CN103343110B - 一种表达口蹄疫病毒空衣壳的重组山羊痘病毒的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达口蹄疫病毒空衣壳的重组山羊痘病毒的构建方法，该方法以上、下游同源臂为基础构建转移质粒，中间依次插入口蹄疫病毒结构蛋白前体基因P1-2A、痘苗病毒背对背启动子P7.5-P11、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因、口蹄疫病毒内部核糖体进入位点序列、口蹄疫病毒3C蛋白酶9位点突变体基因；将转移质粒与山羊痘病毒CVCCAV41株共转染MDBK细胞，以同源重组方式，将外源基因插入上、下游同源臂之间，筛选到的重组山羊痘病毒能稳定存在，并表达口蹄疫病毒空衣壳。

Description

一种表达口蹄疫病毒空衣壳的重组山羊痘病毒的构建方法

技术领域

本发明涉及一种表达口蹄疫病毒空衣壳的重组山羊痘病毒的构建方法。

背景技术

自1982年牛痘病毒被成功用来表达外源蛋白以来，重组活载体疫苗的研究得到了长足发展，单纯疱疹病毒的TK基因被共转染真核细胞进行体内同源重组构建了重组痘苗病毒。1990年表达F基因的重组鸡痘病毒在美国注册；1994年美国批准允许生产表达新城疫病毒的HN和F蛋白基因的重组疫苗，成为第一个商业活载体疫苗；1995年美国农业部正式批准重组鸡痘病毒活载体苗VAX FP-N的商品化。初步的研究结果已显示重组活载体疫苗具有广阔的应用前景，有望发展成为一种经济有效的新型疫苗。

20世纪80年代后期，在兽医领域开始倾向于开发具有宿主特异性的痘病毒载体，如鸡痘病毒（Fowlpox virus）、金丝雀痘病毒（Canarypox virus）、猪痘病毒（Swinepoxvirus）、羊痘病毒和兔痘病毒载体等，其中山羊痘病毒（Goatpox virus，GTPV）因其具有重要的经济意义、良好的安全性而成为重组痘病毒热点之一。

山羊痘病毒（GTPV）属于痘病毒科（Poxviridae），脊索动物痘病毒亚科（Chordopoxrinae，ChPV），羊痘病毒属（Capripoxvirus，CPV）。该属包括山羊痘病毒（GTPV）、绵羊痘病毒（Sheeppox virus，SPV）和牛疙瘩皮肤病病毒（Lumpy skin diseasevirus,LSDV），分别感染山羊、绵羊和牛。最初，羊痘病毒属的成员的分类是根据病毒所分离的宿主，尽管大多数毒株在自然条件下不会交叉感染，但是在实验条件下却可以跨过宿主障碍，出现交叉感染。病毒的不同毒株对于不同的宿主表现的毒力不同。基因组的限制性酶切图谱表明，不同毒株之间的差别很小，而且在自然条件下存在基因重组。因此现在将绵羊、山羊和牛的恶性痘病通称为羊痘。GPV、SPV和LSDV之间关系密切，同源性非常高，基因组核苷酸序列同源性高达96-97%。所有绵羊痘病毒（SPV）和山羊痘病毒（GTPV）基因组中的基因，牛疙瘩皮肤病病毒（LSDV）基因组都有。三者在形态、理化和血清学上无法区别，只能通过基因组加以区分。绵羊痘和山羊痘是由一个单独的病原产生的一个综合性疾病的不同症状，宿主范围区分只是绵羊或山羊宿主对病毒适应的结果。

山羊痘病毒基因组由线性、双股DNA所组成的，A+T含量约为75%，病毒核酸无感染力。SPV和GTPV基因组约有150Kb，彼此十分相似，约有96%的核苷酸完全一致。和其他痘病毒一样，山羊痘病毒基因组包括中间编码区和两端相同的反向末端重复序列（Invertedterminal repeat,ITR）。共编码147个开放阅读框（ORF），编码密度为93%，所编码的蛋白为53～2027个氨基酸不等。牛疙瘩皮肤病病毒（LSDV）基因组约为151Kb，包含中间编码区和2.4Kbp的反向末端重复序列，编码156个ORF。基因组中间约145Kbp的区域（ORFs024～123）有与其他痘病毒同源的保守序列，编码病毒复制所需的蛋白，其功能主要是负责病毒的转录、修饰RNA、病毒DNA的复制以及在胞内组装成熟、在胞外被蛋白膜包裹成成熟的病毒粒子。两端基因序列（ORFs001-023和ORFs124-147）变化较大，可能与病毒的毒力、宿主特异性有关。包括1个基因家族(其中5个基因含有锚蛋白重复基序、3个基因含有kelch样重复基序)及其他与病毒修饰或逃避宿主免疫识别和反应相关的基因，负责编码胞质分裂丝蛋白、白细胞介素-10（IL-10）、表皮生长因子样蛋白（EGF-like protein）、PKR阻遏蛋白等，还有痘病毒所特有的致病基因和选择宿主范围基因。至于具体每个基因的功能至今研究的还很少，大部分都是根据研究较多的痘苗病毒推测而来的。此外，基因组两端含有反向末端重复序列（ITR）每一个ITR长约2.3kb，包括：一个由富含A+T且并非完全配对的序列构成的发夹结构（以此将两条DNA链连接起来）、一个长度小于100bp的高度重复区域（其中含有解开复制连环体DNA的序列）、几个开放阅读框，但与SPV和LSDV不同，在GTPV中未发现末端串联重复序列。各痘病毒的ITR由于序列缺失、重复和转座而长短不一。痘病毒基因组中的ORF一般不发生重叠，mRNA不发生剪接现象。

山羊痘病毒作为病毒载体的优点随着痘病毒载体研究的不断发展，构建重组山羊痘病毒越来越受到人们的关注。重组山羊痘病毒GTPV具有痘病毒作为载体的优点：基因组容量大，可以插入25Kbp的外源基因；有多个复制非必需区可用作外源基因的插入位点；基因组DNA不具有感染性，它在细胞中的复制是在病毒自身的酶及其独特的调控信号作用下进行的，这与真核细胞的基因表达调控机理不同。有别于其它DNA病毒，痘病毒的转录、翻译和装配均发生在细胞质中，这有利于外源基因导入基因组中及外源表达产物的检测。严格的胞浆内复制避免了病毒基因重组入宿主细胞染色体的可能，进而消除了重组病毒的应用对人类的潜在威胁；重组痘病毒表达的蛋白存在加工、修饰及转移过程，如糖基化和磷酸化等，以较高级的形式存在，因此抗原性变异不大；由于GTPV宿主范围窄，仅感染反刍动物，对人无致病性。在其他哺乳动物产生一过性感染或称为流产性感染，即它能有效感染一些哺乳动物细胞并表达基因，也能产生一些晚期基因的表达和DNA复制，但不能翻译成熟的病毒粒子，但并不影响它对外源基因的正确表达，诱发机体产生免疫保护性反应。因此GTPV的最大优点是不但可以作为针对反刍动物的复制型活载体疫苗，而且可以作为非复制型载体应用于反刍动物以外的其它动物。

除此之外，痘病毒的一些特性使重组痘病毒特别适合用作疫苗：山羊痘病毒较为稳定，易于保存，制作冻干疫苗成本低、容易进行生产和使用；疫苗有多种用药途径；免疫保护期长，可以诱导体液免疫和细胞免疫，接种一次就能获得长期的免疫效果，一般比灭活疫苗引起的免疫力更为持久；重组山羊痘病毒疫苗能区分自然感染和免疫接种的动物。这些优点使GTPV成为发展活疫苗的一个较为理想的载体。

1.构建重组病毒的原则

1.1病毒复制非必需区的选择

痘病毒基因组庞大，其中许多基因是病毒复制所非必需的，可供作为外源基因的插入部位。但是，外源基因在不同的部位插入病毒基因组内，可能会产生不同的效果。为了获得一株理想的重组病毒，首先必须进行病毒复制非必需区的克隆与筛选。由于外源基因只有插入到病毒基因的复制非必需区才有可能实现蛋白产物的表达，而且载体表达外源基因的量直接受其在载体中插入位点的制约，因此非必需区的获得是构建重组病毒的先决条件。病毒复制非必需区又有严格的非必需区及一般非必需区之分，所以在构建重组病毒时必须选择严格的复制非必需区，这样才能维持亲本株的复制能力及重组病毒的免疫效力。痘病毒基因组大，目前已经筛选出羊痘病毒的TK基因、LSDV的核糖核苷还原酶基因和基因间区可以作为外源基因的插入位点。

1.2启动子的选择

痘病毒的RNA聚合酶只能识别痘病毒自身的启动子，因此，在所有重组痘病毒研究中，必须应用痘病毒启动子。外源基因的表达水平，主要决定于启动子的强度。为了提高外源基因的表达量，建议使用一些比较强的启动子。目前在痘病毒载体中常用的启动子，按其来源主要分为以下三类：痘苗病毒启动子如早/晚期启动子P7.5、晚期启动子P11和H6等；鸡痘病毒启动子如早/晚期启动子PE/L以及人工合成启动子，如Yanagida等和朱爱华等分别利用早期和晚期启动子人工合成的具有早/晚期活性的启动子Ps，它们的效率均是痘苗启动子P7.5的3～4倍。就基因表达调控机理和重组疫苗的生物安全而言，应首先使用羊痘病毒本身的启动子，遗憾的是目前对羊痘病毒启动子的结构及调控知识仍然知之甚少，好在痘病毒的启动子是非常保守的，羊痘病毒和痘苗病毒间启动子，可为各自的RNA多聚酶相互识别，一般常用痘苗病毒启动子构建重组羊痘病毒，用痘苗病毒7.5K蛋白的早晚期启动子（P7.5）、11K蛋白的晚期启动子（P11）等启动外源基因在GTPV中的表达。

