培養し、これに、上記と同成分のイーグルMEMを10ml
重層し、さらに37℃、５％CO2インキユベーターで３日
間培養した。これに、0.8％バクトアガー、0.03％Ｌ−
グルタミン、10％トリプトースフオスフエイトブロー
ス、0.01％中性紅を含むイーグルMEMを10ml重層し、37
℃、５％CO2インキユベーターで12時間培養し感染細胞
を染色した。
択 10cmのペトリ皿に培養された鶏胎児細胞に実施例５で
得たウイルス液を接種し、２時間後0.8％バクトアガ
ー、５％牛胎児血清、0.03％Ｌ−グルタミン、10％トリ
プトースフオスフエートブロースを含んだ、イーグルME
Mを10ml積層し、37℃、５％CO2インキユベーターで３日
間培養し、これに、上記と同成分のイーグルMEMを10ml
重層し、さらに37℃、５％CO2インキユベーターで３日
間培養した。これに、0.8％バクトアガー、0.03％Ｌ−
グルタミン、10％トリプトースフオスフエイトブロー
ス、0.01％中性紅を含むイーグルMEMを10ml重層し、37
℃、５％CO2インキユベーターで12時間培養し感染細胞
を染色した。
ペトリ皿より寒天培地を除去し４℃に保存しペトリ皿
の底に残つた細胞表面に滅菌したナイロンメンブレンを
押えつけてウイルスを移し、0.5N NaOHで10分、1Mトリ
ス塩酸緩衝液で５分の処理を３回繰返した後、1.5M Na
Cl、0.5Mトリス塩酸緩衝液で５分処理した。２倍SSC
（１部SSC、0.15M NaCl、0.015M C3H4（OH）（COON
a）３）で飽和させ、80℃、２時間焼きつけた。４倍SET
（0.6M NaCl、0.08M Tris HCl、4mM EDTA pH7.8）
−10倍Denhardt−0.1％SDSで68％、２時間処理した。４
倍SET−10倍Denhardt−0.1％SDS−0.1％ Na4P2O7−50
μg/ml変性サケ精子DNAとニツクトランスレーシヨンに
よつて32Pで標識したβ−ガラクトシダーゼをコードす
るDNAを入れて68％、14時間ハイブリダイゼーシヨンし
た。洗浄後、ナイロンメンブレンとＸ線フイルムを重
ね、オートラジオグラフイを行い、スポツトの存在を確
認し、４℃に保存してあつた寒天にＸ線フイルムを重ね
スポツトと合致するプラークがβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子を含む組み換え体と同定し滅菌パスツールピペツト
で単離した。この組み換え体のプラークは、約500個の
プラークが出現した10cmペトリ皿10枚あたりに１個出現
した。（約0.02％） 実施例８ 組み換えアビポツクスウイルスの純化 実施例６で単離した赤色プラークを1mlのイーグルMEM
に懸濁し、200μを10cm2ペトリ皿に培養された鶏胎児
細胞に接種した。２時間後、0.8％バクトアガー、５％
牛胎児血清、0.03％Ｌ−グルタミン、10％トリプトース
ホスフエイトブロースを含んだフエノールレツド不含イ
ーグルMEM10mlを積層し、37℃、５％CO2インキユベータ
ーで３日間培養した。これに、上記と同成分のフエノー
ルレツド不含イーグルMEMを10ml重層し、さらに37℃、
５％CO2インキユベーターで３日間培養した。これに、
0.8％バクトアガー、0.03％Ｌ−グルタミン、10％トリ
プトースホスフエイトブロース、0.03％クロロフエノー
ルレツド−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むフエノー
ルレツド不含イーグルMEMを10ml重層し、37℃、５％CO2
インキユベーターで６時間培養した。組み換え体プラー
クは、実施例６と同様に赤色に発色した。
の底に残つた細胞表面に滅菌したナイロンメンブレンを
押えつけてウイルスを移し、0.5N NaOHで10分、1Mトリ
ス塩酸緩衝液で５分の処理を３回繰返した後、1.5M Na
Cl、0.5Mトリス塩酸緩衝液で５分処理した。２倍SSC
（１部SSC、0.15M NaCl、0.015M C3H4（OH）（COON
a）３）で飽和させ、80℃、２時間焼きつけた。４倍SET
（0.6M NaCl、0.08M Tris HCl、4mM EDTA pH7.8）
−10倍Denhardt−0.1％SDSで68％、２時間処理した。４
倍SET−10倍Denhardt−0.1％SDS−0.1％ Na4P2O7−50
μg/ml変性サケ精子DNAとニツクトランスレーシヨンに
よつて32Pで標識したβ−ガラクトシダーゼをコードす
るDNAを入れて68％、14時間ハイブリダイゼーシヨンし
た。洗浄後、ナイロンメンブレンとＸ線フイルムを重
ね、オートラジオグラフイを行い、スポツトの存在を確
認し、４℃に保存してあつた寒天にＸ線フイルムを重ね
スポツトと合致するプラークがβ−ガラクトシダーゼ遺
伝子を含む組み換え体と同定し滅菌パスツールピペツト
で単離した。この組み換え体のプラークは、約500個の
プラークが出現した10cmペトリ皿10枚あたりに１個出現
