CN102559607B - 新城疫病毒高粘膜免疫水平弱毒疫苗株ndv/lx及反向遗传构建系统 - Google Patents
新城疫病毒高粘膜免疫水平弱毒疫苗株ndv/lx及反向遗传构建系统 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术和免疫学技术,公开了一株新城疫病毒弱毒株NDV/LX及它的全基因组序列。所述新城疫病毒弱毒疫苗株NDV/LX的保藏号为CGMCCNO:3843;全基因组序列如SEQIDNO.37所示。研究表明,NDV/LX具有良好的免疫原性,能在呼吸道和消化道很好的复制,诱导产生高滴度的特异抗体和粘膜免疫应答。以常用疫苗株LaSota和QV4为对照,系统研究了NDV/LX株感染SPF鸡后在呼吸道和肠道的分布、全身体液免疫和局部粘膜免疫以及免疫鸡对流行强毒的保护效力。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术和免疫学技术,筛选一株能同时在消化道和呼吸道产生高水平粘膜免疫的基因I型新城疫病毒弱毒株NDV/LX,用于制造疫苗。
背景技术
新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是严重危害世界养禽业的重要传染性病原体之一,可以感染多种禽类,常导致养禽业产生巨大的经济损失[Alexander,D.J.2001.GordonMemorial Lecture.Newcastle disease.Br Poult Sci 42:5-22.]。该病毒属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)的成员[Mayo,M.A.2002.Virus taxonomy-Houston 2002.Arch Virol 147:1071-1076.]。新城疫病毒有囊膜,基因组为单股、负链、不分节段的RNA病毒,基因组结构模式为:3′-NP-P-M-F-HN-L-5′,依次编码6种结构蛋白:核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)即核蛋白(NP),P,M,F,HN和L蛋白。
根据对鸡的毒力,NDV毒株可以为强毒(Velogenic)、中等毒力(mesogenic)和弱毒(Lentogen)。已开展广泛的试验来阐明病毒致病性的分子决定因素[Huang Z,KrishnamurthyS,Panda A,Samal SK.Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis andfunctions as an alpha interferon antagonist.Journal of virology 2003 Aug;77(16):8676-85.]。大部分研究是关于F和HN蛋白对致病性的作用,研究结果一致认为F蛋白裂解位点处的氨基酸序列是病毒毒力的主要决定因素[Seal BS.Nucleotide and predicted amino acid sequence analysisof the fusion protein and hemagglutinin-neuraminidase protein genes among Newcastle diseasevirus isolates.Phylogenetic relationships among the Paramyxovirinae based on attachmentglycoprotein sequences.Funct Integr Genomics 2004Oct;4(4):246-57.]。NDV毒力差异的分子基础主要决定于F0蛋白的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列,强毒的裂解位点有聚碱性氨基酸序列,其模式基序为112GR/K-R-Q-K/R-R-F117;弱毒的裂解位点则缺少聚碱性氨基酸序列,其模式基序为112-E/G-R/K-Q-E/G-R-L117。
自1926年发现新城疫(ND)以来,ND已发生了四次大的流行,而且每一次流行都有不同基因型的毒株出现,尤其是90年代之后出现了新的基因VII型NDV,给我国的养禽业造成了巨大的经济损失。在控制疫病的过程中,使用疫苗是最有效最经济的方法,新城疫的疫苗已使用了几十年,由于ND疫苗的广泛使用,此病已基本上得到了较好的控制,但是临床上非典型ND的发生十分普遍,ND仍然成为威胁养禽业的主要疾病之一,也就是说,常规的疫苗对于NDV强毒的攻击并不能提供理想的保护。从近十年来的ND流行特点来看,临床上所分离到的NDV毒株大多数属于基因VII型[Liu,X.F.,H.Q.Wan,X.X.Ni,Y.T.Wu,and W.B.Liu.Pathotypical and genotypical characterization of strain of Newcastle disease isolatedfrom outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001.ArchivesofVirology,2003,148(7):1387-1403.],而常规的ND疫苗株的基因型主要为I和II型(如V4、La Sota等),因此,在遗传距离上当前NDV分离株与常规ND疫苗株相差较远。
在我国,ND已成为地方流行性疾病,很难扑灭和根除,对商业鸡群进行疫苗免疫是防控新城疫最重要的措施之一。ND疫苗有活疫苗和灭活疫苗之分,活疫苗使用方便,价格便宜,并能产生坚强的免疫力。ND活疫苗不仅能刺激产生体液免疫和细胞免疫,而且能诱导产生呼吸道和消化道粘膜免疫[Senne,D.A.,D.J.King,and D.R.Kapczynski.2004.Control ofNewcastle disease by vaccination.Dev Biol(Basel)119:165-170.]。因为呼吸道和消化道粘膜是NDV感染宿主的门户,所以坚强的粘膜免疫在免疫保护中起着十分重要的作用[Erf,G.F.2004.Cell-mediated immunity in poultry.Poultry science 83:580-590.]。大多数商业化NDV弱毒疫苗都能诱导产生针对NDV的特异抗体,但是血清中产生的NDV特异抗体并不足以保护动物抵抗NDV强毒的侵袭感染[Reynolds,D.L.,and A.D.Maraqa.2000.Protective immunityagainst Newcastle disease:the role of antibodies specific to Newcastle disease virus polypeptides.Avian Dis 44:138-144.])。