CN106318916A - 重组腺病毒、和四价腺病毒疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组腺病毒、和四价腺病毒疫苗及其制备方法，所述四价重组腺病毒疫苗，包括重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株。本发明首先通过制备包含不同六邻体基因片段在内的重组穿梭质粒，与重组人3型腺病毒基因组进行细菌内同源重组，获得六邻体基因片段被替换为7型、14型、55型的重组腺病毒基因组，转染细胞后拯救得到主要衣壳蛋白‑六邻体蛋白不同的重组人3型、7型、14型、55型重组腺病毒。纯化后按相同蛋白质含量混合，再用β‑内丙脂进行灭活，得到四价腺病毒疫苗，该四价腺病毒疫苗可以诱导出对四种血清型腺病毒的中和抗体应答，中和效价均为500‑1000。

Description

重组腺病毒、和四价腺病毒疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组腺病毒、以及以人3型腺病毒(HAdv3)为载体的四价人腺病毒疫苗及其制备方法。
背景技术
人腺病毒(humanAdenovirus,HAdV)是1953年首次从急性呼吸道疾病病人身上分离、鉴定出来的一类病原体，可以感染人类呼吸道、胃肠道、泌尿系统或眼部等多种组织，导致急性呼吸道感染(ARI)、急性胃肠炎、肾炎、眼角膜结膜炎等多种不同疾病。腺病毒流行广泛，传播快，近年来在多个国家和地区时有爆发和流行，严重威胁到社会公共卫生安全。腺病毒感染的患者主要是婴幼儿及体弱人群，在人员密集的幼儿园、军队院校、新兵训练营中腺病毒暴发流行时有发生，特别是其感染导致的重症肺炎病死率高。腺病毒引起的肺炎尤为严重，不仅可以引起心力衰竭、呼吸衰竭，还可以引起肺外受累，如脑炎、肝损害、心肌炎或心肌损害等，甚至导致死亡，而且通常预后较差。
腺病毒型别多，至今已发现的人腺病毒有7组50多种血清型，超过68种基因型。B组、C组、E组腺病毒都可以引起呼吸道感染，其中B组人3、7、14、55、11型及E组4型腺病毒是严重的呼吸道疾病如急性呼吸道感染和婴幼儿致死性肺炎的重要病原体，传染性强，在国内外多有报道。
腺病毒感染在我国也非常普遍，腺病毒肺炎是我国发病率名位前列的病毒性肺炎之一，患者年龄主要分布主要在6个月至三岁之间。在我国，腺病毒的地方性流行暴发时有发生，导致呼吸道感染的腺病毒主要是腺病毒3型和7型，其中腺病毒3型检出最多，近年来55型成为一种重要的流行株，而B组14型、11型，C组2型、5型、1型，E组4型等型别的腺病毒呼吸道感染也时有报道，但相对较少，近十年来国内基本上没有报告4型腺病毒的流行。
因此，在致婴幼儿和成人急性呼吸道感染ARI的腺病毒中，人腺病毒B组3型、7型、14型和55型是最重要的几个型别。其中3型腺病毒主要导致婴幼儿严重感染，一般不导致成年人严重感染。相对其它型别的腺病毒感染，B组人7型腺病毒(HAdV-B7)、人55型(HAdV-B55)感染引起的肺炎症状通常更严重。国内从60年代以来一直有HAdV-B7重症感染和爆发流行的报道。近年来新出现的HAdV-B55腺病毒导致的呼吸道感染和严重肺炎暴发流行的报道越来越多，在全国范围内在人群密集的军营和高校已有多起爆发流行，已经成为重要的流行病毒株，引起人们更多重视。人腺病毒14型(HAdV-B14)引起的幼儿和成人急性呼吸道感染在国内外都有过爆发病例报道，并且常常导致重症肺炎，特别是近年来出现的高致病的HAdV-14p1株的流行严重威胁公众健康。HAdV-B55是一种基因组重组的腺病毒，其基因组包括纤毛基因主要来自14型腺病毒，只有六邻体高变区来源于人11型腺病毒，这种重组变异导致其不能被HAdV-B14抗血清中和。重组是腺病毒进化的主要方式，重组可能产生生物学特性改变的新型腺病毒，出现更强致病性或更强传染性的新毒株，将会严重威胁人类健康。
