MXPA01002656A

MXPA01002656A - Sistema de expresion del rna de virus de la enfermedad de newcastle, recombinante y vacunas.

Info

Publication number: MXPA01002656A
Application number: MXPA01002656A
Authority: MX
Inventors: Peter Palese
Original assignee: Sinai School Medicine
Priority date: 1998-09-14
Filing date: 1999-09-14
Publication date: 2002-06-04
Also published as: JP2003512009A; US6451323B1; BR9913721A; DK1114189T3; HK1159188A1; NO20011294L; PT1114189E; IL142009A0; PL201738B1; US20090280144A1; ATE452210T1; PT2336370E; ZA200102546B; EP1114189B1; KR100992235B1; EP2336370A3; CY1110704T1; JP4558203B2; ES2558138T3; EP1114189A4

Abstract

Esta invencion se refiere a los virus de la enfermedad de Newcastle geneticamente manipulados y vectores virales que expresan genes heterologos o genes virales de la enfermedad de Newcastle, mutados o una combinacion de genes virales provenientes de diferentes cepas de virus de la enfermedad de Newcastle. La enfermedad se refiere a la construccion y uso de plantillas de RNA viral de NDV de hebra negativa que pueden utilizarse con RNA polimerasa dirigida al RNA viral para expresar los productos genicos heterologos en celulas hospederas adecuadas y/o rescatar el gen heterologo en particulas de virus. En una modalidad especifica de la invencion, el producto del gen heterologo es un peptido o proteina proveniente del genoma de un virus e inmunodeficiencia humana. Las plantillas del RNA de la presente invencion pueden ser preparadas mediante la transcripcion de las secuencias de DNA adecuadas utilizando cualquier RNA polimerasa dirigida al DNA, como puede ser el bacteriofago T7, T3, SP6 polimerasa o polimerasa I eucariotica.

Description

SISTEMAS DE EXPRESIÓN DEL RNA DE VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE, RECOMBINANTE Y VACUNAS • Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud número 09/152,845, presentada el 14 de septiembre de 1998, incorporada en la presente como referencia en su entereza. 1. INTRODUCCIÓN 10 La presente invención se refiere a las plantillas de RNA • del virus de la enfermedad de Newcastle, recombinantes que pueden utilizarse para expresar productos génicos heterólogos en sistemas de células hospedadoras adecuadas y/o para construir virus recombinantes que expresen, 15 empaquen y/o presenten el producto génico heterólogo. Los productos de la expresión y los virus quiméricos pueden utilizarse convenientemente en formulaciones de vacunas. La presente invención también se refiere a los virus recombinantes de la enfermedad de Newcastle genéticamente 20 manipulados que contienen modificaciones y/o mutaciones que hacen al virus recombinante adecuado para uso en formulaciones de vacunas, como puede ser el fenotipo atenuado o mejor inmunogenicidad. La presente invención se refiere a los virus de la 25 enfermedad de Newcastle recombinantes que inducen interferón _- - -t-,-_. tir ' inm ifni üaüBaiÉ y las vias relacionadas. La presente invención se refiere al uso de los virus de la enfermedad de Newcastle recombinantes y los vectores virales contra una amplia gama de patógenos • y/o antigenos, incluidos los antigenos específicos de tumor. 5 La invención se demuestra por medio de los ejemplos en los cuales fueron construidas plantillas de RNA del virus de la enfermedad de Newcastle recombinantes conteniendo las secuencias codificadoras del gen heterólogo en la polaridad negativa. La invención además se refiere a la construcción 10 de las plantillas de RNA del virus de la enfermedad de Newcastle, recombinantes que contienen secuencias codificadoras del gen heterólogo en la polaridad positiva. Estas secuencias del heterólogo incluyen las secuencias provenientes de un virus de inmunodeficiencia humana (VIH) . 15 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Algunos virus que contienen DNA han sido genéticamente manipulados para dirigir la expresión de proteínas • heterólogas en sistemas de células hospedadoras (por 20 ejemplo, virus de vaccinia, baculovirus etc.). En fecha más reciente se han hecho alcances similares con virus que contienen RNA de hebra positiva (por ejemplo, poliovirus). Los productos de la expresión de estas construcciones, es decir, el producto del gen heterólogo o el virus quimérico 25 que expresa el producto del gen heterólogo, se consideran ,-. -<----i-á-i--_.1y (|..|taj^JI ttA** . * , )fc,jai d-d*---B-fa_- --l-«-M-i«---------? ?^-* *??Í*a potencialmente útiles en formulaciones de vacunas (vacunas de subunidad o de virus completo) . Un inconveniente para el uso de los virus como vacunas para construir virus • recombinantes o quiméricos para uso en vacunas es la 5 carercia de variación en sus epítopes principales. Esta carercia de variabilidad en las cepas virales coloca limitaciones estrictas sobre el uso repetido de vacunas quiméricas, en cuanto a que múltiples vacunaciones generarán resistencia del hospedador a la cepa para que el virus 10 inoculado no pueda infectar al hospedador. La inoculación de un individuo resistente con vacuna quimérica, por tanto, no inducirá estimulación inmunitaria. Por lo contrario, los virus de RNA de hebra negativa serían candidatos atractivos para construir virus quiméricos 15 para uso en vacunas. El virus de RNA de hebra negativa, influenza, por ejemplo, es deseable por que su amplia variabilidad genética permite la construcción de un vasto repertorio de formulaciones de vacunas que estimulan inmunidad sin riesgo de desarrollar tolerancia. En fecha 20 reciente, la construcción de partículas de RNA de hebra negativa recombinantes o quiméricas, infecciosas se obtuvo con el virus de influenza (Patente Estadounidense No. 5,166,057 de Palese y col., incorporada en la presente como referencia en su entereza) . 25 2.1 EL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE Las familias de virus que contienen RNA monocatenario envuelto del genoma en sentido negativo se clasifican en • grupos que tienen genomas no segmentados (Paramixoviridae, 5 Rhabdoviridae) o aquellos que tienen genomas segmentados (Orthomixoviridae, Bunyaviridae y Arenaviridae) . La familia paramixoviridae, que se describe con mayor detalle más adelante, y se utiliza en los ejemplos de la presente, contiene los virus de: virus de la enfermedad de Ne castle 10 (NDV) , virus de parainfluenza, virus sendai, virus de simio • 5 y virus de paperas. El virus de la enfermedad de Ne castle es un virus envuelto que contiene un genoma de RNA de sentido negativo, no segmentado, monocatenario, lineal. El RNA genómico 15 contiene genes en el orden de 3' -NP-P-M-F-HN-L, descrito con mayoi detalle más adelante. El RNA genómico también contiene una secuencia líder en el extremo 3' . Los elementos estructurales del virion incluyen la • envoltura del virus que es una bicapa lipídica proveniente 20 de la membrana del plasma de la célula. La glucoproteína, hemaglutinin neuraminidasa (HN) , sobresale de la envoltura permitiendo al virus contener actividades de hemaglutinina y neuraminidasa. La glucoproteína de fusión (F), que también interactúa con la membrana viral, primero ser produce como 25 un precursor inactivo, después se disocia post- traduccionalmente para producir dos polipéptidos con enlaces disulfuro. La proteína F activa esta involucrada en la penetración del NDV en las células hospedadoras facilitando • > la fusión de la envoltura viral con la membrana plasmática 5 de la célula hospedadora. La proteína matriz (M) , esta involucrada con el montaje viral, e interactúa con la membrana viral así como con las proteínas de la nucleocápside. La subunidad de la proteína principal de la 10 nucleocápside es la proteína nucleocápside (NP) que confiere simetría helicoidal en la cápside. En asociación con la nucleocápside están las proteínas P y L. La fosfoproteína (P), que es objeto de fosforilación, se considera que desempeña una función reguladora en la transcripción, y 15 puede estar involucrada en la metilación, fosforilación y poliadenilación. El gen L, que codifica una RNA polimerasa dependiente del RNA, se requiere para la síntesis de RNA viral junto con la proteína P. La proteína L, que capta casi la mitad de la capacidad codificante del genoma viral, es la 20 más grande de las proteínas virales, y desempeña una función importante en la transcripción y replicación. La replicación de todos los virus de RNA de hebra negativa, incluido el NDV, es complicada por la ausencia de maquinaria celular necesaria para replicar el RNA. Además, 25 el genoma de hebra negativa no puede ser traducido directamente en proteína, sino que debe primero ser transcrito en una copia de hebra positiva (mRNA) . Por tanto, con la entrada en una célula hospedadora, el RNA genómico • solo no puede sintetizar la RNA polimerasa dependiente del 5 RNA. Las proteínas L, P y NP deben entrar a la célula junto con el genoma durante la infección. En teoría, la mayor parte o todas las proteínas virales que transcriben el mRNA del NDV también realizan su replicación. El mecanismo que regula los usos alternativos 10 (es decir, transcripción o replicación) del mismo • complemento de proteínas no ha sido identificado claramente pero parece que involucra la abundancia de las formas libres de una o más de las proteínas de la nucleocápside, en particular, la NP. Directamente después de la penetración 15 del virus, se inicia la transcripción mediante la proteína L utilizando el RNA de sentido negativo en la nucleocápside como una plantilla. La síntesis de RNA viral es regulada de modo que se producen los mRNA monocistrónicos durante la transcripción. 20 Después de la transcripción, la replicación del genoma del virus es el segundo suceso esencial en la infección por virus de RNA de hebra negativa. Al igual que con otros virus de RNA de hebra negativa, la replicación del genoma viral en el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) es mediada por 25 proteínas específicas del virus. Los primeros productos de la síntesis de RNA replicativo son copias complementarias (es decir, polaridad más) del RNA del genoma de NDV (cRNA) . Estas copias de hebra más (anti-genomas) difieren de los • transcritos de mRNA de hebra positiva en la estructura de 5 sus zérminos. A diferencia de los transcritos de mRNA, los cRNA anti-genómicos no están coronados y metilados en los 5' terminales, y no están truncados ni poliadenilados en los 3' terminales. Los cRNA son co-terminales con sus plantillas de hebra negativa y contienen toda la información genética en 10 cada segmento de RNA genómico en la forma complementaria. Los cRNA sirven como plantillas para la síntesis de los genomas virales de hebra negativa (vRNA) del NDV. Tanto los genomas de hebra negativa del NDV (vRNA) como los anti-genomas (cRNA) son encapsidados por proteínas de la 15 nucleocápside; la única especie de RNA no encapsidada son los mRNA del virus. Para el NDV, el citoplasma es el sitio de replicación del RNA del virus, también es el sitio para la transcripción. El montaje de los componentes virales parece tomar lugar en la membrana plasmática de la célula 20 hospedadora y el virus maduro se libera por gemación. 2.2 MANIPULACIÓN DEL VIRUS DE RNA DE HEBRA NEGATIVA Las RNA polimerasas dirigidas al RNA de virus de animales han sido ampliamente estudiadas con respecto a 25 múltiples aspectos de la estructura de la proteína y i^^&m^ hli-HN-H-.--1- ^ -•"-* - ---,.- ,..!.. fimitm?"*'* condiciones de reacción. No obstante, los elementos del RNA plantilla que favorecen la expresión óptima mediante la polimerasa solo podrían ser estudiados por inferencia • utilizando las secuencias de RNA viral existentes. Este 5 análisis del promotor es de interés dado que se desconoce el modo en que una polimerasa viral reconoce los RNA virales específicos de entre los múltiples RNA codificados por el hospedador que se encuentran en una célula infectada. Los virus de animales que contienen RNA de genoma en 10 sentido positivo pueden ser replicados cuando el RNA proveniente del plásmido se introduce en las células por transfección (por ejemplo, Racaniello y col., 1981, Science 214: 916-919; Levis, y col., 1986, Cell 44: 137-145). En el caso de poliovirus, la polimerasa purificada replicará un 15 RNA genómico en reacciones in vitro, y cuando esta preparación de RNA de sentido positivo es transfectada a las células es infecciosa (Kaplan y col., 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82: 8424-8428). No obstante, se desconocen los elementos plantilla que sirven como promotor de la 20 transcripción para la polimerasa codificada por el poliovirus dado que incluso los homopolímeros de RNA pueden ser copiados (Ward y col., 1988, J. Virol. 62: 558-562). También se han utilizados los transcritos SP6 para producir los RNA interferentes defectivos (DI) modelo para el genoma 25 viral Sindbis. Cuando el RNA se introduce en células infectadas, éste se replica y empaca. Las secuencias de RNA que fueron responsables del reconocimiento de la polimerasa viral Sindbis y el empacado del genoma en partículas del virus, según se demostró, están dentro de los 162 nucleótidos (nt) del 5' terminal y 19 nt del 3' terminal del genoma (Levis y col., 1986, Cell 44: 137-145). En el caso del virus de mosaico bromado (BMV) , un virus de plantas con RNA de hebra positiva, los transcritos SP6 han sido utilizados para identificar el promotor como un 3' terminal tipo tRNA de 134 nt (Dreher y Hall, 1988, J. Mol. Biol 201: 31-40) . Se demostró que el reconocimiento y síntesis de la polimerasa dependen de la secuencia y características estructurales secundarias (Dreher y col., 1984, Nature 311: 171-175) . Los virus de RNA de sentido negativo han sido refractarios para el estudio de los requisitos de secuencias de la replicasa. La polimerasa purificada del virus de estomatitis vesicular solo es activa durante la transcripción cuando se incluyen como plantilla complejos de ribonucleoproteína (RNP) provenientes de virus (De y Banerjee, 1985, Biochem. Biophys. Res. Commun. 126: 40-49; Emerson y Yu, 1975, J. Virol. 15: 1348-1356; Naito y Ishihama, 1976, J. Biol. Chem. 251: 4307-4314). Con respecto a los virus de influenza, se reportó que el RNA desnudo purificado de virus se utilizó para reconstituir los RNP. __--i£ _-¿_ ----- -_---. > — -- - - ». - . . - ^Á~* ¡b* Las proteínas virales de la nucleocápside y polimerasa fueron purificadas en gel y renaturalizadas en el RNA viral utilizando tioredoxina (Szewczyk, y col., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 7907-7911). No obstante, estos autores no mostraron que la actividad de la preparación fue específica para el RNA viral de influenza, ni analizaron las señales que favorecen la transcripción. Solo en fechas recientes ha sido posible recuperar los virus de RNA de hebra negativa utilizando un planteamiento de genética inversa recombinante (Patente Estadounidense No. 5,166,057 de Palese y col.). Aunque este método originalmente fue aplicado para manipular genomas virales de influenza (Luytjes y col., 1989, Cell 59: 1107-1113; Enami y col., 1990, Proc. Nati. Acad Sci. USA 92: 11563-11567), se ha aplicado con buenos resultados a una amplia variedad de virus de RNA de hebra negativa segmentados y no segmentados, incluidos los virus de rabia (Schnell y col., 1994, EMBO J. 13: 4195-4203); virus sincitial respiratorio (Collins y col., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 9663-9667); y el virus de Sendai (Park y col., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 38: 5537-5541; Kato y col., 1996, Genes Cells 1: 569-579) . Sin embargo, este enfoque todavía tiene que ser aplicado a los genomas de RNA del virus de la enfermedad de Newcastle. 3. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Se describen las plantillas de RNA viral de la enfermedad de Newcastle, recombinantes que pueden ser • utilizadas con RNA polimerasa dirigida al RNA para expresar 5 productos génicos heterólogos en células hospederas adecuadas y/o para rescatar el gen heterólogo en partículas del virus. En una modalidad, la invención se refiere a los virus de la enfermedad de Newcastle, recombinantes, que inducen el interferón y vías relacionadas. La presente 10 inverción se refiere a los virus de la enfermedad de • Ne castle, recombinantes, que contienen modificaciones que culminan en los fenotipos que hacen al virus recombinante más adecuado para uso en formulaciones de vacunas, por ejemplo, los fenotipos atenuados e inmunogenicidad mejorada. 15 En otra modalidad, la presente invención se refiere a la manipulación de los virus de la enfermedad de Newcastle, recombinantes y vectores virales que contienen genes heterólogos que incluyen genes de otros virus, patógenos, genes celulares, antígenos de tumor, etcétera. 20 En otra modalidad, la presente invención se refiere a la manipulación de virus de la enfermedad de Newcastle, recoirbinantes y vectores virales para uso como vacunas. La presente invención se refiere a las formulaciones de vacunas convenientes para administración a humanos, así como para 25 uso •veterinario. Las vacunas de la presente invención pueden ser diseñadas para administración para animales domésticos, incluidos gatos y perros; animales salvajes, incluidos zorros y mapaches; ganado y aves, incluidos caballos, ganado vacuro, ovejas, pavos y pollos. En todavía otra modalidad, la invención se refiere a los vectores virales de la enfermedad de Newcastle, recombinantes y virus que son manipulados para codificar genes virales de la enfermedad de Newcastle, mutantes, o para codificar combinaciones de genes a partir de diferentes cepas de virus de la enfermedad de Newcastle. Las plantillas de RNA de la presente se preparan mediante la transcripción de eecuencias de DNA adecuadas con una RNA polimerasa diricida al DNA. Las plantillas de RNA resultantes son de polaridad negativa y contienen secuencias terminales adecuadas que permiten que el aparato para síntesis de RNA viral reconozca la plantilla. De otro modo, también es posible utilizar plantillas de RNA de polaridad positiva que contengan secuencias terminales adecuadas que permitan que el aparato para sintetizar RNA viral reconozca la plantilla. La expresión de las plantillas de RNA de polaridad positiva puede obtenerse por transfección de plásmidos que tengan promotores que sean reconocidos por la RNA polimerasa dependiente del DNA. Por ejemplo, el DNA plásmido que codifica las plantillas de RNA positivas bajo el control de un promotor T7 puede ser utilizado en combinación con el __t» i-«i. ?. ,_,... A-.«A . --»..-. ,_- . .... .. .. . . . . .s?Alrt sistema T7 de virus de vaccinia. Los mRNA bicistrónicos pueden ser construidos para permitir iniciación interna de la traducción de secuencias • virales y permitir la expresión de proteína extraña que 5 codifique las secuencias desde el sitio de iniciación terminal normal, o viceversa. De otro modo, es posible expresar una proteína extraña a partir de la unidad transcripcional interna en la cual la unidad transcripcional tiene un sitio de iniciación y un sitio de poliadenilación. ^^ 10 En otra modalidad, el gen extraño se inserta en un gen de NDV de modo que la proteína de expresión resultante es una proteína de fusión. Las plantillas de RNA viral de la enfermedad de Newcastle, mutantes, recombinantes de la presente invención 15 pueden ser utilizadas para transfectar líneas de células transformadas que expresen la RNA polimerasa dependiente del RNA permitan la complementación. De otro modo, un plásmido que exprese desde un promotor adecuado, puede ser utilizado • para transfección de RNA específico del virus (quimérico) . 20 La complementación también se puede lograr con el uso de un virus auxiliador que proporcione la RNA polimerasa dependiente del RNA. Además, también se describe un sistema de replicación no dependiente de virus para el virus de la enfermedad de Newcastle. El subconjunto mínimo de proteínas 25 de virus de la enfermedad de Newcastle necesario para la replicación y expresión específica del virus son las tres proteínas L, P y NP, que pueden ser expresadas a partir de plásmidos por un sistema T7 de virus de vaccinia. En todavía otra modalidad, cuando se utilizan plásmidos que codifican la copia antigenómica del genoma NDV para suministrar el genoira viral, el subconjunto mínimo de proteínas de virus de la enfermedad de Ne castle necesaria para la replicación y expresión específica del virus son las proteínas L y P. Cuando se transcribe la copia antigenómica del genoma de NDV, la proteína NP polimerasa es la proteína que se transcribe primero, de este modo no es necesario proporcionar además la NP polimerasa en trans . Los productos de expresión y/o viriones quiméricos obtenidos pueden utilizarse convenientemente en formulaciones de vacunas. Los productos de expresión y viriones quiméricos de la presente invención pueden ser manipulados para crear vacunas contra una amplia gama de patógenos, que incluyen los antígenos virales, antígenos tumorales y auto-antígenos involucrados en trastornos autoinmunes. En particular, los viriones quiméricos de la presente invención pueden ser manipulados para crear vacunas anti-VIH, en donde el polipéptido inmunogénico de gpldO, y/o de las proteínas internas del VIH se manipulan en la proteína glucoproteína HN para construir una vacuna que pueda producir respuestas inmunitarias humorales y mediadas •jTlHiTttt'-liflir- - - - ,»-«--.--n--.»^ * ... -- ... . ^ i irifliiiBf-fif- por células en vertebrados. El uso del virus de la enfermedad de Newcastle recombinante para este propósito es especialmente atractivo, dado que el virus de la enfermedad • de Newcastle no es patógeno en humanos. El uso del virus de 5 la enfermedad de Ne castle recombinante para el suministro de antígenos de tumor es particularmente atractivo dadas las propiedades antineoplásicas e inmunopotenciadoras conocidas del irus. 10 3.1 DEFINICIONES • Cuando se utiliza en la presente, los siguientes términos tendrán los significados que se indican: cRNA = RNA antigenómico VIH = virus de inmunodeficiencia humana 15 L = proteína larga M = proteína matriz (reviste el interior de la envoltura) MDCK = células de riñon canino Madin Darby • MDBK = células de riñon de bovino Madin Darby 20 moi = multiplicidad de la infección NA = neuraminidasa (glucoproteína de la envoltura) NDV = virus de la enfermedad de Ne castle NP = nucleoproteína (asociada con RNA y necesaria para la actividad de la polimerasa) 25 NS = proteína no estructural (función desconocida) nt = nucleótido \ PA, PB1, PB2 = componentes RNA polimerasa dirigida al RNA. RNP = ribonucleoproteína 5 rRNP = RNP recombinante vRNA = RNA del virus, genómico WSN = virus A/WSN/33 de influenza. Virus WSN-HK: virus de reordenamiento que contiene siete genes del virus WSN y el gen NA del virus A/HK/8/68 0 de influenza. 4. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Representación esquemática del minigenoma NDV. La ilustración superior representa el plásmido PNDVCAT que 5 incluye el promotor T7; la secuencia 5' terminal (el extremo 5' del RNA genómico, 191 nt) ; nucleótidos insertados (CTTAA) ; 667 nt del CAT ORF; la secuencia 3' terminal (extremo 3' del RNA genómico, 121 nt) los sitios Bbsl y nucleasa [sic] . La ilustración inferior representa el NDV-0 CAT RNA quimérico resultante de la transcripción in vitro. Como resultado de la amplificación y transcripción a base de NDV del minigenoma quimérico NDV-CAT, la actividad CAT se detecta en las células transfectadas. La Figura 2A-C. Representación esquemática de los 5 vectores de expresión PTMI .

