JP2002518012A

JP2002518012A - ニューカッスル病ウイルス感染性クローン、ワクチンおよび診断アッセイ

Info

Publication number: JP2002518012A
Application number: JP2000554854A
Authority: JP
Inventors: ペトルスヒューベルツスペーテルス，ベルナルデュス; レーウ，オラフスフェンデ; コッフ，フース; レオナルトヨセフヒールケンス，アルナウト
Original assignee: ID Lelystad Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid BV
Current assignee: ID Lelystad Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid BV
Priority date: 1998-06-19
Filing date: 1999-06-17
Publication date: 2002-06-25
Also published as: JP2006141398A; DE69936585D1; IL140381A0; EP1088077B1; BR9911383A; NO329193B1; PL348300A1; EP0974660A1; US7547442B2; EA200100057A1; CN101275142A; EP1088077A1; DK1088077T3; EP1088077B2; PT1088077E; CZ300760B6; CN1314942A; IL140381A; US20040235134A1; US6719979B2

Abstract

(57)【要約】本発明はクローン化した完全長ｃＤＮＡから感染性ニューカッスル病ウイルスを完全に生成させる方法、および前記方法により生成した、また前記方法から誘導したワクチンおよび診断アッセイに関する。該方法は遺伝子修飾によりＮＤＶゲノムを修飾する可能性を提供し、突然変異、欠失、および／または挿入の導入を可能とする。該方法はＮＤＶの毒性を修飾するために使用し得るものであり、それによって高い特性の新しい弱毒化生ワクチンを生成させることができる。該方法はＮＤＶの抗原性構造を修飾するために使用し得るものであり、したがって、ＮＤＶ野生株と血清学的に識別し得る生菌ＮＤＶマーカーワクチンの生成を可能とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は家禽のニューカッスル病のウイルスの感染に関する。

【０００２】ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、死に到る、最も多様な鳥類伝染病原
菌の一つである。ニューカッスル病は明らかに新しい病気として、いくつかの地
理的に異なる場所でほとんど同時期に発生し、しかもその病気のタイプと重篤度
が非常に多様であることから、学名を付けるに当たりいくつかの問題を引き起こ
した。

【０００３】この病気は、偽性鶏ペスト、偽性家禽ペスト、鳥類ペスト、鳥類ジステンパー
、鳥類気脳炎と命名されている。この病気が重大となったのは、主として、２０
世紀において家禽産業が、各国間における集約的な取引に依存する非常に効率の
よい国際的産業に発展したためである。

【０００４】ニューカッスル病は、１９２６年にジャワ（インドネシア）およびタイン川上
流のニューカッスル（イギリス）で最初に発生したと一般的に推測されている（
Kraneveld、１９２６；Doyle、１９２７）。ニューカッスル病という名前は、他
の病気と間違われる可能性がある記述的な名前を避け、仮の名前としてドイルに
よって作り出された。後に、重篤度において劣る他の病気が、ＮＤＶと見分けが
つかないウイルスが原因であることが明らかとなった。アメリカにおいては、比
較的軽度の呼吸器系の病気が鳥類気脳炎と名付けられ、ＮＤＶが原因であること
が示された（Beach、１９４４）。２，３年以内に、鶏において非常に軽度の病
気の原因となる、または、病気の原因とならない、多くのＮＤＶの単離が世界中
で行われた。

【０００５】以下の方法は、この病気の拡大に関係するものであった：１）生活している鳥
、野生の鳥、猟用鳥類、レース用鳩、商用家禽の移動、２）人間や備品の移動、
３）家禽製品の移動、４）風媒による拡大、５）家禽の餌の汚染、６）水の汚染
、７）不活性化が不完全な、または、異種起源のワクチン。ＯＩＥによれば、ニ
ューカッスル病は、生後１日のひよこにおける大脳内病原性指数（ＩＣＰＩ）が
０．７またはそれ以上をもつ鳥類パラミクソウイルス血清型１（ＡＰＭＶ−１）
のウイルスが原因の家禽の病気である。悪性のウイルスは、残基１１７における
Ｆ２タンパク質およびＦ（フェニルアラニン）のC末端、Ｆ１タンパク質のＮ末
端における多数の基本的アミノ酸の存在によって確認することも出来る。このア
ミノ酸配列を実証できなければＩＣＰＩテストによる特徴づけを必要とするであ
ろう。「家禽」と言う語は、繁殖用、消費用の肉、卵の生産用、狩猟のための供
給補充用として、飼育されている鶏、七面鳥、ホロホロ鳥、アヒル、がちょう、
うずら、鳩、キジ、やまうずら、走鳥類などを言う。

【０００６】アレクサンダー（Alexander）（１９８８）によれば、ニューカッスル病を初
めて認識してから、この病気の三つの動物疫病汎流行があった。第一は、この病
気の初期の発生にあたるもので、東南アジアで起こったと思われる。１９２６年
にイギリスで発生したような孤立した突然の発生は、この病気が主としてアジア
を経てヨーロッパへゆっくり移動する前に起こった思いがけないものであった。

【０００７】第二の流行は、１９６０年代の後半に中東ではじまったようであり、１９７３
年までにはほとんどの国々に広がっていた。第二の流行がより急速に広がったの
は、おそらく、相当な国際的な取引となった家禽産業の大変革によるものであっ
た。

【０００８】第三の流行は、主として、鳩などの飼われている鳥に影響した（Vindevogel
and Duchatel、１９８８）。この病気は見たところ１９７０年代後半に中東で
起こったようである。１９８１年までに、ヨーロッパに広がり、その後、主とし
て、競技やショーでの鳥間の接触の結果として、および、かかる鳥の国際的取引
の結果として急速に世界の各地に広がった。

【０００９】今日もなお、ニューカッスル病は、アジア、アフリカ、アメリカおよびヨーロ
ッパの多くの国々において広範囲に広がっている。オセアニアの国々だけは比較
的この病気が起こらないようである（Spradbrow、１９８８）。

【００１０】ＮＤＶは、Mononegavirales目、パラミクソウイルス科、パラミクソウイルス
亜科、Rubulavirus属に属している。通常、鳥類パラミクソウイルスタイプ−１
と呼ばれているＮＤＶは別として、鳥類パラミクソウイルスタイプ−２から−９
と称される他の８つの血清型は、赤血球凝集抑制テストや血清中和テストにおい
て、それらの抗原の関係性に基づいて区別することが可能である（Alexander、
１９９３）。

【００１１】血清学的グループ分けの一致にもかかわらず、異なる血清型のウイルス間でい
くつかの交差した関係がある。

【００１２】 NDV遺伝子は、陰性極性で、ウイルスタンパク質をコードするメッセンジャー
ＲＮＡに相補的な一本鎖ＲＮＡ分子である。ＲＮＡ遺伝子はおよそ大きさでは１
５，２００ヌクレオチドであり、以下の遺伝子産生物（遺伝子ＲＮＡの３‘末端
から５’末端に記録されている）をコードしている：ヌクレキャプシドタンパク
質（ＮＰ）、りんタンパク質（Ｐ）、マトリクスタンパク質（Ｍ）、融合タンパ
ク質（Ｆ）、赤血球凝集ノイラミニダーゼ（ＨＮ）、そして大きなポリメラーゼ
タンパク質（Ｌ）（Chamber et al、１９８６年）。

【００１３】このＲＮＡは、ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質との複合体で、リボ核酸キャプシ
ド粒子（ＲＮＰ）を形成し、該RNPは、内部にＭタンパク質が並んでいるエンベ
ロープによって囲まれている。このエンベロープは、宿主の吸着と侵入に関係す
るＦとＨＮタンパク質を含んでいる。

【００１４】ＮＤＶの複製は、他のパラミクソウイルス属によって使用される方法と類似し
ている。最初の段階は、ＨＮタンパク質によって媒介される宿主受容体へのウイ
ルスの吸着である。宿主細胞膜とウイルスエンベロープとの融合は、ＨＮとＦタ
ンパク質の両方の働きに依存しており、ウイルスの複製される細胞質にＲＮＰが
放たれる結果となる。

【００１５】ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＰの一部である）は、mＲ
ＮＡとして働き、ウイルスタンパク質合成のための細胞の翻訳部分に使用される
相補的な転写物を産生する。ＮＰタンパク質の蓄積により、ＲＮＡポリメラーゼ
複合体は、転写から複製にスウィッチングされ、結果として、完全長のゲノムお
よび相補ゲノムＲＮＡ分子の合成がなされる。

【００１６】新たに形成されたＲＮＰは、細胞原形質膜に蓄積されているF、HNタンパク質
、およびMタンパク質の働きによって細胞膜において包膜される。新たに形成さ
れたウイルス粒子は、出芽メカニズムによって、感染した細胞から放出される。
ＮＤＶの複製についてのより詳細な情報については、Pieeples（１９８８年）を
参照。パラミクソウイルス属の分子生物学についての最近の論文については、La
mbとKolalofsky（１９９６年）を参照。

【００１７】商用家禽（すなわち、鶏、七面鳥、きじ、ほろほろ鳥、アヒル、ガチョウ、は
と）を別にすれば、とらわれていたり、半家禽状態であったり、渡り鳥である水
鳥を含む野生の鳥の多くは、ＮＤＶに感染しやすく、主要な感染源となっている
かもしれない（Kaleta and Baldauf、１９８８）。

【００１８】ＮＤＶ株の病原性は、宿主によってかなり異なっている。最も抵抗のある種は
、水生の鳥のようであり、一方、最も感染しやすい鳥は、一時的に、または永久
的に群れを作る群居する鳥である。鶏は最も感染しやすいが、しかしながらアヒ
ルやガチョウは、感染するかもしれないが、鶏にとっては死に到るウイルス株で
あったとしても、臨床的な兆候をほとんど、または、まったく示さない。

【００１９】ニューカッスル病は、ウイルスの異なる単離体と菌株が、この病気の大きな重
篤度の差をもたらしているという点において複雑な病気である。ビヤード（Bear
d）とハンソン（Hanson）（１９８４年）は、ＮＤＶ株と単離体を、十分に感染
しやすい鶏に見られるうる病気の兆候に関係する異なる病理型にグループ分けし
た：１）内臓に多量出血性の損傷が目立つ急性の致死感染を引き起こす、内臓向
性の速現性ＮＤＶ、および、呼吸器や神経系の兆候が先行し、内臓損傷は起こら
ない、高い致死率の神経向性の速現性ＮＤＶ、２）いくらかの鳥類に低致死率で
急性の呼吸系の病気や神経系の兆候を示す亜病原性のＮＤＶ、３）軽度の、また
は不顕性の呼吸系感染を示す長い潜伏期間をもつＮＤＶ、または腸器官系におい
て主に複製するように思われる無毒性のウイルスである無病候性の腸ＮＤＶ。さ
まざまなグループと関連している、それらの兆候の間にあるいくつかの重複が報
告されている。

【００２０】ウイルスは、呼吸器系や腸器官、または目を通って体内に侵入してくる。気管
においてウイルスは繊毛運動によって広がり、そして、細胞から細胞へ広がって
いく。最初に入ってきた場所における初期の増殖の後、ウイルス血症のエピソー
ドの間、ウイルスは脾臓、肝臓、腎臓、そして肺へと運ばれる。ウイルスのいく
つかの株は、病気の兆候が明らかになる前に鳥たちが死んでしまうかもしれない
ほど非常に急速に、肝臓や腎臓のような必須器官に達する。

【００２１】ほとんどのウイルスは、有意な量の抗体が存在するようになる前に、血液を通
って、中枢神経系に到達する。オウム類において起こっていると推測される長期
間の保菌状態は、家禽産業にとっては恐ろしい存在となる可能性がある。長い潜
伏期間を有するウイルスと速現性のウイルスの両方を長い間保菌する状態は、鶏
にも存在しうる（Heuschele and Easterday、１９７０）。

【００２２】ＮＤＶの複製の間、前駆体の糖タンパクFOがF1とF2に切断され、子孫ウイルス
が感染性となることが必要である（Rott and Klank、１９８８年）。この翻訳
後の切断は宿主プロテアーゼによって媒介される。切断が行われなければ、非感
染性のウイルス粒子が産生され、ウイルスの複製は進行し得ない。伝染力の強い
ウイルスのＦ０タンパク質は、広範囲のプロテアーゼによって切断可能であるが
、しかしながら、感染力の低いウイルスのＦ０タンパク質は、その感受性に限界
があり、これらのウイルスは、ｉｎｖｉｖｏにおけるいくつかの型の宿主細胞
内でのみ増殖することができ、通常、ｉｎｖｉｔｒｏでは増殖できない。

【００２３】長い潜伏期間を持つウイルスは、呼吸器系や腸器官のようにトリプシンに似た
酵素のある領域において複製されるのみであるのに対し、感染力の強いウイルス
は、組織や器官の範囲で複製可能であり、致命的な全身感染という結果となる。

【００２４】Ｆ０前駆体のアミノ酸配列は、低い感染力のウイルスは、Ｆ２鎖とＦ１鎖をつ
なげている単一のアルギニン（Ｒ）を持っていることを示し、それに対し、感染
力の強い株は、切断の部位で、Ｋ／Ｒ−Ｘ−Ｋ／Ｒ−Ｒ−Ｆなどの２つのペアを
形成する付加的必須アミノ酸を有していることを示している。さらに、感染力の
強い株のＦ２鎖は、通常、フェニルアラニン残基で始まっているが、感染力のな
い株のＦ２鎖は、通常、ロイシンで始まっている。

【００２５】ＮＤＶのいくつかの株の場合は、ＨＮタンパク質も、生物学的に活性となるに
は切断を必要とする前駆体として産生される（ガルテンその他１９８０年、
ミラーその他１９８８年）。

【００２６】ＦおよびＨＮタンパク質の切断可能性に加えて、ウイルスの他の要因も病理型
に寄与している可能性がある。マダンスキー（Madansky）およびブラット（Brat
t）（１９７８、１９８１ａ、１９８１ｂ）は、転写と翻訳の変化は、ウイルス
の増殖と細胞間の拡大、および／または細胞変性を調節可能であることを示した
。

【００２７】ＮＤＶの感染に対する最初の免疫応答は、細胞媒介であり、生ワクチン株で感
染後、２、３日で検出可能である。これはおそらく、測定可能な抗体応答が見ら
れる前に、ワクチン接種された鳥に、対抗に対する防御が早くから記録されてい
たことを示している（Gough and Alexander、１９７３）。

【００２８】感染後約一週間で、循環する抗体は、再感染から宿主を保護するであろう。初
期の段階で、ＩｇＭが関与し、ＩｇＧが続く。力価と防御は約三週間後にピーク
に達し、ブースティングがなければ次第に低下していく。これは、年をとった鳥
に対しては、再びワクチンを接種させることが必要であることを意味している。

【００２９】呼吸器系のルートで投与された生ワクチンのみが、血清と同様にすべての粘膜
の表面で抗体を刺激する。不活性ワクチンは、筋肉内ルートで投与されたときで
さえ、血清抗体が高濃度であるにもかかわらず、呼吸器官において局部の抵抗を
誘発しない。

【００３０】このことは、局所免疫性と体系的免疫性の両方を誘発させるには、上部呼吸器
官にウイルス抗原を与えることが可能な生ワクチンが重要であることを強調して
いる。小さな小滴が下部呼吸器官の内部にしみとおり、それによって、主に体液
性免疫応答を刺激し、一方、粒の粗い小滴が、上部呼吸器官において局部免疫を
刺激する。

【００３１】したがって、広範囲の小滴サイズによるエーロゾルが、全体として最良の局所
的および体液性免疫を生じる。

【００３２】しかし、高レベルの抗体価を生じる現行ワクチンにより徹底的に予防接種して
いるにもかかわらず、ウイルスは今なお粘膜表面から回収されることに留意すべ
きである。

【００３３】米国ではニューカッスル病の同定が不活化ワクチンを使用させることになった
（Hofstad、１９５３）。地方病ウイルスのある種のものが極めて軽度の病気を
発病させるという観察が、亜病原性生ワクチン・ロアキン（Roakin）の開発に先
ず帰着した（Beaudette et al.、１９４９）が、続いてより緩和なヒッチナー（
Hitchner）Ｂ１株（Hitchner and Johnson、１９４８）およびラソタ（LaSota）
株(Goldhaft、１９８０）の開発に至り、それらが現在最も広く使用される生ワ
クチンである。

【００３４】ＮＤＶ生ワクチンは２つのグループ、長潜伏期性および亜病原性に分けること
ができる。亜病原性株はその強い毒性のために鳥類の二次予防接種についてのみ
適している。免疫応答性は生ワクチンの病原性が増大するにつれて増大する。し
たがって、重篤な反応なしに所望レベルの防御を得るために、徐々に毒性の強く
なるワクチンを連続的に使用するか、または生ワクチンに続いて不活化ワクチン
を使用することからなる予防接種プログラムが現在使用されている。

【００３５】生ワクチンの主たる利点の一つは、該ワクチンが安価な集団投与技法により投
与し得ることである。共通した投与方法は飲料水によることである。しかし、飲
料水による投与は、過剰の熱や光によって、また、飲料水中の殺ウイルス性不純
物により、ウイルスが不活化されている可能性があるので、注意深くモニターし
なければならない。

【００３６】多数のトリを短時間に予防接種するのが容易なために、スプレーおよびエーロ
ゾルによる生ワクチンの集団投与もまた非常にポピュラーである。粒子が生じる
条件を制御することによって適正な粒子サイズを得ることが重要である。

【００３７】現在使用されている生ワクチンは幾つかの欠点を有する。ワクチンは今なお環
境条件と複雑な感染の存在に左右されて病気の徴候を引起すことがある。それ故
に、一次予防接種では非常に穏やかなウイルスを使用することが重要であり、結
果として、複数回の予防接種が通常必要とされる。さらに、母性誘導抗体が長潜
伏期性生ワクチンによる一次予防接種の成功を妨げる可能性がある。

【００３８】不活化ワクチンは通常感染性尿膜腔液から製造されるが、該尿膜腔液はホルマ
リンまたはベータプロピオラクトンで処理してウイルスを殺し、適当なアジュバ
ントと混合する。不活化ワクチンは筋肉内または皮下注射により投与する。不活
化ワクチンは製造にも投与にも費用がかかる。

【００３９】しかし、不活化油性乳剤ワクチンは生ワクチン程に母仔免疫の悪影響を受けず
、日齢のヒナに使用することができる。不活化ワクチンの利点は予防接種したト
リの有害反応のレベルが低いこと、防御抗体のレベルが高いこと、そして防御期
間の長いことである。上記ワクチンのいずれもが野生型ＮＤＶを血清学的に識別
し得ない。

【００４０】組換えウイルス・ワクチンの開発は家禽産業における多年にわたる興味の対象
であった。この概念は対象疾病作因の決定的な免疫化エピトープ遺伝子をベクタ
ーウイルスの非必須遺伝子に挿入することである。このように、組換えウイルス
による予防接種はベクターウイルスならびに対象疾病作因双方に対し免疫化する
に至る。

【００４１】数種のウイルスが家禽用の有力な生菌ウイルスワクチンとして評価されている
。最も注目された鳥類ウイルスは鶏痘ウイルス（ＦＰＶ）と七面鳥のヘルペスウ
イルス（ＨＶＴ）である。鶏痘ウイルスは大型のゲノムをもつＤＮＡウイルスで
あり、したがって、外来遺伝子を担持する余地をもつと考えられる。

【００４２】弱毒化すると、ＦＰＶは臨床的疾病を引き起こさず、一般にニワトリのワクチ
ンとして使用される。ＨＶＴもＤＮＡウイルスであり、マレック病ウイルス（Ｍ
ＤＶ）族の血清型として分類される。ＨＶＴはニワトリに対しては非病原性であ
り、しかもＭＤＶに対して交差防御的であり、一般にマレック病に対しニワトリ
を予防接種するために使用する。

【００４３】ニューカッスル病に対する防御は組換えＨＶＴまたはＦＰＶワクチンを使用す
ることにより誘発し得ることが示されている（Morgan et al., 1992, 1993; Hec
kert et al. 1996; Boursnell et al., 1990; Taylor et al., 1990)。

【００４４】しかし、ＮＤＶＦタンパク質またはＦおよびＨＮタンパク質双方を発現する
ような組換えワクチンによる予防接種に続くニューカッスル病に対する防御の始
まりは、常套の生菌または不活化ＮＤＶワクチンでの予防接種に続く防御の始ま
りよりも大幅に遅延するが、その理由は恐らく組換えワクチンが、組換えワクチ
ンにより発現されるＮＤＶタンパク質上に見出されるエピトープ以外に、広範囲
の十分に免疫的なスペクトルを有し抗原的に関連するＮＤＶエピトープを提供し
ないか、または免疫系に適切に提示されないからである。

【００４５】さらに、局所的（粘膜、呼吸器または腸内の）防御は組換え体を接種したトリ
において有効に誘発されなかった。これは決定的な欠点であるが、その理由は呼
吸器病に対する一次予防接種に使用したワクチンが、野外条件で飼育したニワト
リに感染する毒性ウイルスの感染と伝播を防御する局所免疫を誘発しなければな
らないからである。

【００４６】宿主を防御し得るＮＤＶに対する抗体は、ウイルス中和試験により測定するこ
とができる。しかし、中和応答は赤血球凝集抑制（ＨＩ）応答と平行していると
思われるので、後者の試験は多くの場合、防御応答、特に予防接種後の応答を評
価するために用いる。

【００４７】ＦおよびＨＮタンパク質双方に対する抗体はＮＤＶを中和し得る。しかし、Ｆ
タンパク質に対する抗体は生体内および生体外試験においてＨＮに対する抗体よ
りもより顕著な中和反応を誘発すると思われる（Meulemans et al., 1986)。

【００４８】トリの血清中にＮＤＶに対する特異抗体が存在したとしても、ＮＤＶの感染株
に関する情報は僅かであり、したがって、診断的価値は限られる。

【００４９】殆どの国で鳥類の長潜伏期性ＮＤＶ株が偏在すること、また、少なくとも血清
学的に野生型ＮＤＶと区別し得ない生ワクチンが殆ど普遍的に使用されているこ
とは、単に感染したことを証明することが適用すべき抑制手段についての正当な
理由にはなっていないことを意味する。野外での疾病がウイルスの真の毒力につ
いての信頼し得ない尺度である可能性があるので、発見されるウイルスについて
さらに特性化することが必要である。

