CN1354800A - 重组的新城疫病毒rna表达系统及疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程新城疫病毒和病毒载体,所述基因工程新城疫病毒和病毒载体表达异源基因或突变的新城疫病毒基因或来源于不同新城疫病毒株的病毒基因的组合。本发明涉及重组负链新城疫病毒的病毒RNA模板的构建和应用,可以将所述的RNA模板与病毒RNA指导的RNA聚合酶一起使用,从而在适当的宿主细胞中表达异源基因产物,且/或在病毒粒子中拯救异源基因。在本发明一个具体的实施方案中,所述异源基因产物是来源于人免疫缺陷病毒基因组的一种肽或蛋白。通过用任一DNA指导的RNA聚合酶转录适当的DNA序列,可制备本发明的RNA模板;所述DNA指导的RNA聚合酶例如:噬菌体T7、T3、SP6聚合酶之一或真核聚合酶I。
Description
本申请是1998年9月14日提交的09/152,845号申请的部分继续，通过引用将09/152,845号申请全部结合到本文中。
1.引言
本发明涉及重组的新城疫病毒RNA模板，可以用所述模板在合适的宿主细胞系统中表达异源基因产物/或构建表达、包装和/或呈现所述异源基因产物的重组病毒。在疫苗制剂方面，可以便利地使用所述的表达产物和嵌合病毒。本发明也涉及包含修饰和/或突变的基因工程重组新城疫病毒，所述修饰和/或突变使该重组病毒适用于疫苗制剂；所述修饰和/或突变例如一种减毒的表型或增强的免疫源性。
本发明涉及诱导干扰素和相关途径的重组新城疫病毒，本发明涉及使用抵抗广大范围的病原体和/或抗原的重组新城疫病毒和病毒载体；所述抗原包括肿瘤特异性抗原。通过实施例的形式说明本发明，在所述实施例中，构建了包含负极链的异源基因编码序列的重组新城疫病毒RNA模板。此外，本发明涉及包含正极的异源基因编码序列的重组新城疫病毒RNA模板的构建。这样的异源基因序列包括来源于人免疫缺陷病毒(HIV)的序列。
2.发明背景
已基因工程化了许多DNA病毒，以指导在宿主细胞系统中表达异源蛋白(例如痘苗病毒、杆状病毒等等)。近来，用正链RNA病毒获得了类似的进展(例如脊髓灰质炎病毒)。在疫苗制剂(或者亚单位疫苗或者完整病毒疫苗)方面，这些构成物的表达产物，即异源基因产物；或者表达所述异源基因产物的嵌合病毒，被认为是潜在有用的。使用病毒例如牛痘构建供疫苗用的重组病毒或嵌合病毒的一个缺点是：在病毒的主要表位缺乏变异。在病毒株中的这种变异性的缺乏严格限制了嵌合牛痘的反复使用；因为多次接种将产生宿主对该病毒株的抗性，使得接种的病毒不能感染该宿主。因此，用嵌合牛痘接种有抗性的个体将不诱导免疫刺激。
对比起来，对于构建供疫苗用的嵌合病毒，负链RNA病毒会是有吸引力的候选者。举例来说，流感，希望有负链RNA病毒，因为其广泛的遗传变异性便于构建疫苗制剂庞大的所有组成部分，所述疫苗制剂激发免疫且没有产生耐受性的危险。近来，用流感病毒完成了感染性重组或嵌合负链RNA粒子的构建(Palese等的第5,166,057号美国专利，通过引用将其全部结合到本文中)。2.1.新城疫病毒
人们把包含有包膜负义基因组单链RNA的病毒家族分类成具有非分段基因组的组(副粘病毒科、弹状病毒科)或者具有分段基因组的组(正粘病毒科、本杨病毒科和沙粒病毒科)。在下面详细描述的且用于本文实施例中的副粘病毒科包括多种病毒，即新城疫病毒(NDV)、副流感病毒、仙台病毒、猿猴病毒5、以及腮腺炎病毒。
新城疫病毒是一种有包膜病毒，该病毒包含一非分段的线性单链的、负义RNA基因组。该基因组RNA包含3’-NP-P-M-F-HN-L次序的基因；在下文中更详细地描述了这些基因。该基因组RNA在3’末端也含有一前导序列。
该病毒粒子的结构元件包括病毒的包膜，该包膜是来源于细胞原生质膜的脂双层。糖蛋白血凝素-神经氨酸酶(HN)从包膜伸出，使该病毒既能够含有血凝素活性、又能够含有神经氨酸酶活性。首先产生作为无活性前体的融合糖蛋白(F)，该融合糖蛋白(F)也和病毒膜相互作用；然后，在翻译后切割该融合糖蛋白(F)，产生两个二硫键连接的多肽。由于活性FF蛋白促进病毒包膜与宿主细胞原生质膜的融合，因而与NDV穿入到宿主细胞中有关。基质蛋白(M)涉及病毒的装配，且与病毒膜以及核衣壳蛋白两者相互作用。
病毒粒子的主要蛋白亚基是把螺旋对称性授予衣壳的核衣壳蛋白(NP)。P蛋白和L蛋白与核衣壳结合。以磷酸化为条件的磷蛋白(P)，被认为在转录中起调节作用；且该磷蛋白(P)也可以与甲基化、磷酸化及聚腺苷酸化有关。对于病毒RNA的合成，需要编码依赖RNA的RNA聚合酶的L基因和所述的P蛋白。占据病毒基因组编码容量的几乎一半的L蛋白是所述病毒蛋白中最大的，且该L蛋白既在转录中、又在复制中起重要的作用。
由于缺乏复制RNA所需要的细胞机器，包括NDV的所有负链RNA病毒的复制是复杂的。另外，不能直接把负链基因组翻译成蛋白质，而必须首先将其转录为正链(mRNA)拷贝。因此，在基因组RNA进入到宿主细胞后，单独的基因组RNA不能立即合成所需要的、依赖RNA的RNA聚合酶。所述L蛋白、P蛋白和NP蛋白必须在感染时随着基因组进入该细胞。
人们假定转录NDV mRNA的大多数或全部病毒蛋白也进行它们自己的复制。还没有清楚地识别出调控同一套蛋白的可变使用(即转录或复制)的机制，但看来似乎涉及一种或更多种核衣壳蛋白、尤其是所述NP蛋白的游离形式的丰度。在病毒穿入后，马上由L蛋白用核衣壳中负义RNA作为模板，起始转录。调节病毒RNA的合成，使得它在转录期间产生各种单顺反子mRNA。
在转录后，在负链RNA病毒感染的过程中，病毒基因组的复制是第二个必要的事件。正如其它负链RNA病毒的情况一样，在新城疫病毒(NDV)方面，由病毒特异性的蛋白介导病毒基因组的复制。复制型RNA合成的最初产物是NDV基因组RNA的互补的拷贝(即正极链)(cRNA)。这些正链拷贝(反义基因组)在其末端结构方面不同于正链mRNA转录物。不象mRNA转录物，在5’末端没给各种反义基因组的cRNA加帽，且没将其甲基化；在3’末端没将反义基因组的cRNA截短和聚腺苷酸化。各cRNA和其负链模板是有共同末端的，并且在互补形式的每个基因组RNA片段中，所述cRNA包含所有的遗传信息。所述cRNA作为用于NDV负链病毒基因组(vRNAs)合成的模板。
不但NDV负链基因组(vRNAs)，而且反义基因组，都被核衣壳蛋白壳体化；唯一不被壳体化的RNA种类为病毒mRNA。对于NDV，细胞质是病毒RNA复制的场所，正如它是用于转录的场所一样。病毒组成成分的装配看来似乎发生在宿主细胞原生质膜上，且通过出芽释放成熟的病毒。2.2.工程负链RNA病毒
关于蛋白结构和反应条件的许多方面，已广泛地研究了动物病毒的RNA指导的RNA聚合酶。然而，通过用现存病毒RNA序列的推断，才能研究模板RNA促进用所述聚合酶的最适表达的元件。这种启动子的分析是有意义的，因为病毒RNA聚合酶怎样从发现于被感染的细胞里的、宿主编码的许多RNA中识别出特定的病毒RNA是未知的。
如果通过转染将由质粒衍生的RNA引进到细胞中，则可以复制包含正义基因组RNA的动物病毒(例如：Racaniello等，1981；Science 214：916-919；Levis等，1986，Cell44：137-145)。就脊髓灰质炎病毒来说，纯化的该聚合酶将在体外反应中复制基因组RNA，并且如果把这正义RNA制备物转染到细胞中，则该RNA制备物是感染性的(Kaplan等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8424-8428)。然而，用作脊髓灰质炎病毒编码的聚合酶的转录启动子之模板元件是未知的；因为甚至RNA均聚物也能被拷贝(Ward等，1988，J.Virol.62：558-562)。同样，运用了SP6转录物来产生对于辛德比斯病毒基因组的、模型缺损干扰(DI)RNA。如果把该RNA引入到感染的细胞中，则该RNA被复制，并被包装。已证明既对由辛德比斯病毒聚合酶的识别负责、又对该基因组包装到病毒粒子中负责的RNA序列存在于基因组5’末端的162个核苷酸(nt)和3’末端的19个核苷酸之中(Levis等，1986，Cell 44：137-145)。就正链RNA植物病毒雀麦花叶病毒(BMV)来说，已用SP6转录物鉴定了作为tRNA样3’末端的134个核苷酸的启动子(Dreher和Hall，1988，J.Mol.Biol.201：31-40)。已证明聚合酶的识别与合成既依赖于序列、又依赖于二级结构的特征(Dreher等，1984，Nature 311：171-175)。