PTM1-NP codifica la proteína NP del NDV. PTM1-P codifica la proteína P del NDV. PTM1-L codifica la proteína L de NDV. Figura 3. Secuencia de RNA de las regiones terminales no 5 codificadoras 5' y 3' del NDV (sentido más) . Las secuencias 5' para el gen CAT representa 121 nt de la región terminal no codificadora 5' del genoma en sentido positivo del NDV conteniendo 65 nt de la secuencia líder (en negritas) seguido por 56 nt del UTR del gen NP. Las secuencias 3' para 10 el gen CAT representan los nucleótidos insertado cuuaa (en • minúsculas) y 121 nt de la región terminal no codificadora del genoma de sentido positivo del NDV conteniendo 127 nt del UTR del gen L seguido por 64 nt de la región de la cola (en negritas) . 15 Figura 4A-B. Representación esquemática de una estructura de los clones de NDV recombinantes. La Figura 4B es la representación del NDV infeccioso expresando Env y Gag del VIH. En la parte superior Env y Gag del VIH están entre los genes M y L. En la parte inferior Env y Gag del VIH 20 están 3' para el gen NP. Figura 5. Representación esquemática de los términos 3' y 5' del NDV alineados con la secuencia de Kurilla y col., 1985 Virology 145: 203-212 (términos 3') y Yusoff y col., 1987 Nucleic Acids Research 15: 3961-3976 (términos 5'). 25 Figura 6. Genética inversa basada en plásmido para la expresión basada en NDV de un gen extraño. Las células están infectadas con el virus de vaccinia recombinante expresando T7 polimerasa. Además, las células están transfectadas con: 1) los DNA plásmidos que codifican las proteínas L, NP y P 5 del NDV bajo el control transcripcional de un promotor T7 (pTMl-L, pTMl-NP y pTMl-P, respectivamente) y 2) un DNA plásrrido que codifica un minigenoma NDV-CAT quimérico bajo el control transcripcional de un promotor T7 (pT7-NDV-CAT- RB) . El extremo 3' adecuado del minigenoma NDV-CAT se 10 obtiene dependiendo de la disociación facilitada a través de • una secuencia de ribozima (RB) . La amplificación y transcripción del minigenoma quimérico NDV-CAT da origen a la actividad CAT detectable en las células transfectadas. Las regiones no codificadoras en los extremos 3' y 5' del 15 minigenoma NDV-CAT están representados como cuadros negros. Figura 7. Rescate del NDV a partir de DNA sintético. Las células son infectadas con un virus de vaccinia recombinante expresando T7 polimerasa. Además, las células son • transfectadas con: 1) DNA plásmidos que codifican las 20 proteínas L, NP y P del NDV bajo el control transcripcional de un promotor T7 (pTMl-L, pTMl-NP y pTMl-P, respectivamente) y 2) un DNA plásmido que codifica el antigenoma de NDV bajo el control transcripcional de un promotor T7 (pT7-NDV+-RB) . El extremo 3' adecuado del 25 antigenoma NDV se obtiene dependiendo de la disociación iftñitfrft T - -** * " — -> facilitada a través de una secuencia de ribozima (RB) . La amplificación y transcripción del antigenoma de NDV da origen al rescate de los virus NDV infecciosos. Las regiones • no codificadoras en las extremos 3' y 5' del antigenoma NDV 5 están representadas como cuadros negros. Figura 8. Expresión basada en NDV de un gen extraño insertado como una unidad transcripcional interna en el antigenoma NDV. Las células están infectadas con un virus de vaccinia recombinante expresando T7 polimerasa. Además, las 10 células son transfectadas con: 1) los DNA plásmidos que • codifican las proteínas L, NP y P del NDV bajo el control transcripcional del promotor T7 (pTMl-L, pTMl-NP y pTMl-P, respectivamente) y 2) un DNA plásmido que codifica un antigenoma NDV-CAT quimérico bajo el control transcripcional 15 de ur promotor T7 (pT7-NDV-CAT-RB) . En el antigenoma NDV-CAT quimérico, el marco de lectura abierto CAT sustituye el marco de lectura abierto HN que ocurre en la naturaleza del antigenoma del NDV tipo silvestre. El extremo 3' adecuado del antigenoma NDV-CAT quimérico se obtiene dependiendo de 20 la disociación facilitada a través de una secuencia de ribozima (RB) . La amplificación y transcripción del antigenoma NDV-CAT quimérico da origen a la actividad CAT detectable en las células transfectadas. Las regiones no codificadoras en los extremos 3' y 5' del antigenoma NDV-CAT 25 quimérico están representadas en cuadros negros. 5. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a los virus de la enfermedad de Newcastle genéticamente manipulados y los vectores virales que expresan genes heterólogos o genes virales de la enfermedad de Newcastle mutados o una combinación de genes virales derivados de diferentes cepas de virus de la enfermedad de Newcastle. La invención se refiere a la construcción y uso de las plantillas de RNA viral de NDV de hebra negativa, recombinantes que pueden ser utilizadas con RNA polimerasa dirigida al RNA, viral para expresar productos génicos heterólogos en células hospedadoras adecuadas y/o para rescatar el gen heterólogo en partículas del virus. En una modalidad específica de la invención, el producto génico heterólogo es un péptido o proteína proveniente del genoma de un virus de inmunodeficiencia humana. Las plantillas de RNA de la presente invención pueden ser preparadas in vitro ó in vivo por transcripción de las secuencias de DNA adecuadas utilizando RNA polimerasa dirigida al DNA como puede ser el bacteriófago T7, T3, la SP6 polimerasa o una polimerasa eucariótica como la polimerasa I. Las plantillas de RNA recombinantes pueden utilizarse para transfectar líneas de células continuas/transfectadas que expresen las proteínas RNA polimerasa dirigidas al RNA permitiendo la complementación, como se demuestra por medio -í Á áí L á MÉ *. de los ejemplos de trabajo en los cuales los transcritos de RNA del DNA clonado que contienen la región codificadora —en orientación en sentido negativo— del gen de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) , flanqueada por los nucleótidos 5' terminal y el 3' terminal del RNA de NDV-CL (cepa California/11914/cepa tipo 1944) (Meindl y col., 1974 Virology 58: 457-463) fueron transfectados en células que expresan las proteínas polimerasa del NDV. En una modalidad preferida, se utiliza un sistema de replicación no dependiente de virus para recuperar el NDV quimérico, en el cual el DNA plásmido que codifica el genoma o antigenoma de NDV se co-expresa con el DNA plásmido que codifica el subconjunto mínimo de proteínas del virus de la enfermedad de Newcastle necesario para la replicación y expresión específica del virus, según se demuestra por medio del ejemplo de trabajo como se describe infra . La capacidad para reconstituir NDV in vivo permite el diseño de virus NDV quiméricos, novedosos que expresen genes extraños o que expresen genes NDV mutantes. La capacidad para reconstituir NDV in vivo también permite el diseño de los NDV quiméricos, novedosos que expresen genes de diferentes cepas de NDV. Una forma de alcanzar este objetivo incluye modificar los genes de NDV existentes. Por ejemplo, el gen de HN puede ser modificado para contener secuencias extrañas en sus dominios externos. Donde la secuencia ' - -'-^rBirrmtli heteróloga son epítopes o antígenos de patógenos, estos virus quiméricos pueden ser utilizados para inducir una respuesta inmunitaria protectora contra el agente de la enfermedad del cual provienen estos determinantes. De acuerdo con la presente invención, se construye un RNA quimérico en el cual una secuencia codificadora proveniente de la región codificadora gpl60 del virus de inmunodeficiencia humana se inserta en la secuencia codificadora HN de NDV, y se produce el virus quimérico a partir de la transfección de este segmento de RNA quimérico en una célula hospedadora infectada con el NDV tipo silvestre. Además, un virus quimérico así debe ser capaz de producir una respuesta inmunitaria humoral y mediada por células en vertebrados. La presente invención además se refiere a la inducción del interferón y las vías relacionadas mediante virus de NDV recombinantes o quiméricos. La presente invención se refiere al uso de los vectores virales y virus quiméricos de la invención para formular vacunas contra una amplia gama de virus y/o antígenos que incluyen los antígenos tumorales. Los vectores virales y virus quiméricos de la presente invención pueden ser utilizados para modular un sistema inmunitario del individuo estimulando una respuesta inmunitaria humoral, una respuesta inmunitaria celular o estimulando la tolerancia a un * » • * » ^a-^a-A--. antígeno. Cuando se utiliza en la presente, un individuo significa: humano, primates, caballos, vacas, ovejas, cerdos, cabras, perros, gatos, especies aviarias y roedores. Cuando se suministran, antígenos de tumor, la invención 5 puede ser utilizada para tratar a individuos que tengan una enfermedad manejable para rechazo mediado por inmunidad, como pueden ser tumores no sólidos o tumores sólidos de tamaño pequeño. También se contempla que el suministro de antígenos de tumor mediante los vectores virales o virus 10 quiméricos descritos en la presente será útil para el • tratamiento subsiguiente para eliminar tumores sólidos grandes. La invención también puede ser utilizada para tratar individuos de los que se sospeche tienen cáncer. La invención puede ser dividida en las siguientes etapas 15 solamente para el propósito de descripción y no como limitación: a) la construcción de plantillas de RNA recombinantes; b) la expresión de productos génicos heterólogos utilizando las plantillas de RNA recombinante; y • c) eí rescate del gen heterólogo en partículas de virus 20 recombinantes. Para claridad de la descripción, la invención se describe en los siguientes ejemplos de trabajo utilizando NDV-CL (cepa California/11914/cepa tipo 1944), no obstante es posible utilizar cualquier cepa de NDV. 25 5.1 CONSTRUCCIÓN DE PLANTILLAS DE RNA RECOMBINANTE Una modalidad específica de la presente invención es la identificación por parte de los solicitantes de la secuencia de nacleótidos correcta de los términos 5' y 3' del RNA 5 genómico de sentido negativo del NDV. La secuencia de nucleótidos de los términos 5' y 3' del RNA del genoma en sentido negativo de NDV de la presente invención difiere en gran medida de la secuencia 3' terminal del NDV anteriormente descrita como se muestra en la Figura 5. La 10 identificación de la secuencia correcta de los nucleótidos • de los términos 5' y 3' del NDV permite por primera vez la manipulación de las plantillas de RNA recombinantes de NDV, la expresión de las plantillas de RNA recombinante y el rescate de las partículas de NDV recombinantes. La presente 15 invención comprende no solo los términos 5' y 3' que tienen la secuencia de nucleótidos como se muestra en la Figura 5, sino también comprende cualquiera de las modificaciones o mutaciones a los términos o cualquiera de los fragmentos de • estos que todavía conserven la función de los términos tipo 20 silvestre, es decir, las señales necesarias para que el aparato para sintetizar RNA viral reconozca la plantilla. Las secuencias codificadores del gen heterólogo flanqueadas por el complemento del sitio de unión/promotor de la polimerasa viral, por ejemplo, el complemento del 25 término 3' del virus de NDV de la presente invención, o los ........ complementos de los términos 3' y 5' del virus de NDV pueden ser construidas utilizando las técnicas bien conocidas. Las plantillas de RNA resultantes pueden ser de polaridad negativa y contener secuencias terminales adecuadas que permitan al aparato para sintetizar RNA viral reconocer la plantilla. De otro modo, las plantillas de RNA de polaridad positiva que contengan las secuencias terminales adecuadas que permitan que el aparato para sintetizar RNA reconozcan la plantilla también pueden ser utilizadas. Las moléculas de DNA recombinante que contienen estas secuencias híbridas pueden ser clonadas y transcritas por una RNA polimerasa dirigida al DNA, como puede ser el bacteriófago T7, T3, la SP6 polimerasa o polimerasa eucariótica como puede ser la polimerasa I y similares, para producir in vitro ó in vivo las plantillas de RNA recombinantes que posean las secuencias virales adecuadas que permitan el reconocimiento y actividad de la polimerasa viral. En todavía otra modalidad, casi cualquier secuencia heteróloga puede ser construida en los virus quiméricos de la presente invención, que incluyen, pero no se limitan a antígenos como pueden ser: 1) antígenos que sean característicos de un patógeno; 2) antígenos que sean característicos de una enfermedad autoinmune; 3) antígenos que sean característicos de un alérgeno; y 4) antígenos que sean característicos de un tumor. Por ejemplo, las -&w-- secuencias de los genes heterólogos que pueden ser manipuladas en los virus quiméricos de la invención incluyen, pero no se limitan a, epítopes del virus de inmunodeficiencia humana (VIH), como puede ser gpl60; el 5 antígeno superficial del virus de hepatitis B (HBsAg) ; las gluccproteínas de virus herpético (por ejemplo gD, gE) ; VP1 de poliovirus; y determinantes antigénicos de patógenos no virales como bacterias y parásitos, por mencionar solo algunos . 10 Los antígenos que son característicos de enfermedad autoinmune por lo común serán obtenidos de la superficie celular, citoplasma, núcleo, mitocondria y similares de los tejidos de mamífero, incluidos los antígenos característicos de diabetes mellitus, esclerosis múltiple, lupus eritematoso 15 sistémico, artritis neumatoide, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, escleroderma, gastritis atrófica autoinmune, diabetes juvenil y lupus eritematoso discoide. Los antígenos que son alérgenos generalmente son proteínas o glucoproteínas, incluidos los antígenos 20 provenientes de polen, polvo, moho, esporas, caspa, insectos y alinentos. Los antígenos que son característicos de antígenos tumorales por lo común serán obtenidos de células superficiales, citoplasma, núcleo, organelos y similares de 25 las células del tejido tumoral. Los ejemplos incluyen m^g* **** ****^ • •' •- - - -- <~- antígenos característicos de las proteínas del tumor, incluidas las proteínas codificadas por oncógenos mutados; proteínas virales asociadas con tumores; y glucoproteínas.