【００５０】現在、感染株の特性化を可能とするニューカッスル病診断の唯一の方法は、ウ
イルスの単離と、引続いての病原性試験である。現在３つの生体内試験法がこの
目的に使用される；１）卵での平均死亡時間（ＭＤＴ）；２）１日齢ヒナの脳内
病原性指標（ＩＣＰＩ）；３）６週齢のトリにおける静脈内病原性指標（ＩＶＰ
Ｉ）。

【００５１】これらの試験法は多くの欠点、例えば、動物の入手可能性、乏しい再現性、お
よび比較的長期の試験などに悩まされている。最後ではあるが大事なことは、こ
れらの試験法がワクチンを接種したまたは野生型株を感染させた家禽類の簡単な
血清学的同定を許さないことである。

【００５２】生体内試験法に替わり得るものとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が毒
性分離株と非毒性分離株との間を区別するために成功裏に使用されている（Stau
ber et al., 1995; Kant et al., 1997)が、しかし、さらに血清学的な区別は不
可能である。

【００５３】家禽類の飼育とその製品の交易は今や国際ベースで、多くの場合多国籍企業の
管理下に組織化されている。ニューカッスル病の脅威はかかる交易上の顕著な抑
制となっていることを示している。

【００５４】ニューカッスル病の成功裏の抑制は、すべての国が発生を報告するようになっ
たときにのみ取り組むことになろう。しかし、国際間の取決めは異なる国での疾
病監視の程度に大きな違いがあるために単純ではない。ある国では予防接種をせ
ず、如何なる形状であってもＮＤＶを家禽類に取込ませようとしないが、その理
由は予防接種した家禽が野生型のＮＶＤに感染した家禽と区別し得ないからであ
る。

【００５５】別の国では特定の生ワクチンの使用のみを許可しており、他のワクチンは受け
入れ難い毒性をもつと考えている。さらに他の国では循環型の毒性の高いウイル
スが存在し続けており、明白な病気が予防接種により隠蔽されるという理由で、
そのままでは認められない。

【００５６】多くの国では、起こり得るニューカッスル病発生を抑制するための法律が存在
する。国家的抑制手段は持ち込みと拡散を防止することに向けられる。殆どの国
が家禽製品、卵、および生きた家禽の商取引に制限を設けている。殆どの国が取
分けオウム病鳥類の輸入に際しての検疫手続を確立している。

【００５７】一部の国では感染した鳥類の強制的屠殺、その接触物、および産物について根
絶政策を適用している。他の国は発生がなくても鳥類の予防的接種を要求し、一
方、一部の国は緩衝帯を確立するために発生地周辺で包囲種痘の政策を採ってい
る。

【００５８】明らかなことは、ニューカッスル病の制御に使用し得るよりよいワクチンとよ
りよい診断方法が必要なことである。生ワクチンの集団投与に際し、個々のトリ
が受ける用量に大きな差異のあることと、また、若いヒナでの母仔免疫レベルに
変動のあることのために、生ワクチンによる接種後反応が避けられない。このこ
とが予防接種を強制される国における農夫の主要関心事の一つである。

【００５９】さらに、多くのワクチンが分集団の混合物である。クローン化する場合、これ
らの分集団はその免疫原性および病原性において互いに有意に異なる可能性があ
る（Hanson, 1988)。

【００６０】しかし、現在使用されている生ワクチンおよび不活化ワクチンの最も大きな欠
点は、予防接種を受けた動物が現在用いられているスクリーニング技法、例えば
、赤血球凝集抑制またはウイルス中和試験により感染した動物と区別し得ないと
いう事実である。

【００６１】毒性のある野生ウイルスが今なお予防接種した群れに広がる可能性があるが、
その理由は病気の症状が予防接種により隠蔽されるからである。生体内技法によ
りウイルスの単離と毒性の特性化が大規模で実行不能である以上、血清学的に野
生ウイルスと識別し得る新しい効果的な弱毒化生ワクチンが是非とも必要である
。

【００６２】ＮＤＶマーカーワクチンと呼ぶ（また、診断法とキットを伴う）かかるワクチ
ンは、抗原性と関連するＮＤＶエピトープの最大限可能な免疫スペクトルを提供
すべきものであり、かつ、野生型ＮＤＶと血清学的にまったく異なるべきである
が、今なお入手し得ない。

【００６３】本発明は遺伝子修飾により鳥類のパラミクソウイルスゲノムを修飾する方法を
提供し、遺伝子修飾した鳥類のパラミクソウイルスおよび鳥類パラミクソウイル
ス・マーカーワクチンを提供する。

【００６４】現代分子生物学技術の出現が、マイナス鎖ウイルスを含む多くのＲＮＡウイル
スの遺伝子修飾を可能としている。この技法はしばしば“逆遺伝”と言われる。
先ず、ウイルスＲＮＡの（完全長）ｃＤＮＡコピーを提供し、それに続いてこの
ＤＮＡを感受性細胞内で転写して、感染性ＲＮＡを産生させ、それが再び感染性
ウイルス粒子を産生するようにする。

【００６５】一般に、標準的な分子生物学技術によりこれまでｃＤＮＡについてなされた修
飾により、遺伝子的に修飾したＲＮＡウイルスを得ることが可能である。しかし
、このことはＮＤＶまたは鳥類パラミクソウイルスについて具体化されたことは
なく、鳥類パラミクソウイルスの複製事象研究のために、鳥類パラミクソウイル
ス・ゲノム・フラグメントのミニゲノム・フラグメントまたはプラスミドを生成
させ、それによって感染性のコピーウイルスをどのように構築すべきかについて
の理解を得ることが、未だに可能ではない。

【００６６】驚くべきことに、本明細書においては、当該鳥類パラミクソウイルスのゲノム
が今までに配列決定されたすべてのパラミクソウイルス・ゲノムの中で最も小型
であるということをこの度完全に確立したが、取分けＮＤＶゲノムの５’末端配
列が、以前に確立されたもの、また、他のパラミクソウイルス科と比較して期待
されたものよりもかなり長い。本発明はこの度初めて完全な鳥類パラミクソウイ
ルス・ゲノムの配列を提供し、かつ、かかるウイルスの完全長またはミニゲノム
長のｃＤＮＡを提供する。

【００６７】本発明は、鳥類パラミクソウイルスの感染性コピー生成を可能とする鳥類パラ
ミクソウイルス・ゲノムの５'-末端に相当する核酸配列を少なくとも含んでなる
鳥類パラミクソウイルスｃＤＮＡをこのように提供するが、当該ｃＤＮＡは、好
ましくは完全長のｃＤＮＡを含んでなる。しかし、本発明はまた、鳥類パラミク
ソウイルス・ゲノムの５'-末端に相当する核酸配列を少なくとも含んでなるｃＤ
ＮＡを提供するが、それによって複製鳥類パラミクソウイルス・ミニゲノムの生
成を可能とする。かかるミニゲノムは、有利にはＲＮＡの転写および／または修
飾核酸配列からのタンパク質発現に使用し得る。本発明はニューカッスル病ウイ
ルスから少なくとも部分的に誘導される本発明のｃＤＮＡを提供するが、例えば
、その場合の当該ニューカッスル病ウイルスは長潜伏期性ウイルスであり、好ま
しくは、ラソタ（LaSota)株ＡＴＣＣＶＲ−６９９などのワクチン株から誘導さ
れる。

【００６８】本発明はさらに核酸における削除、挿入、突然変異、復帰突然変異などの修飾
を含む、本発明に従ったｃＤＮＡを提供する。例えば、当該修飾が修飾プロテア
ーゼ切断部位をエンコードする核酸を含むｃＤＮＡが、例えば、当該切断部位が
融合（Ｆ）タンパク質のプロテアーゼ切断部位であるｃＤＮＡが提供される。

【００６９】さらに他の実施の形態において、本発明は、当該修飾がハイブリッド・ウイル
スタンパク質、例えば、本発明の実験の部に記載したようなハイブリッド赤血球
凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質などをエンコードする核酸を含む
、本発明によるｃＤＮＡを提供する。本発明はまた、当該修飾がマトリックス（
Ｍ）タンパク質などのウイルスタンパク質をエンコードする核酸において欠失を
含む、本発明によるｃＤＮＡを提供する。

【００７０】本発明はさらに異種抗原をエンコードする核酸をさらに供給する本発明のｃＤ
ＮＡを提供するが、好ましくはその場合の当該抗原は家禽の病原、例えば下記の
ごとき病原から由来する。本発明によるｃＤＮＡから得られるＲＮＡまたはそれ
から由来するタンパク質もまた提供される。

【００７１】近年、多くの非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスが完全に特性化され、当該ウイ
ルスのクローン化ｃＤＮＡを細胞にトランスフェクションすることにより完全に
感染性のウイルスを生成させることが可能となり、それらのゲノムの複製と発現
に関する基礎研究が最高潮に達した（Conzelmannによる概説、１９９６）。

【００７２】今日まで、非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスの感染性ウイルスは、例えば、狂
犬病ウイルス（Schnell et al., 1994, Conzelmann; ＥＰＯ７０２０８５Ａ１）
、（Schnell et al., 1994; ＥＰＯ７０２０８５Ａ１）、水疱性口内炎ウイルス
（Lawson et al., 1995; Whelan et al., 1995)、センダイウイルス（Garcin et
al., 1995)、麻疹ウイルス（Radecke et al., 1995; Schneider et al., 1997;
ＥＰＯ７８０４７５Ａ１）、ヒト呼吸器シンシチウム・ウイルス（Collins et
al., 1995)、牛疫ウイルス（Baron and Barrett, 1997)、およびヒト・パライン
フルエンザ・ウイルス３型（Hoffman and Banerjee, 1997, Conzelmann; ＥＰＯ
７０２０８５Ａ１）、（Schnell et al.,1994; ＥＰＯ７０２０８５Ａ１）のク
ローン化ｃＤＮＡから生成させていた。

【００７３】しかし、上記の感染性コピーウイルスのすべては、種々起源の宿主、組織また
は細胞において生体内ならびに生体外双方において増殖可能であり、適切な細胞
系において容易なｃＤＮＡトランスフェクションと感染性ウイルス粒子の複製お
よび生成を可能とする。

【００７４】かかる可能性はＮＤＶについては存在せず、ワクチンを供給し得る長潜伏期性
ＮＤＶ株については確実に存在しない。かかるＮＤＶ株の毒性は広範な細胞内で
複製するその能力と関連しており、毒性株は生体外および生体内で容易に複製可
能であるが、一方、ワクチン株は生体内のみで複製し得るという事実に反映され
ている。

【００７５】このように、ＮＤＶについて歯止め２２の位置づけは明らかである。例えば、
感染性ｃＤＮＡから感染性コピーウイルスを生成させる試みは、恐らく感染性ウ
イルスを結果として生じる可能性のある一方、かかるウイルスは一般にワクチン
としての使用に適さないが、その理由はこのように生成させた感染性ウイルスが
余りに毒性が強いためにワクチンとしての使用を果たし得ないからである；それ
が細胞系に対してｃＤＮＡをトランスフェクションした後に生成、複製され得る
という事実が、ＮＤＶの毒力の性質について上記で検討したように、Ｆｏタンパ
ク質をＦ１とＦ２に容易に切断し得ることを反映している。

【００７６】ｃＤＮＡに対する親材料としてワクチン株を使用してもこの問題を解決するこ
とにはならない；ワクチン株、特に長潜伏期型のワクチン株は容易に切断し得る
Ｆｏタンパク質を含み、初代ウイルスが複製し続けるのを不可能にしている。ト
ランスフェクションに使用する細胞にはまったく感受性がなく、非切断Ｆｏタン
パク質をもつワクチン型ウイルスの一回またはそれ以上の複製を持続させる。

【００７７】本発明はこの問題の解決法を手際よく提供し、それと共に感染性コピーＮＤＶ
、例えば、ワクチンに使用するためのＮＤＶを提供する。

【００７８】本発明は感染性コピー・ニューカッスル病ウイルスの生成法を提供するもので
あり、該方法はウイルスＲＮＡとの複合体を形成するウイルスＮＰ、ＰおよびＬ
タンパク質を発現し得る細胞に、当該ウイルスのクローン化完全長またはゲノム
長ｃＤＮＡをトランスフェクションすることを含み、また、さらに当該ウイルス
のＦｏタンパク質切断を可能とするタンパク質分解活性を有する増殖培地中で当
該細胞をインキュベートすることを含む。

【００７９】我々の系では、ＮＰを発現するプラスミドの同時トランスフェクションを省く
ことができる。ＮＰはＮＰ遺伝子が抗ゲノムＲＮＡの５’末端に続く最初の遺伝
子である故に、恐らく完全長ｃＤＮＡから発現される。真核細胞ｍＲＮＡは通常
単シストロン性であるので、遠位遺伝子の発現は期待されない。しかし、ＮＤＶ
遺伝子の相対位置が変化している完全長ｃＤＮＡを生成させることは可能である
。もしかかるｃＤＮＡの最初の遺伝子がＰまたはＬ遺伝子であるならば、同時ト
ランスフェクションしたプラスミドから対応する遺伝子産物を発現させる必要は
ない。

【００８０】完全長ｃＤＮＡを用いる代りとして、複製応答能のあるサブゲノムＲＮＡを産
生させ、かつ、鳥類パラミクソウイルスタンパク質の完全な補体を共に発現する
２つ以上のサブゲノムＲＮＡを使用することが可能である。たとえＲＮＡが別々
に詰込まれていたとしても、得られるウイルス様粒子は同時感染と遺伝子機能の
補完性により連続的複製のために使用することができる。

【００８１】好適な実施の形態において、本発明は当該タンパク質分解活性がトリプシン様
酵素などの酵素に由来するか、または当該タンパク質分解活性を有する組成物に
由来する場合の方法を提供する。特に好適な実施の形態において、当該増殖培地
はタンパク質分解活性を有する尿膜液を含んでなる。Ｆｏタンパク質の切断は感
染性ウイルスの生成にとって必要である。外部からタンパク質分解活性を加えず
に長潜伏期性株から感染性ウイルスを生成させることが可能である。孵化鶏卵の
尿膜腔にトランスフェクションした細胞の上清を接種することにより、尿膜液に
存在するタンパク質分解活性がＦｏタンパク質を切断し、融合適格Ｆ１−Ｆ２複
合体を生成させることができる。かかる活性化Ｆタンパク質をもつビリオンは感
受性細胞に感染することが可能であって、所望のタンパク質分解活性を発現する
細胞での複製が感染性の子孫を生み出す。トランスフェクションした細胞の上清
に所望のタンパク質分解活性を与える代りとして、例えば、ＮＤＶに対し許容性
であって、かつ、当該タンパク質分解活性をすでに発現している細胞を使用する
ことが可能である。かかる細胞系を用い、外部からタンパク質分解活性を加える
ことなしに感染性の長潜伏期性ＮＤＶを生成させる。かかる細胞系は当該活性を
特定する遺伝子をもつ細胞系の安定なトランスフェクションにより生成させるこ
ともできる。さらに、ウイルス・エンベロープ内に野生型Ｆタンパク質を発現す
る安定なトランスフェクション細胞を生成させ、それによって細胞に侵入する手
段をもつ感染性粒子（それ自体は野生型Ｆタンパク質をエンコードするゲノム情
報を備えていない）を提供することが可能である。感染性長潜伏期性ウイルスの
救済もＮＤＶヘルパーウイルスをトランスフェクション細胞に感染させることに
より可能である。かかるヘルパーウイルスを本質的に必要とするのは、それを抗
体に対して選択し得る場合であり、例えば、ヘルパーウイルスを除去し、長潜伏
期性ウイルスとは反応しない抗体を中和することによる。最終的に、３種の必須
ＮＤＶタンパク質ＮＰ、ＰおよびＬの１つ、２つ、またはすべてを発現する安定
にトランスフェクションした細胞系を構築することができる。かかる細胞系は３
種の必須ＮＤＶタンパク質のサブセットのみを同時発現するか、または感染性コ
ピーウイルスの生成を維持するためにまったく同時発現しないことが必要である
。

【００８２】好適な実施の形態において、本発明はトランスフェクションに使用される当該
細胞がニワトリの一次または二次細胞または細胞系由来である方法を提供する。
本明細書で提供するのは、例えば、ＣＥＲまたはＣＥＦ細胞であって、これらは
、一般に殆ど生体外細胞として、ＮＤＶのＦｏタンパク質、例えば、ラソタ（La
Sota）株のタンパク質を切断するのに必要な、適切なプロテアーゼを欠いている
。しかし、例えば、他の鳥類から由来する細胞も使用することができる。

【００８３】本発明はさらに感染性コピー・ニューカッスル病ウイルスの生成法を提供する
ものであり、該方法は、例えば、図３に同定した当該ウイルスのクローン化完全
長またはゲノム長のｃＤＮＡを細胞にトランスフェクションすることを含み、ま
たさらに、当該ウイルスのＦｏタンパク質を切断し得るタンパク質分解活性を有
する増殖培地中で当該細胞をインキュベートすることを含み、さらに、当該細胞
を培養し、当該培養細胞から由来する物質を孵化鶏卵の尿膜腔に接種することに
より感染ウイルスを回収することを含む。当該物質は、例えば、当該細胞培養物
由来の（収獲または凍結融解した）細胞または細胞残渣または上清を含む。

【００８４】例えば、本明細書で記載するのは感染性ウイルスの回収方法であるが、該方法
ではトランスフェクションしたＣＥＦ単層の上清を孵化鶏卵の尿膜腔に接種した
。４日後に、尿膜液を収獲し、赤血球凝集反応アッセイにより分析し、次いでさ
らに鶏卵に継代した。

【００８５】さらに、本発明は、尿膜液を収獲し、孵化鶏卵に再接種することにより当該感
染性コピー・ニューカッスル病ウイルスを継代することをさらに含む方法を提供
する。

【００８６】本発明の好適な実施の形態においては、当該ウイルスが、例えば、ＮＤＶの無
毒性野外事例由来またはＮＤＶのラソタ（LaSota）株などのＮＤＶワクチン株由
来の長潜伏期性ウイルスであることを特徴とする方法が提供される。さらに、１
つまたはそれ以上の突然変異、欠失、および／または挿入の導入またはその他の
修飾を可能とする遺伝子修飾により、鳥類パラミクソウイルス・ゲノムを修飾す
る方法が提供される。例えば、Ｖタンパク質などのウイルスタンパク質をエンコ
ードするｃＤＮＡを修飾することにより、また、当該修飾したｃＤＮＡを完全長
ｃＤＮＡにクローニングし、当該完全長ｃＤＮＡから感染性コピーウイルスを生
成させることにより、例えば、鳥類パラミクソウイルスの毒性を弱毒化または修
飾する方法が提供され、それによって改善された性質を有する新規ＮＤＶ株また
は新規弱毒化生ワクチンを生成させる。

【００８７】遺伝子産物の修飾による弱毒化の他に、転写および／複写に関わるヌクレオチ
ド配列の修飾によっても鳥類パラミクソウイルスを弱毒化することが可能である
。かかる修飾は、多様な細胞において生体外および生体内双方で切断し得る、ま
た結果として古典的なワクチン株よりもより免疫原性である野生型様Ｆタンパク
質を発現する弱毒化株を結果として与える。

【００８８】好適な実施の形態において、本発明はニューカッスル病ウイルスなどの鳥類パ
ラミクソウイルスの毒性を弱毒化または修飾する方法であって、ウイルスタンパ
ク質のプロテアーゼ切断部位を、当該切断部位をエンコードするｃＤＮＡを修飾
することにより修飾することを含み、さらに、当該ｃＤＮＡを、例えば、ニュー
カッスル病ウイルスのゲノム長ｃＤＮＡにクローニングし、感染性コピー・ニュ
ーカッスル病ウイルスを生成させることを含む方法を提供する。当該切断部位は
、例えば、ニューカッスル病ウイルスのＦまたはＨＮタンパク質におけるプロテ
アーゼ切断部位である。弱毒化は一般に毒性の低下に限定されるが、比較的無毒
性のＮＤＶ株を用い、例えば、特定の細胞型において複製が増加する傾向を与え
ることにより毒性の高くなったかかる株の子孫を提供することも今や可能である
。このように、まったく異なる毒物特性をＮＤＶに与えることも今や可能である
。

【００８９】本発明はニューカッスル病ウイルスなどの鳥類パラミクソウイルスを抗原性に
ついて修飾する方法であって、少なくとも１つの免疫優性エピトープを取込んで
いるウイルスタンパク質の少なくとも一部をエンコードするｃＤＮＡを修飾する
ことを含み、さらに、当該ｃＤＮＡをニューカッスル病ウイルスのゲノム長ｃＤ
ＮＡにクローニングし、感染性コピー・ニューカッスル病ウイルスを生成させる
ことを含む方法を提供する。

【００９０】例えば、本発明は、例えば、提供されたＮＤＶ（ワクチン）の感染性コピーを
産生する方法を用いてＮＤＶを（さらに）修飾する方法を提供し、組換えマーカ
ーＮＤＶワクチンを産生する方法が提供され、マーカーワクチンは抗原性に適切
なＮＤＶエピトープの、最も可能性の高いまたは必要度の高い免疫スペクトルを
含み、さらに、明瞭な血清学的に適切なエピトープまたはマーカーが組換え技術
により取除かれているために、血清学的に野生型ＮＤＶとは別個のものである。
本発明はＮＤＶなどの鳥類パラミクソウイルスの抗原性構造を修飾する方法を提
供し、かくして、例えば、鳥類パラミクソウイルスの野生株と血清学的に区別し
得る生菌ＮＤＶマーカーワクチンの生成を可能とする。

【００９１】一実施の形態において、本発明は感染性コピーＮＤＶを提供し、その場合のＮ
ＤＶのＨＮタンパク質は、当該ＨＮタンパク質の一部をエンコードするｃＤＮＡ
を鳥類パラミクソウイルス、例えば、タイプ２またはタイプ４から由来するＨＮ
タンパク質の一部をエンコードするｃＤＮＡと組換えることにより修飾されてい
る。当該ハイブリッドＨＮタンパク質はこのようにして得た感染性コピーＮＤＶ
株に対し血清学的なマーカーとして働くか、または鳥類パラミクソウイルスの指
向性を他の細胞および／または組織に変えるように働く。本発明により提供され
るこれらのいわゆるマーカー株は、世界中を巡る商業用の鳥の群れにおいて、Ｎ
ＤＶの流行を評価するための非常に貴重な道具であるワクチンの生成を可能とす
る。さらに、かかるマーカーワクチンの大規模適用は、感染した鳥の群れの徹底
的なスクリーニングと鎮圧の過程により、ＮＤＶの完全な撲滅に導くであろう。