腺病毒致病的广泛性和危害的严重性使得腺病毒的防治显得十分重要，接种腺病毒疫苗是预防腺病毒感染最有效的方法之一。但由于腺病毒产生的中和抗体只能中和同型腺病毒的感染，不同型别腺病毒抗体之间无交叉保护作用。在我国，腺病毒疫苗的临床使用还是一片空白。从我国近年来多次爆发腺病毒疫情来看，自主研发腺病毒疫苗十分必要。若研制出一种能同时预防几种型别的腺病毒感染的疫苗对于降低腺病毒感染率将非常有价值。而不同型别腺病毒简单混合的多价疫苗可能体内重组产生高致病的病毒而受到限制。
腺病毒颗粒是一个二十面体的对称结构，壳体由12个位于顶角的五邻体基座和纤维蛋白，240个非顶角颗粒的六邻体(hexon)以及结构辅助蛋白多肽构成。六邻体是三聚体结构，包括是腺病毒颗粒中最丰富的免疫原，是腺病毒最主要的诱导中和性抗体的抗原。不同型别腺病毒的六邻体蛋白的氨基酸序列有高达78-95％的同源性，其区别主要集中在7个高变区(HVRs)，这些高变区暴露于病毒壳体表面，不涉及六邻体单体间的相互作用，也不与其它的腺病毒蛋白相互作用。不同型别腺病毒的六邻体可能可以交换而不影响其复制和增殖。
常规的多价疫苗制备方法为分离不同型别的临床毒株，分别培养纯化，合适比例配伍后制成多价疫苗，但这种方法制备多价腺病毒疫苗有其缺陷，首先，不同型别腺病毒基因组间易发生重组，可能产生毒力更强的新型腺病毒；其次，不同型别腺病毒的复制增殖效率不同，导致研制多价疫苗时配伍困难。目前国际上人腺病毒疫苗只有人4型、7型腺病毒疫苗，这两种疫苗为活的口服肠溶型疫苗，仅在美国军队的新兵训练营中使用，其应用显著减少了美军发热性呼吸道感染的发病率。但是这种疫苗只能预防人4型、7型腺病毒感染，对其它广泛流行的型别如3型、14型和55型没有预防作用。因此，有必要研制一种多价腺病毒疫苗，可以预防常见的腺病毒型别感染。
发明内容
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种重组腺病毒、四价重组腺病毒疫苗及其制备方法。
为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
一种重组腺病毒，其六邻体具有如SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5、或SEQ ID No:6所示的碱基序列。
一种四价重组腺病毒疫苗，其包括重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株，所述重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株的六邻体分别具有如SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ IDNo:5、SEQ ID No:6所示的碱基序列。
一种四价重组腺病毒疫苗，其包括重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株，所述重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株的六邻体分别具有如SEQ ID No:7、SEQ ID No:8、SEQ IDNo:9、SEQ ID No:10所示的氨基酸序列。
在其中一些实施例中，所述疫苗中重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株和重组55型腺病毒株的病毒颗粒数之比为1：1：1：1。
在其中一些实施例中，所述疫苗对3型、7型、14型和55型腺病毒的中和效价均为500-1000。
在其中一些实施例中，所述1ml疫苗中含有的病毒颗粒数为1012vps。
本发明还提供了上述四价重组腺病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：
