KR102015893B1 - 뉴캣슬병 바이러스 병원성 신속 감별방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 뉴캣슬병(Newcastle disease) 진단에 관한 것으로, 신규한 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 증폭반응에 의한 뉴캣슬병 바이러스의 검출 및 바이러스 병원성을 신속하게 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트 2종은 하나의 공통 PCR 반응 조건을 가지고 1회 PCR 반응만으로 신속 정확하게 뉴캣슬병 바이러스 분리주를 검출하고, 동시에 검출된 뉴캣슬병 바이러스의 병원성을 진단할 수 있으므로, 시료 간 교차오염의 위험 및 검사 비용을 줄일 수 있다. 또한, 바이러스 분리 및 동정 절차를 거치지 않고도 신속하고 정확하게 뉴캣슬병을 진단할 수 있어, 조기에 차단방역을 실시할 수 있게 함으로서 양계농장 간 전염성과 치사율이 높은 뉴캣슬병의 확산을 차단하여 양계산업의 피해를 최소화할 수 있다.

Description

뉴캣슬병 바이러스 병원성 신속 감별방법{A rapid pathotyping of Newcastle disease virus}
본 발명은 뉴캣슬병(Newcastle disease) 진단에 관한 것으로, 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 증폭반응에 의한 뉴캣슬병 바이러스의 검출 및 바이러스 병원성을 신속하게 진단하는 방법에 관한 것이다.
뉴캣슬병 바이러스(Newcastle disease virus; NDV)는 닭에서 치명적인 뉴캣슬병(Newcastle disease)을 유발하는 병원체이다.
뉴캣슬병(Newcastle disease)은 가금에서 치명적이고 전염성이 강한 제 1종 가축 전염병이다. 뉴캣슬병은 백신 접종으로 예방이 가능한데, 백신을 접종하지 않은 양계 농장에서 뉴캣슬병이 발생할 경우 수주 이내에 농장 축사 내 대부분의 닭이 폐사할 정도로 전염성이 강하며, 적절한 백신을 하지 않는 경우 호흡기 및 소화기 증상이 나타나고 백신 항체가 낮은 산란계나 종계는 산란율이 떨어지거나 중지되어 경제적인 피해를 일으키는 치명적인 질병이다. 예방 접종을 했더라도 접종 시기나 방법이 잘못되어 항체가 높지 않은 닭에서는 다리와 목이 마비되는 신경증상이 나타나기도 한다. 매년 발생주의보를 발표하고 있으나 발생이 계속 증가하고 전국적으로 발생되는 추세에 있으며 양계 농가에 큰 피해를 주고 있다. 뉴캣슬병의 주요증상은 처음에는 졸기 시작하여 콧물, 기침 등의 호흡기 증상이 나타나고 녹색설사를 하다 죽는다. 한국은 일본의 연구자들에 의해 1920년대부터 뉴캣슬병 바이러스에 대해 연구를 하였고, 동남아시아 유래의 바이러스가 영국에 전파되어 서양에 처음으로 알려진 후 현재 전 세계적인 발병이 보고되고 있다. 현재 뉴캣슬병은 아프리카와 아시아 지역 저개발 국가에서 주로 발생하며, 그로 인해 양계산업에 막대한 피해를 입히고 있는 실정이다.
뉴캣슬병 바이러스는 파라믹소비리데(Paramyxoviridae)과 아불라바이러스(Avulavirus)속의 조류파라믹소바이러스 제1형(Avian paramyxovirus type 1, APMV-1)으로 분류된다.
바이러스 입자는 100 내지 500nm 정도이며, 구형에 가까우나 바이러스 입자마다 다양한 형태를 가지고 있다. 바이러스 입자 내부에는 단일 가닥의 음성 RNA 게놈을 가지고 있다. NDV 입자는 뉴클레오캡시드(Nucleocapsid; N) 단백질, 포스포(P) 단백질, 매트릭스(Matirx; M) 단백질, 퓨전(Fusion; F) 단백질, 헤마글루티닌 뉴라미니다제(Hemagglutinin Neuraminidase; HN), 라지(Large; L) 단백질 등 최소한 6 종류의 구조단백질을 포함하고 있다.
뉴캣슬병 바이러스는 외피(envelope)를 가지고 있으며 외피에는 바이러스가 숙주 세포에 결합할 수 있도록 해주는 HN(Haemagglutinin-Neuraminidase) 단백질 및 외피가 숙주 세포와 융합을 일으키도록 하는 F(Fusion) 단백질이 있다. F 단백질과 HN 단백질은 당단백질(glycoprotein)로서 외피의 표면에 분포되어 있다.
NDV F 단백질은 HN 단백질과 함께 바이러스 외피(envelope)를 구성하는 주요 당단백질이다. HN 단백질은 바이러스가 숙주 세포 수용체에 결합하는 역할을 하며, 반면에 F 단백질은 숙주 세포와 융합을 일으키게 유도하여 바이러스 게놈이 숙주 세포에 침투하는 것을 도와주는 역할을 한다. 바이러스 입자 내부에는 N단백질이 RNA 게놈을 감싸면서 뉴클레오캡시드(neucleo-capsid)를 형성한다. 뉴클레오캡시드에 P단백질과 L 단백질로 구성된 폴리머라제(Polymerase) 복합체가 결합되면서 리보뉴클레오캡시드(RNP)를 형성한다. 리보뉴클레오캡시드에서 L단백질은 감염세포 내에서 mRNA를 전사하고 바이러스 게놈을 복제하는 폴리머라제의 역할을 수행한다.
NDV는 현재까지 단일 혈청형만 존재하는 것으로 간주된다. 그러나 NDV 분리주에 따라 유전형과 병원성이 다양한 것으로 알려져 있다.