【００９２】さらに、他の病原から１つまたはそれ以上の抗原を発現し、かつ、複数の疾病
に対する予防接種に使用し得る感染性コピーＮＤＶ株を生成する方法が提供され
る。例えば、かかる感染性コピーＮＤＶウイルスは、例えば、トリ・インフルエ
ンザ（ＡＩ）（赤血球凝集素（Ｈ５およびＨ７）およびノイラミニダーゼ）、鳥
類白血病ウイルス（ＡＬＶ）（エンベロープタンパク質（ｇｐ８５））、ニワト
リ貧血症ウイルス（ＣＡＶ）（ＶＰ１＋ＶＰ２）、メレック病ウイルス（ＭＤＶ
）（糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、ｇＨ）、感染性喉頭気管支炎ウイルス（ＩＬＴ）
（ｇＢ、ｇＨ、ｇＤ）、感染性嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）（ＶＰ２およびＶＰ３
）、七面鳥鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴ）（融合（Ｆ）タンパク質）、鳥類パラミ
クソウイルス−２、−３、−６（ＰＭＶ）（Ｆ−タンパク質、赤血球凝集素ノイ
ラミニダーゼ（ＨＮ）、またはその他）、感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）（
ぺプロマータンパク質、核タンパク質）、レオウイルス（シグマタンパク質）、
アデノウイルス、肺炎ウイルス、サルモネラ腸炎、カンピロバクター・ジェジュ
ニ（Campylobacter jejuni）、大腸菌、ボルデテラ・アビアム（Bordetella avi
um; 以前はアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faeclis）、ヘモフィル
ス・パラガリナルム（Haemophilus paragallinarum）、パスツレラ・ムルトシダ
（Pasteurella multocida)、オルニトバクテリウム・リノトラキエレ（Ornithob
acterium rhinotracheale)、リエメレラ（以前はパスツレラ（Pasteurella））
アナチペスチファー（Riemerella anatipestifer)、マイコプラズマ（Mycoplasm
ata)（マイコプラズマ・ガリセプチクム（M. gallisepticum)、マイコプラズマ
・シノビエ（M. synoviae)、マイコプラズマ・メレアグリディス（M. mereagrid
is)、マイコプラズマ・アイオワエ（M. iowae))、またはアスペルギルス（Asper
gilli)（アスペルギルス・フラーブス（A. flavus)、アスペルギルス・フミガー
ツス（A. fumigatus)）などから得られる異種タンパク質をエンコードする異種
ｃＤＮＡを含んでなる。

【００９３】本発明は他の家禽病原からの抗原を発現させるワクチン・ベクターとして使用
し得る鳥類パラミクソウイルスまたはそれから由来する株を提供する。幾つかの
性質がＮＤＶを呼吸器または腸内疾患に対する予防接種用の理想的なワクチン・
ベクターとする。１）ＮＤＶは孵化鶏卵において非常に高い力価まで容易に培養
することができる。２）孵化鶏卵におけるＮＤＶの大量培養が比較的安価である
。３）ＮＤＶワクチンは比較的安定で、集団投与法、例えば、飲料水により、ま
たはスプレーもしくはエーロゾル製剤により簡単に投与することができる。４）
ＮＤＶの自然感染経路は呼吸器管および／または腸管によるが、多くの他の家禽
病原の主たる自然感染経路であもある。５）ＮＤＶは、循環している移行抗体が
存在しているにもかかわらず、局所免疫を誘発することができる。

【００９４】ＮＤＶは強力な抗腫瘍性ならびに免疫刺激性を有することが示されている（総
説として参照：Schirrmacher et al., 1998)(Schirrmacher, V., Ahlert, T., S
teiner, H.-H., Herold-Mende, C., Gerhards, R. and Hagmuller, E. (1998)
ウイルス修飾腫瘍細胞による免疫化；腫瘍学セミナー２５：６７７〜６９６）。
ＮＤＶはヒト正常細胞において活発に複製され得るようには見えないが、ヒト癌
細胞の選択的ＮＤＶ−介在致死が認められた。局所ＮＤＶ治療後、ヒト腫瘍異種
移植片のウイルス腫瘍崩壊および完全寛解がヌードマウスで認められた。このこ
とは腫瘍治療に対するＮＤＶの使用に通じる。しかし、問題はかかる適用が局所
治療に限定されることである。

【００９５】ＮＤＶの感染はインターフェロン、ケモカイン、および他の潜在的に重要な遺
伝子産物を誘発し、多形質発現性免疫刺激性を腫瘍細胞に誘導する。この概念は
、ＮＤＶを感染させた新鮮な有効試料からなる自家腫瘍細胞ワクチンの産生に使
用されている。このタイプのワクチンは自家腫瘍ワクチン−ＮＤＶまたはＡＴＶ
−ＮＤＶと呼ばれる（Schirrmacher et al., 1998)。ＮＤＶ感染細胞はガンマ線
照射により不活化するが、この照射は細胞分裂を阻止するが、感染細胞の細胞質
においてなおＮＤＶの複製を可能とする。ＡＴＶ−ＮＤＶを患者に接種した後、
Ｔ細胞がＮＤＶ−誘発ケモカインを介して能力を回復する。これらＴ細胞の一部
はＴ細胞レセプターを発現し、それが細胞表面で主要組織適合性複合体クラスＩ
分子と複合体を形成して腫瘍関連抗原からのペプチドと相互作用し得る。この相
互作用は結果として細胞毒性Ｔ細胞応答を誘発し、自家腫瘍細胞を特異的に致死
させる。

【００９６】本発明はＮＤＶ感染により誘発されるケモカインと免疫刺激性タンパク質の、
レパートリーと量とが調節されることを提供する。本発明は異種遺伝子を取込み
、発現するように修飾した組換えＮＤＶを生成する方法を提供する。かかる組換
えＮＤＶは感染細胞において免疫刺激性タンパク質のレパートリーと量を改変す
るために使用し得る。一実施の形態において、本発明は、ヒト・インターフェロ
ン、ケモカインまたは他の免疫刺激性タンパク質をエンコードする遺伝子を取込
み、発現する組換えＮＤＶを提供する。当該組換えＮＤＶは通常のＡＴＶ−ＮＤ
Ｖよりもより強力なＡＴＶ−ＮＤＶ産生のために使用される。例えば、サイトカ
イン、ＩＦＮ−α、−β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６；ケモカイン、ラン
テス（RANTES）、ＩＰ−１０；他の遺伝子、例えば、ＨＳＰ、ＡＣＴＨ、エンド
ルフィン、ｉＮＯＳ、ＥＰＡ／ＴＩＭＰ、ＮＦｋＢ。ＮＤＶの多形質発現性免疫
刺激性は、感染疾患に対する動物およびヒトの予防接種用のアジュバントとして
も使用し得る。本発明の一実施の形態において、感染作用因子の適切な抗原をエ
ンコードする外来遺伝子はＮＤＶゲノムに導入され、感染細胞による抗原と免疫
刺激タンパク質の同時発現が感染作用因子に対する強い免疫応答を誘発する。本
発明の他の実施の形態において、ＮＤＶの免疫刺激性は、抗原と特異的免疫刺激
タンパク質を同時に発現するＮＤＶ組換え体を使用することでさらに増強される
。好適な実施の形態において、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の関
連抗原を単独または免疫刺激タンパク質との併用において発現するＮＤＶ組換え
体の使用により、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）ワクチンを生成させるため
に使用される。

【００９７】ＮＤＶはまた感染性疾患に対して動物およびヒトに予防接種を行うためのアジ
ュバントとしても使用される。本発明の一実施の形態において、感染性作用因子
の適切な抗原をエンコードする異種または外来性遺伝子はＮＤＶゲノムに導入さ
れ、感染細胞による抗原と免疫刺激タンパク質の同時発現が感染作用因子に対す
る強い免疫応答を誘発する。本発明の他の実施の形態において、ＮＤＶの免疫刺
激性は、抗原と特異的免疫刺激タンパク質を同時に発現するＮＤＶ組換え体を使
用することでさらに増強される。好適な実施の形態において、本発明は、ヒト免
疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の関連抗原を単独または免疫刺激タンパク質との併用
において発現するＮＤＶ組換え体の使用により、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候
群）ワクチンを生成させるために使用される。

【００９８】また、自己制限非伝染性（キャリアー）ワクチンとして使用し得る条件致死Ｎ
ＤＶ欠失突然変異体を生成させる方法が提供される。ＮＤＶ欠失変異体は生成さ
れても、内部細胞膜でＮＤＶの出芽に関与するマトリックス（Ｍ）タンパク質を
発現できない。本発明は、例えば、Ｍタンパク質は発現し得ないが、細胞に感染
し、細胞から細胞への伝播により拡散し得る、表現型に相補性であるＮＤＶ株を
提供する。しかし、突然変異ウイルスは非相補性細胞上感染性の子孫を生成する
ことができない。このことは、表現型に相補性であるＮＤＶ欠失突然変異体が、
環境に拡散することのできない安全な自己制限ワクチンとして使用し得ることを
示している。かかる非伝染性ワクチンは、最も重要な生ワクチンの利点、すなわ
ち、有効性と、最も重要な死菌ワクチンの利点、すなわち、安全性が組み合わさ
っている。

【００９９】本発明は、ニューカッスル病ウイルス、または、例えば、孵化鶏卵または適当
な細胞にて継代し、またはさらに培養することによって誘導したその株、すなわ
ち、本発明により提供される方法により得られる感染性コピーウイルスから誘導
した株を提供する。

【０１００】例えば、ＮＤＶは、弱毒化、毒性修飾、抗原性修飾した感染性コピーニューカ
ッスル病ウイルスを生成する少なくとも１つの方法で修飾したものであって、異
種抗原を発現するかまたは非伝染性またはその組合わせであるＮＤＶが提供され
る。

【０１０１】このようにして、本発明は、例えば、明瞭な毒性の特質または明瞭な抗原特性
を担持することで特徴づけられるＮＤＶワクチンであって、マーカーワクチンを
目的とするか、および／または他の病原から由来する異種抗原を発現するための
ものであるか、伝染性および／または非伝染性型のものであるＮＤＶワクチンを
提供する。

【０１０２】かかるワクチンは死菌ワクチンであっても、生ワクチンであってもよい。好ま
しくは、かかるワクチンは生菌ワクチンであるが、本発明により提供される死菌
ワクチンは生菌ワクチンが、例えば、商業上の制限により、または疾患管理当局
が定めた他の条件のために、適用できないか、適用し難い状況下で有利である。

【０１０３】本発明はこのようにして、当該血清学的に関連した免疫優性エピトープまたは
マーカーに対する抗体を検出するための診断法および対応するテスト・キットを
も提供し、それによって家禽におけるＮＤＶおよび／または他の家禽類疾病を抑
制する、および／または撲滅する方法を実施するための方法および／または手段
を提供する。本発明は新規・有効なワクチンであって、野生型ウイルスおよび旧
型ウイルスとから血清学的に識別し得るワクチンを提供する。かかる新規ワクチ
ンはＮＤＶマーカーワクチンと称し、抗原的に適切なＮＤＶエピトープの最も可
能性の高い免疫スペクトルを提供し、さらに随伴する診断法とキットを適用する
ことにより野生型ＮＤＶから血清学的に区別される。

【０１０４】本発明は未予防接種動物または本発明方法によるＮＤＶワクチンを接種した動
物を、野生型ＮＤＶに感染した動物または未修飾亜病原性または長潜伏期性ＮＤ
Ｖ−ワクチン株を接種した動物から識別する方法を提供し、該方法は最少量の１
サンプル（例えば、血清、血液、卵または眼液）を当該動物から採取し、当該サ
ンプルについて、当該野生型または未修飾ＮＤＶによって発現されるが、本発明
のワクチンによっては発現されない免疫優性エピトープまたはマーカーに対する
抗体の存在を決定することを含む。

【０１０５】本発明は、当該抗体がＮＤＶのＨＮまたはＦタンパク質、例えば、本明細書の
実験の部に記載したハイブリッドタンパク質に対するものである場合の方法を提
供する。本発明は、例えば、当該動物が家禽類からなる群から選択される、好ま
しくはニワトリである場合の診断方法を提供する。

【０１０６】また、本発明は動物間で血清学的に識別する方法に使用する診断キットを提供
する。本発明の一実施の形態においては、簡単で迅速な赤血球凝集阻害（ＨＩ）
試験を用い、予防接種した動物と感染した動物間の識別をする。ＮＤＶのＨＮの
完全球状頭部が他の血清型ＨＮの対応部分と置換わっているマーカーワクチンを
接種した動物は、ＮＤＶのＨＮに対し抗体を誘発しないので、ＮＤＶビリオンに
よる赤血球凝集反応を阻害しない。

【０１０７】ＨＩ試験においてマーカーワクチンビリオンを使用することにより、ハイブリ
ッドＨＮタンパク質に対する抗体を検出し、予防接種の有効性に対する尺度とし
て用いることができる。代替法として、ＮＤＶのＦタンパク質に対する抗体を検
出するＥＬＩＳＡを使用して、予防接種の有効性を測定する。

【０１０８】ＨＩ試験の他にも、ＥＬＩＳＡを用い、ＮＤＶのＨＮに対する抗体の存在を決
定することができる。かかる試験において使用される抗原は、例えば、組換えＤ
ＮＡ技法により発現されるＮＤＶのＨＮであるか、またはＮＤＶのＨＮからの保
存ペプチドである。遮断ＥＬＩＳＡを用いることもできる。この事例では、ＮＤ
ＶのＨＮの保存ペプチドに対する１種またはそれ以上のモノクローナル抗体を使
用し、競合する抗体がワクチン接種した動物からのサンプルに存在するか否かを
決定する。ＥＬＩＳＡ試験は、もしマーカーワクチンがキメラＨＮタンパク質の
みを含んでいるならば、あるいはＮＤＶのＨＮの少数のエピトープが置換わって
いる場合、有利に使用することができる。

【０１０９】本発明をさらに本明細書の実験の部において説明するが、これらは本発明を限
定するものではない。

【０１１０】実施例材料および方法標準クローニング法は、別に記載しない場合は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（
１９８９）によって行った。複製連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成したＤＮＡ断
片を含む全構成分は、塩基配列分析によって確認した。下に挙げるプライマーの
配列において、下線を引いた塩基はＮＤＶの配列に対応し、ＮＤＶゲノム内のポ
ジションを表示する。クローニングに使用した制限部位の塩基配列は、太字で示
す。細胞およびウイルスウシ胎児血清５％ならびに１０００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０００μｇ／ｍｌ
ストレプトマイシン、２０μｇ／ｍｌファンギゾン、５００μｇ／ｍｌポリミキ
シンＢおよび１０ｍｇ／ｍｌカナマイシンからなる抗生物質ミックスを２％含む
ＧＭＥM／ＥＭＥM（１：１）中でＣＥＲ細胞（Ｓｍｉｔｈら、１９７６）を培養
した。ＱＴ３５細胞（Ｍｏｓｃｏｖｉｃｉら、１９７７；Ｃｈｏ、１９８２）は
、ＦＣＳ５％および抗生物質ミックス２％を追加した、ＧｉｂｃｏＢＲＬ／Ｌｉ
ｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって供給された培地（カタログ番号Ｎｏ．
０４１−９１５３６；ＦｏｒｔＤｏｄｇｅが独占権をもつ組成物）で培養した
。ＱＭ５細胞（ＡｎｔｉｎおよびＯｒｄａｈｌ、１９９１）は、燐酸トリプトー
スブイヨン１０％、ＦＣＳ１０％および混合抗生物質２％を追加したＭ１９９培
地で培養した。

【０１１１】ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａはＡＴＣＣ（ＡＴＣＣＶＲ−６９９）から入手し、有
胚鶏卵で２回経代培養した。ｃＤＮＡの構築およびクローニングを始める前に、
該ウイルスは、ニワトリ原発性胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）上でのプラーク精製を３
回繰り返して精製した。この目的のために、ウシ胎児血清５％、抗生物質ミック
ス２％、尿膜腔液５％、ＭｇＣｌ₂３０ｍＭ、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇ
ｍａ）２００μｇ／ｍｌおよび寒天Ｎｏｂｅｌ（Ｄｉｆｃｏ）０．８％を含むＧ
ＭＥM／ＥＭＥM（１：１）で培養したＣＥＦ細胞上に該ウイルスを滴下した。プ
ラーク精製の第３回目から得られたウイルス（クローンＥ１３−１と表示する）
を有胚鶏卵で培養し、接種後４日目に尿膜腔液を採取し、そのアリコートを−７
０℃で保存した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する組替え鶏痘ウイルスｆｐ
ＥＦＬＴ７ｐｏｌ（Ｂｒｉｔｔｏｎら、１９９６；以後ＦＰＶ−Ｔ７と称す）は
、ＭｉｃｈａｅｌＳｋｉｎｎｅｒ博士からの恵贈品であり、ＱＴ３５細胞上で
培養した。

【０１１２】ウイルスＲＮＡの単離操作はすべて、ＲＮアーゼの存在しないガラス容器またはプラスチック容器で
行い、溶液はすべて、１％ジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）で処理したＲ
Ｎアーゼ除去の水で作成した。ＢｅｃｋｍａｎＳＷ４０遠心機による、２１，
０００ｒｐｍ、４℃で７０分間の遠心分離により、尿膜腔液からウイルスをペレ
ット化した。このペレットをホモジナイズ化緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭＮａＣｌ，５ｍＭＥＤＴＡ，０．５％ＳＤＳ
）に再懸濁し、絶えず攪拌しながら３７℃で９０分間プロテイナーゼＫ（２００
μｇ／ｍｌ）で処理した。溶菌液を、等量のフェノール／クロロホルム（１：１
）（ｐＨ５．４）で２回、等量のクロロホルムで１回抽出した。ウイルスＲＮＡ
は、３ＭＮａＯＡｃ（ｐＨ５．３）および２．５倍量の１００％エタノールを
添加して水相から沈殿させた。沈殿は、遠心により採取して、７０％エタノール
で１回洗浄し、水に再懸濁させ、分割して−７０℃で保存した。

【０１１３】逆転写ウイルスＲＮＡ（１．５μｇ）を、１２μｌの容量にプライマー５００ｎｇを
含む液と混合し、７０℃で１０分間インキュベートした。５ｘＲＴ緩衝液（２５
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，３７５ｍＭＫＣｌ，１５ｍＭＭｇ
Ｃｌ₂；ＧｉｂｃｏＢＲＬ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）４μｌ、０
．１ＭＤＴＴ２μｌおよび１０ｍＭｄＮＴＰ'ｓ２μｌ（各２．５ｍＭ
）を添加し、混合液を４２℃で２分間インキュベートした。最終容量２０μｌ中
で、逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ II；ＧｉｂｃｏＢＲＬ／Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）２００単位を添加し、ついで４２℃で６０分間イン
キュベートすることにより逆転写を行った。

【０１１４】ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ＮＤＶゲノムの３'および５'末端を決定するために使用したＰＣＲ反応（下記
参照）はすべて、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を
用いて行った。個々のＮＤＶ遺伝子または大サブゲノムｃＤＮＡのクローニング
のために、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼＰｗｏか、ＴａｑとＰｗｏ
の混合物（ＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙキットまたはＥｘｐａｎ
ｄＬｏｎｇＴｅｍｐｌａｔｅキット）を、メーカー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の指示書に従って使用した。試料はすべて、指示された回
数のＰＣＲサイクルの開始前に９４℃で２分間インキュベートした。指示された
回数のＰＣＲサイクルの後、試料を、ＰＣＲサイクルの伸長反応時間の少なくと
も３倍の時間、伸長反応温度でインキュベートした。ＰＣＲ断片を、高純度ＰＣ
Ｒ製品精製キット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）で直接精製する
か、またはアガロースゲル電気泳動の後、ＱｉａｅｘII抽出キット（Ｑｉａｇｅ
ｎ）を基本的にメーカーの指示どおりに使用して精製した。

【０１１５】塩基配列分析塩基配列はすべて、ＰＲＩＳＭＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＤｙｅＤ
ｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキット（
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて決定した。反応混合液（５μｌ）をＧｅｎ
ｅＡｍｐ２４００サーモサイクラー中で２５サイクルの線形増幅（９４℃で１０
秒、５０℃で５秒、および６０℃で４分）にかけた。その後、反応混合体をエタ
ノールで沈殿させ、７０％エタノールで１回洗浄し、ＴＳＲ緩衝液（Ｐｅｒｋｉ
ｎＥｌｍｅｒ）１５μｌで再懸濁させ、９４℃で２分間加熱した後、Ａｐｐｌ
ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＡＢ３１０自動シークエンサーにかけた。

【０１１６】ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａの全ゲノムの配列決定に用いたプライマーの塩基配列は
、公表されている配列から、またはこの配列決定計画の間に確立された配列から
引き出した。プライマー類を表１に示す。