した。（約0.02％） 実施例８ 組み換えアビポツクスウイルスの純化 実施例６で単離した赤色プラークを1mlのイーグルMEM
に懸濁し、200μを10cm2ペトリ皿に培養された鶏胎児
細胞に接種した。２時間後、0.8％バクトアガー、５％
牛胎児血清、0.03％Ｌ−グルタミン、10％トリプトース
ホスフエイトブロースを含んだフエノールレツド不含イ
ーグルMEM10mlを積層し、37℃、５％CO2インキユベータ
ーで３日間培養した。これに、上記と同成分のフエノー
ルレツド不含イーグルMEMを10ml重層し、さらに37℃、
５％CO2インキユベーターで３日間培養した。これに、
0.8％バクトアガー、0.03％Ｌ−グルタミン、10％トリ
プトースホスフエイトブロース、0.03％クロロフエノー
ルレツド−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを含むフエノー
ルレツド不含イーグルMEMを10ml重層し、37℃、５％CO2
インキユベーターで６時間培養した。組み換え体プラー
クは、実施例６と同様に赤色に発色した。
以上と同様の操作をくり返すことにより再度組み換え
体の純化を行つた。
体の純化を行つた。
その結果、fNZ1003においては、実施例６で、１枚あ
たり約700個のプラークがでた10cmペトリ皿10枚あたり
に組み換え体プラーク（赤色プラーク）が３個（0.04
％）出現したが、１回目のプラーク純化では約300個の
プラークが出現したペトリ皿３枚に組み換え体プラーク
が240個（26％）出現した。２回目のプラーク純化で
は、ほとんどすべてのプラークが、組み換え体であつ
た。他の18種の組み換え体ウイルスにおいても同様であ
つた。
たり約700個のプラークがでた10cmペトリ皿10枚あたり
に組み換え体プラーク（赤色プラーク）が３個（0.04
％）出現したが、１回目のプラーク純化では約300個の
プラークが出現したペトリ皿３枚に組み換え体プラーク
が240個（26％）出現した。２回目のプラーク純化で
は、ほとんどすべてのプラークが、組み換え体であつ
た。他の18種の組み換え体ウイルスにおいても同様であ
つた。
実施例９ 組み換えアビポツクスウイルスのゲノムDNAの解析 実施例８により得られたそれぞれの組み換えアビポツ
クスウイルスを10cmペトリ皿に培養された鶏胎児細胞に
1p.f.u./細胞となるように接種した。以下実施例１と同
様の方法でウイルスDNAを単離した。各組み換えウイル
スDNA2μｇをBamH IまたはHind IIIにて消化後、0.5％
アガロース電気泳動（25V、20時間）で断片を分離し、
サザンの方法［ジヤーナル・オブ・モレキユラー・バイ
オロジイ、98、503−（1975）］で、ナイロンメンブレ
ンにDNAを移した後、80℃、減圧下でDNAをナイロンメン
ブレンに固定した。４倍SET［0.6M NaCl、0.08M、Tris
−HCl（pH7.8）、4mM EDTA］−10倍Denhardt−0.1％SD
Sで68℃、２時間処理後、４倍SET−10倍Denhardt−0.1
％SDS−0.1％Na4P2O7−50μg/ml変性サケ精子DNAとニツ
クトランスレーシヨンによつて32Pで標識したβ−ガラ
クトシダーゼDNAを入れて68℃、14時間ハイブリダイゼ
ーシヨンした。洗浄、乾燥後、ナイロンメンブレンとＸ
線フイルムを重ね、オートラジオグラフイーを行ない、
バンドの存在を確認し、これらの組み換えウイルスが所
定の場所にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を持つことを確
認した。
クスウイルスを10cmペトリ皿に培養された鶏胎児細胞に
1p.f.u./細胞となるように接種した。以下実施例１と同
様の方法でウイルスDNAを単離した。各組み換えウイル
スDNA2μｇをBamH IまたはHind IIIにて消化後、0.5％
アガロース電気泳動（25V、20時間）で断片を分離し、
サザンの方法［ジヤーナル・オブ・モレキユラー・バイ
オロジイ、98、503−（1975）］で、ナイロンメンブレ
ンにDNAを移した後、80℃、減圧下でDNAをナイロンメン
ブレンに固定した。４倍SET［0.6M NaCl、0.08M、Tris
−HCl（pH7.8）、4mM EDTA］−10倍Denhardt−0.1％SD
Sで68℃、２時間処理後、４倍SET−10倍Denhardt−0.1
％SDS−0.1％Na4P2O7−50μg/ml変性サケ精子DNAとニツ
クトランスレーシヨンによつて32Pで標識したβ−ガラ
クトシダーゼDNAを入れて68℃、14時間ハイブリダイゼ
ーシヨンした。洗浄、乾燥後、ナイロンメンブレンとＸ
線フイルムを重ね、オートラジオグラフイーを行ない、
バンドの存在を確認し、これらの組み換えウイルスが所
定の場所にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を持つことを確
認した。
