CN103146751A - 新城疫病毒株rLX/H9HA及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明表达H9亚型禽流感病毒（AvianInfluenzaVirus）血凝素蛋白的重组新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus)rLX/H9HA，保藏号为CGMCCNo：6652。本发明是利用已建立的NDV弱毒LX株的反向遗传操作平台，将H9N2亚型AIV流行株 A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012的HA基因插入LX株基因组全长转录载体pLX中，得到含有H9N2亚型AIVHA基因的重组新城疫病毒基因组全长cDNA克隆pLX-H9HA。经转染获得的重组病毒rLX/H9HA在鸡胚上具有较高的繁殖滴度，连续传多代仍能稳定表达HA蛋白，适合于疫苗的大规模生产，可用于制造疫苗。

Description

新城疫病毒株rLX/H9HA及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及应用反向遗传技术，拯救一株以新城疫病毒为载体表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组疫苗株rLX/H9HA，用于研制疫苗。

背景技术

反向遗传操作技术(Reverse genetics manipulation technique)是指将RNA病毒基因组RNA逆转录成cDNA，在体外通过采用基因突变、基因插入、基因敲除、基因置换等方法人为构建新的具有感染性的病毒，以研究病毒的基因组结构及功能和病毒宿主之间的相互作用等[Conzelmann KK.Reverse genetics of mononegavirales.Curr Top Microbiol Immunol.2004.283:1-41.]，也叫全长感染性cDNA克隆技术，又常被称为“病毒拯救”。解决了RNA病毒基因组难以操作这一难题，同时为新型疫苗的研发提供了新的思路[Nakaya T,et al.,Recombinant Newcastle diseasevirus as a vaccine vector.Journal of Virology,2001.75(23):p.11868-73.]。

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是单股、不分节段的负链RNA病毒，属于副粘病毒科成员。按照标准的致病性指标可以将病毒分为速发型(强毒)、中发型(中等毒力)和缓发型(弱毒)。基因组长度大约15kb，其结构为3’-leader-NP-P-M-F-HN-L-trailer-5’，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白（Nucleocapsidprotein,NP）、磷蛋白（Phosphoprotein,P）、基质蛋白（Matrix protein,M）、融合蛋白（Fusion protein,F）、血凝素-神经

氨酸酶蛋白（Heamagglutinin-Neuraminidase protein，HN）和大分子蛋白（Large protein,L）。

禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)是禽流感(Avian influenza,A I)的病原体，分类上属于正黏病毒科(Orthomyxovoridae)，A型流感病毒属。病毒基因组由8个单股负链的RNA片段组成，各自编码功能性蛋白，分别为PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M和NS基因。一般呈球形，直径80nm~120nm，有囊膜，囊膜表面主要有2种糖蛋白纤突，即血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)，迄今已发现16种HA亚型和9种NA亚型。禽流感病毒对宿主的致病性是由多个基因决定的，其中HA基因及其编码的蛋白尤为重要，在病毒吸附及穿膜过程中起着关键作用，是重要的表面抗原，它刺激机体产生中和抗体，可中和病毒的感染。

H9N2亚型禽流感病毒是危害当前养禽业的重要病原之一，广泛存在于家禽中，虽然表现为低致病性，但具有一些独有的发病特点，主要表现为高感染率、高发病率、低死亡率，多引起雏鸡和育成鸡的隐性感染和产蛋鸡的产蛋下降且产蛋率难以恢复，对养禽业造成了严重的危害，并具有重要的公共卫生意义。

疫苗接种是防制新城疫和禽流感这两种疾病的主要有效手段。同灭活苗相比，活载体疫苗具有用量少、成本低、省时省力、免疫保护时间长等优点，可达到一针防多病的目的。载体病毒最重要的一个特点是能被用来迅速研制出针对新发高致病性传染病的基因工程疫苗。NDV除具备这一特点外，还具有遗传稳定性好、不存在与细胞基因组整合的可能、高繁殖性能、免疫刺激性强等诸多优点，可作为疫苗载体[Bukreyev A,Skiadopoulos M H,Murphy B R,et al.Nonsegmented negative-strand viruses as vaccine vectors[J].Journal of Virology,2006,80(21):10293-10306.]。在NDV基因组内插入禽流感病毒HA基因后的重组病毒，可在动物体内复制并稳定持续地表达HA蛋白，用此重组病毒作为疫苗,可以诱导机体产生针对AI和ND的双重免疫保护力[Veits J,Wiesner D,Fuchs W,et al.Newcastle disease virus expressing H5 hemagglutinin gene protects chickens againstNewcastle disease and avian influenza[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(21):8197-8202.Schroer D,Veits J,Grund C,et al.Vaccination with Newcastle disease virus vectored vaccine protects chickens against highly pathogenicH7 avian influenza virus[J].Avian Dis,2009,53(2):190-197.]。