• Los tumores incluyen, pero no se limitan a, aquellos 5 provenientes de los tipos de cáncer: de labios, nasofaringe, faringe y cavidad oral, esófago, estómago, colon, recto, hígado, vesícula biliar, páncreas, laringe, pulmón y bronquios, melanoma de piel, mama, cervix, uterino, de ovario, vejiga, riñon, útero, cerebro y otras partes del 10 sistema nervioso, tiroides, próstata, testes, enfermedad de • Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple y leucemia. En una modalidad específica de la invención, las secuencias heterólogas se obtienen del genoma del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , de preferencia el virus de 15 inmunodeficiencia humana-1 o el virus de inmunodeficiencia humana-2. En otra modalidad de la invención, las secuencias codificantes heterólogas pueden ser insertadas dentro de una secuencia codificadora del gen de NDV de modo que se exprese un producto génico quimérico que contenga la secuencia de 20 péptidos heterólogos dentro de la proteína viral de NDV. En tal modalidad de la invención, las secuencias heterólogas también pueden obtenerse del genoma de un virus de inmunodeficiencia humana, de preferencia el virus de inmunodeficiencia humana-1 o el virus de inmunodeficiencia 25 humana-2.

En casos por medio de los cuales las secuencias heterólogas se obtienen del VIH, tales secuencias pueden incluir, pero no se limitan a las secuencias provenientes del gen env (es decir, secuencias que codifiquen todo o parte de gpldO, gpl20 y/o gp41) , el gen pol (es decir, las secuencias que codifican toda o parte de la inverso transcriptasa, endonucleasa, proteasa y/o integrasa) , el gen gag (es decir, secuencias que codifican todo o parte de p7, p6, p55, pl7-18, p24-25) tat, rev, nef, vif, vpu, vpr y/o vpx. En todavía otra modalidad, las secuencias del gen heterólogo que pueden ser manipuladas en virus quiméricos incluyen aquellas que codifican proteínas con actividades inmunopotenciadoras. Los ejemplos de las proteínas inmunopotenciadoras incluyen, pero no se limitan a citocinas, interferón tipo 1, interferón gamma, factores estimuladores de colonias, interleucina 1, 2, 4, 5, 6, 12. Un enfoque para construir estas moléculas híbridas es insertar la secuencia codificadora heteróloga en un complemento de DNA de un gen de NDV de modo que la secuencia heteróloga sea flanqueada por las secuencias virales necesarias para la actividad de la polimerasa viral; es decir, el sitio de unión/promotor de la polimerasa viral, en adelante mencionado como el sitio de unión de la polimerasa viral, y un sitio de poliadenilación. En una modalidad preferida, la secuencia codificadora heteróloga está flanqueada por secuencias virales que comprenden los promotores de la replicación de los términos 5' y 3' , las secuencias de inicio del gen y del término del gen, y 5 señales de empacado que se encuentran en los términos 5' y/o 3' . En el método alternativo, los oligonucleótidos que codifican el sitio de unión de la polimerasa viral, por ejemplo, el complemento del término 3' o ambos términos de los segmentos genómicos del virus pueden estar ligados a la 10 secuencia codificadora heteróloga para construir la molécula • híbrida. La colocación de un gen extraño o segmento de un gen extraño dentro de una secuencia elegida anteriormente era dictada por la presencia de sitios de la enzima de restricción adecuados dentro de la secuencia elegida. Sin 15 embargo, avances recientes en la biología molecular han reducido este problema en gran medida. Los sitios de la enzima de restricción pueden ser colocados fácilmente en cualquier parte dentro de una secuencia elegida mediante el • uso de mutagénesis dirigida al sitio (por ejemplo, véase, 20 por ejemplo las técnicas descritas por Kunkel, 1985, Proc. Nati. Acad. Sci. EU. 82; 488) . Las variaciones en la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , descritas infra, también permiten la inserción específica de secuencias (es decir, sitios de la enzima de restricción) y 25 permiten la construcción fácil de moléculas híbridas. De -..^-tt-^itai-ll«?aa-,..J.......... --.... ..»,., . . -• - . . ?_M >, ,. . -~ -t-f-' * . •."•ff.lffa^® otro modo, se podría utilizar las reacciones de la PCR para preparar plantillas recombinantes sin la necesidad de clonación. Por ejemplo, sería posible utilizar reacciones de • la PCR para preparar moléculas de DNA bicatenarias 5 conteniendo el promotor de la RNA polimerasa dirigida al DNA (por ejemplo bacteriófago T3, T7 ó SP6) y la secuencia híbrida que contenga el gen heterólogo y el sitio de unión a la polimerasa del NDV. Las plantillas de RNA entonces podrían ser transcritas directamente desde este DNA 10 reco-rbinante. En todavía otra modalidad, las plantillas de RNA recombinante pueden ser preparadas ligando los RNA que especifiquen la polaridad negativa del gen heterólogo y el sitio de unión de la polimerasa viral utilizando RNA ligasa. Los requisitos de las secuencias para la actividad de la 15 polimerasa viral y las construcciones que pueden ser utilizadas de acuerdo con la invención están descritos en las subsecciones siguientes. 5.1.1 INSERCIÓN DE LA SECUENCIA DEL GEN HETERÓLOGO EN LOS 20 GENES HN, P, NP, M, F, L Los segmentos del gen que codifican para las proteínas HN, P, NP, M, F ó L pueden utilizarse para la inserción de los productos génicos heterólogos. La inserción de una secuencia génica extraña en cualquiera de estos segmentos 25 puede lograrse mediante un reemplazo completo de la región _^yg^^ codificadora viral con el gen extraño o por un reemplazo parcial. El reemplazo completo probablemente se llevaría a cabo mejor a través del uso de mutagénesis dirigida PCR. En • resurren, un iniciador de PCR A contendría, desde el extremo 5 5' al 3' : un sitio de la enzima de restricción único, como puede ser un sitio de la enzima de restricción clase IIS (es decir, una enzima "desplazadora"; que reconozca una secuencia específica pero disocie el DNA corriente arriba o corriente debajo de esta secuencia) ; una extensión de 10 nucleótidos complementaria a una región del gen de NDV; y • una sxtensión de nucleótidos complementaria a la porción codificadora carboxilo terminal del producto génico extraño. El iniciador de la PCR B contendría desde el extremo 5' al 3' : un sitio de enzima de restricción único; una extensión 15 de nucleótidos complementaria a un gen de NDV; y una extensión de nucleótidos correspondiente a la porción codificadora 5' del gen extraño. Después de una reacción de la PCR utilizando estos iniciadores con una copia clonada • del gen extraño, el producto puede ser escindido y clonado 20 utilizando los sitios de restricción únicos. La digestión con La enzima clase IIS y la transcripción con la fago polimerasa purificada generaría una molécula de RNA conteniendo los extremos no traducidos exactos del gen de NDV con una inserción del gen extraño. En una modalidad 25 alternativa, las reacciones iniciadas de la PCR podrían ser - .Tili^- I-f-ri '-"^'' - - ' - '• t • - - utilizadas para preparar DNA bicatenaria conteniendo la secuencia promotora del bacteriófago, y la secuencia génica híbrida de modo que las plantillas de RNA puedan ser • transcritas directamente sin clonación. 5 5.1.2. INSERCIÓN DE LA SECUENCIA GÉNICA HETERÓLOGA EN EL GEN HN Las actividades de hemaglutinina y neuraminidasa del NDV se codifican por un solo gen, HN. La proteína HN es una 10 glucoproteína superficial importante del virus. Para una • variedad de virus, como influenza, las proteínas hemaclutinina y neuraminidasa se han demostrado que contienen un número de sitios antigénicos. En consecuencia, esta proteína es un objetivo potencial para la respuesta 15 inmune humoral después de la infección. Por tanto, la sustitución de sitios antigénicos dentro de la HN con una porción de una proteína extraña puede proporcionar una respuesta humoral vigorosa contra este péptido extraño. Si se inserta una secuencia dentro de la molécula HN y se 20 expresa en la superficie exterior de la HN sería inmunogénica. Por ejemplo, un péptido proveniente de la gpldO de VIH reemplazaría un sitio antigénico de la proteína HN, dando origen a la producción de respuesta inmunitaria humoral. En una perspectiva diferente, la secuencia del 25 péptido extraño puede ser insertada dentro del sitio antigénico sin suprimir (deleción) ninguna de las secuencias virales. Los productos de la expresión de tales construcciones pueden ser útiles en vacunas contra el antígeno extraño, y pueden en realidad circunvenir un problema descrito al principio, el de la propagación del virus recombinante en el hospedero vacunado. Una molécula HN intacta con una sustitución solamente en sitios antigénicos puede permitir la función HN y así permitir la construcción de un virus viable. Por tanto, este virus puede ser crecido sin La necesidad de funciones auxiliadoras adicionales. El virus también puede ser atenuado en otras formas para evitar algún peligro de escape accidental. Otras construcciones híbridas pueden prepararse para expresar proteínas sobre la superficie celular o habilitarlas para ser liberadas de la célula. Como una glucoproteína superficial, la HN tiene una secuencia señal amino terminal que puede ser disociada necesaria para el transporte a la superficie celular, y una secuencia carboxilo terminal necesaria para el anclaje a la membrana. Para expresar una proteína extraña intacta sobre la superficie celular puede ser necesario utilizar estas señales HN para crear una proteína híbrida. En este caso, la proteína de fusión puede ser expresada como una proteína de fusión separada de un promotor interno adicional. De otro modo, si solo están presentes las señales de transporte y el *» » •-- ft,¿,Y.^,.h-..'-v,, domirio de anclaje a la membrana esta ausente, la proteína puede ser secretada de la célula. 5.1.3. CONSTRUCCIÓN DE RNA BICISTRÓNICO Y EXPRESIÓN DE PROTEÍNA HETERÓLOGA El mRNA bicistrónico podría ser construido para permitir iniciación interna de la traducción de secuencias virales y permitir la expresión de las secuencias codificadoras de la proteína extraña a partir del sitio de iniciación terminal regular. De otro modo, una secuencia de mRNA bicistrónica puede ser construida en donde la secuencia viral se traduzca desde el marco de lectura abierto terminal, regular, aunque la secuencia extraña se inicia a partir de un sitio interno. Es posible utilizar ciertas secuencias del sitio de entrada del ribosoma interno (IRES) . Las secuencias IRES que se eligen deben ser muy cortas para no interferir con las limitaciones de empacado del virus de la enfermedad de Newcastle. Así pues, se prefiere que el IRES elegido para tal método bicistrónico sea no mayor que 500 nucleótidos de longitud, siendo preferido menos que 250 nucleótidos. Además, se prefiere que el IRES utilizado no comparta homología de secuencia o estructural con elementos picornavirales. Los elementos IRES preferidos incluyen, pero no se limitan a los IRES BiP de mamífero y el IRES de virus de hepatitis C.