바이러스 유전형은 NDV F단백질 유전자의 유전자 염기서열을 기초로 유전자 계통도 분석방법으로 결정한다. NDV 유전형은 현재까지 클라스 1형 (class 1)과 클라스 2형 (class 2)으로 크게 구분되며, 클라스 1형은 주로 야생조류와 오리류, 재래시장 등에서 주로 발견되지만 닭 등 가금류에게 치명적인 질병을 일으키지 않는다. 클라스 2형은 야생조류와 가금류에서 분리되며, 현재까지 최소한 16개 이상의 유전형(유전형 I 내지 XVI)이 존재한다. 유전형 I과 유전형 Ⅱ는 대부분 닭에서 질병 피해를 유발하지 않는 바이러스들이지만, 클라스 2형의 나머지 유전형 대부분은 닭에서 매우 치명적인 강독형 NDV이다.
NDV 분리주는 닭에서의 병원성 정도에 따라 강독형 (velogenic), 중간독형 (mesogenic), 약독형 (lentogenic NDV)로 분류한다. 강독형 NDV 분리주의 경우 감염 닭의 대부분(90%이상)이 폐사할 정도로 병원성이 매우 강하다. 중간독형 NDV 분리주는 강독형 NDV에 비해 치사율은 낮지만, 호흡기 증상 등을 심하게 일으킨다. 약독형 NDV 분리주는 닭에서 거의 병증을 유발하지 않는다. 이러한 연유로 약독형 NDV 스트레인은 양계 농장에서 뉴캣슬병 예방 백신으로 사용하고 있다.
세계동물보건기구(OIE)는 중간독형 이상의 NDV(병원성 NDV)에 의한 가금류의 감염을 뉴캣슬병 발생으로 간주한다. 그러므로 양계농장에서 뉴캣슬병 발생이 의심되는 경우 가금 시료 검체로부터 NDV를 분리하여 분리된 바이러스의 병원성을 확인하여야만 뉴캣슬병을 진단할 수 있다. 전통적인 NDV 분리주의 병원성 측정 방법은 NDV 항체가 존재하지 않는 특정병원체부재(SPF) 계태아 종란이나 병아리를 사용하여 측정하였다. 즉, 계태아 종란에서의 평균 치사시간(Mean death time; MDT), 1일령 SPF 병아리에서의 뇌내 강독형지수(Intracerebral pathogencity index; ICPI), 6주령 SPF 닭에서의 정맥내 강독형지수(Intravenous pathogenicity index; ICPI) 등의 생물학적 강독형 평가방법을 사용하였다.
최근 분자유전학적 기법이 발달함에 따라, NDV 감염에 의한 병원성 기전이 규명되어, NDV F 단백질 유전자의 F1/F2 분절부위 아미노산 서열의 차이가 NDV의 병원성을 결정하는 것으로 밝혀졌다.
구체적으로 기술하면, NDV 입자에 존재하는 F 단백질은 비활성 전구체 형태(F0)로 존재하지만, 골지 막을 통해 숙주세포 내부로 이동하는 동안 숙주 세포의 단백질 분해효소에 의해 활성 형태인 F1과 F2 단백질로 분절된다.
이때 F1 단백질 소단위체(subunit)의 아미노 말단에서 소수성 도메인(domain)이 노출됨으로서 F단백질이 생물학적 활성을 띄어 숙주 세포막과 바이러스 외피막간 융합이 이루어지도록 유도한다.
NDV F단백질 분절 부위를 구성하는 F 단백질의 112번째부터 117번째 아미노산 배열은 병원성 NDV 분리주와 비병원성 NDV 분리주 간 차이를 나타낸다.
구체적으로 기술하면, 병원성 NDV 분리주의 경우 F단백질의 112번째부터 116번째 아미노산 배열은 R-R-Q-K/R과 같은 연속적인 염기성 아미노산 배열을 가지고 있다. 반면, 비병원성 NDV 분리주의 경우 G-R-Q-G-R과 같이 비연속적인 염기성 아미노산 염기서열을 가지고 있다.
NDV F2 단백질의 카르복실 말단을 구성하는 117번째 아미노산의 경우에도 병원성 NDV와 비병원성 NDV 분리주 간 차이를 보인다. 병원성 NDV 분리주는 페닐알라닌(phenylalanine; F)을 가지고 있지만 비병원성 NDV 분리주는 류신(leucine; L)을 가지고 있다.
이러한 F1/F2 분절부위 아미노산 서열의 차이는 분절 부위에 작용하는 단백질 분해효소의 차이를 초래한다. 즉, 병원성 NDV 분리주의 경우 대부분의 숙주 세포에 존재하는 퓨린-유사(furin-like) 효소에 의해 F단백질이 분절되지만, 비병원성 NDV 분리주는 호흡기 점막과 소화기 점막에 제한적으로 존재하는 트립신-유사(trypsin-like) 효소에 의해서 분절이 이루어진다.
이러한 특성으로 말미암아 NDV 분리주에 따라 전신 감염(병원성 바이러스)이나 국소 감염(비병원성 바이러스)을 유발하여 NDV 분리주의 병원성이 결정된다. 따라서 병원성 NDV와 비병원성 바이러스 간 F1/F2 단백질 분절부위의 아미노산 서열 차이를 만드는 코딩 유전자 염기서열을 기초로 하여 병원성 NDV 분리주를 신속하게 검출하는 다양한 형태의 유전자 진단법이 여러 연구자들에 의해 개발되었다. NDV 검출 유전자 검사방법으로는 역전사효소 PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 실시간 PCR(real-time PCR) 등이 대표적이다.