2004年刘晓文等从LBM的健康鸭群中分离到具有高滴度生长特性的NDV毒株LX（遗传进化上属于ClassII基因I型），并成功构建其全长克隆pLX[王晓泉,刘晓文,等.新城疫病毒弱毒骨架表达强毒F基因的重组病毒生物学特性研究[J].中国动物传染病学报.2010,18(6):22-26.]。2012年，古小兵等于常州武进分离到一株具有代表性的H9N2亚型AIV流行毒株A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012，其HA效价为11log₂，EID₅₀为9.17，热稳定，具有很好的抗原性。因此，本发明以pLX为骨架，构建可表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组疫苗株，用于应对当前H9亚型禽流感和新城疫的流行。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种以新城疫病毒为载体表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组疫苗株，用于制造疫苗。

本发明新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)rLX/H9HA，保藏号为CGMCC No：6652。

本发明新城疫病毒rLX/H9HA用于表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的应用。

本发明利用已建立的鸭源新城疫病毒LX株的反向遗传操作平台，将H9N2亚型AIVWJ57株的HA基因ORF插入NDV全长转录载体pLX，构建出重组质粒pLX-H9HA，该重组质粒与三个辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞后，获得了具有较高繁殖性能的表达H9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组疫苗株rLX/H9HA，适合疫苗的大规模生产。

本发明的第二个目的在于提供一种表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组新城疫疫苗株rLX/H9HA的构建方法，是以NDV弱毒LX株的基因组全长转录载体pLX为骨架，将H9亚型AIV流行株A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012的HA基因的开放阅读框插入转录载体pLX的P、M基因之间，经反向遗传技术获得重组病毒rLX/H9HA。具体包括以下步骤：

1.全长克隆pLX-H9HA的构建

1）H9N2亚型禽流感病毒WJ57株HA基因的分段克隆

构建阳性质粒pmWJ1和pmWJ2：以WJ57株病毒的cDNA为模板，设计两对引物分两段扩增HA基因ORF，即WJ1：1~1067nt、WJ2：1068~1683nt，分别克隆获得阳性质粒pmWJ1和pmWJ2。

2）pmWJ1与NDVLX株P基因融合克隆的构建

以LX株基因组cDNA为模板扩增其2350-3141nt，以pmWJ1为模板扩增HA基因ORF的1~1067nt，通过Overlap PCR将二者融合在一起并克隆得到质粒pPWJ1。

3）pmWJ2与NDVLX株M基因融合克隆的构建

分别以阳性质粒pmWJ2和LX株基因组cDNA为模板PCR扩增H9HA基因ORF的1068~1683nt和LX株基因组3142~3635nt，Overlap PCR将二者融合在一起，克隆得到阳性质粒pWJ2M。

4）全长克隆pLX-H9HA的获得

质粒pPWJ1与pWJ2M同时用AarⅠ和SpeⅠ进行双酶切，回收目的片段并连接，构建质粒pPWJM；用SacⅡ和AvrⅡ对质粒pPWJM进行双酶切后替换pLX的对应序列，构建出重组NDV基因组全长克隆pLX-H9HA，具体的构建模式见图1。

2.重组病毒rLX/H9HA株的拯救

将质粒pLX-H9HA与pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒共转染BSR-T7/5细胞，一段时间后接种9~11日龄SPF鸡胚，收获得到重组病毒rLX/H9HA。