研究表明以呼吸道和肠道分泌性IgA抗体为代表的粘膜免疫在保护免疫鸡群抵抗ND的感染中起到重要作用[Barbour,E.K.,M.Kallas,and M.T.Farran.2001.Immune response to Newcastle disease virus in broilers:a useful model for the assessment ofdetoxification of ervil seeds.Rev Sci Tech 20:785-790.]。粘膜中分泌性IgA抗体的产生与疫苗株病毒在粘膜上皮细胞中的复制密切相关。但是不同的疫苗病毒在肠道和呼吸道中刺激粘膜产生免疫应答的能力有很大的差异。例如常用的疫苗株La Sota是嗜呼吸道型病毒能刺激产生较高水平的呼吸道粘膜免疫,但刺激产生肠道粘膜免疫的能力很差。相反常用疫苗株QV4是嗜肠道病毒,具有较强诱导粘膜免疫的能力,但是诱导呼吸道粘膜免疫的能力差[Brown,C.C.,D.J.King,and B.S.Seal.1999.Comparison of pathology-based techniques for detection ofviscerotropic velogenic Newcastle disease virus in chickens.J Comp Pathol 120:383-389.]。而从美国火鸡肠道中分离的VG/GA毒株,能在呼吸道和消化道中很好的复制,同时诱导产生坚强的呼吸道和消化道粘膜免疫应答,因此它具有比单诱导肠道粘膜免疫的疫苗株QV4和单诱导呼吸道粘膜免疫的疫苗株La Sota更大的优越性[Perozo,F.,P.Villegas,R.Dolz,C.L.Afonso,and L.B.Purvis.2008.The VG/GA strain of Newcastle disease virus:mucosal immunity,protection against lethal challenge and molecular analysis.Avian Pathol 37:237-245.]。
NDV/LX株是我们从健康鸡群中分离到的一株NDV弱毒。初步研究表明,NDV/LX具有良好的免疫原性,能在呼吸道和消化道很好的复制,诱导产生高滴度的特异抗体和粘膜免疫应答。NDV/LX病毒的ICPI值为0.12,MDT为110h,按照OIE标准测得HA效价10.5log2。攻毒用毒株为基因VII型强毒分离株JS-5-05-Go分离自发病鸭群,其F和HN基因序列号分别为EU044798、EU044816,其ICPI和MDT分别是1.91和46小时,HA效价平均为8log2。
发明内容
本发明的第一个目的在于发明一种新城疫病毒高粘膜免疫水平弱毒疫苗株NDV/LX及反向遗传构建系统,从而解决当前所用疫苗株不能同时在消化道和呼吸道产生黏膜免疫的问题。
本发明基因I型弱毒疫苗株NDV/LX,于2010年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,其保藏号为CGMCC NO:3843。
本发明中NDV/LX株是我们从健康家禽群中分离到一批NDV弱毒。将这些毒株分别以106EID50免疫SPF鸡,在免疫后1、4、7、11、15、21天,每组扑杀3只鸡,获取鸡气管和小肠冲洗物以及胆汁。试验的对照组分别为常用疫苗株La Sota、QV4免疫组和PBS免疫空白对照组。经过黏膜抗体水平比较,获得具有良好的免疫原性的NDV/LX株,能在呼吸道和消化道很好的复制,诱导产生高滴度的特异抗体和粘膜免疫应答。
本发明的第二个目的在于测定基因I型弱毒疫苗株NDV/LX全基因组序列,其全基因组序列如SEQ ID NO.37所示。NDV/LX毒株既能在肠道上皮细胞又能在呼吸道上皮细胞中复制的原因仍然是未知的。据报道L蛋白、F蛋白或HN蛋白等结构蛋白的变化是组织嗜性和毒力的主要决定因素。HN和F蛋白可能决定病毒的独特吸附和融合,这将使嗜肠道的病毒能优先进入小肠细胞;而L蛋白的变异将允许嗜肠道毒株在小肠高水平复制,却抑制呼吸道型毒株在小肠的复制。对该毒株进行全基因组测序和反向遗传构建,分析该毒株既能在肠道上皮细胞又能在呼吸道上皮细胞中复制的分子机制,通过反向遗传构建全长克隆使对其基因组修饰成为可能。
本发明的第三个目的在于构建基因I型弱毒疫苗株NDV/LX的全长克隆。
本发明的构建方法如下:
1)基因I型新城疫病毒株NDV/LX株的筛选,对从健康家禽肠道分离到一批新城疫病毒弱毒株进行生物学特性和免疫原性分析,测定血清中抗新城疫病毒的效价以及消化道和呼吸道粘膜免疫水平。
2)NDV/LX株基因组序列测定,新城疫病毒NDV/LX株由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室构建、保存。
设计7对引物扩增基因组序列,引物如下:
3)NDV/LX株基因组的修饰,设计8对引物用于扩增NDV/LX株基因组全长序列,每个片段大小约2000bp左右,引物序列如下:
用8对引物分别构建阳性质粒P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7和P8,构建基因I型NDV/LX株病毒全基因组克隆prLX。
4)NDV/LX株病毒全长克隆的拯救,将质粒prLX与表达NDV Lo Sota毒株NP、P和L基因的pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒共转染BSR-T7/5细胞,转染18h后加入终浓度为10%的SPF鸡胚尿囊液,转染60h后将转染样品接种9~11日龄SPF鸡胚,获得基因I型毒株NDV/LX的感染性克隆NDV/LX
5)RT-PCR检测NDV/LX株组织分布特性
用NDV通用引物通过RT-PCR扩增病毒的F基因。引物序列如下:
FT1::5’-CGTAGAAAAAACACGGGTAGAAGA-3’(SEQ ID NO.33)
FT2::5’-CAGGTAGGTRGCACGCATATTATT-3’(SEQ ID NO.34)。
6)基因I型新城疫病毒株NDV/LX株的免疫效力的测定,140只1日龄SPF鸡分成4组,通过滴鼻/点眼接种106EID50/0.1mL(PBS稀释)疫苗株病毒,对照组同样用0.1mLPBS滴鼻/点眼。取血清测定其体液免疫水平,获取鸡气管和小肠冲洗物以及胆汁,用于测定粘膜免疫水平。攻毒后采集喉头和泄殖腔棉拭子,测定其强毒攻击后的排毒水平。
本发明中NDV/LX株是我们从健康鸭群中分离到的一株NDV弱毒。研究表明,NDV/LX具有良好的免疫原性,能在呼吸道和消化道很好的复制,诱导产生高滴度的特异抗体和粘膜免疫应答。以常用疫苗株La Sota和QV4为对照,系统研究了NDV/LX株感染SPF鸡后在呼吸道和肠道的分布、全身体液免疫和局部粘膜免疫以及免疫鸡对流行强毒的保护效力。
附图说明
图1NDV/LX株全长克隆prLX构建模式图。
图2NDV/LX感染性克隆RT-PCR产物测序鉴定结果。
图3新城疫病毒免疫后血清ELISA效价
图4新城疫病毒免疫鸡IgA抗体水平(OD650).
