CN105420261A - 一种新城疫病毒耐热改造方法及应用 - Google Patents

一种新城疫病毒耐热改造方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新城疫病毒耐热改造的方法及其应用，具体通过HN基因替换的方式显著提升新城疫病毒的耐热特性。本发明运用RNA病毒反向遗传技术，在转录质粒水平对非耐热型新城疫病毒进行改造，以耐热型新城疫病毒的HN基因替换非耐热型新城疫病毒的HN基因，将改造后的转录质粒转染宿主细胞，拯救并获得耐热改造的重组新城疫病毒，从而极大地提高新城疫病毒的耐热特性。本发明首次以人工重组的方式显著提升了新城疫病毒的耐热特性，成功将非耐热型新城疫疫苗LaSota株改造为耐热型新城疫疫苗株rT-HN株。本发明可广泛应用于新城疫病毒疫苗株的耐热改造，在研发耐热、安全、高效的新城疫疫苗等方面具有极大的应用前景。

Description

一种新城疫病毒耐热改造方法及应用
技术领域
本发明属于病毒反向遗传操作领域，尤其涉及一种新城疫病毒耐热改造方法及应用，更具体地，本发明涉及一种对非耐热新城疫病毒进行耐热改造的方法和耐热改造后的重组病毒在疫苗制备方面的应用。
背景技术
新城疫(NewcastleDisease，ND)是由新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus，NDV)引起的极易传染的毁灭性疾病，有较高的发病死亡率，被国际兽疫局规定为仅有的两种A类禽病之一，另一种为禽流感。新城疫病毒属副粘病毒科(Paramyxoviridae)腮腺炎病毒属(Avulavirus)。新城疫病毒的基因组为单股、负链、不分阶段的RNA，全长为15186个碱基，遵循六碱基原则，包含55碱基的3′前导序列和5′后随序列，两者之间存在6个结构基因，按顺序排列分别为3′-NP(核衣壳蛋白)-P(磷酸化蛋白)-M(基质蛋白)-F(融合蛋白)-HN(血凝素神经氨酸酶蛋白)-L(大聚合酶蛋白)-5′，基因组编码至少7个蛋白。在各个结构基因开放阅读框的起始和终止端都存在转录控制序列，分别为起始序列(Genestart，GS)和终止序列(Geneend，GE)，各个基因间存在1-47个数量不等的核苷酸间隔区(IGS)。
鸡新城疫首次于1926年爆发于印尼的爪哇和英国的新城，一直在除大洋洲以外的全世界范围内发生流行，给全球造成了巨大的经济损失。在我国，新城疫也是危害最为严重的禽病之一，许多地区一直都有该病流行，典型的新城疫以呼吸困难、下痢、神经紊乱、消化道粘膜广泛出血等为特征。新城疫的控制以免疫预防为主，属国家强制性免疫疫病。近年来随着疫苗的广泛应用，新城疫的大规模暴发流行已受到明显控制，但该病出现了新的流行特点，如非典型新城疫不断发生、混合感染普遍和宿主范围不断扩大等。
目前，国际上生产和使用的新城疫疫苗有两大类，即活疫苗和灭活疫苗。活疫苗包括低毒力株疫苗和中等毒力株疫苗，低毒力株疫苗包括II系苗(B1)、III系苗(LaSota株)、Clone-30、V4等；中等毒力疫苗包括I系苗、Roskin株、Komorov株、Hert33株和Mukteswar株等。有些低毒力活疫苗具有独特的耐热特性，称之为耐热活疫苗，代表株有V4、HB92和TS09-C株等。此类疫苗具有耐热、低毒、免疫效果好、可同群感染、多途径免疫(拌料、喷雾等)等优点，适用于鸡、鸽、鹌鹑等多种禽类的新城疫防控。与其他非耐热疫苗相比，该疫苗在气温普遍较高的南方地区和冷链条件较差的农村推广应用更有优势，在新城疫的防控中发挥了重要作用。但目前应用最为广泛的低毒力疫苗株LaSota株以及中等毒力株均为非耐热型新城疫病毒株。因此，探讨新城疫病毒的耐热机理以及如何提高LaSota株等其他新城疫病毒株的耐热特性显得极具意义。