附图说明

图1重组质粒pLX-H9HA构建模式图。

图2重组质粒pLX-H9HA的HindⅢ酶切鉴定图；

M：500bp DNA ladder marker；1：pLX-H9HA。

图3重组病毒rLX/H9HA的HA基因RT-PCR产物电泳图；

1：WJ-S1、WJ-R2引物扩增产物；M：200bp DNA ladder marker。

图4重组病毒感染CHO细胞外源基因表达的检测；

A-C为LX感染组，D-F为rLX/H9HA感染组。A、D组以抗NDV HN的单克隆抗体为一抗，B、E组以H9N2亚型AIV高免血清为一抗，C、F组以SPF鸡阴性血清为一抗进行间接免疫荧光检测。

具体实施方式

本发明表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组新城疫疫苗株rLX/H9HA于2012年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；其保藏号CGMCC No：6652，分类命名为：新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)其长度为：16896bp。

构建步骤一：以新城疫病毒LX为载体表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的全长表达克隆的构建

生物材料准备：

新城疫病毒LX株的全长表达克隆pLX[王晓泉,刘晓文,等.新城疫病毒弱毒骨架表达强毒F基因的重组病毒生物学特性研究[J].中国动物传染病学报.2010,18(6):22-26.]，由扬州大学农业部畜禽传染病重点开放实验室构建、保存。

H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012株（下称WJ57株）由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室分离、保存。

pGEMT-easy载体：购自Promega公司；AMV反转录酶、High fidelity DNApolymerase、T4 DNA连接酶、Agarose Gel DNA ExtractionKit购自Roche公司；转染试剂SuperFect和质粒抽提试剂盒(QIAprep Spin MiniPrep Kit)为QIAGEN公司产品；其余常规试剂均为国产分析纯。

1、H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析与基因突变

提取H9N2亚型禽流感病毒WJ57株的总RNA，并用12nt随机引物（5’-AGCAAAAGCAGG-3’（SEQ ID NO.1））进行RT-PCR反应。序列分析发现需要先对其ORF的31和1063位两个SpeⅠ酶切位点进行沉默突变。设计2对引物，分别用于扩增HA基因ORF的1~1076nt、1068~1683nt。

两对突变引物分别是：

WJ-S1：5’-TTAGAAAAAATACGGGTAGAAGCCACCATGGAGACAGTATCACTA

ATAACTATACTCTGTAGCAA-3’（SEQ ID NO.2）

WJ-R1：5’-TATTCACCTGCATCGAC

AGCCCTGACCAACCTCCCTCTAT-3’（SEQ ID NO.3）

WJ-S2：5’-TATTCACCTGCATCGT

GTTGCTGGTTGGTATGGATT-3’（SEQ ID NO.4）

WJ-R2：5’-GTTTGCAGATTATATACAAATGTTGCATCT-3’（SEQ ID NO.5）

突变碱基以斜体标注。以上引物由上海生物工程有限公司合成。

PCR反应：以反转录的cDNA为模板配制如下PCR反应体系：

PCR反应循环参数：94℃预变性3min，94℃35s，55℃1min，+0.5℃/cycle，72℃延伸，延伸时间为1min/kb，20个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

用引物WJ-S1和WJ-R1扩增HA基因ORF的1~1076nt区域，PCR产物经回收纯化后分别与pGEMT-easy载体相连，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，阳性质粒命名为pmWJ1；用引物WJ-S2和WJ-R2扩增其1068~1683nt区域，PCR产物经回收纯化后分别与pGEMT-easy载体相连，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，提取质粒，阳性质粒命名为pmWJ2。

2、融合克隆pPWJ1的构建

以pLX为模板扩增LX株基因组部分P基因2350-3141nt，以pmWJ1为模板扩增HA基因ORF的1~1067nt。PCR产物分别命名为P和WJ1。

用于扩增的两对引物分别是：

PS：5'AAAGCCGCGGAAACAGCC3'（SEQ ID NO.6）

PR：5'GGTGGCTTCTACCCGTATTTTTTCTA AGAGGAGCTTGGTGCAGATACCGTG3'（SEQ ID NO7）

WJ-S1：5’-TTAGAAAAAATACGGGTAGAA

ATGGAGACAGTATCACTAATAACTATACT

CTGTAGCAA-3’（SEQ ID NO.2）

WJ-R1：5’-TATTATCGAC

AG

CCTGACCAACCTCCCTCTAT-3’（SEQ ID NO.3）

突变碱基以斜体标注，酶切位点以波浪线标注，ACgggTAgAA为NDV转录起始信号序列，TTAgAAAAAA为NDV转录终止信号序列，Kozak序列由双下划线标注，重叠部分以下划线标注。以上引物由上海生物工程有限公司合成。