对负义RNA病毒不易研究复制酶的序列要求。当包括起源于病毒的核糖核蛋白复合物(RNPs)作为模板时，纯化的水泡性口炎病毒的聚合酶是转录中唯一有活性的(De和Banerjee，1985，Biochem.Biophys.Res.Commun.126：40-49；Emerson和Yu，1975，J.Virol.15：1348-1356；Naito和Ishihama，1976，J.Biol.Chem.251：4307-4314)。关于流感病毒，报道了使用从病毒纯化的裸露RNA重建RNP。用凝胶纯化了病毒的核衣壳和聚合酶蛋白，并用硫氧还蛋白将病毒的核衣壳和聚合酶蛋白在该病毒RNA上复原(Szewczyk等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：7907-7911)。然而，这些作者没说明：该制剂的活性就对于流感病毒RNA是特异性的；且他们也没有分析启动转录的信号。
只是最近，才可能用一种重组的反向遗传学方法回收负链RNA病毒(Palese等的第5,166,057号美国专利)。虽然最初运用这方法来工程化流感病毒基因组(Luytjes等，1989，Cell 59：1107-1113；Enami等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA92：11563-11567)，但是，已成功地把它应用于各种各样的分段负链RNA病毒和非分段的负链RNA病毒，包括狂犬病(Schnell等，1994，EMBO J.13：4195-4203)、呼吸道合胞病毒(Collins等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：9663-9667)、和仙台病毒(Park等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5537-5541；Kato等，1996，Genes Cells 1：569-579)。然而，还必须将这方法应用于新城疫病毒RNA基因组。
3.发明概述
描述了重组的新城疫病毒RNA模板，可以用所述重组的新城疫病毒RNA模板和RNA指导的RNA聚合酶在适当的宿主细胞中表达异源基因产物，并/或在病毒粒子中拯救异源基因。在一个实施方案中，本发明涉及诱导干扰素和相关途径的重组新城疫病毒。本发明涉及含有修饰的重组新城疫病毒，所述修饰产生使上述重组病毒更适合于在疫苗制剂中应用的表型，例如减毒的表型和提高的免疫源性。在另一个实施方案中，本发明涉及工程重组新城疫病毒和包含异源基因的病毒载体；所述异源基因包括：其它病毒的基因、病原体的基因、细胞的基因、肿瘤抗原的基因等等。
在另一个实施方案中，本发明涉及工程重组新城疫病毒和适合于用作疫苗的病毒载体。本发明涉及适合于给予人的疫苗制剂以及兽医使用的疫苗制剂。可以设计本发明的疫苗，用于给予包括猫和狗的家畜、包括狐狸和浣熊的野生动物、包括马、牛、羊、火鸡与鸡的牲畜和家禽。
在再一个实施方案中，本发明涉及重组的新城疫病毒载体和病毒，所述病毒载体和病毒已被工程化，以编码突变的新城疫病毒基因或编码来自不同的新城疫病毒株的基因的组合。通过用DNA指导的RNA聚合酶转录适当的DNA序列，来制备本发明的RNA模板。所产生的RNA模板为负极链，且包含适当的、使病毒RNA合成系统能够识别该模板的末端序列。可选择地，也可以使用包含适当末端序列的正极链RNA模板，所述的适当末端序列使病毒RNA合成系统能够识别该模板。通过具有由依赖于DNA的RNA聚合酶识别的启动子的质粒的转染，可完成来自正极链RNA模板的表达。例如，可以与痘苗病毒T7系统联合，使用在T7启动子控制下的、编码正RNA模板的质粒DNA。
可以构建双顺反子mRNA，以允许从内部起始病毒序列的翻译，且便于从常规的末端起始位点表达外源蛋白的编码序列；或者，反之亦然。可选择地，可以从内部转录单位表达外源蛋白，在该内部转录单位中，转录单位具有一起始位点和聚腺苷酸化位点。在另一个实施方案中，将外源基因插入到新城疫病毒基因中，使得所产生的表达蛋白为一融合蛋白。
可以用本发明的重组突变的新城疫病毒RNA模板来转染表达依赖于RNA的RNA聚合酶的、且供互补用的、转化了的细胞系。可选择地，对于病毒的特定(嵌合)RNA转染，可以使用从适当的启动子表达的质粒。利用提供依赖于RNA的RNA聚合酶的辅助病毒，也可以达到互补。另外，也描述用于新城疫病毒的、不依赖于病毒的复制系统。对于新城疫病毒的特异性复制和表达，必需的新城疫病毒蛋白的最小子集(subset)为三种蛋白，即所述的L、P和NP；用痘苗病毒T7系统可以由质粒表达它们。在再一个实施方案中，当用编码新城疫病毒基因组之反义基因组拷贝的质粒来提供该病毒基因组时，新城疫病毒的特异性复制和表达必需的新城疫病毒蛋白的最小子集为所述的L蛋白和P蛋白。当转录该新城疫病毒基因组的反义基因组拷贝时，所述NP聚合酶蛋白是首先转录出的蛋白，因而不必另外地以反式提供该NP聚合酶。
可以将所得到的表达产物和/或嵌合病毒粒子便利地应用于疫苗制剂。可将本发明的表达产物和嵌合病毒粒子基因工程化，以产生抵抗广泛范围的病原体的疫苗；所述疫苗包括病毒抗原、肿瘤抗原以及涉及自身免疫疾病的自身抗原。尤其是，可将本发明的嵌合病毒粒子基因工程化，以产生抗HIV的疫苗；其中，将来自HIV的gp160和/或来自HIV内部蛋白的免疫源性多肽工程化到糖蛋白HN蛋白中，以构建既能够引起脊椎动物体液免疫应答、又能够引起细胞介导的免疫应答的疫苗。为了这目的而使用重组新城疫病毒是尤其有吸引力的，因为新城疫病毒在人类中是非致病的。已知新城疫病毒的抗肿瘤特性和免疫增强特性，使用重组新城疫病毒提供肿瘤抗原，是特别有吸引力的。3.1.定义
当用于本文时，下面的术语将有所指出意思。
cRNA＝反义基因组RNA
HIV＝人免疫缺陷病毒
L＝大蛋白
M＝基质蛋白(沿被膜的内侧排列)
MDCK＝Madin Darby犬肾细胞
MDBK＝MadinDarby牛肾细胞
moi＝感染复数
NA＝神经氨酸酶(包膜糖蛋白)
NDV＝新城疫病毒
NP＝核衣壳(与RNA有关、且对于聚合酶活性是需要的)
NS＝非结构蛋白(功能未知)
nt＝核苷酸
PA、PB1、PB2＝RNA指导的RNA聚合酶的组分
RNP＝核糖核蛋白
rRNP＝重组的RNP
vRNP＝基因组病毒RNA
WSN＝流感A/WSN/33病毒
WSN-HK病毒：包含来自WSN病毒的七种基因和来自流感A/HK/8/68病毒的NA基因的重配的病毒
4.附图简述
图1 新城疫病毒小基因组的图解表示。上部的图解描绘：包括T7启动子5’末端序列(基因组RNA的5’末端，191个核苷酸)、插入的核苷酸(CTTAA)、CAT ORF的667个核苷酸、3’末端序列(基因组RNA的5’末端、121个核苷酸)，Bbs1位点和核酸酶位点的PNDVCAT质粒。下部的图解描绘：产生自体外转录的嵌合NDV-CAT RNA。作为基于NDV的扩增和NDV-CAT嵌合小基因组的转录的结果，在转染的细胞中检测出CAT活性。
图2A-C PTM1表达载体的图解表示。
PTM1-NP编码新城疫病毒的NP蛋白。
PTM1-P编码新城疫病毒的P蛋白。
PTM1-L编码新城疫病毒的L蛋白。
图3新城疫病毒5’和3’非编码末端区的RNA序列(正义)。CAT基因5’的序列代表新城疫病毒正义基因组的5’非编码末端区的121个核苷酸，它包括：前导序列的65个核苷酸(粗体的)再加上NP基因UTR的56个核苷酸。CAT基因3’的序列代表插入的核苷酸cuuaa(用小写字母表示)和新城疫病毒正义基因组的非编码末端区的191个核苷酸，后者包括：L基因UTR的127个核苷酸再加上尾随区(trailer region)的64个核苷酸(粗体的)。
图4A-B重组NDV克隆结构的图解表示。图4B表达HIV的Enp和Gag的感染性NDV的说明。上部的板条：在M基因和L基因之间的是HIV的Enp和Gag。下部的板条：HIV的Enp和Gag在NP基因的3’。
图5当与Kurilla等(1985 Virology 145：203-212)的(3’末端)序列和Yusoff等(1987 Nucleic Acids Research 15：3961-3976)的(5’末端)序列对比时的NDV的3’末端和5’末端的图解表示。
图6用于基于新城疫病毒的外源基因表达的、基于质粒的反向遗传学方法。用表达T7聚合酶的重组痘苗病毒感染细胞。另外，用1)的各种质粒DNA和2)的质粒DNA转染细胞，所述1)的各种质粒DNA编码在T7启动子的转录控制之下的NDV的L蛋白、NP蛋白和P蛋白(相应各为pTM1-L、pTM1-NP和pTM1-P)；所述2)的质粒DNA编码在T7启动子的转录控制之下的嵌合NDV-CAT小基因组(pT7-NDV-CAT-RB)。通过依靠由核酶序列(RB)促进的切割，得到NDV-CAT小基因组的适当3’末端。在转染细胞中，NDV-CAT嵌合小基因组的扩增和转录产生可检测出的CAT活性。把在NDV-CAT小基因组的3’末端和5’末端的非编码区以黑框表示。