【０１１７】ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのゲノムの３'および５'末端のクローニングおよび配列
決定ＮＤＶゲノムの３'および５'末端の塩基配列は、ＲＡＣＥ法（ｃＤＮＡ末端の
迅速増幅法）を用いて決定した。プライマーｐ３６０（５'−ＧＧＣＧＡＴＧＴ
ＡＡＴＣＡＧＣＣＴＡＧＴＧＣＴＴ−３'；ｎｔ１４７５６−１４７７９）（
ＮＤＶのＬ−遺伝子の公表された塩基配列（Ｙｕｓｏｆｆら、１９８７）から引
き出した）を用いる、最終容量２０μｌでの逆転写反応には、ＮＤＶＲＮＡを
使用した。一本鎖ｃＤＮＡ（ＲＴ混合物の２．５μｌ）を、アンカープライマー
ＡＬＧ３（５'−ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＴＣＧＡＴＴＣＴＧＧＡＴＣＣＴ
ＴＣ−３'）８ｐｍｏｌに添加し、Ｔｅｓｓｉｅｒら（１９８６）による記載の
とおりに、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、
１０μｇ／ｍｌＢＳＡ、２５％ＰＥＧ、１ｍＭＨＣＣ、２０μＭＡＴＰ
およびＴ４ＲＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）１
０単位を含む反応混合液２０μｌの中で、室温で一夜連結反応をさせた。連結反
応の１μｌを、プライマーｐ３７５（５'−ＣＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡ
ＴＡＴＴＡＣＡＧＴＡＡＣＴ−３'；ｎｔ１４９６４−１４９８３）およびＡ
ＬＧ４（５'−ＧＡＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＴＣＧＡＴＡＧ−３'）を用いるＰＣ
Ｒ反応におけるテンプレートとして使用した。後者のプライマーは、アンカープ
ライマーＡＬＧ３に対し相補的である。ＰＣＲの条件（４０サイクル）は次のと
おりである：９４℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で２分間。ＰＣＲ生
成物を精製し、Ｔ−ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＴＳＫ（Ｉｃｈｉｈａｒ
ａおよびＫｕｒｏｓａｗａ、１９９３）中にクローニングした。あるいはその代
わりに、精製したＰＣＲ生成物をＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼＩで処理し
て平滑末端を作り、プラスミドｐＧＥＭ４Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｃII部
位にクローニングした。１３個の独立クローン（８×ｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐｔＩ
Ｉ−ＴＳＫおよび５×ｐＧＥＭ４Ｚ）を配列して、ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａゲノム
の５'末端の塩基配列を決定した。３'末端の塩基配列は、二つの独立した方法に
よって決定した。方法Ｉでは、Ｓｃｈｕｔｚｅら（１９９５）によって記載され
ているとおりに、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いることによって、プライマーＡＬ
Ｇ３をウイルスＲＮＡの３'末端に連結させた。反応混合液（最終容量１０μｌ
）には、ＮＤＶＲＮＡ２．５μｇ、ＡＬＧ３１００ｐｍｏｌ、１０× Ｔ
４ＲＮＡリガーゼ緩衝液（５００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０
０ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｍＭＤＴＴ、１０ｍＭＡＴＰ）１μｌ、ＤＭＳ
Ｏ１μｌ、１０μＭヘキサミン−塩化コバルト１μｌ、ＲＮアーゼ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）１μｌおよびＴ４ＲＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢ
ｉｏｌａｂｓ）１０単位が含まれていた。この混合液を室温で１夜インキュベー
トし、この連結反応の５μｌを、プライマーとしてＡＬＧ４を用いる逆転写反応
のテンプレートして使用した。プライマーＡＬＧ４およびｐ３７６（５'−ＧＡ
ＧＣＣＴＴＡＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴＣＧＴＡＣＴＧＡＴＣ−３'；ｎｔ１３７
−１６４）（この塩基配列は、ＮＤＶの３'末端の公表された塩基配列（Ｉｓｈ
ｉｄａら、１９８６）から引き出した）を用いるＰＣＲ反応にＲＴ−反応の１μ
ｌを使用した。ＰＣＲ条件は、５'ＲＡＣＥについて上に記載したのと同じであ
った。方法IIにおいては、方法Ｉについて記載したのと同じ条件で、Ｔ４ＲＮ
Ａリガーゼを用いることによってウイルス性ＮＤＶＲＮＡの３'と５'末端を互
いに連結した。連結反応混合液の５μｌを、プライマーｐ３６０を用いる逆転写
反応においてテンプレートとして使用した。プライマーｐ３７５およびｐ３７６
を用い、かつ５'ＲＡＣＥについて上に記載したＰＣＲ条件を用いるＰＣＲ反応
に、ＲＴ反応の１μｌを使用した。ＰＣＲ生成物は、ＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリ
メラーゼＩで処理して平滑末端を作り、プラスミドｐＧＥＭ４ＺのＨｉｎｃII部
位（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。１０個の独立したクローン（方法Ｉ
から４個、方法IIから６個）の配列を分析して、ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのゲノム
の３'末端の塩基配列を決定した。

【０１１８】転写ベクターの構築基本レプリコンとしてプラスミドｐＯＫ１２（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉ
ｎｇ、１９９１）を用いることによって低コピー番号の転写ベクターを構築した
。プラスミドｐＯＫ１２をＰｖｕIIで消化し、複製開始起点およびカナマイシン
−抵抗遺伝子を含むＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片を、転写ベクター２
．０（ＡｎｄｒｅｗＢａｌｌ博士の恵贈品；Ｐａｔｔｎａｉｋら、１９９２）
から得たＥｃｏ４７III−ＡｆｌII断片（ＡｆｌII部位は、ＫｌｅｎｏｗＤＮ
ＡポリメラーゼＩを用いて平滑にした）に連結した。得られたプラスミドからＸ
ｂａＩ−ＮｈｅＩ断片を削除して、できるだけ多くの特定の制限部位を減らした
。得られたプラスミドをｐＯＬＴＶ５と称す（図１）。転写ベクターｐＯＬＴＶ
５には、特異なＳｔｕＩおよびＳｍａＩ制限部位が後続するＴ７ＤＮＡ依存性
ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）由来の自己触媒
性リボザイムおよびバクテリオファージＴ７由来の転写終結シグナルが含まれて
いる。ＳｔｕＩ部位とＳｍａＩ制限部位の間にクローニングされた断片は、Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼを用いることによって、インビトロでもインビボでも転写す
ることができる。転写の後、得られた転写産物の５'末端には、プラスミドによ
ってコードされた２個のＧ残基が含まれている。ＨＤＶリボザイムの自己触媒作
用により、転写産物の３'末端は、クローニングされたＤＮＡ断片の正確な末端
塩基に対応している（Ｐａｔｔｎａｉｋら、１９９２）。

【０１１９】ミニゲノムプラスミドの構築ＮＤＶの複製および転写の要件を調べるために、全ＮＤＶ遺伝子を置換したレ
ポーター遺伝子を側に配置しているＮＤＶの３'および５'末端部分を含んだミニ
ゲノムプラスミドを構築した（図２）。ＮＤＶの３'および５'末端領域に対応す
るＤＮＡ断片を、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（３０サイクル；９４℃で１５秒
、５０℃で３０秒および７２℃で３０秒）を用いること、ならびにテンプレート
として３'および５'ＲＡＣＥ断片（上記参照）を含んだプラスミドを用いること
によるＰＣＲ法によって産生した。

【０１２０】３'領域（ｎｔ１〜１１９）は、プライマー３ＵＩＴ（５'−ＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＡＴＣＣＧＴＧＡＧＴＴＡＣＧＡ −３'、ｎｔ１〜２７）およびＳ
ＥＡＰ３（５'−ＡＴＣＧＡＴＡＣＴＧＧＴＣＡＧＣＡＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＡ
ＧＧＣＴＴＴＣＴＣＧ−３'、ｎｔ１０２〜１１９）を用いることによって作
った。５'領域（ｎｔ１４９７３〜１５１８６）は、プライマーＳＥＡＰ５（
５'−ＧＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＴＡＴＣＧＡＴＡＴＴＡＣＡＧＴＡＡＣＴＧ
ＴＧＡＣＴ−３'、ｎｔ１４９７３〜１４９９０）および５ＮＤＶ（５'−ＡＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＴＧＡＡＴＧＡＣＧＡ −３'、ｎｔ１５１５
８〜１５１８６）を用いることによって作った。２個のＤＮＡ断片を、プライマ
ー３ＵＩＴおよび５ＮＤＶを用いることによる重複ＰＣＲ法（重複は、上に示し
たプライマーの塩基配列においてイタリックで示してある）で結合した。得られ
たＤＮＡ断片（これは、２０個の塩基によって分離されたＮＤＶの３'および５'
末端の融合である）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼの処理によってホスホリ
ル化し、ＳｔｕＩおよびＳｍａＩで切断してウシ腸管ホスファターゼ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）で脱ホスホリル化した転写プラスミドｐＯＬ
ＴＶ５（図１）中の両方の位置にクローニングした。最後に、分泌したアルカリ
性ホスファターゼをコードするＳＥＡＰ−遺伝子を、ＳｐｈＩおよびＣｌａＩで
の消化によってプラスミドｐＳＥＡＰ−Ｂａｓｉｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から回
収し、ＮＤＶの３'と５'末端の間のＳｐｈＩ部位とＣｌａＩ部位の間にクローニ
ングした。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴ
Ｖ５５３と称した。プラスミドｐＯＬＴＶ５３５のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを
用いるインビボまたはインビトロの転写により、アンチゲノムＲＮＡ（〔＋〕−
ＲＮＡ）が生成する。一方、プラスミドｐＯＬＴＶ５５３の転写により、ゲノム
ＲＮＡ（〔−〕ＲＮＡ）が生成する。

【０１２１】プラスミドｐＯＬＴＶ５３５Ｎ０〜−Ｎ５およびｐＯＬＴＶ５５３Ｎ０〜−Ｎ
５は、それぞれ、ｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３の中のＳＥＡＰ−遺
伝子とＮＤＶの５'末端との間に存在するＣｌａＩ部位に自己相補性オリゴヌク
レオチドを挿入することによって産生させた（図２参照）。使用したオリゴヌク
レオチド：Ｎ０には、５'−ＣＧＣＧＡＧＣＴＣＧ−３'；Ｎ１には、５'−ＣＧ
ＣＧＡＧＳＣＴＣＧ−３'；Ｎ２には、５'−ＣＧＣＧＡＧＣＧＣＴＣＧ−３'；
Ｎ３には、５'−ＣＧＣＧＡＧＣＷＧＣＴＣＧ−３'；Ｎ４には、５'−ＣＧＣＧ
ＡＧＣＡＴＧＣＴＣＧ−３'；Ｎ５には、５'−ＣＧＣＧＡＧＣＡＳＴＧＣＴＣＧ
−３'（ここでＷ＝ＡまたはＴ；Ｓ＝ＣまたはＧ）であった。

【０１２２】プラスミドｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３中のＴ７プロモーターの
修飾ＮＤＶの標準５'および３'末端を含むインビトロまたはインビボの転写産物を
生成させるために、プラスミドｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３中のＴ
７プロモーターを、転写がＮＤＶの３'および５'末端の最初の塩基から始まるよ
うに修飾した。

【０１２３】１）ＢＧｌI−制限部位、２）Ｔ７プロモーターの末端にある２個のＧ残基が
Ａ残基で置換されるように修飾したＴ７プロモーター（イタリックで表示）の塩
基配列、ならびに３）ＮＤＶの３'末端（ｎｔ１〜２１）または５'末端（ｎｔ
１５１６４〜１５１８６）、を含むプライマーを設計した。プライマーＢＧＬ
３Ｆ２（５'−ＧＡＴＡＴＧＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣ
ＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＡＴＣＣＧＴＧＡＧ−３'）およびＳＥ
ＡＰ３（上記参照）を用いて、ｐＯＬＴＶ５３５中のＳＥＡＰ遺伝子の起点まで
に修飾したＴ７プロモーターおよびＮＤＶの全３'末端を含むＤＮＡ断片を作製
した。同様に、プライマーＢＧＬ５Ｆ２（５'−ＧＡＴＡＴＧＧＣＣＡＴＴＣＡ
ＧＧＣＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＡＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＴＧＡＡＴＧ −３'）およびＳＥＡＰ５を用いることによって、ｐＯＬＴＶ
５５３中のＳＥＡＰ遺伝子の終点までに修飾したＴ７プロモーターおよびＮＤＶ
の全５'末端を含むＤＮＡ断片を作製した。得られた断片を、それぞれ、Ｂｇｌ
ＩとＳｐｈＩ（３'末端）で、またはＢｇｌＩとＣｌａＩ（５'末端）で消化し、
ｐＯＬＴＶ５３５中のＢｇｌＩ−ＳｐｈＩ断片またはｐＯＬＴＶ５５３中のＢｇ
ｌＩ−ＣｌａＩ断片に置換するのに使用した。得られたプラスミドは、それぞれ
、ｐＯＬＴＶ７３５およびｐＯＬＴＶ７５３と称した。プラスミドｐＯＬＴＶ７
３５Ｎ３およびｐＯＬＴＶ７５３Ｎ３は、ＳＥＡＰ遺伝子と、それぞれ、ｐＯＬ
ＴＶ７３５およびｐＯＬＴＶ７５３の中にあるＮＤＶの５'末端との間に位置す
るＣｌａＩ部位に、自己相補性オリゴヌクレオチド（５'−ＣＧＣＧＡＧＣＷＧ
ＣＴＣＧ−３'；Ｗ＝ＡまたはＴ）を挿入することによって作製した。

【０１２４】ＳＥＡＰレポータープラスミドの構築真核生物の発現ベクターｐＣＩｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＸｈｏＩ部位とＳ
ｍａＩ部位との間に、プラスミドｐＳＥＡＰ−Ｂａｓｉｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
から得たＳＥＡＰ−遺伝子を含むＸｈｏＩ−ＣｌａＩ断片（ＣｌａＩ部位は、Ｋ
ｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼＩを用いて平滑にした）をクローニングするこ
とによってプラスミドｐＣＩｎｅｏＳＥＡＰを構築した。プラスミドｐＳＥＡＰ
−Ｂａｓｉｃには、バクテリオファージＴ７プロモーターに加えてヒトサイトメ
ガロウイルス（ｈＣＭＶ）が含まれている。Ｔ７プロモーターだけから作製した
転写産物によるＳＥＡＰ発現を検査・定量するために、ｈＣＭＶプロモーターを
欠いた他のプラスミドを構築した。この目的のために、ＨｉｎｄIIIでの部分消
化とそれに続くＢｇｌIIでの完全消化によって、ｐＣＩｎｅｏからｈＣＭＶプロ
モーターを削除した。ｈＣＭＶプロモーターを削除したＤＮＡ断片（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈの番号付けによれば、ｎｔ７５６〜５４６９）を単離し、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼで処理して平滑末端を作成し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて再環
化した。得られたプラスミドは、ｐＣＩｎｅｏＤと称した。最後に、ＳＥＡＰ遺
伝子を、ｐＳＥＡＰ−ＢａｃｉｓからＭｌｕＩ−ＡｃｃＩ断片として回収し、ｐ
ＣＩｎｅｏＤ中、ＭｌｕＩ部位とＣｌａＩ部位の間にクローニングした。得られ
たプラスミドをｐＣＩｎｅｏＤＳＥＡＰと称した。

【０１２５】トランスフェクション細胞を、２４穴のペトリ皿に植付け、１夜増殖させて６０〜８０％の集密度に
し、感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）１で、３７℃１時間、ＦＰＶ−Ｔ７に感染させ
た。この細胞に、基本的にメーカー（ＧｉｂｃｏＢＲＬ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ）の指示どおりにＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥおよびＯｐｔｉＭ
ｅｍ３μｌを用いて、ミニゲノムプラスミドＤＮＡ０．５μｇをトランスフェク
ションした。３７℃で４時間（ＣＥＲ細胞）または１６時間（ＱＭ５細胞）イン
キュベートした後、細胞に、多重感染度５で１時間、ＮＤＶ（Ｄｕｔｃｈｖｉ
ｒｕｌｅｎｔｉｓｏｌａｔｅ番号１５２６０８；ウエル当たり２００μｌ）に
感染させるか、または感染させないままで放置した。接種物を吸引し、完全培地
１ｍｌで置換し、細胞を３７℃でさらにインキュベートした。コトランスフェク
ションのために、６穴のペトリ皿で細胞を増殖させ、上記と同じようにＦＰＶ−
Ｔ７に感染させた。細胞は、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＮＩＮＥ８μｌまたはＦｕＧ
ｅｎｅ^TM６（ＢｏｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）９μｌを使用することに
よって、ミニゲノムプラスミドＤＮＡ０．２５μｇ、ｐＣＩｎｅｏＮＰ０．
４μｇ、ｐＣＩｎｅｏＰ０．２μｇおよびｐＣＩｎｅｏＬ（ｃ）またはｐＣＩ
ｎｅｏ０．２μｇをコトランスフェクションした。感染性ウイルスを産生する
ために、ミニゲノムプラスミドを、全鎖長ＮＤＶｃＤＮＡを含んだ転写プラス
ミドに置換した。

【０１２６】ＳＥＡＰ活性の定量Ｐｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ^TM ＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＲｅｐ
ｏｒｔｅｒＡｓｓａｙｆｏｒＳｅｃｒｅｔｅｄＡｌｋａｌｉｎｅＰｈ
ｏｓｐｈａｔａｓｅｋｉｔを基本的にメーカー（Ｔｒｏｐｉｘ）の記載どおり
に使用して、９６穴の使い捨てプレート上で、トランスフェクションした細胞の
培地に分泌されたＳＥＡＰの量を測定した。化学発光を、液体シンチレーション
カウンター（Ｗａｌｌａｃ１４５０ｍｉｃｒｏｂｅｔａＰＬＵＳ）を用い
て定量した。

【０１２７】ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａの全ゲノムに亘るｃＤＮＡのクローニングおよび塩基配
列の決定ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａの全ゲノムをクローニングし、塩基配列を決めるために
、ＲＴ−ＰＣＲによって大サブゲノムｃＤＮＡクローンを作製し、ｐＧＥＭ−Ｔ
の中にクローニングした。上記のごとく、プライマー３ＵＩＴを用いて第１鎖ｃ
ＤＮＡを合成し、ＲＴ反応の１μｌを、ＥｘｐａｎｄＬｏｎｇＴｅｍｐｌａ
ｔｅＰＣＲキット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を用いるＰＣ
Ｒ反応に使用した。ＰＣＲ法は、９４℃で１０秒間、５８℃で３０秒間および６
８℃で６分間のサイクル５回、さらに９４℃で１０秒間、５８℃で３０秒間、お
よび６８℃で６分間のサイクル１０回からなっていた。その中で、６８℃での伸
長反応時間は、サイクルごとに２０秒ずつ延ばした。ＰＣＲ断片は、基本的にメ
ーカー（Ｐｒｏｍｅｇａ）が記載しているとおりにｐＧＥＭ−Ｔクローニングキ
ットを使用してｐＧＥＭ−Ｔ中にクローニングした。連結反応混合液をＥ．Ｃｏ
ｌｉ株ＳＵＲＥ II（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）に形質転換した。２回の独立した
ＲＴ−ＰＣＲ反応（ＡおよびＢ）を行い、おのおのでｃＤＮＡクローンの類似セ
ットを得た。サブゲノムｃＤＮＡクローンの塩基配列は、ＮＤＶ−特異的プライ
マー（表１）を用いて、かつ挿入体の側に配置しているプライマーによって決定
した。クローンのＡおよびＢシリーズの塩基配列を比較した後、残っているあい
まいさをｃＤＮＡの第３独立シリーズ（Ｃシリーズ）の相当領域の塩基配列を決
めることによって取り除いた。ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａの塩基配列を図３に示す。

【０１２８】ＮＤＶの全鎖長ゲノムｃＤＮＡクローンの構築出発プラスミドとしてｐＯＬＴＶ５３５を用いることによって転写プラスミド
ｐＯＬＴＶ５に全鎖長ＮＤＶｃＤＮＡを集めた。これらのＤＮＡ断片を、図４
Ｂに示すように通常の制限酵素を用いて重複点で結合した。一連のクローニング
段階で、ポジション３５２１および１２３５５でＣｌａＩ部位を結合することに
よって生成した、ＣｌａＩ部位によって分離されたヌクレオチド１〜３５２１お
よび１２３５５〜１５１８６を含むプラスミド（ｐ５３５−ＤＩと命名）を構築
した。他の系列のクローニング段階で、ヌクレオチド３５２１〜１２３５５（Ｃ
ｌａＩ断片）を含むＮＤＶゲノムの一部を含んだプラスミド（ｐＧＥＭ−Ｂと命
名）を構築した。クローニングを容易にするために、後者のＣｌａＩ断片に、プ
ラスミドｐＡＣＹＣ１８４から得たクロラムフェニコール抵抗性（Ｃｍ）遺伝子
を標識に付けた（ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ、１９７８）。この目的のために
、プライマーＣＡＴ−Ｆ（５'−ＧＣＧＴＡＣＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣ
ＣＣＴＧＴＴＧＡＴＡＣＣＧＧ−３'）およびＣＡＴ−Ｒ（５'−ＧＣＴＣＴＡＧ
ＡＣＧＴＡＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＣＴＧＡＡＣＣＧＡＣＧ−３'）を用いるＰＣ
ＲによってｐＡＣＹＣ１８４からＣｍ遺伝子を回収した。ＰＣＲ法は、Ｐｗｏ
ＤＮＡポリメラーゼを用いて行い、９４℃で３０秒、６０℃で４５秒および７２
℃で６０秒のサイクル３０回からなっていた。得られたＰＣＲ断片をＢｓｉＷＩ
で消化し、ｐＧＥＭ−Ｂの特定ＢｓｉＷＩ部位にクローニングし、ｐＧＥＭ−Ｂ
（ＣＡＴ）を得た。ｐＧＥＭ−Ｂ（ＣＡＴ）から得たＣｌａＩ断片は、ｐ５３５
−ＤＩの特定ＣｌａＩ部位にクローニングして、ｐＮＤＦＬ（ＣＡＴ）を得た。
最後に、このプラスミドからＣｍ遺伝子を、ＢｓｉＷＩでの消化とそれに続くＥ
．ｃｏｌｉ株ＤＨ５ａの再連結および形質転換によって除去した。得られたプラ
スミドをｐＮＤＦＬ＋と称した。これには、転写プラスミドｐＯＬＴＶ５の中の
Ｔ７プロモーターおよびＨＤＶリボザイムの間にクローニングしたＮＤＶｃＤ
ＮＡ全塩基配列が含まれている。

【０１２９】個々のＮＤＶ遺伝子のクローニングおよび発現ＮＤＶＬａＳｏｔａ遺伝子の各々を含むＤＮＡ断片をＲＴ−ＰＣＲ法によっ
て作成し、ｐＣＩｎｅｏ中にクローニングした。クローニングの後、断片すべて
の塩基配列を、挿入配列を側に持つプライマーを用いることによって、かつ遺伝
子特異的プライマーによって決定した。