具体实施方式
步骤一:NDV/LX株的获得
从健康家禽肠道分离到一批新城疫病毒弱毒株,对其生物学特性:血凝价、ICPI、EID50进行分析,在这些弱毒株中筛选出血凝价高、复制能力强的疫苗候选株;并对候选株进行免疫原性分析,免疫2周龄SPF鸡,免疫后测定血清中抗新城疫病毒的效价以及消化道和呼吸道粘膜免疫水平,最终获得能在呼吸道和消化道很好的复制,诱导产生高滴度的特异抗体和粘膜免疫应答的新城疫弱毒株NDV/LX(基因I型新城疫病毒弱毒NDV/LX株)。
通过EID50测定,获得108.7EID50/0.1mL NDV/LX病毒,ICPI值为0.12,MDT为110h。
本发明基因I型新城疫病毒弱毒NDV/LX株,于2010年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为:CGMCC NO:3843。
步骤二:NDV/LX株基因组测序及其修饰
1、NDV/LX株基因组测序
设计7对引物用于扩增NDV/LX株基因组全长序列,7对引物序列分别为以下引物对:SEQ ID NO.3/NO.4((1-2242nt)、SEQ ID NO.5/NO.6(2211-4518nt)、SEQ ID NO.7/NO.8(4285-6344nt)、SEQ ID NO.9/NO.10(6173-8604nt)、SEQ ID NO.11/NO.12(8366-10393nt)、SEQ ID NO.13/NO.14(10317-12572nt)、SEQ ID NO.15/NO.16(12507-15186nt)。
NDV/LX毒株鸡胚尿囊液用上海生物工程技术服务有限公司的RNA抽提试剂盒提取RNA。取以上抽提的病毒基因组RNA经RT-PCR,获得目的片段,PCR产物经电泳鉴定,并用Agrose Gel DNA Extraction Kit回收,与pGEM-T载体(美国promega公司产品)连接,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,经EcoR I酶切鉴定,将PCR产物和与pGEM-T载体连接的产物同时送上海联合基因科技有限公司测序。获得的序列通过DNAstar软件拼接获得NDV/LX株基因组全长序列,其基因组长度为:15186bp,序列如SEQ ID NO.37所示。
2、NDV/LX株基因组的修饰
设计8对引物用于扩增NDV/LX株基因组全长序列,并进行测序,每个片段大小约2000bp左右,引物序列如下:
用8对引物分别构建阳性质粒P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7和P8,利用目的片段两端添加的酶切位点酶切,将质粒P8中目的基因片段克隆到TVT7R(0.0)载体(由美国Alabama大学L.Andrew Ball教授惠赠)中,构建质粒T8。质粒P1目的片段两端添加的酶切位点将基因片段克隆到T8载体中,构建质粒T18。质粒P5、P6和P7相互连接构建质粒P567,SpeI和mluI酶切胶回收567片段,并与T18连接,构建质粒T3-2。利用质粒P2、P3、P4经目的片段两端添加的酶切位点,将三个片段在pCR2.1 T载体中依次相连,进而构建了质粒P234,利用SacII和Spe I酶切胶回收234片段,与T3-2连接,构建基因I型NDV/LX株病毒全基因组克隆prLX。
步骤三:NDV/LX的拯救
生物材料准备:
质粒:La Sota株的pCI-NP、pCI-P、pCI-L真核表达质粒[胡顺林,孙庆,吴艳涛,刘秀梵.用反向遗传技术致弱基因VIId型鹅源新城疫病毒ZJ1株.微生物学报,2007,47(2):197-200.]由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室构建、保存。
1、共转染
将La Sota株pCI-NP、pCI-P和pCI-L 3个真核表达质粒与含有NDV/LX基因组cDNA全长的转录载体(prLX)共转染BSR-T7/5细胞,转染方法同上,60h后将转染样品用封口膜(parafilm)封好,转移到-70℃低温冰箱反复冻融2次,然后将转染细胞轻轻刮下,与细胞上清充分混合后接种9~11日龄SPF鸡胚,每个样品接种3枚,0.4mL/枚,37℃孵育。定时照胚,弃去24h内死亡胚。取出24h后死亡胚置于4℃充分冷却,待鸡胚血管收缩后收集尿囊液。
2、HA和HI的测定
收集的尿囊液均按OIE标准进行HA测定,所用的红细胞为新鲜制备的1%鸡红细胞。HA和HI试验中均以NDV/LX母本毒株为阳性对照做同样检测。HA和HI检测均为阳性的尿囊液样品用无菌PBS作10-4稀释后继续接种SPF鸡胚,每个稀释度接种3枚,0.2mL/枚,按上述方法培养后收集尿囊液同样做HA和HI检测。
3、RT-PCR验证获救病毒
将HA和HI检测均为阳性的尿囊液在SPF鸡胚上传两代后,收集尿囊液抽提病毒的RNA,用于RT-PCR反应,用引物M1和M2扩增NDV/LX M基因区域长度约为1.0kb的片段,M基因ORF内的966位核苷酸有一个G→A的突变(图2),从而证明病毒的基因组源于转录载体prLX。
引物序列为:
M1:5’-ACAAGACACAGGGGACGGGAAGAAG-3’(SEQ ID NO.35)
M2:5’-AGTTGAAGGGATTGTATTTGGCA-3’(SEQ ID NO.36)
步骤四:RT-PCR检测NDV/LX株组织分布特性
为了证实NDV/LX在鸡体呼吸道和肠道的复制情况,通过RT-PCR评估病毒在NDV/LX免疫组SPF鸡(14日龄免疫)组织中分布,并与La Sota、QV4免疫组相比较,结果见表1。NDV/LX在气管和肺中的存在是暂时的,仅能在接种后4天和7天检测到。早在感染后24小时,NDV/LX的核酸就能在十二指肠检测到,而且直到接种后15天仍能检测到;在接种后4到15天可在盲肠扁桃体中检测到病毒RNA。接种后1到11天在呼吸器官中用RT-PCR可扩增出病毒,证实LaSota毒株的嗜呼吸道特性。
步骤五:NDV/LX株和疫苗株的免疫效力试验
100只1日龄SPF鸡分成4组,每组25只饲养于生物安全3级隔离器中,在14日龄通过滴鼻/点眼接种106 EID50/0.1mL(PBS稀释)NDV/LX、La Sota和QV4,对照组同样用0.1mL PBS滴鼻/点眼。
在免疫后7、14、21、28天,每组随机选择8只鸡采血,血清样品进行ELISA(IDEXX)试验测定血清中抗体水平。
每只试验鸡于免疫后4周接种106ELD50/0.1mL的新城疫VII型强毒I4株。攻毒后连续观察7天,统计发病和死亡情况,并于攻毒后第4d采集气管与泄殖腔棉拭样品用于病毒的分离。
表1.RT-PCR检测病毒在组织中分布
a表示接种后天数.