图7从合成的DNA拯救新城疫病毒。用表达T7聚合酶的重组痘苗病毒感染细胞。另外，用1)的各种质粒DNA和2)的质粒DNA转染细胞，所述1)的各种质粒DNA编码在T7启动子的转录控制之下的NDV的L蛋白、NP蛋白和P蛋白(相应各为pTM1-L、pTM1-NP和pTM1-P)；所述2)的质粒DNA编码在T7启动子的转录控制之下的NDV反义基因组(pT7-NDV+-RB)。通过依靠由核酶序列(RB)促进的切割，得到NDV反义基因组的适当3’末端。NDV反义基因组的扩增和转录导致感染性新城疫病毒的拯救。把在NDV反义基因组的3’末端和5’末端的非编码区以黑框表示。
图8基于NDV的、作为内部转录单位插入到NDV反义基因组中的外源基因的表达。用表达T7聚合酶的重组痘苗病毒感染细胞。另外，用1)的各种质粒DNA和2)的质粒DNA转染细胞，所述1)的各种质粒DNA编码在T7启动子的转录控制之下的NDV的L蛋白、NP蛋白和P蛋白(相应各为pTM1-L、pTM1-NP和pTM1-P)；所述2)的质粒DNA编码在T7启动子的转录控制之下的嵌合NDV-CAT反义基因组(pT7-NDV-CAT-RB)。在该嵌合NDV-CAT反义基因组中，CAT的可读框取代了野生型NDV反义基因组的天然存在的HN可读框。通过依靠由核酶序列(RB)促进的切割，得到嵌合NDV-CAT反义基因组的适当3’末端。在转染细胞中，嵌合NDV-CAT反义基因组的扩增和转录产生可检测出的CAT活性。把在嵌合NDV-CAT反义基因组的3’末端和5’末端的非编码区以黑框表示。
5.发明描述
本发明涉及表达异源基因或表达突变的新城疫病毒基因或表达来自不同新城疫病毒株的病毒基因之组合的基因工程新城疫病毒和病毒载体。本发明涉及重组负链NDV病毒RNA模板的构建和应用，可以用所述模板和病毒RNA指导的RNA聚合酶在合适的宿主细胞中表达异源基因产物，并/或在病毒粒子中拯救异源基因。在本发明的一个特定的实施方案中，该异源基因产物为一来源于人免疫缺陷病毒基因组的肽或蛋白。或者在体外、或者在体内通过用DNA指导的RNA聚合酶转录适当的DNA序列，可制备本发明的RNA模板；所述DNA指导的RNA聚合酶例如噬菌体T7、T3、SP6聚合酶或例如聚合酶I的真核聚合酶。
可以用重组的RNA模板转染连续传代的细胞系/转染了的细胞系，所述细胞系表达RNA指导的RNA聚合酶蛋白供互补用；通过操作实施例说明这一点；在所述操作实施例中，将克隆DNA的RNA转录物转染到表达NDV聚合酶蛋白的细胞中；所述克隆DNA的RNA转录物包含负义方向的氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因的编码区，在该基因的编码区两侧的是NDV-CL(Califomia株/11914/1944样株)(Meindl等，1974 Virology58：457-463)RNA的5’末端核苷酸和3’末端核苷酸。在一个优选的实施方案中，使用不依赖于病毒的复制系统回收嵌合的NDV；在该实施方案中，将编码所述NDV基因组或反义基因组的质粒DNA与编码最小子集的新城疫病毒蛋白的质粒DNA共表达，所述最小子集的新城疫病毒蛋白对于特异性的病毒复制和表达是必需的；通过下文描述操作实施例说明这一点。
在体内重建NDV的能力允许对表达外源基因或表达突变的NDV基因的、新的嵌合新城疫病毒进行设计。在体内重建NDV的能力同样允许表达对来自不同新城疫病毒株基因的、新的嵌合新城疫病毒进行设计。达到这个目的的一种方式涉及修饰现存的NDV基因。例如，可以修饰所述的HN基因，以在其外部域中包含外源序列。在异源序列为表位或病原体抗原的场合下，可以用这些嵌合病毒诱导抵抗衍生出上述的这些决定簇的疾病因子的、保护性免疫应答。
按照本发明，构建一嵌合RNA；在该嵌合RNA中，将一来源于人免疫缺陷病毒的gp160编码区的编码序列插入到NDV的HN编码序列中；且由于将这嵌合的RNA片段转染到用野生型NDV感染了的宿主细胞中，而产生嵌合病毒。而且，这样的嵌合病毒应该既能够引起脊椎动物体液免疫应答、又能够引起细胞介导的免疫应答。此外，本发明涉及用重组新城疫病毒或嵌合新城疫病毒诱导干扰素和相关的途径。
本发明涉及使用本发明的病毒载体和嵌合病毒来配制抵抗广泛范围的病毒和/或抗原的疫苗；所述抗原包括肿瘤抗原。可以用本发明的病毒载体和嵌合病毒通过激发体液免疫应答、细胞免疫应答或通过激发对一种抗原的耐受性来调节受治疗者的免疫系统。当用于本文时，受治疗者意指：人、灵长目动物、马、牛、绵羊、猪、山羊、狗、猫、鸟纲的物种和啮齿动物。当传递肿瘤抗原时，可以用本发明医治患有适合于免疫介导的排斥之疾病的受治疗者；所述疾病例如非实体瘤或小体积的实体瘤。也设想用本文描述的病毒载体和嵌合病毒传递肿瘤抗原对于切除大的实体瘤后治疗将是有用的。同样，可以用本发明医治被怀疑患有癌症的受治疗者。
为了描述而不是作为限制，可以单独地把本发明分成下面的阶段：(a)构建重组的RNA模板；(b)用该重组RNA模板表达异源基因产物；以及(c)在重组病毒粒子中拯救异源基因。为了论述清楚，在操作实施例中用NDV-CL(Califomia株/11914/1944样株)描述本发明；然而，可以利用任一新城疫病毒株。5.1.构建重组的RNA模板
本发明的一个特定的实施方案是本申请人对NDV负义基因组RNA5’末端和3’末端的正确核苷酸序列的鉴定。本发明NDV负义基因组RNA5’末端和3’末端的核苷酸序列大大不同于如在图5中显示的、先前公开的NDV3’末端的序列。NDV5’末端和3’末端正确核苷酸序列的鉴定为重组的新城疫病毒RNA模板的首次工程化、重组RNA模板的表达和重组新城疫病毒粒子的拯救创造了条件。本发明不仅包括具有如在图5中显示的核苷酸序列的5’末端和3’末端，而且包括对所述末端的任何修饰或突变、或者任何仍保留野生型末端之功能的其片段；所述野生型末端之功能即病毒RNA合成系统识别该模板所需要的信号。
运用本技术领域的已知技术，可以构建侧翼为病毒聚合酶结合位点/启动子的互补物的异源基因编码序列；所述互补物例如本发明新城疫病毒3’末端的互补物，或者新城疫病毒的3’末端和5’末端两个末端的互补物。所产生的RNA模板可以是负极链，且包含使病毒RNA合成系统能够识别该模板的适当的末端序列。可选择地，也可以使用含有适当的末端序列的正极链RNA模板，所述适当的末端序列使病毒RNA合成系统能够识别该模板。可以克隆包含这些杂种序列的重组DNA分子，并用DNA指导的RNA聚合酶例如噬菌体T7、T3、SP6聚合酶或例如聚合酶I等等的真核聚合酶将它们转录；从而在体外或体内产生具有合适的病毒序列的重组RNA模板，所述病毒序列为病毒聚合酶的识别与活性创造条件。
在再一个实施方案中，实际上可以将任何异源序列构建到本发明的嵌合病毒中；包括但不限制于抗原，例如1)病原体特征性抗原，2)自身免疫疾病特征性抗原，3)过敏原特征性抗原，以及4)作为肿瘤特征性抗原。举例来说，可被工程化到本发明的嵌合病毒中的异源基因的序列包括但不限制于：诸如gp160之类的人免疫缺陷病毒(HIV)的表位、乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、疱疹病毒的糖蛋白(例如gD，gE)、脊髓灰质炎病毒的VP1、以及非病毒病原体的抗原决定簇，所述病原体例如细菌和几种寄生虫，这只是例举少数例子。
一般将从哺乳动物组织的细胞表面、细胞质、细胞核、线粒体等等得到自身免疫疾病特征性抗原，所述抗原包括糖尿病特征性抗原、多发性硬化特征性抗原、系统性红斑狼疮特征性抗原、类风湿性关节炎特征性抗原、恶性贫血特征性抗原、艾迪生(Addison’s)病特征性抗原、硬皮病特征性抗原、自身免疫萎缩性胃炎特征性抗原、青少年糖尿病特征性抗原、以及盘状红斑狼疮特征性抗原。
作为过敏原的抗原通常是蛋白或糖蛋白，这样的抗原包括来源于花粉、尘埃(dust)、霉菌、孢子、头皮屑、昆虫和食物的抗原。
一般将从肿瘤组织细胞的细胞表面、细胞质、细胞核、细胞器等等得到肿瘤抗原特征性抗原。实例包括肿瘤蛋白特性的抗原、与肿瘤有关的病毒蛋白、以及糖蛋白，所述肿瘤蛋白特性的抗原包括由突变癌基因编码的蛋白。肿瘤包括但不限制于来源于各种类型癌的肿瘤，所述各种类型癌即：唇癌、鼻咽癌、咽和口腔癌、食管癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肝癌、胆囊癌、胰腺癌、喉癌、肺癌和支气管癌、皮肤的黑素瘤、乳腺癌、宫颈癌、子宫的癌、卵巢癌、膀胱癌、肾癌、子宫癌、脑和神经系统的其它部分的癌、甲状腺癌、前列腺癌、睾丸癌、霍奇金(Hodgkin’s)病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤以及白血病。