2.构建重组病毒的方法

2.1同源重组法

1982年，首次应用同源重组的方法，将外源基因插入到痘苗病毒基因组的TK基因中，成功构建了能够在哺乳动物细胞中表达外源基因的重组痘苗病毒。迄今，通过质粒转移载体与病毒基因组DNA之间的同源重组而将外源基因导入病毒基因组已成为一种经典的方法，广泛应用于重组病毒的构建。同源序列间的重组主要有两种方式，即单交换重组和双交换重组。尽管两种形式的重组都能产生重组病毒，但单交换发生的频率要高。这种单交换重组发生在非必需区同源序列的一端(3`或5`端)，导致1个或多个拷贝的整个表达载体重组进入病毒基因组。这种结构由于分子内或与其它分子之间有很多的同源序列，很容易发生分子内或分子间的再次重组，要么得到稳定的呈双交换重组形式的重组体，要么丢失插入的基因序列，恢复野生型FPV的基因组结构。双交换重组由于重组在同源序列的两端同时发生，一次即可产生稳定的重组体。但研究表明，通过同源重组方式产生重组病毒的机率仅仅介于0.0l～0.1%之间。转移载体中同源序列的长度也影响重组率。Parks等研究了载体中同源序列的长度与rFPV产生效率的关系。当同源序列长度从0.73kb延长到4.5kb时，其同源重组率从0.073%线性增长到0.62%，因此可以说二者呈线性相关。

同源重组也存在缺点和不足：首先，同源重组几率小，如果将大片段的外源DNA插入到病毒基因组，同源重组的效率更会大大降低，因此必须经过多次蚀斑纯化，才能获得纯化的重组病毒；同源重组的另一个缺点是需要经过构建中间质粒（转移载体）并在宿主菌体内进行扩增等繁杂步骤，若目的基因片段比较大或存在特殊结构，则可能会引起重组质粒内部发生基因缺失或重排，而当目的基因对宿主菌具有毒性的时候，这一策略更难以奏效。

2.1.1构建方法

痘病毒基因组庞大，不便在体外进行直接操作，而且基因组DNA没有感染性，因此，重组痘病毒的构建必须分两步进行，外源基因不能直接插入到病毒基因组中。第一步是构建一个重组质粒，又叫转移载体质粒。此质粒应带痘病毒的启动子，其下游接外源基因，在它们的两侧为痘病毒特异的DNA序列。第二步是将此质粒导入痘病毒感染的细胞中，痘病毒DNA与质粒中的同源序列在细胞内可发生同源重组，由此将外源基因组装到痘病毒基因组的特定部位,构建出重组的痘病毒。

2.1.2筛选方法

选择一种有效的筛选方法，无疑是获得重组病毒的重要一环，根据所选用的筛选标记基因、外源基因插入的位点以及受体病毒的不同，目前已经建立了多种筛选方法。根据筛选标记不同，重组痘病毒筛选方法可大致分为两类。

2.1.2.1根据病毒表型筛选

在痘苗病毒,利用病毒本身的胸苷激酶（TK）基因作为选择标记，是较常用的方法：该方法首先是由Parks等提出的，他经周密的实验验证后认为该方法是构建和筛选稳定重组痘苗病毒（rVV）的有效方法。痘病毒胸苷激酶（TK）基因是病毒生长的非必需基因，其缺失对痘病毒的增殖能力也有影响，不过这种作用并不显著。TK基因编码胸苷激酶，该酶在核酸合成过程中能催化胸腺嘧啶核苷磷酸化。而胸苷类似物5-溴尿嘧啶脱氧核苷（又叫5-溴脱氧核糖尿苷，BrdU），可掺入细胞DNA分子上，致使DNA复制出现错误，核酸合成不能继续。用TK+痘苗病毒感染表型为TK-的细胞后1～2小时，然后，用由痘苗病毒TK基因构建的转移载体质粒转染该细胞，在受感染的细胞发生TK基因同源重组而形成TK-并带有外源基因的重组痘苗病毒；在培养液中加入5-溴尿嘧淀脱氧核苷(BudR)，TK-病毒缺乏胸苷激酶，不能利用BrdU，因而不受影响，而TK+病毒不能存活。因此，在BrdU环境中能形成蚀斑的病毒即为TK-病毒。因此利用BrdU可以在哺乳动物TK-细胞系中筛选TK-表型的重组痘苗病毒。这种筛选系统的局限是，只能用TK基因作为非必需片段构建重组病毒；另外，需有一株适合病毒生长并能产生蚀斑的TK-细胞系。此外，还有蚀斑表型筛选系统和宿主范围筛选系统。如果将外源基因插入痘苗病毒的与病毒扩散相关基因，这样形成重组病毒的蚀斑大小与亲本病毒有明显差异，因此可以根据蚀斑的大小进行筛选。如果外源基因插入到病毒的宿主范围基因，结果形成的蚀斑的生长特性会发生变化，因此可以应用特定的细胞系进行蚀斑筛选。

2.1.2.2根据报告基因筛选

目前最常采用的筛选系统是根据报告基因进行筛选，常用的报告基因有：大肠杆菌β-半乳糖苷酶（LacZ）基因、绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（E.coli xanthine-guanine phosphoribosyl transferase，GPT）、新霉素磷酸转移酶（neomycin phospho transferase,Neo）基因等。用这类筛选标记，在构建转移载体质粒时需将标记基因盒连同外源基因同时插入非必需片段。根据报告基因筛选可以大大简化筛选的工作量。例如将LacZ基因与外源基因共表达,该酶能使无色的乳糖类似物5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖（吡喃）糖苷分解为半乳糖和深蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝，这样在含有X-gal的培养基中可方便地挑选出蓝色的重组痘病毒；如将Neo基因在外源基因共表达，Neo可使宿主细胞对抗生素G418产生抗性，在含G418的培养液中可挑选到重组痘病毒。如选择Eco gpt作为报告基因，可以用霉酚酸（Mycophenolic Acid，MPA）进行筛选。MPA能强烈抑制肌苷酸脱氢酶（Inosinemonophosphatedehydrogenase,IMPD）导致嘌呤合成的阻断，从而抑制痘病毒在大多数细胞中的复制。但这种阻断作用能被Eco gpt在其底物黄嘌呤和次黄嘌呤存在的条件下弥补，因而持续表达Eco gpt基因的重组病毒能在含霉酚酸、黄嘌呤、次黄嘌呤的培养基中生长，而不含Eco gpt的原型病毒则否。

3.重组羊痘病毒的研究现状

目前，已有多种表达病原蛋白的重组痘苗病毒构建成功，表达蓝舌病病毒VP7基因的TK-重组羊痘病毒，用该重组病毒免疫的绵羊可以抵抗异源血清型强毒攻击。表达小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因的TK-重组羊痘病毒，用该重组病毒免疫山羊，以较低剂量即可使山羊抵抗PPRV攻击。由于羊痘病毒具有宿主范围窄的优点，在非反刍动物细胞中不能组装成成熟的病毒粒子，因此可以用于构建非复制型载体。表达狂犬病病毒（RV）糖蛋白的TK-重组LSDV，可以作为复制缺陷型疫苗。该重组病毒rLSDV-RG在兔体内诱导产生RV中和抗体，抗体水平是OIE要求的2倍。在我国，关于重组羊痘病毒方面的研究仍在探索中。

4.口蹄疫病毒空衣壳在重组痘病毒表达的研究现状

口蹄疫病毒全病毒灭活疫苗，由于其自身的不足和缺点，生产实践中需要更加安全、有效的疫苗。以前的研究认为，口蹄疫病毒空衣壳与天然颗粒具有相似的免疫原性。因此，本研究组也曾构建了共表达Asia-1型口蹄疫病毒mP1-2A和3C蛋白酶基因的质粒，与GTPV CVCC AV41共转染MDBK细胞筛选重组病毒。但是，间接免疫荧光和PCR检测发现，重组病毒连续传代3代以后，就检测不到其能继续存在和传代，这一点与以往的研究结果是一致的。其原因主要是3C蛋白酶在48小时内就诱导宿主细胞凋亡，而重组痘病毒至少需要96小时以上才能完成生命周期，导致其病毒颗粒无法包装完成，连续传代后逐步消失。

山羊痘病毒GTPV属于痘病毒科（Poxviridae）山羊痘病毒属（Capripoxvirus），该属还包括绵羊痘病毒(sheeppox virus,SPPV)和牛疙瘩皮肤病病毒(lumpy skin diseasevirus,LSDV)。三种病毒之间由于基因组具有很高的同源性，普遍认为是同种病毒在长期的进化过程中，适应不同宿主的结果。山羊痘宿主范围较窄，仅感染反刍动物牛、绵羊和山羊，对其他动物无致病性，具有很高的安全性。重组山羊痘病毒具有痘病毒作为载体的优点：基因组容量大，甚至可以插入长度达25Kb的外源基因；基因组复制非必需区（nonessential region）及基因间区（intergenic region,IR）可作为外源基因的插入位点，目前常用的外源基因插入区为病毒胸苷激酶（thymidine kinase,TK）基因区。但是该区域插入外源基因，往往导致重组病毒侵袭力下降，在宿主体内扩散范围偏小而免疫原性较低，而增加了其作为有效疫苗的难度。特别对重组口蹄疫病毒疫苗而言，在TK区插入外源基因的重组病毒，往往达不到所需要的中和抗体水平。本试验选择在重组山羊痘病毒非TK的基因间区插入口蹄疫病毒mP1-2A和3C蛋白酶突变体基因表达盒，期待其能够刺激动物机体产生较高水平的抗口蹄疫病毒中和抗体。