现有关于新城疫反向遗传技术的文献较多，但均未见涉及到对新城疫病毒进行耐热改造的方法的报道。例如：专利号为200510097997.8的文献“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”公开了以新城疫病毒LaSota疫苗株为基础的非耐热活疫苗载体，但未涉及对新城疫病毒耐热改造的方法；专利号为200610075781.6的文献“表达禽流感病毒H5亚型HA蛋白的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株”公开了以新城疫LaSota疫苗株载体构建的禽流感、新城疫二联基因工程活疫苗，也未涉及到对新城疫病毒耐热改造的方法；申请号为CN201310090099.4的文献“新城疫病毒耐热活疫苗载体系统及其应用”公开了新城疫病毒耐热活疫苗载体系统，但未涉及到对非耐热新城疫病毒的耐热改造方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新城疫病毒耐热改造的方法及应用。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种新城疫病毒耐热改造方法，该方法包括如下步骤：a.构建非耐热新城疫病毒的转录质粒；b.将非耐热新城疫病毒的转录质粒中的HN基因替换为耐热新城疫病毒的HN基因，获得改造的转录质粒；c.将改造的转录质粒与三个辅助质粒共同转染宿主细胞，获得耐热改造的重组新城疫病毒。
按上述方案，所述的非耐热新城疫病毒的转录质粒能表达非耐热新城疫病毒的全基因组cDNA。
按上述方案，所述的非耐热新城疫病毒为LaSota株。
按上述方案，所述的耐热新城疫病毒为TS09-C株，其HN基因序列为SEQIDNO：1。
按上述方案，所述的三个辅助质粒能够分别表达新城疫病毒的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白。
按上述方案，所述的耐热改造的重组新城疫病毒为rT-HN株，已于2015年8月3号保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是中国，武汉，武汉大学，其微生物保藏号为：CCTCCNO：V201529。
按上述方案，所述的重组新城疫病毒rT-HN株在制备防制新城疫的耐热活疫苗方面的应用。
本发明的技术原理在于：
1)利用反向遗传操作技术，将耐热TS09-C株和非耐热LaSota株进行NP、P、M、F、HN和L基因的逐个互换，通过研究基因互换后的重组病毒的耐热特性的改变，最终确认HN基因是决定新城疫病毒耐热的关键因子，为新城疫病毒耐热改造方法的建立提供了理论支撑和实践经验；
2)将非耐热新城疫病毒的全基因组RNA通过RT-PCR扩增、克隆连接的方式，连接入低拷贝质粒中，获得非耐热新城疫病毒的转录质粒；
3)通过RT-PCR方式扩增获得耐热新城疫病毒的HN基因，通过基因克隆的方法，将非耐热新城疫病毒的转录质粒中的HN基因替换为耐热新城疫病毒的HN基因，获得改造后的转录质粒；
4)将能够表达T7RNA聚合酶的痘苗病毒预感染宿主细胞，再将改造后的转录质粒和三个辅助质粒(分别表达NP、P和L蛋白)进行细胞共转染。首先，痘苗病毒能够在宿主细胞内表达T7RNA聚合酶；然后，T7RNA聚合酶识别转录质粒上的T7启动子序列，并启动RNA的复制过程，在T7终止子处终止复制，复制出的RNA序列即为嵌合有耐热新城疫病毒HN基因的非耐热新城疫病毒基因组；嵌合基因组RNA与三个辅助质粒表达出的NP、P和L蛋白一起构成核蛋白复合体，启动病毒RNA的首轮转录及病毒蛋白的翻译合成，病毒的各个组份通过自包装产生具有感染性的重组病毒粒子。该病毒粒子除HN蛋白来源于耐热病毒外，其余蛋白均来源于非耐热病毒。由于HN基因是新城疫病毒的关键耐热因子，所以以非耐热新城疫病毒为骨架，嵌合有耐热新城疫病毒HN基因的重组病毒具有了较好的耐热特性，从而实现了对新城疫病毒的耐热改造；
5)由于新城疫病毒不同毒株在基因组结构和生物学特性等方面具有高度相似性，所以很多研究方法或技术在新城疫病毒不同毒株之间是通用的，如：新城疫病毒的PCR检测方法可以检测所有新城疫病毒株；新城疫病毒强毒株的反向遗传操作方法同样适用于新城疫病毒弱毒株；通过修改新城疫病毒LaSota弱毒株的F裂解位点，可将其改造为强毒株，该方法同样可被用于改造其他新城疫弱毒株。因此，本发明建立的新城疫病毒耐热改造方法不仅仅适用于LaSota株，也适用于其他所有新城疫病毒株。