De otro modo, es posible expresar una proteína extraña a partir de una nueva unidad transcripcional interna en la cual la unidad transcripcional tiene un sitio de iniciación y un sitio de poliadenilación. En otra modalidad, el gen extraño se inserta en un gen de NDV de modo que la proteína expresada resultante sea una proteína de fusión. 5.2 EXPRESIÓN DE LOS PRODUCTOS GÉNICOS HETERÓLOGOS UTILIZANDO PLANTILLA DE RNA RECOMBINANTE Las plantillas recombinantes preparadas como ya se describió pueden ser utilizadas en diversas formas para expresar los productos génicos heterólogos en células hosp€'dadoras adecuadas o para crear virus quiméricos que expresen los productos génicos heterólogos. En una modalidad, la plantilla recombinante puede ser utilizada para transfectar células hospedadoras adecuadas, puede diricir la expresión del producto génico heterólogo a altos niveles. Los sistemas de células hospedadoras que proporcionan altos niveles de expresión incluyen líneas de células continuas que proporcionan funciones virales como pueden ser las líneas celulares superinfectadas con NDV, líneas ce células manipuladas para complementar funciones de NDV, etcétera. En una modalidad alternativa de la invención, las plantillas recombinantes pueden ser utilizadas para W t,-. -transfectar líneas celulares que expresen una proteína polimerasa viral para obtener la expresión del producto génico heterólogo. Para este fin, las líneas de células transformadas que expresan una proteína polimerasa como la proteína L pueden ser utilizadas como células hospedadoras adecuadas. Las células hospedadoras del mismo modo pueden ser manipuladas para proporcionar otras funciones virales o funciones adicionales como NP o HN. En otra modalidad, un virus auxiliador puede proporcionar la proteína RNA polimerasa utilizada por las células para obtener la expresión del producto génico heterólogo. En todavía otra modalidad, las células pueden ser transfectadas con vectores que codifiquen las proteínas virales como pueden ser las proteínas NP, P y L. Los ejemplos de tales vectores se ilustran en las Figuras 2a-2c. ¡5.3 PREPARACIÓN DEL VIRUS DE RNA DE HEBRA NEGATIVA, QUIMÉRICO Para preparar el virus quimérico, los RNA, cDNA o RNA del virus de NDV modificados que codifican para el genoma de NDV y/o las proteínas extrañas en el sentido más o menos pueden ser utilizados para transfectar células que proporcionen proteínas virales y funciones requeridas para la replicación y rescate o también son infectadas con un ^^^S^^^jtt^j^^^^^éwsj?^^=-^^-^,*^-^-virus de NDV "precursor". En un método alternativo, los plásmidos que codifican el RNA de NDV genómico o anticenómico, bien sea del tipo silvestre o modificado, pueden ser cotransfectados en células hospedadoras con plásmidos que codifiquen las proteínas polimerasa viral, por ejemplo, NP, P ó L. En otra modalidad, los plásmidos que codifican el RNA antigenómico de NDV pueden ser cotransfectados con plásmidos que codifican las proteínas polimerasa virales P y L, en vista de que la proteína NP polimerasa es la primera proteína transcrita por la copia antigenómica del genoma de NDV, no es necesario además proporcionar la NP polimerasa en trans. En una modalidad de la presente invención, es posible utilizar la técnica de la genética inversa para manipular los virus de RNA de hebra negativa, quiméricos, esta técnica incluye la preparación de los RNA virales, recombinantes, sintéticos que contengan las regiones no codificadoras del RNA viral de hebra negativa que son esenciales para el reconocimiento por las polimerasas virales y para empacar señales necesarias para generar un virión maduro. Los DNA y RNA plásmidos, recombinantes, pueden ser replicados y rescatados en partículas virales infecciosas por cualquiera de las diferentes técnicas conocidas, como está descrito en la Patente Estadounidense No. 5,166,057 publicada el 24 de noviembre de 1992; en la Patente Estadounidense No. 5,854,037, publicada el 29 de diciembre de 1999; en la publicación de la Patente Europea EP0702085A1, publicada el 20 oe febrero de 1996; en la Solicitud de la Patente Estadounidense serie No. 09/152845; en las publicaciones de 5 Patertes Internacionales del PCT WO97/12032 publicadas el 3 de abril de 1997; W096/34625 publicada el 7 de noviembre de 1996; en la publicación de la Patente Europea EP-A 780475; WO99/02657 publicada el 21 de enero de 1999; WO98/53078 publicada el 26 de noviembre de 1998; WO98/02530 publicada 10 el 22 de enero de 1998; W099/15672 publicada el 1 de abril de 1999; WO 98/13501 publicada el 2 de abril de 1998; WO 97/06270 publicada el 20 de febrero de 1997; y EPO 78047SA1 publicada el 25 de junio de 1997, cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su entereza. 15 Hay algunos métodos diferentes que pueden utilizarse para aplicar el enfoque de la genética inversa para rescatar virus de RNA de hebra negativa. En primer lugar, los RNA recombinantes se sintetizan a partir de una plantilla de DNA recombinante y se reconstituyen in vitro con el complejo de 20 la polimerasa viral purificado para formar ribonucleoproteínas recombinantes (RNP) que pueden ser utilizadas para transfectar células. En otro enfoque, se obtiene una transfección más eficiente si las proteínas polimerasa virales están presentes durante la transcripción 25 de los RNA sintéticos in vitro o in vivo . Con este enfoque, los RNA sintéticos pueden ser transcritos a partir de los cDNA plásmidos que sean co-transcritos in vitro con los cDNA plásmidos que codifican las proteínas polimerasa, o transcritos in vivo en presencia de las proteínas 5 polimerasa, es decir, en células que expresan de manera transitoria o constitutiva las proteínas polimerasa. En otra modalidad, es posible utilizar una combinación de técnicas de genética inversa y técnicas de reordenamiento para manipular virus atenuados que tengan epítopes deseados 10 en los virus de RNA segmentados. Por ejemplo, un virus • atenuado (generado por selección natural, mutagénesis o por técnicas de genética inversa) y una cepa portadora del epítope de vacuna deseado (generado por selección natural, mutagénesis o por técnicas de genética inversa) puede ser 15 co-transfectado en hospederos que permitan el reordenamiento de los genomas segmentados. Los reordenamientos que muestran el fenotipo atenuado y el epítope deseado pueden entonces ser seleccionados. Después del reordenamiento, los virus novedosos pueden 20 ser aislados y sus genomas pueden ser identificados por análisis de hibridación. En los enfoques adicionales en la presente descritos, la producción de virus quimérico infeccioso puede ser replicada en sistemas de células hospedadoras que expresen una proteína polimerasa viral de 25 NDV (por ejemplo en sistemas de expresión virus/célula hospedadora; en líneas de células transformadas manipuladas para expresar una proteína polimerasa, etc.), de modo que los virus quiméricos infecciosos sean rescatados. En este caso, no es necesario utilizar el virus auxiliador dado que esta función es proporcionada por las proteínas polimerasa virales expresadas. De acuerdo con la presente invención, es posible utilizar cualquier técnica conocida para los expertos para obtener la replicación y rescate de los virus quiméricos. Un enfoque involucra el suministro de proteínas virales y funciones requeridas para la replicación in vitro antes de transfectar las células hospedadoras. En tal modalidad, es posible suministrar proteínas virales en forma de virus tipo silvestre, virus auxiliadores, proteínas virales purificadas o proteínas virales expresadas de manera recombinante. Las proteínas virales pueden ser suministradas antes, durante o después de la transcripción de los cDNA o RNA sintéticos que codifican el virus quimérico. Es posible utilizar la mezcla completa para transfectar células hospedadoras. En otro enfoque, las proteínas y funciones virales necesarias para la replicación pueden ser suministradas antes o durante la transcripción de los cDNA o los RNA sintéticos que codifican el virus quimérico. En tal modalidad, las proteínas y funciones virales requeridas para la replicación son suministradas en la forma del virus tipo silvestre, el virus . <>a i? auxiliador, extractos virales, los cDNA o RNA sintéticos que expresen las proteínas virales se introducen en la célula hospedadora a través de infección o transfección. Esta • infección/transfección toma lugar antes de o simultánea a la 5 introducción de los cDNA o los RNA sintéticos que codifican el virus quimérico. En un enfoque particularmente deseable, las células manipuladas para expresar todos los genes virales de NDV pueden conducir a la producción de virus quimérico 10 infeccioso que contenga el genotipo deseado; eliminando así v-B^ la necesidad de un sistema de selección. En teoría, es posible sustituir cualquiera de los seis genes o parte de cualquiera de los seis genes de NDV con una secuencia extraña. No obstante, una parte necesaria de esta ecuación 15 es la capacidad para propagar el virus defectivo (defectivo porque falta o se altera el producto génico viral normal) . Existen algunos enfoques posibles para solucionar este problema, en un enfoque, un virus que tenga una proteína mutante puede ser crecido en líneas celulares que estén 20 construidas para expresar de manera constitutiva la versión tipo silvestre de la misma proteína. En esta forma, la línea celular complementa la mutación en el virus. Técnicas similares pueden utilizarse para construir líneas de células transformadas que expresen constitutivamente cualquiera de 25 los genes de NDV. Estas líneas celulares que se preparan para expresar la proteína viral pueden utilizarse para complementar el defecto en el virus recombinante y por este medie propagarlo. De otro modo, ciertos sistemas de rango de • hospedero natural pueden estar disponibles para propagar el 5 virus recombinante. En todavía otra modalidad, las proteínas y funciones virales necesarias para la replicación pueden ser suministradas como material genético en la forma de los cDNA o los RNA sintéticos de modo que éstos sean co-transcritos 10 con los cDNA o los RNA sintéticos que codifican el virus • quimérico. En un enfoque particularmente deseable, los plásmidos que expresan el virus quimérico y la polimerasa viral y/o otras funciones virales son co-transfectados en células hospedadoras, como se describe en los ejemplos. 15 Véase la Sección 12 supra . Otro método de propagación del virus recombinante puede incluir el co-cultivo con virus tipo silvestre. Esto se podría realizar simplemente tomando el virus recombinante y las células co-infectadoras con este y otro virus tipo 20 silvestre (de preferencia una cepa vaccinia) . El virus tipo silvestre debe complementar el producto génico del virus defectivo y permitir el crecimiento del virus natural y recombinante. De otro modo, el virus ayudador puede ser utilizado para soportar la propagación del virus 25 recombinante.