重组活病毒载体疫苗的关键限制因素是，针对载体本身的抗体阻止该病毒的二次免疫，重组GTPV也不例外。以往的痘病毒活载体疫苗研究表明，在TK区插入外源基因将导致病毒侵袭力的显著下降。本研究组选择在非TK基因间区插入外源基因，尽可能保持重组病毒的毒力，通过鼻腔或者口腔粘膜接种后，能够避开抗体的中和作用，在粘膜局部大量复制，实现二次免疫的有效性。

目前，绝大多数的痘病毒的外源基因插入区，普遍选择胸苷激酶（Thymidine kinase,TK）基因作为缺失区，用以插入外源基因。胸苷激酶（TK）是一个普遍存在的蛋白激酶，催化胸苷被ATP磷酸化形成胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTMP）反应的酶，是合成胸苷酸的补救途径的限速酶，在活跃增殖的细胞中其活性很强，它广泛存在于细菌、病毒感染的细胞、再生肝、胸腺、培养细胞、肿瘤细胞及线粒体中。痘病毒和细胞质中的TK是专一性的酶，以约80kDa的同源四聚体形式存在，只能利用ATP和dATP以及胸苷。不同种属来源的TK基因存在明显差异。对痘苗病毒（VV）、禽痘病毒（Fowlpox virus，FPV）、兔纤维瘤病毒（Shope fibroma virus,SFV）TK基因比较发现，这些基因在核苷酸水平上同源性较小，但在氨基酸水平上与VV TK同源性较大。对痘病毒的TK基因研究还表明，在痘病毒科中，不同属的痘病毒TK基因的位置不同。在SFV、VV、FPV三个不同的痘病毒属中，TK基因分别在基因组的三个不同的位置。这种位置的不固定性，很可能是在痘病毒进化过程中，由于痘病毒的基因组重排造成的。尽管存在位置的不固定性，但TK基因位于基因组的中间区域，具有较高的保守性。从基因组碱基组成来看，羊痘病毒的高A+T含量（大约75%）似乎也与TK有关。分析绵羊和山羊一些基因，A+T含量在50%左右，表明GPV高A+T含量的特点与其宿主基因组无关。另外，与GTPV宿主范围相同的副痘病毒，基因组A+T含量约37%。这也反映了羊痘病毒控制自身DNA合成的特点。另外，A+T含量高的GPV、FPV和正痘病毒都含有TK基因，而A+T含量低的传染性软疣病毒（Molluscum contagiosum virus，MCV）、羊接触传染性脓疱性口炎病毒（Orf virus，ORFV）不含有TK基因。这也说明了TK的活性与基因组A+T含量有密切关系。尽管研究表明，TK基因缺失并不影响痘苗病毒体内外复制，被认为是复制非必需基因，但同时TK也是痘病毒毒力相关基因。通过基因工程技术使TK基因缺失后，病毒的毒力降低，但免疫原性并不下降。但是，毒力的下降会影响病毒在机体内的侵袭力，因而对于外源基因的表达水平相应也会降低。

为克服外源基因插入TK区导致重组病毒毒力下降的缺陷，本发明通过基因组分析基因间区，再通过定向插入的方法，参考山羊痘病毒GTPV Pellor株基因组序列，构建在山羊痘病毒Pellor株的29918-29919位核苷酸之间插入外源基因的转移质粒。该区域与CVCCAV41株相应区域同源性大于99%（命名K区）。

发明内容

本发明目的在于，提供一种表达口蹄疫病毒空衣壳的重组山羊痘病毒的构建方法，该方法以上、下游同源臂为基础构建转移质粒，中间依次插入口蹄疫病毒结构蛋白前体基因P1-2A、痘苗病毒背对背启动子P7.5-P11、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因、口蹄疫病毒内部核糖体进入位点序列、口蹄疫病毒3C蛋白酶9位点突变体基因，将转移质粒与山羊痘病毒CVCC AV41株共转染MDBK细胞，以同源重组方式，将外源基因插入上、下游同源臂之间，筛选到的重组山羊痘病毒能稳定存在，并表达口蹄疫病毒空衣壳。

本发明所述的一种表达口蹄疫病毒空衣壳的重组山羊痘病毒的构建方法，按下列步骤进行：

a、以上、下游同源臂为基础构建转移质粒，中间依次插入口蹄疫病毒结构蛋白前体基因P1-2A、痘苗病毒背对背启动子P7.5-P11、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因、口蹄疫病毒内部核糖体进入位点序列、口蹄疫病毒3C蛋白酶9位点突变体基因，其中上游同源臂核苷酸序列为：

5’―CTA TCT CGC GCT AAA TGA ATA CAA AAA AAT GAG AAT GTG TAA TAAAAT AAT TTC TGC TAT AGA TTA TCC AAA TAA AAA TCA CAT TTA TAG TGC GATAAT AGA AAC TGT TAA CAA TTA CTT AGA TAA TCC TCC GAA AAA GCT AGGATA CAA TAT TGA TAC TTG TTT GAC TAT AGC AAA AAA CAA TTA ACA ACTAAT CAT GGA TTT TAT ACG AAG AAA GTA TTT AAT ATA TAC AAT AGA AAACAA AGT TGA TTT TTT AAA AGA TGA AGT ACTAAC AAA GAT ATC AAA CTT TACATT AAA TCA TAT ATT AGC CAT TAA ATA TTT AAT TCT TAA CTT TCC TAG AGATGT TAT ATC AAA AGA TGT ATT ATC GAA CCC AAA TTT TTA TGT TTT TTT ACATAT GGT AAA GTG TAA TGA CAT TTA TGA GAC TGT TTT AAA ACA TTC GTT CGATAT TCC TAC GTT ATA TAT AAA AGC ACT TAT AAA AAA TTA TCC GTT ATT TAATAA CAC AAT AGA AAG ATA TAA AAC TTT AGT TAG TGA ACT TTT TTT AGACGA TAA ATT TAT CGA AAT AGT AAA ATA TTC GTC TGA ATT TGA TAA TAT CATAGC TGT TAA TTA CGA TCT TTT ACT AAA TCC TTT ATT CTA TAA TAA TGA ACCGAT TAA AAA TAT GGA AAT TAT TTA TAG TAA ACT TTT TAA AAA ATC TAA TTTTAG GAA GGT AAA AAA AAT GGA GGT TAT CAG ATT AAT GAT ATG GGC GTACTT AAG TAA ACA AGA TAC TGG ATT AGA TTT TAC TGA TTT TGA CTC TCA AGATAT ATA TAC ACT GTT TCA AAA AAG TGA TAA AGT TAT TAT TCA TAG TGA TATGAC AGA AAA GTT TAA AGA GTA TAT TTT TGG GTC GGA AAA AAC TAG TTATTG GTT ATG GTT AA―3’；

下游同源臂核苷酸序列为：

5’―ATG AAT CAA TAT TTA ATG ATA ATG TCT ACA ATG AAG GGG TTG CAG AATTAA TGT ACG ATA AAA TTC TTA GTT TTA TCT ATT CAG AGA TTA AAC AAG GAAGAG TAA ATA AGA ATA TGC TAA AAT TAG TTT ATA TAT TTG AAA ATG ATG AAT ATATAC AGT CTA TTT TAT TAC AAA TAA TTT ACG GAG TAC CTG GTG ATA TCT TATCAA TTA TAG ATG TAA AGG ATG ATA ACT GGA AAA AAT ATT TTA TAG GTT TTTATA AAG AAA ATT TTA TCG ATG GAA AAA CTT TTA TAA GTG CAA AAA CAT TCAACT ATG ATT TAT TTA AAG TAG TGG CTA AAA TAA ATC CTG AGT ACT TTG ACCCAG ACA AAA TAA TAT CCA TAT TTG ATC ATA AAC CTG AAA AAG TTA AAT ATTTTG ATA CAA TAG ATA TAA ATA ATA CAT TTA TAT CAA ATA TAA TTT ATG AAA CGAATG AAT TAA ATC TTT CAA CGA TTG AAG AAT TAC AAT CAT GCC AAA TAT ATAATG AAG AAA CAG AAT ATT TCA TTA AAG AAT ATA ATA CTT ATC TTT ATT TAAAGG AGA AGG ATC CAT ATA TTT TGT ATA ATG GCA TGT TAA CAA ATA TAT CAAAAG TTC CAT CAA ATA AAA AGT TTT CAT TGT TTA GTA AAA ACA TAT TAA AATATT ATA TAG ATG GAA AAT TGG CAA ATA TAG GTC TTG TGT TAC CAA ATT ATAAAG GTG ATA TAT TGG TAA AAA TAT TAT CGC ATT TGA AAT GTG TAG AAG ACGTTA CTG TTT TCA TTA AAT TTT CAG TAT GTA AAA ACT CTA GCA TAC TAC CATCAA TA―3’；

b、将转移质粒与山羊痘病毒CVCC AV41株共转染MDBK细胞，以同源重组方式，将外源基因插入上、下游同源臂之间，筛选到的重组山羊痘病毒能稳定存在，并表达口蹄疫病毒空衣壳。

