KR100874256B1 - 대장균 내독소 단백질 및 뉴캐슬병 바이러스뉴라미니데이즈 에피토프의 융합단백질 및 이의 용도 - Google Patents

대장균 내독소 단백질 및 뉴캐슬병 바이러스뉴라미니데이즈 에피토프의 융합단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 대장균 내독소 단백질 및 뉴캐슬병 바이러스 뉴라미니데이즈 에피토프의 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것으로서 보다 상세하게는 대장균 내독소 단백질 및 뉴캐슬병 바이러스 뉴라미니데이즈 에피토프를 융합한 융합단백질, 이를 이용한 백신용 조성물 및 뉴캐슬병 바이러스에 대한 면역력을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 대장균 내독소 단백질 및 뉴캐슬병 바이러스 뉴라미니데이즈 에피토프의 융합단백질은 형질전환체에서 기능적으로 정상인 단백질로 발현되며 가금류에서 뉴캐슬병 바이러스에 대해서 면역력을 증진할 수 있는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 융합단백질 또는 상기 융합단백질을 발현하는 형질전환체는 뉴캐슬병 바이러스를 예방하는 목적으로 사용할 수 있다.
뉴캐슬병, 뉴캐슬병 바이러스, 뉴라미니데이즈 에피토프, 대장균 내독소 단백질, 융합단백질

Description

대장균 내독소 단백질 및 뉴캐슬병 바이러스 뉴라미니데이즈 에피토프의 융합단백질 및 이의 용도{Fusion protein of E. coli heat-labile enterotoxin subunit B and epitope of neuraminidase of Newcastle disease virus and use thereof}
도 1은 대장균에서의 야생형 LTB 발현용 벡터(pET21a-LTB) 및 본 발명의 융합단백질 발현용 벡터(pET21a-LTB-HN)를 나타낸 모식도이다. 이 때 pT7은 T7 프로모터, ss는 신호서열, His6은 6개의 히스티딘 태그, TT7은 T7 종결자를 나타낸다.
도 2는 대장균에서 발현, 정제된 LTB 단백질 및 LTB-HN 융합단백질을 SDS-PAGE(A) 및 웨스턴 블럿(B)로 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 LTB-HN 융합단백질의 GM1-갱글리오사이드(GM1-ganglioside)와의 결합을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 엽록소 형질전환용 벡터(pLD-CtV-HN)를 나타낸 모식도이다. 이 때, 16S는 16S 리보솜 RNA, trnI 및 trnA는 보더(border) 서열, Prrn은 rrn 프로모터, aadA는 스펙티노마이신 또는 스펙트로마이신 저항성 유전자, psbA는 종결자를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 형질전환체에서 형질전환여부를 DNA 수준에서 PCR로 확인 한 결과이다. 이 때, 레인 1 내지 5는 각각의 형질전환체, 레인 wt는 야생종, 레인 P는 pLD-CtV-HN에 관한 것이며, A는 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 프라이머쌍, B는 서열번호 11 및 서열번호 12로 표시되는 프라이머쌍, C는 서열번호 9 및 서열번호 13로 표시되는 프라이머쌍으로 증폭한 결과이다. 도 5에서 각각의 선별 횟수는 스펙티노마이신 처리 후 재분화 횟수를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 형질전환체에서 LTB-HN 융합단백질을 암호화하는 유전자의 발현 여부를 RT-PCR로 확인한 결과이다. 이 때, 레인 1은 pLD-CtV-HN, 레인 2는 야생종, 레인 3 내지 8은 형질전환체의 결과이다.
도 7은 본 발명의 형질전환체에서 LTB-HN 융합단백질의 발현 여부를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과이다. 이 때, 레인 1은 대장균 발현 LTB-HN 재조합 단백질, 레인 2는 야생종, 레인 3 및 4는 형질전환체의 결과이다.
도 8은 본 발명의 형질전환체에서 LTB-HN 융합단백질의 GM1-갱글리오사이드(GM1-ganglioside)와의 결합을 확인한 결과이다.
본 발명은 대장균 내독소 단백질 및 뉴캐슬병 바이러스 뉴라미니데이즈 에피토프의 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것으로서 보다 상세하게는 대장균 내독소 단백질 및 뉴캐슬병 바이러스 뉴라미니데이즈 에피토프를 융합한 융합단백질, 이를 이용한 백신용 조성물 및 뉴캐슬병 바이러스에 대한 면역력을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
뉴캐슬병(Newcastle disease)은 파라믹소군(群)에 속하는 뉴캐슬병 바이러스에 의해서 일어나는 바이러스성 질병으로서, 닭 등 가금류에 대해서 치명적인 제1종 가축 전염병이다. 우리나라에서는 1926년부터 발생되어 오늘날까지 닭에게 가장 많은 피해를 주고 있으며, 폐사율(斃死率)이 높고 전염성도 강하다. 이 병은 병원성이 강한 바이러스에 의해서 일어나는 악성 아시아형과 병원성이 약한 바이러스에 의해서 일어나는 아메리카형이 있으며, 우리나라에서는 주로 2년 주기로 크게 발생한다.
뉴캐슬병에 걸리면 주로 호흡기증세와 신경증세, 때로는 소화기 장애가 일어나며, 원기쇠약, 녹색설사, 개구호흡 등을 일으키고, 산란계에서는 연란(軟卵) 및 산란율 저하가 일어나 경제적인 피해를 준다. 일반적으로 아시아형의 폐사율은 일령에 관계없이 100%이며, 아메리카형은 폐사율은 아시아형에 비해 낮으나, 상당한 수준이다.