【０１３０】ＮＰ−遺伝子：プライマー３８６（５'−ＧＡＧＣＡＡＴＣＧＡＡＧＴＣＧＴ
ＡＣＧＧＧＴＡＧＡＡＧＧＴＧ−３'、ｎｔ４０〜６９）を逆転写に使用した
。プライマー３６５（５'−ＧＴＧＴＧＡＡＴＴＣＣＧＡＧＴＧＣＧＡＧＣＣＣ
ＧＡＡＧ−３'；ｎｔ７７〜９４）および８９２（５'−ＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴ
ＧＣＡＧＧＴＣＡＧＴＡＣＣＣＣＣＡＧＴＣ−３'；ｎｔ１５７７〜１５９３
）を、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ法に使用した。次のＰＣＲプ
ロフィール（３０サイクル）を使用した：９５℃で３０秒、６５℃で４０秒およ
び７２℃で４５秒。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中
、ＥｃｏＲＩ部位とＳｍａＩ部位との間にクローニングした。ＮＰタンパク質の
発現は、モノクローナル抗体３８（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９８３）を用いて、Ｐ
ｅｅｔｅｒｓら（１９９２）によって記載されている免疫ペルオキシダーゼ単層
検定法（ＩＰＭＡ）で確認した。

【０１３１】ｐ−遺伝子：プライマーｐＲＴｌ（5'−ＣＡＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＧＴＡＣＧＧＧＴＡＧＡＡ −３'；ｎｔ１７９４〜１８１４）を逆転写に使
用した。プライマーｐＲＴｌおよびｐ２（５'−ＧＣＡＧＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧ
ＣＣＡＴＴＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＧＣ−３'；ｎｔ３０５３〜３０７１）を
、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼを用いるＰＣＲ法に使用した。次のＰＣＲプロフ
ィール（３０サイクル）を使用した：９５℃で３０秒間、６５℃で４０秒間およ
び７２℃で６０秒間。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、ｐ
ＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ部位とＸｂａＩ部位との間にクローニングした。Ｐタ
ンパク質の発現は、モノクローナル抗体６８８（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９８３）
を用いて、ＩＰＭＡで確認した。

【０１３２】Ｍ−遺伝子：プライマー３ＵＩＴ（５'−ＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＡＴＣＣ
ＧＴＧＡＧＴＴＡＣＧＡ−３'；ｎｔ１〜２７）を逆転写に使用した。プライ
マーＮＤＶ５Ｍ（５'−ＧＧＧＴＧＣＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＣＣＣＣＡＡＴＴＧ
ＴＧＣＣＡＡ−３'；ｎｔ３２６８〜３２８８）およびＮＤＶ３Ｍ（５'−ＴＣ
ＴＣＣＣＣＧＧＧＧＣＡＧＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＧＧＡＴ−３'；ｎｔ
４３６８〜４３８９）を、ＥｘｐａｎｄＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙキット
を用いるＰＣＲ法に使用した。このＰＣＲ法は、９５℃で１５秒間、５５℃で３
０秒間および６８℃で２分間のサイクル５回、ついで６８℃での伸長反応時間を
サイクルごとに２０秒ずつ長くしたサイクル１５回からなっていた。得られたＤ
ＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑端を作り、ＮｈｅＩで消化
し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＮｈｅＩ部位とＳｍａＩ部位との間にクローニングした。
Ｍタンパク質の発現は、モノクローナル抗体４２４（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９８
３）を用いてＩＰＭＡで確認した。

【０１３３】Ｆ−遺伝子：プライマー３ＵＩＴ（上記参照）を逆転写に使用した。プライマ
ーＮＤＶ５Ｆ（５'−ＡＣＧＧＧＣＴＡＧＣＧＡＴＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＧＧＴ
ＴＧＧ―３'；ｎｔ４５０８〜４５２６）およびＮＤＶ３Ｆ（５'−ＡＣＴＡＣ
ＣＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＴＣＧＴＴＣＣＴＣＡＴ−３'；ｎｔ６２１２〜６２
３１）を、Ｍ−遺伝子について上に記載した条件を用いて、ＥｘｐａｎｄＨｉ
ｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙキットを用いるＰＣＲ法に使用した。得られたＤＮＡ断
片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作り、ＮｈｅＩで消化し、ｐ
ＣＩｎｅｏ中、ＮｈｅＩ部位とＳｍａＩ部位との間にクローニングした。Ｆタン
パク質の発現は、モノクローナル抗体８Ｅ１２Ａ８Ｃ３（ＩＤ−ＤＬＯ、哺乳動
物ウイルス学の部門）を用いて、ＩＰＭＡで確認した。

【０１３４】ＨＮ−遺伝子：プライマー３ＵＩＴを逆転写に使用した。プライマーＮＤＶ５
ＨＮ（５'−ＧＴＡＧＧＣＴＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＴ
−３'；ｎｔ６３３５〜６３５４）およびＮＤＶ３ＨＮ（５'−ＣＧＡＧＣＣＣ
ＧＧＧＣＣＧＧＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＧＡＴＴＣＴＴＧ−３'；ｎｔ８２０５
〜８２２７）を、Ｍ−遺伝子について上に記載した条件を用いて、Ｅｘｐａｎｄ
ＨｉｇｈＦｉｄｅｌｉｔｙキットを用いるＰＣＲ法に使用した。得られたＤ
ＮＡ断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を作り、ＸｍａＩによる
消化の後、ｐＣＩｎｅｏ中、平滑にした（ＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼに
よる）ＮｈｅＩ部位とＸｍａＩ部位との間にクローニングした。ＨＮ−タンパク
質の発現は、モノクローナル抗体８６（Ｒｕｓｓｅｌｌら、１９８３）を用いて
ＩＰＭＡで確認した。

【０１３５】Ｌ−遺伝子：ＳａｃIIおよびＳａｌＩで消化することによって、ｃＤＮＡクロ
ーンｐＧＥＭ−Ｌ７ａ（図４Ａ）からＬ−遺伝子を回収した。ＳａｌＩでの消化
の前に、ＳａｃII部位をＴ４ＤＮＡポリメラーゼの処理によって平滑にした。得
られた断片は、ｐＣＩｎｅｏ中、平滑にした（ＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラー
ゼによる）ＮｈｅＩ部位とＳａｌＩ部位の間にクローニングした。Ｌ−遺伝子の
Ｔ７プロモーターとＡＴＧ開始コドンの間にある５'非翻訳領域には、Ｌタンパ
ク質の正しい発現を阻害するかもしれない２個のフレーム外ＡＴＧコドンが含ま
れていた。したがって、第一ＡＴＧを欠き、第二ＡＴＧがＰＣＲ突然変異誘発に
よってＡＡＧに変化した新しいプラスミドを、下記のように、構築した。プライ
マー５ＬＥ（Ｅ）（５'−ＣＡＡＴＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＣＡＧＣ
ＴＣＡＡＧＧＴＡＡＡＴＡＡＴＡＣＧＧＧ−３'；ｎｔ８３３２〜８３７４）
および３ＬＥ（Ｂ）（５'−ＧＴＧＡＡＴＣＴＡＧＡＡＴＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧ
ＴＡＣＧＡＡＴＧＣ−３'；ｎｔ８８４７〜８８７０）を、プラスミドｐＧＥ
Ｍ−Ｌ７ａ（図４）を用いるＰＣＲ反応に使用した。本ＰＣＲ法は、ＰｗｏＤ
ＮＡポリメラーゼを用いて行い、９４℃で３０秒間、６０℃で４５秒間および７
２℃で６０秒間のサイクル３０回からなっていた。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏ
ＲＩとＸｂａＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ部位とＸｂａＩ部位との
間にクローニングして、プラスミドｐＣＩｎｅｏＬ（Ｎ）を作成した。続いて、
Ｌ−遺伝子（ｎｔ８８５２〜１５０４６）の残りの部分を含んでいるｐＧＥＭ
−Ｌ７ａから得たＢｓｉＷＩ−ＳａｌＩ断片をｐＣＩｎｅｏＬ（Ｎ）中、Ｂｓｉ
ＷＩ部位とＳａｌＩ部位の間にクローニングし、プラスミドｐＣＩｎｅｏＬ（ｃ
）を作成した。Ｌタンパク質に対する抗体は入手不能なので、Ｌタンパク質の発
現は、免疫化学によっては確認できなかった。

【０１３６】Ｆ−遺伝子への遺伝的標識の導入クローニングした全鎖長ｃＤＮＡから感染性ウイルスを産生させうることを明
白に示すために、ＰＣＲ突然変異誘発によってＦ遺伝子に遺伝的タグを導入した
。この目的のために、２個の重複ＰＣＲ断片を用いてＦ遺伝子をクローニングし
た。第一ＰＣＲ断片は、プライマー類ＮＤＶ５Ｆ（上記参照）およびプライマー
Ｆ５Ｒ（５'−ＡＡＡＧＣＧＣＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧ
ＴＡＧＴＣＡＣ−３'；ｎｔ４８５９〜４８９４）を使用することによって生
成した。太字で示した残基は、Ｆ１とＦ２との間のタンパク質分解的切断部位の
アミノ酸配列を、ＮＤＶＬａＳｏｔａ株（ＧＧＲＱＧＲ｜Ｌ）の配列から毒性
のあるＮＤＶ株（ＧＲＲＱＲＲ｜Ｆ）のための共通切断部位のそれに変えるため
に、プライマーに導入した変換部分である。第二ＰＣＲ断片は、プライマーＦ３
Ｆ（５'−ＧＧＡＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＧＣＧＣＴＴＴＡＴＡＧＧＣＧＣＣＡＴ
ＴＡＴＴＧＧ−３'；ｎｔ４８７５〜４９１１）およびＩＶ０９（５'−ＣＴＣ
ＴＧＴＣＧＡＣＡＣＡＧＡＣＴＡＣＣＡＧＡＡＣＴＴＴＣＡＣ−３'；ｎｔ６
２４６〜６２６６）を使用することによって産生した。ＰＣＲ法は、ＰｗｏＤ
ＮＡポリメラーゼで行い、９４℃で１５秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で
２分間のサイクル２５回からなっていた。２個の重複ＰＣＲ断片（重複は、プラ
イマーの塩基配列においてイタリックで示す）は、プライマーＮＤＶ５ＦとＩＶ
０９を用い、かつ同一のＰＣＲ条件を用いる第二ＰＣＲ法で、結合させた。得ら
れた断片（Ｆ遺伝子の全ＯＲＦを含み、ビルレント共通切断部位をコードしてい
る）をＮｈｅＩとＳａｌＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＮｈｅＩ部位とＳａｌＩ
部位との間にクローニングして、ｐＣＩｎｅｏＦ^wtを産生した。ｐＣＩｎｅｏＦ ^wt から得たＳｔｕＩ−ＮｏｔＩ断片（ｎｔ４６４６〜４９５２）を使用して、
ｐ５３５−ＤＩ中、ＣｌａＩ部位とＳｃａＩ部位との間にｐＧＥＭ−Ｂから得た
ＣｌａＩ−ＳｃａＩ断片（ｎｔ３５２１〜１０３１１）を挿入することによっ
て構築したプラスミドｐ５３５−Ｓ中の対応する断片を置換した（図４Ｃ参照）
。得られたプラスミドは、ｐ５３５−Ｓ［Ｆ^wtｃ］と称した。ｐＡＣＹＣ１８４
（上記参照）由来のＣｍ−抵抗性遺伝子を含むＰＣＲ断片を、ＸｂａＩ断片とし
てプラスミドｐ５３５−Ｓ［Ｆ^wtｃ］の特定ＸｂａＩ部位（ＮＤＶの塩基配列の
ポジション６１７２）にクローニングして、プラスミドｐ５３５−Ｓ［Ｆ^wtｃ］
Ｃｍを産生した。続いて、このプラスミドのＣｍで標識を付けたＡｐａＩ−Ｓｐ
ｅＩ断片（ｎｔ２２８５〜８０９４）を用いて、全鎖長ｃＤＮＡクローンｐ
ＮＤＦＬ₊の対応する断片を置換した。最後に、ＸｂａＩでの消化とそれに続く
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いる再環化によって、このプラスミドからＣｍ遺伝子を
除去した。得られたプラスミド（遺伝的に標識を付けた全鎖長ＮＤＶｃＤＮＡ
を含んでいる）をｐＮＤＦＬ＋［Ｆ^wt］と称した。

【０１３７】個々のＮＤＶ遺伝子を発現する、安定に形質転換した細胞系の生成プラスミド類ｐＣＩｎｅｏＮＰ、ｐＣＩｎｅｏＰ、ｐＣＩｎｅｏＭ、ｐＣＩｎ
ｅｏＦ、ｐＣＩｎｅｏＦ^wtおよびｐＣＩｎｅｏＨＮを使用して、個別にこれらの
タンパク質を発現する、安定に形質転換した細胞系を生成させた。トランスフェ
クションの前日に、６ｃｍのペトリ皿にＣＥＲ細胞を播種し、一夜インキュベー
トして６０〜８０％の集密度を得た。この細胞を、基本的にメーカー（Ｇｉｂｃ
ｏＢＲＬ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の指示どおりにＬｉｐｏｆｅ
ｃｔＡｍｉｎｅとＯｐｔｉＭｅｍの１２μｌを用いて、プラスミドＤＮＡ２μｇ
でトランスフェクションした。４８時間後、細胞にトリプシン処理をし、希釈液
を、１０ｃｍペトリ皿中、Ｇ４１８（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ
）５００μｇ/ｍｌを含む培地に播種した。３日毎に、培地を新しい培地に置換
したが、その際Ｇ４１８を１００μｇ／ｍｌずつ増量し、最終濃度は８００μｇ
／ｍｌに至った。Ｇ４１８８００μｇ／ｍｌ含有培地に細胞を入れたままにし
、トランスフェクションの３週間後、個々のコロニーをつまんで、９６穴のペト
リ皿に移した。クローニングした細胞系について、一過性発現試験について上に
記載したのと同じようにＩＰＭＡを用いて、個々のＮＤＶ遺伝子の発現を調べた
。

【０１３８】ＮＰ、Ｐ、ＭまたはＦを構成的に発現する細胞系を確認することができ、単離
した。しかしながら、ＨＮタンパク質を発現する細胞系を産生させることはでき
なかった。恐らく、ＨＮの構成的発現が細胞に対して有毒になるのであろう。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する、安定に形質転換させた細胞系の生成Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、ＥｃｏＲＩとＳａｌＩでの
消化によってプラスミドｐＲＴ７ＮＴ（Ｒｅｎe ｖａｎＧｅｎｎｉｐ、ＩＤ
−ＤＬＯ、哺乳動物ウイルス学の部門）から回収した。得られた断片には、バキ
ュロウイルスｐ１０プロモーターの背後に隠れて存在するＴ７ＲＮＡポリメラ
ーゼ遺伝子が含まれている。このＤＮＡ断片を、プラスミドｐＣＩｎｅｏ０中、
ＥｃｏＲＩ部位とＳａｌＩ部位の間にクローニングして、プラスミドｐＣＩｎｅ
ｏ１０７を産生した。プラスミドｐＣＩｎｅｏ０は、Ｔ７プロモーターを欠いて
いるが、ＮｈｅＩでの切断、続いてのＳｃａＩによる部分切断、付着末端へのＫ
ｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼの導入、ならびにＴ４ＤＮＡリガーゼによ
る再環化によってｐＣＩｎｅｏ１０７から誘導した。ＥｃｏＲＩとＰａｃＩによ
る消化、続いての平滑末端を作成するためのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理、お
よび再環化によって、ｐＣＩｎｅｏ１０７からバキュロウイルスの塩基配列を除
去した。得られたプラスミドをｐＣＩｎｅｏ００７と称した。Ｔ７ＲＮＡポリ
メラーゼの発現は、細胞をｐＣＩｎｅｏ００７とｐＰＲｈ０１でコトランスフェ
クションすることによって確認した。後者のプラスミドには、Ｔ７プロモーター
の背後にクローニングされ、内在性リボソーム侵入部位（Ｒｅｎe ｖａｎＧ
ｅｎｎｉｐ、私信）を含む古典的なブタコレラウイルスのＥ２が含まれている。
Ｅ２タンパク質の発現は、モノクローナル抗体Ｖ４（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔら、１
９８６）を用いるＩＰＭＡで測定した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する安
定に形質変換したＣＥＲ細胞を、１０ｃｍのペトリ皿を使用したことおよびｐＣ
Ｉｎｅｏ００７ＤＮＡ５μｇとＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ２５μｌで細
胞をトランスフェクションしたことを除いて上記と同じように、産生し、単離し
た。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現について個々の細胞系を調べるために、細
胞を、プラスミドｐＰＲｈ０１でトランスフェクションし、Ｅ２の発現（Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼに依存する）を、モノクローナル抗体Ｖ４を用いてＩＰＭＡ
で測定した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現した数個の細胞系を同定した。１
細胞系（ＣＥＲ−Ｃ９と称する）をその後の実験に使用した。

【０１３９】ＨＮ遺伝子およびハイブリッド−ＨＮ遺伝子のクローニングおよび発現上記したように、プライマー３ＵＩＴを使用して、ＮＤＶの一本鎖ｃＤＮＡな
らびにトリパラミクソウイルスの血清型２および４（ＡＰＭＶ２およびＡＰＭＶ
４）を作製した。その後のＰＣＲ反応はすべて、９４℃で１５秒間、５５℃で３
０秒間および７２℃で２分間のサイクル２５回の条件を用いて行った。

【０１４０】ＡＰＭＶ２のＨＮ遺伝子の全コード領域は、プライマーＩＶ０３（５'−ＧＧ
ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣＡＴＴＣＡＡＴＧＡＡＧＧＧＴＣＴＡＣ−３'）および
ＩＶ０５（５'−ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＣＴＴＡＡＡＣＣＡＧＧＣＴＴＣＧＣ
ＡＡＴＧ−３'）（塩基配列は、ＡＰＭＶ２のＨＮ遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎ
ｋ登録番号Ｄ１４０３０）から引き出した）を用いるＰＣＲ法によって回収した
。ＡＰＭＶ４のＨＮ遺伝子の全コード領域は、プライマーＩＶ０６（５'−ＧＧ
ＧＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＴＡＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＡＧＣ−３'）および
ＩＶ０８（５'−ＡＴＴＧＣＣＣＧＧＧＧＧＧＴＡＡＣＴＡＡＴＣＡＧＧＡＴＣ
ＴＣＡＧ−３'）（塩基配列は、ＡＰＭＶ４のＨＮ遺伝子の配列（ＧｅｎＢａｎ
ｋ登録番号Ｄ１４０３１）から引き出した）を用いて、ＰＣＲ法によって回収し
た。得られたＰＣＲ断片を（直ちに、またはｐＧＥＭ−Ｔでのサブクローニング
の後に）ＥｃｏＲＩとＸｍａＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ部位とＸ
ｍａＩ部位の間にクローニングした。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＣＩ
ｎｅｏＨＮ２およびｐＣＩｎｅｏＨＮ４と称した。

【０１４１】ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのＨＮ遺伝子とＡＰＭＶ２および４のＨＮ遺伝子との間
のハイブリッドを、次のように重複ＰＣＲ法によって構築した。ＮＤＶ株ＬａＳ
ｏｔａのＨＮ遺伝子のＮ末端部（ａａ１−１４１）を、プライマーＩＶ０１Ｂ
（５'−ＧＴＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＴ−３'
；ｎｔ６３２５〜６３５４）およびＩＶ１０（５'−ＡＡＴＧＡＧＴＴＣＴＴ
ＴＧＣＣＴＡＴＣＣＣＣＣＣ−３'；ｎｔ６８１１〜６８３４）を用いて、Ｐ
ｗｏＤＮＡポリメラーゼで増幅した。ＡＰＭＶ２のＨＮ遺伝子のＣ末端部（ａ
ａ１４２〜５８０）を、プライマーＩＶ１１Ｂ（５'−ＧＧＧＧＧＧＡＴＡＧ
ＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣ−
３'）およびＩＶ０５を用いてＰｗｏＤＮＡポリメラーゼで増幅した。得られ
たＰＣＲ断片を、重複ＰＣＲ（重複はイタリックで表示）においてプライマーＩ
Ｖ０１ＢおよびＩＶ０５を用いることによって、かつＥｘｐａｎｄＨｉｇｈ
Ｆｉｄｅｌｉｔｙ酵素ミックスを用いることによって連結させた。得られたＰＣ
Ｒ断片を（直ちに、またはｐＧＥＭ−Ｔにおけるサブクローニングの後）、Ｅｃ
ｏＲＩとＸｍａＩで消化させ、ｐＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ部位とＸｍａＩ部位
との間にクローニングした。得られたプラスミドには、ＮＤＶのａａ１〜１４
１およびＡＰＭＶ２のａａ１４２〜５８０からなるハイブリッドＨＮ遺伝子が
含まれており、これをｐＣＩｎｅｏＨＮ１／２¹⁴¹と称した。

【０１４２】ＡＰＭＶ４のＨＮ遺伝子のＣ末端部（ａａ１４３〜５６９）を、プライマー
ＩＶ１４Ｂ（５'−ＧＧＧＧＧＧＡＴＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＴＧＴＡ
ＧＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＡＡＡＴＴＴＣＣ−３'）およびＩ
Ｖ０８を用いることによって増幅した。この断片は、プライマーＩＶ０１Ｂおよ
びＩＶ０８を用いて、重複ＰＣＲにおいてＮＤＶのＨＮ遺伝子のＮ末端部（上記
参照）と連結させた。得られたＰＣＲ断片を、（直ちに、またはｐＧＥＭ−Ｔに
おいてサブクローニングした後）ＥｃｏＲＩとＸｍａＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ
中、ＥｃｏＲＩ部位とＸｍａＩ部位との間にクローニングした。得られたプラス
ミドは、ＮＤＶのａａ１〜１４１とＡＰＭＶ４のａａ１４３〜５６９とから
なっているハイブリッドＨＮ遺伝子を含んでおり、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４¹⁴¹
と称した。