현재까지 NDV 분리주를 감별하는 유전자 진단법은 F1/F2 분절부위 유전자 염기서열을 포함하는 F단백질 유전자 부위, 또는 M 및 F 단백질 유전자 부위를 증폭하거나 검출하는 진단 방법을 적용하고 있다. 이들 유전자 진단 방법은 주로 병원성 NDV 분리주만을 특이적으로 검출하거나, 비병원성 NDV 분리주와 병원성 NDV 분리주를 감별하는 방식으로 개발되었다 (Fuller et al., Arch Virol 154:929-937, 2009; Seal et al., J Clin Microbiol 33:2624-2630, 1995; Parkas et al., J Clin Microbiol 2114-2123, 2009; Steyer et al., J Virol Methods 166:28-36, 2010). 한편 NDV 분리주를 모두 검출하는 RT-PCR법과 강독형 NDV를 특이적으로 검출하는 RT-PCR법을 동시에 수행하는 유전자 진단법이 개발되기도 하였다(Kwon et al., Korean J Vet Res 46(4): 371-379, 2006).
또한, 국내의 경우 뉴캣슬병 진단을 위하여 가축질병병성감정 실시기관에서 사용하고 있는 뉴캣슬병 RT-PCR 진단키트를 제공하고 있다. 종래의 뉴캣슬병 RT-PCR 진단키트는 모든 NDV 분리주를 검출하고 병원성 NDV 분리주를 감별하도록 설계되어 있으나, NDV 검출과 병원성 NDV 감별을 위한 RT-PCR은 별개의 구성으로 되어 있어 동일 시료에 대하여 각각 별도로 두 번 실험해야 하고, 클래스 I의 NDV 분리주를 포함하여 일부 유전형의 NDV 분리주를 검출하지 못하는 한계가 있었다.
결론적으로, 현재까지 개발되었거나 개발되어 상용화되어 있는 종래의 뉴캣슬병 유전자 진단법은 몇 가지 한계를 가지고 있었다.
첫째, 종래의 유전자 진단법들은 NDV F 단백질 유전자만을 주요 증폭부위로 적용하고 있다. 그러나 NDV F 단백질 유전자는 NDV 분리주들 사이에 심한 유전적 변동성이 존재하는 유전자 부위로 알려져 있다. 그러한 까닭으로 NDV 분리주 중 일부를 검출하지 못하는 한계를 가지고 있다 (Catolli et al., J Vet Diagn Invest 23(4) 637-656, 2012).
둘째, 종래의 NDV 유전자 진단법 중에는 병원성 NDV만을 검출함을 목적으로 하고 있다. 그러나 이러한 유전자 진단법은 유전적 차이가 존재하는 병원성 NDV 분리주 일부를 검출하지 못하는 문제점을 가지고 있다(Fuller et al., Arch Virol 154:929-937, 2009;Seal et al., J Clin Microbiol 33:2624-2630, 1995). 이 경우 일부 진단 시료에서 병원성 NDV에 대해 가성 음성(false negative) 결과가 나올 경우 양계농장에서 초기 방역 조치의 지연으로 치명적인 질병 피해를 초래할 수 있다.
셋째, 비병원성 NDV 분리주와 병원성 NDV를 감별하는 종래의 유전자 진단법의 경우, 일부 NDV 분리주를 검출하지 못하는 문제점 이외에도 서로 다른 프라이머 세트를 사용하여 각각 RT-PCR 검사법을 실시해야 하는 번거로운 문제점을 가지고 있다(Parkas et al., J Clin Microbiol 2114-2123, 2009; Steyer et al., J Virol Methods 166:28-36, 2010; Kwon et al., Korean J Vet Res 46(4): 371-379, 2006). 이와 같이 검사 시료를 반복적으로 취급하는 과정에서 검체 시료 유전자가 교차 오염되는 문제가 발생할 소지가 있다.
따라서, 상기 문제점들을 해소하고 보다 정확한 뉴캣슬병 바이러스의 신속한 검출을 위한 새로운 방법에 대한 필요성이 있다.
이에, 본 발명자들은 종래의 유전자 진단법이 가지고 있는 여러 가지 문제점을 동시에 극복하고자 NDV 분리주간 유전적 변동성이 낮은 L단백질 유전자 부위를 증폭 부위로 삼아 신규 프라이머를 제작하여 모든 NDV를 검출할 수 있도록 함으로서 NDV 공통항원 검출효율을 높이고자 하였다. 또한, 병원성 NDV 분리주들을 대상으로 유전자 비교 분석을 실시하고, 종래의 유전자 진단법에서 사용하는 NDV F1/F2 분절부위 유전자 서열을 비교 분석하여 병원성 NDV 분리주만 검출할 수 있도록 신규 프라이머 염기서열을 제작하여 뉴캣슬병 의심사례 진단과정에서 발생할 수 있는 가성 음성 진단 가능성을 최소화하고자 하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 모든 NDV 분리주의 L유전자를 검출하는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 병원성 NDV 분리주의 F유전자를 특이적으로 검출하는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 뉴캣슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) 검출 및 병원성 진단용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단용 조성물, 상기 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단용 조성물을 포함하는 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단용 키트 및 상기 프라이머 세트를 사용한 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단에 대한 정보제공방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 뉴캣슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) 검출 및 병원성 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단용 조성물을 포함하는, 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 시료의 RNA를 추출하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계에서 추출된 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머세트;를 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계;를 포함하는, 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단에 대한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트 2종은 하나의 공통 PCR 반응 조건을 가지고 1회 PCR 반응만으로 신속 정확하게 뉴캣슬병 바이러스 분리주를 검출하고, 동시에 검출된 뉴캣슬병 바이러스의 병원성을 진단할 수 있으므로, 시료 간 교차오염의 위험 및 검사 비용을 줄일 수 있다. 또한, 바이러스 분리 및 동정 절차를 거치지 않고도 신속하고 정확하게 뉴캣슬병을 진단할 수 있어, 조기에 차단방역을 실시할 수 있게 함으로서 양계농장 간 전염성과 치사율이 높은 뉴캣슬병의 확산을 차단하여 양계산업의 피해를 최소화할 수 있다.