뉴캐슬병의 예방을 위해서는 비동화(非動化) 백신 또는 생독(生毒) 백신을 사용하여 면역화를 시키는 방법이 이용된다. 이를 위하여 병아리 때의 기초 백신 접종과 이후 정기적인 보강접종(補强接種)을 통하여 뉴캐슬병을 예방하고 있으나, 비용이 많이 들고, 번거로운 측면이 있어 비경제적이다.
한편, 뉴캐슬병을 일으키는 뉴캐슬병 바이러스는 네거티브-센스 게놈의 외피형 단일-가닥 RNA를 보유한 바이러스로서, 바이러스의 게놈 RNA는 3'-NP-P-M-F-HN-L의 순서로 유전자를 보유하며, 3' 말단에 리드 서열을 보유한다. 바이러스의 구조는 세포 혈장막으로부터 유래된 지질이중층의 바이러스 외피가 있으며, 여기에 당단백질인 혈액응혈인자-뉴우라미니데이즈(HN, 혈액응혈 및 뉴우라미니데이즈 활성)가 외피로부터 돌출되어 있다. 융합 당단백질(F)은 바이러스막과 상호작용하는 융합 당단백질로서, 바이러스 외피와 숙주 세포 혈장막의 융합을 용이하게 하여 뉴캐슬 바이러스가 숙주 세포에 침투하도록 하는데 관여한다. 매트릭스 단백질(M)은 바이러스 조합에 관여하고, 바이러스막 및 뉴클레오캡시드 단백질과 상호작용한다. 뉴클레오캡시드 단백질(NP)은 뉴클레오캡시드의 주요 단백질 서브유니트로서 캡시드상에 나선형 대칭구조를 제공하는 역할을 한다. 인산화의 표적이 되는 인단백질(P)은 전사에서 조절역할을 하는 것으로 생각되고, 또한 메틸화, 인산화, 폴리아데닐화에도 관여하는 것으로 보인다. RNA-의존성 RNA 중합효소를 인코드하는 L 유전자는 P 단백질과 함께 RNA 합성에 관여한다.
이와 같은 뉴캐슬병 바이러스의 분자생물학적 연구성과를 토대로 뉴캐슬병 바이러스를 예방할 수 있는 백신을 개발하기 위한 노력이 있어 왔다. 그 결과 뉴캐슬 바이러스의 HN 단백질에서 2개의 에피토프가 밝혀졌으나(Nishikawa et al., Virology, 1983, 130:318-330; Sakaguchi et al., Virology, 1989, 169:260-272), 이를 이용한 효과적인 뉴캐슬병 예방 방법은 아직 개발되어 있지 않다.
이에 본 발명자들은 뉴캐슬병을 예방할 수 있는 효과적인 방법을 개발하기 위하여 연구한 결과, 대장균 내독소 단백질 및 뉴캐슬병 바이러스 뉴라미니데이즈 에피토프를 융합시킨 융합단백질을 제조하고, 이를 발현하는 형질전환체를 제조하여 상기 형질전환체가 뉴캐슬병을 예방하는 목적으로 이용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 대장균 내독소 단백질 및 뉴캐슬병 바이러스 뉴라미니데이즈 에피토프의 융합단백질 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대장균 내독소 단백질 및 뉴캐슬병 바이러스 뉴라미니데이즈 에피토프의 융합단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형 질전환된 형질전환세균 및 형질전환식물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 뉴캐슬병 바이러스 예방 백신용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 융합단백질을 가금류에 투여하는 것을 특징으로 하는 뉴캐슬병 바이러스에 대한 면역력을 증진하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 형질전환식물을 가금류에 섭취시키는 것을 특징으로 하는 뉴캐슬병 바이러스에 대한 면역력을 증진시키는 방법을 제공한다.
이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 융합단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 대장균 내독소 단백질 및 뉴캐슬병 바이러스 뉴라미니데이즈 에피토프의 융합단백질인 것을 특징으로 한다.
본원발명의 융합단백질에서 상기 대장균 내독소 단백질(LTB; heat-labile enterotoxin subunit B)은 Genbank Accession No. M17874에 기재된 단백질이며, 뉴캐슬병 바이러스 뉴라미니데이즈 에피토프(HN, heamgglutinin-neuraminidase)는 종래 문헌(Chambers P et al., (1988) Location of a neutralizing epitope for the haemagglutinin-neuraminidase glycoprotein of Newcastle disease virus, J. Gen . Virol., 69:2115-2122)에 기재된 DEQDYQIR의 아미노산 서열을 가지는 것이다. 본원발명의 융합단백질에서 상기 에피토프는 대장균 내독소 단백질의 C 말단에 2개가 연속하여 융합되며, 상기 에피토프가 단백질으로 발현시 단백질 밖으로 잘 노출되도록 각각의 에피토프 앞에는 글리신-프롤린-글리신-프롤린(GPGP)의 아미노산 서열을 추가하였다. 이와 같이 디자인된 본원발명의 융합단백질을 LTB-HN이라고 명명하였다.