En otro enfoque, las plantillas sintéticas pueden ser repli cadas en células co-infectadas con los virus recombinantes que expresan la proteína polimerasa del virus • de NDV. De hecho, este método puede ser utilizado para 5 rescatar virus infecciosos recombinantes de acuerdo con la inverción. Para este fin, la proteína polimerasa del NDV puede ser expresada en cualquier sistema vector de expresión/célula hospedadora, que incluye pero no se limita a los vectores de expresión viral (por ejemplo, virus de 10 vaccinia, adenovirus, baculovirus, etc.) o líneas de células que expresan una proteína polimerasa (por ejemplo, véase Cristal y col., 1986, Proc. Nati. Acad. Sci. EU 83: 2709- 2713) . Más aún, la infección de las células hospedadoras que expresan las seis proteínas de NDV pueden originar la 15 producción de partículas de virus quimérico infecciosas. Este sistema eliminaría la necesidad de un sistema de selección, en vista de que todo el virus recombinante producido sería del genotipo deseado. Se debe señalar que puede ser posible construir un virus recombinante sin 20 alterar la viabilidad del virus. Estos virus alterados entonces serían crecidos competentes y no necesitarían funciones auxiliadoras para replicarse. 25 5.4 FORMULACIONES DE VACUNAS UTILIZANDO LOS VIRUS QUIMÉRICOS La invención comprende las formulaciones de vacunas que contienen el virus de RNA de hebra negativa manipulado de la • presente invención. La invención comprende el uso de virus 5 de NDV recombinantes que hayan sido modificados en formulaciones de vacunas para conferir protección L contra infección por NDV. En todavía otra modalidad, los virus de NDV recombinantes de la presente invención pueden ser utilizados como vehículo para expresar epítopes extraños que á^ 10 induzcan una respuesta protectora a cualquiera de una variedad de patógenos. La invención comprende formulaciones de vacunas para ser administradas a humanos y animales. En particular, la invención comprende formulaciones de vacunas que pueden ser 15 administradas a animales domésticos, incluidos perros y gatos, animales silvestres incluidos zorros y mapaches; y ganado incluido vacuno, caballos y cerdos, ovejas y cabras; y a aves, incluidos pollos y pavos. La invención comprende formulaciones de vacunas que son 20 útiles contra agentes causantes de enfermedades aviarias que incluyen NDV, el virus de la enfermedad de Marek (MDV) , virus de la enfermedad Bursal infecciosa (IBDV), virus de bronquitis infecciosa (IBV), virus de bursitis infecciosa, virus de anemia de pollo (CAV) , virus de laringotraqueritis 25 infecciosa (ILV), virus de leucosis aviaria (ALV), virus de reticuloendoteliosis (RV) y virus de influenza aviaria. En otra modalidad, la invención comprende formulaciones de vacuna que son útiles contra agentes causantes de enfermedades domésticas que incluye virus de rabia, virus de 5 leucemia felina (FLV) y virus del moquillo canino. En todavía otra modalidad, la invención comprende formulaciones de vacunas que son útiles para proteger al ganado contra virus de estomatitis vesicular, virus de rabia, virus de ictericia hematúrica, virus de viruela porcina y otras, para 10 proteger a los animales silvestres contra virus de rabia. Los virus atenuados generados por genética inversa pueden ser utilizados en las formulaciones de vacuna y farmacéuticas en la presente descritas. Las técnicas de genética inversa también pueden ser utilizadas para 15 manipular mutaciones adicionales a otros genes virales importantes para la producción de vacunas, es decir, los epítopes de variantes de cepas de vacuna útiles pueden ser manipuladas en virus atenuados. De otro modo, los epítopes completamente extraños, incluidos los antígenos provenientes 20 de otros patógenos virales o no virales pueden ser manipulados en la cepa atenuada. Por ejemplo, los antígenos de virus no relacionados como el VIH (gpldO, gpl20, gp41) antígenos parásitos (por ejemplo malaria), antígenos bacterianos o micóticos o antígenos de tumor pueden ser 25 manipulados en la cepa atenuada. De otro modo, los epítopes -«---a^lfffmrJitlTIi.-a-que alteran el tropismo del virus in vivo pueden ser manipulados en los virus atenuados, quiméricos de la invención. Casi cualquier secuencia génica heteróloga puede ser construida en virus quiméricos de la invención para uso en vacunas. De preferencia, los epítopes que inducen una respuesta inmunitaria protectora a cualquiera de una variedad de patógenos, o antígenos que se unen a los anticuerpos neutralizantes pueden ser expresados por o como parte de los virus quiméricos. Por ejemplo, las secuencias génicas heterólogas que pueden ser construidas en los virus quiméricos de la invención incluyen, pero no se limitan a glucoproteínas de influenza, en particular, hemaglutinina H5, H7, epítopes virales de la enfermedad de Marek; epítopes del ?rirus de la enfermedad bursal infecciosa (IBDV), virus de bronquitis infecciosa (IBV) , virus de anemia de pollo (CAV), virus de laringotraqueitis infecciosa (ILV), virus de leucosis aviaria (ALV) , virus de reticuloendoteliosis (RV) , virus de influenza aviaria (AIV) , virus de rabia, virus de leucemia de felino, virus de moquillo canino, virus de estomatitis vesicular, virus de ictericia hematúrica y virus de viruela porcina (véase Fields y col., (ed. ) , 1991, Fundamental Virology, segunda edición, Raven Press, New York, incorporada en la presente como referencia en su entereza) . <.--* ...--..^ En todavía otra modalidad, las secuencias génicas heterólogas pueden ser manipuladas en virus quiméricos que incluyen aquellos que codifican proteínas con actividades inmunopotenciadoras. Los ejemplos de las proteínas inmunopotenciadoras incluyen, pero no se limitan a, citocinas, interferón tipo 1, interferón gamma, factores estimuladores de colonias, interleucina 1, 2, 4, 5, 6, 12. Además, las secuencias génicas heterólogas que pueden ser construidas en los virus quiméricos de la invención para uso en vacunas incluyen, pero no se limitan a, las secuencias provenientes de un virus de inmunodeficiencia humara (VIH), de preferencia tipo 1 o tipo 2. En una modalidad preferida, un péptido proveniente de VIH, inmunogénico que puede ser la fuente de un antígeno puede ser construido en un NDV quimérico que entonces puede ser utilizado para producir una respuesta inmunitaria en vertebrados. Estos péptidos provenientes de VIH pueden incluir, pero no se limitan a, las secuencias provenientes del gen env (es decir, las secuencias que codifican toda o parte de la gpldO, gpl20 y/o gp41), el gen pol, (es decir, secuencias que codifican toda o parte de la inverso transcriptasa, endonucleasa, proteasa y/o integrasa) , el gen gag (es decir, secuencias que codifican toda o parte de p7, pd, p55, pl7/18, p24/25), tat, rev, nef, vif, vpu, vpr y/o vpx . -e ?.? .»--..., -*.- i-i-.- Otras secuencias heterólogas pueden ser provenientes del antígeno superficial del virus de hepatitis B (HBsAg) ; antígenos de superficie del virus de hepatitis a ó C, las • glucoproteínas del virus de Epstein Barr; las glucoproteínas 5 del papilomavirus humano; las glucoproteínas del virus sincitial respiratorio, virus de parainfluenza, virus de senda i, simianvirus 5 ó virus de paperas; las glucoproteínas del virus de influenza; las glucoproteínas del virus de herpes (por ejemplo, gD, gE) ; VP1 de poliovirus; á^ 10 determinantes antigénicos de patógenos no virales como bacterias y parásitos, por mencionar solo algunos. En otra modalidad, es posible expresar todos o porciones de los genes de inmunoglobulina. Por ejemplo, las regiones variables de las inmunoglobulinas anti-idiotípicas que 15 imitan tales epítopes pueden ser construidas en los virus quiméricos de la invención. Otras secuencias heterólogas pueden ser obtenidas de antígenos de tumor, y los virus quiméricos resultantes pueden utilizarse para generar una respuesta inmunitaria 20 contra las células tumorales dando origen a la regresión del tumor in vivo. Estas vacunas pueden ser utilizadas en combinación con otros esquemas terapéuticos, que incluyen pero no se limitan a quimioterapia, terapia de radiación, cirugía, trasplante de médula ósea, etc., para el 25 tratamiento de tumores. De acuerdo con la presente inverción, los virus recombinantes pueden ser manipulados para expresar antígenos asociados al tumor (TAA) , que incluye pero no se limita a, antígenos de tumor humano • recorocidos por las células T (Robbins y Kawakami, 1996, 5 Curr. Opin. Immunol. 8: 628-636, incorporada en la presente como referencia en su entereza) , proteínas de linaje del melarocito, incluida gplOO, MART-1/MelanA, TRP-1 (gp75) , tirosinasa; antígenos ampliamente compartidos específicos de tumor, MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-1, N-^fc 10 acetilglucosaminiltransferasa-V, pl5; antígenos mutados específicos de tumor, ß-catenina, MUM-1, CDK4; antígenos no melanoma para carcinoma de mama, ovario, cervical y pancreático, HER-2/neu, papilomavirus humano-E6, E7, MUC-. Es posible formular una vacuna viral recombinante viva o 15 una vacuna viral recombinante inactivada. Una vacuna viva puede ser preferida porque la multiplicación en el hospedador conduce a un estímulo prolongado de clase y magnitud similar a la que ocurre en infecciones naturales, y por tanto, confiere inmunidad substancial y de larga 20 duración. La producción de tales formulaciones de vacunas de virus recombinantes virus puede lograrse utilizando los métodos tradicionales que incluyen la propagación del virus en el cultivo celular o en las alantoides de embriones de pollo seguido por purificación. Además, como se ha 25 demostrado que el NDV es no patógeno en humanos, este virus es muy conveniente para uso como una vacuna viva. En este sentido, el uso de NDV genéticamente manipulados (vectores) para propósitos de vacuna puede requerir la • presencia de las características de atenuación en estas 5 cepas. La introducción de mutaciones adecuadas (por ejemplo deleciones) en las plantillas utilizadas para la transfección puede proporcionar a los virus novedosos características de atenuación. Por ejemplo, las mutaciones antisentido específicas que están asociadas con la 10 sensibilidad a la temperatura o adaptación al frío pueden prepararse en mutaciones por deleción. Estas mutaciones deber ser más estables que las mutaciones puntuales asociadas con mutantes sensibles al frío o temperatura y deber ser extremadamente bajas las frecuencias de reversión. 15 De otro modo, es posible construir virus quiméricos con características "suicidas". Tales virus irían solo a través de una o pocas rondas de replicación dentro del hospedador. Cuanco se utilizan como vacuna, el virus recombinante iría a través de ciclo (s) de replicación limitado e induciría un 20 nivel suficiente de respuesta inmunitaria pero no iría más allá en el hospedador humano ni causaría enfermedad. Los virus recombinantes que carecen de uno o más de los genes de NDV o que poseen genes de NDV mutados no podrían sufrir rondas sucesivas de replicación. Los virus defectivos pueden 25 ser producidos en líneas celulares que expresan .--a^--.aéi^á---g»---fe»j..<-tt í Í.? ?..L .M-... . _a_-aa--, . . _-...--,. .. . _. _ ...-. _ „ .-,,.!