これらの結果から、プロモーターDNAとβ−ガラクト
シダーゼ遺伝子を連結したDNA断片が、検出容易な酵素
を基づく酵素活性を利用する組み換えアビポツクスウイ
ルスの選択に有効であり、また、宿主細胞ゲノムDNAな
らびにアビポツクスウイルスゲノムDNAと実質的に相同
性を有しないDNAを利用する組み換えアビポツクスウイ
ルスの選択にも有効であることを示している。
シダーゼ遺伝子を連結したDNA断片が、検出容易な酵素
を基づく酵素活性を利用する組み換えアビポツクスウイ
ルスの選択に有効であり、また、宿主細胞ゲノムDNAな
らびにアビポツクスウイルスゲノムDNAと実質的に相同
性を有しないDNAを利用する組み換えアビポツクスウイ
ルスの選択にも有効であることを示している。
第１図は本発明で言うアビポツクスウイルスの増殖に非
必須なDNA領域の例を示し、第２図、第３図はアビポツ
クスウイルスの増殖に非必須なDNA領域を検索同定し、
該領域を利用して組み換えアビポツクスウイルスを製造
する方法の概略を示し、第４図は本発明で言う第１のハ
イブリツドプラスミドの作製手順を示し、第５図は第
２、又は第５のハイブリツドプラスミドの作製手順を示
し、第６図は第３又は第６のハイブリツドプラスミドの
作製手順を示す。
必須なDNA領域の例を示し、第２図、第３図はアビポツ
クスウイルスの増殖に非必須なDNA領域を検索同定し、
該領域を利用して組み換えアビポツクスウイルスを製造
する方法の概略を示し、第４図は本発明で言う第１のハ
イブリツドプラスミドの作製手順を示し、第５図は第
２、又は第５のハイブリツドプラスミドの作製手順を示
し、第６図は第３又は第６のハイブリツドプラスミドの
作製手順を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小川 良平 神奈川県川崎市川崎区夜光１丁目２番１ 号 日本ゼオン株式会社研究開発センタ ー内 (72)発明者 鴨川 幸市 神奈川県川崎市川崎区夜光１丁目２番１ 号 日本ゼオン株式会社研究開発センタ ー内 (56)参考文献 特表 昭61−502586（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，67〔８〕 （1986）ｐ．1591−1600
Claims (5)
- 【請求項１】下図（ａ），（ｂ），（ｃ），（ｄ），
（ｅ），（ｆ），（ｇ），（ｈ），（ｉ），（ｊ），
（ｋ），（ｌ）または（ｍ）に示される制限酵素切断点
地図をもつアビポックスウイルス由来のDNA領域又はそ
の一部であるアビポックスウイルスの増殖に非必須なDN
A領域に外来性DNAが組み込まれた組み換えアビポックス
ウイルス。 - 【請求項２】プロモーターが外来性DNAの５′側上流域
に外来性DNAと共に組み込まれた特許請求の範囲第１項
記載の組み換えアビポックスウイルス。 - 【請求項３】下図に示すアビポックスウイルスの増殖に
非必須なDNA領域のいずれか一つが組み込まれたpNZ18
0、pNZ160、pNZ163、pNZ124、pNZ131、pNZ133、pNZ13
4、pNZ135、pNZ137、pNZ142、pNZ144、pNZ145、pNZ14
7、pNZ1003、pNZ1004、pNZ1005、pNZ1025、pNZ1027、pN
Z1028、pNZ1029、pNZ1045、pNZ1046、pNZ1047、pNZ104
2、pNZ1030、pNZ1035、pNZ1040、pNZ1050、pNZ1031、pN
Z1032、またはpNZ1033から選ばれるプラスミドベクタ
ー： - 【請求項４】プロモーター及びその支配下で発現可能な
外来性DNAをアビポックスウイルスの増殖に非必須なDNA
領域に組み込んで組み換えウイルスを製造するにあた
り、下記の手順に従って実施することを特徴とする組み
換えアビポックスウイルスの製造方法。 アビポックスウイルスゲノム中の任意のDNA断片を
挿入した第１のハイブリッドプラスミドと、プロモータ
ー及びその支配下に検出容易な酵素をコードするDNAを
連結した第２のハイブリッドプラスミドを作製すること 第１のハイブリッドプラスミドのアビポックスウイ
ルス由来のDNA断片中に第２のハイブリッドプラスミド
中のプロモーター及び検出容易な酵素をコードするDNA
を含む断片を挿入した第３のハイブリッドプラスミドを
作製すること アビポックスウイルス感染細胞に第３のハイブリッ
ドプラスミドを細胞内移入させて相同組み換えを起こさ
せたのち、プラークアッセイにより前記検出容易な酵素
に基づく酵素活性を有する第１の組み換えアビポックス
ウイルスを単離すること 前記アビポックスウイルスゲノム由来のDNA断片又
は前記プロモーターとその支配下にある検出容易な酵素
をコードするDNAの連結断片を組み込み部位として利用
することによりプロモーター及びその支配下で発現可能
な外来性DNAを組み込んだ第４のハイブリッドプラスミ
ドを作製すること 前記第１の組み換えアビポックスウイルス感染細胞