(1)、利用ClaI+BamHI双酶切穿梭质粒pBRHexonL/R和腺病毒Ad7、Ad14和Ad55的六邻体基因，连接，转化，分别获得腺病毒Ad7、Ad14和Ad55的穿梭质粒H7-pBRH3S、H14-pBRH3S和H55-pBRH3S；所述腺病毒Ad7、Ad14和Ad55的六邻体基因分别具有如SEQ ID No:4、SEQ IDNo:5和SEQ ID No:6所示的碱基序列；
(2)、用AvRII+PacI双酶切骨架质粒pBRAd△E3GFP使之线性化，凝胶回收纯化大片段；用EcoRI+SalI分别双酶切步骤(1)的穿梭质粒H7-pBRH3S、H14-pBRH3S和H55-pBRH3S，将线性化的骨架质粒的大片段和经双酶切的穿梭质粒共电转化细菌BJ5183，获得重组质粒，再经AsisI酶切线性化后转染AD293细胞，拯救包装，得到重组腺病毒rAd3H7、rAd3H14、和rAd3H55；骨架质粒pBRAd△E3GFP经AsisI酶切线性化后转染AD293细胞，拯救包装得到重组腺病毒rAd3EGFP；
(3)、将纯化后的重组腺病毒rAd3EGFP、rAd3H7、rAd3H14、rAd3H55按1:1:1:1的病毒颗粒数混合，灭活，即得。
在其中一些实施例中，步骤(3)中采用β-内丙脂进行灭活。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明首先通过制备包含不同六邻体基因片段在内的重组穿梭质粒，与重组人3型腺病毒基因组进行细菌内同源重组，获得六邻体基因片段被替换为7型、14型、55型的重组腺病毒基因组，转染细胞后拯救得到主要衣壳蛋白-六邻体蛋白为3型、7型、14型、55型的重组人3型、7型、14型、55型重组腺病毒。在HEp-2细胞中连续传代10代后提取病毒基因组进行酶切鉴定、测序鉴定，结果表明重组病毒基因组保持稳定，没有基因缺少、重组现象，嵌合型病毒产量与3型重组腺病毒无显著差异，且均具有与野生型腺病毒相近的免疫原性；四种重组腺病毒混合后培养过程中都能有效复制，复制效率相近，基因组拷贝数相近，六邻体型特异性抗体ELISA检测混合培养产物，四种型别的六邻体都可以检测到；
2、将3型、7型、14型、55型重组腺病毒疫苗候选株纯化后按相同蛋白质含量混合，再用β-内丙脂进行灭活，得到四价腺病毒疫苗，该四价腺病毒疫苗可以诱导出对四种血清型腺病毒的中和抗体应答，中和效价均为500-1000，其中对3型腺病毒的中和效价最高，对7型最低，但差异不显著。
附图说明
图1为本发明实施例1中，293细胞接种不同量的重组腺病毒培养2天后，收集病毒，感染新的293细胞，检测其感染性病毒(i.p.)滴度；
图2为本发明试验例1中，嵌合型重组腺病毒rAd3H55在小鼠体内诱导出强烈的抗HAdV55抗体应答；
图3为本发明试验例1中，嵌合型重组腺病毒rAd3H14在小鼠体内诱导出强烈的抗HAdV14抗体应答；
图4为本发明试验例2中通过Q-PCR检测四种重组腺病毒混合培养的复制特性；其中，ADV为通用Q-PCR体系检测，可以检测rAd3H14、rAd3H55、rAd3H7与rAd3EGFP四种病毒；其他用六邻体型别特异性的Q-PCR体系检测，只能分别特异检测rAd3EGFP、rAd3H7、rAd3H14、rAd3H55；
图5为本发明试验例2中四种重组腺病毒混合培养后纯化产物的Q-PCR检测结果，其中，ADV为通用Q-PCR体系检测；其它为六邻体型别特异的Q-PCR体系检测；
图6为本发明试验例2中六邻体型特异性抗体ELISA检测混合培养产物的结果；
图7为本发明试验例3中细胞微量中和实验检测多价腺病毒疫苗免疫小鼠抗血清对各型别野生型腺病毒的中和作用；其中：Anti-rAd-A为rAd3EGFP、rAd3H7、rAd3H14、rAd3H55混合培养后纯化的重组腺病毒免疫小鼠抗血清；Anti-rAd-B为分别培养纯化后简单同比例混合后免疫小鼠抗血清。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