도 1은 NDV 공통항원(common type)과 병원성 NDV 항원(Pathotype)을 동시에 검출하기 위한 duplex RT-PCR 프라이머 세트를 나타낸 도이다.
도 2는 검체시료에 대한 duplex RT-PCR 검사 실시결과를 나타낸 도이다. (M: 마커, 1: NDV 양성 시료, 2: 병원성 NDV 양성 시료, 3: NDV 음성 시료)
도 3은 종래의 NDV 검출방법과 본 발명의 프라이머 세트 2종을 이용한 검출 방법에 따른 결과를 비교하여 나타낸 도이다. 도 3의 A는 종래의 RT-PCR방법(공통항원), 도 3의 B는 종래의 RT-PCR방법(병원성 NDV 항원), 도 3의 C는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 duplex RT-PCR방법으로 검체 시료를 검사한 결과를 나타낸 것이다. (M: 마커, 1: LaSota(NDV), 2: H170(NDV), 3: Kr005(NDV), 4: APMV-15(UPO216))
도 4는 duplex RT-PCR 방법의 특이도 검사결과를 나타낸 도이다. (M: 마커, 1; negative, 2: KR005(NDV), 3: Lasota(NDV), 4: IBV, 5: IBDV, 6:AMPV)
도 5는 duplex RT-PCR 방법에 의한 NDV 검출한계 측정결과를 나타낸 도이다.
도 6은 말레이시아 NDV 시료에 대한 duplex RT-PCR 적용결과를 나타낸 도이다. (1-14: 말레이시아 NDV 시료, V4: V4백신 스트레인, La: Lasota 백신스트레인)
도 7은 파키스탄 NDV 검사시료에 대한 duplex RT-PCR 적용결과를 나타낸 도이다. (M: 마커, Neg: negative, P: P농장 시료, A1-2: A농장 시료)
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 뉴캣슬병바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) 검출 및 병원성 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트는 모든 NDV 분리주를 검출하기 위한 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 PCR 프라이머 세트, 병원성 NDV 분리주를 특이적으로 검출하기 위한 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 PCR 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트는 병원성과 관계없이 모든 NDV 분리주를 검출하기 위하여 제작한 프라이머 세트이다. NDV는 단일 혈청형이지만 게놈 전체를 기준으로 NDV 스트레인 간 최대 15% 이상 유전적인 차이가 존재하고 있어서 모든 NDV에 보존되어 있는 유전적 부위를 찾아내는 것은 쉽지 않은 일이다. 이에 본 발명의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트는 모든 NDV 분리주를 검출하기 위하여 유전적으로 매우 안정적으로 보존되어 있는 NDV L단백질 유전자를 타겟으로 하는 것을 특징으로 한다. 이를 통해 NDV 분리주들 간 유전적 변동성이 매우 높은 F 단백질 유전자의 초가변 부위(hypervariable region)를 증폭부위로 하는 종래의 유전자 진단법과 달리, NDV 분리주간 유전적 변동성이 낮은 L 단백질 유전자 부위를 증폭 부위로 삼아 신규 프라이머를 제작하여 모든 NDV를 검출할 수 있도록 함으로서 NDV 공통항원 검출효율을 높이고자 하였다.
본 발명의 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트는 병원성 NDV 분리주의 F 단백질 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있도록 제작한 프라이머 세트이다. NDV의 F 단백질 분절부위는 바이러스의 병원성을 결정하는 모티프 부위로 알려져 있다. 신규한 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트는 병원성 NDV가 특이적으로 가지고 있는 F 단백질 분절 부위 염기서열을 포함하여 구성된 것을 특징으로 한다. 그러므로 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트는 병원성 NDV를 검출할 수 있지만 비병원성 NDV를 검출하지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단용 조성물을 포함하는, 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 프라이머 서열을 이용하여 검사 시료로부터 병원성 NDV를 검출하여 뉴캣슬병을 진단하기 위한 키트는 1) 진단의뢰 시료로부터 고순도의 RNA를 추출하기 위한 용해 용액, 세척 용액, 용출 용액, 침전 용액 및 이에 사용되는 용기, 및 2) 추출된 RNA를 이용하여 cDNA 합성과 이를 주형으로 한 PCR 증폭 산물을 만들기 위한 반응용 완충용액, dNTP 및 역전사 효소, 중합효소, 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 프라이머 세트, 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 프라이머 세트를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 뉴캣슬병 바이러스 진단용 키트는 감염 숙주의 검사 시료로부터의 바이러스 분리 및 동정 그리고 NDV 분리주의 병원성 측정 등 장기간 소요되는 진단절차 없이도, 감염 숙주의 병변 조직 또는 장기로부터 직접 NDV 검출 및 분리 바이러스의 병원성 감별이 가능한 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용한 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단에 대한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 NDV 병원성 진단에 대한 정보제공방법은 a) 시료의 RNA를 추출하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계에서 추출된 RNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트;를 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계를 포함한다.