PCR反应：以pLX或pmWJ1为模板配制如下PCR反应体系：

PCR反应循环参数：94℃预变性3min，94℃30s，58℃1min，72℃延伸，延伸时间为1min/kb，20循环后72℃延伸10min，4℃保存。

用引物PS和WJ-R1将上述两个扩增产物通过Overlap PCR融合在一起，Overlap PCR反应体系及条件：

Overlap PCR反应循环参数：94℃预变性3min；94℃30s，58℃退火1min，+0.5℃/cycle，72℃延伸2min，18个循环之后再94℃ 40s，64℃退火1min，72℃延伸2min，7个循环后72℃延伸10min，4℃保存。

Overlap PCR产物经回收纯化后克隆入pGEMT-easy载体。提取的质粒送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序验证，阳性质粒命名为pPWJ1。

3.融合克隆pWJ2M的构建

分别以阳性质粒pmWJ2和pLX为模板PCR扩增H9HA基因ORF的1068~1683nt和LX株基因组3142~3635nt，PCR产物分别命名为WJ2和M。

用于扩增的引物序列如下：

WJ-S2：5’-TATT

ATCGTCGTTGCTGGTTGGTATGGATT-3’

WJ-R2：5’-GTTTGCAGATTATATACAAATGTTGCATCT-3’

MS：5'-ATTTGTATATAATCTGCAAACCCAAGGTCCAAC-3'（SEQ ID NO.8）

MR：5'-TTACCACCATAGTGAGGCAGG-3'（SEQ ID NO.9）

酶切位点以斜体标注，重叠部分以下划线标注。以上引物由上海生物工程有限公司合成。

PCR反应：以pmWJ2或pLX为模板配制如下PCR反应体系：

PCR反应循环参数：94℃预变性4min，94℃40s，59℃退火1min，72℃延伸1min，15个循环之后再94℃ 40s，63℃退火1min，72℃延伸1min，10循环后72℃延伸10min，4℃保存。

用引物WJ-S2和MR将以上两个扩增片段通过Overlap PCR相连，Overlap PCR反应体系及条件：

Overlap PCR反应循环参数：94℃预变性3min，94℃30s，58℃退火1min，+0.5℃/cycle，72℃延伸2min，18循环之后再94℃ 40s，60℃退火1min，72℃延伸2min，6循环后72℃延伸10min，4℃保存。

Overlap PCR产物经回收纯化后克隆入pGEMT-easy载体。提取的质粒送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序验证，阳性质粒命名为pWJ2M。

4、全长克隆pLX-H9HA的获得

质粒pPWJ1与pWJ2M同时用AarⅠ和SpeⅠ进行双酶切，回收目的片段并连接，构建质粒pPWJM；用SacⅡ和AvrⅡ分别对质粒pPWJM与pLX进行双酶切，回收目的片段后连接，构建质粒pLX-H9HA，并用HindⅢ进行酶切鉴定，阳性克隆保存于-70℃（见图2）。

以上各工具酶购自Thermo Fisher Scientific。

步骤二：重组病毒rLX/H9HA株的拯救

生物材料准备：

可稳定表达T7RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞：由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高研究员惠赠。

真核表达质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L[胡顺林,张艳梅,孙庆等.鹅源新城疫病毒拯救体系的建立[J].微生物学通报.2007,34(3):426-429.]：由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室构建、保存。

SPF种蛋购自北京梅里亚公司，在扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室孵化。

1、重组病毒的拯救

转染时所用质粒(pLX-H9HA、pCI-NP、pCI-P和pCI-L)均采用QIAprepSpinMiniPrepKit抽提。将pCI-NP、pCI-P和pCI-L3个辅助质粒与重组NDV基因组全长cDNA克隆pLX-H9HA共转染BSR-T7/5细胞，18-24h后加入终浓度为10%SPF胚尿囊液，60h后将转染样品反复冻融3次后，收获并接种9~11日龄SPF鸡胚，收集鸡胚尿囊液，按OIE标准测定血凝效价，即获得表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的重组病毒rLX/H9HA。