본원발명의 융합단백질은 엽록체 형질전환용 벡터를 이용하여 형질전환된 형질전환체에서 정상적인 구조를 가지며 발현되며 따라서 가금류에 섭취 또는 투여시 가금류 자체의 면역반응이 뉴캐슬병 바이러스 뉴라미니데이즈 에피토프를 인지하여 상기 에피토프에 대한 항체를 제조할 수 있게 된다. 이와 같은 일련의 과정을 통해 가금류는 뉴캐슬병 바이러스에 대해서 면역력을 가지게 된다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질(LTB-HN)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 바람직하게 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 DNA 또는 RNA일 수 있다. 이 때, 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우 서열번호 2의 티민(T)는 우라실(U)로 대체하는 것으로 이해될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 공지된 화학적 합성법에 의해서 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명에서 “발현 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물(상기 폴리뉴클레오티드)이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
본 발명에서 용어, “작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도 성일 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 시그널 서열에는 숙주가 대장균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 본 발명의 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 pLD-CtV-HN 발현벡터일 수 있다. 상기 pLD-CtV-HN 발현벡터는 문헌에 공지된 pLD-CtV 벡터로부터 제조된 벡터로서, 본원발명의 서열번호 2의 염기서열을 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머쌍을 이용하여 PCR에 의해 증폭된 염기 단편을 pLD-CtV 벡터의 EcoRI 및 NotI 부위에 삽입한 벡터이다(도 4 참조).
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환세균 또는 형질전환식물을 제공한다. 형질전환은 핵산을 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼 슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로박테리아-매개 형질전환, PEG(polyethylene glycol), 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 입자 충격법(particle bombardment) 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
상기 형질전환세균은 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스( Staphylococcus), 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 형질전환세균은 대장균 또는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)이다.
상기 형질전환식물은 단자엽 또는 쌍자엽 식물일 수 있다. 단자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 바람직하게는 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마 및 생강이 있으며, 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두가 있다. 바람직하게는, 상기 형질전환식물은 담배일 수 있다.
상기에서 기재한 바와 같이 본원발명의 융합단백질은 뉴캐슬병 바이러스 뉴라미니데이즈의 에피토프를 포함하고 있어 가금류에서 면역반응을 유도하며, 뉴캐슬병 바이러스에 대한 항체를 형성하게 하여 면역력을 가지도록 한다. 따라서, 본원발명은 본원발명의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 뉴캐슬병 바이러스 예방 백신용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 유효한 양의 본원발명의 융합단백질(LTB-HN)을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 담체를 포함할 수 있다. 상기에서 "유효한 양"이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말하며 바람직하게는 뉴캐슬병을 예방하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 LTB-HN 단백질의 유효한 양으로는 0.0001 내지 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.01 내지 1mg/day/체중kg이다. 그러나, 상기 유효한 양은 품종, 계절, 영양상태, 사육상태, 연령 및 투여 경로와 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화될 수 있다.
상기에서 담체는 생리학적으로 허용되고 가금류에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 설사, 위장 장애 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말하며, 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
한편, 본 발명에 따른 조성물은 투여 경로에 따라 적합한 담체와 함께 제형화될 수 있다. 상기 본 발명에 따른 조성물의 투여 경로로는 이에 한정되지는 않으나 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적 투여 경로로는 예를 들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하 또는 정맥 등의 여러 경로가 포함된다.
본 발명의 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당 업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 조성물은 적합한 비경구용 담 체와 함께 주사제, 경피 투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 “경피 투여”는 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로 에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 당업계에 공지된 다양한 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
또한, 본 발명에 따른 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 뉴캐슬병을 예방하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병용하여 투여할 수 있다
한편, 본 발명은 본 발명의 융합단백질을 가금류에 투여하는 것을 특징으로 하는 뉴캐슬병 바이러스에 대한 면역력을 증진시키는 방법을 제공한다.
상기 가금류는 뉴캐슬병 바이러스에 감염되는 닭, 오리, 거위, 꿩, 오골계, 칠면조, 비둘기, 공작, 뿔닭, 메추라기, 카나리아일 수 있으며, 바람직하게는 닭일 수 있다. 본 발명에서 상기 “면역력 증진”은 뉴캐슬병 바이러스에 대한 감수성을 낮추는 것으로, 대조군에 비해서 뉴캐슬병의 회피, 증상완화 등의 효과를 보이는 것을 나타낸다. 본 발명의 융합단백질은 뉴캐슬병 바이러스의 뉴라미니데이즈 에피토프를 포함하고 있어 가금류에서 면역반응을 유도하여 항체 등을 생성하게 하고, 이를 통해 뉴캐슬병 바이러스에 대한 감수성을 낮추게 된다.
아울러, 본 발명은 상기 형질전환식물을 가금류에 섭취시키는 것을 특징으로 하는 뉴캐슬병 바이러스에 대한 면역력을 증진시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에서는 공지된 대장균 내독소 단백질의 서열 및 뉴캐슬병 바이러스 뉴라미니데이즈 에피토프의 서열을 참조하여, 이를 식물염색체에서 발현이 용이하게 이루어지도록 서열번호 1의 아미노산 서열 및 서열번호 2의 염기서열 을 디자인하였고, 상기 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 합성하여 이를 포함하는 발현 벡터를 제조하였다.
