PT1088077E - Clones infecciosos do vírus da doença de newcastle, vacinas e ensaios de diagnóstico - Google Patents

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ΡΕ1088077 1 DESCRIÇÃO "CLONES INFECCIOSOS DO VÍRUS DA DOENÇA DE NEWCASTLE, VACINAS E ENSAIOS DE DIAGNÓSTICO" A invenção refere-se a vírus da doença de New-castle infecções de aves domésticas. O vírus da doença de Newcastle (NDV) é um dos patogénios de aves mais diversos e mortíferos. A ocorrência quase simultânea da doença de Newcastle como uma nova doença evidente em várias localizações geográficas diferente e a grande variação no tipo e gravidade da doença provocou alguns problemas com a nomenclatura. A doença foi denominada pseudo peste das aves de capoeira, pseudo praga das aves domésticas, peste aviária, distúrbio aviário e pneumoencefalite aviária. A importância da doença é principalmente devida ao desenvolvimento da indústria das aves domésticas durante o século XX numa indústria altamente eficiente que é dependente do comércio intensivo entre países.

Assume-se geralmente que o primeiro surto da doença de Newcastle ocorreu em 1926 em Java, Indonésia, e em Newcastle-upon-Tyne, Inglaterra (Kraneveld, 1926; Doyle, 1927) . 0 nome de doença de Newcastle foi criado por Doyle 2 ΡΕ1088077 como um nome temporário para evitar um nome descritivo que poderia ser confundido com outras doenças. Mais tarde tornou-se claro que outras doenças menos severas eram provocadas por virus indistinguíveis de NDV. Nos EUA, uma doença respiratória relativamente moderada foi denominada pneumoencefalite aviária e demonstrou ser provocada por NDV (Beach, 1944). Dentro de alguns anos, foram realizados em todo o mundo numerosos isolamentos de NDV que provocaram doenças extremamente moderadas, ou nenhuma doença em frangos.

Os métodos seguintes foram implicados na disseminação da doença: 1) movimentação de aves vivas, aves selvagens, aves de caça, pombos de corrida e aves domésticas comerciais; 2) movimentação de pessoas e equipamentos; 3) movimentação de produtos de aves domésticas; 4) dispersão aérea; 5) rações de aves domésticas contaminadas; 6) água contaminada; 7) vacinas incompletamente inactivadas ou heterogéneas. De acordo com a OIE, a doença de Newcastle é uma doença de aves domésticas provocada por um vírus de paramixovírus aviário serotipo 1 (APMV-1) que possui um índice de patogenicidade intracerebral (ICPI) em pintos de um dia de idade de 0,7 ou superior. O vírus virulento também pode ser confirmado pela presença de aminoácidos básicos múltiplos no terminal C da proteína F2 e F (fenilalanina) no resíduo 117, o terminal N da proteína F1. A incapacidade de demonstrar esta sequência de aminoácidos iria requerer a caracterização por testes de ICPI. A palavra 'aves domésticas' refere-se a aves de capoeira 3 ΡΕ1088077 domésticas, perus, pintada, patos, gansos, codornízes, pombos, faisões, perdizes e ratites que são criados ou mantidos em cativeiro para criação, produção de carne ou ovos para consumo, ou para repor o stock de caça.

De acordo com Alexander (1988) ocorreram três panzoóticos da doença de Newcastle desde o primeiro reconhecimento da doença. O primeiro representou os surtos iniciais da doença e parece ter surgido no Sudoeste Asiático. Surtos isolados, tais como o que ocorreu na Inglaterra em 1926, for introduções ao acaso à frente do fluxo principal que se deslocou lentamente através da Ásia até à Europa.

Um segundo panzoótico parece ter surgido no Médio Oriente no final da década de 1960 e atingiu a maioria dos países por volta de 1973. A disseminação mais rápida do segundo panzoótico foi provocada provavelmente pela revolução principal da indústria de aves domésticas com comércio internacional considerável.

Um terceiro panzoótico afectou principalmente aves domesticadas, tais como pombos e pombas selvagens (Vindevogel e Duchatel, 1988) . A doença surgiu aparentemente no Médio Oriente no final da década de 1970. Por volta de 1981 atingiu a Europa e depois disseminou-se rapidamente a todas as partes do mundo, em grande parte como um resultado do contacto entre aves em corridas e exibições e o comércio internacional nessas aves. 4 ΡΕ1088077

Hoje em dia, a doença de Newcastle está ainda disseminada em muitos países da Ásia, África, as Américas, e Europa. Apenas os países da Oceânia parecem estar relativamente livres da doença (Spradbrow, 1988). 0 NDV pertence à ordem Mononegavirales, família Paramixoviridae, sub-família Paramixovirinae, género Rubulavírus. Para além do NDV, geralmente denominado paramixovírus aviário de tipo-1, podem ser distinguidos oito outros serotipos, designados paramixovírus aviário de tipo-2 a -9, com base na sua relação antigénica em testes de hemaglutinação-inibição e testes de neutralização de soro (Alexander, 1993).

Apesar da consistência do agrupamento serológico existem algumas relações cruzadas entre vírus de diferentes serotipos. 0 genoma de NDV é uma molécula de RNA de cadeia simples de polaridade negativa, complementar ao RNA mensageiro que codifica para as proteínas do vírus. O genoma de RNA tem aproximadamente 15 200 nt de tamanho e codifica para os seguintes produtos genéticos (listados da extremidade 3' para a extremidade 5' do RNA genómico) : proteína da nucleocápside (NP) , fosfoproteína (P), proteína da matriz (M), proteína de fusão (F), hemaglutinina-neuraminidase (HN), e proteína grande da polimerase (L) (Chambers et ai., 1986). 5 ΡΕ1088077 O RNA é complexado com as proteínas NP, P e L para formar uma particular de ribonucleocápside (RNP) que está rodeada por um envelope que está forrado no interior pela proteína M. 0 envelope contém as proteínas F e HN que estão envolvidas na ligação e penetração da célula hospedeira. A replicação de NDV é semelhante à estratégia utilizada por outros paramixovirinae. P passo inicial é a ligação do vírus aos receptores da célula hospedeira, mediada pela proteína HN. A fusão do envelope virai com uma membrana célula hospedeira está dependente da acção de ambas as proteínas HN e F e resulta na libertação da RNP para o citoplasma onde a replicação do vírus ocorre. A polimerase de RNA dependente do RNA virai (que é uma parte da RNP) produz transcritos complementares que actuam como mRNAs e são utilizados pela maquinaria de tradução da célula para a síntese de proteínas de vírus. Devido à acumulação da proteína NP, o complexo de polimerase de RNA muda de transcrição para replicação, resultando na síntese de moléculas de RNA genómico e antigenómico de comprimento total.

Os RNPs formados de novo são encapsidados na membrana celular pela acção da proteína M e das proteínas F e HN que se acumularam na membrana plasmática celular. As partículas de vírus formadas de novo são libertadas da 6 ΡΕ1088077 célula infectada por um mecanismo de gemulação. Para informação mais detalhada sobre replicação de NDV ver Peeples (1988) . Para uma revisão recente da biologia molecular de paramixovirinae ver Lamb e Kolakofsky (1996) .

Para além de aves domésticas comerciais (i.e. galinhas, perus, faisões, pintada comum, patos, gansos, pombos), uma vasta gama de aves cativas, semi-domésticas e em liberdade, incluindo aves aquáticas migratórias, é susceptivel a NDV e podem ser fontes de infecção principais (Kaleta e Baldauf, 1988). A patogenicidade de estirpes de NDV difere grandemente com o hospedeiro. A espécie mais resistente parece ser a de aves aquáticas enquanto que a mais susceptivel são aves gregárias que formam bandos temporários ou permanentes. As galinhas são altamente susceptiveis, mas patos e gansos podem ser infectados e apresentam poucos ou nenhuns sinais clinicas, mesmo com estirpes que são letais para as galinhas. A doença de Newcastle é complicada na medida em que isolados e estirpes diferentes do virus podem induzir enorme variação na gravidade da doença. Beard e Hanson (1984) agruparam estirpes e isolados de NDV em diferentes patotipos que se relacionam com os sinais da doença que podem ser observados em galinhas totalmente susceptiveis: 1) NDV viscerotrópico velogénico, que produz infecções letais agudas nas quais lesões hemorrágicas são proemi- 7 ΡΕ1088077 nentes no intestino; e NDV neurotrópico velogénico, que produz mortalidade elevada precedida por sinais respiratórios e neurológicos, mas sem lesões no intestino; 2) NDV mesogénico, que produz mortalidade baixa, doença respiratória aguda e sinais nervosos em algumas aves; 3) NDV lentogénico, que produz infecções respiratórias moderadas ou inaparentes ou mesmo NDV assintomático entérico, vírus avirulento que parece replicar principalmente no tracto intestinal. Foi relatada alguma sobreposição entre os sinais associados com os diferentes grupos. 0 vírus entra no corpo através das vias respiratórias e do tracto intestinal ou através do olho. Na traqueia, o vírus espalha-se por acção dos cílios e por disseminação célula a célula. Após multiplicação inicial no local da introdução, o vírus é transportado durante episódios de presença do vírus na circulação sanguínea para o baço, fígado, rim e pulmões. O vírus de algumas estirpes atinge órgãos vitais, como o fígado e o rim muito rapidamente, de modo que as aves podem morrer antes dos sintomas da doença serem observáveis. A maioria dos vírus atinge o sistema nervoso central através do sangue antes de existirem quantidades significativas de anticorpo. Um longo estado de transporte assintomático que se presume que ocorra em psittacines constitui uma ameaça potencial para a indústria das aves domésticas. Também pode existir um estado de transporte de longo termo tanto de vírus lentogénico como de velogénico em galinhas (Heuschele e Easterday, 1970) . ΡΕ1088077

Durante a replicação de NDV é necessário que a glicoproteína precursora Fo seja clivada em F1 e F2 para que o virus da progenia seja infeccioso (Rott e Klenk, 1988). Esta clivagem pós-tradução é mediada por proteases da célula hospedeira. Se não ocorre a clivagem, são produzidas partículas não infecciosas e a replicação virai não pode prosseguir. A proteína Fo do vírus virulento pode ser clivada por uma vasta gama de proteases, mas proteínas Fo em vírus de virulência baixa estão restritos na sua sensibilidade e estes vírus apenas podem crescer in vivo em certos tipos de célula hospedeira e, em geral, não podem ser cultivados in vitro.

Os vírus lentogénicos apenas replicam em áreas com enzimas do tipo tripsina, tais como o tracto respiratório e intestinal, enquanto que o vírus virulento pode replicar numa variedade de tecidos e órgãos resultando em infecção sistémica fatal.

Sequenciação de aminoácidos do precursor de Fo demonstrou que vírus de baixa virulência possuem uma única arginina (R) que liga as cadeias F2 e Fl, enquanto que estirpes virulentas possuem aminoácidos básicos adicionais formando dois pares, tais como K/R-X-K/R-R-F no sítio de clivagem. Além disso, a cadeia F2 de estirpes virulentas começa geralmente com um resíduo de fenilalanina, enquanto que a das estirpes não virulentas começa geralmente com uma leucina. 9 ΡΕ1088077

Para algumas estirpes de NDV a proteína HN é também produzida como um precursor que requer clivagem para ser biologicamente activo (Garten et al., 1980; Millar et al.r 1988) .

Para além da capacidade de clivagem das proteínas F e HN, outros factores virais podem contribuir para a patogenicidade. Madansky e Bratt (1978, 1981a, 1981b) demonstraram que alterações na transcrição e tradução podem modular o crescimento e a disseminação célula a célula do vírus e/ou a citopatogenicidade. A resposta imunitária inicial à infecção com NDV é mediada pela célula e pode ser detectável tão cedo quanto 2-3 dias após infecção com estirpes de vacina vivas. Isto explica presumivelmente a protecção precoce contra desafios que foram registados em aves vacinadas antes de ser observada uma resposta mensurável de anticorpo (Gough e Alexander, 1973). A cerca de 1 semana após infecção, anticorpos em circulação podem proteger o hospedeiro de re-infecção. Na fase precoce está envolvida IgM, seguida por IgG. Os títulos e a protecção atingem o pico após cerca de 3 semanas e o declínio gradual se não houver reforço. Isto significa que, para aves mais velhas, são necessárias re-vacinações. 10 ΡΕ1088077

Apenas vacinas vivas administradas pela via respiratória estimulam o anticorpo em todas as superfícies, assim como no soro. A vacina inactivada, mesmo quando aplicada através da via intramuscular, não origina resistência local no tracto respiratório, apesar das concentrações elevadas de anticorpo no soro.

Isto Salienta a importância de vacinas vivas capazes de apresentar antigénio virai no tracto respiratório superior para induzir tanto imunidade local como sistémica. Goticulas pequenas penetram no tracto respiratório inferior, provocando, desse modo, uma resposta imunitária principalmente humoral enquanto que goticulas grosseiras estimulam a imunidade local no tracto respiratório superior.

Por isso, aerossóis com uma vasta gama de tamanhos de goticula criam a melhor imunidade global local e humoral.

Todavia, deve ser Salientado que apesar da vacinação intensiva com as presentes vacinas criando níveis elevados de títulos de anticorpo, o vírus pode ainda ser recuperado das superfícies mucosas. A identificação da doença de Newcastle nos EUA conduziu à utilização de vacinas inactivadas (Hofstad, 1953). A observação de que alguns vírus enzoóticos produzem apenas doença moderada resultou primeiro no desenvolvimento 11 ΡΕ1088077 da vacina viva mesogénica Roakin (Beaudette et ai., 1949) e, subsequentemente, no desenvolvimento das estirpes moderadas Hitchner BI (Hitchner e Johnson, 1948) e LaSota (Goldhaft, 1980), que são presentemente as vacinas vivas mais vastamente utilizadas.

As vacinas de NDV vivas podem ser divididas em dois grupos, lentogénicas e mesogénicas. As estirpes mesogénicas são adequadas apenas para vacinação secundária de aves devido à sua maior virulência. A resposta imunitária aumenta à medida que a patogenicidade da vacina viva aumenta. Por isso, para obter o nivel de protecção desejado sem reacção séria, são utilizados presentemente programas de vacinação que envolvem a utilização sequencial de vacinas progressivamente mais virulentas, ou vacinas vivas seguido por vacinas inactivadas.

Uma das principais vantagens das vacinas vivas é que elas podem ser administradas através de técnicas não dispendiosas de aplicação em massa. Um método comum de aplicação é através da água do bebedouro. Todavia, a aplicação na água do bebedouro deve ser monitorizada cuidadosamente já que o virus pode ser inactivado por calor e luz em excesso e por impurezas virucidas na água. A aplicação em massa de vacinas vivas através de sprays e aerossóis é também muito popular devido à facilidade com a qual largos números de aves podem ser vacinadas num curto período. É importante alcançar o 12 ΡΕ1088077 tamanho correcto de partícula controlando as condições nas quais as partículas são criadas.

As vacinas vivas presentemente utilizadas possuem várias desvantagens. A vacina pode ainda provocar sinais de doença, dependendo das condições ambientais e da presença de infecções complicadas. Por isso, é importante utilizar vírus extremamente moderados para vacinação primária e, como um resultado, as vacinações múltiplas são normalmente necessárias. Além disso, anticorpos derivados por via materna podem prevenir com sucesso a vacinação primária com vacinas vivas lentogénicas.

As vacinas inactivadas são normalmente produzidas a partir de fluido alantóico infeccioso que é tratado com formalina ou betapropiolactona para matar o vírus e misturado com um adjuvante adequado. As vacinas inactivadas são administradas por injecção, quer intramuscularmente ou subcutaneamente. As vacinas inactivadas são dispendiosas de produzir e de aplicar.

Todavia, vacinas inactivadas de emulsão em óleo não são afectadas tão adversamente pela imunidade materna como as vacinas vivas e podem ser utilizadas em pintos de um dia de idade. As vantagens de vacinas inactivadas são o nível baixo de reacções adversas em aves vacinadas, o nível elevado de anticorpos de protecção, e a longa duração da protecção. Nenhuma das vacinas acima pode ser diferenciada serologicamente a partir de NDV de tipo selvagem. 13 ΡΕ1088077 O desenvolvimento de vacinas virais recombinantes tem tido interesse para a indústria das aves domésticas durante vários anos. 0 conceito é inserir genes de epitopos imunizantes críticos de um agente de doença de interesse num gene não essencial de um vírus vector. A vacinação com o vírus recombinante resulta, deste modo, na imunização contra ambos o vírus vector e o agente da doença de interesse. Vários tipos de vírus foram avaliados como potenciais vacinas virais vivas para aves domésticas. Dois vírus aviários que receberam a maior atenção são vírus da varíola de aves de capoeira (FPV) e herpesvírus de perus (HVT) . 0 vírus da varíola de aves é um vírus de DNA que possui um genoma grande e, daí é considerado como possuindo espaço suficiente para comportar genes estranhos.

Quando atenuado, o FPV não provoca doença clínica e é normalmente utilizada como uma vacina em galinhas. O HVT é também um vírus de DNA e é classificado como serotipo III da família do vírus da doença de Marek (MDV) . O HVT é não patogénico para galinhas no entanto de protecção cruzada contra MDV e é normalmente utilizado para vacinar galinhas contra a doença de Marek.

Foi demonstrado que a protecção contra a doença de Newcastle pode ser induzida utilizando vacinas de HVT ou FPV recombinante (Morgan et ai., 1992, 1993; Heckert et ai., 1996; Boursnell et ai., 1990; Taylor et ai., 1990). 14 ΡΕ1088077

Todavia, o início da protecção contra a doença de Newcastle após vacinação com essas vacinas recombinantes que expressam ou a proteína F de NDV ou ambas as proteínas F e HN foi severamente retardado em comparação com a seguinte vacinação com uma vacina viva convencional ou NDV inactivada, possivelmente porque as vacinas recombinantes não proporcionam um espectro imunológico suficientemente lato de epitopos de NDV antigenicamente relevantes para além daqueles que se encontram na proteína de NDV que é expressa pela vacina recombinante ou não são apresentados apropriadamente ao sistema imunitário.

Além disso, a protecção local (da mucosa, respiratória ou entérica) não foi induzida eficazmente em aves vacinadas com os recombinantes. Isto é um inconveniente sério uma vez que as vacinas utilizadas para vacinação primária contra doenças respiratórias devem induzir imunidade local para prevenir a infecção e disseminação de vírus virulentos que infectam galinhas criadas em condições de campo.

Anticorpos contra NDV que são capazes de proteger o hospedeiro podem ser medidos em testes de neutralização de vírus. Todavia, uma vez que a resposta de neutralização parece ter paralelo na inibição da resposta de hemaglutinação (Hl), este último teste é frequentemente utilizado para avaliar a resposta de protecção, especialmente após vacinação. 15 ΡΕ1088077

Os anticorpos contra ambas as proteínas F e HN podem neutralizar NDV. Todavia, os anticorpos contra a proteína F parecem induzir maior neutralização do que aqueles dirigidos contra HN em testes in vivo e in vitro (Meulemans et al., 1986). A presença de anticorpos específicos para NDV no soro de uma ave fornece pouca informação na estirpe infectante de NDV e por isso possui valor de diagnóstico limitado. A omnipresença de estirpes de NDV lentogénica em aves na maioria dos países e a utilização quase universal de vacinas vivas que não podem ser distinguidos, pelo menos não serologicamente de NDV de tipo selvagem, significa que a mera demonstração de infecção é raramente a causa adequada para as medidas de controlo serão impostas. Uma vez que a doença pode ser uma medição falível da verdadeira virulência do vírus, é necessário caracterizar mais profundamente o vírus que se encontra.

No presente, o único método de diagnóstico da doença de Newcastle que permite a caracterização da estirpe infectante, é o isolamento do vírus seguido pelo teste de patogenicidade. No presente, são utilizados três testes in vivo para este efeito: 1) tempo médio de morte (MDT) em ovos; 2) índice de patogenicidade intracerebral (ICPI) em galinhas de um dia de idade; 3) índice de patogenicidade intravenosa (IVPI) em aves de seis semanas de idade. 16 ΡΕ1088077

Estes testes sofrem de uma série de desvantagens, tais como a disponibilidade de animais, fraca reprodu-tibilidade, e a duração relativamente longa dos testes. Por último, mas não menos importante, Estes testes não permitem uma simples identificação serológica de aves domésticas vacinadas com uma vacina ou infectadas com uma estirpe de tipo selvagem.

Como uma alternativa aos testes in vivo, a reacção da polimerase em cadeia (PCR) foi utilizada com sucesso para distinguir entre isolados virulentos e não virulentos, i isolados não virulentos (Stauber et al., 1995; Kant et al., 1997), todavia, novamente a diferenciação serológica não é possível. A subida de aves domésticas e o comércio dos seus produtos é agora organizada numa base internacional, frequentemente sob a gestão de companhias multinacionais. A ameaça da doença de Newcastle demonstrou uma maior restrição nesse comércio. 0 controlo do sucesso da doença de Newcastle será apenas abordado quando todos os países relatam surtos. Todavia, os acordos internacionais não são apenas devidos à enorme variação na extensão da vigilância da doença em diferentes países. Alguns países não vacinam e não quereriam qualquer forma de NDV introduzida em aves domésticas porque as aves domésticas vacinadas não podem 17 ΡΕ1088077 ser distinguidas das outras infectadas com NDV de tipo selvagem.

Outros apenas permitem a utilização de vacinas vivas especificas e consideram outras vacinas como virulência inaceitável. Ainda outros países possuem a presença continuada de vírus virulento altamente circulante, que não é reconhecido como tal porque a doença aberta é mascarada por vacinação.

Em muitos países existe legislação para controlar surtos da doença de Newcastle que possam ocorrer. Medidas de controlo nacional são dirigidas à prevenção da introdução e disseminação. A maioria dos países possui restrições no comércio de produtos de aves domésticas, ovos, e aves domésticas vivas. A maioria dos países estabeleceu processos de quarentena para a importação, especialmente para aves psitacinas.

Alguns países adoptaram políticas de erradicação com o abate compulsivo de aves infectadas, os seus contactos, e produtos. Outros requerem vacinação profiláctica de aves mesmo na ausência de surtos, enquanto que alguns possuem uma política de vacinação em anel em redor dos surtos para estabelecer uma zona tampão.

Claramente, existe uma necessidade para melhores vacinas e para melhores métodos de diagnóstico que pode ser utilizada para controlar a doença de Newcastle. Devido 18 ΡΕ1088077 tanto a grandes diferenças na dose que é recebida por aves individuais durante a aplicação em massa de vacinas vivas como para a variação em niveis de imunidade materna em galinhas jovens, as reacções de pós-vacinação com vacinas vivas são inevitáveis. Esta é uma das principais preocupações dos agricultores em paises nos quais a vacinação é obrigatória.

Além disso, muitas vacinas são misturas de sub-populações. Quando clonadas, estas sub-populações podem diferir significativamente umas das outras em imunogeni-cidade e patogenicidade (Hanson, 1988).

Todavia, a maior desvantagem de vacinas vivas e vacinas inactivadas correntemente utilizadas é o facto que animais vacinados não podem ser distinguidos de animais infectados com técnicas de rastreio correntemente utilizadas, tais como testes de inibição de hemaglutinação ou neutralização de virus.

Os virus de campo virulento podem ainda disseminar em bandos vacinados uma vez que os sintomas de doença são mascarados por vacinação. Uma vez que o isolamento de virus e a caracterização de virulência por técnicas in vivo não é exequível numa grande escala, há uma grande necessidade para novas e eficazes vacinas atenuadas vivas, que pode ser serologicamente discriminada dos vírus de campo. 19 ΡΕ1088077

Essas vacinas, denominadas vacinas de marcador de NDV (e métodos e kits de diagnóstico acompanhantes), que devem proporcionar o mais completo espectro imunológico possível de epitopos de NDV antigenicamente relevantes, e que no entanto devem ser serologicamente distintos de NDV de tipo selvagem ainda não estão disponíveis. A invenção proporciona um método para modificar um genoma de paramixovírus aviário por modificação genética, proporciona paramixovírus aviário geneticamente modificado e uma vacina marcador de paramixovírus aviário. 0 advento das técnicas modernas de biologia molecular tem permitido a modificação genética de muitos vírus de RNA, incluindo vírus de RNA de cadeia negativa. Esta técnica é frequentemente referida como "genética reversa". Uma primeira proporciona uma cópia de cDNA (comprimento total) do RNA virai, após o qual se transcreve este DNA em células susceptíveis para produzir RNA infeccioso que pode novamente replicar para produzir partículas de vírus infeccioso.