本发明的有益效果为：
1)本研究以新城疫病毒非耐热LaSota株的转录质粒为基础，将LaSota株的转录质粒中的HN基因替换为耐热新城疫病毒TS09-C株的HN基因，构建出了改造的转录质粒，并成功获得了新的重组病毒。耐热试验结果表明，新的重组病毒的耐热特性明显高于LaSota亲本株，证实了用该方法对新城疫病毒进行耐热改造的能力。利用本发明建立的新城疫病毒耐热改造方法，可构建出一系列新的重组耐热新城疫病毒株，并应用于耐热新城疫疫苗的制备；
2)相对于传统的新城疫疫苗，耐热新城疫疫苗具有如下优点：a)可在4度甚至常温保存，相比于常规疫苗的冷冻保存，将极大地降低运输、保存成本；b)提高疫苗产品的热稳定性，延长疫苗的保质期，确保疫苗的使用效果；c)使用方便，可通过拌料、气雾、点眼、滴鼻等方式免疫。
附图说明
图1是耐热改造的新城疫病毒rT-HN株的构建示意图。
图2是耐热改造的新城疫病毒rT-HN株的生长曲线。
图3是耐热改造的新城疫病毒rT-HN株的耐热特性测定结果。
具体实施方式
以下结合附图和实施例进一步对本发明进行说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
新城疫病毒非耐热LaSota株的转录质粒的构建
新城疫病毒非耐热LaSota株的转录质粒包含了LaSota株的全基因组序列、T7RNA聚合酶启动子序列、T7RNA聚合酶终止子序列、丁型肝炎病毒核酶序列和低拷贝质粒序列等，其主要功能是转录表达并准确切割出LaSota株的全基因组RNA序列。其构建策略为：首先分片段扩增全基因组序列，共分为A-D4个片段。其中在A片段的上游加入了T7启动子，D片段的下游加入了丁型肝炎病毒核酶序列和T7终止子。通过普通PCR、融合PCR和引物自延伸的方法扩增获得4个片段后，通过In-fusionPCR克隆的方式，将4个片段依次连入低拷贝质粒中，获得转录质粒。
1.病毒RNA的提取及RT反应
以新城疫病毒LaSota株鸡胚尿囊液为对象，参照试剂盒说明书进行病毒基因组RNA的提取。将总RNA溶解于17μlDEPC水，加入1μl随机引物，75℃5min，立即冰浴，然后加入逆转录反应液：5×RTBuffer5μl，dNTPs(10mM)1μl和M-MLV1μl。42℃60min，95℃5min，获得病毒的基因组cDNA，于-20℃保存，待PCR扩增。
2.四个片段的PCR扩增及克隆
设计并合成了四对覆盖病毒全基因组的PCR引物。为方便In-fusion克隆，片段之间留有重叠区域。以病毒cDNA为模板，进行病毒全基因组DNA的PCR扩增。PCR反应体系由10×Buffer、MgCl2(25mM)、dNTPs、上、下游引物(10μM)、Taq酶、cDNA和水组成。其中上、下游引物由于扩增片段的不同而不同。常规的PCR扩增条件为：95℃5min；30×(94℃30sec，55℃2min，72℃5min)；72℃10min。琼脂糖凝胶电泳检测，将特异的阳性条带以DNA纯化试剂盒进行纯化回收，以相应的内切酶进行酶切鉴定，鉴定正确的PCR片段保存于-20度，待进行克隆连接。
3.转录质粒的连接与鉴定
将鉴定正确的四个PCR片段分先后以In-fusionPCR克隆的方式连接入低拷贝质粒中。参照In-fusionPCR克隆试剂盒的操作说明，将低拷贝质粒以适当的内切酶进行酶切，先将A片段与质粒进行连接克隆，获得pBR-A。再以PCR的方式扩增出pBR-A的大部分序列，两端为与B片段的连接序列，与B片段进行连接克隆，获得pBR-AB。以同样的方式，再将C和D片段连入质粒中，即可获得pBR-ABCD质粒，即LaSota株的转录质粒。
4.辅助质粒的构建
以转录质粒为PCR模板进行PCR扩增，分别得到核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白的3个基因全序列，以酶切连接的方式，将3个片段分别克隆至真核表达质粒。为增加蛋白的表达量，在起始密码子前加入Kozak序列。对PCR检测为阳性的菌液进行质粒提取及酶切鉴定。结果表明，所构建的三个辅助质粒pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L均正确。测序结果与预期相符，辅助质粒构建成功。