한편, 본 발명의 다른 실시예에서는 상기 발현 벡터를 이용하여 대장균에서 본 발명의 융합단백질을 발현, 정제하였고, 그 구조적으로 정상적인지를 분석한 결과 본 발명의 융합단백질이 기능적으로 정상적인 구조를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
이에 본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명의 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 가지는 식물 엽록체용 발현 벡터를 제조하고, 이를 이용하여 형질전환 식물을 제조하였다. 상기 형질전환 식물을 분석한 결과 본 발명의 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환되어 본 발명의 융합단백질을 발현하고 있었으며, 상기 융합단백질은 기능적으로 정상적인 구조를 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 대장균 내독소 단백질 및 뉴캐슬병 바이러스 뉴라미니데이즈 에피토프의 융합단백질 및 이의 용도를 제공한다.
이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 본원발명의 융합단백질을 암호화하는 유전자의 수득 및 벡터의 제작
<1-1> 융합단백질을 암호화하는 염기서열 및 아미노산 서열의 디자인 및 합성
식물 엽록체에서 본원발명의 융합단백질(LTB-HN)을 암호화하는 유전자의 발현을 증대시키고자 식물엽록체 코돈 사용빈도(codon usage)에 따라서 서열번호 2의 LTB-HN 유전자의 염기서열을 정하고, 이를 합성하였다(codon usage database, http://www.kazusa.or.jp/codon/). 이 때 BLAST 2 시퀀스 얼라인먼트(Sequences alignment) 프로그램을 사용하여 합성된 유전자와 대장균간의 내독소 단백질(LTB) 부위의 상동성을 조사한 결과 82%였다. 한편, 합성된 LTB-HN 유전자에는 뉴캐슬병 바이러스 뉴라미니데이즈의 에피토프(DEQDYQIR)가 2개 부착되어 있으며(서열번호 1의 제109번 내지 제116번 및 제121번 내지 제128번), 상기 에피토프의 앞에는 상기 에피토프가 단백질 밖으로 잘 노출되도록 글리신-프롤린-글리신-프롤린의 아미노산을 배열하였다(서열번호 1의 제105번 내지 제108번 및 제117번 내지 제120번). 아울러, 본원발명의 LTB-HN 유전자에 리보솜의 결합을 용이하게 하기 위하여 리보솜 결합 부위(GGAGG)를 가장 앞에 포함하도록 디자인하였다.
<1-2> 야생형 LTB 를 포함하는 대장균 발현 벡터의 제조
야생형 대장균 내독소 단백질(LTB)을 대장균내에서 발현시키기 위하여 야생형 LTB 유전자를 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제조하였다: 먼저 서열번호 3(5‘-GGAATTCCATATGAATAAAGTAAAATGTTATGTTTTAT-3’) 및 서열번호 4(5‘-CCGCTCGAGGTTTTCCATACTGATTGCCGCA-3’)의 프라이머쌍을 사용하여 pMYO46 벡터 (Kang et al., 2003, Expression of the B subunit of E. coli heat-labile enterotoxin in the chloroplasts of plants and its characterization Transgenic Res. 12(6):683-689)에서 PCR을 통하여 야생 LTB 유전자를 증폭 하였으며 이를 pET21a 벡터(Novagen, 미국)의 NdeI과 XhoI 제한효소 부위에 클로닝을 하고, 이를 pET21a-LTB라고 명명하였다(도 1 참조). 상기 클로닝은 PCR 산물 및 pET21a 벡터를 모두 NdeI과 XhoI 제한효소로 처리한 다음 연결효소(ligase)에 의해 연결하여 수행되었다.
<1-3> 본원발명의 LTB - HN 유전자를 포함하는 대장균 발현 벡터의 제조
본원발명에서 합성된 LTB-HN 융합단백질을 대장균에서 발현시키기 위하여 LTB-HN 융합단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 발현 벡터를 다음과 같이 제조하였다: 서열번호 5 (5‘-GGCGAGCTCCTCAATCTATTACTGAACT-3’) 및 서열번호 6 (5’-CCGCTCGAGACGAATTTGATAATCTTGTTCATCAGGACCAGGACC-3’)의 프라이머쌍을 사용하여 상기 실시예 <1-1>에서 합성된 본원발명의 융합단백질을 암호화하는 유전자를 주형으로 하여 PCR로 증폭하였다. 합성된 PCR 산물을 pET21a-LTB의 SacI과 XhoI 제한효 소 부위에 재클로닝을 하였으며, 이를 pET21a-LTB-HN라고 명명하였다(도 1 참조).
< 실시예 2> 대장균에서의 융합단백질의 발현 및 기능분석
<2-1> 야생형 LTB 및 LTB - HN 의 발현 및 정제
상기 실시예 <1-2>에서 제조된 pET21a-LTB 및 <1-3>에서 제조된 pET21a-LTB-HN를 발현시켜 이를 분리하기 위하여, 상기 발현 벡터들을 E. coli BL21(DE3) (pLysS계통; Novagen, 미국)에 각각 형질전환하였다. 형질전환된 각각의 대장균 균주를 암피실린(100 μg/ml)이 함유된 LB(Luria-Bertani)배지를 사용하여 37℃에서 배양한 후, 세포 배양액 흡광도(600 nm)가 0.8일 때 1 mM의 농도 IPTG(Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, 다시 28℃에서 18시간동안 배양하였다.