Em geral, através da modificação prévia do cDNA com técnicas convencionais de biologia molecular, é possível obter um vírus de RNA geneticamente modificado. Todavia, isto nunca se materializou para NDV ou outros paramixovírus aviários, ainda nem sequer foi possível criar fragmentos de minigenoma ou plasmídeos de fragmentos genómico de paramixovírus aviário para estudar os eventos 20 ΡΕ1088077 replicativos de paramixovírus aviário, criando, deste modo, um entendimento sobre como construir virus de cópias infecciosas.

Surpreendentemente, embora nesta descrição tenha sido totalmente estabelecido que o genoma de paramixovírus aviário é o mais pequeno de todos os genomas de paramixovírus sequenciados até agora, especialmente a sequência da extremidade do terminal 5' do genoma de NDV é mais longa do que tinha sido previamente estabelecido e do que se esperava pela comparação com outros Paramixoviridae. A invenção, agora pela primeira vez proporciona uma sequência completa de um genoma de paramixovírus aviário e proporciona cDNA de comprimento total ou de comprimento minige-nómico de um tal vírus. A invenção aqui junto proporciona cDNA de paramixovírus aviário compreendendo pelo menos a extremidade do terminal 5' do genoma de NDV correspondendo à extremidade do terminal 5' de NDV como apresentado na Figura 6 permitindo criar uma cópia infecciosa de paramixovírus aviário, compreendendo o referido cDNA preferencialmente um cDNA de comprimento total. Todavia, a invenção também proporciona cDNA compreendendo pelo menos a extremidade do terminal 5' do genoma de NDV correspondendo à extremidade do terminal 5' de NDV como apresentado na Figura 6 permitindo desse modo criar um minigenoma de paramixovírus aviário replicante. Esses minigenomas podem ser utilizados vantajosamente para transcrever RNA e/ou 21 ΡΕ1088077 expressar a proteína a partir de sequências de ácido nucleico modificadas. A invenção proporciona um cDNA de acordo com a invenção pelo menos parcialmente derivado do vírus da doença de Newcastle, por exemplo em que o referido vírus da doença de Newcastle é um vírus lentogénico, preferencialmente derivado de uma estirpe de vacina, tal como a estipre LaSota ATCC VR-699. A invenção, além disso, proporciona um cDNA de acordo com a invenção proporcionado adicionalmente com uma modificação, tal como uma deleção, inserção, mutação, reversão, ou de outro modo num ácido nucleico. Por exemplo, é proporcionado um cDNA em que a referida modificação compreende um ácido nucleico codificando um sítio de clivagem de protease modificado, por exemplo em que o referido sítio de clivagem é um sítio de clivagem de protease da proteína de fusão (F).

Ainda noutra forma de realização, a invenção proporciona um cDNA de acordo com a invenção em que a referida modificação compreende um ácido nucleico codificando uma proteína virai híbrida, tal como uma proteína de hemaglutinina-neuraminidase (HN) híbrida, como descrito na parte experimental da invenção. A invenção também proporciona um cDNA de acordo com a invenção em que a referida modificação compreende uma deleção num ácido nucleico codificando uma proteína virai, tal como uma proteína de matriz (M). 22 ΡΕ1088077 A invenção proporciona adicionalmente um cDNA de acordo com a invenção proporcionado adicionalmente com um ácido nucleico codificando um antigénio heterólogo, preferencialmente em que o referido antigénio é derivado de um patogénio de aves domésticas, como por exemplo descrito abaixo. Um RNA, e proteína dele derivada, obtida a partir de um cDNA de acordo com a invenção é também proporcionado.

Nos anos mais recentes, foram caracterizados vários vírus de RNA não segmentados de cadeia negativa e o trabalho fundamental sobre a replicação e expressão dos seus genomas culminou na capacidade para criar vírus infecciosos inteiramente através da transfecção de células com cDNA clonado de um referido vírus (revisto por Conzelmann, 1996).

Até à data, vírus infecciosos de vírus de RNA não segmentados de cadeia negativa foram criados a partir de cDNA clonado de, por exemplo, vírus da raiva (Schnell et ai., 1994, Conzelmann; EP0702085A1). (Schnell et al., 1994; EP0702085A1), vírus da estomatite vesicular (Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995), vírus Sendai (Garcin et al., 1995), vírus do sarampo (Radecke et al., 1995; Schneider et al., 1997; EP0780475A1), vírus do sincício respiratório humano (Collins et al., 1995), vírus da peste do gado (Baron e Barrett, 1997), e vírus da parainfluenza humana de tipo 3 (Hoffman e Banerjee, 1997, Conzelmann; P0702085A1), (Schnell et al., 1994; EP0702085A1). 23 ΡΕ1088077

Todavia, todos os vírus de cópia infecciosos acima são capazes de crescer tanto in vivo bem como in vitro em hospedeiros, tecidos ou células de origem vária, permitindo fácil transfecção de cDNA e replicação e criação de partículas de vírus infecciosos numa linha celular adequada.

Essa possibilidade não existe para NDV, certamente não para estirpes de NDV lentogénicas que podem proporcionar uma vacina. A virulência de uma tal estirpe de NDV está associada com a sua capacidade para replicar numa larga variedade de células, reflectido pelo facto de as estirpes virulentas poderem facilmente replicar in vitro e in vivo, enquanto que as estirpes da vacina apenas podem replicar in vivo.

Deste modo, com NDV é óbvia uma situação de uma "armadilha 22". Embora as tentativas para criar um vírus de cópia infeccioso a partir de, por exemplo, cDNA infeccioso por possivelmente resultar nu vírus infeccioso, esse vírus é, em geral, não adequado para utilização como uma vacina porque os vírus infecciosos assim criados são, por defeito, demasiado virulentos para serem utilizados como vacina; o facto de que pode ser criado e replicado após transfecção de cDNA numa linha celular reflecte a sua facilidade para ser limpo da proteína Fo em F1 e F2, como discutido acima uma característica de virulência de um NDV.

Utilizar uma estirpe de vacina como material de 24 ΡΕ1088077 origem para o cDNA não resolveria este problema; uma estirpe de vacina, especialmente de um tipo lentogénico não contém uma proteina Fo facilmente clivável, tornando impossível que a primeira geração de vírus continue a replicar. A célula utilizada para transfecção simplesmente não será susceptível a suportar uma ou mais rondas de replicação de vírus de tipo vacina com uma proteína Fo não clivável. A invenção proporciona agora elegantemente uma solução para este problema, e com isso proporciona NDV de cópia infecciosa, por exemplo para utilização numa vacina. A invenção proporciona um método para criar vírus de cópia infecciosa da doença de Newcastle compreendendo transfectar células, capazes de expressar proteínas NP, P e L virais para complexar com RNA virai com comprimento total ou cDNA de comprimento genómico clonado de um vírus referido e compreendendo ainda incubar as referidas células em meio de cultura, compreendendo actividade proteolítica permitindo clivagem da proteína Fo de um vírus referido.

No presente sistema, a co-transfecção de um plasmídeo que expressa NP pode ser omitida. A NP é provavelmente expressa a partir do cDNA de comprimento total porque o gene da NP é o primeiro gene após a extremidade 5' do RNA antigenómico. Uma vez que os mRNAs eucarióticos são normalmente monocistrónicos, a expressão de genes distais não é esperada. Todavia, é possível criar 25 ΡΕ1088077 cDNA de comprimento total no qual as posições relativas dos genes NDV são alteradas. Se o primeiro gene desse cDNA é o gene P ou L, não é necessário expressar o produto genético correspondente a partir de um plasmideo co-transfectado.

Como uma alternativa à utilização do cDNA de comprimento total, é possível utilizar dois ou mais cDNA's subgenómicos que criam RNAs subgenómicos competentes para replicação e que, expressam em conjunto o complemento total de proteínas de paramixovírus aviário. Mesmo se os RNAs forem empacotados separadamente, as partículas de tipo vírus resultantes podem ser utilizadas para rondas sucessivas de replicação por meio de co-infecção e complemen-tação de funções genéticas.

Numa forma de realização preferida, a invenção proporciona um método em que a referida actividade prote-olítica é derivada de uma enzima, tais como uma enzima de tipo tripsina, ou é derivada de uma composição compreendendo uma actividade proteolítica referida. Numa forma de realização preferida, um meio de cultura referido compreende fluido alantóico compreendendo actividade proteolítica. A clivagem da proteína Fo é necessária para a geração de vírus infeccioso. É possível criar vírus infec-ciosos a partir da estirpe lentogénica sem a adição de actividade proteolítica exógena. Inoculando o sobrenadante de células transfectadas na cavidade alantóica de ovos embrionados, a actividade proteolítica que está presente no fluido alantóico é capaz de clivar a proteína Fo para criar 26 ΡΕ1088077 o complexo de fusão-competente F1-F2. Os viriões com uma tal proteína F activada são capazes de infectar células susceptíveis e replicação nas células que expressam a actividade proteolítica desejada produz progenia infec-ciosa. Como uma alternativa para proporcionar a actividade proteolítica desejada para o sobrenadante de células transfectadas, é por exemplo possível utilizar uma célula que é permissiva para NDV e que já expressa a referida actividade proteolítica. Uma tal linha celular é utilizada para produzir NDV lentogénica infecciosa sem a adição de actividade proteolítica exógena. Uma tal linha celular pode também ser criada por transfecção estável da linha celular com um gene que especifica a referida actividade. Além disso, é possível criar uma linha celular transfectada estável que expressa a proteína F de tipo selvagem no envelope do vírus, proporcionando deste modo partículas infecciosas (elas próprias não proporcionadas com informação genómica codificando proteína F de tipo selvagem) com meios para entrar na célula. A recuperação do vírus lentogénico infeccioso é também possível por infecção de células transfectadas com um vírus auxiliar de NDV. Um requisito essencial para um tal vírus auxiliar seria que pode ser seleccionado contra, por exemplo por meios de neutralizar anticorpos que eliminam o vírus auxiliar, mas que não reagem com o vírus lentogénico. Finalmente, pode construir-se uma linha celular transfectada de forma estável que expresse uma, duas, ou todas as três proteínas de NDV essenciais, NP, P, e L. Essas linha celulares requerem a co-expressão de apenas um subconjunto das três 27 ΡΕ1088077 proteínas essenciais ou não co-expressâo em todas para suportar a criação de vírus de cópia infecciosos.

Numa forma de realização preferida, a invenção proporciona um método em que as referidas células utilizadas para transfectar são derivadas de células ou linhas celulares primárias ou secundárias de galinha. A descrição proporciona, por exemplo, células CER ou CEF, que, como a maioria das células in vitro em geral, não têm as proteases apropriadas que são necessárias para clivar a proteína Fo de NDV, por exemplo da estirpe LaSota. Todavia, as células derivadas a partir, por exemplo, de outras aves também podem ser utilizadas. A invenção proporciona ainda um método para criar vírus de cópia infecciosos da doença de Newcastle compreendendo transfectar células com cDNA clonado de comprimento total ou de comprimento genómico de um referido vírus como, por exemplo, identificado na figura 3 e compreendendo ainda incubar as referidas células em meio de cultura compreendendo actividade proteolítica permitindo clivagem da proteína Fo de um vírus referido, compreendendo ainda recuperar vírus infecciosos cultivando as referidas células e inoculando material derivado das referidas células cultivadas para a cavidade alantóica de ovos embrionados. 0 referido material, por exemplo, compreende células (recolhidas ou congeladas-descongeladas) ou resíduos celulares ou sobrenadante derivado de uma referida cultura de células. 28 ΡΕ1088077

Por exemplo, a descrição descreve um método para recuperar vírus infecciosos, em que o sobrenadante de monocamadas de CEF transfectadas foi inoculado na cavidade alantóica de ovos embrionados. Quatro dias mais tarde, o fluido alantóico foi recolhido, analisado num ensaio de hemaglutinação, e passado ainda em ovos.

Adicionalmente, a invenção proporciona um método compreendendo ainda passar o referido vírus da doença de Newcastle de cópia infecciosa recolhendo fluido alantóico e re-inoculando ovos embrionados.

Numa forma de realização preferida da invenção, é proporcionado um método em que o referido vírus é um vírus lentogénico, por exemplo derivado de um caso de campo avirulento de NDV ou de uma estirpe de vacina de NDV, tais como a estirpe de NDV LaSota. Além disso, é proporcionado um método para modificar um genoma de paramixovírus aviário por meio de modificação genética que permite a introdução de uma ou mais mutações, deleções, e/ou inserções ou outras modificações. Por exemplo, é proporcionado um método para atenuar ou modificar a virulência de paramixovírus aviário modificando o cDNA, por exemplo codificando uma proteína virai, tal como a proteína V, e clonando o referido cDNA modificado no cDNA de comprimento total e criando vírus de cópia infecciosos a partir do referido cDNA de comprimento total, criando desse modo novas estirpes de NDV ou novas vacinas vivas atenuadas com propriedades melhoradas. 29 ΡΕ1088077

Para além da atenuação por modificação de produtos genéticos, também é possível atenuar paramixovírus aviário por modificação de sequências de nucleótidos que estão envolvidas na transcrição e/ou replicação. Essas modificações resultam em estirpes atenuadas que expressam proteínas F de tipo selvagem que são cliváveis tanto in vitro como in vivo numa vasta variedade de células e como um resultado são mais imunogénicas que as estirpes de vacina clássicas.

Numa forma de realização preferida, a invenção proporciona um método para atenuar ou modificar a virulência de um paramixovírus aviário, tal como um vírus da doença de Newcastle, compreendendo modificar um sítio de clivagem de protease de uma proteína virai por modificação do cDNA codificando o referido sítio de clivagem, compreendendo ainda clonar o referido cDNA em cDNA de comprimento genómico de e. g. vírus da doença de Newcastle e criando vírus de da doença de Newcastle cópia infecciosa. O referido sítio de clivagem é, por exemplo, um sítio de clivagem de protease na proteína F ou HN do vírus da doença de Newcastle. A atenuação é, em geral, restrita à redução de virulência, todavia, é agora também possível utilizar uma estirpe de NDV relativamente avirulenta e proporcionar a progenia de uma tal estirpe com virulência aumentada, por exemplo proporcionando-a com uma tendência aumentada para replicar num tipo de célula especificada. É agora, por isso, possível to determinar atributos de virulência distintos a NDV. 30 ΡΕ1088077 A invenção proporciona um método para modificar antigenicamente paramixovirus aviário, tais como um vírus da doença de Newcastle, compreendendo modificar cDNA codificando pelo menos uma parte de uma proteína virai contendo pelo menos um epitopo imunodominante, compreendendo ainda clonar o referido cDNA em cDNA de comprimento genómico de vírus da doença de Newcastle e criando vírus de cópia infecciosos da doença de Newcastle.

Por exemplo, a invenção proporciona um método para (ainda) modificar NDV, por exemplo utilizando um método para produzir uma cópia infecciosa de NDV (vacina) que tenha sido proporcionada, é proporcionado um método para produzir uma vacina de NDV de marcador recombinante, uma vacina marcador que contém o espectro imunológico mais completo possível ou necessário de epitopos de NDV antigenicamente relevantes, e ainda será serologicamente distinto do NDV de tipo selvagem porque um epitopo ou marcador distinto, serologicamente relevante foi removido por técnicas recombinantes. A invenção proporciona um método para modificar a camuflagem antigénica de parami-xovírus aviário, tais como NDV, permitindo assim a geração de e. g. uma vacina de marcador de NDV vivo que possa ser serologicamente distinguível das estirpes de campo de paramixovirus aviário.

Numa forma de realização, a invenção proporciona NDV de cópia infecciosa em que a proteína HN de NDV foi 31 ΡΕ1088077 modificada por recombinaçâo de cDNA codificando uma parte da referida proteina HN com cDNA codificando uma parte da proteína HN derivada de um paramixovírus aviário, por exemplo tipo 2 ou tipo 4. A referida proteína HN híbrida serve como um marcador serológico para a estirpe de NDV de cópia infecciosa assim obtida ou pode servir para alterar o tropismo do paramixovírus aviário para outras células e/ou tecidos. Assim, as assim denominadas, estirpes marcadoras como proporcionadas por uma invenção permite a geração de vacinas que são uma ferramenta inestimável para avaliar a prevalência de NDV em bandos comerciais em todo o mundo. Além disso, a aplicação em larga escala dessas vacinas marcadoras conduzirá à erradicação completa de NDV por um processo de rastreio intensivo e selagem de bandos infectados.

Além disso, é proporcionado um método para criar uma estirpe de NDV de cópia infecciosa que expressa um ou mais antigénios de outros patogénios e que pode ser utilizada para vacinar contra múltiplas doenças. Um tal vírus de NDV de cópia infecciosa compreende, por exemplo, um cDNA heterólogo codificando uma proteína heteróloga obtida a partir de, por exemplo, Gripe Aviária (AI) (Hemaglutinina (H5 e H7) e Neuraminidase), Vírus da leucose aviária (ALV) (proteína env (gp85)) , Vírus da anemia das galinhas (CAV) (VP1+VP2) , Vírus da doença de Marek (MDV) (glicoproteína B (gB), gH), Vírus da laringotraqueite infecciosa (ILT) (gB, gH, gD), vírus doença da bolsa infecciosa (IBDV) (VP2 e VP3), Vírus da rinotraqueite de 32 ΡΕ1088077 peru (TRT) (proteína de fusão (F)), Paramixovírus aviário-2,-3,-6 (PMV) (proteína F, Hemaglutinina neuraminidase (HN), ou outros, Vírus bronquite infecciosa (IBV) (proteína peplomero, nucleoproteína), Reovírus (proteína sigma), Ade-novírus Pneumovírus, Salmonella enteritidis, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Bordetella avium (anteriormente denominada Alcaligenes faecalis), Haemphilus paragalli-narum, Pasteurella multocida, Ornithobacterium rhinotra-cheale, Riemerella (anteriormente denominado Pasteurella) anatipestifer, Mycoplasmata (M. gallisepticum, M synoviae, M. mereagridis, M. iowae), ou Aspergilli (A. flavus, A. fumigatus). A invenção aqui apresentada proporciona paramixovírus aviário ou estirpes derivadas deste que pode ser utilizado como um vector de vacina para a expressão de antigénios de outros patogénios de aves domésticas. Várias propriedades tornam o NDV um vector de vacina ideal para vacinação contra doenças respiratórias ou intestinais. 1) O NDV pode ser facilmente cultivado até títulos muito elevados em ovos embrionados. 2) A cultura em massa de NDV em ovos embrionados é relativamente barata. 3) As vacinas de NDV são relativamente estáveis e podem ser administradas simplesmente por métodos de aplicação em massa, tais como através da água do bebedouro ou por aspersão ou formação de aerossóis. 4) A via de infecção natural de NDV é através do tracto respiratório e/ou intestinal que são também as vias de infecção principais naturais de muitos outros patogénios de aves domésticas. 5) 0 NDV pode induzir imunidade local apesar da presença de anticorpo materno em circulação. 33 ΡΕ1088077

Foi demonstrado que o NDV possui um antineoplá-sico potente, bem como propriedades imuno-estimuladoras (para uma revisão ver Schirrmacher et al., 1998) [Schirrma-cher, V., Ahlert, T., Steiner, H.-H., Herold-Mende, C., Gerhards, R. e Hagmuller E. (1998). Imunização com células tumorais modificadas com vírus. Seminars in Oncology 25: 677-696] . Embora o NDV não pareça ser capaz de replicar produtivamente em células humanas normais, foi registada uma morte selectiva mediada por NDV de células cancerosas humanas. Após terapêutica para NDV local, foram observadas oncólise virai e remissão completa de xenoenxertos tumorais humanos em murganhos sem pêlo. Isto conduziu à utilização de NDV para terapêutica tumoral. Todavia, um problema é que essa aplicação pode ser restrita a tratamento local. A infecção com NDV induz interferões, quimio-cinas, e outros produtos genéticos potencialmente importantes, e introduz propriedades imuno-estimuladoras pleio-trópicas em células tumorais. Este conceito foi utilizado para a produção de vacinas de células tumorais autólogas consistindo em espécimes frescos operativos que foram infectados com NDV. Este tipo de vacina é denominado vacina de tumor autólogo-NDV ou ATV-NDV (Schirrmacher et al., 1998). As células infectadas com NDV são inactivadas por irradiação gama que previne a divisão celular, mas que ainda permite a replicação de NDV no citoplasma de células infectadas. Após inoculação dos pacientes com ATV-NDV, as células T são recrutadas através de quimiocinas induzidas 34 ΡΕ1088077 por NDV. Algumas destas células T podem expressar um receptor de células T que pode interactuar com péptidos de antigénios associado a tumor em complexos com moléculas do complexo de histocompatibilidade principal de classe I na superfície da célula. Esta interacção resulta na indução de uma resposta de células T citotóxicas, que resulta na morte específica de células tumorais autólogas. A invenção proporciona que o repertório e a quantidade de quimiocinas e proteínas imuno-estimuladoras induzidas por infecção com NDV são moduladas. A presente invenção proporciona um método para criar NDV recombinante que foi modificada para incorporar e expressar (a) gene(s) heterólogos. Esse NDV recombinante pode ser utilizado para modificar o repertório e a quantidade de proteínas imuno-estimuladoras em células infectadas. Numa forma de realização, a invenção proporciona um NDV recombinante que incorpora e expressa genes codificando interferões humanos, quimiocinas ou outras proteínas imuno-estimuladoras. 0 referido NDV recombinante é utilizado para a produção de ATV-NDV que é mais potente do que ATV-NDV convencional. Por exemplo: citocinas IFN-α, -β, TNF-a, IL-1, IL-6; quimiocinas RANTES, IP-10; outros genes tais como HSP, ACTH, endorfina, iNOS, EPA/TIMP, NFkB.) As propriedades pleiotrópicas imuno-estimuladoras de NDV também podem ser utilizadas como um adjuvante para vacinação de animais e humanos contra doenças infecciosas. Numa forma de realização da invenção, genes estranhos codificando (a) antigénio(s) relevantes de (um) agente(s) infecciosos são 35 ΡΕ1088077 introduzidos no genoma de NDV e a expressão simultânea dos antigénio(s) e as proteínas imuno-estimuladoras por células infectadas pode induzir uma resposta imunitária potente contra o agente infeccioso. Noutra forma de realização da invenção, as propriedades imuno-estimuladoras de NDV podem ser ainda aumentadas utilizando NDV recombinantes que expressam simultaneamente antigénios e proteínas imuno-estimuladoras específicas. Numa forma de realização preferida, a invenção é utilizada para criar uma vacina da SIDA (síndrome da imunodeficiência adquirida) utilizando NDV recombinantes que expressam antigénios relevantes do vírus da imuno-deficiência humana (HIV), quer ioladamente ou em combinação com proteínas imuno-estimuladoras.

Os NDV são também utilizados como um adjuvante para vacinação de animais e humanos contra doenças infec-ciosas. Numa forma de realização da invenção, genes heteró-logos ou estranhos codificando (a) antigénio(s) relevantes de (um) agente (s) infecciosos são introduzidos no genoma de NDV e a expressão simultânea do(s) antigénio(s) e as proteínas imuno-estimuladoras por células infectadas pode induzir uma resposta imunitária potente contra o agente infeccioso. Noutra forma de realização da invenção, as propriedades imuno-estimuladoras de NDV são ainda aumentadas utilizando NDV recombinantes que expressam simultaneamente antigénios e proteínas imuno-estimuladoras específicas. Numa forma de realização preferida, a invenção é utilizada para criar uma vacina da SIDA (síndrome da imunodeficiência adquirida) utilizando NDV recombinantes 36 ΡΕ1088077 que expressam antigénios relevantes do vírus da imuno-deficiência humana (HIV), quer isoladamente ou em combinação com proteínas imuno-estimuladoras.