b缩写代表:T.气管;L,肺;I.十二指肠;Ct.盲肠扁桃体;+.RT-PCR阳性-.RT-PCR阴性.
NDV/LX、La Sota和QV4免疫组鸡均未发病,而攻毒对照组鸡在攻毒后5d全部死亡(见表2)。
表2免疫效力试验结果
虽然三种疫苗的免疫保护率均达到100%,但在病毒分离率上,各免疫组的情况却不相同,NDV/LX免疫组鸡的病毒分离率明显低于QV4和La Sota免疫组(见表3),另外,攻毒对照组鸡喉气管和泄殖腔的病毒分离率均为10/10。
NDV/LX、La Sota和V4免疫组不同时间点采集的样品的ELISA结果,NDV/LX、QV4与La Sota免疫组的IgG水平呈现逐渐上升的趋势(见图3),在IgG水平上没有明显的差异,但是与非免疫组的抗体水平在统计学上有明显差异(P<0.05)。
气管、十二指肠冲洗物和胆汁中IgA抗体水平分别见图4。气管冲洗物中IgA抗体水平代表呼吸道粘膜免疫应答,表明NDV/LX与La Sota能够诱导产生NDV特异性IgA,两者的IgA抗体水平不同,NDV/LX比La Sota免疫组IgA抗体水平略高,但差异不明显(P>0.05),但两者与QV4免疫组的差异显著(P<0.05)。QV4与NDV/LX免疫组肠道冲洗物中都产生了NDV特异的IgA抗体,而且NDV/LX免疫组的抗体水平略高于QV4免疫组,但差异不明显(P>0.05),而两者都明显高于La Sota免疫组(P<0.05)。NDV/LX和QV4免疫组胆汁中的IgA抗体水平显著高于La Sota免疫组(P<0.05),而NDV/LX免疫组IgA抗体水平与QV4免疫组没有显著的差异(P<0.05)。
表3攻毒后第4d病毒分离结果
SEQUENCE LISTING
<110> 扬州大学
<120> 新城疫病毒高粘膜免疫水平弱毒疫苗株NDV/LX及反向遗传构建系统
<130>
<160> 37
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tacgacccta tcaccaatct gagcat 26
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
cctcattatc ctctgtatgc acgcca 26
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tggaaatgga gattgggcca gtctgtgta 29
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
ccacgcgtcg agtgcaagag actaatagtt 30
<210> 31
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tcactagtca atcacgacgg gtcacaccaa c 31
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
cgtctctacc caccaaacaa agatttggtg aatg 34
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
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cgtagaaaaa acacgggtag aaga 24
<210> 34
<211> 24
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<213> 人工序列
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caggtaggtr gcacgcatat tatt 24
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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acaagacaca ggggacggga agaag 25
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
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agttgaaggg attgtatttg gca 23
<210> 37
<211> 15186
<212> DNA
<213> 新城疫病毒(Newcastle disease virus)
<400> 37
accaaacaga gaatccgtaa ggtacgatag aaggcgaagg agcaatcgaa gtcgtacggg 60
tagaaggtgt gaatctcgag tgcgagcccg aagctcaaac tcgagagagc cttctgccaa 120
aatgtcttct gtattcgatg agtacgagca gctcctcgcg gctcagactc gccccaatgg 180
agctcatggc ggaggagaga aggggagcac cttaaaggta gaagtcccgg tattcactct 240
caacagtgat gacccagaag atagatggaa ctttgcagtg ttttgtcttc ggattgctgt 300
tagcgaggat gccaacaaac cacttaggca aggtgctctc atatctctct tatgttccca 360
ctctcaagtg atgaggaacc atgttgccct tgcggggaaa cagaatgagg ccacactggc 420
tgttcttgag atcgatggtt ttaccaacgg cgtgccccag ttcaacaaca ggagtggagt 480
gtctgaagag agagcacaga gatttatgat gatagcaggg tctctccctc gggcatgcag 540
caacggtacc ccgttcgtca cagctggggt tgaagatgat gcaccagaag acattactga 600
taccctggag aggatcctct ctatccaggc tcaagtatgg gtcacggtgg caaaggccat 660
gactgcatat gagacagcag atgagtcaga aacaagaaga atcaataagt acatgcagca 720
aggcagggtc cagaagaagt acatcctcca ccccgtatgc aggagcgcaa tccaactcac 780
aatcagacag tctctggcgg tccgcatctt tttggttagc gagcttaaga gaggccgcaa 840
cacggcaggt gggacctcca cctattacaa cttggtgggg gatgtagact catacatcag 900
gaacactggg ctaactgcat tcttcctgac acttaaatat ggaattaaca ccaagacatc 960
agcccttgca cttagcagcc tctcaggcga tatccagaaa atgaagcagc tcatgcgctt 1020
gtatcggatg aaaggagata atgcgccgta catgacattg ctcggtgaca gtgaccagat 1080
gagctttgca cctgccgagt atgcacaact ttactccttt gccatgggta tggcatcagt 1140
cctagataaa ggaactagca aataccaatt tgccagggac tttatgagca catcattctg 1200
gagacttgga gtagagtacg ctcaggctca aggaagtagc atcaatgagg atatggccgc 1260
cgagctaaag ctaaccccag cagcaaggag aggcctggca gctgctgccc aaagagtgtc 1320
tgaggagacc agcagcatgg acatgcccac ccaacaagcc ggggtcctca ctggactcag 1380
cgacggaggc tcccaagccc cccaaggtgc actgaacaga tcacaagggc aaccggacac 1440