-- ,-. - . permanentemente tal (es) gen (es). Los virus que carecen de un gen (es) esencial serán replicados en estas líneas celulares, pero cuando se administran al hospedador humano no podrán • completar una ronda de replicación. Tales preparaciones 5 pueden transcribir y traducir —en este ciclo abortivo— un número suficiente de genes para inducir una respuesta inmuritaria. De otro modo, grandes cantidades de las cepas podrían ser administradas, de modo que estas preparaciones sirvan como vacunas de virus inactivados (muertos) . Para 10 vacunas inactivadas, se prefiere que el producto génico • heterólogo sea expresado como un componente viral, de modo que el producto génico sea asociado con el virión. La ventaja de tales preparaciones es que contienen proteínas nativas y no sufren inactivación por tratamiento con 15 formalina u otros agentes utilizados en la fabricación de vacunas de virus muertos. De otro modo, el NDV mutado preparado a partir de cDNA puede ser altamente atenuado de modo que se replique durante solo algunas rondas. En otra modalidad de este aspecto de la invención, las 20 formulaciones de vacunas inactivadas pueden ser preparadas utilizando las técnicas tradicionales para "matar" los virus quiméricos. Las vacunas inactivadas son "muertas" en el sentido que su infectividad ha sido destruida. En teoría, la infectividad del virus se destruye sin afectar su 25 inmunogenicidad. Para preparar vacunas inactivadas, los ?rn-- -|rYÍ-----rti--r-f«Íhi- f ir . ?l? i 11 ipr* -..-—-----. .. .. _„-,..„-._—_._.. - -.- -- -. .-.-....--.... ...^.->----..-,..„ _.-,.-_ ..-.i. ------- J-------e-^------- virus quiméricos pueden ser crecidos en cultivos celulares o en las alantoides de embriones de pollo, purificadas por ultra centrifugación zonal, inactivadas por formaldehído o ß- propiolactona y combinadas. La vacuna resultante normalmente 5 se irocula por vía intramuscular. Los virus inactivados pueden ser formulados con un coadyuvante conveniente para mejorar la respuesta inmur ológica. Tales coadyuvantes pueden incluir, pero no se limitan a, geles minerales, por ejemplo, hidróxido de 10 aluminio; sustancias activas de superficie como • lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones; péptidos; emulsiones oleosas; y coadyuvantes potencialmente útiles para humanos como puede ser BCG y Corynebacterium parvum. Es posible utilizar múltiples métodos para introducir 15 las formulaciones de vacunas descritas en lo anterior, estos incluyen pero no se limitan a, las vías oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea e intranasal. Puede ser preferible introducir la formulación de vacuna de virus quimérico por una vía natural de 20 infección del patógeno para el cual está diseñada la vacuna. 6. EJEMPLO: EXPRESIÓN Y EMPACADO DE UN GEN EXTRAÑO POR NDV RECOMBINANTE La expresión del gen transferasa de cloranfenicol (CAT) 25 utilizando el minigenoma de NDV esta descrito. El minigenoma --¿------g-------^---t-i-----.--...j.-...- .- -urnt-f - - *~. -tir — —- - ------- . -.--.—— ...- .--• — - -« — —--..-..- L-a-al-B-a- de NDV se preparó utilizando pNDVCAT, un plásmido recombinante que contiene el gen de CAT. El plásmido pNDVCAT es un plásmido pUC19 que contiene en la secuencia: el • promotor T7, el extremo 5' del RNA genómico de NDV que 5 contiene 191 nucleótidos de la secuencia de RNA de NDV no codificadora; 5 nucleótidos insertados (3'CTTAA); la secuencia codificadora completa del gen de transferasa de cloranfenicol (CAT) en el orden invertido y complementado; el extremo 3' de la secuencia de RNA genómica de NDV que 10 contiene 121 nucleótidos de la secuencia de RNA del NDV no • codificadora; un sitio de clonación Bbsl y algunos sitios de restricción permitiendo la transcripción de la plantilla. El pNDVCAT puede ser transcrito utilizando la T7 polimerasa para crear un RNA con secuencias flanqueadoras sentido, 15 virales de la enfermedad de Newcastle alrededor de un gel de CAT en orientación invertida. La longitud de un RNA de paramixovirus puede ser un factor importante que determine el nivel de replicación del RNA, siendo la replicación del genoma más eficiente cuando 20 el número total de los nucleótidos es un múltiplo de 6. Para el NDV, la cuestión de si esta regla de seis es crucial para la replicación fue examinada generando mini-replicones de CAT de diferentes longitudes, difiriendo por 1 a 5 nucleótidos. Solo una construcción cuyo genoma fue divisible 25 entre 6 pudo inducir alta actividad de CAT. 6.1 CONSTRUCCIÓN DEL MINIGENOMA DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE NEWCASTLE Para construir un minigenoma de NDV, como se describe • supra , se utilizó la siguiente estrategia. La secuencia 5' 5 terminal del RNA de NDV genómico se obtuvo por RACE (Gibco, BRL) utilizando las técnicas normales. La plantilla para la reacción RACE fue el RNA genómico que fue purificado de viriones de NDV (NDV-CL: California/11914/tipo 1944). Como se ilustra en la Figura 3, esta secuencia terminal contenía 10 64 nucleótidos de una secuencia cola más 127 nucleótidos de • la región no traducida del gen de L. Ubicada adyacente a la secuencia de 191 nucleótidos virales, se insertó una secuencia de 5' nucleótidos (3'CCTTAA). Un gen de CAT que contenía 667 nucleótidos del marco de lectura abierto de CAT 15 que fue colocado entre las regiones no codificadoras 5' y 3' terminales, virales. Para obtener la región 3' terminal de la secuencia NDV, se utilizó RT-PCR. La plantilla para la reacción RT-PCR fue RNA genómico del NDV poliadenilado in vitrc. Como se ilustra en la Figura 3, la región 3' terminal 20 de 121 nucleótidos estuvo compuesta de 56 nucleótidos de la región no traducida del gen de NP más 65 nucleótidos de una secuencia líder. La construcción resultante del minigenoma NDV se muestra en la Figura 1. Las secuencias de nucleótidos de la región terminal no codificadora 3' y 5' se muestran en 25 la Figura 3. i.-,,.---a-^.'.--<- ,_---?-- _-.. fc-¿-A, ,.- --... . „..--..... „ - .. . ..... .„..--. .:_,. . .- ....--„-....-- ¡ |iJhd?-Í-----É 6.2 CONSTRUCCIÓN DE LOS PLÁSMIDOS DE EXPRESIÓN NP, P & L DEL NDV Como se describió en la Sección 5, la transcripción o • replicación del genoma de RNA de cadena negativa requiere 5 que algunos componentes proteínicos se pongan en contacto con el virus, incluida la proteína L, proteína P y proteína NP. Para facilitar la expresión del minigenoma de NDV, los genes que codifican cada una de las proteínas L, P y NP fueron clonados en los vectores de expresión pTMl como se ^ 10 ilustra en las Figuras 2A-C. Los vectores de expresión pTMl comprenden un promotor T7, algunos sitios de clonación para la inserción del gen de interés (L, P ó NP) , un terminador T7, un origen de replicación pUC19 y un gen de resistencia a ampicilina. Para construir los plásmidos de expresión, el 15 DNA de longitud completa de la nucleoproteína (NP) , fosfcproteína (P) y polimerasa (L) del NDV fueron obtenidos por amplificación por RT-PCR. Estos DNA fueron clonados en el vector de expresión T7 polimerasa pTMl, respectivamente (Figura 2A-C) . 20 6.3 TRANSCRIPCIÓN DEL RNA DEL MINIGENOMA DE NDV La transcripción del RNA a partir del plásmido del minigen de NDV se realizó con el kit Ribomax (Promega) como se especifica por los manuscritos. Para permitir la 25 transcripción, 1 µg del plásmido del minigenoma de NDV . *. -A -a - --^^ - . - -. . - .^,. > . > *..-- .*---.-- • •, .-_. -- ^-. ,- . » i > .k -iáá**á*álu¿*¿>¿ (pNDVCAT) fue digerido con BbsI. El plásmido linealizado fue luego utilizado como una plantilla de la reacción de transcripción (durante dos horas a 37°C) . Para separar el • DNA plantilla, la mezcla de reacción resultante fue tratada 5 con DNasa sin RNasa (durante 15 minutos a 37°C) y purificado por precipitación con fenol-cloroformo, seguido por precipitación con etanol. 6.4 TRANSFECCIONES CELULARES 10 Células cos-1, o células 293T fueron crecidas en placas • de 35 mm e infectadas con el virus auxiliador rVV T7 en una multiplicidad de infección (moi) de aproximadamente 1 durante una hora antes de la transfección. Las células fueron luego transfectadas con los vectores de expresión que 15 codifican las proteínas NP, P y L del NDV. Específicamente, las transfecciones se realizaron con DOTAP (Boehringer Mannheim) . Después de la infección con el virus auxiliador, las células fueron transfectadas con el pTMl-NP (1 µg) , pTMl- P (I. µg) y pTMl-L (0.1 µg) durante 4 horas. Las 20 transfecciones control, carentes de la proteína L, fueron realizadas en una serie paralela de células con pTMl-NP (1 µg) , pTMl-P (1 µg) y pTMl-L imitación (0 µg) . Después de un periodo de incubación de 4 horas, las células fueron sometidas a transfección con RNA con 0.5 µg del RNA (-) 25 quimérico de NDV-CAT (véase la Figura 1) . Después de la transfección con RNA, las células fueron incubadas durante 18 horas. Los lisados celulares fueron posteriormente cosechados para el ensayo de CAT. 5 6.5 ENSAYOS DE CAT Se realizaron los ensayos de CAT de acuerdo con los procedimientos normales, adaptados de Gorman y col., 1982, Mol. Cell. Biol. 2: 1044-1051. Los ensayos contenían 10 µl de cloranfenicol 1C (0.5 µCi; 8.3 nM; NEN); 20 µl de acetil CoA 10 (Boehringer) 40 mM y 50 µl de extractos celulares en buffer Tris 0.25 M (ph 7.5). Los tiempos de incubación fueron de 16-18 horas. 6.6 RESULTADOS 15 En cada línea de células transfectadas con los vectores de expresión NP, P, L, y el RNA de NDV-CAT quimérico, se obtuvieron altos niveles de expresión de CAT 18 horas después de la infección. Además, las células transfectadas control carentes de la proteína L no expresaron CAT. 20 7. RESCATE DE LOS VIRUS NDV INFECCIOSOS UTILIZANDO EL RNA PROVENIENTE DEL DNA RECOMBINANTE ESPECÍFICO Los experimentos descritos en las sub-secciones siguientes demuestran el rescate del NDV infeccioso 25 utilizando RNA que proviene de los RNA recombinantes, J-fc.?-...m-t->,., específicos. Los RNA correspondientes al RNA de NDV-CAT quimérico pueden utilizarse para mostrar que los 191 nucleótidos del 5' terminal y los 121 nucleótidos de los nucleótidos 3' terminal de los RNA virales contienen todas las señales necesarias para la transcripción, replicación y empacado de los RNA de NDV modelo. Los RNA que contienen todas las unidades transcripcionales de los genomas de NDV pueden ser expresados a partir de los plásmidos tranefectados. Así pues, esta tecnología permite la" manipulación de los virus de NDV infecciosos utilizando los clones de cDNA y mutagénesis específica del sitio de sus genomas. Además, esta tecnología permite la construcción de los virus de NDV quiméricos, infecciosos que pueden ser utilizados como vectores eficientes para la expresión génica en cultivo tisular, animales o humanos. 