Também, é proporcionado um método para criar um mutante de deleção de NDV letal condicional que pode ser utilizado como vacina auto-restrito não transmissível (veículo) . Foi criado um mutante de deleção de NDV que é incapaz de expressar a proteína de matriz (M) que está envolvida na gemulação de NDV na membrana celular interna. A invenção proporciona por exemplo uma estirpe de NDV fenotipicamente complementada que é incapaz de expressar a proteína M que é ainda capaz de infectar células e disseminar por meio de transmissão célula-a-célula. Todavia, o vírus mutante é incapaz de criar progenia infecciosa em células não complementares. Isto demonstra que mutantes de deleção de NDV fenotipicamente complementados podem ser utilizados como vacinas auto-restritas que são incapazes de disseminar para o ambiente. Uma tal vacina não transmissível combina a vantagem mais importante das vacinas vivas, í.e., a eficácia, com a vantagem mais importante das vacinas mortas, í.e., a segurança. A invenção proporciona vírus da doença de Newcas-tle, ou estirpes derivadas deste, por exemplo passando ou cultivando ainda em ovos embrionados ou células apropriadas, que é derivado de vírus de cópia infecciosa que se obtêm através de um método proporcionado pela invenção. 37 ΡΕ1088077

Por exemplo, é proporcionado NDV que foi modificado em pelo menos um modo para criar vírus de cópia infecciosa da doença de Newcastle que está atenuado, modificado na virulência, antiqenicamente modificado, expressando um antigénio heterólogo ou são não transmissíveis, ou combinações destes.

Em anexo a invenção proporciona vacinas de NDV, caracterizadas por exemplo por comportar atributos de virulência distintos ou características antigénicas distintas, seja para efeitos de vacina de marcador e/ou para expressar antigénios heterólogo derivados de outros patogénios, seja na forma transmissível e/ou não transmissível .

Uma tal vacina pode ser uma vacina morta ou uma viva. Preferencialmente, uma tal vacina é uma vacina viva, todavia, as vacinas mortas como proporcionado pela invenção são benéficas sob as circunstâncias em que uma vacina viva não é aplicável ou é apenas pouco aplicável, por exemplo devido a restrições de comércio ou outras condições estabelecidas pelas autoridades de controlo da doença. A invenção aqui apresentada também proporciona um método de diagnóstico, para detectar anticorpos contra o referido epitopo imunodominante serologicamente relevante ou marcador, proporcionado desse modo métodos e meios para executar um método para controlo e/ou erradicação de NDV e/ou outras doenças de aves domésticas em aves domésticas. 38 ΡΕ1088077 A invenção proporciona vacinas novas e eficazes que podem ser serologicamente discriminadas a partir de vírus de campo e vacinas de tipo velho. Essas novas vacinas, denominadas vacinas de marcador de NDV, proporcionam o mais completo espectro imunológico possível de epitopos de NDV antigenicamente relevantes, e no entanto são serologicamente distintos de NDV de tipo selvagem através da aplicação dos métodos de diagnóstico acompanhantes. A invenção proporciona um método para distinguir animais não vacinados ou animais vacinados com uma vacina de NDV de acordo com a invenção de animais infectados com NDV de tipo selvagem ou vacinados com uma estirpe de vacina de NDV não modificada mesogénica ou lentogénica, compreendendo recolher pelo menos uma amostra (tal como soro, sangue, ovos ou fluido lacrimal) de um referido animal e determinando na referida amostra a presença de anticorpos dirigidos contra um epitopo imunodominante ou marcador expresso por um referido NDV de tipo selvagem ou não modificado, mas não por uma vacina de acordo com a invenção. A invenção proporciona um método em que os referidos anticorpos são dirigidos contra a proteína HN ou F de NDV, por exemplo uma proteína híbrida, como descrito na parte experimental como esta descrição. A invenção proporciona, por exemplo, um método de diagnóstico em que o referido animal é seleccionado do grupo composto por aves domésticas, preferencialmente de galinhas. 39 ΡΕ1088077

Numa forma de realização da invenção, é utilizado um teste simples e rápido de inibição de hemaglutinina (Hl) para distinguir entre animais vacinados e animais infectados. Animais vacinados com uma vacina de marcador, em que a cabeça globular completa de HN de NDV foi substituída com a parte correspondente de HN de outro serotipo não induzirá anticorpos contra HN de NDV e por isso não irá inibir a hemaglutinação de eritrócitos por viriões de NDV.

Utilizando viriões de vacina de marcador no teste de Hl, os anticorpos contra a proteína HN híbrida são detectados e podem ser utilizados como uma medida para a eficácia de vacinação. Como uma alternativa, é utilizada uma ELISA que detecta anticorpos contra a proteína F de NDV para medir a eficácia da vacinação.

Para além do teste de Hl, pode ser utilizada uma ELISA para determinar a presença de anticorpos contra HN de NDV. O antigénio a ser utilizado nesse teste é, por exemplo, HN de NDV que é expresso por técnicas de DNA recombinante ou um péptido conservado de HN de NDV. Também pode ser utilizada uma ELISA de bloqueamento. Neste caso, são utilizados um ou mais anticorpos monoclonais contra epitopos conservados de HN de NDV para determinar se os anticorpos em competição estão presentes em amostras de animais vacinados. Os testes de ELISA podem ser utilizados vantajosamente se a vacina marcador contém apenas uma proteína de HN quimérica ou quando alguns epitopos de HN de NDV são substituídos. 40 ΡΕ1088077 A invenção é ainda explicada na parte experimental desta descrição sem limitar a invenção a esta.

PARTE EXPERIMENTAL

MATERIAIS E MÉTODOS

Foram realizados processos de clonagem convencionais de acordo com Sambrook et al. (1989) salvo referência em contrário. Todas as construções envolvendo fragmentos de DNA que foram criados por meio da reacção da polimerase em cadeia (PCR) foram verificadas por análise de sequência. Nas sequências iniciadoras apresentadas abaixo, os nucleótidos sublinhados correspondem a sequências de NDV e a posição no genoma de NDV é indicada. A sequência de nucleótidos dos sítios de restrição que foram utilizados para clonar são indicados em negrito. Células e vírus Células CER (Smith et al., 1976) foram cultivadas em GMEM/EMEM (1:1) contendo soro de vitela fetal a 5% e 2% de uma mistura de antibióticos que continha 1000 U/mL de Penicilina, 1000 pg/mL de Estreptamicina, 20 pg/mL de Fungizona, 500 pg/mL de Polimixina B, e 10 mg/mL de Canamicina. Células QT35 (Moscovici et al., 1977; Cho, 1982) foram cultivadas em meio fornecido por GibcoBRL/ Life Technologies (n°. cat. 041-91536; composição de proprie- 41 ΡΕ1088077 tário de Fort Dodge) suplementado com FCS a 5% e mistura de antibióticos a 2%. Células QM5 (Antin e Ordahl, 1991) foram cultivadas em meio M199 suplementado com caldo de fosfato de triptose a 10%, FCS a 10% e mistura de antibióticos a 02, Z o . A estirpe de NDV LaSota foi obtida da ATCC (ATCC VR-699) e foi passada duas vezes em ovos embrionados. Antes de se iniciar a construção e a clonagem de cDNA, o vírus foi purificado da placa através de três rondas de purificação de placa em fibroblastos primários de embrião de galinha (CEF) . Para este fim, o vírus foi titulado em células CEF cultivadas em GMEM/EMEM (1:1) contendo soro de vitela fetal a 5%, mistura de antibióticos a 2%, fluido alantóico a 5%, MgCl2 a 30 mM, 200 pg/mL DEAE-dextrano (Sigma) e agar Nobel a 0,8% (Difco) . O vírus da terceira ronda de purificação de placa (designado clone E13-1) foi cultivado em ovos embrionados e quatro dias após inoculação o fluido alantóico foi recuperado e armazenado em fracções a -70 °C. 0 vírus recombinante de varíola das aves fpEFLT7pol (Britton et al., 1996; de aqui em diante FPV- T7) , que expressa polimerase de RNA de T7, foi uma gentil oferta do Dr. Michael Skinner e foi cultivado em células QT35.

Isolamento de RNA virai

Todas as manipulações foram realizadas em material de vidro ou material de plástico sem RNase e todas 42 ΡΕ1088077

as soluções foram preparadas com água sem RNase que foi tratada com dietilpirocarbonato a 1% (DEPC) e esterilizada por autoclavagem. 0 virus foi sedimentado a partir de fluido alantóico por centrifugação a 21 000 rpm durante 70 min num rotor Beckman SW40 a 4 °C. O sedimento foi ressuspenso em tampão de homogeneização (Tris-HCl a 50 mM pH 7,5, NaCl a 50 mM, EDTA a 5 mM, SDS a 0,5%) e tratado com Proteinase K (200 pg/mL) durante 90 min a 37 °C durante agitação constante. O lisado foi extraído duas vezes com um volume igual de fenol/clorofórmio (1:1) pH 5,4 e uma vez com um volume igual de clorofórmio. O RNA virai foi

precipitado da fase aquosa pela adição de 0,1 volume de NaOAc a 3M pH 5,3 e 2,5 volumes de etanol a 100%. O precipitado foi recolhido por centrifugação, lavado uma vez com etanol a 70%, ressuspenso em água, e armazenado em fracções a -70 °C.

Transcrição reversa O RNA virai (1,5 pg) foi misturado com 500 ng de iniciador num volume de 12 pL e incubado durante 10 min a 70 °C. Foram adicionados 4 pL de tampão RT a 5x (Tris-HCl a 250 mM, pH 8,3, KC1 a 375 mM, MgCl2 a 15 mM; GibcoBRL/Life Technologies), 2 pL de DTT a 0,1 M e 2 pL de dNTP's a 10 mM (2,5 mM cada) e a mistura foi incubada durante 2 min a 42 °C. A transcrição reversa foi realizada num volume final de 20 pL pela adição de 200 Unidades de transcriptase reversa (Superscript II; GibcoBRL/Life Technologies) seguido por incubação durante 60 min a 42 °C. 43 ΡΕ1088077

Reacção da polimerase em cadeia (PCR)

Todas as reacções de PCR que foram utilizadas para determinar a extremidade 3' e 5' do genoma de NDV (ver abaixo) foram realizadas utilizando Polimerase de DNA Taq (Perkin Elmer). Para a clonagem de genes de NDV individuais ou cDNA's subgenómicos grandes, foram utilizadas ou a polimerase de DNA Pwo à prova de leitura, ou misturas de Taq e Pwo (Expand High Fidelity Kit ou Expand Long Template Kit), de acordo com as instruções do fabricante (Boehringer Mannheim). Todas as amostras foram incubadas durante 2 min a 94 °C antes do início do número indicado de ciclos de PCR. Após o número indicado de ciclos de PCR, as amostras foram incubadas à temperatura de elongação durante pelo menos 3x a duração do tempo de elongação do ciclo de PCR. Os fragmentos de PCR foram purificados directamente utilizando o High Pure PCR Product Purification Kit (Boehringer Mannheim) ou após electroforese em gel de agarose utilizando o kit de extracção QiaexII (Qiagen) essencialmente como descrito pelos fornecedores.

Análise de sequências

Todas as sequências foram determinadas utilizando o PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle

Sequencing Kit (Perkin Elmer). As misturas de reacção (5 pL) foram sujeitas a 25 ciclos de amplificação linear (10 seg a 94 °C, 5 seg a 50 °C, e 4 min a 60 °C) num 44 ΡΕ1088077 termociclador GeneAmp2400. Subsequentemente, as misturas de reacção foram precipitadas com etanol, lavadas uma vez com etanol a 70%, ressuspensas em 15 pL de tampão TSR (Perkin Elmer) e aquecidas durante 2 min a 94 °C antes de serem aplicadas num sequenciador automático Applied Biosystems AB310.

As sequências de nucleótidos dos iniciadores que foram utilizados para sequenciar o genoma completo da estirpe de NDV LaSota foram ou derivados de sequências publicadas ou de sequências estabelecidas durante este projecto de sequenciação. Os iniciadores são apresentados na Tabela 1.

Clonaqem e sequenciação das extremidades 3' e 5' do genoma da estirpe de NDV LaSota A sequência de nucleótidos dos terminais 3' e 5' do genoma de NDV foram determinadas utilizando processos RACE (amplificação rápida de extremidades de cDNA). O RNA de NDV foi utilizado numa reacção de transcrição reversa num volume final de 20 pL utilizando iniciador p360 (5' — GGCGATGTAATCAGCCTAGTGCTT-3' ; nt 14756-14779) que derivou da sequência publicada do gene L de NDV (Yusoff et al., 1987). O cDNA de cadeia simples (2,5 pL da mistura de RT) foi adicionado a 8 pmol do iniciador âncora ALG3 (5'-CACGAATTCACTATCGATTCTGGATCCTTC-3') e ligado durante a noite à temperatura ambiente em 20 pL de uma mistura de reacção contendo Tris-HCl a 50 mM, pH 8,0, MgCl2 a 10 mM, BSA a 10 45 ΡΕ1088077 pg/mL, PEG a 25%, HCC 1 mM, ATP 20 μΜ e 10 unidades de ligase de RN A de T4 (New England Biolabs), como descrito por Tessier et al. (1986). Foi utilizado 1 pL da reacção de ligação como molde numa reacção de PCR utilizando os iniciadores p375 (5' -CAATGAATTCAAAGGATATTACAGTAACT-3' nt 14964-14983) e ALG4 (5'-GAAGGATCCAGAATCGATAG-3'). Este último iniciador é complementar ao iniciador âncora ALG3. As condições de PCR (40 ciclos) foram como se segue: 1 min a 94 °C, 1 min a 55 °C, e 2 min a 72 °C. Os produtos de PCR foram purificados e clonados no vector T pBluescriptII-TSK (Ichihara e Kurosawa, 1993) . Alternativamente, os produtos de PCR purificados foram tratados com polimerase I de DNA de Klenow para criar extremidades rombas e clonados no sitio HincII do plasmideo pGEM4Z (Promega). Foram sequen-ciados catorze clones independentes (8x pBleuscriptII-TSK e 5x pGEM4Z) para determinar a sequência de nucleótidos da extremidade 5' do genoma da estripe de NDV LaSota. A sequência de nucleótidos da extremidade 3' foi determinada por dois métodos independentes. No método I, o iniciador ALG3 foi ligado à extremidade 3' do RNA virai utilizando ligase de RNA de T4 como descrito por Schutze et al. (1995) . A mistura de reacção (volume final 10 pL) continha 2,5 pg de RNA de NDV, 100 pmol de ALG3, 1 pL de tampão de ligase de RNA a lOx (Tris-HCl a 500 mM, pH 7,8, MgCl2 100 mM, DTT a 100 mM, ATP a 10 mM) , 1 pL de DMSO, 1 pL de hexamina-cloreto de cobalto a 10 μΜ, 1 pL de RNasin (Promega) e 10 unidades de ligase de RNA de T4 (New England Biolabs). A mistura foi incubada durante a noite à temperatura ambiente e foi utilizado 5 pL da reacção de 46 ΡΕ1088077 ligação como molde numa reacção de transcrição reversa utilizando ALG4 como iniciador. Foi utilizado 1 pL da reacção de RT numa reacção de PCR utilizando os iniciadores ALG4 e p376 (5'-GAGCCTTAAGGAGCTGCTCGTACTGATC-3'; nt 137- 164) que derivaram da sequência publicada da extremidade 3' de NDV (Ishida et al., 1986). As condições de PCR foram como descrito acima para a RACE de 5'. No método II, as extremidades 3' e 5' do RNA virai de NDV foram ligadas uma à outra utilizando ligase de RNA de T4 utilizando as mesmas condições como descrito acima para o método I. Foi utilizado 5 pL da mistura de ligação como molde numa reacção de transcrição reversa utilizando o iniciador p360. Foi utilizado 1 pL da reacção de RT numa reacção de PCR utilizando os iniciadores p375 e p376 e as condições de PCR descritas acima para a RACE de 5'. Os produtos de PCR foram tratados com polimerase I de DNA de Klenow para criar extremidades rombas e clonados no sitio HincII do plasmideo pGEM4Z (Promega). Foram sequenciados dez clones independentes (4 do método I e 6 do método II) para determinar a sequência de nucleótidos da extremidade 3' do genoma da estirpe de NDV LaSota.

Construção do vector de transcrição

Foi construído um vector de transcrição de baixo número de cópias utilizando o plasmideo pOK12 (Vieira e Messing, 1991) como o replicão básico. 0 plasmideo pOKl2 foi digerido com PvuII e o fragmento de DNA contendo a origem de replicação e o genes de resistência à canamicina 47 ΡΕ1088077 foi isolado. Este fragmento de DNA foi ligado a um fragmento £co47III-AflII (o sitio AflII foi tornado rombo utilizando polimerase I de DNA de Klenow) do vector de transcrição 2,0 (uma oferta generosa do Dr. Andrew Bali; Pattnaik et al., 1992). Do plasmídeo resultante foi removido um fragmento Xbal-Nhel para eliminar tantos sítios de restrição únicos quanto possível. O plasmídeo resultante foi designado pOLTVS (Fig. 1) . O vector de transcrição pOLTV5 contém o promotor da polimerase de RNA dependente de DNA de T7 seguido pelos sítios de restrição únicos StuI e SmaI, a ribozima autocatalítica do vírus da hepatite delta (HDV) e o sinal de terminação de transcrição do bacteriófago T7. Os fragmentos de DNA clonados entre o sítios de restrição StuI e Smal podem ser transcritos quer in vitro ou in vivo utilizando polimerase de RNA de T7. Após transcrição, a extremidade 5' dos transcritos resultantes contêm dois resíduos G codificados pelo plasmídeo. Devido à acção autocatalítica da ribozima de HDV, a extremidade 3' dos transcritos corresponde ao nucleótido terminal exacto do fragmento de DNA clonado (Pattnaik et al., 1992).

Construção de plasmídeos de miniqenoma

De modo a examinar os requisitos para a replicação e transcrição de NDV, foram construídos plasmídeos de minigenoma que continham as regiões dos terminais 3' e 5' de NDV flanqueando um gene repórter que substituiu todos os genes de NDV (Fig. 2). Os fragmentos de 48 ΡΕ1088077 DNA correspondendo às regiões dos terminais 3' e 5' de NDV foram criados por meio de PCR utilizando polimerase de DNA Pwo (30 ciclos; 15 seg a 94 °C, 30 seg a 50 °C, e 30 seg a 72 °C) e utilizando plasmideos contendo os fragmentos de RACE 3' e 5' como moldes (ver acima). A região 3' (nt 1-119) foi criada utilizando os iniciadores 3UIT (51 — ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTACGA-3' , nt 1-27) e SEAP3 (5'-A TCGATACTGGTCAGCATGCTGGCAGAAGGCTTTCTCG-3', nt 102-119). A 5' região (nt 14973-15186) foi criado utilizando os iniciadores SEAP5 (5'-GCATGCTGACCAGTATC GATAT TACAGTAAC TGTGACT-3', nt 14973-14990) e 5NDV (5'-ACCAAACAAAGATTTGGTGAATGACGA-3', nt 15158-15186). Os dois fragmentos de DNA foram reunidos numa PCR de sobreposição (a sobreposição é apresentada em itálico nas sequências iniciadoras apresentadas acima) utilizando os iniciadores 3UIT e 5NDV. O fragmento de DNA resultante, que é uma fusão da extremidade 3' e 5' de NDV separadas por 20 nucleótidos, foi fosforilado por tratamento com cinase de polinucleótido de T4 e clonado em ambas as orientações no plasmideo de transcrição pOLTV5 (Fig. 1) que foi clivado com StuI e Smal e desfosforilado com fosfatase de intestino de vitela (Boehringer Mannheim). Finalmente, o gene SEAP (codificando a fosfatase alcalina secretada) foi recuperado do plasmideo pSEAP-Basic (Clontech) por digestão com sphl e Ciai, e clonado entre os sítios Sphl e Ciai entre as extremidades 3' e 5' de NDV. Os plasmideos resultantes foram designados pOLTV535 e pOLTV553, respectivamente. A transcrição in vivo ou in vitro utilizando polimerase de RNA de T7 do plasmideo pOLTV535 dá origem a RNA antigenómico ([+]-RNA), enquanto 49 ΡΕ1088077 que a transcrição do plasmídeo pOLTV553 dá origem ao RNA genómico ([-]-RNA). Os plasmídeos pOLTV535NO até -N5 e pOLTV553NO até -N5 foram criados inserindo oligonucleótidos auto-complementares no sitio Ciai localizado entre o gene SEAP e a extremidade 5' de NDV em pOLTV535 e pOLTV553, respectivamente (ver Fig. 2). Os oligonucleótidos utilizados foram: NO, 5'-CGCGAGCTCG-3'; Nl, 5'-CGCGAGSCTCG-3'; N2, 5'-CGCGAGCGCTCG-3'; N3, 5'-CGCGAGCWGCTCG-3'; N4, 5'- CGCGAGCATGCTCG-3'; N5, 5'-CGCGAGCASTGCTCG-3' (W = A ou T; S = C ou G) .

Modificação do promotor de T7 nos plasmídeos pOLTV535 e pOLTV553

Para criar transcritos in vitro ou in vivo contendo as extremidades autênticas dos terminais 5' e 3' de NDV, o promotor de T7 nos plasmídeos pOLTV535 e pOLTV553 foi modificado de modo a que a transcrição deva iniciar-se no primeiro nucleótido da extremidade do terminal 3' ou 5' de NDV.

Foram concebidos iniciadores que continham, 1) um sítio de restrição Bgll, 2) a sequência do promotor de T7 (apresentada em itálico) que foi modificada de modo a que dois resíduos G na extremidade do promotor de T7 foram substituídos por um resíduo A, e 3) a extremidade 3' (nt 1-21) ou 5' (nt 15164-15186) de NDV. Os iniciadores BGL3F2 (5' — GATATGGCCATTCAGGCTTAATACGACTCACTATAACCAAACAGAGAATCCGTGAG-3') e SEAP3 (ver acima) foram utilizados para criar um 50 ΡΕ1088077 fragmento de DNA contendo o promotor de T7 modificado e a extremidade 3' inteira de NDV até ao inicio do gene SEAP em pOLTV535. De um modo semelhante, foi criado um fragmento de DNA que continha o promotor de T7 modificado e a extremidade 5' inteira de NDV até ao início do gene SEAP em pOLTV553 utilizando iniciadores BGL5F2 (5'-GATATGGCCATTCAGGCTTAATA-CGACTCACTATAACCAAACAAAGATTTGGTGAATG-3') e SEAP5. Os fragmentos resultantes foram digeridos com Bgll e Sphl (extremidade 3') ou Bgll e Ciai (extremidade 5'), respecti-vamente, e utilizados para substituir o fragmento Bgll-Sphl em pOLTV535, ou o fragmento BglI-Clal em pOLTV553. Os plasmídeos resultantes foram designados pOLTV735 e pOLTV753, respectivamente. Os plasmídeos pOLTV735N3 e pOLTV753N3 foram criados por inserção de um oligonucleótido auto-complementar (5'-CGCGAGCWGCTCG-3'; W = A ou T) no sítio Ciai localizado entre o gene SEAP e a extremidade 5' de NDV em pOLTV735 e pOLTV753, respectivamente.

Construção de plasmídeos repórter de SEAP O plasmídeo pCIneoSEAP foi construído clonando um fragmento Xhol-Clal (o sítio Ciai foi tornado rombo utilizando a polimerase I de DNA de Klenow) contendo o gene SEAP do plasmideo pSEAP-Basic (Clontech) entre os sítios XhoI e Smal do vector de expressão eucariótico pCIneo (Promega). O último plasmídeo contém o promotor do citome-galovírus humano (hCMV) adicionalmente ao promotor de bacteriófago T7. De modo a examinar e quantificar a expressão de SEAP pelos transcritos gerados apenas a partir 51 ΡΕ1088077 do promotor T7, foi construído outro plasmídeo que não tinha o promotor de hCMV. Para este fim, o promotor de hCMV foi removido de pCIneo por digestão parcial com HindIII seguido por digestão completa com BglII. O fragmento de DNA (nt 756-5469, de acordo com a numeração da Clontech) do qual o promotor hCMV foi removido, foi isolado, tratado com polimerase de DNA de T4 para criar extremidades rombas e recircularizadas utilizando ligase de DNA de T4. O plasmídeo resultante foi designado pCIneoD. Finalmente, o gene SEAP foi recuperado a partir de pSEAP-Bacis como um fragmento Mlul-Accl e clonado em pCIneoD entre os sítios MluI e Ciai. O plasmídeo resultante foi designado pCIneoD SEAP.