【０１４３】上記の構築に類似して、ＮＤＶのａａ１〜１４３とＡＰＭＶ２のａａ１４
４〜５８０、またはＮＤＶのａａ１〜１４３とＡＰＭＶ４のａａ１４５〜５
６９からハイブリッドＨＮ遺伝子を構築した。これらの構築のために、下記のプ
ライマーのペアを使用してＰＣＲ断片を得た；ＮＤＶａａ１〜１４３には、
プライマーＩＶ０１ＢとＩＶ１３（５'−ＡＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＴＴＣＴＴ
ＴＧＣＣＴＡＴＣ−３'；ｎｔ６８１６〜６８４０）；ＡＰＭＶ２ａａ１
４４〜５８０には、プライマーＩＶ１４Ｂ（５'−ＧＧＧＧＧＧＡＴＡＧＧＣＡ
ＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＡＡＡＴＴＴＣＣ −３'）とＩＶ０５；ＡＰＭＶ４ａａ１４５〜５６９には、プ
ライマーＩＶ１５Ｂ（５'−ＧＧＧＧＧＧＡＴＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴ
ＴＧＴＡＧＡＴＣＡＡＡＣＡＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＣＡＧＣＡＧ−３'）とＩＶ
０８。これらのＰＣＲ断片を、（直ちに、またはｐＧＥＭ−Ｔにおいてサブクロ
ーニングした後）ＥｃｏＲＩとＸｍａＩで消化し、ｐＣＩｎｅｏ中、ＥｃｏＲＩ
部位とＸｍａＩ部位との間にクローニングした。得られたプラスミドは、それぞ
れ、ｐＣＩｎｅｏ１／２¹⁴³およびｐＣＩｎｅｏ１／４¹⁴³と称した。ＨＮタンパ
ク質の発現を調べるために、ＣＥＲ細胞またはＱＭ５細胞をＦＰＶ−Ｔ７に感染
多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）１で１時間感染させ、プラスミド類ｐＣＩｎｅｏＨＮ、
ｐＣＩｎｅｏＨＮ２、ｐＣＩｎｅｏＨＮ４、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／２¹⁴¹、ｐＣ
ＩｎｅｏＨＮ１／２¹⁴³、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４¹⁴³およびｐＣＩｎｅｏＨＮ１
／４¹⁴³、そしてトランスフェクションの２４時間後、その単層を室温で４５分
間、ニワトリ赤血球の１％ＰＢＳ懸濁液で覆った。その後、その単層をＰＢＳで
注意深く３回洗浄し、トランスフェクションした細胞への赤血球の付着を顕微鏡
で調べた。ＨＮおよびＦタンパク質の共発現後の細胞融合の誘導を調べるために
、ＣＥＲ細胞またはＱＭ５細胞を、ｐＣＩｎｅｏＦ^wtと、ｐＣＩｎｅｏ−ＨＮ１
、ｐＣＩｎｅｏＨＮ２、ｐＣＩｎｅｏＨＮ４、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／２¹⁴¹、ｐ
ＣＩｎｅｏＨＮ１／２¹⁴³、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４¹⁴¹またはｐＣＩｎｅｏＨＮ
１／４¹⁴³のいずれかとコトランスフェクションした。２〜３日間インキュベー
トした後、その単層をＰＢＳで洗浄し、Ｇｉｅｍｓａ溶液（水で３０倍希釈）で
１５分間染色し、顕微鏡で調べた。

【０１４４】全鎖長ゲノムＮＤＶｃＤＮＡへのハイブリッド−ＨＮ遺伝子のクローニングオリゴヌクレオチドＨＮ１２ａ（５'−ＧＧＣＣＧＣＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＧ
ＴＴＡＡＣＧＡＣＴＴＡ−３'）とＨＮ１２ｂ（５'−ＣＴＡＧＴＡＡＧＴＣＧＴ
ＴＡＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＴＧＣ−３'）とを用いて、一つの合成リンカー（
ＨＮ１２と表示）をｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＮｏｔＩ部位とＳｐｅＩ
部位との間に挿入した。オリゴヌクレオチドＨＮ１４ａ（５'−ＧＧＣＣＧＣＡ
ＴＡＴＴＣＴＡＧＡＧＴＴＡＡＣＧＡ−３'）とＨＮ１４ｂ（５'−ＣＴＡＧＴＣ
ＧＴＴＡＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＡＴＧＣ−３'）とを用いて、一つの合成リンカ
ー（ＨＮ１４）をｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＮｏｔＩ部位とＳｐｅＩ部
位との間に挿入した。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＧＥＭ−ＨＮ１２お
よびｐＧＥＭ−ＨＮ１４と称した。これらのプラスミドをＮｏｔＩとＸｂａＩで
消化し、プラスミドｐ５３５−Ｓ［Ｆ^wtｃ］Ｃｍから得たＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ断
片（ｎｔ３３９０〜７４８８）をクローニングするために使用した。得られた
プラスミドは、それぞれ、ｐＧＥＭ−ＨＮ１／２ＮＳおよびｐＧＥＭ−ＨＮ１／
４ＮＳと称した。これらのプラスミドのＨＮ遺伝子を、それぞれ、プラスミドｐ
ＣＩｎｅｏＨＮ１／２¹⁴³およびｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４¹⁴³から得たハイブリッ
ドＨＮ遺伝子で置換した（「ＨＮ遺伝子およびハイブリッド−ＨＮ遺伝子のクロ
ーニングおよび発現」のセクション参照）。この目的のために、ｐＣＩｎｅｏＨ
Ｎ１／２¹⁴³およびｐＣＩｎｅｏＨＮ１／４¹⁴³をＮｈｅＩとＳｍａＩで消化し、
プラスミドｐＧＥＭ−ＨＮ１／２ＮＳおよびｐＧＥＭ−ＨＮ１／４ＮＳのＮｈｅ
Ｉ部位とＨｐａＩ部位との間にクローニングして、それぞれ、ｐＧＥＭ＋ＨＮ１
２およびｐＧＥＭ＋ＨＮ１４を得た。

【０１４５】後者のプラスミドを用いて、ＮＤＶの全鎖長ゲノムｃＤＮＡクローンにハイブ
リッドＨＮ遺伝子を導入した。この目的のために、プラスミドｐＧＥＭ＋ＨＮ１
２およびｐＧＥＭ＋ＨＮ１４を、ＮｏｔＩとＳｐｅＩで消化し、ＨＮ１２または
ＨＮ１４遺伝子のいずれかを含む断片を用いて、ｐＮＤＦＬ＋の対応する断片を
置換し、それぞれ、ｐＮＤＦＬ＋ＨＮ１／２¹⁴³ＣｍおよびｐＮＤＦＬ＋ＨＮ１
／４¹⁴³Ｃｍを産生した。これらのプラスミドから、ＸｂａＩでの消化とそれに
続くＴ４ＤＮＡリガーゼを用いる再環化によってＣｍ遺伝子を取り除いた。「
６の法則」を満たすために、自己相補性オリゴヌクレオチドを用いて、これらの
プラスミドの特定ＳｐｅＩ部位にリンカーを導入した。リンカーＨ２（５'−Ｃ
ＴＡＧＣＧＡＧＣＧＣＴＣＧ−３'）をプラスミドｐＮＤＦＬ＋ＨＮ１／２¹⁴³に
、リンカーＨ３（５'−ＣＴＡＧＣＧＡＧＣＷＧＣＴＣＧ−３）をプラスミドｐ
ＮＤＦＬ＋ＨＮ１／４¹⁴³に挿入して、それぞれ、プラスミドｐＮＤＦＬ＋ＨＮ
１／２¹⁴³（Ｈ２）およびｐＮＤＦＬ＋ＨＮ１／４¹⁴³（Ｈ３）を産生した。

【０１４６】ＮＤＶＬａＳｏｔａのＨＮタンパク質にある特異的エピトープの削除ＭＡｂ４Ｄ６によって認識される（Ｌｏｎｇら、１９８６；Ｍｅｕｌｅｍａ
ｎｓら、１９８６）、ＮＤＶＬａＳｏｔａのＨＮタンパク質中の特異的エピト
ープ、すなわちアミノ酸３４６〜３５４（ＰＤＥＱＤＹＱＩＲ）を、この配列を
ＡＰＭＶ−２（ＮＲＴＤＩＱＱＴＩ）またはＡＰＭＶ−４（ＰＤＰＬＱＤＱＩＬ
）のいずれかのＨＮタンパク質の相当する配列に置換することによって、削除し
た。この目的のために、プラスミドｐＣＩｎｅｏＨＮ（「個々のＮＤＶ遺伝子の
クローニングおよび発現」のセクション参照）をテンプレートとして用いて、重
複ＰＣＲ断片を作製した。ＡＰＭＶ−２配列のために、プライマー類ＩＶ０１（
５'−ＧＴＡＧＡＣＧＣＧＴＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＣＴＣＡＡＴ−３'）
およびプライマー３ＨＮ２（５'−ＧＡＴＡＧＴＴＴＧＣＴＧＴＡＴＡＴＣＡＧ
ＴＣＣＧＡＴＴＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＴＴＧＴＡＴＣＧＣＴＴＧＴＡＴＡＴＣＡ
Ｃ−３'）を用いて第一ＰＣＲ断片を作製した。第二ＰＣＲ断片は、プライマー
５ＨＮ２（５'−ＡＡＴＣＧＧＡＣＴＧＡＴＡＴＡＣＡＧＣＡＡＡＣＴＡＴＣＡ
ＴＧＧＣＣＡＡＧＴＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣ−３'）および
ＮＤＶ３−ＨＮ（５'−ＣＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＣＧＧＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＧ
ＡＴＴＣＴＴＧ−３'）を用いて作製した。得られた断片を結合させて、プライ
マー類ＩＶ０１Ｂ（５'−ＧＴＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣ
ＣＴＣＡＡＴ−３'）およびプライマーＮＤＶ３−ＨＮを用いる第三ＰＣＲ法の
ためのテンプレートとして使用した。ＡＰＭＶ−４配列のために、第一ＰＣＲ断
片を、プライマー類ＩＶ０１およびプライマー３ＨＮ４（５'−ＴＡＡＧＡＴＣ
ＴＧＡＴＣＴＴＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＡＧＧＧＣＡＴＧＴＧＴＣＡＴＴＧＴＡＴ
ＣＧＣＴＴＧＴＡＴＡＴＣＡＣ−３'）を用いて作製した。第二ＰＣＲ断片は、
プライマー５ＨＮ４（５'−ＣＣＴＧＡＣＣＧＣＴＧＣＡＡＧＡＴＣＡＧＡＴＣ
ＴＴＡＡＴＧＧＣＣＡＡＧＴＣＴＴＣＧＴＡＴＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＣＣ−３'
）およびＮＤＶ３−ＨＮを用いることによって作製した。得られた断片を結合し
て、プライマーＩＶ０１ＢおよびＮＤＶ３−ＨＮを用いる第三ＰＣＲ法のための
テンプレートとして使用した。プライマー３ＨＮ２／５ＨＮ２および３ＨＮ４／
５ＨＮ４は、一部相補的であり、それぞれ、ＨＮ２配列（ＮＲＴＤＩＱＱＴＩ）
およびＨＮ４（ＰＤＰＬＱＤＱＩＬ）のための遺伝子コードを含んでいる。ＰＣ
Ｒ法は、ＥｘｐａｎｄＬｏｎｇＴｅｍｐｌａｔｅＰＣＲキット（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を用いて行った。このＰＣＲ法は、９４℃で
１０秒間、５８℃で３０秒間および６８℃で２分間のサイクル３０回、続いて６
８℃で４分間のサイクル１回からなっていた。ＰＣＲ断片は、ＥｃｏＮＩとＢｓ
ｕ３６Ｉで消化し、ｐＣＩｎｅｏＨＮのＥｃｏＮＩ部位とＢｓｕ３６Ｉ部位との
間にクローニングした。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＣＩｎｅｏＨＮ１
（ＨＮ２ｅ）およびｐＣＩｎｅｏＨＮ１（ＨＮ４ｅ）と称した。検討した一過性
発現は、修飾したタンパク質が正しく発現されて、ニワトリ赤血球を用いる赤血
球吸着ウイルス試験から判断されるように、細胞表面に輸送されたことを示した
。

【０１４７】さらに、ＮＤＶのＨＮの線状エピトープに対抗するよう向けられており、アミ
ノ酸３４６〜３５４からなる（または、少なくともそれを含む）ＭＡｂ６Ｄ４
は、修飾ＨＮタンパク質とは反応しなかった。

【０１４８】プラスミドｐＣＩｎｅｏＨＮ１（ＨＮ２ｅ）およびｐＣＩｎｅｏＨＮ１（ＨＮ
４ｅ）をＮａｒＩとＳｐｅＩで消化し、修飾ＨＮ遺伝子を含む断片を、それぞれ
、ｐＧＥＭ−ＨＮ１／２ＮＳおよびｐＧＥＭ−ＨＮ１／４ＮＳのＮａｒＩ部位と
ＳｐｅＩ部位との間にクローニングした。得られたプラスミド（ｐＧＥＭ−ＨＮ
１（ＨＮ２ｅ）およびｐＧＥＭ−ＨＮ１（ＨＮ４ｅ）と表示）をＮｏｔＩとＳｐ
ｅＩで消化し、ｐＭＤＦＬ＋中のＮｏｔＩ−ＳｐｅＩ断片と置換するのに使用し
た。得られたプラスミドは、それぞれ、ｐＮＤＦＬ−ＨＮ（ＨＮ２ｅ）Ｃｍおよ
びｐＮＤＦＬ−ＨＮ（ＨＮ４ｅ）Ｃｍと称した。これらのプラスミドから、Ｘｂ
ａＩで消化させて再連結することによってＣｍ遺伝子を取り除いた。得られたプ
ラスミドは、それぞれ、ｐＮＤＦＬ−ＨＮ（ＨＮ２ｅ）およびｐＮＤＦＬ−ＨＮ
（ＨＮ４ｅ）と称した。

【０１４９】結果ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのゲノムの３'および５'末端部の塩基配列ＮＤＶゲノムの推定３'末端の配列は、ここで用いたＮＤ株（ＬａＳｏｔａ）
とは異なる株（Ｄ２６）ではあるが、すでに公表されている（Ｉｓｈｉｄａら、
１９８６）。Ｙｕｓｏｆｆら（１９８７）は、Ｌ遺伝子およびＮＤＶ株Ｂｅａｕ
ｄｅｔｔｅＣのＬ遺伝子の背後にある比較的大きな非コード領域の配列を公表
した。しかしながら、本出願に示すように、この配列には、感染性模写ＮＤＶを
生成することを不可能にするウイルスゲノムの５'末端全体が含まれていなかっ
た。マイナス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムの３'および５'末端部は、複製および転
写の基本的な機能を果たす（ＬａｍｂおよびＫｏｌａｋｏｆｓｋｙ、１９９６）
。それゆえ、逆遺伝学による感染性ウイルスの作製（Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ、１
９９６）に使用することができる、全鎖長ＮＤＶｃＤＮＡを作製するためには
、ウイルスゲノムの正確な３'および５'末端を含めることが絶対的に必須である
。したがって、われわれは、３'および５'ＲＡＣＥ法（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅
法）を利用して、ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのゲノムＲＮＡの３'および５'両末端の
正確な塩基配列を決定した。５'末端は、一本鎖アンカープライマー（ＡＬＧ３
）を、ゲノムＲＮＡの５'末端の逆転写によって産生した一本鎖ｃＤＮＡに連結
した後、ＰＣＲ法によって回収した。アンカープライマーに相補的なプライマー
（ＡＬＧ４）およびＮＤＶ特異的プライマーを用いることによって、５'末端を
含んだＰＣＲ生成物を産生した。

【０１５０】ＮＤＶの３'末端をクローニングするために、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを用いて
、一本鎖アンカープライマーＡＬＧ３をウイルスＲＮＡの３'末端に連結し、プ
ライマーＡＬＧ４およびＮＤＶ特異的プライマーを用いてＰＣＲにより増幅させ
た（方法Ｉ）。別法としては、ＮＤＶＲＮＡの３'および５'末端を、Ｔ４Ｒ
ＮＡリガーゼを用いて互いに連結し、得られたコンカテナン（ｃｏｎｃａｔｅｎ
ａｔｅｄ）ＲＮＡを、連結点をそばに置いたＮＤＶ特異的プライマーを用いるＲ
Ｔ−ＰＣＲ法に使用した（方法II）。３'および５'ＲＡＣＥ生成物は、Ｔベクタ
ーｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII−ＴＳＫ（ＩｃｈｉｈａｒａおよびＫｕｒｏｓａｗ
ａ、１９９３）またはｐＧＥＭ４Ｚの中にクローニングし、数個の独立したクロ
ーンを単離し、塩基配列を決定した。結果は、表２にまとめてある。

【０１５１】３'および５'末端の直接の比較を可能にするために、塩基配列はＤＮＡの形で
示し、ゲノム鎖の３'末端は、アンチゲノム鎖の５'末端として表示する。ゲノム
ＲＮＡのレベルでは、３'末端は、３'−ＵＧＧＵＵＵＧＵＣＵＣＵＵＡＧと読め
る。一方、５'末端の配列は、ＵＵＵＡＧＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡ−５'と読める。
この３'末端の配列は、公表されたＮＶＤ株Ｄ２６の３'末端配列（Ｉｓｈｉｄａ
ら、１９８６）にほぼ類似している。しかしながら、５'末端の配列は、ＮＤＶ
株ＬａＳｏｔａが、ＮＤＶ株ＢｅａｕｄｅｔｔｅＣのＬ遺伝子の公表された配列
（Ｙｕｓｏｆｆら、１９８７）と比較すると、６４個の塩基が余計に存在するこ
とを示した（図６）。

【０１５２】ヘルパーウイルスによるＮＤＶミニゲノムの複製ＮＤＶの３'および５'末端が複製および転写に機能しているかどうかを決定す
るために、ＮＤＶの３'末端（ｎｔ１〜１１９）、分泌アルカリホスファター
ゼ（ＳＥＡＰ）をコードしているレポーター遺伝子およびＮＤＶの５'末端（ｎ
ｔ１４９７３〜１５１８６）からなったミニゲノムを構築した（図２）。

【０１５３】これらのミニゲノムを、転写ベクターｐＯＬＴＶ５中で両方向にクローニング
して、それぞれ、プラスミドｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３を産生し
た（構築の詳細は「材料および方法」参照）。プラスミドｐＯＬＴＶ５（図１）
には、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが含まれ、その結果、特異Ｓｔｕ
ＩおよびＳｍａＩ制限部位、Ｄ型肝炎ウイルス由来の自己触媒リボザイムおよび
バクテリオファージＴ７由来の転写終結シグナルが含まれている（Ｐａｔｔｎａ
ｉｋら、１９９２）。プラスミドｐＯＬＴＶ５３５のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ
を用いるインビボまたはインビトロの転写により、アンチゲノムＲＮＡ（または
［＋］−ＲＮＡ）が生成し、一方、プラスミドｐＯＬＴＶ５５３の転写では、ゲ
ノムＲＮＡ（または［−］−ＲＮＡ）が生成する（図５）。

【０１５４】プラスミドｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３によって産生したミニゲ
ノムＲＮＡが、ヘルパーウイルスとしてＮＤＶを用いることによって複製されか
つ発現されるかどうかを調べるために、構成的に（ＣＥＲ−Ｃ９細胞、「材料お
よび方法」参照）、またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する鶏痘組換え体ｆ
ｐＥＦＬＴ７ｐｏｌ（Ｂｒｉｔｔｏｎら、１９９５；以後ＦＰＶ−Ｔ７と称す）
で感染させた後にＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現したＣＥＲ細胞を使用した。
ＣＥＲ−Ｃ９細胞およびＦＰＶ−Ｔ７感染ＣＥＲ細胞を、ミニゲノムプラスミド
ｐＯＬＴＶ５３５およびｐＯＬＴＶ５５３でトランスフェクションし、３７℃で
３時間インキュベートした後、細胞を、１時間ＮＤＶに感染させるか、または未
感染のままに放置した。トランスフェクションの約２４時間後、培地から細胞を
採取して、ＳＥＡＰ活性を検定した。結果は、ｐＯＬＴＶ５３５でトランスフェ
クションしたＦＰＶ−Ｔ７感染細胞においてＳＥＡＰ発現が非常に高いことを示
した。これは驚くべきことではない。何故なら、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによ
る転写により、アンチゲノム［＋］−ＲＮＡが生成し、これが鶏痘酵素によって
キャップを付けられ、宿主細胞によって効果的に翻訳されるからである。ｐＯＬ
ＴＶ５５３でトランスフェクションした細胞において、Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼによる転写によって、ゲノム［−］−ＲＮＡが生成するが、これがＳＥＡＰタ
ンパク質に翻訳されるためには、ヘルパーウイルスによって［＋］−ＲＮＡに変
換されねばならない（図５参照）。両方の場合に、非感染性細胞と比較して、Ｎ
ＤＶ感染細胞におけるＳＥＡＰ発現の増加は認められなかった。反対に、ＮＤＶ
感染細胞のＳＥＡＰ発現は、非感染細胞におけるよりも常に約２倍低かった（デ
ータは示さず）。ｐＯＬＴＶ５３５をトランスフェクションした細胞に関しては
、これは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって作り出された転写によるＳＥＡＰ
発現のレベルがすでに非常に高いことで説明できるかもしれない。

【０１５５】しかしながら、ｐＯＬＴＶ５５３でトランスフェクションした細胞において、
ここではＳＥＡＰの効果的な発現がウイルスポリメラーゼ複合体によるアンチゲ
ノム［＋］−ＲＮＡまたはｍＲＮＡへのゲノム［−］−ＲＮＡの転換に依存して
いるが、われわれはＮＤＶ感染後のＳＥＡＰ発現の増加を期待したのであった。