在本发明特定的一个实施方案中，从人免疫缺陷病毒(HIV)的基因组得到所述异源序列，优选人免疫缺陷病毒1或人免疫缺陷病毒-2。在本发明另一个实施方案中，可以将异源编码序列插入到NDV基因编码序列内，以致于表达在NDV病毒蛋白内含有所述异源肽序列的嵌合基因产物。在这样的本发明的实施方案中，也可以从人免疫缺陷病毒基因组，优选从人免疫缺陷病毒1或人免疫缺陷病毒2的基因组，得到所述的异源序列。
在异源序列为从HIV得到的异源序列的实例中，这样的序列可以包括但不限制于来源于如下基因或部分的序列，所述如下基因或部分即：env基因(即编码gp160、gp120和/或gp41的全部或部分的序列)、pol基因(即编码反转录酶、内切核酸酶、蛋白酶和/或整合酶的全部或部分的序列)、gag基因(即编码p7、p6、p55、p17/18、p24/25的全部或部分的序列)、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr和/或vpx。
在再一个实施方案中，可被工程化到所述的嵌合病毒中的异源基因序列包括：编码具有免疫增强活性之蛋白的异源基因序列。免疫增强蛋白的实例包括但不限制于：细胞因子、1型干扰素、γ干扰素、集落刺激因子、白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-12。
用于构建这些杂种分子的一种方法是：将异源编码序列插入到NDV基因的DNA互补物中，使得该异源序列的两侧是病毒聚合酶活性所需要的病毒序列；所述病毒序列即病毒聚合酶结合位点/启动子和聚腺苷酸化位点，在下文将该病毒聚合酶结合位点/启动子称为病毒聚合酶结合位点。在一优选的实施方案中，使该异源编码序列两侧为病毒序列，所述序列包括5’末端和3’末端的复制启动子、基因起始序列和基因终止序列、以及在5’末端和/或3’末端发现的包装信号。在一个选择的方法中，可以将编码病毒聚合酶结合位点的寡核苷酸例如所述病毒基因组片段的3’末端或两个末端的互补物连接到异源编码序列上，以构建杂种分子。以前，根据在目标基因内存在的、适当的限制性内切酶位点来决定目标基因内外源基因或外源基因片段的布置。然而，近来在分子生物学方面的进展，已大大地使这问题变得较不重要了。通过运用定点诱变(例如，参见：例如由Kunkel，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82；488描述的技术)，可以在目标基因内的任何位点容易地安置限制性内切酶的位点。在下文描述的聚合酶链反应(PCR)技术的各种变体也为序列的特定插入(即限制性内切酶位点)创造了条件；且便于容易地构建杂种分子。另一种方法是，可用PCR反应制备重组模板，而不需要克隆。例如，可以用PCR反应制备包含DNA指导的RNA聚合酶启动子(例如噬菌体T7、T3或SP6)的双链DNA分子、以及含有异源基因和NDV聚合酶结合位点的杂种序列。然后，可以从这重组的DNA直接转录出RNA模板。在再一个实施方案中，通过用RNA连接酶连接表示异源基因负极链的RNA与表示病毒聚合酶结合位点的RNA，可以制备重组的RNA模板。在下面的小节中描述了病毒聚合酶活性的序列要求和可按照本发明使用的构成物的序列要求。5.1.1.将所述异源基因序列插入到所述HN、P、NP、M、F、L基因中
对于异源基因产物的插入，可以使用编码HN、P、NP、M、F或L蛋白的基因片段。或者通过用外源基因完全取代病毒编码区，或者通过部分取代，可以完成将外源基因序列插入到这些片段的任一种中。通过使用PCR指导的诱变，或许能最好地完成完全取代。简短地说，PCR引物A要以从5’末端到3’末端的方向包含：一个特有的限制性内切酶位点，例如一个IIS类的限制性内切酶位点(即一种“跳码者(shifter)”的酶，该酶识别一特定的序列，但或者在那序列的上游、或者在其下游切割该DNA)；互补于所述NDV基因区的一段核苷酸；以及互补于外源基因产物羧基末端的编码部分的一段核苷酸。PCR引物B要以从5’末端到3’末端的方向包含：一个特有的限制性内切酶位点；互补于NDV基因的一段核苷酸；以及对应于外源基因的5’编码部分的一段核苷酸。在用这些引物和一外源基因的克隆拷贝进行PCR反应后，可以用所述特有的限制性内切酶位点将产物切下及克隆。用IIS类酶消化和用纯化的噬菌体聚合酶转录，能产生包含所述NDV基因的正确非翻译末端和一外源基因插入物的RNA分子。在另外一个实施方案中，可以用PCR引物引导的反应来制备包含噬菌体启动子序列和所述杂种基因序列的双链DNA，使得可直接转录RNA模板而不用克隆。5.1.2.将所述异源基因序列插入到所述HN基因中
NDV的血凝素活性和神经氨酸酶活性由一单基因HN编码。该HN蛋白是该病毒的主要的表面糖蛋白。对于各种各样的病毒，例如流感，已证实血凝素蛋白和神经氨酸酶蛋白含有许多抗原位点。因而，对于感染后的体液免疫应答，这种蛋白是一潜在的目标。因此，用外源蛋白的部分取代HN内的抗原位点，可以提供有力的针对该外源肽的体液反应。如果在HN分子内插入一序列，且在该HN外表面上表示所述序列，则所述序列该是免疫源的。例如，衍生自HIV gp160的一种肽可以取代HIN蛋白的抗原位点，导致两者都引起体液免疫应答。用一种不同的方法，可以在所述抗原位点内插入外源肽序列而不缺失任何病毒序列。这样的构成物的表达产物在针对所述外来抗原的疫苗方面可能是有用的；并且确实可以防止更早一些时候论述的问题发生，所述问题即：在接种了的宿主中重组病毒繁殖的问题。仅在抗原位点具有取代的完整HN分子可以为HN的功能创造条件，且因而便于构建一种可行的病毒。因此，可以培养这病毒，而不需要另外的辅助功能。也可以用其它的方法将这病毒减毒，以避免任何意外漏出的危险。
可以进行其它杂种的构建，从而在细胞表面表达蛋白，或使表达的蛋白能够从细胞中被释放出来。作为一种表面糖蛋白，所述HN有一氨基末端可切割的信号序列和一羧基末端序列；该氨基末端可切割的信号序列是转运到细胞表面所必需的，该羧基末端序列是膜锚活动所必需的。为了在细胞表面表达一完整外源蛋白，用这些HN信号产生杂种蛋白可能是必需的。在这种情况下，可以以一分离的融合蛋白的形式，从另一内部启动子表达该融合蛋白。或者，如果仅存在该转运信号而缺乏膜锚域，则该蛋白可被分泌出细胞。
5.1.3.双顺反子RNA的构建和异源蛋白的表达
可以构建双顺反子mRNA，以允许从内部开始病毒序列的翻译，且便于从常规的末端起始位点表达外源蛋白编码序列。可选择地，可构建双顺反子mRNA序列；其中，从常规的末端可读框翻译该病毒序列，同时从一内部位点起始外源序列。可以利用某些内部核糖体进入位点(IRES)序列。所选择的IRES序列应该足够地短，从而不妨碍新城疫病毒的包装限制。因而，更可取的是：为这样的双顺反子方法而选择的IRES应该不长于500个核苷酸；优选具有少于250个核苷酸的IRES序列。此外，更好的是：所利用的IRES应该与小RNA病毒元件不具有序列或结构的同源性。优选的IRES元件包括但不限制于：哺乳动物的BiP IRES和丙型肝炎病毒的IRES。
可选择地，可以从一新的内部转录单位表达外源蛋白，其中该转录单位具有一起始位点和聚腺苷酸化位点。在另一个实施方案中，将外源基因插入到新城疫病毒基因中，使得所产生的表达蛋白为一融合蛋白。
5.2.用重组RNA模板表达异源基因产物
可以以各种各样的方式使用如上描述制备的重组模板，在适当的宿主细胞中表达异源基因产物或产生表达异源基因产物的嵌合病毒。在一个实施方案中，可以用重组模板转染适当的宿主细胞，该重组模板可以指导异源基因产物以高水平表达。保证高水平表达的宿主细胞系统包括提供病毒功能的传代细胞系，例如用NDV超感染的细胞系，工程化的、从而互补NDV功能的细胞系，等等。
在本发明另外一个实施方案中，为了完成异源基因产物的表达，可以用该重组模板来转染表达病毒聚合酶蛋白的细胞系。为此，可把表达例如L蛋白的聚合酶蛋白的、转化细胞系用作适当的宿主细胞。可以将宿主细胞类似地工程化，以提供其它的病毒功能，或者提供例如NP或HN的另外的功能。
在另一个实施方案中，为了完成异源基因产物的表达，一种辅助病毒可以提供被细胞利用的RNA聚合酶蛋白。
在再一个实施方案中，可以用编码病毒蛋白的载体来转染细胞，所述病毒蛋白例如所述的NP蛋白、P蛋白和L蛋白。在图2A-2C中说明了这样的载体的实例。
5.3.嵌合负链RNA病毒的制备