이하, 본 발명의 각 단계를 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서, 상기 a) 단계에서 검출 및 진단하고자 하는 시료는 바이러스를 증식한 계태아 종란 요양막액일 수 있고, 세포배양을 통하여 증식한 닭 적혈구를 응집시키는 성질을 가진 바이러스액이나 뉴캣슬병 감염으로 의심되는 병변 조직 또는 장기 시료일 수 있다. 따라서 본 발명의 시료는 계태아 종란 요양막액, 바이러스액, 조직, 분변, 및 분비물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 a) 단계에서 검출하고자 하는 시료 샘플은 시료 샘플을 실온 또는 그 이상의 온도에 보관할 경우 바이러스 RNA가 쉽게 파괴될 수 있다. 그러므로 시료 샘플은 채취 후 가능한 빠른 시일 내에 검사에 사용하도록 한다. 수 일 이상 장기간 보관해야 하는 경우 냉장 온도(4℃) 또는 냉동(-20℃이하)에서 보관하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단계에서 사용하는 프라이머 세트는 서열번호 1과 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트와 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트를 포함한다. 서열번호 1과 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트는 모든 NDV를 검출하기 위한 용도로 제작되었고, 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트는 병원성 NDV 분리주를 특이적으로 검출하기 위하여 제작되었다. 본 발명의 프라이머 세트 2종을 각각 독립적으로 PCR 튜브에 첨가하여 사용하여 통상적인 RT-PCR 방법으로 적용할 수도 있으나, 바람직하게는, NDV 검출 및 NDV 병원성 감별을 신속하게 진행하기 위하여 상기 프라이머 세트 2종을 하나의 PCR 튜브에 모두 첨가하여 사용하는 duplex RT-PCR 방식을 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단계의 증폭반응은 RT-PCR(역전사 중합효소 연쇄반응), real-time PCR(실시간 중합효소 연쇄반응), Inverse PCR(역 PCR), duplex RT-PCR(이중 PCR) 및 Multiplex PCR(다중 PCR) 중 하나일 수 있고, 바람직하게는 duplex RT-PCR일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단계에서 NDV F 단백질 유전자를 증폭하기 위하여 역전사 효소, 중합효소, dNTP가 포함된 반응물을 사용하여 하나의 PCR 튜브에서 cDNA 반응과 PCR 반응을 연속 실시할 수 있다. 본 발명의 프라이머 세트 2종은 공통의 PCR 조건을 갖고 있어 한번의 PCR 반응에 동시에 적용하는 것이 가능하다. PCR 반응조건은 통상적으로 DNA변성-프라이머결합-DNA 신장의 3단계 반응을 1사이클로 할 수 있다. 바람직하게는, DNA변성-프라이머결합 및 DNA 신장의 2단계 반응을 1사이클로 함으로서 반응시간을 단축하여 진단 소요시간을 단축할 수 있다.
구체적인 PCR 조건으로는 40~50℃에서 20~40분 반응 후 90~95℃에서 1~10분 반응시키고 난 다음, 90~95℃에서 10초~2분간 변성 단계(denaturation); 50~60℃에서 10초~2분간 어닐링 단계(annealing); 50~75℃에서 10초~2분간 합성 단계(extension)를 총 10~40회 반복하여 PCR 증폭을 실시할 수 있으며, 상기 반응 온도 및 반응 시간 조건은 당업자가 적절하게 변형하여 수행할 수 있다. 보다 바람직하게는, 45℃에서 30분 반응 후 94℃에서 5분 반응시키고 난 다음, 94℃에서 30초간 변성시킨 후, 56℃에서 어닐링 및 합성을 1분 사이클로 40회 반복 실시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단계에서 NDV F 유전자 증폭 여부와 증폭된 유전자 산물의 크기의 확인은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있고, 바람직하게는 겔 전기영동일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 가장 바람직하게는, 1 내지 2% 농도의 아가로스 겔을 사용하여 전기영동을 실시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단계에서 NDV의 병원성을 감별하는 방법은 다음과 같다. 증폭 산물이 386bp인 경우 NDV 공통항원 양성, 386bp와 함께 229bp인 밴드가 동시에 관찰될 경우 병원성 NDV 양성으로 판정한다. 유전자 증폭밴드가 관찰되지 않는 경우 NDV 음성으로 판정한다. 병원성 NDV 분리주와 비병원성 NDV 분리주를 감별하는 검사를 각각 서로 다른 PCR 튜브에서 독자적으로 수행하는 종래의 유전자 진단법과 달리, 본 발명은 단 하나의 PCR 튜브에서 NDV 검출 및 병원성 진단이 동시에 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예를 통하여 NDV 검출 한계를 측정한 결과, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트는 103. 0EID50/0.1㎖ 농도 이상의 NDV를 검출(386bp)할 수 있고, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트는 103.0EID50/0.1㎖ 농도 이상의 병원성 NDV를 검출(229bp) 할 수 있다. 따라서 본 발명의 각 프라이머 세트의 NDV에 대한 검출한계는 103. 0EID50/0.1㎖로서 상기 농도의 시료에서도 NDV의 검출 및 병원성 진단이 가능하다.
이와 같이, 본 발명의 프라이머 세트 2종 및 이를 이용한 증폭반응에 의한 뉴캣슬병 바이러스 진단 방법은 종래의 유전자 진단법에 비해 특이성 및 민감성이 우수할 뿐만 아니라, 하나의 PCR 튜브에서 뉴캣슬병 바이러스의 검출 및 병원성을 신속하게 진단하므로 시간과 노동력을 크게 줄일 수 있는 경제적이고 효율적인 장점이 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 뉴캣슬병 바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 제작
NDV 공통항원 및 병원성 NDV를 동시에 검출하기 위한 duplex RT-PCR을 개발하기 위하여 프라이머 세트를 제작하였다. 본 발명의 프라이머 세트를 개발하기 위하여, 유전자은행(Genbank)에 등재된 NDV(APMV-1) 17개 스트레인 및 다른 APMV 혈청형 7개 스트레인 등 총 24개 스트레인의 유전자 염기서열 정보를 사용하였다.