に前記第４のハイブリッドプラスミドを細胞内移入させ
て相同組み換えを起こさせたのち、の場合と同様にプ
ラークアッセイにより酵素活性を消失した第２の組み換
えアビポックスウイルスを単離すること - 【請求項５】プロモーター及びその支配下で発現可能な
外来性DNAをアビポックスウイルスの増殖に非必須なDNA
領域に組み込んで組み換えウイルスを製造するにあた
り、下記の手順に従って実施することを特徴とする組み
換えアビポックスウイルスの製造方法。 アビポックスウイルスゲノム中の任意のDNA断片を
挿入した第１のハイブリッドプラスミドと、宿主細胞ゲ
ノムDNA及びアビポックスウイルスDNAのいずれとも実質
的に相同性を有しないDNA断片（非相同性DNA断片）を挿
入した第５のハイブリッドプラスミドを作製すること 第１のハイブリッドプラスミドのアビポックスウイ
ルス由来のDNA断片中に第５のハイブリッドプラスミ中
の非相同性DNA断片を挿入した第６のハイブリッドプラ
スミドを作製すること アビポックスウイルス感染細胞に第６のハイブリッ
ドプラスミドを細胞内移入させて相同組み換えを起こさ
せたのち、前記非相同性DNA断片をプローブとするプラ
ークハイブリダイゼーションにより増殖可能な第３の組
み換えアビポックスウイルスを単離すること 前記アビポックスウイルスゲノム由来のDNA断片又
は前記非相同性DNA断片を組み込み部位として利用する
ことによりプロモーター及びその支配下で発現可能な外
来性DNAを組み込んだ第７のハイブリッドプラスミドを
作製すること 前記第３の組み換えアビポックスウイルス感染細胞
に第７のハイブリッドプラスミドを細胞移入させて相同
組み換えを起こさせたのち、前記外来性DNA、プロモー
ター又はその双方をプローブとするプラークハイブリダ
イゼーション、外来性DNAの挿入に基づく表現型の変
化、あるいは、外来性DNAの発現によって生成する蛋白
のイムノアッセイにより、増殖可能な第４の組み換えア
ビポックスウイルスを単離すること
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP88302673A EP0284416B1 (en) | 1987-03-27 | 1988-03-25 | Recombinant avipoxyvirus |
| AU13766/88A AU605567B2 (en) | 1987-03-11 | 1988-03-25 | Recombinant avipoxvirus |
| DE3853088T DE3853088T2 (de) | 1987-03-27 | 1988-03-25 | Rekombinantes Avipoxvirus. |
| KR88003313A KR960016703B1 (en) | 1987-03-27 | 1988-03-26 | Recombinant avipoxvirus |
| US07/752,982 US5387519A (en) | 1987-03-27 | 1991-09-03 | Recombinant avipoxvirus |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7356887 | 1987-03-27 | ||
| JP62-73568 | 1987-09-14 | ||
| JP62-229972 | 1987-09-14 | ||
| JP22997287 | 1987-09-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01168279A JPH01168279A (ja) | 1989-07-03 |
| JP2531729B2 true JP2531729B2 (ja) | 1996-09-04 |
Family
ID=26414710
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63057947A Expired - Lifetime JP2531729B2 (ja) | 1987-03-11 | 1988-03-11 | 組み換えアビポックスウイルス |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5387519A (ja) |
| JP (1) | JP2531729B2 (ja) |
| KR (1) | KR960016703B1 (ja) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5505941A (en) * | 1981-12-24 | 1996-04-09 | Health Research, Inc. | Recombinant avipox virus and method to induce an immune response |