【０１５６】われわれは、このミニゲノムがＮＤＶによって発現され、複製されることがな
かった二つの理由を考慮することができる。第一に、ミニゲノムＲＮＡの大きさ
がいわゆる「６の法則」（ＣａｌａｉｎおよびＲｏｕｘ、１９９３；Ｋｏｌａｋ
ｏｆｓｋｙら、１９９８）に従っていないことである。この法則によれば、パラ
ミクソウイルスゲノムは、その長さが６の倍数のｎｔであるときにのみ、効果的
に複製されるのである。第二に、ミニゲノムＲＮＡの５'末端に存在する２個の
余分のＧ残基が、ウイルスポリメラーゼ複合体による正しい複製および／または
転写を妨害するのかもしれない。ゲノムの複製が「６の法則」に依存しているか
どうかを確認するために、われわれは、サイズで１ｎｔだけ大きくした短い自己
相補オリゴヌクレオチドの１系列を、ミニゲノムプラスミドｐＯＬＴＶ５３５お
よびｐＯＬＴＶ５５３の特異的ＣｌａＩ部位に挿入した（図２）。得られたプラ
スミド（ｐＯＬＴＶ５３５Ｎ０〜Ｎ５およびｐＯＬＴＶ５５３Ｎ０〜Ｎ５）は、
サイズが１〜６ｎｔだけ異なっており、したがってそれらの一つによって、「６
の法則」に合致するミニゲノムＲＮＡが生成するに違いない。これらのプラスミ
ドを用いて、上に記載したように、ＣＥＲ細胞またはＦＰＶ−Ｔ７感染ＣＥＲ−
Ｃ９細胞をトランスフェクションした。その結果、プラスミドｐＯＬＴＶ５３５
Ｎ３およびｐＯＬＴＶ５５３Ｎ３だけがＮＤＶ感染後のＳＥＡＰ活性の上昇を引
き起こした。これらのプラスミドからＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって生成し
たミニゲノムＲＮＡの長さは、計算すると６ｎ＋２であった。ミニゲノムＲＮＡ
の５'末端には２個の余分のＧ残基が存在するので、これらの結果は、ミニゲノ
ムＲＮＡの真正の３'末端と５'末端の間に存在するＲＮＡ配列のサイズだけが「
６の法則」に関係していることを示唆している。このことは、Ｔ７ＲＮＡポリ
メラーゼの転写開始を、ＲＮＡに組み入れた最初のヌクレオチドがＮＤＶの３'
または５'末端のヌクレオチドとなるように変えたミニゲノムプラスミドを構築
することによって確認された（「材料および方法」参照）。これらのプラスミド
のトランスフェクションは、プラスミドｐＯＬＴＶ７３５Ｎ３およびｐＯＬＴＶ
７５３Ｎ３によって生成したミニゲノムＲＮＡだけがヘルパーウイルスによって
複製されることを示した（実験結果は示さず）。これらの発見は、再度、ＮＤＶ
の複製が６の法則に厳密に依存していることを示唆している。さらに、これらの
発見は、ミニゲノムＲＮＡの５'末端にある余分のＧ残基２個は正確な複製を妨
害しないことを示している。他のパラミクソウイルス科由来のミニゲノムプラス
ミド（またはＤＩプラスミド）でも同様の結果が得られた（Ｐａｔｔｎａｉｋら
、１９９２；ＨａｒｔｙおよびＰａｌｅｓｅ、１９９５）。

【０１５７】ヘルパーウイルスによるＮＤＶミニゲノムのパッケージングミニゲノムＲＮＡがＮＤＶヘルパーウイルスでパッケージされるか否かを決定
するために、トランスフェクションした細胞の培地を新しい単層に移し、１時間
の吸着の後、その単層をＰＢＳで３回洗浄し、さらに完全培地でインキュベート
した。２４時間のインキュベーションの後、培地中のＳＥＡＰ活性を測定した。
その結果、ＳＥＡＰ活性はミニゲノムプラスミドｐＯＬＴＶ５５３Ｎ３でトラン
スフェクションした細胞からの培地で処理した細胞にだけ存在することが判った
（表４）。この発見は、ミニゲノムＲＮＡが、ＮＤＶエンベロープにパッケージ
され得ることおよびこれらの粒子が細胞を感染させ得ることを示している。さら
に、これらの結果が示していることは、パッケージングが複製に依存しているこ
とであり、このことは、ウイルス性ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質と複合体を形成
するＲＮＡ分子だけがウイルス様粒子にパッケージされることを示している。

【０１５８】ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質を発現するプラスミドによるＮＤＶミニゲノムの
複製ミニゲノムＲＮＡも基本的なＮＰ、ＰおよびＬタンパク質をコードしているプ
ラスミドによって複製されるかどうかを決定するために、われわれは、ＦＰＶ−
Ｔ７に感染した細胞でコトランスフェクション実験を行った。ミニゲノムプラス
ミドならびに、それぞれ、プラスミドｐＣＩｎｅｏＮＰ、−Ｐおよび−Ｌ（ｃ）
からなるプラスミドの組み合わせで細胞をトランスフェクションした。ネガティ
ブコントロールとして、ｐＣＩｎｅｏＬ（ｃ）（基本的Ｌタンパク質をコードし
ている）を、ベクタープラスミドｐＣＩｎｅｏで置換した。その結果（表５）、
ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質をコードしているプラスミドは事実、ミニゲノムＲ
ＮＡを複製し得ることが判明した。さらにこれらの結果は、ヘルパーウイルスに
よるミニゲノム複製に類似して、ＮＰ、ＰおよびＬタンパク質による複製もまた
、６の法則に依存していることを示している。

【０１５９】ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａの全ゲノムの塩基配列全ＮＤＶゲノムに亘るサブゲノムｃＤＮＡ断片をＲＴ−ＰＣＲ法によって構築
した（図４）。ＰＣＲエラーの数を最小限に保つために、プルーフリーディング
酵素ミックス（ＥｘｐａｎｄＬｏｎｇＴｅｍｐｌａｔｅ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を、限られた回数のＰＣＲサイクル（１５サイクル）
と組み合わせて使用した。ＮＤＶＲＮＡの３'末端に相補的であるプライマー
３ＵＩＴを逆転写のために使用し、そして遺伝子特異的プライマーをＰＣＲ法の
ために使用した。起こり得るＰＣＲエラーを確認するために、３つの独立したＲ
Ｔ反応を行い、サブゲノムｃＤＮＡの３つの独立した組を作製した。サイズにお
いて約４ｋｂから７ｋｂまでばらついているｃＤＮＡをｐＧＥＭ−Ｔ中にクロー
ニングした。公表されたＮＤＶ配列から引き出したプライマーを用いることによ
って、あるいはこの配列決定プロジェクトの間に引き出されたＮＤＶ配列から取
り出したプライマーによって、二組のｃＤＮＡの塩基配列を決定した（表１）。
残っている不確かさは、第３組のｃＤＮＡクローンの相当領域の配列決定をする
ことで解消した。ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのゲノムは、１５１８６ｎｔからなって
いる（図３）が、これは、このゲノムが、今日までに全配列が確立されたパラミ
クソウイルスゲノム全体の中で最小のゲノムであることを示している（Ｋｏｌａ
ｋｏｆｓｋｙ、１９９８）。

【０１６０】転写プラスミドｐＯＬＴＶ５中の全鎖長ＮＤＶｃＤＮＡクローンの構築ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａの全鎖長ｃＤＮＡクローンを構築するために、図４に示
されている戦略に従って、全ＮＤＶゲノムに亘る重複ｃＤＮＡクローンを共有制
限部位で結合した。転写プラスミドｐＯＬＴＶ５から導出されるミニゲノムプラ
スミドｐＯＬＴＶ５３５（上記参照）の中に全ＮＤＶｃＤＮＡを集めた。

【０１６１】図４Ｂに見られるように、全ＮＤＶｃＤＮＡの構築の最終段階は、ｐＧＥＭ
−Ｂから得た約８．８ｋｂＣｌａＩ（ｎｔ３５２１〜１２３５５）断片を、
両側にＣａｌＩ部位を配置しているＮＤＶ配列（すなわち、それぞれ、ｎｔ１
〜３５２１および１２３５５〜１５１８６）を含んだｐ５３５−ＤＩにクローニ
ングすることであった。この段階は、非常に困難であることが判った。われわれ
は、正確なクローンを産生することに何度も失敗した。そこで、ｐＧＥＭ−Ｂの
ＣｌａＩ断片に、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４から得たクロラムフェニコール抵
抗性（Ｃｍ）遺伝子を標識として付けた。Ｃｍ遺伝子を持つＣｌａＩ断片を単離
して、ｐ５３５−ＤＩのＣｌａＩ部位にクローニングし、ＣｍとＫｍ両者に対し
て抵抗する形質変換体を選び出した。形質変換体は、増殖が遅いので、抗生物質
の選択を、Ｃｍは１５μｇ／ｍｌ、Ｋｍは１０μｇ／ｍｌに落とし、インキュベ
ーション温度を３７℃から３２℃に下げた。最後に、このプラスミドからＣｍ遺
伝子を、ＢｓｉＷＩでの消化とそれに続くＴ４ＤＮＡリガーゼを用いる再環化
で除去した。Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換の後、Ｃｍ感受性の両方についてスクリー
ニングすることによって、適切なプラスミドを持つ細胞を、表現型によって同定
した。転写プラスミドｐＯＬＴＶ５のＳｍａＩ部位とＳｔｕＩ部位との間にクロ
ーニングした全鎖長ＮＤＶｃＤＮＡからなる、得られたプラスミドをｐＮＤＦ
Ｌ＋と称した。

【０１６２】全鎖長ｃＤＮＡからの感染性ＮＤＶの産生クローニングしたｃＤＮＡだけから感染性ＮＤＶを産生するために、ミニゲノ
ムプラスミドについて上に記載したように、ｐＣＩｎｅｏＮＰ、−Ｐおよび−Ｌ
（ｃ）を用いるコトランスフェクション実験において、プラスミドｐＮＤＦＬ＋
を使用した。ミニゲノムプラスミドｐＯＬＴＶ５５３Ｎ３を用いること、および
ＳＥＡＰ発現を測定することによってＣＥＲおよびＣＥＦ細胞のトランスフェク
ションを監視した。ネガティブコントロールとしては、ｐＣＩｎｅｏＬ（ｃ）を
ｐＣＩｎｅｏに置換した。コトランスフェクションの後、５％尿膜腔液を含む培
地で３〜６日間細胞をインキュベートした。尿膜腔液の添加は必要である。なぜ
なら、ＣＥＲおよびＣＥＦ細胞は、ＮＤＶ株ＬａＳｏｔａのＦタンパク質を切断
するために必要とされる適当なプロテアーゼを欠いているからである。

【０１６３】Ｆタンパク質の開裂は、感染性ウイルスの細胞から細胞への伝播および産生の
ために絶対必要である。３日間のインキュベーションの後、われわれは、Ｆタン
パク質に対するモノクローナル抗体を用いて固定単層の免疫学的染色を行った。
その結果、抗体で染色した細胞はｐＮＤＦＬ（＋）、ｐＣＩｎｅｏＮＰ、−Ｐお
よびＬ（ｃ）でトランスフェクションした単層にのみ存在することが判明した。
この結果は、ゲノムの複製および発現がこれらの細胞で起こっていることを示し
た。コトランスフェクション実験でｐＣＩｎｅｏＬ（ｃ）をｐＣＩｎｅｏに置換
した場合には、染色した細胞は認められなかった。

【０１６４】感染性ウイルスを回収するために、トランスフェクションしたＣＥＦ単層の上
清を有胚鶏卵の尿膜腔に注入した。４日後、尿膜腔液を採取し、血球凝集反応検
定法で分析し、さらに卵中で経代培養した。その結果、ｐＮＤＦＬ（＋）、ｐＣ
ＩｎｅｏＮＰ、−Ｐおよび−Ｌ（ｃ）の複合体でトランスフェクションした細胞
の上清だけが、血球凝集検定法で陽性の反応を示した。血球凝集反応陽性を示し
た尿膜腔液は、続いて、異なるＮＤＶ株間を区別するのに使用することのできる
モノクローナル抗体７Ｂ７、８Ｃ１１、５Ａ１、７Ｄ４および４Ｄ６（Ｌｏｎｇ
ら、１９８６）を用いて、血球凝集抑制検定法で分析した。この検定法の結果で
は、接種した卵から回収したＮＤＶ株は、元のＬａＳｏｔａ株と同じ活性を示し
た。接種した鶏卵から回収したウイルスは、元のＬａＳｏｔａ株からのものと区
別するためにＮＤＦＬと称した。

【０１６５】完全長ｃＤＮＡからの遺伝的に修飾したＮＤＶの作成共存形質移入（コトランスフェクション）を用いて、クローニングした完全長
のＮＤＶのｃＤＮＡから感染性ウイルスを回収することができることをはっきり
と示すために、プラスミドｐＮＤＦＬ（＋）に遺伝子タグを導入した。この目的
のために、ＰＣＲの変異誘発（詳細は材料と方法の項参照）によって、Ｆｏタン
パク質におけるプロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列を、ＬａＳｏｔａ株の配列
（ＧＧＲＱＧＲ／Ｌ）から毒性ＮＤＶ株のコンセンサス配列（ＧＲＲＱＲＲ／Ｆ
）に変更した。上記共存形質移入システムを用いて、ウイルスを作成するために
、出来上ったプラスミドｐＤＮＦＬ＋［Ｆ^wt］を使用した。共存形質移入したＣ
ＥＦ細胞の培養液を接種した胚含有卵の尿膜腔液から感染性ウイルスを回収した
。ＨＩ試験では、ＬａＳｏｔａ株に特異的な７Ｄ４を含むあらゆるＭＡｂは、新
しく作成したウイルスとの間で元々のＬａＳｏｔａ株との反応性と同一の反応性
を示した。Ｆタンパク質のプロテアーゼ切断部位をコードする領域の核酸配列は
ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。結果は当該核酸配列が、元々のＬａＳｏｔａ配
列を修飾するのに使用された変異プライマーに導入された核酸の正確な変更を含
むことを示した。この知見は、当該ウイルスがプラスミドｐＤＮＦＬ＋［Ｆ^wt］
に由来することを示し、（遺伝的に修飾された）ＮＤＶが、クローニングした完
全長ＮＤＶｃＤＮＡから完全に作成できることを明らかにしている。ＮＤＶのＦ
ｏタンパク質のプロテアーゼ切断部位は毒性に対する鍵となる決定基である。

【０１６６】一般的に、Ｆｏタンパク質のプロテアーゼ切断部位におけるアミノ酸配列は、
様々なＮＤＶ株における毒性にとって鍵となる決定基であると思われている。プ
ロテアーゼ切断部位のアミノ酸配列を遅現性（非毒性）から速現性（毒性）のＮ
ＤＶ株の配列に変更した遺伝的に修飾したＬａＳｏｔａ株の作成によって、この
仮定を試す独特の機会が提供された。従って、新しく作成したウイルスＮＤＦＬ
［Ｆ^wt］の大脳内病原性指数（ＩＣＰＩ）を測定し、ＮＤＦＬ株及びＬａＳｏｔ
ａ株（クローンＥ１３−１）のＩＣＰＩと比較した。その結果、ＮＤＦＬ［Ｆ^wt ］のＩＣＰＩは１．３であり、ＮＤＦＬ（ＩＣＰＩ＝０．０）及びクローンＥ１
３−１（ＩＣＰＩ＝０．３）株の値よりもはるかに高いことが示された。このよ
うな結果は、予想通り、ＮＤＶの毒性はＦｏタンパク質におけるプロテアーゼ切
断部位のアミノ酸配列によって大きく左右されることを示している。

【０１６７】血清学的なマーカーの導入ＮＤＶにおける包膜糖タンパク質Ｆ及びＨＮはウイルスで最も免疫原性のある
タンパク質である。感染後、Ｆ及びＨＮタンパク質は、強い抗体中和反応を引き
出す。そのような抗体中和反応の誘導は、（広く用いられているＬａＳｏｔａ株
のような）非毒性ＮＤＶ株によるワクチン接種が上手く行く基礎となる。

【０１６８】しかしながら、ＮＤＶワクチン株に対する抗体反応は毒性のあるＮＤＶ野生株
に対する抗体反応と区別することができない。従って、血清学的な方法によって
毒性のある野生株による感染を追跡することはできない。野生型ウイルスによる
感染がワクチン接種により隠され、野生株によって起きた臨床的な徴候が見落と
される可能性があり、又はワクチンのせいにすらされるので、この状況は望まし
くない。ワクチン接種と感染を上手く区別することは、ＮＤＶ撲滅には必須のこ
となので、我々は、ワクチン接種に使用することができ、ＮＤＶ野生株と血清学
的に区別できるような遺伝的に修飾したＮＤＶの開発に乗り出した（いわゆる標
識ワクチン）。

【０１６９】ＮＤＶ標識ワクチンを開発するために、（主要な）抗原の１つで１個又は数個
の免疫的に優勢なエピトープを欠失する、又は修飾することができるようにウイ
ルスは遺伝的に修飾されなければならない。必須タンパク質部位の欠失は、当該
タンパク質の生物機能を損なう可能性がある。従って、我々は、タンパク質の生
物機能を保ったままで、修飾したタンパク質に対する抗体のレパトアが元々のタ
ンパク質に対するものとは異なるような方法で、ＮＤＶの免疫的に優勢な包膜タ
ンパク質の１つを修飾することを選択する。以下に特定するような理由で、我々
は発明の実施態様を１つ選択し、ＮＤＶのＨＮタンパク質を修飾する。ＮＤＶの
感染は、宿主細胞の原形質膜とビリオン包膜との融合によって開始する。この工
程のためにＦタンパク質とＨＮタンパク質の両方が必要となる。Ｆタンパク質と
ＨＮタンパク質は物理的に相互作用し、この相互作用には膜の融合が必要である
ことが明らかにされている（Deng et al., 1995)。その上、その相互作用は型特
異的である、即ち、Ｆ及びＨＮタンパク質は、融合活性を示すには同一ウイルス
に由来しなければならないことが示されている。ＮＤＶにおけるＨＮタンパク質
の相互作用するドメインはタンパク質のいわゆる柄領域又は茎領域に位置し、Ｈ
Ｎタンパク質の外部ドメインである９２個のアミノ酸配列を含んでいる（Deng e
t al., 1995)。ＮＤＶのアミノ酸１〜１４１とヒトのパラインフルエンザ３型の
アミノ酸１４１〜５７２（ｈＰＩＶ３）から成るハイブリッドＨＮタンパク質は
、ＮＤＶのＦタンパク質と共に共存発現させた場合、融合活性を保持しているこ
とが示された。このような知見は、ＮＤＶの柄領域とそれに続く別の鳥類のパラ
ミクソウイルスの血清型のＨＮタンパク質の球状頭部から成るハイブリッドＨＮ
タンパク質を抱く遺伝的に修飾されたＮＤＶ株が生存可能であることを示唆して
いる。

【０１７０】更に、そのような株はＮＤＶとは異なった抗ＨＮ抗体反応を引出す。Ｆタンパ
ク質に対する中和抗体反応は、ウイルス感染のチャレンジに対して効果的に防御
できるほど十分なので、そのような遺伝的に修飾されたＮＤＶ株は、標識ワクチ
ンに必須の２つの必要事項、即ち、疾患に対する防御と血清学的な区別を満たし
ている。

【０１７１】ＮＤＶのアミノ酸１〜１４１及び鳥類パラミクソウイルス２型のアミノ酸１４
２〜５８０（ＡＰＭＶ２）（ＨＮ１／２¹⁴¹と命名）又はＮＤＶのアミノ酸１〜
１４３及びＡＰＭＶ２のアミノ酸１４４〜５８０（ＨＮ１／２¹⁴³と命名）のど
ちらかの融合から成るハイブリッドＨＮ遺伝子を構築した。

【０１７２】同様に、ＮＤＶのアミノ酸１〜１４１及びＡＰＭＶ４のアミノ酸１４３〜５６
９（ＨＮ１／４¹⁴¹と命名）又はＮＤＶのアミノ酸１〜１４３及びＡＰＭＶ４の
アミノ酸１４５〜５６９（ＨＮ１／４¹⁴³と命名）のどちらかの融合から成るハ
イブリッドＨＮ遺伝子を構築した。有核細胞の発現ベクターｐＣＩｎｅｏでハイ
ブリッド遺伝子をクローニングし、ＮＤＶのＦタンパク質を含むプラスミドと共
に共存形質移入実験に用いた。この目的で、Ｆ２とＦ１の間のタンパク質分解切
断部位をＬａＳｏｔａ配列から毒性ＮＤＶ株のコンセンサス配列（材料と方法の
項を参照）のものに変更するようにＦタンパク質を修飾した。ＣＥＦ細胞及びＱ
Ｍ５細胞における共存形質移入実験によって、ＨＮ１／２¹⁴¹及びＨＮ１／２¹⁴³ の両方共、ＨＮ１／４¹⁴¹及びＨＮ１／４¹⁴³同様に、Ｆ^wtタンパク質と共に共存
発現させた場合、細胞融合を誘導することが示された。このような結果は、ハイ
ブリッドＨＮタンパク質とＦタンパク質との複合体が生物活性を持つことを示し
ている。ハイブリッドＨＮタンパク質ＨＮ１／２¹⁴³及びＨＮ１／４¹⁴³を用いて
、完全長クローンｐＮＤＦＬ＋における元々のＨＮ遺伝子と入れ替え、ｐＮＤＦ
Ｌ−ＨＮ１／２¹⁴³及びｐＮＤＦＬ−ＨＮ１／４¹⁴³を得た。上記共存形質移入シ
ステムを用いて、感染性ウイルスを作成するために続いて後者２つのプラスミド
を使用した。形質移入した単層培養細胞の培養上清を接種した胚含有卵の尿膜腔
液から生きた組換えウイルス（ＮＤＦＬ−ＮＨ１／２¹⁴³及びＮＤＦＬ−ＨＮ１
／４¹⁴³と命名された）を単離することができた。

【０１７３】各２つの組換え産物におけるハイブリッドＨＮ遺伝子の存在はＲＴ−ＰＣＲに
よって確認した。赤血球凝集抑制試験によって、ＮＤＶに対するモノクローナル
抗体及び多価抗血清は組換えウイルスＮＤＦＬ−ＮＨ１／２¹⁴³及びＮＤＦＬ−
ＨＮ１／４¹⁴³によるニワトリ赤血球の凝集を阻止できないことが示された。こ
のような結果は、従来のＮＤＶワクチンとは血清学的に区別することができるワ
クチンとしてＮＤＦＬ−ＮＨ１／２¹⁴³及びＮＤＦＬ−ＨＮ１／４¹⁴³株を使用し
てもよいことを示している。

【０１７４】組換えＮＤＶからのヘテロ接合体タンパク質の発現外来遺伝子をＮＤＶゲノムに挿入することができるかどうかを調べるために、
我々は、ＳＥＡＰリポーター遺伝子を持つ組換えウイルスを構築した。ＳＥＡＰ
遺伝子は、プラスミドｐＯＬＴＶ５３５に由来し、ＮＤＶの典型的な転写開始ボ
ックスと転写停止ボックスを含むように修飾した。転写開始ボックスと転写停止
ボックスが後に続いたＳＥＡＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片をプラスミドｐＮＤＦＬ
＋［Ｆ^wt］のＸｍｎＩ部位（ｎｔ１０９）に挿入した。共存形質移入システムに
よってＮＤＦＬ−ＡＰと命名した感染性ウイルスを作成し、ＲＴ−ＰＣＲによっ
てＳＥＡＰ遺伝子の存在を確認した。ＮＤＦＬ−ＡＰ株を感染させた細胞は、極
めて高いレベルでＳＥＡＰタンパク質を発現した。ＳＥＡＰタンパク質の比活性
を用いて、我々はＮＤＦＬ−ＡＰを感染させた細胞に発現されているタンパク質
のｘ％がＳＥＡＰタンパク質から成っていることを算出した。このような結果は
、組換えＮＤＶから極めて高いレベルでヘテロ接合体遺伝子が発現されうること
を示している。