为了制备嵌合病毒，可以用各种修饰的新城疫病毒RNA、cDNA或编码NDV基因组和/或外源蛋白的正义或负义的RNA转染细胞，所述细胞提供复制和拯救所需要的病毒蛋白与功能，或者也用“亲本”新城疫病毒感染所述的细胞。在一个可选择的方法中，可以将编码或者野生型、或者修饰的新城疫病毒基因组RNA或反义基因组RNA的质粒与编码例如NP、P或L的病毒聚合酶蛋白的质粒共转染到宿主细胞中去。在另一个实施方案中，可以将编码新城疫病毒反义基因组RNA的质粒与编码病毒聚合酶蛋白P和L的质粒共转染；由于该NP聚合酶蛋白是第一个由新城疫病毒基因组的反义基因组拷贝转录出的蛋白，因而不必另外地以反式提供该NP聚合酶。
在本发明的一个实施方案中，可以利用反向遗传学技术来工程化所述的嵌合负链RNA病毒，该技术涉及合成的、含有负链病毒RNA之非编码区的重组病毒RNA的制备；对于用病毒聚合酶的识别以及对产生成熟病毒粒子所必需的包装信号，所述负链病毒RNA之非编码区是必不可少的。可以复制各种合成的重组质粒DNA和RNA，并可通过如在下面的文献中描述的许多本技术领域的已知技术，将它们拯救到感染性的病毒粒子中；所述文献为：1992年11月24日授予的第5,166,057号美国专利、1998年12月29日授予的第5,854,037号美国专利、1996年2月20日公布的欧洲专利公布号EP 0702085A1、序号09/152,845的美国专利申请、1997年4月3日公布的国际专利公布号PCT WO97/12032、1996年11月7日公布的WO 96/34625、欧洲专利公布号EP-A780475、1999年1月21日公布的WO 99/02657、1998年11月26日公布的WO98/53078、1998年1月22日公布的WO 98/02530、1999年4月1日公布的WO 99/15672、1998年4月2日公布的WO 98/13501、1997年2月20日公布的WO97/06270、以及1997年6月25日公布的EPO78047SA1；通过引用将这些文献中的每份作为一个整体结合到本文中。
有许多不同的、可以用来运用反向遗传学手段拯救负链RNA病毒的方法。首先，从重组DNA模板合成各种重组RNA，且在体外将各种重组RNA与纯化的病毒聚合酶复合体一起重建，以形成各种可被用来转染细胞的、重组的核糖核蛋白(RNP)。在另一个方法中，如果在或者体外或者体内的合成RNA的转录期间存在病毒聚合酶蛋白，则达到更有效的转染。用这种方法，可以从cDNA质粒转录出各种合成的RNA，所述cDNA质粒或者在体外与编码所述聚合酶蛋白的cDNA质粒一起共转录，或者在体内于存在聚合酶蛋白的情况下，即在瞬时或组成型地表达所述聚合酶蛋白的细胞中，转录所述的cDNA质粒。
在另外一个实施方案中，可以用反向遗传学技术和重配技术的组合来构建在分段RNA病毒中具有所希望的表位的、减毒的病毒。例如，可以把减毒的病毒(通过自然选择、诱变或用反向遗传学技术而产生的)与具有所希望的疫苗表位的病毒株(通过自然选择、诱变或用反向遗传学技术而产生的)共感染到允许分段基因组重配的宿主中。然后，可选择既显示减毒的表型、又显示所希望的表位的重配病毒。
在重配之后，可以分离新的病毒，并通过杂交分析鉴定它们的基因组。在本文描述的另外的方法中，在表达NDV病毒聚合酶蛋白的宿主细胞系统中(例如，在病毒/宿主细胞表达系统中，在工程化以表达聚合酶蛋白的转化细胞系中，等等)，可以重复感染性嵌合病毒的生产；结果是感染性嵌合病毒被拯救。在这个实例中，不需要利用辅助病毒，因为这种功能由表达的所述病毒聚合酶蛋白提供。
按照本发明，可以用本领域技术熟练人员已知的任何技术来完成嵌合病毒的复制和拯救。一种方法涉及在转染宿主细胞前提供在体外复制所需要的病毒蛋白和功能。在这样的一个实施方案中，可以以野生型病毒、辅助病毒、纯化的病毒蛋白或重组表达的病毒蛋白之形式提供病毒蛋白。可以在编码该嵌合病毒的合成的cDNA或RNA转录前、转录期间或转录后提供所述的病毒蛋白。可以用全部的混合物来转染宿主细胞。在另一种方法中，可以在编码该嵌合病毒的合成的cDNA或RNA转录前或转录期间提供复制所需要的病毒蛋白和功能。在这样的一个实施方案中，以表达该病毒蛋白的野生型病毒、辅助病毒、病毒提取物、合成的cDNA或RNA的形式，提供复制所需要的病毒蛋白和功能；通过感染或转染将其引入到宿主细胞中。这种感染/转染发生在引入合成的cDNA或编码该嵌合病毒的RNA之前，或者与引入编码该嵌合病毒的合成的cDNA或RNA同时发生。
按照一特别吸引人的方法，经工程化从而表达全部新城疫病毒基因的细胞，可以导致含有所希望基因型的感染性嵌合病毒的产生；因而省去了对选择系统的需要。理论上，人们可以用一外源序列取代NDV六个基因中的任何一个或六个基因中任何一个基因的一部分。然而，这种取代产物的必需作用是繁殖缺陷病毒(因为失去或改变正常的病毒基因产物而缺陷的病毒)的能力。存在许多可能的方法来回避该问题。按照一种方法，可以在构建以组成型地表达的野生型蛋白的细胞系中培养具有突变的同一蛋白的病毒。通过这种方式，该细胞系互补所述病毒的突变。可以用类似的技术构建组成型地表达任何NDV基因的转化细胞系。可以用这些构建以表达该病毒蛋白的细胞系，以互补重组病毒中的缺陷并因此繁殖它。可选择地，可以用某些天然宿主区系(range system)来繁殖重组病毒。
在再一个实施方案中，可以以合成的cDNA或RNA形式的遗传物质，提供复制所需要的病毒蛋白和功能；使得所述遗传物质与编码该嵌合病毒的合成cDNA或RNA共转录。按照一特别吸引人的方法，如在实施例中描述的，将表达该嵌合病毒与病毒聚合酶和/或其它病毒功能的质粒共转染到宿主细胞中；参见上述11节。
繁殖该重组病毒的另一个方法可包括与野生型病毒共培养。通过简易地选取重组病毒并用这重组病毒和另一种野生型病毒(最好是一疫苗株)共感染细胞，可以做到这一步。该野生型病毒应补充缺陷病毒的基因产物，并使野生型病毒和重组病毒都能生长。可选择地，可以用辅助病毒支持该重组病毒的繁殖。
在另一个方法中，可以在用表达新城疫病毒聚合酶蛋白的重组病毒共感染的细胞中复制合成的模板。事实上，可用这方法拯救依据本发明的重组的感染性病毒。为了这目的，可以在任一表达载体/宿主细胞系统中表达该新城疫病毒聚合酶蛋白；所述的表达载体/宿主细胞系统包括但不限制于：病毒表达载体(例如痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒、等等)或表达聚合酶蛋白的细胞系(例如：参见Krystal等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：2709-2713)。此外，对表达新城疫病毒全部六种蛋白的宿主细胞的感染可以导致感染性嵌合病毒粒子的产生。该系统能省去对选择系统的需要，因为产生的所有重组病毒都会具有所希望的基因型。应该注意：构建一重组病毒而不改变病毒的生存力可以是可能的。而且这些改变的病毒会是有生长能力的，并且不会需要辅助功能来复制。5.4.用所述嵌合病毒的疫苗制剂
本发明包括包含本发明的工程化负链RNA病毒的疫苗制剂。本发明包括在疫苗制剂方面应用已修饰的重组新城疫病毒来给予抵抗新城疫病毒感染的L保护。在再一个实施方案中，可以将本发明的重组新城疫病毒用作载体，来表达诱导针对各种各样的病原体中任一种的保护性应答的外源表位。
本发明包括给予人和动物的疫苗制剂。尤其是，本发明包括给予包括猫和狗的家畜、包括狐狸和浣熊的野生动物、包括牛、马、猪、绵羊和山羊的牲畜、以及包括鸡与火鸡的家禽的疫苗制剂。
本发明包括有效抵抗禽类疾病病原体的疫苗制剂，所述病原体包括：新城疫病毒、马立克氏病病毒(MDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性腔上囊炎病毒、鸡贫血病毒(CAV)、传染性喉气管炎病毒(ILV)、禽造白细胞组织增生病毒(ALV)、网状内皮组织增殖病毒(RV)、以及禽流感病毒。
在另一个实施方案中，本发明包括有效抵抗家畜疾病病原体的疫苗制剂，所述病原体包括：狂犬病病毒、猫白血病病毒(FLV)和犬瘟热病毒。在再一个实施方案中，本发明包括有效保护家畜以防水泡性口炎病毒、狂犬病病毒、牛瘟病毒、猪痘病毒的疫苗制剂，而且包括有效保护野生动物以防狂犬病病毒的疫苗制剂。
可以将按反义遗传学方法产生的减毒病毒用于本文描述的疫苗和药物制剂中。也可以用反义遗传学技术来建造对疫苗生产重要的其它病毒基因的另外的突变；即可以将有效疫苗株变异体的表位工程化到减毒的病毒中。可选择地，可以将包括来源于其它病毒病原体或非病毒病原体的抗原的、完全外源的表位工程化到减毒株中。例如，可以将非相关病毒的抗原工程化到减毒株中，所述非相关病毒的抗原例如：HIV抗原(gp160、gp120、gp41)、寄生虫抗原(例如疟疾)、细菌或真菌抗原或肿瘤抗原。可选择地，可以将在体内改变病毒向性的表位工程化到本发明的嵌合减毒病毒中。