모든 NDV 분리주(공통항원)를 검출하기 위한 프라이머 세트를 제작하기 위하여 NDV 스트레인 간 유전적 변동성이 적은 L유전자 부위를 프라이머 표적 부위로 선정하였다. NDV L 유전자 비교분석을 통하여, 모든 NDV를 검출할 수 있도록 일부 차이가 나는 핵산 염기서열을 보정하여 서열번호 1과 서열번호 2로 표시되는 프라이머를 제작하였다. NDV SF2 스트레인(유전자은행 accession no. KF306265)을 기준으로 게놈의 9428번째 위치에서 시작하는 부위에서 서열번호 1로 표시되는 정방향(forward) 프라이머를 제작하였고, NDV 게놈의 9794번째 위치에서 시작되는 역방향(reverse) 프라이머를 제작하였다. 서열번호 1과 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트 사용시 예상되는 PCR 증폭 산물의 크기는 386bp이며, 구체적인 프라이머 서열은 하기와 같다.
서열번호 1 (정방향 프라이머): 5'-AAY CAR GCA GCD GAG ATG TTR TG-3'
서열번호 2 (역방향 프라이머): 5'-ACA TGT GCG ATT GCC TTG TC-3'
병원성 NDV 분리주만을 특이적으로 검출하기 위하여 NDV 병원성 모티프 부위인 F 단백질 분절부위를 표적부위로 선정하였다. NDV F 유전자 염기서열 분석을 통하여, 병원성 NDV만을 검출할 수 있도록 핵산 염기서열을 보정하여 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 프라이머를 제작하였다. NDV SF2 스트레인(유전자은행 accession no. KF306265)을 기준으로 NDV 게놈의 4883번째 위치에서 시작하는 부위를 서열번호 3으로 표시되는 정방향(forward) 프라이머를 제작하였고, NDV 게놈의 5085번째 위치에서 시작되는 서열번호 4로 기재된 역방향(reverse) 프라이머를 제작하였다. 서열번호 3과 서열번호 4로 기재되는 프라이머 세트 사용시 예상되는 PCR증폭 산물의 크기는 229bp이며, 구체적인 프라이머 서열은 하기와 같다.
서열번호 3 (정방향 프라이머): 5'-CTC CTA GGA GAC AGA AAC GCT TTA-3'
서열번호 4 (역방향 프라이머): 5'-ACA AAC TGT TGC ATC TTC CCA A-3'
본 발명의 duplex RT-PCR을 위하여 제작한 프라이머 세트를 도 1에 도식화하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, NDV 공통항원을 검출하기 위해 NDV L 유전자를 타겟으로 하는 서열번호 1과 서열번호 2로 표시되는 “common type 프라이머 세트” 및 병원성 NDV 항원을 검출하기 위해 NDV F 유전자를 타겟으로 한 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 “pathotype 프라이머 세트”를 제작하였다.
실시예 2: 프라이머 세트를 이용한 duplex RT- PCR 실시
2.1 검체 시료로부터 핵산추출
검체로부터 핵산을 추출하기 위해 범용적으로 사용하고 있는 바이러스 핵산 추출제품을 이용하여 핵산을 추출하였다. 추출 방법은 각 추출 키트의 사용설명서대로 진행하였다. 본 실시예에서는 ㈜인트론바이오테크놀로지社의 LiliFTM PGS DNA/RNA Extraction Kit의 방법을 사용하여 다음과 같은 과정으로 핵산을 추출하였다. 검체 150μl를 1.5ml 코니컬 튜브에 넣고, Lysis Buffer 300μl를 첨가 후 15초 간 vortex한 후 10분간 실온에서 방치하였다. Binding Buffer 300μl 를 첨가하여 혼합한 다음 spin column에 넣고 13,000rpm에서 1분간 원심분리하였다. 그 후 Washing Buffer A 500μl를 spin column에 넣고 13,000rpm에서 1분간 원심분리한 다음, Washing Buffer B 500μl를 첨가하여 다시 동일한 방법으로 원심 분리하였다. 그 후 Elution Buffer 30-60μl를 spin column에 첨가한 후 1분간 방치하였다가 13,000rpm에서 1분간 원심분리하였다.
2.2 RT- PCR 실시
PCR 프라이머(서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 각 7pmol)와 함께, 역전사효소, 중합효소, dNTPs 등이 들어있는 RT-PCR premix((주)인트론바이오테크놀로지社))가 들어있는 각 PCR tube에 DNase/RNase free water를 18μl를 첨가한 후 상기에서 추출한 검체 핵산 2μl를 첨가하였다. 이때 음성 대조 반응 tube의 경우 DNase/RNase free water를 2μl를 더 첨가하였다. 그 후 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR 반응은 45℃에서 30분 반응 후 94℃에서 5분 반응시키고 난 다음, 94℃에서 denaturation 30초와 56℃에서 annealing 및 extention 1분 사이클로 40회 반복 실시하는 조건에서 실시하였다.
2.3 검사결과 판정
RT-PCR반응이 완료되면, Etidium Bromide 및 RedSafe Nucleic acid staining solution ((주)인트론바이오테크놀로지社) 등 밴드(band) 확인이 가능한 염색용액이 함유된 1.5% 아가로스를 준비하고, 상기 아가로스 겔에 RT-PCR 반응물 7μl를 로딩한 후 100볼트로 30분 내지 40분간 전기영동을 실시하였다. 전기영동 후 UV transilluminaor를 이용하여 결과를 확인하였다. 전기영동 결과 증폭된 RT-PCR 산물로서 386bp가 존재할 경우 NDV 공통항원 양성, 229bp가 존재할 경우 병원성 NDV 양성으로 판정한다. 검체 시료에 대한 duplex RT-PCR 검사의 실시결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 1번 column에서 386bp 밴드가 관찰되므로 1번은 NDV 공통항원 양성이며, 2번 column에서는 386bp 밴드뿐만 아니라 229bp 밴드도 관찰되므로 병원성 NDV 양성임을 알 수 있음을 확인하였다. 또한, 어떤 밴드도 관찰되지 않은 3번 column은 NDV 음성 시료임을 확인하였다.