Transfecções

Foram semeadas células em placas de cultura de 24 poços, cultivadas durante a noite até 60-80% de confluência, e infectadas a uma m.o.i. de 1 com FPV-T7 durante lha 37 °C. As células foram transfectadas com 0,5 pg de DNA de plasmídeo minigenoma, utilizando 3 pL de Lipo-fectAMINE' e OptiMem essencialmente como descrito pelo fornecedor (GibcoBRL/Life Technologies). Após incubação durante 4 h (células CER) ou 16 h (células QM5) a 37 °C as células foram ou infectadas com NDV (isolado virulento Holandês n° 152 608; 200 pL por poço) durante lha uma m.o.i. de 5, ou deixadas não infectadas. O inoculo foi aspirado e substituído por 1 mL de meio completo e as células foram ainda incubadas a 37 °C. Para co-trans- 52 ΡΕ1088077 fecções, as células foram cultivadas em placas de cultura de 6 poços e infectadas com FPV-T7, como descrito acima. As células foram co-transfectadas com 0,25 pg de DNA de plasmideo de minigenoma, 0,4 pg de pCIneoNP, 0,2 pg de pCIneoP e 0,2 pg de pCIneoL(c) ou pCIneo utilizando ou 8 pL de LipofectAMINE ou 9 pL de FuGene 6 (Boehringer Mannheim). De modo a criar virus infeccioso, o plasmideo de minigenoma foi substituído por um plasmideo de transcrição que continha o cDNA de NDV de comprimento total.

Quantificação da actividade de SEAP A quantidade de SEAP que foi secretada para o meio de células transfectadas foi medido em placas descartáveis de 96 poços utilizando o Phospha-Light Chemiluminescent Repórter Assay for Secreted Alcaline Phosphatase kit essencialmente como descrito pelo fornecedor (Tropix). A quimioluminescência foi quantificada utilizando um contador de cintilações em líquido (Wallac 1450 microbeta PLUS).

Clonaqem e sequenciação de cDNA's que se espalham por todo o qenoma da estirpe de NDV LaSota.

Para clonar e sequenciar o genoma inteiro da estirpe de NDV LaSota, foram criadas grandes quantidades de clones de cDNA subgenómico por meio de RT-PCR e clonados em pGEM-T. A síntese da primeira cadeia de cDNA foi realizada utilizando o iniciador 3UIT como descrito acima, e 1 pL da 53 ΡΕ1088077

reacção RT foi utilizado numa reacção de PCR utilizando o Expand Long template PCR kit (Boehringer Mannheim) . A PCR consistiu em 5 ciclos de 10 seg a 94 °C, 30 seg a 58 °C, e 6 min a 68 °C, seguido por 10 ciclos de 10 seg a 94 °C, 30 seg a 58 °C, e 6 min a 68 °C, em que o tempo de elongação a 68 °C foi aumentado em 20 seg por ciclo. Os fragmentos de PCR foram clonados em pGEM-T utilizando o kit de clonagem de pGEM-T essencialmente como descrito pelo fornecedor (Promega). As misturas de ligação foram transformadas na estirpe de E. coli SURE II (Stratagene). Foram realizadas duas reacções independentes de RT-PCR (A e B) e cada uma produziu um conjunto semelhante de clones de cDNA. A sequência de nucleótidos dos clones subgenómicos de cDNA foi determinada utilizando iniciadores específicos para NDV (Tabela 1) e pelos iniciadores que flanqueiam as inserções. Após comparação da sequência de nucleótidos das séries de clones A e B, as ambiguidades permanecentes foram resolvidas por sequenciação das regiões relevantes de uma terceira série independente de cDNA's (série C). A sequência de nucleótidos da estirpe de NDV LaSota é apresentada na Fig.3.

Construção de um clone de cDNA qenómico de NDV de comprimento total. O cDNA de NDV de comprimento total foi montado no plasmídeo de transcrição pOLTV5 utilizando pOLTV535 como o plasmídeo de partida. Os fragmentos de DNA foram unidos nas sobreposições utilizando enzimas de restrição comuns como 54 ΡΕ1088077 detalhado na Fig. 4B. Numa série de passos de clonagem, foi construído um plasmídeo (designado p535-DI) contendo os nucleótidos 1-3521 e 12355-15186 separados por um sítio Ciai que foi criado unindo os sítios Ciai na posição 3521 e 12355. Noutra série de passos de clonagem, foi construído um plasmídeo (designado pGEM-B)que continha parte do genoma de NDV incluindo os nucleótidos 3521-12355 (fragmento Ciai). Para facilitar a clonagem, este último fragmento Ciai foi marcado com o gene da resistência a cloranfenicol (Cm) do plasmídeo pACYC184 (Chang e Cohen, 1978). Para este objectivo o gene Cm foi recuperado de pACYC184 por meio de PCR utilizando os iniciadores CAT-F (5'-GCGTACGTCTAGACTGG-TGTCCCTGTTGATACCGG-3') e CAT-R (5'-GCTCTAGACGTACGACCCTGCC-CTGAACCGACG-3') . A PCR foi realizada com polimerase de DNA Pwo e consistiu em 30 ciclos de 30 seg a 94 °C, 45 seg a 60 °C, e 60 seg a 72 °C. O fragmento de PCR resultante foi digerido com Ssíwi e clonado no sítio único BsiWI de pGEM-B, produzindo pGEM-B(CAT). O fragmento Ciai de pGEM-B(CAT) foi clonado no sítio Ciai de p535-DI, produzindo pNDFL(CAT). Finalmente, o gene Cm foi removido deste plasmídeo por digestão com BsiWI seguido por religação e transformação da estirpe de E. coli DH5a. O plasmídeo resultante foi designado pNDFLf e contém a sequência inteira de cDNA de NDV clonado entre o promotor T7 e a ribozima de HDV no plasmídeo de transcrição pOLTV5.

Clonagem e expressão de genes de NDV individuais.

Os fragmentos de DNA contendo cada um dos genes de NDV LaSota foram criados por meio de RT-PCR e clonado em 55 ΡΕ1088077 pCIneo. Após clonagem, todos os fragmentos foram sequen-ciados utilizando iniciadores flanqueando as inserções e por iniciadores específicos para o gene. Gene NP: foi utilizado o iniciador 386 (5'-GAGCAATCGAAGTCGTACGGGTA-GAAGGTG-3', nt 40-69) para transcrição reversa. Foram utilizados os iniciadores 365 (5'-GTGTGAATTCCGAGTGCGAGCCCGAAG-3'; nt 77-94) e 892 (5'-TTGCATGCCTGCAGGTCAGTACCCCCAGTC-3'; nt 1577-1593) para PCR utilizando polimerase de DNA Pwo. Foi utilizado o seguinte perfil de PCR (30 ciclos) ; 30 seg a 95 °C, 40 seg a 65 °C, e 45 seg a 72 °C. O fragmento de DNA resultante foi digerido com EcoRl e clonado em pCIneo entre os sítios EcoRl e Smal. A expressão de NP foi verificada num ensaio de monocamada de imunoperoxidase (IPMA) como descrito por Peeters et al (1992) utilizando o anticorpo monoclonal 38 (Russell et al., 1983). Gene P: foi utilizado o iniciador pRTl (5'-CAAAGAATTCAGAAAAAAGTA-CGGGTAGAA-3'; nt 1794-1814) para transcrição reversa. Foram utilizados os iniciadores pRTl e p2 (5'-GCAGTCTAGA-TTAGCCATTCACTGCAAGGCGC-3'; nt 3053-3071) para PCR utilizando polimerase de DNA Pwo. Foi utilizado o seguinte perfil de PCR (30 ciclos); 30 seg a 95 °C, 40 seg a 65 °C, e 60 seg a 72 °C. O fragmento de DNA resultante foi digerido com EcoRl e Xbal e clonado em pCIneo entre os sítios EcoRl e Xbal. A expressão de P foi verificada num IPMA utilizando o anticorpo monoclonal 688 (Russell et al., 1983). Gene M: foi utilizado o iniciador 3UIT (5'-ACCAAACAGAGAATCCG-TGAGTTACGA-3' nt 1-27) para transcrição reversa. Foram utilizados os iniciadores NDV5M (5'-GGGTGCTAGCGGAGTGCCCC-AATTGTGCCAA-3'; nt 3268-3288) e NDV3M (5'-TCTCCCCGGGGCA- 56 ΡΕ1088077 GCTTATTTCTTAAAAGGAT-3'; nt 4368-4389) para PCR utilizando o Expand High Fidelity kit. A PCR consistiu em 10 ciclos de 15 seg a 95 °C, 30 seg a 55 °C, e 2 min a 68 °C, seguido por 15 ciclos em que o tempo de elongação a 68 °C foi aumentado durante 20 seg por ciclo. O fragmento de DNA resultante foi tratado com polimerase de DNA de T4 para criar extremidades rombas, digeridas com NheI, e clonadas em pCIneo entre os sitios NheI e Smal sites. A expressão da proteína M foi verificada num IPMA utilizando o anticorpo monoclonal 424 (Russell et al.r 1983). Gene F: foi utilizado o iniciador 3UIT (ver acima) para transcrição reversa. Foram utilizados os iniciadores NDV5F (5' — ACGGGCTAGCGATTCTGGATCCCGGTTGG-3'; nt 4508-4526) e NDV3F (5'-ACTACCCGGGAAACCTTCGTTCCTCAT-3'; nt 6212-31) para PCR utilizando o Expand High Fidelity kit utilizando as condições descritas acima para o gene Μ. O fragmento de DNA resultante foi tratado com polimerase de DNA de T4 para criar extremidades rombas, digeridas com NheI, e clonadas em pCIneo entre os sitios NheI e Smal. A expressão da proteína F foi verificada num IPMA utilizando o anticorpo monoclonal 8E12A8C3 (ID-DLO, departamento de Virulogia Aviária) . Gene HN: foi utilizado o iniciador 3UIT para transcrição reversa. Foram utilizados os iniciadores NDV5HN (5'-GTAGGCTAGCAAGAGAGGCCGCCCCTCAATG-3'; nt 6335-6354) e NDV3HN (5'CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG- 3'; nt 8205-8227) para PCR utilizando o Expand High Fidelity kit utilizando as condições acima descritas para o gene Μ. O fragmento de DNA resultante foi tratado com polimerase de DNA de T4 para criar extremidades rombas e após digestão 57 ΡΕ1088077

com XmaI foi clonado em pCIneo entre o sítio tornado rombo (polimerase de DNA de Klenow) Nhel e o sítio Xmal. A expressão da proteína HN foi verificada num IPMA utilizando o anticorpo monoclonal 86 (Russell et al., 1983) . Gene L: 0 gene L foi recuperado do clone de cDNA pGEM-L7a (Figura 4A) por digestão com SacII e SalI. Antes da digestão com Sall, o sítio SacII foi tornado rombo por tratamento com polimerase de DNA de T4 . O fragmento resultante foi clonado em pCIneo entre o sítio tornado rombo (polimerase de DNA de Klenow) Nhel e o sítio Sall. A região 5' não traduzida entre o promotor T7 e o codão de iniciação ATG do gene L continha 2 codões ATG fora de grelha que podem interferir com a expressão correcta da proteína L. Por isso, foi construído um novo plasmídeo no qual o primeiro ATG não existia e no qual o segundo ATG foi alterado para AAG por meio de mutagénese por PCR, como se segue. Foram utilizados OS iniciadores 5LE (E) 5'-CAATGGAATTCAAGGCAAAACAGCTCAAGG-TAAATAATACGGG-3'; nt 8332-8374) e 3LE(B) 5'-GTGAATCTAGAAT-GCCGGATCCGTACGAATGC-3'; nt 8847-8870) numa reacção de PCR utilizando o plasmídeo pGEML7a (Fig. 4) como um molde. A PCR foi realizada utilizando polimerase de DNA Pwo e consistiu em 30 ciclos de 30 seg a 94 °C, 45 seg a 60 °C, e 60 seg a 72 °C. O fragmento de DNA resultante foi digerido com EcoRI e Xbal e clonado em pCIneo entre os sítios EcoRI e Xbal, criando o plasmídeo pCIneoL(N). Subsequentemente, o fragmento BsiYlI-SalI de pGEM-L7a, que contém a parte restante do gene L (nt 8852-15046), foi clonado em pClneoL(N) entre os sítios BsíWI e Sall, criando o plasmídeo pCIneoL(c). Uma vez que os anticorpos contra a proteína L 58 ΡΕ1088077 não estavam disponíveis, a expressão de L não podia ser verificada por imunoquímica.

Introdução de um marcador genético no gene F.

Para demonstrar sem ambiguidade que os vírus infecciosos podem ser criados a partir de cDNA clonado de comprimento total, foi introduzido um marcador genético no gene F por meio de mutagénese por PCR. Para este fim, o gene F foi clonado utilizando dois fragmentos de PCR sobreponíveis. 0 primeiro fragmento de PCR foi criado utilizando os iniciadores NDV5F (ver acima) e o iniciador F5R (5 ' -AÃAGCGCCGCTGrÇrCCrCCCTCCAGATGTAGTCAC-3 '; nt 4859-4894). Os resíduos apresentados em negrito são alterações que foram introduzidas no iniciador de modo a alterar a sequência de aminoácidos do sítio de clivagem proteolítico entre F1 do da estirpe de NDV LaSota (GGRQGRI L) para o do sítio de consenso de clivagem para estirpes de NDV virulentas (GRRQRR | F) . 0 segundo fragmento de PCR foi criado utilizando os iniciadores F3F (5'-GGAGGAGACAGCGGCGCTTTATA-GGCGCCATTATTGG-3'; nt 4875-4911) e IV09 (5'-CTCTGTCGA-CACAGACTACCAGAACTTTCAC-3'; nt 6246-6266). A PCR foi realizada com polimerase de DNA Pwo e consistiu em 25 ciclos de 15 seg a 94 °C, 30 seg a 55 °C, e 2 min a 72 °C. Os dois fragmentos de PCR sobreponíveis (a sobreposição é apresentada em itálico nas sequências iniciadoras) foram unidos numa segunda PCR utilizando os iniciadores NDV5F e IV09 e utilizando as mesmas condições de PCR. O fragmento resultante, que contém a ORF inteira do gene F e que 59 ΡΕ1088077 codifica um sitio de clivagem de consenso virulento, foi digerido com NheI e Sall e clonado em pCIneo entre os sítios Nhel e Sall, produzindo pCIneoFwt. O fragmento Stul-Not I (nt 4646-4952) de pCIneoFwt foi utilizado para substituir o fragmento correspondente no plasmídeo p535-S que tinha sido construído inserindo o Clal-Scal (nt 3521-10311) de pGEM-B em p535-DI entre os sítios Ciai e Seal (ver Fig. 4C) . O plasmídeo resultante foi designado p535-S[FwtC]. Um fragmento de PCR contendo o gene da resistência a Cm de pACYC184 (ver acima) foi clonado como um fragmento xbal no sítio único xbal (posição 6172 na sequência de NDV) do plasmídeo p535-S[FwtC], produzindo o plasmídeo p535-S[FwtC]Cm. Subsequentemente, o fragmento Apal-Spel marcado com Cm (nt 2285-8094) deste plasmídeo foi utilizado para substituir o fragmento correspondente do clone de cDNA de comprimento total pNDFL+. Finalmente, o gene Cm foi removido deste plasmídeo por digestão com Xbal seguido por recircularização utilizando ligase de DNA de T4. O plasmídeo resultante, que contém o cDNA de NDV geneticamente marcado, de comprimento total, foi designado pNDFL+[Fwt].

Geração de linhas celulares estavelmente transformadas que expressam genes de NDV individuais

Os plasmídeos pCIneoNP, pCIneoP, pCIneoM, pClneoF, pCIneoFwt, e pCIneoHN foram utilizados para a criação de linhas celulares estavelmente transformadas que expressam estas proteínas individualmente. O dia antes da 60 ΡΕ1088077 transfecçâo, foram semeadas células CER em placas de cultura de 6 cm e incubadas durante a noite para produzir uma confluência de 60-80%. As células foram transfectadas com 2 pg de DNA de plasmideo utilizando 12 pL de Lipo-fectAmine e OptiMem essencialmente como descrito pelo fornecedor (GibcoBRL/ Life Technologies). Após 48h as células foram tripsinizadas e foram semeadas as diluições em placas de cultura de 10 cm em meio contendo 500 pg/mL de G418 (Boehringer Mannheim) . A cada 3 dias o meio foi substituído por meio fresco contendo quantidades crescentes (em passos de 100 pg/mL) de G418 até que a concentração de 800 pg/mL tenha sido alcançada. As células foram mantidas em meio contendo 800 pg/mL de G418 e três semanas após a transfecçâo foram repicadas colónias individuais e transferidas para placa de cultura de 96 poços. As linhas celulares clonadas foram examinadas em relação à expressão do respectivo gene de NDV utilizando um IPMA como descrito acima para estudos de expressão transiente. As linhas celulares que expressavam constitutivamente NP, P, M ou F podem ser identificadas e isoladas. Todavia, não foi possível criar linhas celulares que expressassem a proteína HN. Talvez a expressão constitutiva de HN seja tóxica para as células.

Geração de linhas celulares estavelmente transformadas que expressam polimerase de RNA de T7 O gene codificando polimerase de RNA de T7 foi recuperado a partir do plasmideo pRT7NT (René van Gennip, 61 ΡΕ1088077 ID-DLO, Departamento de Virulogia de Mamíferos) por digestão com EcoRI e Sall. O fragmento resultante contém o gene da polimerase de RNA de T7 localizado atrás do promotor plO de baculovírus. O fragmento de DNA foi clonado no plasmídeo pCIneoO entre os sítios EcoRI e Sall sites, criando o plasmídeo pCIneol07. O plasmídeo pCIneoO não tem o promotor T7 e foi derivado de pCIneo por clivagem com NheI seguido por clivagem parcial com Seal, enchendo as extremidades protuberantes com polimerase de DNA de Klenow e recircularização utilizando ligase de DNA de T4. As sequências de baculovírus foram removidas de pCIneol07 por digestão com EcoRI e PacI, seguido por tratamento com polimerase de DNA de T4 para criar extremidades rombas e recircularização. O plasmídeo resultante foi designado pCIneo007. A expressão da polimerase de RNA de T7 foi verificada por co-tranfecção de células com pCIneo007 e pPRhOl. Este último plasmídeo contém a proteína E2 de vírus da febre suína clássico clonado atrás de um promotor de T7 e contendo um sítio de entrada de ribossoma interno (René van Gennip, comunicação pessoal) . A expressão de E2 foi determinada num IPMA utilizando o anticorpo monoclonal V4 (Wensvoort et al., 1986). Foram criadas linhas celulares de CER estavelmente transformadas expressando polimerase de RNA de T7 e isoladas como descrito acima excepto que foram utilizadas placas de cultura de 10 cm e as células foram transfectadas com 5 pg de DNA de pCIneo007 e 25 pL de LipofectAmine. Para examinar as linhas celulares individuais para a expressão da polimerase de RNA de T7, elas foram transfectadas com o plasmídeo pPRhOl e a expressão de 62 ΡΕ1088077 Ε2 (que é dependente da polimerase de RNA de T7) foi determinada num IPMA utilizando o anticorpo monoclonal V4. Foram identificadas várias linhas celulares que expressaram polimerase de RNA de T7. Uma linha celular, designada CER-C9, foi utilizada para experiências subsequentes.

Clonagem e expressão de genes HN e genes híbridos de HN

Foi utilizado o iniciador 3UIT para sintetizar cDNA de cadeia simples de NDV e paramixovírus aviário serotipo-2 e -4 (APMV2 e APMV4) como descrito acima. Todas as reacções de PCR subsequentes foram realizadas utilizando 25 ciclos de 15 seg a 94 °C, 30 seg a 55 °C e 2 min a 72 °C. A região codificante inteira do gene HN de APMV2 foi recuperada por meio de PCR utilizando os iniciadores IV03 (5'-GGGGGAATTCCCCATTCAATGAAGGGTCTAC-3') e IV05 (5'-GATCCCC-GGGTCTTAAACCAGGCTTCGCAATG-3') que foram derivados da sequência do gene HN de APMV2 (Número de Acesso da GenBank D14030) . A região codificante inteira do gene HN de APMV4 foi recuperada por meio de PCR utilizando os iniciadores IV06 (5'-GGGGGAATTCTGGTAGGGTGGGGAAGGTAGC-3') e IV08 (5'-ATTGCCCGGGGGGTAACTAATCAGGATCTCAG- 3') que foram derivados da sequência do gene HN de APMV4 (Número de Acesso de GenBank D14031) . Os fragmentos de PCR resultantes foram digeridos (quer directamente ou após subclonagem em pGEM-T), com EcoRI e Xmal e clonados em pCIneo entre os sítios EcoRI e Xmal. Os plasmideos resultantes foram designados pCIneoHN2 e pCIneoHN4, respectivamente. 63 ΡΕ1088077

Foram construídos híbridos entre o gene HN da estirpe de NDV LaSota e os genes HN de APMV2 e -4 por meio de sobreposição por PCR somo se segue. A parte N-terminal (aa 1-141) do gene HN da estirpe de NDV LaSota foi amplificada com polimerase de DNA Pwo utilizando os iniciadores IV01B (5'-GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3'; nt 6325-6354) e IV10 (5'-AATGAGTTCTTTGCCTATCCCCCC-3'; nt 6811-6834). A parte C-terminal do gene HN de APMV2 (aa 142-580) foi amplificada com polimerase de DNA Pwo utilizando os iniciadores IV11B (5'~G GGGGGATAGGCAAAGAACTCATTCAAGGAGAT-GCATCTGCAGGC-3') e IV05. Os fragmentos de PCR resultantes foram unidos numa PCR de sobreposição (sobreposição apresentada em itálico) utilizando os iniciadores IV01B e IV05 e utilizando a mistura enzimática Expand High Fidelity. O fragmento de PCR resultante foi digerido (quer directamente ou após subclonagem em pGEM-T) com EcoRI e XmaI e clonado em pCIneo entre os sítios EcoRI e Xmal. O plasmídeo resultante que contém um gene HN híbrido consistindo nos aa 1-141 de NDV e aa 142-580 de APMV2 foi designado pCIneoHNl/2 141. A parte C-terminal do gene HN de APMV4 (aa 143-569) foi amplificada utilizando os iniciadores IV14B (5' — GGGGGGArAGGCAMGAACrCArrGTAGATGATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3' ) e IV08. Este fragmento foi unido com a parte N-terminal do gene HN de NDV (ver acima) numa PCR de sobreposição utilizando os iniciadores IV01B e IV08. O fragmento de PCR resultante foi digerido (quer directamente ou após subclo- 64 ΡΕ1088077

nagem em pGEM-T) com EcoRI e Xmal e clonado em pCIneo entre os sítios EcoRI e Xmal. 0 plasmídeo resultante que contém um gene HN híbrido consistindo nos aa 1-141 de NDV e aa 143-569 de APMV4 foi designado pCIneoHNl/4141. Em analogia com as construções acima descritas, foram construídos genes HN híbridos que consistiam nos aa 1-143 de NDV e aa 144-580 de APMV2, ou aa 1-143 de NDV e aa 145-569 de APMV4. Para estas construções, os fragmentos de PCR foram obtidos utilizando os seguintes pares de iniciadores; NDV aa 1-143, iniciador IVOlB-e IV13 (5 '-ATCTACAATGAGTTCTTTGCCTATC-3'; nt 6816-6840); APMV2 aa 144-580, iniciador IV14B (5'-G GGGGGArAGGCAAAGAACrCArrGrAGATGATGCATCTGCAGGCCTAAATTTCC-3') e IV05; APMV4 aa 145-569, iniciador IV15B (5'- GGGGGGATAGGCAAAGAACTCATTGTAGATCAAACAGCTGACTACACAGCAG-3') e IV08. Os fragmentos de PCR foram digeridos (quer direc-tamente ou após subclonagem em pGEM-T) com EcoRI e Xmal e clonados em pCIneo entre os sítios EcoRI e Xmal. Os plasmídeos resultantes foram designados pCIneol/2143 e pCIneol/4143, respectivamente. Para examinar a expressão das proteínas HN, células CER ou células QM5 foram infectadas com FPV-T7 durante lha uma m.o.i. de 1, transfectadas com os plasmídeos pCIneoHN, pCIneoHN2, pCIneoHN4, pCIneoHNl/2 141, pCIneoHNl/2 143, pCIneoHNl/4 143 e pCIneoHNl/4 143, e 24 h após transfecção as monocamadas foram cobertas com uma suspensão de eritrócitos de galinha a 1% em PBS durante 45 min à temperatura ambiente. Subsequentemente, as monocamadas foram cuidadosamente lavadas três vezes com PBS e a adesão dos eritrócitos às células transfectadas foi examinada microscopicamente. Para 65 ΡΕ1088077 examinar a indução da fusão de células após co-expressão da proteina HN e F, as células CER ou células QM5 foram co-transfectadas com pCIneoFwt, juntamente com qualquer de pCIneo-HNl, pCneoHN2, pCIneoHN4, pCIneoHNl/2 141, pCIneoHNl/4 141, pCIneoHNl/2 143 ou pCIneoHNl/4 143. Após incubação durante 2 a 3 dias, as monocamadas foram lavadas com PBS, coradas durante 15 min com um solução de Giemsa (diluição 1:30 em água), e examinadas microscopicamente.