8 EJEMPLO: VIRUS DE ENFERMEDAD DE NEWCASTLE RECOMBINANTE CONTENIENDO UN EPÍTOPE gpl60 DEL ANTÍGENO DE VIH INSERTADO EN EL GENOMA NDV En el Ejemplo que se presenta en la presente, un NDV quimérico se construye para expresar un antígeno heterólogo proveniente de gpldO del VIH. Los experimentos que se describen en la sub-secciones siguientes demuestran el uso de una plantilla de RNA recombinante para generar un NDV quimérico que exprese un péptido proveniente de gpl60 del VIH dentro del genoma de NDV y, además, este NDV quimérico se utiliza para producir una respuesta inmunitaria humoral y mediada por células en vertebrados. • 5 8.1 CONSTRUCCIÓN DEL PLÁSMIDO Los clones de cDNA del NDV recombinantes que expresan las proteínas gpldO del VIH pueden ser construidos en diferentes formas conocidas. Por ejemplo, como se ilustra en la Figura 4, las proteínas Env y Gag del VIH pueden ser 10 insertadas en el NDV en diferentes lugares. En un ejemplo, • las proteínas Env y Gag se insertan entre los genes M y L. En ur ejemplo diferente, las proteínas Env y Gag se insertan 3' para el gen NP (entre la secuencia líder y NP) . De otro modo, estas proteínas del VIH serán incorporadas entre las 15 proteínas de envoltura del NDV (HN y F) en el extremo 3' . Estas proteínas también pueden ser insertadas en o entre cualquiera de los genes de NDV. 8.2 GENERACIÓN DE VIRUS QUIMÉRICO INFECCIOSO 20 La transfección de RNA proveniente del plásmido que contiene un genoma de NDV recombinante puede ser transfectado en células como por ejemplo COS, 293 MDBK y la selección del virus quimérico infeccioso puede realizarse como ya se describió. Véase la Patente Estadounidense No. 25 5,166,057, incorporada en la presente como referencia en su ^^^-^ entereza. El RNA resultante puede ser transfectado en células infectadas con virus tipo silvestre utilizando procedimientos de protocolo de transfección normales. Después de la transfección, el sobrenadante puede ser recolectado y utilizado en diferentes diluciones para infectar células nuevas en presencia de antisuero de NDV. El sobrenadante también puede utilizarse para ensayos de placas en presencia del mismo antisuero. El virus rescatado entonces puede ser purificado y caracterizado, y utilizado por ejemplo en la producción de anticuerpos. 8.3 ENSAYOS DE INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN Y DE NEUTRALIZACIÓN DEL VIRUS Los ensayos de inhibición de la hemaglutinación (Hl) se realizan como ya se describió (Palmer, D. F. y col., 1975, Immunol . Ser. 6: 51-52). Los anticuerpos monoclonales (2G9, 4B2, 2F10, 25-5) se preparan por procedimientos normales con un anticuerpo monoclonal anti-gpl20 humano. El fluido con los ascites conteniendo anticuerpos monoclonales se trata con encima destructora del receptor como ya se describió (Palmer, D. F. y col., 1975, Immunol . Ser. 6: 51-52). Para ensayo de neutralización del virus, las células en cajas de 30 mm de diámetro se infectan con el virus. Después de una hora de adsorción, se adiciona una capa de agar conteniendo el anticuerpo en diferentes diluciones. La monocapa de células luego se tiñe con 0.1% de violeta cristal a las 72 horas después de la infección. 8.4 INMUNIZACIÓN 5 Ratones BALB/c de seis semanas de nacidos se infectan por la vía de aerosol con el virus, o se inmunizan por vía intraperitoneal (ip) con 10 µg del virus purificado. Para todas las inmunizaciones de refuerzo, 10 µg del virus purificado se administran ip. Los sueros se recolectan 7 10 días después de cada inmunización. • 8.5 RADIOINMUNOENSAYO El radioinmunoensayo se realiza como ya se describió (Zaghouani, H. y col., 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. EU 88: 15 5645-6549) . En resumen, las placas de microtitulación se recubren con 5 µg/ml de conjugado péptido-BSA, se saturan con BSA al 2% en salina amortiguada con fosfatos (PBS) y se incuban con diferentes diluciones de suero. Los anticuerpos unidos se revelan utilizando el anticuerpo monoclonal kappa 20 anti-ratón etiquetado con 125I. 8.6 RADIOINMUNOPRECIPITACIÓN La línea de células T humanas H9 se infecta en forma aguda con VIH. Cuatro días después de la infección, 5 x 107 25 células infectadas se etiquetan con 35S-cisteína, 35S- metionina y 3H-isoleucina a 2 x 106/ml en medio conteniendo 100 uCi de cada isótopo por ml . Después de 20 horas del etiquetado metabólico, los viriones radioactivos se empacan por centrifugación durante una hora a 45,000 rpm. El paquete luego se resuspende en 1.0 ml de buffer de lisis conteniendo Tritón x-100 al 1% y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 2 mM (PMSF). Aproximadamente 20 µl de sueros o 0.5 µg de anticuerpo monoclonal (en 20 µl de PBS) y 175 µl del lisado de viriones se incuban durante la noche a 4°C en 0.5 ml de buffer para inmunoprecipitación conteniendo dodecilsulfato de sodio (SDS), al 0.5%, 1 mg/ml de BSA, Trtion X-100 al 2% y fosfato de sodio 50 mM (pH 7.4). Los complejos antígeno-anticuerpo se unen a las perlas de proteína A-Sepharose y se analizan por electroforesis sobre un gel de poliacrilamida-SDS al 10%. 8.7 ENSAYOS DE NEUTRALIZACIÓN DEL VIH-1 Se realiza el ensayo de neutralización in vitro como ya se describió (Nara, P. L. y col., 1987, AIDS. Res. Hum. Retroviruses 3: 283-302). En resumen, series de diluciones dobles de suero inactivado por calor se incuban durante una hora a temperatura ambiente con 150-200 unidades formadoras de sLncitios del virus VIH producidas en células H9. La mezcla virus-suero se incuba durante una hora a 37 °C con 50 , 000 células CEMss tratadas con DEAE-dextrano (adheridas a -------------_ .-----.. .-.. las cajas microplacas utilizando poli-L-lisina) o 50,000 células en suspensión H9. Después de la adsorción del virus, el virus no unido se retira y 200 µl de medio se adiciona a cada pozo. Cuatro días después de la infección, 50 µl del 5 medici sobrenadante se retira para la cuantificación de la proteína p24gag viral (Coulter Source, Inc.). El número total de sincitios en células CEMss se cuenta cinco días después de la infección. Los títulos de la neutralización se calculan por comparación con pozos control de solo virus, y 10 se expresan como el recíproco de la dilución de suero más • alta que reduce el número de sincitios por más de 50% o inhibe la síntesis de p24 en más de 50%. 8.8 INDUCCIÓN DE LA RESPUESTA DE CTL 15 Ratones BALB/c se inmunizan con 0.2 ml de la suspensión viral conteniendo 107 UFP de virus de NDV quimérico. Siete días después, se obtienen las células esplénicas y se reestimulan in vi tro durante 5 días con células esplénicas irradiadas, solas o cubiertas con péptidos inmunogénicos, en 20 presencia de concanavalina A al 10% en el sobrenadante como ya fue descrito (Zaghouani, H. y col., 1992, J. Immunol . 148: 3604-3609) . 25 <a-ta--J----l-Mll«---, .,. «..-...-,- ..-..... „,.. -. _^----,.--, .--.. ... . .. —.---... ....... .-.- ...1 ------l-j-------»----- 8.9 ENSAYO DE CITOLISIS Las células elegidas recubiertas con péptidos se marcan con Ma51Cr4 (100 µCi/106 células) durante una hora a 37°C. Después de lavadas dos veces, las células se transfieren a 5 placas de 96 pozos, de fondo V, se adicionan las células efectoras y se incuban a 37°C en C02 al 7%. Cuatro horas después, el sobrenadante se cosecha y se cuenta. Se determina el cromo máximo liberado incubando las células con detergente Nonidet P40 al 1%. El porcentaje de lisis 10 específico se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula: • [(muestras cpm - liberación espontánea cpm) / (liberación máxima cpm - liberación espontánea cpm)] x 100. 9. EXPRESIÓN INTRACELULAR DEL RNA DE NDV-CAT QUIMÉRICO 15 Para aumentar la eficiencia de la expresión de los minigenomas de NDV, un plásmido pT7-NDV-CAT-RB) se construyó para la expresión intracelular de RNA de NDV-CAT. Esto se logró insertando una ribozima proveniente del virus de hepatitis delta directamente después del final de la región 20 no codificadora 3' del RNA de NDV-CAT. La cotransfección de pTMl-NP, pTMl-P, pTMl-L y pT7-NDV-CAT-RT) en células 293, 293T, COSÍ, CV1 o fibroblastos de embriones de pollo (CEF) que fueron previamente infectados con rVV-T7 o con virus de vaccinia Ankara modificado expresando T7 polimerasa (MVA-T7) 25 condujo a altos niveles de actividad de CAT (Figura 6) . La actividad de CAT fue de aproximadamente 100 a 100,000 veces mayor que la obtenida por la transfección de RNA directa del RNA de NDV-CAT. 5 10. RESCATE DEL VIRUS NDV INFECCIOSO UTILIZANDO RNA OBTENIDO DEL DNA RECOMBINANTE ESPECÍFICO Para obtener el virus recombinante de rescate a partir de un sistema derivado de plásmido, no dependiente de virus, un plásmido que permite la expresión intracelular del ^fc 10 antigenoma de longitud completa del NDV fue ensamblado. El cDNA de NDV fue sometido a RT-PCR en algunas piezas a partir de RNA purificado de una cepa tipo California de NDV (NVD- CL) (Meindl y col., 1974 Virology 58:457-463). Las piezas de cDNA fueron ligadas y ensambladas en un plásmido con el 15 promotor T7 y secuencias flanqueadoras ribozima, dando origen al plásmido pT7-NDV+RB. Una mutación silenciosa creando un nuevo sitio de restricción Xmal se introdujo en el marco de lectura abierto L de pT7-NDV+RB. Monocapas de células CEF en cajas de 10 cm fueron infectadas con MVA-T7 20 en una multiplicidad de infección de aproximadamente 0.1. Una hora después, las células fueron transfectadas (lipofectadas) con 2.4 µg de pTMl-NP, 1.2 µg de pTMl-P, 1.2 µg de pTMl-L y 1.5 µg de pT7-NDV+-RB. Después de 8 horas de incubación a 37°C, se adicionó medio fresco. 20 horas 25 después de la transfección, se adicionó el inhibidor de ^-em- virus de vaccinia araC a una concentración final de 60 µg/ml. Dos días después de la transfección, medio fresco conteniendo 100 µg/ml de araC fue adicionado. El sobrenadante de las células transfectadas en un día 4 después de la 5 transfección fue utilizado para inocular la cámara alantóica de huevos de pollo embrionados de 10 días de edad. Después de dos días de incubación a 37°C, el fluido alantóico fue cosechado y se encontró positivo para la presencia de virus NDV-CAT por hemaglutinación. El análisis del RNA aislado del é^ 10 virus rescatado confirmó la presencia del sitio Xmal recién insertado, confirmando que el virus fue proveniente del cDNA plásmido clonado. La representación esquemática del procedimiento de rescate es el protocolo que se muestra en la Figura 7. 15 11. EXPRESIÓN DE UN GEN EXTRA O A PARTIR DE UN CISTRON INTERNO DE UN GENOMA DE NDV QUIMÉRICO Se construyó el plásmido pT7-NDV+-CAT/RN-RB sustituyendo el marco de lectura abierto HN en el cDNA de NDV-CL con un 20 maree de lectura abierto CAT. Se adicionaron nucleótidos adicionales en las regiones no codificadoras para permitir una longitud total de nucleótidos del RNA de NDV quimérico, resultante, que fuera divisible entre 6. La cotransfección de pT7-NDV+-CAT/HN-RB junto con pTMl-NP, pTMl-P y pTMl-L en 25 las monocapas de CEF que anteriormente fueron infectadas con virus MVA-T7 originaron actividad de CAT según se midió en el cía 2 después de la transfección (Figura 8) . Estos resultados demuestran que es posible utilizar NDV como • vector para la expresión de genes extraños clonados como 5 unidades transcripcionales en el genoma de NDV. La presente invención no se limita en su alcance por las modalidades específicas descritas que se proponen solo como ilustraciones de los aspectos individuales de la invención, y cualquiera de las construcciones, virus o enzimas que sean á^ 10 funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de esta inverción. En realidad, algunas modificaciones de la inverción además de las mostradas y descritas en la presente serár evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción antes mencionada y los dibujos que le 15 acompañan. Tales modificaciones están propuestas para entrar dentro del alcance de las cláusulas anexas. Todas las referencias mencionadas en la presente se incorporan como referencia en su entereza para todos los propósitos . 20