| DE3813093A1 (de) * | 1988-04-19 | 1989-11-09 | Immuno Ag | Rekombinantes plasmid, verfahren zum herstellen eines rekombinanten avipoxvirus, rekombinantes avipoxvirus und dessen verwendung |
| US5651972A (en) | 1989-04-21 | 1997-07-29 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Use of recombinant swine poxvirus as a live vaccine vector |
| US5925358A (en) * | 1993-02-26 | 1999-07-20 | Syntro Corporation | Recombinant fowlpox viruses and uses thereof |
| EP0696204A4 (en) * | 1993-02-26 | 1999-03-31 | Syntro Corp | Recombined chickenpox virus and its use |
| US6136318A (en) * | 1993-02-26 | 2000-10-24 | Cochran; Mark D. | Recombinant fowlpox viruses and uses thereof |
| DE69435209D1 (de) * | 1993-03-31 | 2009-06-10 | Zeon Corp | Polypeptid, dafür kodierende DNA, diese DNA beinhaltender, rekombinanter Vektor, Herstellung eines rekombinanten Virus unter Verwendung dieses Vektors und dessen Anwendung |
| WO1996040880A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Syntro Corporation | Recombinant fowlpox viruses and uses thereof |
| EP2789346A1 (en) | 2013-04-11 | 2014-10-15 | CEVA Santé Animale SA | Fusion polypeptides and vaccines |
| EP3034609A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-22 | Ceva Sante Animale | Recombinant swinepox virus and vaccines |
| EP3254692A1 (en) | 2016-06-10 | 2017-12-13 | Ceva Sante Animale | Multivalent recombinant spv |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5174993A (en) * | 1981-12-24 | 1992-12-29 | Health Research Inc. | Recombinant avipox virus and immunological use thereof |
| WO1986000528A1 (en) * | 1984-07-05 | 1986-01-30 | Genex Corporation | Cloned gene and method for making and using the same |
| FR2571060B1 (fr) * | 1984-10-03 | 1987-01-09 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux vecteurs de clonage et d'expression dans les cellules eucaryotes utilisant le virus de la vaccine |
| EP0218625B1 (en) * | 1985-03-29 | 1995-04-05 | Btg International Limited | Infectious bronchitis virus spike protein |
| AU602875B2 (en) * | 1985-12-18 | 1990-11-01 | British Technology Group Limited | Newcastle disease virus gene clones |
| WO1988002022A1 (en) * | 1986-09-22 | 1988-03-24 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Or | Recombinant poxviruses |