발현된 야생형 LTB와 LTB-HN는 Ni-NTA 컬럼을 이용한 통상의 정제방법에 따라 다음과 같이 정제하였다: 배양된 E. coli BL21(DE3)를 원심분리하여 수득한 뒤, 바인딩 완충액(5 mM 이미다졸, 0.5 M 염화나트륨, 20 mM의 Tris-HCl, pH 7.9)에 현탁하였다. 이를 4 ℃, 12,000 rpm에서 20분간 원심분리 한 후, 그 상등액을 바인딩 완충액으로 평형된 Ni-NTA 컬럼 (Quiagen, 미국)에 로딩하여 레진과 결합시켰다. 컬럼을 50 ml의 완충액 (60 mM 이미다졸, 0.5 M 염화나트륨, 20 mM의 Tris-HCl, pH 7.9)으로 세척하고, 다시 희석 완충액(1 M 이미다졸, 0.5 M 염화나트륨, 20 mM의 Tris-HCl, pH 7.9)으로 용출시켜 각각의 단백질을 정제하였다.
<2-2> 야생형 LTB 및 합성 LTB - HN 의 SDS - PAGE 및 웨스턴 블럿 분석
상기 형질전환체에서 발현된 각각의 단백질의 분자량 및 5합체 형성여부를 확인하기 위하여 다음과 같이 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿 분석을 실시하였다: 재조합된 야생형 LTB와 합성 LTB-HN (1 μg)을 각각 DTT(dithiothreitol)를 함유하거나, 함유하지 않는 시료를 통해 4-15%의 SDS-PAGE에 전기영동을 실시하였고, 쿠마시 블루(Coomassie blue) R-250 시약을 사용하여 염색을 하였다.
한편, 상기와 같이 SDS-PAGE를 수행한 젤에서 단백질 시료를 10 mM의 CAPS-10% 메탄올 용액을 사용하여 250 V에서 2시간동안 니트로셀룰로즈페이퍼에 옮겼고, 페이퍼의 비특이적 항체 결합을 억제하고자, Tween과 Tris로 완충된 살린(saline)에 녹인 5%의 무지방 밀크 파우더(milk powder)로 블로킹(blocking)하였다. 이 후 LTB(Abcam, 미국) 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(Keyhole Limpet Hemocyanin; KLH)-HN 에피토프에 대한 다클론 항체(1:1000 dilution)를 사용하여 항원 항체 결합 반응을 실시하였다. 이 때, KLH-HN 에피토프에 대한 다클론 항체는 토끼를 이용하여 공지된 문헌(Kitagawa, J., et al. (1981). Preparation and characterization of hetero-bifunctional cross-linking reagents for protein modifications. Chem . Pharm . Bull.; 28: 1130-5.; Murdin AD, Doel TR. (1987) Synthetic peptide vaccines against foot-and-mouth disease. II. Comparison of the response of guinea-pigs, rabbits and mice to various formulations.J Biol Stand. 15(1):53- 65.)에 기재된 방법에 따라 제조한 것이다. 세척 용액(PBS-0.05% Tween 20)으로 3번 세척한 후 HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 이차항체 (Pierce, 미국, 1:5000)를 2시간 결합시켰고, 다시 상기 세척 용액으로 3번 세척한 후 4-클로로나프톨(4-chloronaphthol)과 H2O2를 사용하여 발색 반응을 실시하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 재조합된 야생형 LTB와 본원발명의 LTB-HN은 DTT를 첨가하면 단일 형태의 분자량인 약 12.8 kDa와 15.5 kDa를 나타내었고 DTT가 없는 시료에서는 5합체(pentamer) 형태의 분자량을 확인할 수 있었다(도 2A 및 도 2B 참조). 즉 대장균에서 발현된 재조합 야생 LTB는 5합체를 이루는데 본원발명의 융합단백질도 안정적으로 5합체를 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 LTB 항체를 이용한 경우 야생형 LTB와 본원발명의 합성 LTB-HN 재조합 단백질에 모두 발색반응을 볼 수 있었으나 LTB-HN에 대한 항체를 이용한 경우는 LTB-HN에서만 발색 반응을 확인 할 수 있었던 점에서 본원발명의 융합단백질은 LTB이외에도 HN의 중화항체를 유도하는 에피토프 부위를 포함하여 발현됨을 확인할 수 있었다(도 2B).
<2-3> GM1 갱글리오사이드 ( ganglioside ) 수용체와의 결합 측정
LTB 단백질의 생체내 수용체인 GM1 갱글리오사이드와 본원발명의 융합단백질의 결합력을 확인하고자 다음과 같이 ELISA를 실시하였다. 중탄산나트륨 완충용액 에서 제조된 3.0 μg/ml의 모노시알로갱글리오사이드-GM1(Monosialoganglioside-GM1, Calbiochem-Merck, 독일)을 96-웰 ELISA 플레이트에 투여한 후 4℃에서 하룻밤 놓아 두었다. 다음날 300 μl의 세척용액(PBS-0.05% Tween 20, PBST)으로 두 번 세척하였다. 이 후 PBS로 녹여진 4%의 무지방 밀크로 블로킹(blocking)하였고 PBST로 3회 세척하였다. 야생형 LTB 와 LTB-HN 재조합 단백질을 10 ng에서 1/2씩 순차적으로 희석하여, 각각 10, 5, 2.5, 1.25, 0.63, 0.31, 0.16, 0.08ng을 각각의 웰에 투입하고, 37℃에서 2시간동안 반응시킨 후 PBST로 3회 세척하였다. LTB 또는 HN 중화항체 유도 에피토프에 특이적인 항체를 포함하는 혈청 (1:1000 dilution)을 각 웰에 첨가하여 37℃에서 2시간동안 반응시킨 후 각 웰을 PBST로 3회 세척하였다. HRP가 결합된 염소 항-토끼 IgG 다클론 혈청 (1:5,000 dilution)을 첨가하여 37℃에서 2시간동안 반응시킨 후 PBST로 3회 세척하고, 100 μl의 o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(o-phenylenediamine dihydrochloride)를 첨가하여 발색반응을 시켰다. 50 μl의 1 M HCl를 넣어 발색 반응을 중단한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로 야생형 LTB 와 LTB-HN 재조합 단백질대신 BSA(bovine serum albumin)을 사용하여 수행하였다.