실시예 3: 종래의 방법과 NDV 검출능력 비교
실시예 1에서 제작한 서열번호 1 내지 4로 기재되는 프라이머 세트를 이용한 신규한 duplex RT-PCR 키트가 NDV만을 특이적으로 검출하고 검출된 NDV의 병원성을 감별할 수 있는지 유효성 평가를 실시하였다. 신규한 duplex RT-PCR 방법의 NDV 검출 효능 평가를 비교하기 위하여 종래의 RT-PCR 방법((주)인트론바이오테크놀로지社)과 병행하여 실시하였다. 신규한 duplex RT-PCR 키트의 효능 평가를 위하여 농림축산검역본부 세계동물보건기구(OIE) 뉴캣슬병 표준실험실에서 보관 중인 NDV 3종과 다른 조류파라믹소바이러스 1종을 사용하었다. 신규한 duplex RT-PCR 방법에 의해 검체 시료를 검사한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3의 A 및 B에는 종래의 RT-PCR방법에 의한 검체 시료의 검사 결과를 나타내었다. A는 공통항원을 검출하는 종래의 RT-PCR 방법에 의한 검사결과를, B는 병원성 NDV 항원을 검출하는 종래의 RT-PCR 방법에 의한 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 3의 A 및 B에 나타낸 바와 같이, 종래의 RT-PCR 방법의 경우 평가한 NDV 3종 중 2종에서 NDV를 검출하였고(1, 3번 column), 2번 column에서는 밴드가 관찰되지 않았으므로 class I에 해당하는 NDV 1종(H170)을 검출하지 못하는 것을 확인하였다. 반면 4번 column에서도 밴드가 관찰되어 다른 조류파라믹소바이러스(APMV-15) 1종에서도 양성 반응을 보이는 것을 확인하였다.
도 3의 C에는 신규한 duplex RT-PCR에 의한 검체 시료의 검사 결과를 나타내었다. 신규한 duplex RT-PCR의 경우 1, 2, 3번 column 모두에서 밴드가 관찰되어 NDV 3종 모두 검출함을 확인하였고, 4번 column에서는 밴드가 관찰되지 않아 다른 조류파라믹소 바이러스(APMV-15)에서는 양성반응을 나타내지 않음을 확인하였다.
따라서, 일부 NDV 스트레인을 검출하지 못하고, 다른 조류파라믹소바이러스에 대해 비특이 양성반응을 보이는 종래의 방법의 문제점을 극복했다는 점에서 신규한 duplex RT-PCR 방법은 민감도와 특이도가 개선되었음을 확인하였다.
실시예 4: 신규한 Duplex RT- PCR 방법의 비특이 반응여부 조사
실시예 1에서 제작한 서열번호 1 내지 4로 기재되는 프라이머 세트를 이용한 신규한 duplex RT-PCR 방법이 검체 시료에서 NDV만을 특이적으로 검출하는지를 알아보기 위하여, 다른 가금바이러스 병원체 검체들을 대상으로 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 duplex RT-PCR을 실시하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 실험에 사용되는 바이러스 시료는 농림축산검역본부 세계동물보건기구 뉴캣슬병 표준실험실에서 보관중인 Infectious bronchitis virus(IBV), Iinfectious bural diseas virus (IBDV), Avian metapneumovirus(AMPV)를 사용하였다. 양성 대조로 사용된 NDV 스트레인은 LaSoat(비병원성 NDV) 및 KR005(병원성 NDV) 스트레인을 포함하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, RT-PCR 증폭산물을 전기영동하여 결과를 판독했을 때, 대조 그룹으로 포함된 비병원성 NDV LaSota(3번 column)는 386bp의 밴드가, 병원성 NDV KR005(2번 column)에서는 386bp와 229bp 두 종의 밴드가 모두 관찰되었다. 그러나 NDV가 아닌 타 가금바이러스 검체 시료(4, 5, 6번 column)에서는 이러한 밴드가 관찰되지 않았다. 따라서 신규한 duplex RT-PCR 방법은 NDV 이외의 타 가금바이러스 병원체는 검출하지 않아 NDV를 특이적으로 검출함을 확인하였다.
실시예 5: 뉴캣슬병 바이러스 시료의 검출 한계 농도 측정
본 발명의 duplex RT-PCR 방법으로 검사 시료에서 NDV를 검출하고 NDV의 병원성을 판별할 수 있는 NDV의 검출 한계를 측정하였다. 구체적으로, 비병원성 NDV LaSota 스트레인과 병원성 NDV KR005 스트레인을 사용하였다. 상기 NDV 스트레인은 계태아 종란에 접종하여 증식시킨 바이러스로서, 바이러스 역가는 107EID50/0.1㎖이었다. NDV 바이러스 원액을 인산완충용액(PBS)로 10진 단계 희석하여 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 duplex RT-PCR를 실시한 후 전기영동을 실시하여 특이유전자 증폭여부를 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 한편, 여기에서 상기 EID50이란 특정병원체 부재(SPF) 계태 종란에 접종하였을 때 접종란의 50%가 감염시킬 수 있는 바이러스 농도를 의미한다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 모든 NDV를 검출하는 386bp 유전자 증폭밴드는 바이러스 원액을 10-4배 희석한 농도까지 NDV를 검출할 수 있었다. 이로써 NDV 공통항원을 검출하는 duplex RT-PCR 방법의 NDV 검출한계 농도는 103. 0EID50/0.1 ㎖임을 확인하였다. 또한, 병원성 NDV를 특이적으로 검출하는 229bp의 유전자 증폭 밴드의 경우에도 바이러스 원액을 10-4배 희석한 농도까지 NDV를 검출할 수 있었으므로 병원성 NDV 검출한계 농도는 103. 0EID50/0.1㎖임을 확인하였다.