-
1988
- 1988-03-11 JP JP63057947A patent/JP2531729B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-03-26 KR KR88003313A patent/KR960016703B1/ko not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-09-03 US US07/752,982 patent/US5387519A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６７〔８〕（１９８６）ｐ．１５９１−１６００ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5387519A (en) | 1995-02-07 |
| KR880011341A (ko) | 1988-10-27 |
| JPH01168279A (ja) | 1989-07-03 |
| KR960016703B1 (en) | 1996-12-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0284416B1 (en) | Recombinant avipoxyvirus | |
| EP0110385B1 (en) | Process for producing poxvirus recombinants for expression of foreign genes | |
| JP2766984B2 (ja) | 組み換え家禽痘疹ウイルス | |
| KR970000530B1 (ko) | 재조합 아비폭스비루스 | |
| EP0198328B1 (en) | Vaccinia dna | |
| US6998252B1 (en) | Recombinant poxviruses having foreign DNA expressed under the control of poxvirus regulatory sequences | |
| JP2703853B2 (ja) | 組換え鶏痘ウイルス | |
| EP0353851B1 (en) | Fowlpox virus non-essential regions | |
| JP2531729B2 (ja) | 組み換えアビポックスウイルス | |
| JP2781605B2 (ja) | 組み換えアビポックスウイルス | |
| JP2683804B2 (ja) | Ｄｎａ配列、ベクター、組換えウイルス及びｃｈｏ細胞において増殖可能な組換えワクシニアウイルスを用いる方法 | |
| US5286639A (en) | Recombinant avipoxvirus | |
| JP2638622B2 (ja) | 組み換えアビポックスウイルス | |
| JPH03504196A (ja) | 新規組換えワクチニアウイルス発現ベクター及びその選択方法 | |
| EP0261925B1 (en) | Gene for a-type inclusion body of poxvirus, its preparation and use | |
| US6936707B2 (en) | Modified DNA molecule, recombinant containing the same, and uses thereof | |
| JP2638677B2 (ja) | プロモーター、それを含むプラスミド及び組み換えアビポツクスウイルス | |
| JP3924328B2 (ja) | 新規ｄｎａベクター、及び組み換え新規ｄｎａベクターを有効成分とするワクチン | |
| JPH0795956B2 (ja) | ポックスウイルス由来発現制御領域 | |
| US20030059799A1 (en) | Modified DNA molecule, recombinant containing the same, and uses thereof | |
| JP3458880B2 (ja) | 組み換え体、多価組み換え体、及びその作製方法 | |
| JPH0695937B2 (ja) | 組み換えワクチニアウイルスの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S531 | Written request for registration of change of domicile |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313531 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080627 Year of fee payment: 12 |