cggggatggg gagacccaat ttctggatct gatgagagcg gtggcaaata gcatgagaga 1500
agcgccaaac tctgcgcagg gcacccctca accggggcct cccccaaccc ctgggccctc 1560
tcaagacaat gacaccgact gggggtactg accgacagca cccagtttgc ttctatgagg 1620
tcatcccaat tcctctgccc acaccccacc cctcaatccg caatcccgca tggccaaacc 1680
cacaaacgaa cccccctgtc tccctcctct cccccagccc tacaacccca cctgcccagg 1740
gcaacatagg tacaatgcga cccactaata atcaatacag ggccaaagaa attagaaaaa 1800
agtacgggta gaagggagac attcagagat cagggcgagt cacccgggtc tctgctctcc 1860
cttctaccta gtggattagg atggagatgg ccacctttac agatgcggag atcgacgagc 1920
tatttgagac cagtggaact gtcattgaca gcataattac ggcccaggga aaaccagtag 1980
agactgttgg aaggagtgca atcccacaag gcaaaactaa ggctttgagc gcagcatggg 2040
agaagcatgg gagcatccag tcaccagcca gccaagacac ccctgatcga caggacagat 2100
cagataaaca actgtccaca cccgagcaag cgagtccaaa cgacagcccc ccagccacat 2160
ccactgacca gcctcccact caggctgcag atgaggccgg cgatacacag ctcaagaccg 2220
gagcaagcca ctctctgctg tcgatgcttg ataaactcag caataggtca tctaatgcta 2280
aaaagggccc agggtcgagc cctcaagaaa ggcatcatca acgtctgact caacaacagg 2340
ggagtcaaca aagccgcgga aacagccaag agagaccgca gaaccaggcc aaggccatcc 2400
ctggaaacca ggtcacagac gcgaacacag catatcatgg acaatgggag gagtcacaac 2460
tatcagctgg tgcaacccat catgctctcc gatcagagca gagccaagac aatactcctg 2520
cacctgtgga tcatgtccag ctacctgtcg actttgtgca ggcgatgatg tctatgatgg 2580
aggcgatatc acagagggta agtaaagttg actatcagct ggaccttgtc ttgaaacaga 2640
catcttctat ccccatgatg cggtctgaaa tccagcagct gaaaacgtct gttgcggtca 2700
tggaagccaa tttgggcatg atgaagatcc tggaccctgg ttgtgccaac gtttcatctc 2760
taagtgatct acgggcagtt gcccgatccc acccggtttt aatttctggc cccggagacc 2820
catctcctta tgtgacccaa gggggcgaaa tggcactcaa taaactttcg caaccggtgc 2880
aacacccctc tgaattgatt aaacccgcca cggcaagcgg gcctgatata ggagtggaga 2940
aagacactgt ccgtgcattg atcatgtcac gccctatgca tccgagctct tcagctaggc 3000
tcttgagcaa actggacgca gccggatcga ttgaggaaat cagaaaaatc aagcgccttg 3060
cactgaatgg ctaatcacca ccgcaacccg cagcagatcc ctgtccaccc agcaccacac 3120
ggtatctgca ccaagctcct ctctgcaaac ccaaggtcca acaccccgag cgacaaccct 3180
gtcctgcttc ctctgcccca ctaaatgatc gcgcagctgc aatcaattca gctatattaa 3240
ggattaagaa aaaatacggg tagaatcgga gtgccccgat tgtgccaaga tggactcatc 3300
taggacaatc gggctgtact ttgattctac ccttccttct agcaacctgc tagcattccc 3360
gatagtccta caagacacag gggacgggaa gaagcaaatc gccccgcaat acaggatcca 3420
gcgtcttgac tcgtggacag acagcaaaga agactcggta ttcatcacca cctatggatt 3480
catctttcag gttgggaatg aagaagccac tgtcggcatg atcaatgata atcccaagcg 3540
cgagttactt tccactgcca tgctatgcct agggagtgta ccaaatgtcg gagatcttgt 3600
tgagctggca agggcctgcc tcactatggt ggtaacatgc aagaagagtg caactaacac 3660
cgagagaatg gtcttctcag tagtgcaggc accccaggtg ctgcaaagct gtagggttgt 3720
ggcaaacaaa tactcgtcgg tgaatgcagt caagcacgtg aaagcaccag agaagattcc 3780
tgggagcgga accctagagt acgaagtgaa ctttgtctct ctgaccgtgg tgccaagaaa 3840
ggacgtctac aagataccaa ctgcagcact taaggtctct ggctcaagtc tgtacaatct 3900
tgcgctcaat gtcactattg atgtggaggt agacccgaag agcccgttgg tcaaatccct 3960
ttccaagtcc gacagtgggt actatgctaa tctcttctta catattgggc ttatgtccac 4020
tgtagataag aaggggaaga aagtgacatt tgacaagctg gaaaggaaga taaggagact 4080
tgatctatct gtagggctta gtgacgtgct cggaccttcc gtgcttgtaa aggcgagagg 4140
tgcacggact aagctgctgg cacctttctt ctctagcagt gggacagcct gctatcccat 4200
agcaaatgcc tctcctcagg tggccaagat actctggagc caaaccgcgt acctgcggag 4260
tgtaaaagtc attatccaag cgggcaccca gcgtgctgtc gcagtgaccg ccgaccacga 4320
ggttacctct actaagctgg agaaggggca taccattgcc aaatacaatc ccttcaagaa 4380
ataggctgca tctctgagat tgcactccgc ccatcttccc ggatcaccat gacactaaat 4440
aatgatctgt cttgattact tatagttagt tcgcctgtct atcaaattag aaaaaacacg 4500