在鸡胚上传代三次后，所测HA效价为9log₂，与母本毒株LX相比下降了1个滴度。

2、RT-PCR验证获救病毒rLX/H9HA

将红细胞凝集试验(hemagglutination,HA)和红细胞凝集抑制(hemagglutination inhibition,HI)检测均为阳性的尿囊液在SPF鸡胚上传3代后，收集尿囊液抽提病毒的总RNA，用6nt随机引物反转录成cDNA后用于RT-PCR反应。

用引物WJ-S1和WJ-R2扩增H9的HA基因，长度约为1700bp，回收目的片段进行测序鉴定，扩增片段的测序结果显示毒株WJ57的HA基因成功插入（见图3）。

用于扩增重组病毒rLX/H9HA中HA基因的引物序列为：

WJ-S1：

5’-TTAGAAAAAATACGGGTAGAAGCCACCATGGAGACAGTATCACTAATAACTATACTGCTGGTAGCAA-3’

WJ-R2：5’-GTTTGCAGATTATATACAAATGTTGCATCT-3’

步骤三：重组病毒的生物学特性鉴定

生物材料准备：

SPF种蛋购自北京梅里亚公司，在扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室孵化。

抗NDV HN蛋白特异性单克隆抗体6B1[胡顺林.基因Ⅶ型新城疫病毒单克隆抗体的研制、鉴定与初步应用[D].扬州：扬州大学.2004.]、H9N2亚型AIV高免血清由扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室制备、保存。

FITC标记的羊抗鼠IgG、FITC标记的兔抗鸡IgG(以下合称FITC标记的IgG)：购自Sigma公司。

1、MDT与ICPI的测定

鸡胚平均致死时间(mean death time,MDT)测定：用灭菌生理盐水分别连续10倍（10^-3、10^-4……10^-7）递增稀释重组病毒rLX/H9HA，每个稀释度接种5只9～11日龄SPF鸡胚，37℃孵育5d，按OIE标准方法计算病毒的MDT。结果：病毒5个稀释度的接种鸡胚在120h内没有发生死亡，说明该毒株的MDT值大于120h。

雏鸡脑内接种致病指数(intracerebral pathogenicity index,ICPI)测定：重组病毒的尿囊液以灭菌生理盐水10倍稀释后经脑内接种10只1日龄的SPF鸡，按OIE标准方法计算病毒的ICPI。尿囊液经脑内接种1日龄SPF鸡后，ICPI的测定值仅为0.15，表明获救病毒的毒力完全符合弱毒株的标准。

2、细胞感染试验

将重组病毒rLX/H9HA和母本病毒LX分别作10^-3稀释后接种鸡胚成纤维细胞，48h后，分别以抗NDVHN蛋白特异性单克隆抗体6B1、H9N2亚型AIV高免血清为一抗，FITC标记的IgG为二抗，进行IFA试验。重组病毒感染细胞孔内均能观察到特异性荧光信号；母本病毒感染细胞孔用抗NDVHN蛋白特异性单克隆抗体为一抗作用能检测到荧光，其他则不能检测到荧光。重组病毒和母本病毒感染细胞以SPF阴性血清为一抗的IFA结果为阴性（见图4）。

3、重组病毒的免疫原性试验

重组病毒rLX/H9HA以10⁶EID₅₀滴鼻点眼免疫3周龄SPF鸡，免疫后3周用WJ57株配制四单位抗原检测抗体水平，平均HI滴度可以达到6log₂以上。

Claims (3)

1.一株新城疫病毒(Newcastle Disease Virus) rLX/H9HA，保藏号为CGMCC No：6652。

2.权利要求1所述新城疫病毒rLX/H9HA的构建方法，其特征在于：以NDV弱毒LX株的基因组全长转录载体pLX为骨架，将H9亚型AIV流行株A/Chicken/Jiangsu/WJ57/2012的HA基因插入转录载体pLX的P、M基因之间，经反向遗传技术获得重组病毒rLX/H9HA。

3. 权利要求1所述新城疫病毒rLX/H9HA用于表达H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的应用。

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