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de RNA recombinante que contiene el sitio de unión específico para una RNA polimerasa de un virus de enfermedad de Newcastle y las señales requeridas para la replicación y transcripción mediada por NDV, ligadas de manera operante a una secuencia de RNA heteróloga.

2. Una molécula de RNA recombinante que contiene un sitie de unión para una RNA polimerasa de un virus de la enfermedad de Newcastle y las señales requeridas para la replicación y transcripción mediada por NDV, ligadas de manera operante a un gen viral de la enfermedad de Newcastle; en donde la molécula de RNA contiene una mutación, inserción o deleción.

3. La molécula de RNA recombinante de la reivindicación 1 ó 2, en la cual el sitio de unión a la polimerasa comprende el sitio de unión a la polimerasa contenido en la región flanqueadora no codificadora 3' y 5' del genoma de RNA viral de la enfermedad de Newcastle.

4. La molécula de RNA recombinante de la reivindicación 3 en la cual la región flanqueadora no codificadora 3' y 5' tiene una secuencia sentido viral como se muestra en la Figura 1.

5. La molécula de RNA recombinante de la reivindicación 1, en la cual el RNA heterólogo codifica un antí?eno viral.

6. La molécula de RNA recombinante de la reivindicación 5, en la cual el antígeno viral se obtiene del virus de • inmunodeficiencia humana, el virus de la enfermedad de 5 Newcastle, el virus de influenza, sincitial respiratorio, el virus de la enfermedad de Marek, el virus de la enfermedad bursal infecciosa, virus de bronquitis infecciosa, virus de bursitis infecciosa, virus de anemia de pollo, virus de laringotraqueitis infecciosa, virus de leucemia aviaria, 10 virus de reticuloendoteliosis, virus de influenza aviaria, virus de rabia, virus de moquillo felino, virus de estomatitis vesicular, virus de ictericia hematúrica o virus de viruela porcina.

7. Una célula recombinante que contiene las secuencias de 15 nucleótidos que codifican para una molécula NDV recombinante de la reivindicación 1 y las proteínas RNA polimerasa P y L de NDV.

8. Un virus quimérico que comprende un virus de RNA de hebra negativa conteniendo la molécula de RNA recombinante 20 de la reivindicación 1 ó 2.

9. El virus quimérico de la reivindicación 8, en el cual el RNA heterólogo proviene de un antígeno viral.

10. El virus quimérico de la reivindicación 9, en el cual el antígeno viral se obtiene del virus de inmunodeficiencia 25 humana, el virus de la enfermedad de Newcastle, influenza, --------a?-----iM---É----^.^-...i..---.-.-.... ...-. . .... .. ...... . „-»fc.-. , ...... ... ,....„.,.- ^ sincitial respiratorio, virus de la enfermedad de Marek, virus de la enfermedad bursal infecciosa, virus de broncuitis infecciosa, virus de bursitis infecciosa, virus de anemia de pollo, virus de laringotraqueitis infecciosa, virus de leucosis aviaria, virus de reticuloendoteliosis, virus de influenza aviaria, virus de rabia, virus de moquillo felino, virus de estomatitis vesicular, virus de ictericia hematúrica o virus de viruela porcina.

11. El virus quimérico de la reivindicación 8, en el cual el RNA heterólogo está contenido dentro del gen de HN del virus de la enfermedad de Newcastle.

12. Un método para producir un virus de RNA de hebra negativa, quimérico, consiste en transfectar una célula hospedadora con las secuencias de nucleótidos que codifican el RNA recombinante de la reivindicación 1 ó 2 y las funciones virales requeridas para la replicación y transcripción, y reconvertir el virus quimérico del cultivo.

13. Una formulación de vacuna que contiene el virus de la enfermedad de Newcastle genéticamente manipulado conteniendo modificaciones que dan origen a un fenotipo atenuado, y un vehículo aceptable para uso fisiológico.

14. La formulación de vacuna de la reivindicación 13, en la cual la modificación es derivada de un mutante que ocurre en la naturaleza.

15. Jna formulación de vacuna que contiene un virus de la _.-_ -» J-.-. -t.-...-.,-........-.,.-, _,---a---- -.----,. -----k---- - enfermedad de Newcastle genéticamente manipulado, quimérico, el genoma del cual codifica un epítope heterólogo, y un excipiente aceptable para uso farmacéutico.

16. La formulación de vacuna de la reivindicación 15 en la 5 cual el epítope heterólogo es un antígeno viral.

17. La formulación de vacuna de la reivindicación 16, en la cual el antígeno viral se obtiene del virus de ínmunodeficiencia humana, el virus de la enfermedad de Newcastle, influenza, virus sincitial respiratorio, virus de 10 la enfermedad de Marek, virus de enfermedad bursal infecciosa, virus de bronquitis infecciosa, virus de bursitis infecciosa, virus de anemia de pollo, virus de laringotraqueitis infecciosa, virus de leucosis aviaria, virus de reticuloendoteliosis, virus de influenza aviaria, 15 virus de rabia, virus de moquillo felino, virus de estomatitis vesicular, virus de ictericia hematúrica o virus de viruela porcina.

18. La formulación de vacuna de la reivindicación 15, en la cual el epítope heterólogo es una proteína 20 inmunopotenciadora.

19. La formulación de vacuna de la reivindicación 15, en la cual el epítope heterólogo es un antígeno de tumor. .~~~* ¡ jj»í* l M*mi¡?í.?^.?. - .¿.--i....--.-