그 결과, 도 3에서 보듯이 본원발명의 LTB-HN 융합단백질은 야생형의 LTB 단백질과 마찬가지로 GM1 갱글리오사이드와 결합할 수 있으며, 그 결합 정도는 야생형의 LTB 단백질과 유사함을 확인할 수 있었다. 한편, LTB 항체를 이용한 경우 LTB와 LTB-HN 모두 발색반응을 볼 수 있어 본원발명의 HN의 중화항체 유도 에피토프가 LTB의 구조형성에 영향을 주지 않음을 알 수 있었고, LTB-HN에 대한 항체를 이용한 경우 LTB-HN에서만 발색 반응을 확인 할 수 있어 본원발명의 HN의 중화항체 유도 에피토프가 독자적으로 구조를 형성하고 있음을 확인할 수 있었다.
< 실시예 3> 형질전환용 벡터 및 형질전환체의 제작
<3-1> 엽록체 형질전환용 벡터 제작
이상의 결과에서 본원발명의 재조합 융합단백질이 대장균에서 잘 발현되며, 기능적으로 온전한 구조를 가짐을 알 수 있었다. 이에 본원발명의 재조합 융합단백질을 발현하는 형질전환 식물을 제조하기 위하여, 이하와 같이 엽록체 형질전환용 벡터를 제작하였다.
엽록체 형질전환용 벡터를 제작하기 위해서 서열번호 7(CCGGAATTCGGAGGGATTTATGGCTCCTCA) 및 서열번호 8(ATAAGAATGCGGCCGCTCAACGAATTTGATAATCTTGTTCATC)의 프라이머쌍을 사용하고 상기 실시예 <1-1>에서 합성된 본원발명의 융합단백질을 암호화하는 유전자를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물과 pLD-CtV 벡터 (De Cosa et al., 2001, Overexpression of the Bt cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to formation of insecticidal crystals. Nat Biotechnol. 19(1):71-74)을 각각 EcoRI 및 NotI로 절단한 후, pLD-CtV 벡터의 EcoRI 및 NotI의 제한효소 부위에 클로닝하였다. 상기 pLD-CtV 벡터는 상동 재조합(homologous recombination)을 유도하도록 16S ribosomal RNA-trnAI와 trnA를 border 서열로 하고 prrn 프로모터와 psbA 터미네이터를 가지며, 스펙티노마이신 또는 스펙트로마이신에 저항성을 갖도록 aadA 유전자가 삽입되었으며, 미생물의 특이적인 라이보좀 결합 서열을 가지고 있다. 본원발명의 엽록체 형질전환용 벡터의 모식도는 도 4와 같으며, 본원발명의 엽록체 형질전환용 벡터를 pLD-CtV-HN이라고 명명하였다.
<3-2> 형질전환체의 제조
담배 종자 (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana)를 소독 처리하여, 6주 동안 무균 상태로 MS 배지에서 재배하였다. 담배 잎의 엽록체 게놈에 형질전환하기 위해서, 무균상태의 담뱃잎을 외과용 수술 칼로 절단하여 RMOP 배지 위에 오려 놓았다 (Svab et al., 1990, Stable transformation of plastids in higher plants. Proc Natl Acad Sci U S A. 87(21):8526-8530). 상기한 pLD-CtV-HN 플라스미드를 금입자 (0.6 μm)로 코팅하고 상용의 형질전환 시스템(Biolistic device PDS-1000/He Particle Delivery System, Bio-Rad, 미국)을 이용하여 제조사의 지침에 따라서 담뱃잎에 형질전환시켰다. 이 후, pLD-CtV-HN 플라스미드로 형질전환된 담배 잎을 항생제가 없는 RMOP 배지에서 암조건하에 2일간 배양하고 그 잎을 작은 조각 (5 mm x 5 mm)으로 잘라 선별 배지 (500 mg/ml spectinomycin dihydrochloride를 포함하는 RMOP 배지)에 올려 놓았다. 결국 스펙트로마이신 저항성 줄기를 6주후에 얻었으며, 더 작은 조각 (2 mm x 2 mm)으로 절단하여 선택적 배지에 올려 놓고 총 3회의 상기와 동일한 과정을 거쳐 형질전환체(호모 플라즈믹(Homoplasmic)한 엽록체 형질전환체)를 제작하였다. 제작된 형질전환체는 멸균된 토양에 식재하고 순화 과정을 거쳐 온실에서 재배를 하였다.