ggtagaagat tctggatccc ggttggcgcc ttcaaggtgc aagatgggca ccagatcttc 4560
taccaggatc ccagtacctc tcatgctgac cgtccgagtc atgttggcac tgagttgcgt 4620
ctgtccgacc agcgctcttg atggcaggcc tcttgcagct gcagggattg tggtaacagg 4680
agacaaagca gtcaacatat acacctcatc tcagacaggg tcaatcataa tcaagttact 4740
cccaaatatg cccaaggata aagaggcgtg tgcaaaagcc ccgttggagg catacaacag 4800
gacattgact actttgctca ccccccttgg tgattctatc cgtaggatac aagagtctgt 4860
gaccacgtcc ggaggaggga aacagggacg tcttataggc gccattatcg gtggtgtagc 4920
tctcggggtt gcaaccgctg cacagataac agcagcctcg gctctgatac aagccaatca 4980
aaatgctgcc aacatactcc ggctaaaaga gagcattgct gcaaccaatg aggctgtgca 5040
cgaggtcact aatggattat cacaactagc agtggcagtt gggaagatgc agcaatttgt 5100
taatgaccag tttaataaaa cagctcagga attggactgt ataaaaatta cacagcaggt 5160
tggtgtagaa ctcaacctgt acctaactga attgactaca gtattcgggc cacaaatcac 5220
ttcccctgcc ttaactcagc tgactatcca ggcgctttac aatctagctg gtgggaatat 5280
ggattacttg ttgactaagt taggtgtggg gaacaaccaa ctcagctcat taattagtag 5340
tggcctgatc accggcaacc ctattctgta cgactcacag actcaactct tgggtataca 5400
ggtaacccta ccctcagtcg ggaacctaaa taatatgcgt gccacctacc tggaaacctt 5460
gtctgtaagt acaaccaaag gatttgcctc agcacttgtc ccaaaagtag tgacacaggt 5520
cggttccgtg atagaagagc ttgacacctc gtactgtata gagaccgatt tggatctata 5580
ttgtacaaga atagtgacat tccctatgtc tcctggtatt tattcctgtt tgagtggcaa 5640
tacatctgct tgcatgtact caaagactga aggcgcactc actacgccgt atatgaccct 5700
caaaggctca gttattgcta actgtaagat gacaacatgt agatgtgcag accccccggg 5760
tatcatatcg caaaattatg gagaagctgt gtctctaata gataggcaat catgcaatat 5820
cttatcctta gacgggataa ctttgaggct cagtggggaa tttgatgcaa cttatcaaaa 5880
gaatatctca atacaagatt ctcaagtaat agtgacaggc aatcttgata tctcgactga 5940
gcttgggaat gtcaacaact cgataagtaa tgctttggat aagttagagg aaagcaacag 6000
caaactagat aaggtcaatg tcaaactgac cagcacatcc gctcttatta cctatatcgt 6060
tttaactgtc atatctcttg tatgtggtat acttagcctg gttctagcat gctacctgat 6120
gtacaagcaa aaggcgcaac agaagacctt gttgtggctt gggaataata ccctagacca 6180
gatgagggcc actacaaaaa tgtgaatgcg gatgagaggc agaaacatcc ccaatagcag 6240
tttgtgtgta aagtctgaca gcctgttaat tagaagaatt aagaaaaaac taccggatgt 6300
agatgaccaa agggcgatat acgggtagaa cggtcgggga ggccgtccct caatcgggag 6360
ccgggcctca caacatccgt tctaccgcat caccaatagc agttttcagt catggaccgc 6420
gcagttagcc aagttgcgct agagaatgat gaaagagagg caaagaatac atggcgcttg 6480
gtattccgga tcgcaatcct actctcaacg gtggtgacct tagccatctc tgcagccgcc 6540
cttgcatata gcatggaggc cagcacacct agcgatcttg taggcatacc gactgcgatc 6600
tctagagcag aggaaaagat tacatctgca ctcggttcca atcaagatgt agtagatagg 6660
atatataagc aggtggccct cgaatctcca ctggcattgc taaacaccga atctacaatt 6720
atgaacgcaa taacgtctct ctcttatcga atcaatgggg ccgcaaatag cagcggatgt 6780
ggagcaccca ttcatgatcc agattatatt ggaggaatag gtaaagaact tattgtagat 6840
gatgctagcg acgtcacatc atactatccc tctgcgttcc aagaacacct gaactttatc 6900
ccggcgccta ctacaggatc aggttgcact cggataccct catttgacat gagcgctacc 6960
cactactgtt atactcacaa tgtgatatta tctggctgca gagatcactc gcactcacat 7020
caatatttag cacttggtgt gcttcggaca tctgcaacag ggagggtatt cttttccact 7080
ctgcgttcca tcaatctgga tgacacccaa aatcggaagt cttgcagtgt gagtgcaacc 7140
cccttgggtt gtgatatgct gtgctctaaa gtcacagaga ctgaagaaga ggattataac 7200
tcagctatcc ccacgtcgat ggtacatgga aggttagggt tcgacggcca ataccacgag 7260
aaggacctag atgtcacaac actattcgag gactgggtgg caaactaccc aggagtaggg 7320
ggcgggtctt ttattgacaa ccgcgtatgg ttcccagttt acggagggct aaaacccaat 7380
tcgcccagtg acaccgcaca agaagggaaa tatgtaatat acaagcgata caatgacaca 7440
tgtccagatg agcaagatta tcagattcaa atggctaagt cttcatataa gcctgggcgg 7500
tttggaggga aacgcgtaca gcaggccatc ttatctatca aagtgtcaac atccttgggc 7560