步骤a中所述的口蹄疫病毒3C蛋白酶9位点突变体基因，是将3C蛋白酶的第10、60、92、95、97、101、126、196和203位氨基酸残基，采用固相亚磷酸酰胺法人工合成基因的方法将下列位点进行突变：第10位赖氨酸K突变为天冬酰胺N、第60位精氨酸R突变为谷氨酰胺Q、第92位精氨酸R突变为天冬酰胺N、第95位精氨酸R突变为谷氨酰胺Q、第97位精氨酸R突变为组氨酸H、第101赖氨酸K突变为谷氨酰胺Q、第126位精氨酸R突变为天冬酰胺N、第196精氨酸R突变为谷氨酰胺Q、第203位赖氨酸K突变为谷氨酰胺Q；

口蹄疫病毒3C蛋白酶9位点突变体氨基酸序列为：

NH₂―ASGAPPTDLQNMVMGNTKPVELILDGKTVAICCATGVFGTAYLVPRHLFAEKYDKIMLDGQAMTDSDYRVFEFEIKVKGQDMLSDAALMVLHNGNQVHDITQHFRDVAKMKKGTPVVGVINNADVGNLIFSGEALTYKDIVVCMDGDTMPGLFAYKAVTRAGYCGGAVLAKDGAETFIVGTHSAGGNGVGYCSCVSQSMLLKMQAHIDPEPHHE―COOH。

本发明所述的一种表达口蹄疫病毒空衣壳的重组山羊痘病毒的构建方法，该方法中的口蹄疫病毒3C蛋白酶9位点突变体采用固相亚磷酸酰胺法人工合成基因的方法进行突变，该突变体显著降低了对宿主细胞的诱导凋亡作用，同时保留了对口蹄疫病毒衣壳前体蛋白的剪切活性。

附图说明

图1为本发明原始3C蛋白酶与3C蛋白酶9位点突变体序列比对图；

图2为本发明转移质粒p9m3C-mP1-2A结构示意图。

具体实施方式

实施例

本发明所述的一种表达口蹄疫病毒空衣壳的重组山羊痘病毒的构建方法，具体操作按下列步骤进行：

1．细胞、毒株与载体

1.1MDBK细胞由本实验室保存、准备；受体菌E.coli由本实验室保存；

1.2山羊痘病毒疫苗（GTPV CVCC AV41株）购自新疆天康畜牧生物技术股份公司，测定病毒TCID₅₀为1×10^-0.5/0.1mL；

1.3质粒pCI购自Promega公司；口蹄疫病毒3C蛋白酶9位点突变体基因克隆质粒p9m3C质粒、口蹄疫病毒结构蛋白基因克隆质粒pmP1-2A(Js/05)，由本申请人构建并保存；

2．口蹄疫病毒3C蛋白酶9位点突变体克隆质粒p9m3C的构建：

2.1从GenBank数据库下载口蹄疫病毒Asia-1/Jiangsu/China/2005(GenBankAccession:EF149009)的3C蛋白酶基因，其核苷酸序列如下：

5’―AGT GGT GCC CCA CCG ACT GAC TTG CAA AAG ATG GTC ATG GGC AAC ACC AAGCCT GTT GAG CTC ATC CTC GAC GGC AAG ACG GTA GCC ATC TGC TGC GCT ACC GGA GTCTTT GGT ACT GCC TAC CTC GTG CCT CGT CAC CTT TTC GCA GAG AAG TAC GAC AAG ATCATG CTG GAC GGC AGA GCC ATG ACA GAC AGT GAC TAC AGA GTG TTT GAG TTT GAG ATTAAA GTA AAA GGA CAG GAC ATG CTC TCA GAC GCC GCA CTC ATG GTG CTC CAC CGT GGGAAT CGC GTG CGT GAC ATC ACG AAG CAC TTC CGT GAT GTA GCC AAG ATG AAG AAA GGAACC CCC GTC GTT GGT GTG ATT AAC AAC GCC GAC GTT GGG AGA CTG ATT TTC TCT GGTGAG GCC CTA ACC TAC AAA GAC ATT GTA GTG TGC ATG GAC GGA GAC ACC ATG CCT GGCCTT TTT GCC TAC AAG GCC GTC ACC AGG GCG GGC TAC TGT GGA GGA GCC GTT CTC GCGAAG GAC GGA GCC GAG ACT TTC ATC GTC GGC ACT CAC TCC GCA GGC GGC AAC GGA GTTGGA TAC TGC TCG TGC GTT TCC AGG TCT ATG CTG CTC AAG ATG AAG GCT CAC ATT GATCCC GAA CCA CAC CAC GAG―3’；

对应的3C蛋白酶氨基酸序列为：

NH₂―SGAPPTDLQKMVMGNTKPVELILDGKTVAICCATGVFGTAYLVPRHLFAEKYDKIMLDGRAMTDSDYRVFEFEIKVKGQDMLSDAALMVLHRGNRVRDITKHFRDVAKMKKGTPVVGVINNADVGRLIFSGEALTYKDIVVCMDGDTMPGLFAYKAVTRAGYCGGAVLAKDGAETFIVGTHSAGGNGVGYCSCVSRSMLLKMKAHIDPEPHHE―COOH。

2.2基于X-射线衍射晶体结构(PDB：2WV4)和前人的研究成果，对诱导宿主细胞凋亡的9个关键氨基酸残基位点对应的核酸序列进行突变，同时根据哺乳动物细胞表达密码子偏好性，对基因进行优化，突变并优化后的基因命名为9m3C，其核苷酸序列为：

5’―TCT GGT GCT CCG CCG ACC GAC CTG CAG AAC ATG GTT ATG GGT AAC ACC AAACCG GTT GAA CTG ATC CTG GAC GGT AAA ACC GTT GCT ATC TGC TGC GCT ACC GGT GTTTTC GGT ACC GCT TAC CTG GTT CCG CGT CAC CTG TTC GCT GAA AAA TAC GAC AAA ATCATG CTG GAC GGT CAG GCT ATG ACC GAC TCT GAC TAC CGT GTG TTC GAG TTT GAG ATCAAG GTG AAA GGT CAG GAC ATG CTG TCT GAC GCT GCT CTG ATG GTT CTG CAC AAC GGTAAC CAG GTT CAC GAC ATC ACC CAG CAC TTC CGT GAC GTT GCT AAA ATG AAA AAA GGTACC CCG GTT GTT GGT GTT ATC AAC AAC GCT GAC GTT GGT AAC CTG ATC TTC TCT GGTGAA GCT CTG ACC TAC AAA GAC ATC GTT GTT TGC ATG GAC GGT GAC ACC ATG CCG GGTCTG TTC GCT TAC AAA GCT GTT ACC CGT GCT GGT TAC TGC GGT GGT GCT GTT CTG GCTAAA GAC GGT GCT GAA ACC TTC ATC GTT GGT ACT CAT TCA GCA GGA GGT AAC GGT GTTGGT TAC TGC TCT TGC GTT TCT CAG TCT ATG CTG CTG AAA ATG CAG GCT CAC ATC GACCCG GAA CCG CAC CAC GAA―3’；

对应的9m3C氨基酸序列为：

NH₂―ASGAPPTDLQNMVMGNTKPVELILDGKTVAICCATGVFGTAYLVPRHLFAEKYDKIMLDGQAMTDSDYRVFEFEIKVKGQDMLSDAALMVLHNGNQVHDITQHFRDVAKMKKGTPVVGVINNADVGNLIFSGEALTYKDIVVCMDGDTMPGLFAYKAVTRAGYCGGAVLAKDGAETFIVGTHSAGGNGVGYCSCVSQSMLLKMQAHIDPEPHHE―COOH。

2.3原始3C蛋白酶（original3C）与3C蛋白酶9位点突变体（9m3C）氨基酸位点差异见图1：

具体地说，相对于其亲本，口蹄疫病毒3C蛋白酶9位点突变体（9m3C）突变位点为：将3C蛋白酶的第10、60、92、95、97、101、126、196和203位氨基酸残基，采用固相亚磷酸酰胺法人工合成基因的方法突变为：第10位赖氨酸K突变为天冬酰胺N、第60位精氨酸R突变为谷氨酰胺Q、第92位精氨酸R突变为天冬酰胺N、第95位精氨酸R突变为谷氨酰胺Q、第97位精氨酸R突变为组氨酸H、第101赖氨酸K突变为谷氨酰胺Q、第126位精氨酸R突变为天冬酰胺N、第196精氨酸R突变为谷氨酰胺Q、第203位赖氨酸K突变为谷氨酰胺Q。

2.4口蹄疫病毒3C蛋白酶9位点突变体（9m3C）克隆质粒的构建：

将9m3C核苷酸序列，委托生工生物工程（上海）有限公司采用固相亚磷酸酰胺法人工合成，并插入pUC57质粒的EcoRV位点，构建成功克隆质粒。

3.基因插入区选择：

3.1外源基因插入区初步筛选：

根据GenBank收录的GTPV pellor株序列（GenBank accession NC_004003）全基因组注释，对基因间区进行筛选，在分析、评估的基础上，初步确定将pellor株29918-29919核苷酸之间作为外源基因插入区。

3.2外源基因插入区上、下游同源臂序列扩增、序列测定：

参考GenBank收录的GTPV pellor株序列（GenBank accession NC_004003），用Oligo6.0设计1对引物，用于扩增包含酶切位点基因间区的同源臂片段，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，上游同源臂引物对：上游：KL-1U22：5’GGA TCC CTATCT CGC GCT AAA TGA ATA C3'；下游KL-887L22：5'AGG TCT TTA ACC ATA ACC AAT AAC TAG T3'。下游同源臂引物对：上游KR-1U22：5'GGA TCC ATG AAT CAA TAT TTA ATG ATA A3'；下游KR-820L22：5'AGA TCT TAT TGA TGG TAG TAT GCT AGA G3'；下划线部分为限制酶识别位点；