< 실시예 4> 형질전환체에서 LTB - HN 융합단백질의 발현 확인
<4-1> DNA 수준의 형질전환 여부 확인
상기 제조된 형질전환체가 본원발명의 LTB-HN 융합단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는지 확인하기 위하여 PCR을 통하여 다음과 같이 형질전환여부를 확인하였다. 본원발명의 LTB-HN 융합단백질을 암호화하는 유전자의 염기서열 정보를 이용하여 서열번호 9(5‘-AAAACCCGTCCTCAGTTCGGATTGC-3’) 및 서열번호 10(5‘-CCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACG-3’)으로 표시되는 프라이머쌍; 서열번호 11(5‘-CTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGC-3’) 및 서열번호 12(5‘-TGACTGCCCACCTGAGAGCGGACA-3’)로 표시되는 프라이머쌍; 및 서열번호 9 및 서열번호 13(5‘-CACGAGTTGGAGATAAGCGGAC-3’)로 표시되는 프라이머쌍 등 3종의 프라이머쌍을 디자인하여 조합하였고, 94°C, 30초, 60°C 30초, 72°C 2 또는 4분로 30회 증폭의 조건으로 PCR을 하였으며 그 산물을 1% 아가로스 젤에서 전기영동하였다.
그 결과, 도 5에서 보듯이 각각 1.65, 1.9, 3.88 kbp의 위치에서 PCR 산물을 확인할 수 있었고, 이는 프라이머를 디자인할 때 예측되었던 위치와 동일한 것이 다. 따라서, 본원발명의 형질전환체는 LTB-HN 융합단백질을 암호화하는 유전자에 의해 안정적으로 형질전환된 것임을 알 수 있었다.
<4-2> 형질전환체의 LTB - HN 전사확인
본원발명의 형질전환체가 LTB-HN 융합단백질을 암호화하는 유전자를 전사하는지 확인하기 위하여 RT-PCR의 방법으로 다음과 같이 수행하였다: 담뱃잎 (150 mg)에서 전체 RNA를 Davis등의 방법에 따라 정제하였다(Davis and Ausubel, 1989, Characterization of elicitor-induced defense responses in suspension-cultured cells of Arabidopsis. Mol. Plant-microbe Interact. 2: 363-368). RT-PCR 분석을 하기 위하여, 전체 RNA 시료를 DNase(Takara, 일본)로 처리하고 RT-PCR 증폭 시료를 다음과 같이 구성하였다: 1 μg 전체 RNA, 1 x one step RNA PCR 완충액, 0.8 U RNase inhibitor, 0.4 μM 각각의 프라이머, 0.1 U AMV RTase XL, 0.1 U AMV-optomized Taq DNA 중합효소, 5 mM dNTP 와 5 mM MgCl2 (Takara, Japan). RT 반응은 50°C에서 30분 동안 실시하였으며 94°C에서 2분간 놓아 두어 반응을 정지한 후, 서열번호 14(5‘-ATGGCTCCTCAATCTATTACTGAA-3‘) 및 서열번호 15(5’-TCAACGAATTTATCTTGTTCATC-3’)의 프라이머쌍을 사용하여 94°C, 30초, 60°C, 30초, 72°C, 1분으로 35회 반복하여 PCR 반응을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 1% 아가로스젤에서 전기영동하여 관찰하였다.
그 결과 도 6에서 보듯이, LTB-HN 융합단백질을 암호화하는 유전자의 크기에 해당하는 387 bp의 증폭된 RT-PCR 산물을 확인할 수 있어, 본원발명의 융합단백질을 암호화하는 유전자는 RNA 수준에서 안정적으로 전사됨을 확인할 수 있었다.
<4-3> 형질전환체의 LTB - HN 융합단백질의 발현 확인
본원발명의 형질전환체가 LTB-HN 융합단백질을 발현하는지 또한 발현된 융합단백질의 분자량을 측정하기 위해 다음과 같이 웨스턴 블럿 분석을 실시하였다: 1X PBS(phosphate buffered saline) 버퍼 1 ml에 형질전환체 200 mg을 분쇄(homogenize)하고 4 ℃에서 30분간 방치하였다. 그 후 12,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액 (100 )을 10% SDS-PAGE를 사용하여 전기영동하였다. 전기영동 후 토끼 항-LTB 다클론항체(polyclonal, Abcam)를 사용하여 하룻밤동안 4 ℃에서 반응시켰고, PBS-0.05% Tween 20 용액(PBST)으로 5회 세척한 다음, HRP(horseradish peroxidase)가 붙어 있는 이차 항체(Pierce, 미국)와 상온에서 4시간 반응시켰다. 다시 상기 PBST 용액으로 5회 세척한 후 4-클로로나프톨(4-chloronaphthol)을 이용하여 발색 반응을 실시하였다.
그 결과, 도 7에서 보듯이 본원발명의 형질전환체에서 본원발명의 LTB-HN 융합단백질이 발현되며, 형질전환체내에서 모노머(monomer) 형태를 비롯하여, 2합체(dimer), 3합체(trimer) 및 5합체(pentamer) 등 올리머(oligmer)형태들로 강하게 발현됨을 확인 할 수 있었다.
< 실시예 5> 본원발명의 LTB - HN 발현 형질전환체 추출물의 GM1 - 갱글리오사이드와의 결합 측정
본원발명의 형질전환체에서 발현되는 융합단백질이 GM1 갱글리오사이드와 결합하는지 확인하기 위해 분리 정제된 단백질을 사용하는 대신 본원발명의 형질전환체의 추출물 또는 야생종 추출물을 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 <2-3>과 동일하게 하여 ELISA 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 8에서 보듯이, 형질전환체의 추출물(4 및 5)에서는 야생종 추출물(1, 2, 3)에 비해서 4 내지 10배정도 높은 흡광도를 나타내었다. 이러한 결과는 본원발명의 형질전환체에서 발현되는 융합단백질이 구조적으로 정상적인 폴딩을 하여 기능적으로 이상이 없음을 보여주는 것이다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 대장균 내독소 단백질 및 뉴캐슬병 바이러스 뉴라미니데이즈 에피토프의 융합단백질은 형질전환체에서 기능적으로 정상인 단백질로 발현되며 가금류에서 뉴캐슬병 바이러스에 대해서 면역력을 증진할 수 있는 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 융합단백질 또는 상기 융합단백질을 발현하는 형질전환체는 뉴캐슬병 바이러스를 예방하는 목적으로 사용할 수 있다.