Clonaqem de genes de HN híbridos em cDNA de NDV genómico de comprimento total

Um ligando sintético, designado HN12, foi inserido entre os sítios NotI e Spel de pGEM-T (Promega) utilizando os oligonucleótidos HN12a (5'- GGCCGCATATTCTA-GAGTTAACGACTTA-3') e HN12b (5'-CTAGTAAGTCGTTAACTCTAGA-ATATGC-3'). Um ligando sintético, designado HN14, foi inserido entre os sítios NotI e Spel de pGEM-T utilizando os oligonucleótidos HN14a (5'-GGCCGCATATTCTAGAGTTAACGA-3') e HN14b (5'-CTAGTCGTTAACTCTAGAATATGC-3') . Os plasmídeos resultantes foram designados pGEM-HN12 e pGEM-HNl4, respectivamente. Estes plasmídeos foram digeridos com NotI e Xbal e utilizados para clonar o fragmento NotI-Spel (nt 3390-7488) do plasmídeo p535-S[Fwtc]Cm. Os plasmídeos resultantes foram designados pGEM-HNl/2NS e pGEM-HNl/4NS, respectivamente. Os genes HN destes plasmídeos foram substituídos pelos genes HN híbridos dos plasmídeos pCIneoHNl/2143 e pCIneoHNl/4143, respectivamente (ver secção: 66 ΡΕ1088077

Clonagem e expressão dos genes HN e genes de HN híbridos). Com esta finalidade, pClneoHNl/2143 e pClneoHNl/4143 foram digeridos com Nhel e Smal e os fragmentos resultantes (contendo os genes híbrido HN1/2143 e o híbrido HN1/4143) foram clonados entre o sítio Nhel e Hpal dos plasmídeos pGEM-HNl/2NS e pGEMHNl/4NS, resultando em pGEM+HNl2 e pGEM+HN14, respectivamente. Estes últimos plasmídeos foram utilizados para introduzir os genes HN híbridos no clone de cDNA genómico de NDV de comprimento total. Para esta finalidade, os plasmídeos pGEM+HN12 e pGEM+HN14 foram digeridos com NotI e Spel e o fragmento contendo quer o gene HN12 ou HN14 foi utilizado para substituir o fragmento correspondente de pNDFL+, produzindo pNDFL+HNl/2143 Cm e pNDFL+HNl/4143 Cm, respectivamente. O gene Cm foi removido destes plasmídeos por digestão com Xbal seguido por recircularização utilizando ligase de DNA de T4. de modo a cumprir com a "regra-de-seis", foi inserido um ligando no sítio único Spel destes plasmídeos utilizando oligonucle-ótidos autocomplementares. 0 ligando H2 (5'-CTAGCGAGCGCTCG-3') foi inserido no plasmídeo pNDFL+HNl/2143 e o ligando H3 (5'-CTAGCGAGCWGCTCG-3) foi inserido em pNDFL+HNl/4143, produzindo os plasmídeos pNDFL+HNl/2143 (H2) e pNDFL+HNl/ 4143(H3), respectivamente.

Eliminação de um epitopo específico na proteína HN de NDV La Sota

Um epitopo específico, í.e. aminoácidos 346 a 354 67 ΡΕ1088077 (PDEQDYQIR), na proteína HN de NDV LaSota que é reconhecido pelo MAb 4D6 (Long et al., 1986; Meulemans et al.f 1986), foi eliminado substituindo esta sequência pela sequência correspondente das proteínas HN de qualquer um de APMV-2 (NRTDIQQTI) ou APMV-4 (PDPLQDQIL). Com esta finalidade, o plasmídeo pCIneoHN (ver secção: Clonagem e expressão dos genes de NDV individuais) foi utilizado como molde para criar fragmentos de PCR sobreponíveis. Para a sequência de APMV-2 o primeiro fragmento de PCR foi criado utilizando os iniciadores IV01 (5'-GTAGACGCGTAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3') e o iniciador 3HN2 (5' GATAGTTTGCTGTATATCAGTCCGATTGCATGTGTCA-TTGTATCGCTTGTATATCAC-3'). A segunda PCR foi criada utilizando os iniciadores 5HN2 (5'-AATCGGACTGATATACAGCA-AACTATCATGGCCAAGTCTTCGTATAAGCCTGGAGCC-3') e NDV3-HN (5'-CGAGCCCGGGCCGGCATTCGGTTTGATTCTTG-3'). Os fragmentos resultantes foram combinados e utilizados como molde para uma terceira PCR utilizando os iniciadores IV01B (5'-GTAGGAATTCAAGAGAGGCCGCCCCTCAAT-3') e o iniciador NDV3-HN. Para a sequência de APMV-4 o primeiro fragmento de PCR foi criado utilizando os iniciadores IV01 e o iniciador 3HN4 (5' TAAGATCTGATCTTGCAGCGGGTCAGGGCATGTGTCATTGTATCGCTTGTATAT-CAC-3'). A segunda PCR foi criada utilizando os iniciadores 5HN4 (5'-CCTGA-CCGCTGCAAGATCAGATCTTAATGGCCAAGTCTTCGTATAA-GCCTGGAGCC-3') e NDV3-HN. Os fragmentos resultantes foram combinados e utilizados como molde para uma terceira PCR utilizando os iniciadores IV01B e NDV3-HN. Os iniciadores 3HN2/5HN2 e 3HN4/5HN4 são parcialmente complementares e contêm os códigos genéticos para a sequência de HN2 (NRTDIQQTI) e a sequência de HN4 (PDPLQDQIL), respectiva- 68 ΡΕ1088077 mente. As reacções de PCR foram realizadas utilizando o Expand Long Template PCR kit (Boehringer Mannheim). A PCR consistiu em 30 ciclos de 10 seg a 94 °C, 30 seg a 58 °C e 2 min a 68 °C, seguido por 1 ciclo de 4 min a 68 °C. Os fragmentos de PCR foram digeridos com EcoNI e Bsu361, e clonados entre os sítios EcoNI e Bsu361 de pCIneoHN. Os plasmídeos resultantes foram designados pCIneoHNl (HN2e) e pCIneoHNl (HN4e), respectivamente. A expressão transiente estudada indicou que as proteínas HN modificadas foram expressas correctamente e transportadas para a superfície celular como avaliado a partir de estudos de hemadsorção utilizando eritrócitos de galinha. Além disso, o MAb 6D4 que está dirigido contra um epitopo linear de HN de NDV e que consiste em (ou pelo menos inclui, os aminoácidos 346-354) não reagiu com as proteínas HN modificadas.

Os plasmídeos pCIneoHNl (HN2e) e pCIneoHNl(HN4e) foram digeridos com NarI e SpeI e os fragmentos contendo os genes HN modificados foram clonados entre os sítios NarI e Spel de pGEM-HNl/2NS e pGEM-HNl/4NS, respectivamente. Os plasmídeos resultantes, designados pGEM-HNl(HN2e) e pGEM-HN1 (HN4e), foram digeridos com NotI e Spel, e utilizados para substituir o fragmento NotI-Spel em pNDFL+. Os plasmídeos resultantes foram designados pNDFL-HN(HN2e) Cm e pNDFL-HN (HN4e)Cm, respectivamente. O gene Cm foi removido destes plasmídeos por digestão com Xbal seguido por religação. Os plasmídeos resultantes foram designados pNDFL-HN (HN2e) e pNDFL-HN(HN4e), respectivamente. 69 ΡΕ1088077

RESULTADOS

Sequência de nucleótidos das extremidades dos terminais 3' e 5' do genoma de estirpe de NDV LaSota A sequência de uma extremidade 3' putativa do genoma de NDV foi publicada (Ishida et al., 1986) embora de outra estirpe de NDV (D26) do que aquela aqui utilizada (LaSota). Yusoff et al. (1987) publicaram a sequência do gene L e uma região relativamente grande não codificante atrás do gene L da estirpe de NDV Beaudette C. Todavia, como aqui apresentado, esta sequência não incluiu a extremidade completa do terminal 5' do genoma virai que torna impossível criar NDV de cópia infecciosa. As extremidades dos terminais 3' e 5' do genoma de vírus de RNA de cadeia negativa cumprem uma função essencial na replicação e transcrição (Lamb e Kolakofsky, 1996) . Assim, de modo a criar um cDNA de NDV de comprimento total que pode ser utilizado para criar vírus infecciosos por meio de genética reversa (Conzelmann, 1996), é absolutamente essencial incluir as extremidades 3' e 5' correctas do genoma virai. Por isso, foi determinada a sequência de nucleótidos exacta de ambas as extremidades 3' e 5' do RNA genómico da estirpe de NDV LaSota utilizando processos de RACE em 3' e 5' (amplificação rápida de extremidades de cDNA). A extremidade 5' foi recuperada por meio de PCR após ligação de um único iniciador âncora de cadeia simples (ALG3) ao cDNA de cadeia simples que foi criado por transcrição reversa da extremidade 5' do RNA genómico. Utilizando um iniciador (ALG4) que é complementar ao 70 ΡΕ1088077 iniciador âncora e um iniciador especifico para NDV, foram criados produtos de PCR que continham a extremidade 5'.

Para clonar a extremidade 3' de NDV, o iniciador âncora de cadeia simples ALG3 foi ligado à extremidade 3' do RNA virai utilizando ligase de RNA de T4 e amplificado por meio de PCR utilizando o iniciador ALG4 e um iniciador especifico para NDV (método I) . Alternativamente, as extremidades 3' e 5' do RNA de NDV foram ligadas uma à outra utilizando ligase de RNA de T4 e o RNA concatenado resultante foi utilizado para RT-PCR utilizando iniciadores específicos para NDV que flanquearam o ponto de ligação (método II). Os produtos de RACE de 3' e 5' foram clonados no vector T pBluescriptII-TSK (Ichihara e Kurosawa, 1993) ou em pGEM4Z e vários clones independentes foram isolados e sequenciados. Os resultados estão compilados na Tabela 2. Para permitir a comparação directa das extremidades dos terminais 3' e 5', as sequências são apresentadas na forma de DNA e a extremidade 3' da cadeia genómica é representada como a extremidade 5' da cadeia antigenómica. Ao nível do RNA genómico a sequência da extremidade 3' lê 3'-UGGUUUGUCUCUUAG enquanto que a sequência da extremidade 5' lê UUUAGAAACAAACCA-5'. A sequência da extremidade 3' é quase semelhante à sequência do terminal 3' publicada da estirpe de NDV D26 (Ishida et al., 1986). Todavia, a sequência da extremidade 5' demonstrou que a estirpe de NDV LaSota contém 64 nucleótidos adicionais em comparação com a sequência publicada do gene L da estirpe de NDV Beaudette C (Yusoff et al., 1987). (Figura 6.) 71 ΡΕ1088077

Replicação de miniqenomas de NDV por vírus auxiliares

Para determinar se as extremidades 3' e 5' de NDV são funcionais na replicação e transcrição, foram construídos minigenomas que consistiram na extremidade 3' de NDV (nt 1-119), um gene repórter codificando fosfatase alcalina secretada (SEAP), e a extremidade 5' de NDV (nt 14973-15186) (Fig. 2). Estes minigenomas foram clonados em ambas as orientações no vector de transcrição pOLTV5, criando os plasmídeos pOLTV535 e pOLTV553, respectivamente (para detalhes da construção ver Materiais e Métodos). O plasmídeo pOLTV5 (Fig. 1) contém o promotor da polimerase de RNA de T7 seguido por sítios de restrição únicos StuI e Smal, a ribozima autocatalítica do vírus da hepatite delta (HDV) e o sinal de terminação de transcrição do bacteriófago T7 (Pattnaik et al., 1992). A transcrição in vivo ou in vitro utilizando polimerase de RNA de T7 do plasmídeo pOLTV535 dá origem ao RNA antigenómico (ou [+]-RNA) , enquanto que a transcrição do plasmídeo pOLTV553 dá origem a RNA genómico (ou [-]-RNA) (Fig. 5).

Para examinar se os RNAs do minigenoma criados pelos plasmídeos pOLTV535 e pOLTV553 podem ser replicados e expressos utilizando NDV como vírus auxiliares, foram utilizadas células CER que expressaram polimerase de RNA de T7 quer constitutivamente (células CER-C9, ver Materiais e Métodos), ou após infecção com varíola das aves recombi-nante fpEFLT7pol (Britton et al., 1995; de aqui em diante FPV-T7) que expressa polimerase de RNA de T7. Células CER- 72 ΡΕ1088077 C9 e células CER infectadas com FPV-T7 foram transfectadas com os plasmídeos de minigenoma pOLTV535 ou pOLTV553 e após incubação durante 3h a 37 °C as células foram ou infectadas com NDV durante 1 h, ou deixadas não infectadas. Aproxi-madamente 24 h após transfecção, foi retirada uma amostra do meio e ensaiado para actividade de SEAP. Os resultados demonstraram que a expressão de SEAP foi muito elevada em células infectadas com FPV-T7 que foram transfectadas com pOLTV535. Isto não é surpreendente uma vez que a transcrição por polimerase de RNA de T7 cria [+]-RNA antigenómico, que é coberto por enzimas da varíola das aves e que é eficazmente traduzido pela célula hospedeira. Nas células transfectadas com pOLTV553, a transcrição pela polimerase de RNA de T7 cria [-]-RNA genómico que deve ser convertido em [+]-RNA por vírus auxiliares de modo a ser traduzido na proteína SEAP (cf. Fig. 5). Em ambos os casos, não pode ser observado aumento na expressão de SEAP em células infectadas com NDV em comparação com células não infectadas. Pelo contrário, a expressão de SEAP em células infectadas com NDV foi consistentemente aproximadamente duas vezes mais baixa do que em células não infectadas (resultados não apresentados). Para células transfectadas com pOLTV535 isto pode ser explicado pelo nível já muito elevado da expressão de SEAP pelo transcritos criados pela polimerase de RNA de T7. Todavia, em células tranfectadas com pOLTV553, em que a expressão eficiente de SEAP está dependente da conversão de [-]-RNA genómico no [+]-RNA antigenómico ou mRNA pelo complexo da polimerase virai, seria de esperar um aumento na expressão de SEAP após 73 ΡΕ1088077 infecção com NDV. Pode pensar-se em duas razões pelas quais os minigenomas não podiam ser expressos e replicados por NDV. Primeiro, o tamanho do RNA do minigenoma não se conforma com a denominada "regra-de-seis" (Calain e Roux, 1993; Kolakofsky et al., 1998). De acordo com esta regra, os genomas de paramixovirus são apenas replicados eficientemente quando eles são um múltiplo de 6 nt de comprimento. Em segundo, os dois resíduos G extra que estão presentes na extremidade 5' do RNA do minigenoma pode interferir com a replicação e/ou transcrição correctas pelo complexo da polimerase virai. Para descobrir se a replicação dos genomas estava dependente da regra-de-seis, foi inserida uma série de oligonucleótidos curtos auto-complementares que aumentaram 1 nt de tamanho no sítio único Ciai nos plasmídeos pOLTV535 e pOLTV553 (Fig. 2) . Os plasmídeos resultantes (pOLTV535NO até -N5 e pOLTV553NO até -N5) diferem em tamanho desde 1 até 6 nt e por isso um deles deve criar um RNA de minigenoma que está de acordo com a regra-de-seis. Os plasmídeos foram utilizados para transfectar células CER ou células CER-C9 infectadas com FPV-T7, como descrito acima. Os resultados demonstraram que apenas os plasmídeos pOLTV535N3 e pOLTV553N3 deram origem a uma actividade de SEAP aumentada após infecção com NDV. O comprimento do RNA do minigenoma criado por estes plasmídeos pela polimerase de RNA de T7 foram calculados como sendo 6n+2. Uma vez que dois resíduos G extra estão presentes na extremidade 5' do RNA do minigenoma, estes resultados sugerem que apenas o tamanho da sequência de RNA que está localizada entre as extremidades autênticas de 3' 74 ΡΕ1088077 e 5's do RNA do minigenoma é relevante para a regra-de-seis. Isto foi verificado construindo os plasmídeos do minigenoma em que o inicio de transcrição da polimerase de RNA de T7 foi alterada de modo a que o primeiro nucleótido que foi incorporado no RNA foi o primeiro nucleótido da extremidade 3' ou 5' de NDV (ver Materiais e Métodos). A transfecção destes plasmídeos indicou que apenas os RNAs do minigenoma criado pelos plasmídeos pOLTV735N3 e pOLTV753N3 são replicados pelos vírus auxiliares (resultados não apresentados). Estas descobertas indicam novamente que a replicação de NDV está estritamente dependente da regra-de-seis. Além disso, estas descobertas indicam que a presença de dois resíduos G extra na extremidade 5' dos RNAs do minigenoma não interferem com a replicação correcta. Foram obtidos resultados semelhantes com plasmídeos de minigenoma (ou plasmídeos Dl) de outros paramixoviridae (Pattnaik et al., 1992; Harty e Palese, 1995).

Empacotamento de miniqenomas de NDV por vírus auxiliares

Para determinar se os RNAs do minigenoma podem ser empacotados por vírus auxiliares de NDV, o meio das células transfectadas foi transferido para monocamadas frescas e após lh de adsorção, as monocamadas foram lavadas três vezes com PBS e depois incubadas em meio completo. Após 24 h de incubação, a actividade de SEAP no meio foi medido. Os resultados demonstraram que a actividade de SEAP estava presente apenas nas células que 75 ΡΕ1088077 tinham sido tratadas com o meio das células transfectadas com plasmideo do minigenoma pOLTV553N3 (Tabela 4) . Esta descoberta indica que os RNAs do minigenoma podem ser empacotados em envelopes de NDV e que Estas partículas são capazes de infectar células. Além disso, estes resultados demonstram que o empacotamento está dependente da replica-ção que indica que apenas as moléculas de RNA que são complexadas com as proteínas virais NP, p e L são empacotadas nas partículas do tipo vírus.

Replicação de minigenomas de NDV pelos plasmideos que expressam as proteínas NP, P, e L

Para determinar se os RNAs do minigenoma também podem ser replicados pelos plasmideos codificando as proteínas essenciais NP, P, e L, realizaram-se experiências de co-transfecção em células infectadas com FPV-T7. As células foram transfectadas com uma combinação de plasmí-deos consistindo no plasmideo de minigenoma e os plasmideos pCIneoNP, -P, e -L(c), respectivamente. Como um controlo negativo, o pCIneoL(c), que codifica a proteína L essencial, foi substituída pelo plasmideo vector pCIneo. Os resultados (Tabela 5) indicaram que na verdade, os plasmí-deos codificando NP, P, e L são capazes de replicar RNAs de minigenoma. Os resultados, além disso, demonstram que, de um modo semelhante à replicação do minigenoma por vírus auxiliares, também a replicação pelas proteínas NP, P, e L está dependente da regra-de-seis. 76 ΡΕ1088077

Sequência de nucleótidos do qenoma completo da estirpe de NDV LaSota

Os fragmentos de cDNA sub-genómicos que se estendem pelo genoma inteiro de NDV foram construídos por meios de RT-PCR (Fig. 4). Para manter o número de erros de PCR num mínimo, foi utilizada uma mistura de enzimas de prova de leitura (Expand Long Template; Boehringer Mannheim) em combinação com um número limitado de ciclos de PCR (15 ciclos) . O iniciador 3UIT que é complementar à extremidade 3' de RNA de NDV foi utilizado for transcrição reversa, e os iniciadores específicos para o gene foram utilizados para PCR. Para identificar possíveis erros da PCR, foram realizadas três reacções de RT independentes e utilizadas para criar três conjuntos independentes de cDNAs subgenómicos. Os cDNAs, que variam em tamanho desde aproximadamente 4 até 7 kb, foram clonados em pGEM-T. A sequência de nucleótidos de dois conjuntos de cDNAs foi determinada utilizando iniciadores que eram ou deduzidos a partir das sequências de NDV publicadas, ou por iniciadores derivados da sequência de NDV que foi deduzida durante este projecto de sequenciação (Tabela 1) . As restantes ambiguidades foram resolvidas por sequenciação das regiões relevantes do terceiro conjunto de clones de cDNA. O genoma da estirpe de NDV LaSota consiste em 15186 nt (Fig. 3), que o torna no mais pequeno de todos os genomas de paramixovírus do qual a sequência inteira foi estabelecida, até ao presente (Kolakofsky et al., 1998). 77 ΡΕ1088077

Construção de um clone de cDNA de NDV de comprimento total no plasmídeo de transcrição pOLTV5

Para construir um clone de cDNA de comprimento total da estirpe de NDV LaSota, os clones de cDNA que se espalham pelo genoma de NDV inteiro foram unidos em sítios de restrição partilhados, de acordo com a estratégia apresentada na Fig. 4. O cDNA de NDV inteiro foi montado no plasmídeo de minigenoma pOLTV535 (ver acima) que é derivado do plasmídeo de transcrição pOLTV5. Como pode ser observado na Fig. 4B, o último passo na montagem do cDNA de NDV completo foi a clonagem de um fragmento de aproximadamente 8,8 kb Ciai (nt 3521-12355) de pGEM-B em p535-DI que continha as sequências de NDV flanqueadoras do sítio Ciai em qualquer sítio (i.e., nt 1-3521 e 12355-15186, respectivamente). Este passo demonstrou ser muito difícil uma vez que repetidamente não foi possível criar os clones correctos. Por isso, o fragmento Ciai de pGEM-B foi marcado com o gene da resistência ao cloranfenicol (Cm) do plasmídeo pACYC184. O fragmento Ciai contendo o gene Cm foi isolado e clonado no sítio Ciai de p535-DI e os transformantes foram seleccionados para a resistência contra ambos Cm. Uma vez que estes transformantes cresceram fracamente, a selecção de antibiótico foi reduzida para 15 pg/mL de Cm e 10 pg/mL de Km e a temperatura de incubação foi reduzida desde 37 °C para 32 °C. Finalmente, o gene Cm foi removido deste plasmídeo por digestão com Bsiwi seguido por recircularização utilizando ligase de DNA de T4. Após transformação de E. coli, as células contendo o plasmídeo 78 ΡΕ1088077 desejado foram identificadas fenotipicamente por rastreio para resistência a Km e sensibilidade a Cm. O plasmideo resultante que consistiu no cDNA de NDV de comprimento total clonado entre os sitios Smal e StuI do plasmideo de transcrição pOLTV5 foi designado pNDFL+.