采用SDS-蛋白酶K方法提取病毒基因组DNA；以山羊痘病毒CVCC AV41株DNA为PCR模板，建立25μL PCR反应体系：灭菌去离子水14.5μL10×PCR buffer2.5μL；2.5mmol/LdNTP2.0μL；DNA模板5.0μL；上下游引物(25pmol/μL)各1.0μL;Ex Taq DNA聚合酶0.25μL;PCR反应热循环参数为：温度95℃预变性5min，温度94℃变性1min、温度40℃退火1min、温度72℃延伸1min，30个循环，温度72℃延伸10min；按生工生物工程（上海）有限公司核酸回收试剂盒上的说明进行回收；将回收后的上下游基因片段分别克隆到pMD18-T simple载体中，并转化JM109感受态细胞，涂布于氨苄青霉素(Amp+100μg/mL)的LB平板上，温度37℃培养过夜；从平板上随机挑取单个菌落，分别接种到2mL LB(Amp+,100μg/mL)液体培养基中进行温度37℃振荡培养约10h，采用碱裂解法小量制备质粒DNA；将提取的质粒DNA在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳，紫外凝胶成像系统下观察结果，根据质粒大小初步判断挑选阳性质粒，疑似阳性质粒进一步酶切鉴定。对于酶切鉴定为阳性的重组质粒，委托生工生物工程（上海）技术有限公司进行核苷酸序列测定。将测序结果与GenBank收录的山羊痘病毒属代表株对应基因进行比较，用DNAStar和DNAMAN软件分析分子特征、核苷酸和氨基酸的同源性及进化关系。测序正确的上、下游同源臂序列克隆质粒分别命名为L-pMD18T、R-pMD18T；

测序结果显示上游同源臂全长908bp，核苷酸序列为：

5’―CTA TCT CGC GCT AAA TGA ATA CAA AAA AAT GAG AAT GTG TAA TAA AAT AATTTC TGC TAT AGA TTA TCC AAA TAA AAA TCA CAT TTA TAG TGC GAT AAT AGA AAC TGTTAA CAA TTA CTT AGA TAA TCC TCC GAA AAA GCT AGG ATA CAA TAT TGA TAC TTG TTTGAC TAT AGC AAA AAA CAA TTA ACA ACT AAT CAT GGA TTT TAT ACG AAG AAA GTA TTTAAT ATA TAC AAT AGA AAA CAA AGT TGA TTT TTT AAA AGA TGA AGT ACTAAC AAA GATATC AAA CTT TAC ATT AAA TCA TAT ATT AGC CAT TAA ATA TTT AAT TCT TAA CTT TCCTAG AGA TGT TAT ATC AAA AGA TGT ATT ATC GAA CCC AAA TTT TTA TGT TTT TTT ACATAT GGT AAA GTG TAA TGA CAT TTA TGA GAC TGT TTT AAA ACA TTC GTT CGA TAT TCCTAC GTT ATA TAT AAA AGC ACT TAT AAA AAA TTA TCC GTT ATT TAA TAA CAC AAT AGAAAG ATA TAA AAC TTT AGT TAG TGA ACT TTT TTT AGA CGA TAA ATT TAT CGA AAT AGTAAA ATA TTC GTC TGA ATT TGA TAA TAT CAT AGC TGT TAA TTA CGA TCT TTT ACT AAATCC TTT ATT CTA TAA TAA TGA ACC GAT TAA AAA TAT GGA AAT TAT TTA TAG TAA ACTTTT TAA AAA ATC TAA TTT TAG GAA GGT AAA AAA AAT GGA GGT TAT CAG ATT AAT GATATG GGC GTA CTT AAG TAA ACA AGA TAC TGG ATT AGA TTT TAC TGA TTT TGA CTC TCAAGA TAT ATA TAC ACT GTT TCA AAA AAG TGA TAA AGT TAT TAT TCA TAG TGA TAT GACAGA AAA GTT TAA AGA GTA TAT TTT TGG GTC GGA AAA AAC TAG TTA TTG GTT ATG GTTAA―3’；

测序结果下游同源臂全长824bp，核苷酸序列为：

5’―ATG AAT CAA TAT TTA ATG ATA ATG TCT ACA ATG AAG GGG TTG CAG AAT TAA TGTACG ATA AAA TTC TTA GTT TTA TCT ATT CAG AGA TTA AAC AAG GAA GAG TAA ATA AGA ATATGC TAA AAT TAG TTT ATA TAT TTG AAA ATG ATG AAT ATA TAC AGT CTA TTT TAT TAC AAATAA TTT ACG GAG TAC CTG GTG ATA TCT TAT CAA TTA TAG ATG TAA AGG ATG ATA ACT GGAAAA AAT ATT TTA TAG GTT TTT ATA AAG AAA ATT TTA TCG ATG GAA AAA CTT TTA TAA GTGCAA AAA CAT TCA ACT ATG ATT TAT TTA AAG TAG TGG CTA AAA TAA ATC CTG AGT ACT TTGACC CAG ACA AAA TAA TAT CCA TAT TTG ATC ATA AAC CTG AAA AAG TTA AAT ATT TTG ATACAA TAG ATA TAA ATA ATA CAT TTA TAT CAA ATA TAA TTT ATG AAA CGA ATG AAT TAA ATCTTT CAA CGA TTG AAG AAT TAC AAT CAT GCC AAA TAT ATA ATG AAG AAA CAG AAT ATT TCATTA AAG AAT ATA ATA CTT ATC TTT ATT TAA AGG AGA AGG ATC CAT ATA TTT TGT ATA ATGGCA TGT TAA CAA ATA TAT CAA AAG TTC CAT CAA ATA AAA AGT TTT CAT TGT TTA GTA AAAACA TAT TAA AAT ATT ATA TAG ATG GAA AAT TGG CAA ATA TAG GTC TTG TGT TAC CAA ATTATA AAG GTG ATA TAT TGG TAA AAA TAT TAT CGC ATT TGA AAT GTG TAG AAG ACG TTA CTGTTT TCA TTA AAT TTT CAG TAT GTA AAA ACT CTA GCA TAC TAC CAT CAA TA―3’；

也就是说，山羊痘病毒CVCC AV41株外源基因插入区上下游侧翼核苷酸序列为：5'―CAC TGT TTC AAA AAA GTG ATA AAG TTA TTA TTC ATA GTG ATA TGA CAG AAA AGT TTAAAG AGT ATA TTT TTG GGT CGG AAA AAA CTA GTT ATT GGT TAT GGT TAAATG AAT CAA TATTTA ATG ATA ATG TCT ACA ATG AAG GGG TTG CAG AAT TAA TGT ACG ATA AAA TTC TTA GTTTTA TCT ATT CAG AGA TTA AAC AAG GAA―3'。黑体下划线标注29918、29919位核苷酸，二者之间插入外源基因阅读框。

4．口蹄疫病毒衣壳结构蛋白基因克隆质粒pmP1-2A(Js05)的构建：

从GenBank下载的口蹄疫病毒Asia-1/Jiangsu/China/2005(GenBank Accession:EF149009)的结构蛋白前体基因序列、痘苗病毒（Vaccinia virus,VV）的P11-P7.5背对背启动子序列、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（E.coli xanthine-guaninephosphoribosyl transferase，GPT）基因、口蹄疫病毒内部核糖体进入位点IRES序列、9m3C序列，组成完整表达阅读框（图2），并根据哺乳动物细胞翻译密码子偏好性，对序列进行优化。优化后的全长核苷酸序列委托生工生物工程（上海）有限公司采用固相亚磷酸酰胺法人工合成，并插入pUC57质粒的EcoRV位点，构建成功pmP1-2A(Js05)克隆质粒。完整阅读框全长4,403bp，核苷酸序列如下：