gaggacccgg tactgactgt accgcccaac acagtaacac tcatgggggc cgaaggcaga 7620
gttctcacag tagggacatc tcatttcctt tatcagcgag ggtcatcata cttctcccct 7680
gccctactat atcctatgat agtcagcaac aaaacagcca ctcttcatag tccttataca 7740
ttcaatgcct tcactcgacc aggtagtgtc ccttgccagg cttcagcaag atgccctaac 7800
tcatgtgtta ccggagtcta tactgatcca tatcccttgg tcttctatag gaaccacacc 7860
ttgcgagggg tattcgggac gatgcttgat gataaacaag caagactcaa ccctgtatct 7920
gcagtatttg acagcatatc ccgcagtcgc ataacccggg tgagttcaag cagcaccaag 7980
gcagcataca caacatcaac atgttttaaa gttgtaaaga ccaataaaac ctattgtctc 8040
agcattgccg aaatatccaa taccctcttc ggggaattca gaatcgtccc tttactagtt 8100
gagattctca aggatgatgg ggttagagaa gccaggtcta gccggttgag tcaactgcga 8160
gagggttgga aagatgacat tgtatcacct atcttttgcg acgccaagaa tcaaactgaa 8220
taccggcgcg agctcgagtc ctacgctgcc agttggccat aatcagctag tgctaatgtg 8280
attagattaa gtcttgtcgg tagtcacttg attaagaaaa aatgtgggtg gtagcgggat 8340
ataaggcaaa acaactcaag gaggatagca cgggtaggac atggcgagct ccggtcccga 8400
gagggcggag catcagatta tcctaccaga gtcacacctg tcttcaccat tagtcaagca 8460
caaactactc tattactgga aattaactgg gctaccactc cctgacgagt gtgacttcga 8520
ccacctcatt ctcagccgac aatggaagaa aatacttgaa tcggcctccc ctgacactga 8580
gagaatgata aaacttggaa gggcagtgca ccagactctc aaccacaatt ccaagataac 8640
cggagtactc catcccaggt gtttagaaga attggctagt attgaggttc ctgactcaac 8700
caacaagttt cggaagatcg agaagaaaat ccaaattcac aacacaaggt atggagaact 8760
gttcacaaga ctgtgcacgc atgtagagaa gaaattgttg ggatcatctt ggtctaataa 8820
tgtcccccgg tcagaagagt tcaacagcat ccgtacagat ccggcattct ggtttcactc 8880
aaaatggtcc acaactaagt ttgcatggct ccatataaaa cagattcaaa ggcatctgat 8940
tgtggcagca agaacaaggt ccgcagccaa caaattggtg acgctgaccc ataaggtagg 9000
ccaagtcttt gttactcctg agcttgtcat tgtgacacat acagatgaga acaagttcac 9060
gtgtcttacc caggaacttg tgttgatgta tgcagatatg atggagggca gagatatggt 9120
caacataata tcatccacgg cggcacatct caggagccta tcagagaaaa ttgatgacat 9180
tctgcggtta gtagatgccc tggcaaaaga tctgggtaat caagtctacg atgttgtagc 9240
actcatggag ggatttgcat acggcgccgt ccagctgctt gagccgtcag gtacattcgc 9300
aggggatttc ttcgcattca acctgcagga gctcaaagac actttgatcg gcctccttcc 9360
taaggatata gcagaatctg tgactcacgc aatagccact gtattctctg gcttagaaca 9420
aaatcaagcg gctgagatgc tgtgcctgtt gcgtctatgg ggccacccat tacttgagtc 9480
ccgtattgcg gcaaaagcag taaggagcca aatgtgcgca ccaaaaatgg tagactttga 9540
tatgatcctc caggtattgt ctttctttaa aggaacaatt atcaacggat acagaaagaa 9600
gaatgcaggt gtttggccac gtgtcaaagt agatacgata tacgggaagg tcattgggca 9660
gctacacgct gattcagcgg agatttcaca cgatatcatg ttgagagagt acaagagttt 9720
atctgcgctt gaattcgagc catgtataga atacgaccct atcaccaatc tgagcatgtt 9780
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ccttctctct gaggaccaga agaaacatgt aaaggaggca acctctacta accgtctctt 9900
gatagagttc ttagagtcaa atgattttga tccatataag gagatggaat atctgacgac 9960
ccttgagtac caaagagatg acaatgtggc agtatcatac tcgctcaagg agaaggaagt 10020
gaaggttaat gggcggattt ttgctaagct aacaaagaaa ttaaggaact gtcaagtgat 10080
ggcggaaggg atcttagctg accagattgc acctttcttt caagggaatg gggtcattca 10140
ggatagcata tctttaacca agagtatgct agcgatgagt caattgtctt tcaacagcaa 10200
taagaaacgt atcactgact gcaaagaaag agtagcctca aaccgcaatc acgatcaaaa 10260
gagcaagaat cgtcggagag ttgccacttt tataacgact gacctgcaaa agtactgtct 10320
taattggaga tatcagacaa tcaaactgtt cgctcatgcc atcaatcagc tgatgggctt 10380
acctcacttc ttcgaatgga ttcatctaag actaatggat actacgatgt ttgtaggaga 10440
ccctttcaat cccccaagtg acccaactga ctgtgatctc tcaagagtcc caaatgatga 10500
catatatatt gtcagtgcta gagggggtat tgagggatta tgtcagaagc tatggacaat 10560
gatctcaatt gctgcaatcc aacttgctgc agcaagatca cattgtcgcg tcgcctgtat 10620
ggtacagggt gacaatcaag taatagctgt aacgagagag gtaaggtcag atgactcccc 10680