实施例2
HN基因改造的LaSota株转录质粒的构建及病毒拯救
以新城疫病毒耐热TS09-C株的HN基因替换LaSota株转录质粒中相应的HN基因，获得HN基因改造的LaSota转录质粒，如图1所示。将改造的转录质粒与辅助质粒共转染宿主细胞，获得耐热改造的重组新城疫病毒。
1.新城疫病毒TS09-C株HN基因的PCR扩增
以新城疫病毒TS09-C株鸡胚尿囊液为对象，参照试剂盒说明书进行病毒基因组RNA的提取。将总RNA溶解于17μlDEPC水，进行HN基因的RT-PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测，将特异的阳性条带以DNA纯化试剂盒进行纯化回收，以相应的内切酶酶切鉴定，鉴定正确的PCR片段保存于-20度。
2.LaSota株转录质粒的HN基因改造
设计并合成了一对PCR引物用于扩增LaSota株转录质粒中除HN基因以外的全部序列。PCR反应体系由10×Buffer、、dNTPs、上、下游引物(10μM)、PFUUltraIIFusionHSDNA聚合酶、LaSota转录质粒和水组成。PCR扩增条件为：92℃2min；30×(92℃10sec，55℃20sec，68℃10min)；68℃10min。琼脂糖凝胶电泳检测，将特异的阳性条带以DNA纯化试剂盒进行纯化回收，以相应的内切酶进行酶切鉴定，鉴定正确的PCR片段保存于-20度。获得了LaSota株转录质粒PCR片段(不含HN基因)，命名为pLaSota-Del-HN。
参照In-fusionPCR克隆试剂盒的操作说明，将TS09-C株的HN基因PCR片段与pLaSota-Del-HN以In-fusion克隆的方式进行连接，转化感受态细菌。摇菌提取质粒，经酶切和测序鉴定正确后，即获得改造的LaSota株转录质粒。
3.耐热改造病毒的拯救恢复及检测
将BHK-21细胞传至6孔板，在传代1天后长至80-90％；细胞营养液换为2％新生牛血清的DMEM培养基；将痘苗病毒vTF7-3分别按照0.01MOI量感染BHK-21细胞，感染一个小时；采用磷酸钙法，将改造的LaSota株转录质粒与三个辅助质粒共转染BHK-21细胞，质粒的量分别为：2ug、0.5ug、0.5ug和1ug；在转染6小时后，将细胞培养液换成不含新生牛血清的DMEM培养基，加入TPCK处理的胰酶；观察细胞状态，待细胞发生明显病变后，反复冻融细胞2次，收获上清液，0.22um滤膜过滤去除痘苗病毒，SPF鸡胚连续传代3次。以HA效价测定方法和RT-PCR测序的方法对拯救的重组病毒进行鉴定。鉴定正确的重组病毒即为耐热改造的新城疫病毒，命名为rT-HN。
实施例3
耐热改造的新城疫病毒rT-HN株的生物学特性试验
在对新城疫病毒LaSota株进行耐热改造后，获得一株新的病毒株rT-HN。为验证其是否与LaSota亲本株有着相似的生物学特性，开展了重组病毒rT-HN的生物学特性试验。
1.新城疫病毒rT-HN株的细胞生长特性试验
将BHK-21细胞传至6孔板，在24小时内细胞长为致密单层，将稀释后的rT-HN尿囊液接种细胞，设置LaSota株病毒对照。在接种后的0、24、48、72和96小时吸取细胞上清液，测定上清液中的新城疫病毒含量。具体测定方法：将上清液进行10倍梯度稀释，接种至已在96孔板中长为致密单层的BHK-21细胞，稀释度范围10-1到10-8，接种量为100μl/孔，每个稀释度重复3孔。接种1小时后，以PBS洗涤2次，换为无血清、含TPCK胰酶的DMEM营养液，继续培养，观察记录细胞病变情况。根据细胞病变的孔数来计算病毒含量，得到病毒的生长曲线。结果如图2所示，rT-HN在感染后72小时的增殖滴度最高，为107.1TCID50/ml，与LaSota亲本株有着相似的生长曲线。
2.新城疫病毒rT-HN株对鸡的安全性试验