5'―GCG GCC GCA CAA AAA CTA CCC AGG GTT GGA CTC CAC GTC TCC TGC CAA CTTGAG TAG GTC AAA GTT CAA AGT CTG TTT CTC AGG TGC AAT GAT CTT CTG TTT ACG GCGGTC TTG TGT GGT GTC AAG AGC CAG CAA GGG CCT GGG GCA GTA TGT TTC CGC ACG CTTCAT GCG GAT CAA CAG CTC CGT GAT GGT GTC GGC CTT CAC AGC GCC GTA GTT GAA GGAAGT GGG CAG CCG GTT GTT CAC TCT GCG TGC AAG GGC GGC GAG ATC ACC ACG CCG CGAGGA TTC TTC TCC GTA CGT TGT CTT CCC GTT GTA CAC TGT TGA CAG CAC ACG GTG GGGAGC GGT GTA GGG GAG TGC CAA GCG GGT GAT AGG CTG CTT CTG GTA AGC AGT CGG GTTGGT GTG GTT GTT CAA GGC GGT CTT GGG CGC ACC ATT GGG CAC CCA CGT GAC CGG TCCTGT GTG GAC GAG CGC AAC CTC CAG GTC TGA GAA GTA GTA CGT CGC AGA CCG GAG AAGCGC CCC GAC CAG TGT GTG TGA GGG GAT CTG CAT GAG ATC AAG GGT TTG GGT GCT CTTGGG CTG GGT GAG TTT CAC GAA CCT GTC GAG AAC GAA GGC GAC ATC AGT GTG AAG CCGTCG GGC CGT CTG GGT CTC TCC TCC GTA GTT CTC AAC CGT GGT GGT GAC TGG GTC CGCGGA CTC GCC AGT GGT GGT AGT CTG TTG GCG GGC ATC CAC CGG CAG TCG AAA CTC AAAGTC CTT GCC AGC GCT GAC GGA CAC GAC CAG CGC GTC ACC TTC AGC TTT TCC GTG GGTGAT CTG GTA AAT ACA CAC CCA TCC CTG CAC ACT CGT GGT CTC AGC CAC GTC AGA AGCAGT GTA AGC ATA GTC TGC AGC AGA AAG GTA AGG GAT AGA AAA GGT AAA TTT AGA ATTGAG TCC AGT GTC CCA CTC AGA ATG AAT GCA GTG TGC AGC CCG CTC CGG GTC CGT TGGCGG CGT CAT ACC AGG AGG TAT GTA AGC CAC CAT GTA GCG GGC TTT GGC ATC CGT GGGTCC GGT GAA CAT GAA GTG GAT ATT CAT AGT GCC GCT GTA CTG TGT GTA GTA CTG CGCCAA ACC TGC CAA GTA GGT GTT GGA CAT GTG CCC CGC AGC GAG GGA CAC GTC AAA CTTGGC AAG CAA GCG GTC ACC AGA GTT CAC CGT CTT CAC AAA TGG TAC TTC TCC GAA GCGGAG GAA GGT TGG ACA CGC CTC CGC TAC ATC AAG GAA GTT TGT GAA GCG CCC AGG GAAGCT TGT TCT GGG GGG GTT AGA CAC TTT CCC GTA GAC GGG GTC AGC CGT CTT CGG GTCCGT GGT TAC CAT GTT GCC GTA ACC GTC CAC ACA CGC CAC AGG AAC TAT CCC CTC TTTCGA GGG CAG TTC TCC TGC CAC GTG CAC GTA GGT CGG CGC TGC ATT CAT GTA GAC CTTGAT CTG TTC AGA ACC ACC AGT TTT GAC GGT AAG CGG GGC CAC CAC CAT CAC CAC AAGCGT CCA CGG TTT GTG GAG CTC GTA CTG GTC GTA CCT GTT GAC ACC CAC GTA CGG CACGTT AAT GTG AGC CGT CAT GTT AGT GCG CGG GTT AAT GAA CTG GTG TGG GAA GAG GGTTAA CTG ATA CTT CTG CCG CGT GTC GAG CTC TTT CAG CTC CGG CAC GAG TGC GAC GAGGAG ACA ACC ACC ATT GAA CTG ATT TCC AAC AGC GGT CAC CTC AAT GTC CCA CCC GTTCCT CAT GTA AGC ATA AGA GCT CAT GAG GCT GCC AAA CAC GCC CTT GTG TTC AGA GGGGAG TTC CAA GTA GTG ACA GTG TCC AAA TGA CAA ATC CGG CGT CCA GTC AAA CAG GTGTTT CTT GAA GAA CCG TTC AGC CTG TGT CAC GCG GGT CTC CAG GCC TGA GGT GTT AGGCCC AGA TAC CGC GTC CTC AGC CAC AGC GTA ACC ATA TGT TAC GCC AAC ACT CGA CTGTGT CGT CGA CGT CGT GTG GCC ATT TCT GGT GGT GAG AAT GCG GTC TTC AAG CAG AGTTGT CTC CTC CGT TTT CTT GTC AGC CAA AAG AGC ACC AAA CAG TCC GCT AAA GGC CGAGCT GGC CAA GCG TGA GAA CCA ATC ATT GTT TTG GGT GTT GTT TGT GTG TGT GGA CGTGGT GTC CGT GGA ACC CTC GTT GGA GCC TCC GCT GAT AGC GTT ATC TCC AAG TTG CGTGTC CAT GGA GTT CTG GTA CTG CTG CAT GTA GTA GTT GTT AAT GAT GCT TCC AGT ATT GCCTGA CTG GTT CTG CGA CCC GGT CGC CGG ACT GGA TTG CCC GGC TCC CAT GGT GGC ACGCGT GTC GAC CGG GGA TCC GTC ACT GTT CTT TAT GAT TCT ACT TCC TTA CCG TGC AAT AAATTA GAA TAT ATT TTC TAC TTT TAC GAG AAA TTA ATT ATT GTA TTT ATT ATT TAT GGG TGAAAA ACT TAC TAT AAA AAG CGG GTG GGT TTG GAA TTA GTG ATC AGT TTA TGT ATA TCG CAACTA CCG GGC ATA TGG CTA TCG ACA TCG AGA ACA TTA CCC ACA TGA TAA GAG ATT GTA TCAGTT TCG TAG TCT TGA GTA TTG GTA TTA CTA TAT AGT ATA TAG ATG TCT AGA AGC GAT GCTACG CTA GTC ACA ATC ACC ACT TTC ATA TTT AGA ATA TAT GTA TGT AAA AAT ATA GTA GAATTT CAT TTT GTT TTT TTC TAT GCT ATA AAT GAA TTC CTC GAG TAC CAT GAG CGA AAA ATACAT CGT CAC CTG GGA CAT GTT GCA GAT CCA TGC ACG TAA ACT CGC AAG CCG ACT GATGCC TTC TGA ACA ATG GAA AGG CAT TAT TGC CGT AAG CCG TGG CGG TCT GGT ACC GGGTGC GTT ACT GGC GCG TGA ACT GGG TAT TCG TCA TGT CGA TAC CGT TTG TAT TTC CAG CTACGA TCA CGA CAA CCA GCG CGA GCT TAA AGT GCT GAA ACG CGC AGA AGG CGA TGG CGAAGG CTT CAT CGT TAT TGA TGA CCT GGT GGA TAC CGG TGG TAC TGC GGT TGC GAT TCGTGA AAT GTA TCC AAA AGC GCA CTT TGT CAC CAT CTT CGC AAA ACC GGC TGG TCG TCCGCT GGT TGA TGA CTA TGT TGT TGA TAT CCC GCA AGA TAC CTG GAT TGA ACA GCC GTGGGA TAT GGG CGT CGT ATT CGT CCC GCC AAT CTC CGG TCG CTA ACT GCA GAT CGC CCCTCT CCC TCC CCC CCC CCT AAC GTT ACT GGC CGA AGC CGC TTG GAA TAA GGC CGG TGTGCG TTT GTC TAT ATG TTA TTT TCC ACC ATA TTG CCG TCT TTT GGC AAT GTG AGG GCC CGGAAA CCT GGC CCT GTC TTC TTG ACG AGC ATT CCT AGG GGT CTT TCC CCT CTC GCC AAAGGA ATG CAA GGT CTG TTG AAT GTC GTG AAG GAA GCA GTT CCT CTG GAA GCT TCT TGAAGA CAA ACA ACG TCT GTA GCG ACC CTT TGC AGG CAG CGG AAC CCC CCA CCT GGC GACAGG TGC CTC TGC GGC CAA AAG CCA CGT GTA TAA GAT ACA CCT GCA AAG GCG GCA CAACCC CAG TGC CAC GTT GTG AGT TGG ATA GTT GTG GAA AGA GTC AAA TGG CTC TCC TCAAGC GTA TTC AAC AAG GGG CTG AAG GAT GCC CAG AAG GTA CCC CAT TGT ATG GGA TCTGAT CTG GGG CCT CGG TGC ACA TGC TTT ACA TGT GTT TAG TCG AGG TTA AAA AAA CGTCTA GGC CCC CCG AAC CAC GGG GAC GTG GTT TTC CTT TGA AAA ACA CGA TGA TAA TATGGC CAC AAC CAT GGC TTC TGG TGC TCC GCC GAC CGA CCT GCA GAA CAT GGT TAT GGGTAA CAC CAA ACC GGT TGA ACT GAT CCT GGA CGG TAA AAC CGT TGC TAT CTG CTG CGCTAC CGG TGT TTT CGG TAC CGC TTA CCT GGT TCC GCG TCA CCT GTT CGC TGA AAA ATACGA CAA AAT CAT GCT GGA CGG TCA GGC TAT GAC CGA CTC TGA CTA CCG TGT GTT CGAGTT TGA GAT CAA GGT GAA AGG TCA GGA CAT GCT GTC TGA CGC TGC TCT GAT GGT TCTGCA CAA CGG TAA CCA GGT TCA CGA CAT CAC CCA GCA CTT CCG TGA CGT TGC TAA AATGAA AAA AGG TAC CCC GGT TGT TGG TGT TAT CAA CAA CGC TGA CGT TGG TAA CCT GATCTT CTC TGG TGA AGC TCT GAC CTA CAA AGA CAT CGT TGT TTG CAT GGA CGG TGA CACCAT GCC GGG TCT GTT CGC TTA CAA AGC TGT TAC CCG TGC TGG TTA CTG CGG TGG TGCTGT TCT GGC TAA AGA CGG TGC TGA AAC CTT CAT CGT TGG TAC TCA TTC AGC AGG AGGTAA CGG TGT TGG TTA CTG CTC TTG CGT TTC TCA GTC TAT GCT GC TGAA AAT GCA GGC TCACAT CGA CCC GGA ACC GCA CCA CGA ATA GTA ATT TTT GTG CTA GC―3':。