实际上可将任一异源基因序列构建到本发明的嵌合病毒中供疫苗之用。最好是，可由该嵌合病毒表达或者可以作为该嵌合病毒的部分而表达：诱导针对各种各样病原体中任一种的保护性免疫应答的表位、或结合中和抗体的抗原。例如，可以被构建到本发明的嵌合病毒中的异源基因序列包括但不限制于：流感糖蛋白(尤其是血凝素H5、H7)、马立克氏病病毒的表位；以下病毒的表位：传染性法氏囊病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡贫血病毒(CAV)、传染性喉气管炎病毒(ILV)、禽造白细胞组织增生病毒(ALV)、网状内皮组织增殖病毒(RV)、禽流感病毒(AIV)、狂犬病病毒、猫白血病病毒、犬瘟热病毒、水泡性口炎病毒、牛瘟病毒、以及猪痘病毒(参见Field等(ed.)，1991，基础病毒学(Fundamental Virology)，第二版，RavenPress，New York，通过引用全盘结合到本文中)。
在再一个实施方案中，可以被工程化到所述嵌合病毒中的异源基因序列包括：编码具免疫增强活性的蛋白的异源基因序列。免疫增强蛋白的实例包括但不限制于：细胞因子、1型干扰素、γ干扰素、集落刺激因子、白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-12。
另外，可以被构建到本发明的嵌合病毒中供疫苗之用的异源基因序列包括但不限制于：来源于人免疫缺陷病毒(HIV)的序列，优选来源于1型或2型HIV的序列。在一个优选的实施方案中，可以将可以是一抗原源的来源于HIV的免疫原性肽构建到嵌合的新城疫病毒中；然后，可以用包含免疫原性肽的嵌合新城疫病毒来引起脊椎动物的免疫应答。这样的来源于HIV的免疫原性肽可以包括但不限制于：来源于env基因(即编码gp160、gp120和/或gp41的全部或部分的序列)、pol基因(即编码反转录酶、内切核酸酶、蛋白酶和/或整合酶的全部或部分的序列)、gag基因(即编码p7、p6、p55、p17/18、p24/25的全部或部分的序列)、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr和/或vpx的序列。
可以从下列物质得到其它的异源序列，所述下列物质即乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、甲型肝炎病毒或丙型肝炎病毒表面抗原、EB(EpsteinBarr)病毒的糖蛋白、人乳头瘤病毒的糖蛋白、呼吸道合胞病毒的糖蛋白的糖蛋白、副流感病毒的糖蛋白、仙台病毒的糖蛋白、猿猴病毒5或腮腺炎病毒糖蛋白、流感病毒的糖蛋白、疱疹病毒的糖蛋白(例如gD，gE)、脊髓灰质炎病毒的VP1、非病毒病原体例如细菌和寄生虫的抗原决定簇，这仅举几个例子。在另一个实施方案中，可以表达免疫球蛋白基因的全部或部分。例如，可以将模拟这样表位的抗独特型免疫球蛋白的可变区构建到本发明的嵌合病毒中。
可以从肿瘤抗原得到其它异源序列；用所得到的嵌合病毒来引起对肿瘤细胞的免疫应答，从而导致体内肿瘤的消退。可以将这些疫苗与其它治疗方式结合使用，所述的其它治疗方式包括但不限制于：用于治疗肿瘤的化疗、放疗、外科手术、骨髓移植等等。按照本发明，可以构建重组病毒以表达肿瘤相关抗原(TAA)，所述肿瘤相关抗原包括但不限制于：由T细胞识别的人肿瘤抗原(Robbins和Kawakami，1996，Curr.Opin.Immunol.8：628-636，通过引用全部结合到本文中)、黑素细胞谱系蛋白包括gp100、MART-1/MelanA、TRP-1(gp75)、酪氨酸酶；肿瘤特异性的广泛共有的抗原、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-1、N-乙酰氨基葡糖基转移酶-V、p15；肿瘤特异性的突变蛋白、β-连环蛋白(catenin)、MUM-1、CDK4；乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌和胰腺癌的非黑色素瘤抗原、HER-2/neu、人乳头瘤病毒-E6、人乳头瘤病毒-E7、MUC-1。
可以配制活的重组病毒疫苗或者灭活的重组病毒疫苗。活疫苗可能是优选的，因为在宿主中的增殖导致延长的、性质和大小与天然感染中发生的性质和大小相似的刺激；且因此使该宿主具有真实的、长期持久的免疫。用包括在细胞培养物中或在鸡胚的尿囊中繁殖病毒继之以纯化的常规方法，可以完成这样的活重组病毒疫苗制剂的生产。另外，由于已证实NDV在人类中是非致病的，因而将这病毒用作活疫苗是非常适合的。
在这方面，将基因工程化NDV(载体)用于疫苗目的，可能需要在这些病毒株中存在减毒的特征。将适当的突变(例如缺失)引入到用于转染的模板中，可以提供具有减毒特性的新病毒。例如，可以使与温度敏感或冷适应相关的、特定的错义突变成为缺失突变。这些突变应当是比与温度敏感突变体或冷突变体相关的点突变更稳定的，且回复突变频率该是极低的。
可选择地，可以构建具有“自杀”特性的嵌合病毒。这样的病毒在宿主内大概仅经历一次或几次复制循环。当用作疫苗时，该重组病毒能够经历有限的复制循环，并能诱导足够水平的免疫应答；但它在人类宿主中不能进一步起作用且不能引起疾病。缺少一个或更多个NDV基因、或者具有突变的NDV基因的重组病毒大概不能经历连续的复制循环；可以在持久地表达这样的基因的细胞系中产生缺陷病毒。在这些细胞系中，将复制缺乏必不可少的基因的病毒；但当把这些病毒给予人类宿主时，则它们将不能完成复制循环。在该失败的循环中，这样的制备物可以转录并翻译足够数量的基因以诱导免疫应答。可选择地，为了将这些制备物用作灭活的(杀死的)病毒疫苗，可以给予大量的所述病毒株。对于灭活的疫苗，优选作为病毒组分而表达异源基因产物；以便该基因产物伴随着病毒粒子。这样的制备物的优点是它们含有天然的蛋白，且不经受通过用福尔马林或用于制造灭活病毒疫苗的其它因子处理的灭活。可选择地，可以高度地衰减从cDNA制备的突变NDV，使得它仅复制几个循环。
在本发明这方面的另一个实施方案中，可以用常规技术“杀死”嵌合病毒而制备灭活的疫苗制剂。在疫苗的传染性已被破坏的意义上，灭活的疫苗是“死”的。理想地是，破坏病毒的传染性而不影响其免疫源性。为了制备灭活疫苗，可以在细胞培养物中或在鸡胚的尿囊中培养所述的嵌合病毒；通过区带超离心将其纯化，用甲醛或β-丙内酯将这嵌合病毒灭活，并将其收集。通常肌内接种所得到的疫苗。
为了增强免疫学反应，可以用合适的佐剂配制灭活的病毒。这样的佐剂可包括但不限制于：例如氢氧化铝的矿物凝胶；诸如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子之类的表面活性物质；多肽；油乳液；以及例如BCG和小棒杆菌(Corynebactcrium parvum)的潜在有用的用人用佐剂。
可以用许多方法来导入上面描述的疫苗制剂，这些方法包括但不限制于：经口、皮内的、肌内的、腹膜内的、静脉内的、皮下的、以及鼻内的途径。通过疫苗设计针对的病原体的天然感染途径引入所述的嵌合病毒疫苗制剂可能是更好的。
6.实施例：用重组新城疫病毒表达和包装外源基因
描述了运用该新城疫病毒小基因组的、氯霉素转移酶基因(CAT)的表达。用一种含有CAT基因的重组质粒pNDVCAT制备该新城疫病毒小基因组。该pNDVCAT质粒是按顺序含有下述序列的pUC19质粒，所述下述序列为：T7启动子、包含NDV非编码RNA序列的191个核苷酸的NDV基因组RNA的5’末端、5个插入的核苷酸(3’CTTAA)、以反向且互补的顺序的氯霉素转移酶(CAT)基因的完整编码序列、包含NDV非编码RNA序列121个核苷酸的NDV基因组RNA序列的3’末端、允许模板的失控转录的一个BbsI克隆位点和几个限制性内切酶位点。可以用T7聚合酶转录该pNDVCAT，以产生在反向CAT基因两侧具有新城疫病毒有义序列的RNA。
副粘病毒RNA的长度可以是决定RNA复制水平的主要因素，当核苷酸的总数为六的倍数时，具有最高效率的基因组复制。对于新城疫病毒，通过产生不同长度的、相差一至五个核苷酸的CAT小复制子，研究了是否这种六个的规则对复制是关键性的问题。唯一一种基因组可被六除尽的构成物能诱导高的CAT活性。
6.1.新城疫病毒小基因组的构建