Geração de NDV infeccioso de cDNA de comprimento total

Para criar NDV infeccioso inteiramente a partir de cDNA clonado, o plasmideo pNDFL+ foi utilizado em experiência de co-transfecção com pCIneoNP, -P, e -L(c), como descrito acima para os plasmideos de minigenoma. A transfecção de células CER e CEF foi monitorizada utilizando o plasmideo de minigenoma pOLTV553N3 e medindo a expressão de SEAP. Como um controlo negativo, o pCIneoL(c) foi substituído por pCIneo. Após co-transfecção, as células foram incubadas durante 3 a 6 dias em meio contendo fluido alantóico a 5%. A adição de fluido alantóico é necessária porque as células CER ou CEF não possuem as proteases apropriadas que são necessárias para clivar a proteína F da estirpe de NDV LaSota. A clivagem da proteína F é absolutamente necessária para a disseminação célula-a-célula e para a geração de vírus infeccioso. Após 3 dias de incubação, foi realizada a coloração imunológica das monocamadas fixadas utilizando um anticorpo monoclonal contra a proteína F. Os resultados demonstram que as células que foram coradas com o anticorpo estavam presentes apenas em monocamadas que tinham sido co-transfectadas com pNDFL (+), pCIneoNP, -P, e L(c). Estes resultados indicaram que a replicação e expressão do genoma ocorreu nestas 79 ΡΕ1088077 células. Nãc ) foram observadas células coradas quando foi substituído pCIneoL (c) por pCIneo nas experiências de co- transfecção. Para recuperar 0 vírus infeccioso, 0 sobrenadante das monocamadas de CEF transfectadas foi injectado para a cavidade alantóica de ovos embrionados. Quatro dias mais tarde, o fluido alantóico foi recuperado, analisado num ensaio de hemaglutinação, e passado ainda em ovos. Os resultados demonstraram que apenas o sobrenadante das células transfectadas com uma combinação de pNDFL+ e pCIneoNP, -P, e -L(c) produziram uma reacção positiva no ensaio de hemaglutinação. O fluido alantóico que apresentou uma reacção de hemaglutinação positiva foi subsequentemente analisado num ensaio de inibição de hemaglutinação utilizando os anticorpos monoclonais 7B7, 8C11, 5A1, 7D4, e 4D6 (Long et al., 1986) que podem ser utilizados para diferenciar entre diferentes estirpes de NDV. Os resultados deste ensaio indicaram que a estirpe de NDV que foi recuperada a partir dos ovos inoculados apresentou a mesma reactividade que a estirpe original LaSota. O virus que foi recuperado a partir dos ovos inoculados foi designado NDFL para o distinguir da estirpe original LaSota.

Geração de NDV geneticamente modificado a partir de cDNA de comprimento total

Para demonstrar sem ambiguidade que o sistema de co-transfecção pode ser utilizado para recuperar virus infecciosos de cDNA de NDV clonado de comprimento total, foi introduzido um marcador genético no plasmideo pNDFL(+). Para esta finalidade, a sequência de aminoácidos do sitio 80 ΡΕ1088077 de clivagem de protease na proteína Fo foi alterada daquela da estirpe LaSota (GGRQGR | L) para a sequência de consenso de estirpes virulentas de NDV (GRRQRR | F) por meio de mutagénese de PCR (para detalhes, ver Materiais e Métodos). 0 plasmideo resultante, pNDFL+[Fwt], foi utilizado para criar o virus utilizando o sistema de co-transfecção acima descrito. O virus infeccioso, designado NDFL[Fwt], foi recuperado a partir do fluido alantóico de ovos embrionados que tinham sido inoculados com o meio de células CEF co-transfectadas. Num teste de Hl, todos os MAbs, incluindo 7D4, que é especifico para a estirpe LaSota, apresentou a mesma reactividade com o virus gerado de novo como com a estirpe original LaSota. A sequência de nucleótidos da região codificando o sitio de clivagem de protease da proteína F foi determinada por meio de RT-PCR. Os resultados demonstraram que a sequência de nucleótidos continha as alterações de nucleótidos exactas que foram introduzidas no iniciador mutagénico que foi utilizado para modificar a sequência original LaSota. Esta descoberta demonstra que o vírus foi derivado do plasmideo pNDFL+[Fwt] e demonstrou que o NDV (geneticamente modificado) pode ser criado inteiramente a partir de cDNA de NDV clonado de comprimento total. O sítio de clivagem de protease da proteína Fo de NDV é um determinante chave para a virulência E geralmente assumido que a sequência de amino-ácidos do sítio de clivagem de protease da proteína Fo é um determinante chave para a virulência de diferentes estirpes 81 ΡΕ1088077 de NDV. A geração de uma estirpe LaSota geneticamente modificada em que a sequência de aminoácidos do sitio de clivagem de protease foi alterada a partir de uma estirpe lentogénica (não virulenta) para a de um NDV velogénico (virulento) criou a oportunidade única para testar esta suposição. Por isso, foi determinado o índice de patogenicidade intracerebral (ICPI) do vírus criado de novo NDFL [ Fwt ] e foi comparado com o da estirpe NDFL e da estirpe original LaSota (clone E13-1). Os resultados demonstraram que o ICPI da estirpe NDFL[Fwt] foi 1,3 que é muito acima do valor para as estirpes NDFL (ICPI=0,0) e clone E13-1 (ICPI=0,3). Estes resultados demonstram que, como esperado, a virulência de NDV é largamente determinada pela sequência de aminoácidos do sítio de clivagem da protease da proteína Fo.

Introdução de marcador serolóqico

As glicoproteínas do envelope F e HN de NDV são as proteínas mais imunogénicas do vírus. Após infecção, ambas as proteínas F e HN originam uma forte resposta de anticorpo neutralizante. A indução de uma tal resposta de anticorpo neutralizante é a base de vacinação bem sucedida por estirpes de NDV não virulentas (tais como a estirpe mais vastamente utilizada LaSota). Todavia, a resposta de anticorpo contra as estirpes de vacina de NDV não podem ser distinguidas da resposta de anticorpo contra estirpes de campo de NDV virulentas. Assim, as infecções com vírus de campo virulentas não podem ser rastreadas por métodos 82 ΡΕ1088077 serológicos. Esta situação é indesejável uma vez que as infecções com vírus de campo são mascaradas por vacinação e os sinais clínicos que são provocados por estirpes de campo podem ser passados despercebidos ou serem mesmo atribuídos à vacina. Uma vez que a diferenciação com sucesso entre vacinação e infecção é essencial para a erradicação de NDV, estabeleceu-se o desenvolvimento de estirpes de NDV geneticamente modificadas que podem ser utilizadas para vacinação e que podem ser serologicamente distinguidas das estirpes de campo de NDV (as denominadas vacinas de marcador). De modo a desenvolver uma vacina de marcador de NDV, o vírus tem que ser geneticamente modificado de modo a que um ou vários epitopos imunodominantes de um dos antigénios (principais) são ou eliminados ou modificados. A deleção de parte(s) de uma proteína essencial pode conduzir à perda da função biológica dessa proteína. Por isso, escolheu-se modificar uma das proteínas de envelope imunodominante de NDV de modo a que a função biológica da proteína foi retida enquanto que o repertório de anticorpo contra a proteína modificada diferiu daquele contra a proteína original. Pelas razões especificadas abaixo, foi escolhida uma forma de realização da invenção para modificar a proteína HN de NDV. A infecção de NDV é iniciada pela fusão do envelope do virião com a membrana plasmática da célula hospedeira. Para este processo, tanto a proteína F como a proteína HN são necessárias. Foi demonstrado que as proteínas F e HN interagem fisicamente e que esta interacção é necessária para a fusão da membrana (Deng et ai., 1995). Além disso, foi demonstrado que a 83 ΡΕ1088077 interacção é específica para o tipo, í.e., as proteínas F e HN devem ser derivadas do mesmo vírus de modo a apresentar a actividade de fusão. 0 domínio de interacção da proteína HN de NDV foi localizada na denominada região de caule ou tronco da proteína, compreendendo os primeiros 92 resíduos de aminoácido do ectodomínio da proteína HN (Deng et al., 1995). Proteínas de HN híbridas consistindo nos aa 1-141 de NDV e aa 141-572 do vírus parainfluenza humano tipo-3 (hPIV3) demonstraram reter actividade de fusão quando co-expressas com a proteína F de NDV. Estas descobertas sugerem que estirpes geneticamente modificadas de NDV que contêm uma proteína HN híbrida que consiste na região de tronco de NDV seguido pela cabeça globular da proteína HN de um serotipo de paramixovírus aviário diferente podem ser viáveis. Além disso, essas estirpes iriam induzir uma resposta de anticorpo anti-HN que é diferente da de NDV. Uma vez que a resposta de anticorpo neutralizante contra a proteína F é suficiente para permitir a protecção eficiente contra infecção com vírus de confronto, essas estirpes de NDV geneticamente modificadas cumprem o dois requisitos essenciais de uma vacina marcador, í.e., protecção contra doença e diferenciação serológica.

Foram construídos genes HN híbridos que consistiram na fusão dos aa 1-141 de NDV e aa 142-580 de paramixovírus aviário tipo-2 (APMV2) (designados HN1/2141) ou aa 1-143 de NDV e aa 144-580 de APMV2 (designados HN1/2143) . De um modo semelhante, foram construídos os genes HN híbridos que consistiram em aa 1-141 de NDV e aa 143-569 84 ΡΕ1088077 de AMPV4 (designado HNl/4141) ou aa 1-143 de NDV e aa 145-569 de APMV4 (designado HNl/4143) Os genes hibridos foram clonados no vector de expressão eucariótica pCIneo e utilizados em experiências de co-transfecção com um plasmideo contendo a proteína F de NDV. Para esta finalidade, a proteína F foi modificada de modo a que a sequência de aminoácidos do sítio de clivagem proteolítico entre F2 e Fl foi alterada da sequência de LaSota de modo a que a sequência de consenso das estirpes de NDV virulentas (Fwt, ver secção de Materiais e Métodos). As experiências de co-transfecção em células CER e células QM5 indicaram que ambas as HN1/2141 e HN1/2143 bem como HNl/4141 e HNl/4143 induziram a fusão de células quando co-expressas com a proteína Fwt. Estes resultados indicaram que os complexos entre as proteínas HN híbridas e a proteína F eram biologicamente activa. As proteínas HN híbridas HN1/2143 e HNl/4143 foram utilizadas para substituir o gene HN original no clone de cDNA de comprimento total pNDFL+, produzindo pNDFL-HNl/2143 e pNDFL-HNl/4143. Os últimos dois plasmídeos foram subsequentemente utilizados para a geração de vírus infecciosos utilizando o sistema de co-transfecção acima descrito. Os vírus recombinantes viáveis (designados NDFL-HN1/2143 e NDFL-HN1/4143) podem ser isolados do fluido alantóico de ovos embrionados que tinham sido inoculados com o sobrenadante de monocamadas transfectadas. A presença do gene HN híbrido em cada um de dois recombinantes foi verificada por meio de RT-PCR. Os testes de inibição da hemaglutinação demonstraram que os 85 ΡΕ1088077 anticorpos monoclonais e anti-soros polivalentes contra NDV foram incapazes de inibir a aglutinação de eritrócitos de galinha pelo virus recombinante NDFL-HN1/2143 e NDFL-HN1/4143. Estes resultados indicam que as estirpes NDFL-HN1/2143 e NDFL-HN1/4143 podem ser utilizadas como vacinas que podem ser serologicamente distinguidas a partir de vacinas de NDV clássicas.

Expressão de uma proteína heteróloqa de NDV recombi- nante

Para examinar se os genes estranhos podem ser inseridos no genoma de NDV, foi construído um vírus recombinante que transportava o gene repórter de SEAP. O gene de SEAP foi derivado do plasmídeo pOLTV535 e foi modificado para incluir as típicas caixas de terminação e início de transcrição de NDV. Um fragmento de DNA contendo o gene SEAP seguido pelas caixas de terminação e início de transcrição foi inserido no sítio Xmnl (nt 109) no plasmídeo pNDFL+[Fwt], O vírus infeccioso, designado NDFL-AP, foi criado por meio do sistema de co-transfecção, e a presença do gene de SEAP foi verificado por meio de RT-PCR. As células infectadas com a estirpe NDFL-AP expressaram vários níveis elevados da proteína SEAP. Utilizando a actividade específica da proteína SEAP, calculou-se que x% das proteínas expressas em células infectadas com NDFL-AP consistiu na proteína SEAP. Estes resultados demonstraram que os genes heterólogos podem ser expressos em níveis muito elevados de NDV recombinante. 86 ΡΕ1088077

Geração de um mutante de deleção de NDV numa linha celular trans-complementar

De modo a abolir a expressão da proteína M de NDV, uma grande parte do gene M foi eliminado por digestão de pNDFL+[Fwt] com BsaAI (nt 3087) seguido por digestão parcial com HindIII (nt 4252) . Após enchimento na extremidade HindIII com a polimerase do DNA de Klenow, o fragmento foi recircularizado utilizando ligase de DNA de T4 e utilizado para transformar E. coli. O plasmídeo resultante, designado pNDFL+[Fwt] dM, foi utilizado para criar vírus por meio do sistema de co-transfecção em células CER-M trans-complementares que expressou a proteína M de NDV. O sobrenadante de monocamadas transfectadas foi passado três vezes em células CER-M e analisadas para a presença de vírus. O vírus foi obtido como evidenciado pelo facto de o sobrenadante da cultura da terceira passagem ter produzido resultados positivos em testes de hemaglutinação (HA) e inibição de hemaglutinação (Hl) . 0 vírus foi designado NDFL-dM. Quando foi utilizado NDFL-dM para infectar monocamadas de células CEF, o vírus foi ainda capaz de se disseminar por transmissão célula-a-célula como observado num IPMA utilizando um anticorpo monoclonal contra a proteína F. Conforme esperado, a expressão da proteína M não pode ser demonstrada num IPMA utilizando anticorpos monoclonais contra a proteína M. Quando o sobrenadante foi utilizado para infectar quer células CEF ou células CER-M, foi impossível demonstrar a presença de 87 ΡΕ1088077 vírus replicante nestas monocamadas por meio de IPMA. Esta descoberta indica que os vírus infecciosos não podem ser criados nas células CEF não complementares. Esta descoberta foi confirmada pela observação de que a inoculação de ovos embrionados com sobrenadante de células CEF infectadas não resultou na geração de vírus de progenia quando testados em testes de HA ou Hl. A necessidade de melhores vacinas de NDV, e especialmente a necessidade de vacinas de marcador de NDV, impeliu o desenvolvimento de um sistema de genética reversa que permitiria a modificação genética de NDV. Neste documento, descreve-se que a geração de infecciosa de NDV inteiramente de cDNA clonado de comprimento total. Demonstrou-se que a virulência de NDV pode ser dramaticamente alterado modificando apenas 3 nucleótidos que determinam a especificidade do sítio de clivagem da protease da proteína F. Neste caso, o sítio de clivagem de protease foi alterado a partir daquele da estirpe LaSota para o do sítio de clivagem de consenso de estirpes de NDV virulentas. Criando esta estirpe de NDV geneticamente modificada é criada a prova formal de que a capacidade de clivar a proteína F é o determinante chave (mas não o único determinante) para a virulência de NDV. Utilizando a mesma abordagem de genética reversa, o sítio de clivagem pode ser modificado, à vontade, para qualquer outra sequência de aminoácidos. Isto pode conduzir à geração de uma série de estirpes de NDV que apresentam um espectro de níveis de virulência. 88 ΡΕ1088077 in vivo

Como já mencionado acima, foi demonstrado que, para além da capacidade de clivagem das proteínas F e HN, outros factores virais podem contribuir para a patogeni-cidade. As alterações na transcrição e tradução podem modular o crescimento e a disseminação célula-a-célula do virus e/ou citopatogenicidade. A disponibilidade de um cDNA infeccioso de NDV permite a modificação sistemática de sequências que estão envolvidas na transcrição e repli-cação. Isto pode conduzir à concepção de novas vacinas de NDV que apresentam imunogenicidade óptima para virtualmente não existência de virulência. A segurança é uma das propriedades mais importantes de vacinas vivas. Todavia, para muitas vacinas vivas, incluindo NDV, a imunogenicidade está frequentemente inversamente relacionada com a virulência. Por isso, maior atenuação das vacinas vivas sem perder a imunogenicidade é uma das alterações mais desejadas para a qual a modificação genética pode ser utilizada. Neste aspecto, é vantajoso mencionar que foi demonstrado que a eliminação da expressão da proteina V do virus Sendai resultou numa patogenicidade marcadamente reduzida in vivo para murganhos (Kato et ai., 1997). De modo semelhante ao virus Sendai, o NDV também gera uma proteina V por um mecanismo de edição de RNA conhecido (Steward et al.r 1993). É previsível que a eliminação da expressão da proteina V de NDV também pode resultar num fenótipo atenuado in vivo. Para além de alterar a virulência de NDV, demonstrou-se que é possível modificar a 89 ΡΕ1088077 construção antigénica de NDV de modo a que possam ser criadas estirpes que possam ser serologicamente discriminadas a partir de estirpes de campo de NDV. Estas, denominadas, vacinas de marcador são uma ferramenta inestimável para avaliar a prevalência de NDV em bandos comerciais em todo o mundo. Além disso, a aplicação dessas vacinas de marcador em grande escala podem, em última análise, conduzir à erradicação completa de NDV por um processo de rastreio intensivo e marcação para eliminação dos bandos infectados. Neste documento, demonstra-se que podem ser inseridos genes estranhos no genoma de NDV. Estes genes estranhos podem ser expressos em níveis muito elevados em células infectadas. Isto demonstra que o NDV pode ser utilizado como um vector de vacina para a expressão de antigénios de outros patogénios (de aves domésticas). Várias propriedades tornam o NDV um vector de vacina ideal para vacinação contra doenças respiratórias ou intestinais. 1) 0 NDV pode ser facilmente cultivado até títulos muito elevados em ovos embrionados. 2) A cultura em massa de NDV em ovos embrionados é relativamente barata. 3) As vacinas de NDV são relativamente estáveis e podem ser simplesmente administradas por aplicação em massa de métodos tais como adição à água do bebedouro ou por aspersão ou formação de aerossóis. 4) A via de infecção natural do NDV é através do tracto respiratório e/ou intestinal que são também as principais vias de natural infecção de muitos outros patogénios de aves domésticas. 5) A NDV pode induzir imunidade local apesar da presença de anticorpo maternal em circulação. 90 ΡΕ1088077

Finalmente, é demonstrado que podem ser criados mutantes de deleção de NDV viáveis utilizando linhas celulares trans-complementares. Foi criado um mutuante de deleção de NDV que é incapaz de expressar a proteína de matriz (M) que está envolvida na gemulação de NDV na membrana celular interna. Demonstrou-se que uma estirpe de NDV fenotipicamente complementar que é incapaz de expressar a proteína M é ainda capaz de infectar células e disseminar por meio de transmissão célula-a-célula. Todavia, o vírus mutante é incapaz de criar progenia infecciosa em células não complementares. Esta descoberta demonstra que mutantes de deleção de NDV fenotipicamente complementados podem ser utilizados como vacinas auto-restritas seguras, que são incapazes de disseminar para o ambiente. Uma tal vacina não transmissível combina a vantagem mais importante das vacinas vivas, i.e., eficácia, com a vantagem mais importante das vacinas mortas, i.e., a segurança.

LEGENDAS

Fig.1. O vector de transcrição pOLTV5 é um derivado do vector de transcrição descrito por Pattnaik et al. (1992). Ver texto para detalhes da construção. O plasmídeo contém o promotor da polimerase de RNA dependente de DNA de T7 (apresentado em negrito) seguido por sítios de restrição únicos StuI e Smal e a ribozima autocatalítica do vírus da 91 ΡΕ1088077 hepatite delta (HDV). Os fragmentos de DNA pode ser clonado entre os sítios StuI e Smal e podem ser transcritos quer in vitro ou in vivo utilizando polimerase de RNA de T7. A extremidade 5' dos transcritos resultantes contém dois resíduos G extra que não estão codificados pela inserção. Devido à acção da ribozima, a extremidade 3' dos transcritos corresponde exactamente ao último nucleótido da inserção.

Fig. 2.

Estrutura dos plasmídeos de minigenoma pOLTV535 (Fig. 2A) e pOLTV553 (Fig. 2B). Os plasmídeos de minigenoma são baseados no plasmídeo de transcrição pOLTV5 (cf. Fig. 1) e contêm a região 3' (nt 1-119) e a região 5' (nt 14970-15186) da estirpe de NDV LaSota flanqueando o gene codificando fosfatase alcalina secretada (SEAP). A transcrição de pOLTV535 pela polimerase de RNA de T7 produz RNA antigenómico (ou [+]-RNA) enquanto que a transcrição de pOLTV553 produz RNA genómico (ou [-]-RNA). As caixas de início (S) e final (E), que são sinais de iniciação e terminação de transcrição virai, estão indicados. O codão de iniciação do gene SEAP está sublinhado. As sequências das inserções (N0-N5) no sítio Ciai que criam plasmídeos de minigenoma em que cada um difere 1 nt em comprimento (pOLTV535NO-N5 e pOLTV553NO-N5, respectivamente) são também apresentados.

Fig. 3. 92 ΡΕ1088077 A sequência de nucleótidos do genoma da estirpe de NDV LaSota e a sequência de aminoácidos deduzida dos genes NDV. A sequência apresentada corresponde à cadeia antigenómica e é apresentada na direcção 5' para 3' na forma de ssDNA. A sequência apresentada nesta figura é a da sequência de consenso que foi determinado por sequenciação completa de dois conjuntos independentes de cDNAs subgenómicos sobreponiveis que se estendem pelo genoma inteiro de NDV. As restantes ambiguidades (provavelmente como resultado dos erros da PCR) foram resolvidos por sequenciação de regiões relevantes de um terceiro conjunto independente de clones. A sequência do clone de cDNA de comprimento total pNDFL+ que foi montado a partir de clones de cDNA subgenómicos sobreponiveis (ver Fig. 4), diferem daquele da sequência de NDV de consenso nas seguintes posições (sequência de consenso entre parênteses): nt 1755, G (A); nt 3766, A (G); nt 5109, G (A); nt 6999, T (C); nt 7056, G (A); nt 9337, G (A); nt 9486, A (T); nt 10195, T (C) ; nt 13075, A (G) . Estas diferenças resultam em 3 alterações de aminoácidos (sequência de consenso entre parênteses): proteína F, R189 (Q); proteína HN S200 (P) proteína L- N369 (I) .

Fig. 4. (A) Estratégia global utilizada para a montagem do 93 ΡΕ1088077

cDNA de NDV de comprimento total de clones de cDNA subgenómicos sobreponíveis. O cDNA foi montado no plasmideo pOLTV535 que já continha as extremidades 3'

e 5' da estirpe de NDV LaSota (cf. Fig. 2). O plasmideo resultante, designado pNDFL+, foi utilizado para a geração de NDV infeccioso. (B) Processo detalhado de clonagem para a montagem do

cDNA de NDV de comprimento total de clones de cDNA subgenómico sobreponíveis. Cm representa o gene de resistência a cloranfenicol que foi introduzido temporariamente como um marcador fenotípico (ver texto para detalhes). (C) Processo detalhado de clonagem para a geração de cDNA de NDV geneticamente modificado de comprimento total. A modificação consiste em alterações de 3 nucleótidos que foram introduzidos no gene F e que resulta na modificação da sequência de aminoácidos do sítio de clivagem proteolítico da proteína F (ver texto para detalhes).

Fig. 5. (A) Série pOLTV535. A transcrição por meio da polimerase de RNA de T7 produz RNA antigenómico (ou [+]-RNA) que pode ser directa-mente traduzido na proteína SEAP pela célula. Após infecção das células por vírus auxiliares (ou após co-transfecção de plasmídeos codificando NP, P, e L) , o RNA antigenómico é 94 ΡΕ1088077 utilizado pelo complexo de polimerase virai para a síntese de RNA genómico (ou [-] -RNA) . O RNA genómico é então utilizado pelo complexo de polimerase virai para a síntese quer de mRNA (utilizando as caixas de início [S] e final [E] de transcrição específica) e RNA antigenómico. (B) série pOLTV553. A transcrição por meio da polimerase de RNA de T7 produz RNA genómico (ou [-]-RNA) que não pode ser traduzido na proteína SEAP. Após infecção de células pelos vírus auxiliares (ou após co-transfecção de plasmídeos codificando NP, P, e L) , o RNA genómico é utilizado pelo complexo de polimerase virai para a síntese quer de mRNA (utilizando as caixas de início [S] e fim [E] da transcrição específica) e RNA antigenómico.

Figura 6.