ggaaatggtg ttaacacaat tgcatcaagc cagtgataat ttcttcaagg aattgattca 10740
tgttaatcat ttgattggcc ataatttgaa ggatcgtgaa acaatcagat cagacacatt 10800
cttcatatac agcaaacgaa tattcaaaga tggagcaata ctcagtcaag tcctcaaaaa 10860
ttcatctaaa ttagtgctaa tatcaggcga ccttagtgaa aacaccgtaa tgtcctgtgc 10920
caacattgca tctactatag cacggctgtg cgagaacggg cttccaaagg atttctgtta 10980
ttacttaaac tacctgatga gttgcgtgca gacatacttt gattctgagt tttccatcac 11040
taacagctcg caccccgatt ctaaccagtc gtggattgaa gacatctctt ttgtgcactc 11100
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agcacttgaa gtgcttctcg actgttctta tcagctctac tatctgagag taagaggcct 12840
agacaatatc gtgttgtata tgagtgactt atataagaat atgccaggaa ttctactttc 12900
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actattagtc tcttgcactc gacgcgtggt ctcaggttta tatgcaggga ataagtatga 13080
tctgctgttc ccgtctgtct tagatgataa cctgagtgag aagatgcttc agctgatatc 13140
tcggttatgc tgcctgtata cggtgctctt tgctacaaca agagagatcc cgaaaataag 13200
aggcttatct gcagaagaga agtgttcagt acttactgag tacctactgt cagatgctgt 13260
gaaaccatta cttagttctg agcaagtgag ctctatcatg tctcctaaca tagttacgtt 13320
cccagctaat ctatattaca tgtctcggaa gagccttaat ttgattaggg aaagagagga 13380
cagggacact atcttggcat tgttgttccc ccaagagcca ctacttgagt tccccttagt 13440
acaagatatt ggcgctcgag tgaaagatcc attcacccga caacctgcgg cgtttttaca 13500
agaattagat ttgagcgctc cagcaaggta tgacgcattt acacttagtc aggttcattc 13560
tgaacacaca tcaccaaatc cggaggacga ctacttagta cgatacctgt tcagaggaat 13620
agggaccgcg tcctcctctt ggtataaggc atctcacctt ctttctgtac ctgaggtcag 13680
atgtgcaagg cacgggaatt ccttatactt ggcagaagga agcggagcca ttatgagtct 13740
tctcgaactg catgtgccgc atgagactat ctattacaat acgctcttct caaacgagat 13800
gaacccccca cagcggcatt tcggaccgac cccaacacag tttctgaatt cagttgttta 13860
taggaatcta caggcggagg taccatgtaa ggatggattt gtccaggagt tccgtccatt 13920
atggagagag aatacagaag aaagcgatct gacctcagat aaagcagtgg gttacatcac 13980
atctgcagtg ccctaccggt ctgtatcatt gctgcactgt gacattgaga ttcctccagg 14040
atccaatcaa agcttactgg atcaactggc taccaatctg tctctgattg ccatgcattc 14100
tgtaagggag ggcggggtcg tgatcatcaa agtgttgtat gcaatgggat attacttcca 14160
tctactcatg aacttgttca ctccgtgttc tacgaaagga tatattctct ctaatggcta 14220
tgcatgtaga ggggatatgg agtgttacct ggtatttgtc atgggctatc gaggtgggcc 14280
tacatttgta catgaggtag tgaggatggc aaaaactcta gtgcagcggc acggtacact 14340
tttgtccaaa tcagatgaga tcacactgac taggttattt acctcacagc ggcagcgtgt 14400
aacagacatc ctatccagtc ctttaccgag actaataaag ttcttgagaa agaatatcga 14460
tactgcgcta attgaagccg ggggacaacc cgtccgtcca ttctgtgcag agagcttggt 14520
gaggacacta gcgggcacaa ctcagatgac ccagatcatc gctagtcaca ttgacacagt 14580
cattcgatct gtgatctaca tggaggctga gggtgatctc gccgacacag tgttcttatt 14640
taccccctac aatctctcta cagacggtaa aaagagaaca tcacttaaac agtgcacaag 14700
gcagatctta gaggtcacaa tattgggtct tagagttgaa aatctcaata aagtaggtga 14760
tgtagtcagt ctagtactta aaggtatgat ttctctggag gacctgatcc ctctaagaac 14820
atacttgaag cgtagtacct gccctaagta tttgaagtct gttctaggta ttactaaact 14880
caaagaaatg tttacagaca cctctttatt atacttgact cgtgctcaac aaaaattcta 14940
catgaaaact ataggcaacg cagtcaaggg atactacagt aactgtgact cttaaagata 15000
atcacatatt aataggctcc ttttctagtt aactgagccc ttgttgattt aatgatacta 15060
tattagaaaa aagttgcact ccgatccttt aggactcgtg ttcgaattca aataattgtc 15120
ttagaaaaaa gttgcgcgta attgttcttg aatgtagtcc tgtcattcac caaatctttg 15180
tttggt 15186
Claims (1)
1.一种新城疫病毒弱毒疫苗株NDV/LX,它的保藏号为CGMCC NO:3843。
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S Hu et al.A vaccine candidate of attenuated genotype VII Newcastle disease virus generated by reverse genetics.《Vaccine》.2008,第27卷904-910. |
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