为了构建上述的新城疫病毒的小基因组，运用了下面的对策。按RACE(Gibco，BRL)，用本技术领域的标准技术得到了NDV基因组RNA的5’末端序列。用于RACE反应的模板是从NDV病毒粒子(NDV-CL：Califomia/11914/1944状的)纯化的基因组RNA。如在图3中说明的，该末端序列包含尾随序列的64个核苷酸加上L基因非翻译区的127个核苷酸。在毗连191个病毒核苷酸序列的位置，插入一种五个核苷酸的序列(3’CTTAA)。一CAT基因包括安置在病毒5’末端非编码区和3’末端非编码区之间的、667个核苷酸的CAT可读框。为了获得NDV序列的3’末端区，运用了RT-PCR。用于该RT-PCR反应的模板是体外聚腺苷酸化的NDV基因组RNA。如在图3中说明的，121个核苷酸的该3’末端区由NP基因非翻译区的56个核苷酸加上前导序列的65个核苷酸组成。在图1中显示了所产生的新城疫病毒小基因组的构成物。在图3中显示了3’末端非编码区的核苷酸序列和5’末端非编码区的核苷酸序列。
6.2.新城疫病毒NP、P和L表达质粒的构建
如在第5节中所描述的，负链RNA基因组的转录或复制需要几种与病毒一起带入的蛋白成分；包括所述L蛋白、P蛋白和NP蛋白。为了促进来自所述新城疫病毒小基因组的表达，将编码L、P和NP蛋白中的每种蛋白的基因克隆到如在图2A-C中说明的pTM1表达载体中。所述pTM1表达载体包括：一T7启动子、几个用于目的基因(L、P或NP)插入的克隆位点、一T7终止子、一pUC19复制起点和一氨苄青霉素抗性基因。为了构建所述表达质粒，通过RT-PCR扩增，获得了新城疫病毒的核蛋白(NP)、磷蛋白(P)和聚合酶(L)的全长DNA。将这些DNA分别克隆到T7聚合酶表达载体pTM1中(图2A-C)。
6.3.所述新城疫病毒小基因组的RNA转录
用Ribomax试剂盒(Promega)、按照说明书的详细说明来完成从新城疫病毒小基因组质粒的RNA的转录。为了允许失控转录，用BbsI消化1μg新城疫病毒小基因组质粒(pNDVCAT)。然后，将该线性化的质粒用作转录反应(于37℃达2小时)的模板。为了除去模板DNA，用无RNA酶的DNA酶处理所产生的反应混合物(于37℃处理15分钟)，并通过苯酚-氯仿抽提、继之以乙醇沉淀而进行纯化。
6.4.细胞转染
在35mm平皿上培养Cos-1细胞或293T细胞，并在转染前以大约1的感染复数(moi)用辅助病毒rVV T7感染Cos-1细胞或293T细胞1小时。然后，用编码新城疫病毒NP蛋白、P蛋白和L蛋白的表达载体转染所述的细胞。具体地说，用DOTAP(Boehringer Mannheim)进行转染。在辅助病毒感染后，用pTM1-NP(1μg)、pTM1-P(1μg)和pTM1-L(0.1μg)转染细胞4小时。用pTM1-NP(1μg)、pTM1-P(1μg)和模拟的pTM1-L(0μg)，对一组平行的细胞进行缺少该L蛋白的对照转染。在4小时的保温期之后，用0.5μg的NDV-CAT嵌合(-)RNA(参见图1)，使细胞受到RNA转染。在RNA转染后，让细胞保温达18小时。随后收获细胞的裂解物，用于CAT分析。
6.5.CAT分析
按照根据Gorman等的文章(Gorman等，1982，Mol.Cell.Biol.2：1044-1051)而修改的标准步骤，进行CAT分析。试样包含在0.25MTris缓冲液(pH7.5)中的10μl的14C氯霉素(0.5μCi；8.3nM；NEN)、20μl的40mM乙酰CoA(Boehringer)和50μl的细胞抽提物。保温时间为16至18小时。
6.6.结果
在用NP、P、L表达载体以及嵌合NDV-CAT RNA转染的各细胞系中，在感染后18小时得到高水平的CAT表达。另外，缺少所述L蛋白的转染细胞对照不表达CAT。
7.用来源于特定重组DNA的RNA拯救感染性新城疫病毒
在以下小节中描述的实验显示了用来源于特定重组DNA的RNA来拯救感染性新城疫病毒。可以用与嵌合NDV-CATRNA对应的RNA来表明所述病毒RNA 5’末端的191个核苷酸和3’末端的121个核苷酸包含模型NDV RNA的转录、复制及包装所必需的所有信号。可以从转染的质粒表达出包含NDV基因组全部转录单位的RNA。因而，这种技术允许运用病毒基因组的cDNA克隆和定点诱变来人工改造感染性新城疫病毒。此外，这种技术可为感染性嵌合新城疫病毒的构建创造条件，可以将所述感染性嵌合新城疫病毒用作适合于在组织培养物、动物或人中表达基因的有效载体。
8.实施例：包含插入到NDV基因组中的HIV抗原gp160
表位的重组新城疫病毒
在本文描述的实施例中，构建了一种嵌合NDV以表达来源于HIV的gp160的异源抗原。在以下小节中描述的实验显示了：运用重组RNA模板来产生嵌合NDV，所述嵌合NDV表达在该NDV基因组内的、来源于HIV gp160的多肽；以及进一步地，用这种嵌合NDV来引起脊椎动物的体液免疫应答和细胞介导的免疫应答。
8.1.质粒的构建
可以用本技术领域已知的许多方法来构建表达HIV gp160蛋白的重组NDV cDNA克隆。例如，如在图4中说明的，可以在许多位置将HIV的Env蛋白和Gag蛋白插入到NDV中。在一个实例中，在M基因和L基因之间插入所述的Env蛋白和Gag蛋白。在一个不同的实例中，将所述的Env蛋白和Gag蛋白插入到NP基因3’端(在前导序列和NP之间)。可选择地，将这些HIV的蛋白掺入到在3’端的NDV包膜蛋白(HN和F)之间。也可以把这些蛋白插入到任一NDV基因中或任何NDV基因之间。
8.2.感染性嵌合病毒的产生
如先前所描述的，可将来源于质粒包括重组NDV基因组的RNA转染到例如COS、293、MDBK的细胞中和可以进行感染性嵌合病毒的选择。参见第5,166,057号美国专利，通过引用将其全部结合到本文中。通过运用标准转染方案的步骤，可以将所得到的RNA转染到用野生型病毒感染的细胞中。转染后，可以收集上清液，并在存在NDV抗血清的情况下，用该上清液以不同的稀释度感染新鲜细胞。也可以在存在同一抗血清的情况下，将该上清液用于噬斑分析。然后，可纯化拯救的病毒并鉴定拯救病毒的特征，且可以将拯救的病毒用于例如抗体的生产。
8.3.红细胞凝集抑制测定和病毒中和测定
如先前所描述的，进行红细胞凝集抑制(HI)测定(Palmer，D.F.等，1975，Immunol.Ser.6：51-52)。按标准步骤，用人的抗-gpl120单克隆抗体制备单克隆抗体(2G9，4B2，2FlO，25-5)。如先前所描述的，用破坏受体的酶处理含有单克隆抗体的腹水(Palmer，D.F.等，1975，Immunol.Ser.6：51-52)。
对于病毒中和测定，用病毒感染直径30毫米平皿中的细胞。在吸附1小时后，加入包含不同稀释度的抗体的琼脂覆层。接着，在感染72小时之后，用0.1％结晶紫将细胞单层染色。
8.4.免疫接种
或者通过用病毒的气雾剂途径来感染六周龄BALB/c小鼠，或者用10μg纯化的病毒腹膜内免疫六周龄BALB/c鼠。对于所有加强剂量的免疫接种，腹膜内给予10μg纯化的病毒。在每次免疫接种7天后，收集血清。
8.5.放射免疫分析
如先前所描述的，进行放射免疫分析(Zaghouani，H.等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5645-6549)。简单地说，用5μg/ml的肽-BSA缀合物包被微量滴定板，用在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的2％BSA将其饱和，并与不同稀释度的血清一起保温。通过用125I标记的抗鼠K单克隆抗体来揭示结合的抗体。
8.6.放射免疫沉淀
用HIV急性地感染H9人T细胞系。感染4天之后，用35S-半胱氨酸、35S-甲硫氨酸和3H-异亮氨酸以2×106的浓度在含有100μCi/ml各同位素的培养基中标记5×107个感染的细胞。在代谢标记20小时后，通过以45,000rpm离心1小时，沉淀放射性的病毒粒子。然后，将这沉淀重悬浮于1.0ml包含1％TritonX-100和2mM苯基甲磺酰氟(PMSF)的裂解缓冲液中。在4℃于0.5ml包含0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)、1mg/ml BSA、2％Triton X-100、以及50 mM磷酸钠(pH 7.4)的免疫沉淀缓冲液中，将大约20μl血清或0.5μg单克隆抗体(在20μlPBS中)与175μl病毒粒子裂解液保温过夜。使该抗原-抗体复合物结合到A蛋白-琼脂糖珠上，并通过在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的电泳，分析所述抗原-抗体复合物。
8.7.HIV-1中和测定