Os alinhamentos das sequências de ácido nucleico das extremidades do terminal 5' de NDV LaSota e outros paramixovírus são apresentados como comparação de sequência de NDV ao longo de quatro membros do género Rubulavírus, três membros do género Paramixovírus, e três membros do género Morbillivírus. As sequências são apresentadas na caixa da extremidade do gene L para a extremidade 5' (3' - 5' cDNA) . NDV, vírus da doença de Newcastle; hPIV2, vírus 2 95 ΡΕ1088077 parainfluenza humano; MuV, vírus da papeira; SV5 e SV41, vírus símio 5 e 41 respectivamente; SeV, vírus sendai; bPIV3, e hPIV3 vírus de parainfluenza bovino e humano, respectivamente; CDV, vírus do distúrbio canino; virus MeV do sarampo RPV, virus da peste do gado. As sequências de nucleótidos (nt) dos genomas inteiros foram obtidos como se segue (N° de acesso): NDV (AF077761); hPIV2 (X57559); MuV(AB000388); SV5 (AF052755); SV41(X64275); bPIV3(D84095); hPIV3 (Z11575): CDV(L13194); MeV (X16565) ; RPV(Z30697).

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Tabela 1. 3’UIT ACCAAACAGAGAATCCGTGAGTTA 1-24 P368+ GT GATGAGGAACCAT GTTGC 368-387 P800+ GTCCGCATCTTCTTGGTTAG 800-819 P1201+ GAGACTT GGAGTAGAGTACG 1201-1220 Ρ127Θ+ AGCAGCAATGAAGGGCCTGG 1279-1298 P1356+ AAATCGGAGTCCTCACTGGG 1356-1375 P1683+ CTCTATATGACCACACCCTC 1664-1683 PRT1 CAAAGAATTCAGAAAAAAGTACGG GTAGAAG 1785-1814 P2357+ GGAAACAGTCAGGAAAGACC 2358-2377 P2599+ TAAGTAAAGTTGACTATCAG 2599-2618 P2852+ GGCACTTAATAAACTTTCGC 2852-2871 P3496+ GAATGAAGAAGCCACTGT CG 3496-3515 P3587+ CGGAGATCTTGTTGAGTTGG 3589-3608 P4267+ CATTATCCA AG C AG GTAC C C 4270-4299 NDV5-F ACGGGCTAGCGATTCTGGATCCCG GTTGG 4498-4526 P4731+(LS) AAGCTCCTCCCGAATCTGCC 4733-4752 P4958+ AGCTCTGATACAAGCCAAAC 4960-4979 P5266+(LS) CTGGTGGGAATATGGATTAC 5267-5286 P5591 +(LS) AGTAACGTTCCCTATGTCCC 5593-5612 P5616+ GTATTTATTCCTGCTTGAGC 5616-5635 P6000 AATAC C CTTG AT CAGAT G AGAGCC 6166-6190 NDV5-HN GTAGGCTAGCAAGAGAGGCCGCCC CTCAAT 6325-6354 P6693+(L) CATT GTT AAAAACT GAGAGC 6695-6714 P7110+(L) ATCGGAAGTCTTGCAGTGTG 7112-7131 P7501+(L) TGGTGGGAAACGCATCCAGC 7503-7522 P7900+(LS) AAGACTTAATCCTACGTCTG 7902-7921 P8590+ AACTCGGAAGGGCAGTACAC 8592-8611 L9000 TTT GT CACT CCT GAACTT GTCATT 9008-9031 P9359+ CAATGATATAGCAGAATCCG 9361-9380 P9371+ GCAGAATCCGTGACTCATGC 9371-9411 P9390+ ATAGCTACTGTATTCTCTGG 9392-9411 P9686+ TCACACGATATCATGTTGAG 9686-9705 P9799+ CACACCCTAACGATAATTGG 9801-9820 P10198+ ATAAGAAACGTATCACTGAC 10200-10219 P10601+ TTGTCGCGTTGCCTGTATGG 10603-10622 P11006+ GCAGACATACTTTGACTCTG 11008-11027 P11393+ TCCCTTATTGTCTGGAGTGC 11395-11414 ΡΕ1088077 106 (continuação) P11798+ TGATACGATAGAACT CGTAG 11800-11819 L12000 CAT ATGT CGCCACATGT GAAGGCT 12008-12031 P12373+ CAACCAGGACATATGATGAG 12375-12394 P12796+ TCGACTGTTCTTACCAACTC 12798-12817 P12978+ CACACCAACTTGCAGATACG 12978-12997 P13236+ GAGTATCTACTGTCGGATGC 13238-13257 P13601+ ATACTT GTTCAGAGGAAT AG 13603-13622 P13943+ GACCTGACCTCAGATAAAGC 13946-13965 P14002+ TATCATTGCTGCATTGTGAC 14004-14023 P360 GGCGATGTAATCAGCCTAGTGCTT 14756-14779 P14812+ ACTAAGGACATACTTGAAGC 14812-14831 P230- CCGGGACTTCTACTTTTAAG 230-211 P998- TTTGGATATCGCCTGAGAGG 998-979 P1898-, AAAGGTGGCCATGTTTGTCC 1898-1879 P2617- TG AT AGT CA ACTTT ACTT AC 2617-2598 P3328- GCAGAATCAAAGTACAGCCC 3330-3311 P3610- CTT GCCAACT CAACAAGATC 3612-3593 P3990- GATTAGCATAGTATCCACTG 3992-3973 NDV3-M TCTCCCCGGGGCAGCTTATTTCTT AAAAGGAT 4400-4368 P4593- GACAGATGCAACTCAGTACC 4625-4606 P4618-(LS) ATGCAACTCAGTACCAGCGC 4620-4601 P5390- GTAGAGTTACCTGTATACCC 5411-5392 NDV3-F ACTACCCGGGAAACCTTCGTTCCT CAT 6238-6212 P6710-(LS) TCTCAGTTTTTAACAATGCC 6712-6693 P7093-(LS) GTTGATGGAACGCAGAGTAG 7095-7076 P7522-(LS) CTGCTGGATGCGTTTCCCAC 7524-7505 P367 AGGGACCTCAATACTAGCCAGTTC 8692-8666 P9905- CTCTATCAAGAGGCGATTAG 9907-9888 P10320- TAAGACAGTACTTTTGCAGG 10322-10303 P10684- GATGCAACT GTGT CAACACC 10687-10706 P11122- AATTGGGCAGGAGTCAGAAC 11124-11105 P11510- TGCCTCCATGATAGCATGCG 11512-11493 P11903- ATTGCTTGGAAGATGGAACC 11905-11886 P12717- TGTCATACACTATTATGGCG 12719-12700 P13141 CAAAGAGTACCGTGTACAGACAGC ATAACC 13172-13143 P13281- GACATGATAGAGCTCACCTG 13302-13283 107 ΡΕ1088077 (continuação) P14101- ACGGAATGCATGGCAAT CAG 14163-14144 P14522- GCTCACCAAACTCTCTGCAC 14524-14505 P14687- AGG ATCTGTCTCGT GCACT G 14709-14690 P377 TTTCCTTAAGTTTGGTAATACCTA GGAC 14888-14861 P359 CAC C AAGT CG ACAATT G G C CAG AA AAGGAG 15046-15017 5NDV AC CAAAC AA AGATTT GGT G AAT GA CGA 15186-15159

Tabela 2. Sequência das extremidades dos terminais 3' e 5' do genoma da estirpe de NDV La Sota A. Sequência da extremidade do terminal 3' (apresentada como a extremidade 5' da cadeia de DNA antigenómico)

método I. clone sequência 04 ACCAAACAGAGAATC 05 ACCAAACAGAGAATC 13 ACCAAACAGAGAATC 21 ACCAAACAGAGAATC método II. clone sequência

26 ACCAAACAGAGAATC 28 ACCAAACAGAGAATC 30 ACCAAACAGAGAATC 31 GCCAAACAGAGAATC 32 ACCAAACAGAGAATC 33 ACCAAACAGAGAATC

Consenso

ACCAAACAGAGAATC 108 ΡΕ1088077 B. Sequência da extremidade do terminal (apresentada como DNA) clones de pBluescriptli-TSK clone sequência

r3101-13 ACCAAACAAAGATTT r3101-14 ACCAAACAAAGATTT r3101-15 ACCAAACAAAGATTT r2601-17 ACCAAACAAAGATTT r2601-18 ACCAAACAAAGATTT r2601-19 ACCAAACAAAGATTT

r2601-20 AACAAGGTGAAGATA r2601-21 ACCAAACAAAGATTT clones de pGEM4Z clone sequência

r3101-16 ACCAAACAAAGATTT r3101-17 ACCAAACAAAGATTT

método I. clone sequência r3101-18 ACCAAACAAAGATTT r3101-19 ACCAAACAAAGATTT r3101-22 ACCAAACAAAGATTT

Consenso ACCAAACAAAGATTT 109 ΡΕ1088077

Tabela 3. Replicação de minigenoma pelos vírus auxiliares de NDV A. Actividade de SEAP (cps) após transfecção das células CER-C9 com as séries de plasmídeos pOLTV535 e POLTV553. plasmídeo +NDV -NDV proporção pOLTV535NO 3,5 x 104 7,1 x 104 0,49 pOLTV535Nl 5, 9 12,1 0,49 pOLTV535N2 2,4 6,2 0,39 pOLTV535N3 7,6 5,2 1,46 pOLTV535N4 1,8 4,1 0,44 POLTV535N5 1,5 3,0 0,50 POLTV553N0 5,5 x 103 9,6 x 103 0,57 POLTV553N1 9,6 27,6 0,35 POLTV553N2 2,4 3, 5 0,68 POLTV553N3 15,1 9,5 1,59 pOLTV553N4 3,4 7,9 0,43 POLTV553N5 2,9 4,8 0,60 B. Actividade de SEAP (cps) após transfecção de células CER infectadas com FPV-T7 com a série de plasmídeos pOLTV553. Plasmídeo +NDV -NDV proporção POLTV553NO 7,2 x 104 8,3 x 104 0,86 pOLTV553Nl 8,4 12,0 0,70 PE1088077 - 110 - pOLTV553N2 8,9 12,6 0,71 pOLTV553N3 27,4 8,6 3,19 pOLTV553N4 9,7 10,4 0,93 pOLTV553N5 8,5 8,1 1,05

Tabela 4.

Transferência da actividade de SEAP (cps) após tratamento das células CER com o sobrenadante de células CER infectadas com FPV-T7 que tinham sido transfectadas com a série de plasmídeos pOLTV553 e que tinham sido superinfectadas com NDV (ver Tabela 3).

Plasmídeo pOLTV553NO 2,4 x 10 pOLTV553Nl 6,2 pOLTV553N2 2,0 pOLTV553N3 20,6 pOLTV553N4 2,0 pOLTV553N5 2,1

Tabela 5

Actividade de SEAP (cp) após co-transfecção de células CER com a série de plasmídeos pOLTV553 e os plasmídeos pCIneoNP, pCIneoP e pCIneoL(c) (ou pCIneo como um controlo negativo). 111 ΡΕ1088077

Proporção de plasmídeo NP, P & L NP, P & pCIneo pOLTV553NO 3,1 x 104 2,7 x 103 11,7 pOLTV553Nl 4,1 5,2 7,9 POLTV553N2 3,1 3,1 10,0 pOLTV553N3 35, 9 3,6 100,8 pOLTV553N4 1,9 4,6 4,1 pOLTV553N5 1,0 4,1 2,5

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek Peeters, Bernardus P.H.

Leeuw de, Olav S.

Koch, Guus

Gielkens, Arnoud L.J. <120> clones vacinas e ensaios de diagnóstico do vírus da doença de Newcastle infecciosos, <130> P22065PC00 <140> PCT/NL99/00377 <141> 1999-06-17 <150> EP 98202054.7 <151> 1998-06-19 <160> 179 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(24) <223> /nota="Iniciador 360" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 0 0 > 1 112 ΡΕ1088077 ggcgatgtaa tcagcctagt gctt 24

<210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1).. (307 <223> /nota="Iniciador âncora ALG3" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 00> 2 cacgaattca ctatcgattc tggatccttc 30

<210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(29) <223> /nota="Iniciador p375" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 00> 3 caatgaattc aaaggatatt acagtaact 29

<210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador ALG4" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 4 gaaggatcca gaatcgatag 20

<210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência Artificial 113 ΡΕ1088077 <2 2 0 > <221> iniciador_ligação <222> (1)..(28) <223> /nota="Iniciador ρ37β" <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 00> 5 gagccttaag gagctgctcg tactgatc 28

<210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(27) <223> /nota="Iniciador 3UIT" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 6 accaaacaga gaatccgtga gttacga 27

<210> 7 <211> 38 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(38) <223> /nota="Iniciador SEAP3" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 7 atcgatactg gtcagcatgc tggcagaagg ctttctcg 38

<210> 8 <211> 38 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1) .. (38) <223> /nota="Iniciador SEAP5" 114 ΡΕ1088077 <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 8 gcatgctgac cagtatcgat attacagtaa ctgtgact 38

<210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(27) <223> /nota="Iniciador 5NDV" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 9 accaaacaaa gatttggtga atgacga 27

<210> 10 <211> 10 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc <222> (1).. (10) <223> /nota="01igonucleótido N0" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: oligonucleótido <400> 10 cgcgagctcg 10

<210> 11 <211> 11 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc <222> (1)..(11) <223> /nota="01igonucleótido Nl, em que S = C ou G" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: oligonucleótido <4 0 0 > 11 cgcgagsctc g 11 115 ΡΕ1088077

<210 > 12 <211> 13 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc <222> (1)..(13) <223> /nota="01igonucleótido N2" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: <400> 12 cgcgagcgct cgd 13

<210> 13 <211> 13 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> característica_misc <222> (1).. (13) <223> /nota="01igonucleótido N3, em que <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: <400> 13 cgcgagcwgc tcg 13

<210> 14 <211> 14 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc <222> (1)..(14) <223> /nota="01igonucleótido N4" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: <4 0 0 > 14 cgcgagcatg ctcg 14

<210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica misc oligonucleótido W = A ou T" oligonucleótido oligonucleótido 116 ΡΕ1088077 <222> (1)..(15) <223> /nota="01igonucleótido Ν5, em que S = C ou G" <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: oligonucleótido <400> 15 cgcgagcast gctcg 15

<210 > 16 <211> 56 <212> DNA <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <221> iniciador_ligação <222> (1) . . (56) <223> /nota="Iniciador BGL3F2" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 0 0 > 16 gatatggcca ttcaggctta atacgactca ctataaccaa acagagaatc cgtgag 56

<210 > 17 <211> 58 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1) . . (58) <223> /nota="Iniciador BGL5F2" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 17 gatatggcca ttcaggctta atacgactca ctataaccaa acaaagattt ggtgaatg 58

<210> 18 <211> 35 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1) . . (36) <223> /nota="Iniciador CAT-F" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador 117 ΡΕ1088077 <400> 18 gcgtacgtct agactggtgt ccctgttgat accgg 35

<210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(33) <223> /nota="Iniciador CAT-R" <220> iniciador <223> Descrição da Sequência Artificial: <4 0 0 > 19 gctctagacg tacgaccctg ccctgaaccg acg 33

<210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador 386" <220> iniciador <223> Descrição da Sequência Artificial: <400> 20 gagcaatcga agtcgtacgg gtagaaggtg 30

<210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(27) <223> /nota="Iniciador 365" <220> iniciador <223> Descrição da Sequência Artificial: <400> 21 gtgtgaattc cgagtgcgag cccgaag 27

<210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial 118 ΡΕ1088077 <2 2 0 > <221> iniciador_ligação <222> (1)..(30) <223> /nota="Iniciador 892" <220> iniciador <223> Descrição da Sequência Artificial: <400> 22 ttgcatgcct gcaggtcagt acccccagtc 30

<210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(30) <223> /nota="Iniciador pRTl" <220> iniciador <223> Descrição da Sequência Artificial: <400> 23 caaagaattc agaaaaaagt acgggtagaa 30

<210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1) .. (32) <223> /nota="Iniciador p2" <220> iniciador <223> Descrição da Sequência Artificial: <400> 24 gcagtctaga ttagccattc actgcaaggc gc 32

<210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(31) <223> /nota="Iniciador NDV5M" <220> 119 ΡΕ1088077 <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 25 gggtgctagc ggagtgcccc aattgtgcca a 31

<210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(32) <223> /nota="Iniciador NDV3M" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 26 tctccccggg gcagcttatt tcttaaaagg a 32

<210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(29) <223> /nota="Iniciador NDV5F" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 27 acgggctagc gattctggat cccggttgg 29

<210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(27) <223> /nota="Iniciador NDV3F" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 28 acticccggg aaaccttcgt tcctcat 27 <216> 29 <211> 30 120 ΡΕ1088077

<212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(30) <223> /nota="Iniciador NDVSHN" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 29 gtaggctagc aagagaggcc gcccctcaat 30

<210> 30 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(30) <223> /nota="Iniciador NDV3HN" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 30 cgagcccggg ccggcattcg gtttgattct tg 32

<210> 31 <211> 43 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(43) <223> /nota="Iniciador 5LE(E)" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 31 caatggaatt caaggcaaaa cagctcaagg taaataatac ggg 43

<210> 32 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(32) <223> /nota="Iniciador 3LE(E)" 121 ΡΕ1088077 <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 32 gtgaatctag aatgccggat ccgtacgaat gc 32

<210> 33 <211> 36 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(33) <223> /nota="Iniciador F5R" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 33 aaagcgccgc tgtctcctcc ctccagatgt agtcac 36

<210> 34 <211> 37 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(37) <223> /nota="Iniciador F3F" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 34

ggaggagaca gcggcgcttt ataggcgcca ttattgg 37 <210> 35 <211> 31 <212>, DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(31) <223> /nota="Iniciador IV09" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 35 ctctgtcgac acagactacc agaactttca c 31 <210> 36 122 ΡΕ1088077

<211> 31 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(31) <223> /nota="Iniciador IV03" <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 36 gggggaattc cccattcaat gaagggtcta c 31

<210> 37 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(32) <223> /nota="Iniciador IV05" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 37 gatccccggg tcttaaacca ggcttcgcaa tg 32

<210> 38 <211> 31 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(31) <223> /nota="Iniciador IV06" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 38 gggggaattc tggtagggtg gggaaggtag c 31

<210> 39 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(31) 123 ΡΕ1088077 <223> /nota="Iniciador IV08" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 39 attgcccggg gggtaactaa tcaggatctc ag 32

<210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(30) <223> /nota="Iniciador IV01B" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 40 gtaggaattc aagagaggcc gcccctcaat 30

<210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(24) <223> /nota="Iniciador IV10" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 00> 41 aatgagttct ttgcctatcc cccc 24

<210> 42 <211> 45 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(45) <223> /nota="Iniciador IV11B" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 42 ggggggatag gcaaagaact cattcaagga gatgcatctg caggc 45 124 ΡΕ1088077

<210> 43 <211> 54 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(54) <223> /nota="Iniciador IV14B" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 43 ggggggatag gcaaagaact attgtagatg atgcatctgc aggcctaaat ttcc 54

<210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(25) <223> /nota="Iniciador IV13" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 44 atctacaatg agttctttgc ctatc 25

<210> 45 <211> 51 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(51) <223> /nota="Iniciador IV15B" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 45 ggggggatag gcaaagaact attgtagatc aaacagctga ctacacagca g 51

<210> 46 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica misc 125 ΡΕ1088077 <222> (1).. (28) <223> /nota="Ligando oligonucleótido HNl2a" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 46 ggccgcatat tctagagtta acgactta 28

<210> 47 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc <222> (1).. (28) <223> /nota="Ligando oligonucleótido HN12b" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 47 ctagtaagtc gttaactcta gaatatgc 28

<210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> característica_misc <222> (1) .. (24) <223> /nota="01igonucleótido HN14a" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 48 ggccgcatat tctagagtta acga 24

<210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica misc <222> (1)..(24) <223> /nota="01igonucleótido HN14b" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 49 ctagtcgtta actctagaat atgc 24 126 ΡΕ1088077

<210> 50 <211> 14 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc <222> (1). (14) <223> /nota="Ligando H2" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 50 ctagcgagcg ctcg 14

<210> 51 <211> 15 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc <222> (1)..(15) <223> /nota="Ligando H3, em que W = A ou T" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 00> 51 ctagcgagcw gctcg 15

<210> 52 <211> 9 <212> PRT <213> virus da doença de Newcastle <220> <221> DOMÍNIO <222> (1)..(9) <223> /nota="Epitopo para o MAb 4D6" <400> 52

Pro Asp Glu Gin Asp Tyr Gin Ile Arg 1 5

<210> 53 <211> 9 <212> PRT <213> Paramixovirus aviário 2 <220>

<221> PÉPTIDO 127 ΡΕ1088077 <222> (1)..(9) <223> /nota="Sequência da proteína HN de APMV-2 correspondendo com a SEQ ID NO 52" <400> 53

Asn Arg Thr Asp Ile Gin Gin Thr Ile 1 5

<210> 54 <211> 9 <212> PRT <213> Paramixovírus aviário 4 <220> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(9) <223> /nota="Sequência da proteína HN de APMV-4 correspondendo com a SEQ ID NO 52" <400> 54

Pro Asp Pro Leu Gin Asp Gin Ile Leu 1 5

<210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(30) <223> /nota="Iniciador IV01" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 55 gtagacgcgt aagagaggcc gcccctcaat 30

<210> 56 <211> 57 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(57) <223> /nota="Iniciador IV01" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 56 128 ΡΕ1088077 gatagtttgc tgtatatcag tccgattgca tgtgtcattg tatcgcttgt atatcac 57

<210> 57 <211> 57 <212> DNA <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <221> iniciador_ligação <222> (1) . . (57) <223> /nota="Iniciador 5HN2" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 57 aatcggactg atatacagca aactatcatg gccaagtctt cgtataagcc tggagcc 57

<210> 58 <211> 50 <212> DNA <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <221> ligação do iniciador <222> (1) .. (50) <223> /nota="Iniciador 3HN4" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 58 tgatcttgca gcgggtcagg gcatgtgtca ttgtatcgct tgtatatcac 50

<210> 59 <211> 56 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1) . . (56) <223> /nota="Iniciador 5HN4" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 59 cctgaccgct gcaagatcag atcttaatgg ccaagtcttc gtataagcct ggagcc 56

<210> 60 <211> 15 <212> RNA 129 ΡΕ1088077 <213> vírus da doença de Newcastle <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(24) <223> /nota="Iniciador 3'UIT, pos. 1-24" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 64 accaaacaga gaatccgtga gtta 24

<210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P386+, pos. 368-387" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 65 gtgatgagga accatgttgc 20

<210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P800+, pos. 800-819" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 66 gtccgcatct tcttggttag 20

<210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P1201+, pos. 1201-1220" 130 ΡΕ1088077 <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 67 gagacttgga gtagagtacg 20 <221> misc_RNA <222> (1)..(15) <223> /nota="RNA genómico da extremidade 3' de NDV" <400> 60 ugguuugucu cuuag 15

<210> 61 <211> 15 <212> RNA <213> vírus da doença de Newcastle <220> <221> misc_RNA <222> (1)..(15) <223> /nota="RNA genómico da extremidade 5' de NDV" <4 00> 61 uuuagaaaca aacca 15

<210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> vírus da doença de Newcastle <220> <221> DOMÍNIO <222> (1)..(7) <223> /nota="Sequência do sítio de clivagem de protease na proteína Fo da estirpe LaSota" <400> 62

Gly Gly Arg Gin Arg Arg Leu 1 5

<210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> vírus da doença de Newcastle <220> <221> DOMÍNIO <222> (1)..(7) <223> /nota="Sequência de consenso das estirpes de NDV virulentas" <400> 63 ΡΕ1088077 131

Gly Arg Arg Gin Arg Arg Phe 1 5

<210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220>

<210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P1279+, pos. 1279-1298" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 68 agcagcaatg aagggcctgg 20

<210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P1356+, pos. 1356-1375" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 69 aaatcggagt cctcactggg 20

<210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P1683+, pos. 1664-1683" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 70 132 ΡΕ1088077 ctctatatga ccacaccctc 20