以鸡胚最小致死剂量的平均致死时间(MDT/MLD)和脑内致病指数(ICPI)评价重组病毒rT-HN对鸡的安全性，同时设置LaSota株对照。MDT测定方法：将病毒液以灭菌生理盐水稀释10倍，接种9日龄的SPF鸡胚，0.1ml/枚。每日照蛋2次，连续观察7天，记录鸡胚的死亡时间，计算出MDT/MLD值。ICPI测定方法：将10倍稀释的病毒液脑内接种出壳24～40小时的SPF雏鸡，共10只，接种量为0.05ml/只。每天观察一次，并给鸡打分，正常鸡为0，发病鸡为1，死亡鸡为2。共观察8天，计算出ICPI值。结果表明，重组病毒rT-HN的MDT值为121小时，ICPI值为0.00，LaSota株的MDT值为118小时，ICPI值为0.00。因此，rT-HN病毒具有与LaSota亲本株相似的毒力。
3.新城疫病毒rT-HN株的耐热特性试验
将rT-HN株病毒尿囊液以EP管进行分装，500μl/管。置于56℃水浴锅中进行热处理，分别于2.5、5、7.5、10、15、30和60分钟后，取出病毒液，用于HA活性和病毒滴度的测定。结果如图3所示，与LaSota株病毒相比，重组病毒rT-HN的感染力耐热性和HA耐热性均得到了显著的提升。
实施例4
耐热改造的新城疫病毒rT-HN株的免疫试验
在确定耐热改造后的新城疫病毒rT-HN株的耐热特性得到明显提升后，进一步对其免疫原性进行测定。1日龄SPF鸡共40只，随机分成4组，分别为rT-HN组、rTS09-C组、rLaSota组和PBS组，进行隔离饲养。将相应的病毒样品以滴鼻/点眼的方式对鸡进行免疫，免疫剂量0.1ml，浓度为106.0EID50/ml。在免疫后2周采集血清进行HI效价测定。同时以新城疫强毒株F48E9株以滴鼻/点眼的方式对免疫鸡进行攻毒，攻毒剂量为104.0EID50/只。攻毒后，每天观察记录鸡的发病、死亡情况，持续观察2周，计算攻毒保护率。免疫试验结果如表1所示，所有免疫组的攻毒保护率均为100％，而对照PBS组则为0％。rT-HN组的HI抗体水平略比LaSota组的低，远高于TS09-C组。结果表明新城疫病毒rT-HN株具有与亲本株LaSota株相近的免疫原性，可用于新城疫耐热活疫苗的制备。
表1.重组新城疫病毒的免疫及攻毒保护试验
序列表
＜110＞湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
＜120＞一种新城疫病毒耐热改造方法及应用
＜160＞4
＜210＞1
＜211＞1851bp
＜212＞DNA
＜213＞人工序列
＜223＞质粒
＜400＞1
atggaccgcgcagttagccaagttgcgctagagaatgatgaaagagaggcaaagaataca60
tggcgcttggtattccggatcgcaatcctactctcaacggtggtgaccttagccatctct120
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Claims (7)

1.一种新城疫病毒耐热改造方法，其特征在于，包括如下步骤：a.构建非耐热新城疫病毒的转录质粒；b.将所述非耐热新城疫病毒的转录质粒中的HN基因替换为耐热新城疫病毒的HN基因，获得改造的转录质粒；c.将改造的转录质粒与三个辅助质粒共同转染宿主细胞，获得耐热改造的重组新城疫病毒。
2.根据权利要求1所述的新城疫病毒耐热改造方法，其特征在于，所述的非耐热新城疫病毒的转录质粒能表达非耐热新城疫病毒的全基因组cDNA。
3.根据权利要求2所述的新城疫病毒耐热改造方法，其特征在于，所述的非耐热新城疫病毒为LaSota株。
4.根据权利要求1所述的新城疫病毒耐热改造方法，其特征在于，所述的耐热新城疫病毒为TS09-C株，其HN基因序列为SEQIDNO：1。
5.根据权利要求1所述的新城疫病毒耐热改造方法，其特征在于，所述的三个辅助质粒分别表达新城疫病毒的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白。
6.根据权利要求1所述的新城疫病毒耐热改造方法，其特征在于，所述的耐热改造的重组新城疫病毒为rT-HN株，其微生物保藏号为：CCTCCNO：V201529。
7.根据权利要求6所述的重组新城疫病毒rT-HN株在制备防制新城疫的耐热活疫苗方面的应用。
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