如先前所描述的，在体外进行中和测定(Nara，P.L等，1987，AIDS Res.Hum.Retroviruses 3：283-302)。简单地说，将热灭活血清的连续二倍稀释物与150-200合胞体形成单位的、在H9细胞中产生的HIV病毒于室温保温1小时。在37℃，将该病毒/血清混合物与50,000 DEAE-葡聚糖处理的CEMss细胞(用多聚-L-赖氨酸的使其粘附到微量培养平皿上)或50,000H9悬浮细胞保温1小时。在病毒吸附后，除去非结合的病毒，并往每个孔中加入200μl培养基。感染4天后，取出50μl上层清液培养基，用于定量测定病毒p24gag蛋白(Coulter Source，Inc.)。感染5天后，计数在CEMss细胞中的合胞体的总数。通过与仅用病毒的对照孔相比，计算中和效价；并将中和效价如下表示：合胞体数目的减少大于50％的最高血清稀释度的倒数、或者p24合成的抑制超过50％的最高血清稀释度的倒数。
8.8.诱导CTL反应
用0.2ml含有107PFU的嵌合新城疫病毒的病毒悬浮液免疫BALB/c小鼠。如先前所描述的(Zaghouani，H.等，1992，J.Immunol.148：3604-3609)，7天后，获得脾细胞，且在上清液中存在10％伴刀豆球蛋白A的情况下，在体外单独地用照射过的脾细胞、或用照射过的包有免疫原性肽的脾细胞再刺激所述脾细胞5天。
8.9.细胞溶解测定
在37℃，用Na51Cr4(100μCi/106个细胞)标记包有肽的靶细胞达1小时。将所述细胞洗涤两次后，把它们转移到V形底96孔板上；添加效应细胞，并在7％CO2中于37℃保温。4小时后，收获上清液并对其计数。通过将所述细胞和1％的Nonidet P40去垢剂保温，确定铬释放的最大量。按照下面的公式计算特异性溶解的百分数；公式即：[(样品的cpm数-自发释放的cpm数)/(最大释放量的cpm数-自发释放的cpm数)]×100。
9.嵌合NDV-CAT RNA的细胞内表达
为了增加NDV小基因组表达的效率，构建了用于细胞内表达NDV-CAT RNA的质粒(pT7-NDV-CAT-RB)。通过在NDV-CAT RNA 3’非编码区的末端后面直接插入得自自δ肝炎病毒的核酶，而获得该质粒。将pTM1-NP、pTM1-P、pTM1-L和pT7-NDV-CAT-RT)共转染到先用rVV-T7感染的或者先用表达T7聚合酶的修饰安卡拉痘苗病毒(MVA-T7)感染的293、293T、COS1、CV1、或鸡胚成纤维细胞(CEF)中，产生高水平的CAT活性(图6)。该CAT活性与通过NDV-CAT RNA的直接RNA转染而获得的CAT活性相比，大约高100至1,000倍。
10.用RNA衍生的特定重组DNA拯救
感染性新城疫病毒
为了完成拯救，装配了来自不依赖于病毒的质粒衍生系统，即允许在细胞内表达全长新城疫病毒反义基因组的质粒的重组病毒。由新城疫病毒Califomia样病毒株(NDV-CL)(Meindl等，1974 Virology 58：457-463)之纯化的RNA，以几个部件的方式逆转录聚合酶链反应出新城疫病毒的cDNA。连接这些cDNA部件，并将其装配到具有T7启动子序列和核酶侧翼序列的质粒中，从而产生质粒pT7-NDV+RB。将产生一新的Xmal限制性内切酶位点的一沉默突变引入到pT7-NDV+-RB的L可读框中。用MVA-T7以大约0.1的感染复数感染10cm平皿中的单层CEF细胞。一小时后，用2.4μgpTM1-NP、1.2μgpTM1-P、1.2μgpTM-1L和1.5μgpT7-NDV+-RB转染(脂质转染)细胞。在37℃保温8小时后，加入新鲜的培养基。转染20小时后，以60μg/ml的终浓度加入痘苗病毒抑制剂araC。转染2天后，加入含有100μg/ml araC的新鲜培养基。在转染后第4天，用来自转染细胞的上清液接种10天龄受孕鸡卵的尿囊室。在37℃孵育2天后，收集尿囊液，且通过血细胞凝集发现：就存在NDV-CAT病毒而言，该尿囊液是阳性的。从被拯救病毒分离的RNA的分析，证实了存在新插入的Xmal位点；且证实了该病毒来源于所述克隆质粒cDNA。在图7中显示了方案的拯救步骤的图解表示。
11.从嵌合NDV基因组的内部顺反子表达外源基因
通过用CAT可读框取代NDV-CL cDNA中的HN可读框，构建质粒pT7-NDV+-CAT/RN-RB。考虑到产生的嵌合NDVRNA的、可被六除尽的总核苷酸长度，把附加的额外核苷酸添加到非编码区。将pT7-NDV+-CAT/HN-RB和pTM1-NP、pTM1-P以及pTM1-L共转染到先用MVA-T7病毒感染的CEF单层中，产生在转染后第2天测定的CAT活性(图8)。这些结果证实：用新城疫病毒作为载体来表达作为转录单位而被克隆到该新城疫病毒基因组中的外源基因是可能的。
本发明不限于用具体的实施方案描述的范围内，所述的实施方案意在作为本发明各个方面的单纯说明；并且功能等同的任何构成物、病毒或酶都在本发明的范围内。实际上，除了本文显示和描述的那些外，根据先前的描述和附图，本发明的各种各样的修饰对于本领域技术熟练人员将变得显而易见。这样的修饰将属于附加的权利要求书的范围内。
为了所有的目的，通过引用，将本文引用的所有参考文献全部结合到本文中。
Claims (19)
1.重组RNA分子，所述重组RNA分子包含有效地连接到一异源RNA序列的新城疫病毒RNA聚合酶特异性的结合位点和新城疫病毒介导的复制与转录所需要的信号。
2.重组RNA分子，所述重组RNA分子包含有效地连接到一新城疫病毒基因的新城疫病毒RNA聚合酶特异性的结合位点和新城疫病毒介导的复制与转录所需要的信号；其中，所述RNA分子含有突变、插入或缺失。
3.权利要求1或2的重组RNA分子，其中，所述聚合酶结合位点包括：在新城疫病毒RNA基因组的3’和5’的非编码侧翼区中包含的聚合酶结合位点。
4.权利要求3的重组RNA分子，其中，如在图1中所显示的，所述3’和5’的非编码侧翼区具有病毒有义序列。
5.权利要求1的重组RNA分子，其中，该异源RNA编码一病毒抗原。
6.权利要求5的重组RNA分子，其中，所述病毒抗原来源于人免疫缺陷病毒、新城疫病毒、流感、呼吸道合胞病毒、马立克氏病病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、传染性腔上囊炎病毒、鸡贫血病毒、传染性喉气管炎病毒、禽造白细胞组织增生病毒、网状内皮组织增殖病毒、禽流感病毒、狂犬病病毒、猫瘟病毒、水泡性口炎病毒、牛瘟病毒、或猪痘病毒。
7.重组的细胞，所述重组的细胞包括：编码权利要求1的重组新城疫病毒分子和新城疫病毒RNA聚合酶蛋白P与L的核苷酸序列。
8.嵌合病毒，所述嵌合病毒包括：包含权利要求1或2的重组RNA分子的负链RNA病毒。
9.权利要求8的嵌合病毒，其中，所述异源RNA来源于一病毒抗原。
10.权利要求9的嵌合病毒，其中，所述病毒抗原来源于人免疫缺陷病毒、新城疫病毒、流感、呼吸道合胞病毒、马立克氏病病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、传染性腔上囊炎病毒、鸡贫血病毒、传染性喉气管炎病毒、禽造白细胞组织增生病毒、网状内皮组织增殖病毒、禽流感病毒、狂犬病病毒、猫瘟病毒、水泡性口炎病毒、牛瘟病毒、或猪痘病毒。
11.权利要求8的嵌合病毒，其中，将所述异源RNA包含于新城疫病毒的HN基因内。
12.用于产生嵌合负链RNA病毒的方法，所述方法包括：用编码权利要求1或2的重组RNA以及复制与转录所需要的病毒功能的核苷酸序列，转染宿主细胞；并从这培养物中回收该嵌合病毒。
13.疫苗制剂，所述疫苗制剂包括：包含导致减毒表型的各种修饰的基因工程新城疫病毒、以及生理上可接受的赋形剂。
14.权利要求13的疫苗制剂，其中，所述修饰来源于一天然存在的突变体。
15.疫苗制剂，所述疫苗制剂包括基因工程嵌合新城疫病毒和一药学上可接受的赋形剂，该嵌合新城疫病毒基因组编码一异源表位。
16.权利要求15的疫苗制剂，其中，所述异源表位为一病毒抗原。
17.权利要求16的疫苗制剂，其中，所述病毒抗原来源于人免疫缺陷病毒、新城疫病毒、流感、呼吸道合胞病毒、马立克氏病病毒、传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、传染性腔上囊炎病毒、鸡贫血病毒、传染性喉气管炎病毒、禽造白细胞组织增生病毒、网状内皮组织增殖病毒、禽流感病毒、狂犬病病毒、猫瘟病毒、水泡性口炎病毒、牛瘟病毒、或猪痘病毒。
18.权利要求15的疫苗制剂，其中，所述异源表位为一免疫增强蛋白。
19.权利要求15的疫苗制剂，其中，所述异源表位为一肿瘤抗原。
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