<110> Republic of Korea <120> Fusion protein of E. coli heat-labile enterotoxin subunit B and epitope of neuraminidase of Newcastle disease virus and use thereof <130> NP07-0022 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LTB-HN fusion protein <400> 1 Met Ala Pro Gln Ser Ile Thr Glu Leu Cys Ser Glu Tyr His Asn Thr 1 5 10 15 Gln Ile Tyr Thr Ile Asn Asp Lys Ile Leu Ser Tyr Thr Glu Ser Met 20 25 30 Ala Gly Lys Arg Glu Met Val Ile Ile Thr Phe Lys Ser Gly Ala Thr 35 40 45 Phe Gln Val Glu Val Pro Gly Ser Gln His Ile Asp Ser Gln Lys Lys 50 55 60 Ala Ile Glu Arg Met Lys Asp Thr Leu Arg Ile Thr Tyr Leu Thr Glu 65 70 75 80 Thr Lys Ile Asp Lys Leu Cys Val Trp Asn Asn Lys Thr Pro Asn Ser 85 90 95 Ile Ala Ala Ile Ser Met Glu Asn Gly Pro Gly Pro Asp Glu Gln Asp 100 105 110 Tyr Gln Ile Arg Gly Pro Gly Pro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln Ile Arg 115 120 125 <210> 2 <211> 397 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LTB-HN gene <400> 2 ggagggattt atggctcctc aatctattac tgaactttgt tctgaatatc ataatactca 60 aatttatact attaatgata aaattctttc ttatactgaa tctatggctg gtaaaagaga 120 aatggttatt attactttta aaagtggtgc tacttttcaa gttgaagttc ctggtagtca 180 acatattgat tctcaaaaaa aagctattga aagaatgaaa gatactttaa gaattactta 240 tcttactgaa actaaaattg ataaattatg tgtttggaat aataaaactc ctaattctat 300 tgctgctatt agtatggaaa atggtcctgg tcctgatgaa caagattatc aaattcgtgg 360 tcctggtcct gatgaacaag attatcaaat tcgttga 397 <210> 3 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for LTB <400> 3 ggaattccat atgaataaag taaaatgtta tgttttat 38 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for LTB <400> 4 ccgctcgagg ttttccatac tgattgccgc a 31 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for LTB-HN <400> 5 ggcgagctcc tcaatctatt actgaact 28 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for LTB-HN <400> 6 ccgctcgaga cgaatttgat aatcttgttc atcaggacca ggacc 45 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for chloroplast expression vector <400> 7 ccggaattcg gagggattta tggctcctca 30 <210> 8 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for chloroplast expression vector <400> 8 ataagaatgc ggccgctcaa cgaatttgat aatcttgttc atc 43 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3P primer <400> 9 aaaacccgtc ctcagttcgg attgc 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3M primer <400> 10 ccgcgttgtt tcatcaagcc ttacg 25 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5P primer <400> 11 ctgtagaagt caccattgtt gtgc 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2M primer <400> 12 tgactgccca cctgagagcg gaca 24 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4M primer <400> 13 cacgagttgg agataagcgg ac 22 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for RT-PCR <400> 14 atggctcctc aatctattac tgaa 24 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for RT-PCR <400> 15 tcaacgaatt tatcttgttc atc 23

Claims (17)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 대장균 내독소 단백질 및 뉴캐슬병 바이러스 뉴라미니데이즈 에피토프의 융합단백질.
  2. 제1항의 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 프로모터 및 이와 작동가능하게 연결된 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  6. 제4항에 있어서, 상기 발현벡터는 pLD-CtV-HN인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  7. 제4항의 벡터로 형질전환된 형질전환세균.
  8. 제7항에 있어서, 상기 형질전환세균은 대장균 또는 아그로박테리움 투메파시엔스인 것을 특징으로 하는 형질전환세균.
  9. 제4항의 벡터로 형질전환된 형질전환식물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 식물은 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환식물.
  11. 삭제
  12. 제10항에 있어서, 상기 쌍자엽 식물은 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩 및 완두로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 형질전환식물.
  13. 제1항의 융합단백질을 유효성분으로 포함하는 뉴캐슬병 바이러스 예방 백신용 조성물.
  14. 제1항의 융합단백질을 가금류에 투여하는 것을 특징으로 하는 뉴캐슬병 바이러스에 대한 면역력을 증진시키는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 가금류는 닭, 오리, 거위, 꿩, 오골계, 칠면조, 비둘기, 공작, 뿔닭, 메추라기, 카나리아로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제9항, 제10항 또는 제12항중 어느 한 항의 형질전환식물을 가금류에 섭취시키는 것을 특징으로 하는 뉴캐슬병 바이러스에 대한 면역력을 증진시키는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 가금류는 닭, 오리, 거위, 꿩, 오골계, 칠면조, 비둘기, 공작, 뿔닭, 메추라기, 카나리아로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
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