5．表达口蹄疫病毒空衣壳的山羊痘病毒转移载体p9m3C-mP1-2A构建：

分别从L-pMD18T、R-pMD18T用Bgl II、BamH I酶消化上下游同源臂序列，依次分别与用相同酶切的pCI(Promega,USA)质粒连接，转化JM109感受态细胞，扩增、提取、纯化质粒，待两步依次完成后，测序确认插入方向一致，并命名为pUL。再用NheⅠ和NotⅠ酶切pmP1-2A(Js05)质粒，胶收4.4Kbp，插入相同酶切的pUL载体，连接后转化JM109感受态细胞，扩增、提取、纯化质粒。测序确认正确后，命名为p9m3C-mP1-2A。外源基因插入GTPV CVCC AV41株的K区基因之间，双向启动子来源于痘苗病毒（VV），十四脘酰化位点（MGXXXS）核苷酸序列用△表示（图2），转移质粒构建完成后，转化JM109感受态细胞，大量扩增和纯化质粒，并将质粒浓度稀释为1μg/μL；

所有构建过程均采用测序方法确认，上、下游同源臂与GTPV Pellor株同源序列的一致性分别为99.4和99.5%；转移质粒p9m3C-GPT-mP1-2A全长约10.6kbp，Mlu I、Not I酶切片断为2.3和8.3kbp；Mlu I、Nhe I酶切片断为2.1和8.5kbp。

6．病毒重组、筛选、纯化及鉴定：

将山羊痘病毒（GTPV）CVCC AV41株病毒按1%剂量接种80%单层的MDBK细胞，温度37℃感作2h，然后弃去感染液，按照QIAGEN的Effectene Transfection Reagent操作手册进行转染转移质粒，8h后换上加压筛选液（霉芬酸25μg/ml、黄嘌呤250μg/ml、次黄嘌呤15μg/ml的DMEM，pH7.2～7.4）；以后逐日更换加压筛选液，直至典型病变出现，约至7-10日收获病毒，将收获的重组病毒间歇超声破碎（20W，20sec；Insonator,Model200M,Kubota,Japan）三次，再按照1%剂量接种细胞，依所述方法，重组病毒连续传代5代，然后用加压筛选液将第5代重组病毒作10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释后，接种MDBK细胞，温度37℃，5%CO₂感作2h，然后弃去感染液，加入1%低熔点琼脂糖的DMEM培养基，继续温度37℃，5%CO₂培养至出现典型聚集细胞团块，挑取细胞聚集体，再重复筛选直至完全纯化；从第6代开始，抽提每代重组病毒基因组DNA作为模板，利用PCR鉴定外源基因稳定性。采用SDS-蛋白酶K方法提取重组病毒基因组DNA作为PCR模板，建立25μL PCR反应体系：灭菌去离子水14.5μ L10×PCR buffer 2.5μL；2.5mmol/L dNTP2.0μL；DNA模板5.0μL；上下游鉴别引物(25pmol/μL)各1.0μL；PrimeSTAR DNA聚合酶0.25μL；PCR反应热循环参数为：温度95℃预变性3min，温度94℃变性1min、温度45℃退火1min、温度72℃延伸1min，30个循环，温度72℃延伸10min，鉴别引物为：上游1U24，5’―CAC TGT TTC AAA AAA GTG ATA AAG―3’；下游181L24，5’―TTC CTTGTT TAA TCT CTG AAT AGA―3’；

转移质粒p9m3C-mP1-2A与GTPV CVCC AV41共转染MDBK细胞，在加压筛选条件下培养至细胞病变出现，并连续传代至第五代，之后挑选单个的细胞聚集团块，培养收获后用PCR方法检测纯度，检测结果显示：第6代重组病毒中能够筛选到只有4.4Kbp目标条带，而没有亲本病毒才具有的200bp条带的重组子；将该重组子挑选出来，进一步加压筛选，确认无亲本毒存在，作为重组病毒rGTPV-P1-2A-9m3C。直至第10代，结果与第5代相同。

7．重组病毒与亲代毒株的TCID₅₀比较：

制备单层MDBK细胞，在接入重组病毒前弃去上清，加入1%病毒液，温度37℃感作2h，充分吸附后，加入含2%小牛血清的DMEM继续培养，直至细胞完全病变后收获细胞和上清，反复冻融3次后，用无血清的DMEM营养液将收获的毒以10^-1-10^-6倍比稀释，按每孔100μL接种已长成80-90%的MDBK细胞的24孔板，每个滴度接4个孔，5%CO₂温度37℃培养箱中培养5-7d，每天观察细胞病变，按Karber方法计算病毒TCID₅₀；

检测结果显示：第6-10代重组病毒的TCID₅₀分别为5.25、5.75、5.5、5.25、5.50，对应的亲本病毒TCID₅₀分别为5.5、5.5、5.25、6.0、5.75，差异不显著。

8．重组病毒在LT细胞上的生长特性：

以10²TCID₅₀的第10代重组病毒与亲本GTPV CVCC AV41株分别接种已长满方瓶的MDBK细胞，分别在接种后培养24h、48h、72h、96h、120h和144h取出方瓶收获病毒，冻融3次，按Karber方法测定病毒TCID₅₀，绘制生长动力学曲线；

检测结果显示：第10代重组病毒在感染MDBK细胞24h、48h、72h、96h、120h和144h后，其TCID₅₀分别为1.0、1.0、2.5、3.75、5.25、5.5；对应的亲本病毒TCID₅₀分别为1.0、1.0、2.75、4.25、5.5、5.5，二者差异不显著。

9.重组病毒体外遗传稳定性：

用蚀斑纯化的第10代重组病毒在MDBK细胞上连续传代，以10²TCID₅₀的重组病毒接种细胞，5%CO₂温度37℃培养箱内感作2h，弃去病毒接种物，加入病毒培养维持液，定期观察细胞的形态，记录80-90%以上细胞出现病变的时间，并收获病毒，如此连续培养至第20代，间隔5代检测重组病毒滴度（TCID₅₀）；

检测结果显示：第10、15、20代重组病毒TCID₅₀分别为5.25、5.5、5.5，表明重组病毒传代稳定。

10.口蹄疫病毒结构蛋白及空衣壳组装检测：

10.1SDS-PAGE电泳：

制备单层MDBK细胞，弃去上清，加入1%病毒液，温度37℃感作2h，充分吸附后，加入含6-8%胎牛血清的DMEM继续培养，直至144h后病变明显，反复冻融3次，收获细胞和上清，作为重组病毒，取重组病毒90μl，加入4×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀，煮沸10分钟，制备电泳样品，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，结束后，染色1h，脱色过夜，观察图谱；

电泳结果显示：在24Kd、25Kd附近位置有与VP1、VP3和3C蛋白酶大小相当的条带，而亲本病毒对照中无对应条带。

10.2Western-blot检测：

将SDS-PAGE电泳胶，100V45min转印PVDF膜，5%脱脂乳PBS封闭过夜，PBS作为稀释液，1:50的Asia-1FMDV康复牛血清,温度37℃结合1h，PBS充分洗涤，二抗HRP-山羊抗牛IgG(1:1000稀释)温度37℃结合1h，DAB显色，观察图谱；

Western-blot检测表明：重组病毒rGTPV-9m3C-mP1-2A与Asia-1/Jiangsu/China/2005康复牛血清能有效识别。

10.3电镜检测空衣壳：

收获感染rGTPV-mP1-2A-9m3C的MDBK细胞，PBS洗涤3次，预留PBS约1mL，反复冻融3次，收集1mL细胞培养物，温度4℃条件下12,000r/min离心10min，取上清液约1mL，加入10μL Asia-1FMDV康复牛血清，温度37℃作用30min，迅速放置温度4℃平衡1h，温度4℃条件下12,000r/min离心30min，弃上清液900μL，留100μL上清溶解沉淀作为电镜样品，磷钨酸负染色，于H-600透射电镜下观察。

免疫电镜检测显示：能观察到直径约25nm左右大小的病毒样颗粒，亲本毒对照样品中观察不到相应颗粒。

上述检测结果均支持重组病毒不但表达了结构蛋白，而且9m3C对其也进行了有效剪切，并且能组装为空衣壳。

结论：本发明所述的一种表达口蹄疫病毒空衣壳的重组山羊痘病毒的构建方法，该方法中构建成功的口蹄疫病毒3C蛋白酶9位点突变体（9m3C），显著降低了其亲本对宿主细胞的诱导凋亡作用，同时保留了其对衣壳前体蛋白的剪切功能，最终成功筛选到了在宿主细胞体内表达、组装口蹄疫病毒空衣壳的重组山羊痘病毒，并且能够稳定、连续传代。

名称：一种表达口蹄疫病毒空衣壳的重组山羊痘病毒的构建方法

申请人：新疆维吾尔自治区畜牧科学院兽医研究所

上游同源臂核苷酸序列为：

5’―CTA TCT CGC GCT AAA TGA ATA CAA AAA AAT GAG AAT GTG TAA TAA AAT AAT TTC TGC TAT AGA TTA TCC AAA TAA AAA TCA CAT TTA TAG TGC GAT AAT AGA AAC TGT TAA CAA TTA CTT AGA TAA TCC TCC GAA AAA GCT AGG ATA CAA TAT TGA TAC TTG TTT GAC TAT AGC AAA AAA CAA TTA ACA ACT AAT CAT GGA TTT TAT ACG AAG AAA GTA TTT AAT ATA TAC AAT AGA AAA CAA AGT TGA TTT TTT AAA AGA TGA AGT ACTAAC AAA GAT ATC AAA CTT TAC ATT AAA TCA TAT ATT AGC CAT TAA ATA TTT AAT TCT TAA CTT TCC TAG AGA TGT TAT ATC AAA AGA TGT ATT ATC GAA CCC AAA TTT TTA TGT TTT TTT ACA TAT GGT AAA GTG TAA TGA CAT TTA TGA GAC TGT TTT AAA ACA TTC GTT CGA TAT TCC TAC GTT ATA TAT AAA AGC ACT TAT AAA AAA TTA TCC GTT ATT TAA TAA CAC AAT AGA AAG ATA TAA AAC TTT AGT TAG TGA ACT TTT TTT AGA CGA TAA ATT TAT CGA AAT AGT AAA ATA TTC GTC TGA ATT TGA TAA TAT CAT AGC TGT TAA TTA CGA TCT TTT ACT AAA TCC TTT ATT CTA TAA TAA TGA ACC GAT TAA AAA TAT GGA AAT TAT TTA TAG TAA ACT TTT TAA AAA ATC TAA TTT TAG GAA GGT AAA AAA AAT GGA GGT TAT CAG ATT AAT GAT ATG GGC GTA CTT AAG TAA ACA AGA TAC TGG ATT AGA TTT TAC TGA TTT TGA CTC TCA AGA TAT ATA TAC ACT GTT TCA AAA AAG TGA TAA AGT TAT TAT TCA TAG TGA TAT GAC AGA AAA GTT TAA AGA GTA TAT TTT TGG GTC GGA AAA AAC TAG TTA TTG GTT ATG GTT AA―3’；