상기 실험 결과에 따라 NDV 검출 및 병원성 판별을 위한 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 duplex RT-PCR법의 검출 한계는 103. 0EID50/0.1㎖ 임을 확인하였다. 따라서, 의심농장의 닭 검체시료에서 병원성 NDV를 검출하여 뉴캣슬병을 진단하는 데 본 발명인 신규한 duplex RT-PCR 방법이 유용함을 확인하였다.
실시예 6: 뉴캣슬병 감염시료 검사에의 적용
6.1 말레이시아 유행 NDV 검출
실시예 1에서 제작한 서열번호 1 내지 4로 기재되는 프라이머 세트를 이용한 신규한 duplex RT-PCR방법이 현재 뉴캣슬병 상재 발생국인 말레이시아에서 유행하는 NDV를 검출하고 병원성을 감별할 수 있는지 평가하였다. 이를 위하여 대한민국 농림축산검역본부에 있는 뉴캣슬병 OIE 표준실험실이 보유하고 있는 말레이시아 NDV 시료 14종의 병원성 NDV가 실험에 사용되었다. 대조그룹으로서 비병원성 NDV인 V4와 LaSota 백신스트레인이 포함되었다. 말레이시아 NDV 검체 시료에 대하여 상기 실시예 3의 방법으로 duplex RT-PCR을 실시하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 말레이시아 병원성 NDV 14개의 시료에서 모두 386bp와 229bp의 유전자 밴드가 증폭되었다. 반면 대조 그룹으로 사용한 비병원성 NDV 2종(V4, La)은 모두 386bp의 유전자 밴드만이 관찰되었다. 따라서 본 발명인 신규한 duplex RT-PCR방법은 말레이시아 병원성 NDV를 모두 검출할 수 있어 동남아시아에서 유행하는 뉴캣슬병을 진단하는데 유용함을 확인하였다.
6.2 파키스탄 뉴캣슬병 의심시료의 진단
본 발명의 신규한 duplex RT-PCR방법이 현재 뉴캣슬병 상재 발생국인 파키스탄에서 유행하는 NDV를 검출하고 병원성을 감별할 수 있는지 평가하였다. 이를 위하여 대한민국 농림축산검역본부에 있는 세계동물보건기구 뉴캣슬병 표준실험실에 의뢰되어 뉴캣슬병 양성으로 판정된 파키스탄 P 농장(1개 시료)과 A 농장(2개 시료)의 폐사닭 조직(맹장편도)에 대하여 상기 실시예 2의 방법으로 duplex RT-PCR을 실시하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 뉴캣슬병 진단결과는 뉴캣슬병 표준진단법인 바이러스 분리검사법 결과와 비교하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 이들 시료를 본 발명의 duplex RT-PCR 방법으로 검사했을 때 검사 시료 모두 386bp와 229bp의 유전자 밴드가 증폭되어 병원성 NDV 양성으로 판정되었다. 한편, P농장과 A농장 시료 모두 표준진단법(바이러스 분리검사법)으로 진단검사를 실시한 결과 병원성 NDV 양성으로 판정되어, 본 발명의 duplex RT-PCR 방법으로 검사한 결과와 표준 진단법 진단 결과가 일치하였다. 따라서, 신규한 duplex RT-PCR방법이 중앙아시아에 위치한 파키스탄에서 유행하는 병원성 NDV를 감염 닭 조직시료에서 직접 진단하는데 있어서 유용함을 확인하였다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) INTRON BIOTECHNOLOGY CO., LTD <120> A rapid pathotyping of Newcastle disease virus <130> QIA1-9P <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 aaycargcag cdgagatgtt rtg 23 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 acatgtgcga ttgccttgtc 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 ctcctaggag acagaaacgc ttta 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 acaaactgtt gcatcttccc aa 22

Claims (9)

  1. 뉴캣슬병 바이러스의 L 유전자를 타겟으로 하는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및
    병원성 뉴캣슬병 바이러스의 F 유전자를 타겟으로 하는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는, 뉴캣슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) 검출 및 병원성 진단용 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는, 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단용 조성물.
  5. 제4항의 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단용 조성물을 포함하는, 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단용 키트.
  6. a) 시료의 RNA를 추출하는 단계; 및
    b) 상기 a) 단계에서 추출된 RNA를 주형으로 하고, 뉴캣슬병 바이러스의 L 유전자를 타겟으로 하는 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 병원성 뉴캣슬병 바이러스의 F 유전자를 타겟으로 하는 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트;를 이용하여 증폭반응을 수행하는 단계;
    를 포함하는, 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단에 대한 정보제공 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 a) 단계의 시료는 계태아 종란 요양막액, 바이러스액, 조직, 분변, 및 분비물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단에 대한 정보제공 방법.
  8. 제6항에 있어서, 증폭산물이 386bp 단독일 경우 비병원성 뉴캣슬병 바이러스로 판단하는, 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단에 대한 정보제공 방법.
  9. 제6항에 있어서, 증폭산물이 386bp 및 229bp를 모두 포함할 경우 병원성 뉴캣슬병 바이러스로 판단하는, 뉴캣슬병 바이러스 검출 및 병원성 진단에 대한 정보제공 방법.
KR1020170058824A 2017-05-11 2017-05-11 뉴캣슬병 바이러스 병원성 신속 감별방법 KR102015893B1 (ko)

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