【０１７５】トランス型相補性細胞株におけるＮＤＶ欠失変異の作成ＮＤＶのＭタンパク質の発現を除くために、ＢｓａＡＩ（ｎｔ３０８７）によ
るｐＮＤＦＬ＋［Ｆ^wt］の消化とその後のＨｉｎｄＩＩＩ（ｎｔ４２５２）によ
る部分消化によってＭ遺伝子の大部分を削除した。ＨｉｎｄＩＩＩ末端をＫｌｅ
ｎｏｗＤＮＡポリメラーゼで埋めた後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって再び環状化
し、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換するのに用いた。ｐＮＤＦＬ＋［Ｆ^wt］ｄＭと命名
された出来上ったプラスミドを用いて、ＮＤＶのＭタンパク質を発現しているト
ランス型相補性のＣＥＲ−Ｍ細胞において共存形質移入によってウイルスを作成
した。形質移入した単層培養細胞の培養上清でＣＥＲ−Ｍ細胞を３回継代し、ウ
イルスの存在を分析した。３回継代した培養上清が赤血球凝集試験（ＨＡ）及び
赤血球凝集抑制試験（ＨＩ）の陽性結果を生じたということを証拠としてウイル
スが得られた。ウイルスをＮＤＦＬ−ｄＭと命名した。ＮＤＦＬ−ｄＭを用いて
単層ＣＥＦ細胞に感染させた場合、Ｆタンパク質に対するモノクローナル抗体を
用いてＩＰＭＡで見られるように、ウイルスは依然として細胞から細胞への伝染
することによって広がっていくことができた。予想通り、Ｍタンパク質に対する
モノクローナル抗体を用いたＩＰＭＡではＭタンパク質の発現を明らかにするこ
とはできなかった。培養上清を用いてＣＥＦ細胞又はＣＥＦ−Ｍ細胞に感染させ
た場合、ＩＰＭＡによってこのような単層培養細胞において複製しているウイル
スの存在を示すことはできなかった。このような知見は感染性ウイルスは非相補
性ＣＥＦ細胞では作られなかったことを示している。感染させたＣＥＦ細胞から
得た培養上清を接種した胚含有卵では、ＨＡ試験又はＨＩ試験で調べたとき、子
孫ウイルスを生じなかったという観察によってこの知見は裏付けられた。

【０１７６】より良いＮＤＶワクチンの必要性、及び特にＮＤＶ標識ワクチンの必要性に促
されて我々は、遺伝的修飾ができる逆遺伝システムを開発した。本明細書で我々
は、クローニングした完全長ｃＤＮＡに完全に由来する感染性ＮＤＶの作成を記
載する。我々は、Ｆタンパク質のプロテアーゼ切断部位の特異性を決定するたっ
た３個のヌクレオチドによってＮＤＶの毒性を劇的に変えられることを明らかに
する。この場合、プロテアーゼ切断部位は、ＬａＳｏｔａ株の切断部位から毒性
ＮＤＶ株のコンセンサス切断部位のプロテアーゼ切断部位に変更した。この遺伝
的に修飾されたＮＤＶ株を作成するために、我々は、Ｆタンパク質の切断可能性
が鍵となる決定基（しかし唯一の決定基ではない）であるという公式な証明を届
ける。同じ逆遺伝学的アプローチを用いて、切断部位を意のままに他のいかなる
アミノ酸配列にも変更することができる。これによって毒性レベルのスペクトル
を呈する一連のＮＤＶ株の作成が導かれる。

【０１７７】ｉｎｖｉｖｏ（生体内）既に上述したように、Ｆ及びＨＭタンパク質の切断可能性のほかに、他のウイ
ルス因子が病原性に寄与している可能性があることが示されている。転写及び翻
訳における改変がウイルス及び又は細胞病原性の増殖や細胞から細胞への広がり
に介在する可能性がある。ＮＤＶの感染性ｃＤＮＡによって転写や複製を含む配
列の酵素的な改変ができるようになる。これによって現実には存在しない毒性へ
の最適な免疫原性を保った新しいＮＤＶワクチンの設計が導かれる可能性がある
。

【０１７８】安全性は生ワクチンの最も重要な特徴の１つである。しかしながら、ＮＤＶを
含めて多くの生ワクチンでは、免疫原性は逆に毒性に関係することが多い。従っ
て、免疫原性を失わずに生ワクチンをさらに減毒化することは、遺伝的修飾を使
用することができる改変の最も所望のものの１つである。この点に関して、セン
ダイ・ウイルスのＶタンパク質の発現を除くことによってマウスにおけるｉｎ
ｖｉｖｏ病原性を著しく低下させたというのは価値ある記述である（Kato et al
., 1997)。センダイ・ウイルスと同様に、ＮＤＶもまたＲＮＡ編集として知られ
るメカニズムによってＶタンパク質を生じる(Steward et al., 1993)。ＮＤＶの
Ｖタンパク質の発現を除くことによってもｉｎｖｉｖｏで減毒化された表現型
を生じる可能性があることが予測可能である。

【０１７９】ＮＤＶの毒性の変更とは別に、我々は、ＮＤＶ野生株と血清学的に区別できる
株を作成できるような方法で、ＮＤＶの抗原の性質を修飾することが可能である
ことを明らかにする。このような所謂、標識ワクチンは、世界中の商業的な群集
団におけるＮＤＶの流行を見極めるのに貴重なツールである。

【０１８０】更に、そのような標識ワクチンを大規模に適用するということは、徹底的なス
クリーニング過程と感染した群れの一掃することによって完全な撲滅を導くこと
になる。本明細書で我々は、外来遺伝子をＮＤＶのゲノムに挿入できることを明
らかにする。このような外来遺伝子は、感染細胞に極めて高レベルで発現されう
る。このことは、他の（トリの）病原体に由来する抗原を発現するためにワクチ
ン・ベクターとしてＮＤＶを使用できることを示している。いくつかの特徴によ
ってＮＤＶは、呼吸器疾患又は腸疾患に対するワクチン接種にとって理想的なワ
クチン・ベクターとなっている。１）ＮＤＶは、胚含有卵において極めて高い
力価で容易に培養することができる。２）胚含有卵におけるＮＤＶの大量培養
は比較的安価である。３）ＮＤＶワクチンは相対的に安定であり、飲み水への添
加、スプレー又はエアゾール形状によって簡単に投与することができる。４）Ｎ
ＤＶの自然感染経路は呼吸器及び／又は腸管によるものであり、それは、他の多
くの鳥類病原体の主要な自然感染経路である。５）ＮＤＶは、循環する母体抗体
が存在するにもかかわらず、局所免疫を誘導することができる。

【０１８１】最後に我々は、トランス型相補性細胞株を用いて、ＮＤＶの可変欠失変異を作
成することができることを明らかにする。内細胞膜でのＮＤＶの出芽に関与する
マトリックス（Ｍ）タンパク質を発現できないＮＤＶ欠失変異を作成した。我々
は、Ｍタンパク質を発現できない、表現型上相補性のあるＮＤＶ株が、依然とし
て細胞に感染することができ、細胞から細胞への伝染によって広がることができ
ることを明らかにする。しかしながら、変異ウイルスは、非相補性細胞では感染
性の子孫を生じることはできない。この知見は、表現型の上で相補性のあるＮＤ
Ｖ欠失変異体は、環境に広がることができない安全な自己制約的ワクチンとして
使用してもよいことを示している。そのような非伝染性ワクチンは、例えば安全
性のような、例えば死菌ワクチンの最も重要な利点を伴った有効性のような、生
ワクチンの最も重要な利点を兼ね備えている。

【０１８２】

【表１】

【０１８３】

【表２】

【０１８４】

【表３】

【０１８５】

【表４】

【０１８６】

【表５】

【０１８７】

【図面の簡単な説明】

【図１】転写ベクターｐＯＬＴＶ５はPattnaikら（1992)によって記述された転写ベク
ターの誘導体である。構築の詳細については本文参照のこと。プラスミドはＴ７
ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（肉太活字で示した）と、それに
続く単一のＳｔｕＩおよびＳｍａＩ制限部位、およびデルタ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＤＶ）からの自己触媒性リボザイムを含む。ＤＮＡフラグメントはＳｔｕＩおよ
びＳｍａＩ部位の間にクローン化されることが可能であり、Ｔ７ＲＮＡポリメラ
ーゼを用いてインヴィトロまたはインヴィヴォのいずれかにおいて転写されるこ
とが可能である。結果として生じる転写物の５´末端は、インサートにはコード
化されていない二つの余分のＧ−残基を含む。リボザイムの働きにより、当該転
写物の３´末端はインサートの最後のヌクレオチドに正確に対応する。

【図２】ミニゲノムプラスミド、ｐＯＬＴＶ５３５（図２Ａ）およびｐＯＬＴＶ５５３
（図２Ｂ）の構造。ニニゲノムプラスミドは、転写プラスミドｐＯＬＴＶ５（図
１を参照）を主成分とし、分泌されたアルカリ性ホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を
コード化している遺伝子の側面に並んでいる、ＬａＳｏｔａ系ＮＤＶの３´領域
（ｎｔ１〜１１９）と、５´領域（ｎｔ１４９７０〜１５１８６）とを含む
。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるｐＯＬＴＶ５３５の転写は、反ゲノムＲＮＡ（
または［＋］−ＲＮＡ）を生じるが、一方ｐＯＬＴＶ５５３の転写は、ゲノムＲ
ＮＡ（または[−]−ＲＮＡ）を生じる。ウイルス転写の開始および終止シグナル
である、開始（Ｓ）および終止（Ｅ）ボックスが示されている。ＳＥＡＰ遺伝子
の開始コドンには下線が付されている。各々１ｎｔずつ長さの異なるミニゲノム
プラスミド（各々ｐＯＬＴＶ５３５Ｎ０〜Ｎ５およびｐＯＬＴＶ５５３Ｎ０〜Ｎ
５）を生じるＣｌａＩ部位のインサーション（Ｎ０〜Ｎ５）の配列も示されてい
る。

【図３】ＬａＳｏｔａ系ＮＤＶのゲノムのヌクレオチド配列および、推定されるＮＤＶ
遺伝子のアミノ酸配列。示した配列は反ゲノム鎖に対応しており、５´から３´
の方向へ、ｓｓＤＮＡの形で示されている。この図に示された配列は、全ＮＤＶ
ゲノムにわたる二つの独立した重複するサブゲノムｃＤＮＡのセットの完全なシ
ーケンシングにより決定された共通配列のものである。残りのアンビギュイティ
ー（おそらくＰＣＲのエラーの結果）は、第３の独立したクローンのセットにつ
いての関連領域のシーケンシングによって解明された。重複するサブゲノムｃＤＮＡクローンから組立てられた完全長のｃＤＮＡクロ
ーンｐＮＤＦＬ＋（図４参照）の配列は、以下の位置においてＮＤＶの共通配列
のそれと異なっている（括弧間共通配列）：ｎｔ１７５５，Ｇ（Ａ）；ｎｔ３
７６６，Ａ（Ｇ）；ｎｔ５１０９，Ｇ（Ａ）；ｎｔ６９９９，Ｔ（Ｃ）；ｎｔ
７０５６，Ｇ（Ａ）；ｎｔ９３３７，Ｇ（Ａ）；ｎｔ９４８６，Ａ（Ｔ）；
ｎｔ１０１９５，Ｔ（Ｃ）；ｎｔ１３０７５，Ａ（Ｇ）。これらの差は結果と
して３つのアミノ酸の変化を生じる（括弧間共通配列）：Ｆタンパク質、Ｒ¹⁸⁹
（Ｑ）；ＨＮタンパク質Ｓ²⁰⁰（Ｐ）Ｌ−タンパク質Ｎ³⁶⁹（Ｉ）。

【図４】（Ａ）重複するサブゲノムｃＤＮＡクローンからの完全長のＮＤＶｃＤＮＡの
組立てに用いられた総体的な方法。ｃＤＮＡは、ＬａＳｏｔａ系ＮＤＶの３´お
よび５´末端をすでに含んでいるプラスミドｐＯＬＴＶ５３５（図２参照）にお
いて組立てられた。結果として生じるプラスミドはｐＮＤＦＬ＋と名付けられ、
感染性ＮＤＶの生成に使用された。（Ｂ）重複するサブゲノムｃＤＮＡクローンからの完全長のＮＤＶｃＤＮＡの
組立てのための詳細なクローニング法。Ｃｍは、表現形のタグとして一時的に導
入されたクロラムフェニコール耐性遺伝子を示す（詳細は本文参照）。（Ｃ）遺伝学的に変異された完全長のＮＤＶｃＤＮＡの生成のための詳細なク
ローニング法。変異は、Ｆ遺伝子に導入された３つのヌクレオチドの変化から成
り、その結果Ｆタンパク質のタンパク質分解部位のアミノ酸配列の変異を生じる
（詳細は本文参照）。

【図５】（Ａ）ｐＯＬＴＶ５３５系Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写は反ゲノムＲＮＡ（または［＋］−ＲＮＡ
）を生じるが、それは細胞によりＳＥＡＰタンパク質に直接翻訳されることが可
能である。ヘルパーウイルスによる細胞感染の後（またはＮＰ、Ｐ、およびＬを
コード化しているプラスミドの同時トランスフェクションの後）、ゲノムＲＮＡ
（または［−］−ＲＮＡ）合成のため、反ゲノムＲＮＡがウイルスポリメラーゼ
複合体によって使用される。ゲノムＲＮＡは次に、ウイルスポリメラーゼ複合体
によりｍＲＮＡ（特異的な転写開始［Ｓ］および終止［Ｅ］ボックスの使用によ
る）および反ゲノムＲＮＡの両者の合成に用いられる。（Ｂ）ｐＯＬＴＶ５５３系Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写はゲノムＲＮＡ（または［−］−ＲＮＡ）
を生じるが、それはＳＥＡＰタンパク質に翻訳されることができない。ヘルパー
ウイルスによる細胞感染の後（またはＮＰ、Ｐ、およびＬをコード化しているプ
ラスミドの同時トランスフェクションの後）、ｍＲＮＡ（特異的な転写開始［Ｓ
］および終止［Ｅ］ボックスの使用による）および反ゲノムＲＮＡの両者の合成
のため、ゲノムＲＮＡがウイルスポリメラーゼ複合体によって使用される。

【図６】ＮＤＶＬａＳｏｔａおよび他のパラミクソウイルスの、５´末端の核酸配列の
アラインメントが、ルブラウイルス（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）属の４つの仲間
、パラミクソウイルスの３つの仲間、およびモルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌ
ｉｖｉｒｕｓ）属の３つの仲間にわたるＮＤＶの配列の比較として示されている
。配列はＬ遺伝子の終止ボックスから５´末端まで（３´〜５´ｃＤＮＡ）描か
れている。ＮＤＶ，ニューカッスル病ウイルス；ｈＰＩＶ２，ヒトパラインフルエンザウ
イルス２；ＭｕＶ，おたふくかぜウイルス；ＳＶ５およびＳＶ４１，各々シミア
ンウイルス５および４１；ＳｅＶ，センダイウイルス；ｂＰＩＶ３，およびｈＰ
ＩＶ３各々ウシおよびヒトのパラインフルエンザウイルス；ＣＤＶ，イヌジス
テンパーウイルス；ＭｅＶはしかウイルス；ＲＰＶ，牛疫ウイルス。全ゲノム
のヌクレオチド（ｎｔ）配列は、以下のように取得された（受託番号）：ＮＤＶ
（ＡＦ０７７７６１）；ｈＰＩＶ２（Ｘ５７５５９）；ＭｕＶ（ＡＢ０００３８
８）；ＳＶ５（ＡＦ０５２７５５）；ＳＶ４１（Ｘ６４２７５）；ｂＰＩＶ３（
Ｄ８４０９５）；ｈＰＩＶ３（Ｚ１１５７５）；ＣＤＶ（Ｌ１３１９４）；Ｍｅ
Ｖ（Ｘ１６５６５）；ＲＰＶ（Ｚ３０６９７）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/70 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ 15，Ｌｅｌｙｓｔａｄ，ｔｈｅＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ (72)発明者ペーテルス，ベルナルデュスペトルスヒューベルツスオランダ国レーリスタットホルフパルク 18 (72)発明者デレーウ，オラフスフェンオランダ国アルメーレヨハンウェステルフェルトストラート４ (72)発明者コッフ，フースオランダ国レーリスタットウィルトバーン 12 (72)発明者ヒールケンス，アルナウトレオナルトヨセフオランダ国レーリスタットブーヤー 04−76 Ｆターム(参考） 4B024 BA32 CA04 DA02 EA02 GA11 HA01 4B063 QA01 QQ10 QR32 QR55 QS32 4B065 AA95X AB01 BA02 CA24 CA43 4C084 AA13 NA14 ZB331 4C085 AA03 BA57 BA59 CC04 DD62

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】鳥類パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）の感
染性コピー生成を可能とする鳥類パラミクソウイルス・ゲノムの５'-末端に相当
する核酸配列を少なくとも含んでなる鳥類パラミクソウイルスｃＤＮＡ。
【請求項２】完全長ｃＤＮＡを含んでなることを特徴とする請求項１記載の
ｃＤＮＡ。
【請求項３】複製鳥類パラミクソウイルス・ミニゲノム生成を可能とする鳥
類パラミクソウイルス・ゲノムの５'-末端に相当する核酸配列を少なくとも含ん
でなることを特徴とするｃＤＮＡ。
【請求項４】ニューカッスル病ウイルスから少なくとも一部由来することを
特徴とする請求項１、２または３記載のｃＤＮＡ。
【請求項５】前記ニューカッスル病ウイルスが長潜伏期性ウイルス、好まし
くはワクチン株由来のものであることを特徴とする請求項４記載のｃＤＮＡ。
【請求項６】前記ワクチン株がラソタ（LaSota）株ＡＴＣＣＶＲ−６９９
であることを特徴とする請求項５記載のｃＤＮＡ。
【請求項７】さらに核酸内に修飾を含むことを特徴とする請求項１ないし６
のいずれかに記載のｃＤＮＡ。
【請求項８】前記修飾が修飾プロテアーゼ切断部位をエンコードする核酸を
含んでなることを特徴とする請求項７記載のｃＤＮＡ。
【請求項９】前記切断部位が融合（Ｆ）タンパク質のプロテアーゼ切断部位
であることを特徴とする請求項８記載のｃＤＮＡ。
【請求項１０】前記修飾がハイブリッド・ウイルスタンパク質をエンコード
する核酸を含むことを特徴とする請求項７記載のｃＤＮＡ。
【請求項１１】前記タンパク質が赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）
タンパク質であることを特徴とする請求項１０記載のｃＤＮＡ。
【請求項１２】前記修飾がウイルスタンパク質をエンコードする核酸におい
て欠失を含むことを特徴とする請求項７記載のｃＤＮＡ。
【請求項１３】前記ウイルスタンパク質がマトリックス（Ｍ）タンパク質で
あることを特徴とする請求項１２記載のｃＤＮＡ。
【請求項１４】異種抗原をエンコードする核酸をさらに含むことを特徴とす
る請求項１ないし１３のいずれかに記載のｃＤＮＡ。
【請求項１５】前記抗原が家禽病原に由来することを特徴とする請求項１４
記載のｃＤＮＡ。
【請求項１６】免疫刺激タンパク質またはその部分をエンコードする核酸を
さらに含むことを特徴とする請求項１４または１５記載のｃＤＮＡ。
【請求項１７】請求項１ないし１６のいずれかに記載のｃＤＮＡから得られ
るＲＮＡ。
【請求項１８】請求項１ないし１６のいずれかに記載のｃＤＮＡを少なくと
も１つの細胞にトランスフェクションすることを含む感染性コピー・鳥類パラミ
クソウイルスの生成方法。
【請求項１９】前記細胞がウイルス・ヌクレオカプシド（ＮＰ）、ホスホ−
（Ｐ）または大型ポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質を少なくとも発現し得るもので
あることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】前記ウイルスの融合タンパク質切断を可能とすることをさら
に含むことを特徴とする請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】タンパク質分解活性を含む増殖培地中で前記細胞をインキュ
ベートすることをさらに含むことを特徴とする請求項１８ないし２０のいずれか
に記載の方法。
【請求項２２】前記増殖培地が前記タンパク質分解活性を有する尿膜液を含
むことを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】前記細胞がニワトリ細胞由来のものであることを特徴とする
請求項１８ないし２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】請求項１８ないし２３のいずれかに記載の方法により得られ
る感染性コピー・鳥類パラミクソウイルス。
【請求項２５】請求項２４記載のウイルスを含んでなるワクチン。
【請求項２６】請求項２５記載の生ワクチン。
【請求項２７】前記感染性コピー・鳥類パラミクソウイルスがニューカッス
ル病ウイルス（ＮＤＶ）に少なくとも部分的に由来するものであることを特徴と
する請求項２５または２６記載のワクチン。
【請求項２８】未予防接種動物または請求項２７記載のＮＤＶワクチンを接
種した動物を、野生型ＮＤＶに感染した動物または未修飾亜病原性または長潜伏
期性ＮＤＶ株を接種した動物から識別する方法であって、最少量の１サンプルを
前記動物から採取し、前記サンプルについて、前記野生型または未修飾ＮＤＶに
よって発現されるが、前記ワクチンによっては発現されない免疫優性エピトープ
またはマーカーに対する抗体の存在を決定することを含んでなる方法。
【請求項２９】前記抗体がＮＤＶのＨＮまたはＦタンパク質に対するもので
あることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】前記動物が家禽類からなる群から選択される、好ましくはニ
ワトリであることを特徴とする請求項２８または２９記載の方法。
【請求項３１】請求項２８ないし３０のいずれかに記載の方法に使用する診
断キット。