下游同源臂核苷酸序列为：

5’―ATG AAT CAA TAT TTA ATG ATA ATG TCT ACA ATG AAG GGG TTG CAG AAT TAA TGT ACG ATA AAA TTC TTA GTT TTA TCT ATT CAG AGA TTA AAC AAG GAA GAG TAA ATA AGA ATA TGC TAA AAT TAG TTT ATA TAT TTG AAA ATG ATG AAT ATA TAC AGT CTA TTT TAT TAC AAA TAA TTT ACG GAG TAC CTG GTG ATA TCT TAT CAA TTA TAG ATG TAA AGG ATG ATA ACT GGA AAA AAT ATT TTA TAG GTT TTT ATA AAG AAA ATT TTA TCG ATG GAA AAA CTT TTA TAA GTG CAA AAA CAT TCA ACT ATG ATT TAT TTA AAG TAG TGG CTA AAA TAA ATC CTG AGT ACT TTG ACC CAG ACA AAA TAA TAT CCA TAT TTG ATC ATA AAC CTG AAA AAG TTA AAT ATT TTG ATA CAA TAG ATA TAA ATA ATA CAT TTA TAT CAA ATA TAA TTT ATG AAA CGA ATG AAT TAA ATC TTT CAA CGA TTG AAG AAT TAC AAT CAT GCC AAA TAT ATA ATG AAG AAA CAG AAT ATT TCA TTA AAG AAT ATA ATA CTT ATC TTT ATT TAA AGG AGA AGG ATC CAT ATA TTT TGT ATA ATG GCA TGT TAA CAA ATA TAT CAA AAG TTC CAT CAA ATA AAA AGT TTT CAT TGT TTA GTA AAA ACA TAT TAA AAT ATT ATA TAG ATG GAA AAT TGG CAA ATA TAG GTC TTG TGT TAC CAA ATT ATA AAG GTG ATA TAT TGG TAA AAA TAT TAT CGC ATT TGA AAT GTG TAG AAG ACG TTA CTG TTT TCA TTA AAT TTT CAG TAT GTA AAA ACT CTA GCA TAC TAC CAT CAA TA―3’。

口蹄疫病毒3C蛋白酶9位点突变体氨基酸序列为：

NH₂―ASGAPPTDLQNMVMGNTKPVELILDGKTVAICCATGVFGTAYLVPRHLFAEKY DKIMLDGQAMTDSDYRVFEFEIKVKGQDMLSDAALMVLHNGNQVHDITQHFRDVAKMK KGTPVVGVINNADVGNLIFSGEALTYKDIVVCMDGDTMPGLFAYKAVTRAGYCGGAVLAKDGAETFIVGTHSAGGNGVGYCSCVSQSMLLKMQAHIDPEPHHE―COOH。

Claims (1)

1.一种表达口蹄疫病毒空衣壳的重组山羊痘病毒的构建方法，其特征在于按下列步骤进行：

a、以上、下游同源臂为基础构建转移质粒，中间依次插入口蹄疫病毒结构蛋白前体基因P1-2A、痘苗病毒背对背启动子P7.5-P11、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因、口蹄疫病毒内部核糖体进入位点序列、口蹄疫病毒3C蛋白酶9位点突变体基因，所述的口蹄疫病毒3C蛋白酶9位点突变体基因，是将3C蛋白酶的第10、60、92、95、97、101、126、196和203位氨基酸残基，采用固相亚磷酸酰胺法人工合成基因的方法将下列位点进行突变：第10位赖氨酸K突变为天冬酰胺N、 第60位精氨酸R突变为谷氨酰胺Q、第92位精氨酸R突变为天冬酰胺N、第95位精氨酸R突变为谷氨酰胺Q、第97位精氨酸R突变为组氨酸H、第101赖氨酸K突变为谷氨酰胺Q、第126位精氨酸R突变为天冬酰胺N、第196精氨酸R突变为谷氨酰胺Q、第203位赖氨酸K突变为谷氨酰胺Q；其中上游同源臂核苷酸序列为：

5’―CTA TCT CGC GCT AAA TGA ATA CAA AAA AAT GAG AAT GTG TAA TAA AAT AAT TTC TGC TAT AGA TTA TCC AAA TAA AAA TCA CAT TTA TAG TGC GAT AAT AGA AAC TGT TAA CAA TTA CTT AGA TAA TCC TCC GAA AAA GCT AGG ATA CAA TAT TGA TAC TTG TTT GAC TAT AGC AAA AAA CAA TTA ACA ACT AAT CAT GGA TTT TAT ACG AAG AAA GTA TTT AAT ATA TAC AAT AGA AAA CAA AGT TGA TTT TTT AAA AGA TGA AGT ACTAAC AAA GAT ATC AAA CTT TAC ATT AAA TCA TAT ATT AGC CAT TAA ATA TTT AAT TCT TAA CTT TCC TAG AGA TGT TAT ATC AAA AGA TGT ATT ATC GAA CCC AAA TTT TTA TGT TTT TTT ACA TAT GGT AAA GTG TAA TGA CAT TTA TGA GAC TGT TTT AAA ACA TTC GTT CGA TAT TCC TAC GTT ATA TAT AAA AGC ACT TAT AAA AAA TTA TCC GTT ATT TAA TAA CAC AAT AGA AAG ATA TAA AAC TTT AGT TAG TGA ACT TTT TTT AGA CGA TAA ATT TAT CGA AAT AGT AAA ATA TTC GTC TGA ATT TGA TAA TAT CAT AGC TGT TAA TTA CGA TCT TTT ACT AAA TCC TTT ATT CTA TAA TAA TGA ACC GAT TAA AAA TAT GGA AAT TAT TTA TAG TAA ACT TTT TAA AAA ATC TAA TTT TAG GAA GGT AAA AAA AAT GGA GGT TAT CAG ATT AAT GAT ATG GGC GTA CTT AAG TAA ACA AGA TAC TGG ATT AGA TTT TAC TGA TTT TGA CTC TCA AGA TAT ATA TAC ACT GTT TCA AAA AAG TGA TAA AGT TAT TAT TCA TAG TGA TAT GAC AGA AAA GTT TAA AGA GTA TAT TTT TGG GTC GGA AAA AAC TAG TTA TTG GTT ATG GTT AA―3’；

下游同源臂核苷酸序列为：

5’―ATG AAT CAA TAT TTA ATG ATA ATG TCT ACA ATG AAG GGG TTG CAG AAT TAA TGT ACG ATA AAA TTC TTA GTT TTA TCT ATT CAG AGA TTA AAC AAG GAA GAG TAA ATA AGA ATA TGC TAA AAT TAG TTT ATA TAT TTG AAA ATG ATG AAT ATA TAC AGT CTA TTT TAT TAC AAA TAA TTT ACG GAG TAC CTG GTG ATA TCT TAT CAA TTA TAG ATG TAA AGG ATG ATA ACT GGA AAA AAT ATT TTA TAG GTT TTT ATA AAG AAA ATT TTA TCG ATG GAA AAA CTT TTA TAA GTG CAA AAA CAT TCA ACT ATG ATT TAT TTA AAG TAG TGG CTA AAA TAA ATC CTG AGT ACT TTG ACC CAG ACA AAA TAA TAT CCA TAT TTG ATC ATA AAC CTG AAA AAG TTA AAT ATT TTG ATA CAA TAG ATA TAA ATA ATA CAT TTA TAT CAA ATA TAA TTT ATG AAA CGA ATG AAT TAA ATC TTT CAA CGA TTG AAG AAT TAC AAT CAT GCC AAA TAT ATA ATG AAG AAA CAG AAT ATT TCA TTA AAG AAT ATA ATA CTT ATC TTT ATT TAA AGG AGA AGG ATC CAT ATA TTT TGT ATA ATG GCA TGT TAA CAA ATA TAT CAA AAG TTC CAT CAA ATA AAA AGT TTT CAT TGT TTA GTA AAA ACA TAT TAA AAT ATT ATA TAG ATG GAA AAT TGG CAA ATA TAG GTC TTG TGT TAC CAA ATT ATA AAG GTG ATA TAT TGG TAA AAA TAT TAT CGC ATT TGA AAT GTG TAG AAG ACG TTA CTG TTT TCA TTA AAT TTT CAG TAT GTA AAA ACT CTA GCA TAC TAC CAT CAA TA―3’；

b、将转移质粒与山羊痘病毒CVCC AV41株共转染MDBK细胞，以同源重组方式，将外源基因插入上、下游同源臂之间，筛选到的重组山羊痘病毒能稳定存在，并表达口蹄疫病毒空衣壳。