<210> 71 <211> 31 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(31) <223> /nota="Iniciador PRT1, pos. 1785-1814, (tabela 1)" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 00> 71 caaagaattc agaaaaaagt acgggtagaa g 31

<210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P2357+, pos. 2358-2377" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 72 ggaaacagtc aggaaagacc 20

<210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P2599+, pos. 2599-2618" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 73 taagtaaagt tgactatcag 20

<210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial 133 ΡΕ1088077 <2 2 0 > <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador Ρ2852+, pos. 2852-2618" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 74 ggcacttaat aaactttcgc 20

<210> 75 <211>' 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P3496+, pos. 3496-3515" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 75 gaatgaagaa gccactgtcg 20

<210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1).. (20) <223> /nota="Iniciador P3587+, pos. 3589-3608" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 76 cggagatctt gttgagttgg 20

<210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1) .. (2Õ) <223> /nota="Iniciador P4267+, pos. 4270-4299" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador 134 ΡΕ1088077 <400> 77 cattatccaa gcaggtaccc 20

<210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P4731+ (LS), pos. 4733-4752" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 78 aagctcctcc cgaatctgcc 20

<210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P4958+, pos. 4960-4979" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 79 agctctgata caagccaaac 20

<210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P5266+ (LS), pos. 267-5286" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 80 ctggtgggaa tatggattac 20

<210> 81 <211> 20 <212> DNA 135 ΡΕ1088077 <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P5591+ (LS), pos. 5593-5612" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 00> 81 agtaacgttc cctatgtccc 20

<210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P5616+, pos. 5616-5635" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 82 gtatttattc ctgcttgagc 20

<210> 83 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1) .. (2Õ) <223> /nota="Iniciador P6000, pos. 6166-6190" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 83 aatacccttg atcagatgag agcc 24

<210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P6693+ (L), pos. 6695-6714" 136 ΡΕ1088077 <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 84 cattgttaaa aactgagacc 20

<210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P7110+ (L), pos. 7112-7131" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 85 atcggaagtc ttgcagtgtg 20

<210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P7501+ (L), pos. 7503-7522" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 86 tggtgggaaa cgcatccagc 20

<210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1) .. (20) <223> /nota="Iniciador P7900+ (LS), pos. 7902-7921" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 87 aagacttaat cctacgtctg 20 <210> 88 137 ΡΕ1088077

<211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador Ρ8590+, pos. 8592-8611" <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 88 aactcggaag ggcagtacac 20

<210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(24) <223> /nota="Iniciador L9000, pos. 9008-9031" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 89 tttgtcactc ctgaacttgt catt 24

<210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P9359+, pos. 9361-9380" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 90 caatgatata gcagaatccg 20

<210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) 138 ΡΕ1088077 <223> /nota="Iniciador Ρ9371+, pos. 9371-9411" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 91 gcagaatccg tgactcatgc 20

<210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P9390+, pos. 9392-9411" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial; iniciador <400> 92 atagctactg tattctctgg 20

<210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P9686+ , pos. 9686-9705" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 93 tcacacgata tcatgttgag 20

<210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <221> <221> iniciador_ligação <222> (1) .. (2Õ) <223> /nota="Iniciador P9799+, pos. 9801-9820" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 94 cacaccctaa cgataattgg 20 139 ΡΕ1088077

<210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P10198+, pos. 10200-10219" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 95 ataagaaacg tatcactgac 20

<210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P10601+, pos. 10603-10622" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 96 ttgtcgcgtt gcctgtatgg 20

<210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P 11006+, pos. 11008-11027" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 97 gcagacatac tttgactctg 20

<210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> 140 ΡΕ1088077 <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador Ρ11393+, pos. 11395-11414" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 98 tcccttattg tctggagtgc 20

<210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P11798+, pos. 11800-11819" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 99 tgatacgata gaactcgtag 20

<210> 100 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(24) <223> /nota="Iniciador L12000, pos. 12008-12031" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 100 catatgtcgc cacatgtgaa ggct 24

<210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P12373+, pos. 12375-12394" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador 141 ΡΕ1088077 <400> 101 caaccaggac atatgatgag 20

<210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P12796+, pos. 12798-12817" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 0 0 > 102 tcgactgttc ttaccaactc 20

<210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1) .. (20) <223> /nota="Iniciador P12978+, pos. 12978-12997" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 0 0 > 103 cacaccaact tgcagatacg 20

<210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P13236+, pos. 13238-13257" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 104 gagtatctac tgtcggatgc 20

<210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial 142 ΡΕ1088077 <2 2 0 > <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador Ρ13601+, pos. 13603-13622" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 0 0 > 105 atacttgttc agaggaatag 20

<210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P13943+, pos. 13946-13965" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 0 0 > 106 gacctgacct cagataaagc 20

<210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P14002+, pos. 14004-14023" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 107 tatcattgct gcattgtgac 20

<210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P14812+, pos. 14812-14831" <220> 143 ΡΕ1088077 <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 0 0 > 108 actaaggaca tacttgaagc 20

<210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P230-, pos. 230-211" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 0 0 > 109 ccgggacttc tacttttaag 20

<210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P998-, pos. 998-979" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 110 tttggatatc gcctgagagg 20

<210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P1898-, pos. 1898-1879" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 111 aaaggtggcc atgtttgtcc 20 <210> 112 <211> 20 144 ΡΕ1088077

<212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P2617-, pos. 2617-2598" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 112 tgatagtcaa ctttacttac 20

<210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador 3328-, pos. 3330-3311" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 113

gcagaatcaa agtacagccc 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P3610-, pos. 3612-3593" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 114 cttgccaact caacaagatc 20

<210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P3990-, pos. 3992-3973" 145 ΡΕ1088077 <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 115 gattagcata gtatccactg 20

<210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P4593-, pos. 4625-4606" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 116 gacagatgca actcagtacc 20

<210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P4618- (LS), pos. 4620-4601" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 117 atgcaactca gtaccagcgc 20

<210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P5390-, pos. 5411-5392" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 118 gtagagttac ctgtataccc 20 <210> 119 <211> 20 146 ΡΕ1088077

<212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P6710- (LS), pos. 6712-6693 <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 119 tctcagtttt taacaatgcc 20

<210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P7093- (LS), pos. 7095-7076 <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 120 gttgatggaa cgcagagtag 20

<210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1) .. (20) <223> /nota="Iniciador P5722- (LS), pos. 7524-7505 <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 121 ctgctggatg cgtttcccac 20

<210> 122 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1) .. (24) <223> /nota="Iniciador P367, pos. 8692-8666" 147 ΡΕ1088077 <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 122 agggacctca atactagcca gttc 24

<210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P9905-, pos. 9907-9888" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 123 ctctatcaag aggcgattag 20

<210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P10320-, pos. 10322-10303" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 124 taagacagta cttttgcagg 20

<210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P10684-, pos. 10687-10706" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 0 0 > 125 gatgcaactg tgtcaacacc 20 148 ΡΕ1088077

<210 > 126 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /pote="Primer P11122-, pos. 11124-11105" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 126 aattgggcag gagtcagaac 20

<210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P11510-, pos. 11512-11493" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 127 tgcctccatg atagcatgcg 20

<210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P11903-, pos. 11905-11886" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 0 0 > 128 attgcttgga agatggaacc 20

<210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação 149 ΡΕ1088077 <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador Ρ12717-, pos. 12719-12700" <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 129 tgtcatacac tattatggcg 20

<210> 130 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(30) <223> /nota="Iniciador P13141, pos. 13172-13143" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 0 0 > 130 caaagagtac cgtgtacaga cagcataacc 30

<210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P13281-, pos. 13302-13283" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 0 0 > 131 gacatgatag agctcacctg 20

<210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P14101-, pos. 14163-14144" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 132 150 ΡΕ1088077 acggaatgca tggcaatcag 20

<210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P14522-, pos. 14524-14505" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 0 0 > 133 gctcaccaaa ctctctgcac 20

<210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(20) <223> /nota="Iniciador P14687-, pos. 14709-14690" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <4 0 0 > 134 aggatctgtc tcgtgcactg 20

<210> 135 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> iniciador ligação <222> (1) .. (28) <223> /nota="Iniciador P377, pos. 14888-14861" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 135 tttccttaag tttggtaata cctaggac 28

<210> 136 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial 151 ΡΕ1088077 <220> <221> iniciador_ligação <222> (1)..(30) <223> /nota="Iniciador Ρ359, pos. 15096-15017" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador <400> 136 caccaagtcg acaattggcc agaaaaggag 30

<210> 137 <211> 15 <212> DNA <213> vírus da doença de Newcastle <220> 221> característica_misc <222> (1)..(15) <223> /nota="Sequência da extremidade do terminal 3' do genoma ds estirpe de NDV La Sota dos clones 04, 05, 13, 21, 26, 28, 30, 32 e 33 (apresentadas as extremidade 5' da cadeia de DNA antigenómico)" <400> 137 accaaacaga gaatc 15

<210> 138 <211> 15 <212> DNA <213> vírus da doença de Newcastle <220> <221> característica_misc <222> (1)..(15) <223> /nota="Sequência da extremidade do terminal 3' do genoma da estirpe de NDV La Sota do clone 31 (apresentado como a extremidade 5' da cadeia de DNA antigenómica)" <400> 138 gccaaacaga gaatc 15

<210> 139 <211> 15 <212> DNA <213> vírus da doença de Newcastle <220> <221> característica misc <222> (1)..(15) <223> /nota="Sequência da extremidade do terminal 5' do genoma da estirpe de NDV La Sota dos clones r3101-13, r3101-14, r3101-15, r2601-17, r2601-18, r2601-19, r2601-21, e pGEM4Z-clones (apresentados como DNA)" 152 ΡΕ1088077 <400> 139 accaaacaaa gattt 15

<210> 140 <211> 15 <212> DNA <213> vírus da doença de Newcastle <220> <221> caracteristica_misc <222> (1). (15) <223> /nota="Sequência da extremidade do terminal 5' do genoma da estirpe de NDV La Sota do clone r2601-20 (apresentado como DNA) " <400> 140 aacaaggtga agata 15

<210> 141 <211> 43 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> característica_misc <222> (1)..(43) <223> /nota="Transcrição-vector pOLTV5" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmídeo <4 0 0 > 141 ttaatacgac tcactatagg cctggatctt cccgggtcgg cat 43

<210> 142 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> característica_misc <222> (1). (32) <223> /nota="Parte do vector de transcrição pOLTV535 incluindo o promotor T7" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmídeo <400> 142 ttaatacgac tcactatagg accaaacaga ga 32

<210> 143 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial 153 ΡΕ1088077 <220> <221> característica_misc <222> (1).. (22) <223> /nota="Parte do vector de transcrição pOLTV535 incluindo o sitio de clivagem da ribozima" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmídeo <400> 143 tctttgtttg gtgggtcggc a 22

<210> 144 <211> 26 <212> DNA <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <221> caracteristica_misc <222> (1)..(26) <223> /nota="Parte do vector de transcrição pOLTV535 incluindo o sítio Sphl" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmídeo <400> 144 gccttctgcc agcatgctgc tgctgc 26

<210> 145 <211> 25 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> característica_misc <222> (1)..(25) <223> /nota="Parte do vector de transcrição pOLTV535 incluindo o sítio Ciai" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmídeo <400> 145 ccgctgaatt ggaatcgata ttaca 25

<210> 146 <211> 24 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> característica_misc <222> (1)..(24) <223> /nota="Variantes do vector de transcrição pOLTV535 154 ΡΕ1088077 incluindo a inserção NO no sítio Ciai" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmídeo <400> 146 ccgctgaatt ggaatccgag ctcg 24

<210> 147 <211> 25 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> característica_misc <222> (1)..(25) <223> /nota=" Variantes do vector de transcrição pOLTV535 incluindo a inserção NI no sítio Ciai" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmídeo <4 0 0 > 147 ccgctgaatt ggaatccgag sctcg 25

<210 > 148 <211> 26 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0 > <221> característica_misc <222> (1) . . (26) <223> /nota=" Variantes do vector de transcrição pOLTV535 incluindo a inserção N2 no sítio CiaI" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmídeo <4 0 0 > 148 ccgctgaatt ggaatccgag cgctcg 26

<210> 149 <211> 27 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> característica_misc <222> (1)..(27) <223> /nota=" Variantes do vector de transcrição pOLTV535 incluindo a inserção N3 no sítio Ciai" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmídeo 155 ΡΕ1088077 <400> 149 ccgctgaatt ggaatccgag cwgctcg 27

<210> 150 <211> 28 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc <222> (1).. (28) <223> /nota=" Variantes do vector de transcrição pOLTV535 incluindo a inserção N4 no sitio Ciai" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmideo <400> 150 ccgctgaatt ggaatccgag catgctcg 28

<210> 151 <211> 29 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc <222> (1).. (29) <2 2 3> /nota=" Variantes do vector de transcrição pOLTV535 incluindo a inserção N5 no sitio Ciai" <22 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmideo <400> 151 ccgctgaatt ggaatccgag castgctcg 29

<210> 152 <211> 32 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> característica_misc <222> (1)..(32) <223> /nota="Parte do vector de transcrição pOLTV553 incluindo o promotor de T7" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmideo <400> 152 ttaatacgac tcactatagg accaaacaaa ga 32 156 ΡΕ1088077

<210> 153 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc <222> (1)..(22) <223> /nota="Parte do vector de transcrição pOLTV553 incluindo o sitio de clivagem da ribozima" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmideo <400> 153 tctgtgtttg gtgggtcggc a 22

<210> 154 <211> 25 <212> DNA <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <221> característica_misc <222> (1) . . (25) <223> /nota=" Parte do vector de transcrição pOLTV553 incluindo O sítio Ciai" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmideo <400> 154 tgtaatatcg attccaattc agcgg 25

<210> 155 <211> 26 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> característica_misc <222> (1).. (26) <223> /nota=" Parte do vector de transcrição pOLTV553 incluindo o sítio Sphl" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmideo <400> 155 gcagcagcag catgctggca gaaggc 26

<210> 156 <211> 17 <212> DNA <213> Sequência Artificial 157 ΡΕ1088077 <220> <221> caracteristica_misc <222> (1)..(17) <223> /nota="Variantes do vector de transcrição pOLTV553 incluindo a inserção NO no sitio Ciai" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmideo <400> 156

tgtaatatcc gagctcg 17 <210> 157 <211> 18 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc <222> (1)..(18) <223> /nota=" Variantes do vector de transcrição pOLTV553 incluindo a inserção NI no sitio Ciai" <210> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmideo <400> 157 tgtaatatcc gagsctcg 18

<210> 158 <211> 19 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> característica_misc <222> (1) .. (19) <223> /nota=" Variantes do vector de transcrição pOLTV553 incluindo a inserção N2 no sitio CiaI" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmideo <400> 158 tgtaatatcc gagcgctcg 19

<210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica misc <222> (1) . . (20) transcrição pOLTV553 <223> /nota=" Variantes do vector de incluindo a inserção N3 no sitio Ciai" 158 ΡΕ1088077 <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmideo <400> 159 tgtaatatcc gagcwgctcg 20

<210> 160 <211> 21 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc <222> (1)..(21) <223> /nota=" Variantes do vector de transcrição pOLTV553 incluindo a inserção N4 no sitio Ciai" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmideo <400> 160 tgtaatatcc gagcatgctc g 21

<210> 161 <211> 22 <212> DNA <213> Sequência Artificial <220> <221> caracteristica_misc <222> (1) .. (22) <223> /nota=" Variantes do vector de transcrição pOLTV553 incluindo a inserção N5 no sitio CiaI" <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: plasmideo <4 0 0 > 161 tgtaatatcc gagcastgct cg 22

<210> 162 <211> 15186 <212> DNA <213> vírus da doença de Newcastle <220> <221> intrão <222> (1)..(121) <223> /nota="Sequência de nucleótidos da estirpe de NDV La Sota" <220>

<221> CDS <222> (122) .. (1591) <223> /nota="Sequência de nucleótidos da estirpe de NDV La Sota" 159 ΡΕ1088077 <2 2 0 > <221> intrão <222> (1592) .. (1886) <223> /nota="Sequência de nucleótidos da estirpe de NDV La Sota" <220>

<221> CDS <222> (1887) .. (3074) <223> /nota="Sequência de nucleótidos da estirpe de NDV La Sota" <220> <221> intrão <222> (3075) .. (3289) <223> /nota="Sequência de nucleótidos da estirpe de NDV La Sota" <220>

<221> CDS <222> (3290) .. (4384) <223> /nota="Sequência de nucleótidos da estirpe de NDV La Sota" <220> <221> intrão <222> (4385) .. (4543) <223> /nota="Sequência de nucleótidos da estirpe de NDV La Sota" <220>

<221> CDS <222> (4544) .. (6205) <223> /nota="Sequência de nucleótidos da estirpe de NDV La Sota" <220> <221> intrão <222> (6206) .. (6411) <220>

<221> CDS <222> (6412) .. (8145) <220> <221> intrão <222> (8146) .. (8380) <220>

<221> CDS <222> (8381) . . (14995) <220> <221> intrão <222> (14996) .. (15186) <400> 162 160 ΡΕ1088077 accaa^caga gaatccgtga gttacgataa aaggcgaagg agcaattgaa gtcgcac^gg 60 tagáaggtgt gaatctcgag tgcgagcccg aagcacaaac tcgagaaagc cttctgccaa 120 c atg tct tec gta ttt gat gag tac gaa cag ctc ctc gcg gct cag actl69 Met Ser Sçr Vai Phe Asp Glu Tyr Glu Gin Leu Leu Ala Ala Gin Thr 15 10 15 cgc ccc aat gga gct cat gga ggg gga gaa aaa ggg agt acc tta aaa 217 Arg;Pro Asn Gly Ala His Gly Gly Gly Glu Lys Gly Ser Thr Leu Lys 20 25 30 gta'gac gtc ccg gta ttc act ctt aac agt gat gac cca gaa gat aga 265 Vai Asp Val Pro Val Phe Thr Leu Asn Ser Asp Asp Pro Glu Asp Arg 35 40 45 tgg;age ttt gtg gta ttc tgc ctc cgg att gct gtt age gaa gat gee 313 TrpSer Phe Val Val Phe Cys Leu Arg Ile Ala Val Ser Glu Asp Ala 50 55 60 aac aaa cca ctc agg caa ggt gct ctc ata tct ctt tta tgc tcc cac 361 AsnLys Pro Leu Arg Gin Gly Ala Leu lie Ser Leu Leu Cys Ser His 65. 70 75 80 161 ΡΕ1088077 tca CÈÍf gt-8 atg sgg aac ca.t gtt gos att gea ggç a a® cag ast gaa 409 Ser Gin Vai Met ftorg Acn Me Vai Ara Ile Ala Qly hW Gin Asn Gltt 05 90 95 gçc eca ttg gee 0*« ott gag att gafc ggc ttt gee aac ggc acg ccc 45? 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<210> 178 <211> 30 <212> DNA <213> vírus da doença de Newcastle <220> <221> característica_misc <222> (1)..(30) <223> /nota="SV41 Rubulavírus alinhado com NDV La Sota" <400> 178 ttaagaaaaa atatccgttc tccccttggt 30

<210> 179 <211> 42 <212> DNA <213> vírus da doença de Newcastle <220> <221> característica_misc <222> (1).. (42) <223> /nota="SV5 Rubulavírus alinhado com NDV La Sota" <400> 179 ttaagaaaaa agaagaggat taatcttggt tttccccttg gt 42 202 ΡΕ1088077

Lisboa, 17 de Outubro de 2007

Claims (16)

1. ΡΕ1088077 1 REIVINDICAÇÕES 1. cDNA de Paramixovírus aviário compreendendo pelo menos a extremidade do terminal 5' do genoma do virus da doença de Newcastle (NDV) correspondendo à extremidade do terminal 5' de NDV, como apresentado na Figura 6, permitindo criar uma cópia infecciosa de paramixovírus aviário. 2. cDNA de acordo com a reivindicação 1 compreendendo um cDNA de comprimento total. 3. cDNA compreendendo pelo menos a extremidade do terminal 5' do genoma de NDV, correspondendo ao terminal 5' e ao NDV como apresentado na Figura 6 permitindo criar um minigenoma replicante de paramixovírus aviário. 4. cDNA de acordo com as reivindicações 1, 2, ou 3 pelo menos parcialmente derivadas do vírus da doença de Newcastle. 5. cDNA de acordo com a reivindicação 4, em que o referido vírus da doença de Newcastle é um vírus lentogénico, preferencialmente derivado de uma estirpe de vacina. 6. cDNA de acordo com a reivindicação 5, em que a referida estirpe de vacina é uma estirpe LaSota ATCC VR-699. 2 ΡΕ1088077 7. cDNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, adicionalmente proporcionado com uma modificação num ácido nucleico por meio de modificação genética, compreendendo o referido cDNA o terminal 5' e é especificado na reivindicação 1. 8. cDNA de acordo com a reivindicação 7, em que a referida modificação compreende um ácido nucleico codificando um sitio de clivagem de protease modificado. 9. cDNA de acordo com a reivindicação 8 em que o referido sitio de clivagem é um sitio de clivagem de protease da proteína de fusão (F) . 10. cDNA de acordo com a reivindicação 7, em que a referida modificação compreende um ácido nucleico codificando uma proteína do envelope virai híbrido. 11. cDNA de acordo com a reivindicação 10, em que a referida proteína é uma proteína de hemaglutinina-neuraminidase (HN). 12. cDNA de acordo com a reivindicação 7, em que a referida modificação compreende a deleção num ácido nucleico codificando a proteína virai. 13. cDNA de acordo com a reivindicação 12, em que a referida proteína virai é uma proteína de matriz (M). 3 ΡΕ1088077 14. cDNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 adicionalmente proporcionada com um ácido nucleico codificando um antiqénio heteróloqo. 15. cDNA de acordo com a reivindicação 14, em que o referido antigénio é derivado de um patogénio de aves domésticas.
2. 16. RNA obtido a partir de um cDNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
3. 17. Método para criar paramixovirus aviário de cópia infecciosa compreendendo transfectar pelo menos uma célula com cDNA de acordo com qualquer das reivindicações 7 a 15.
4. 18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a referida célula é, pelo menos, capaz de expressar a proteína da virai nucleocápside (NP), fosfo- (P) ou grande polimerase (L) .
5. 19. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 18 compreendendo ainda permitir a clivagem da proteína de fusão do referido vírus.
6. 20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 19 compreendendo ainda incubar a referida célula em meio de cultura compreendendo actividade proteolítica. 4 ΡΕ1088077
7. 21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que o referido meio de cultura compreende fluido alantóico compreendendo a referida actividade proteolitica.
8. 22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 21 em que a referida célula é derivada de uma célula de galinha.
9. 23. Paramixovirus aviário infeccioso compreendendo um gene heterológo que se pode obter por um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22.
10. 24. Vacina compreendendo um virus de acordo com a reivindicação 23.
11. 25. Vacina de acordo com a reivindicação 24, compreendendo uma vacina viva.
12. 26. Vacina de acordo com a reivindicação 24 ou 25, em que o referido paramixovirus aviário de cópia infec-ciosa é derivado de um virus da doença de Newcastle (NDV).
13. 27. Método para distinguir uma amostra de animais não vacinados ou animais vacinados com a vacina de NDV de amostras de animais infectados com NDV de tipo selvagem ou vacinados com uma estirpe de NDV não modificada ou lentogénica compreendendo: determinar em pelo menos uma amostra dos referidos animais a presença de anticorpos 5 ΡΕ1088077 dirigidos contra um epitopo imunodominante ou marcador do referido NDV de tipo selvagem ou não modificado, mas não da referida vacina, em que a referida vacina de NDV compreende um virus que foi obtido transfectando pelo menos uma célula com cDNA de acordo com as reivindicações 10 ou 11.
14. 28. Método de acordo com a reivindicação 27, em que os referidos anticorpos são dirigidos contra a proteína HN ou F de NDV.
15. 29. Método de acordo com a reivindicação 27 ou 28, em que o referido animal é seleccionado a partir do grupo composto por aves domésticas, preferencialmente de galinhas.
16. 30. Paramixovirus aviário infeccioso de acordo com a reivindicação 23, em que o referido gene heterólogo expressa proteínas imunoestimuladoras. Lisboa, 17 de Outubro de 2007