以下实施例中所述Ad3病毒株为HAdv3-gz01，全基因组Genbank号：DQ099432；所述Ad7病毒株为Ad7-GZ08，全基因组序列GenBank号：GQ478341.1；所述Ad14病毒株为Ad14-GZ01，全基因组序列GenBank号：JQ824845.1；所述Ad55病毒株为Ad55-Shanxi-Y16，六邻体基因序列GenBank号：KF911353.1。
实施例1六邻体置换型重组腺病毒rAd3H14、rAd3H55和rAd3H7的制备
以发明人前期获得的骨架质粒pBRAd△E3GFP(公开的文献为Zhang Q,Su X,SetoD,Zheng BJ,Tian X,Sheng H,Li H,Wang Y,Zhou R.Construction andcharacterization of a replication-competent human adenovirus type 3-basedvector as a live-vaccine candidate and a viral delivery vector.Vaccine 2009；27(8):1145-53)为基础，用Ad7、Ad14或Ad55的全长六邻体基因(分别扩增自Ad7、Ad14或Ad55的病毒株，氨基酸序列无突变)替换掉该重组3型腺病毒的六邻体基因，获得六邻体置换型重组腺病毒rAd3H7、rAd3H14、rAd3H55。基本构建程序如下：PCR扩增Ad7、Ad14或Ad55的六邻体基因，克隆到六邻体穿梭质粒pBRHexonL/R，以pBRAd△E3GFP为骨架质粒，采用细菌内同源重组的方法构建重组腺病毒质粒，线性化后转染，AD293细胞内包装拯救复制型的重组腺病毒rAd3H7、rAd3H14、rAd3H55。
具体步骤如下：
(1)、从培养的腺病毒Ad7、Ad14或Ad55保存液提取病毒基因组，分别取1μl病毒基因组作为模板，用六邻体上下游引物对Hex18F：5’-ctttcaagatggccaccccatcgatg-3’(SEQID No:1)和Hex2714R：5’-ggctcatccatgggatccacctcaaa-3’(SEQ ID No:2)进行PCR扩增，分别获得序列号分别为SEQ ID No:4、SEQ ID No:5和SEQ ID No:6的Ad7、Ad14和Ad55的六邻体基因，其氨基酸序列为SEQ ID No:8、SEQ ID No:9和SEQ ID No:10，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用试剂盒回收；PCR反应程序：98℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火30s，72℃延伸2.5min，28个循环；72℃延伸5min。PCR反应体系：
(2)、ClaI+BamHI双酶切上述回收的PCR产物，同时用ClaI+BamHI双酶切穿梭质粒pBRHexonL/R(发明人前期制备，见文献Hongling Qiu,Xiao Li,Xingui Tian,ZhichaoZhou,Ke Xing,Haitao Li,Ni Tang,Wenkuan Liu,Peisheng Bai and RongZhou.Serotype-Specific Neutralizing Antibody Epitopes of Human AdenovirusType 3(HAdV-3)and HAdV-7 Reside in Multiple Hexon HypervariableRegions.J.Virol.2012Aug,86(15):7964-75.)，用T4DNA连接酶连接，将六邻体基因克隆至穿梭质粒pBRHexonL/R中，将连接产物转化100μl Top10化学感受态细胞，过夜培养，挑单菌落进行菌落PCR鉴定，并扩大培养后提取质粒进行酶切鉴定，阳性克隆送测序公司进行测序鉴定，分别命名为H7-pBRH3S(H7S)，H55-pBRH3S(H55S)，H14-pBRH3S(H14S)；
(3)、用EcoRI+SalI双酶切穿梭质粒H7-pBRH3S(H7S)，H55-pBRH3S(H55S)，H14-pBRH3S(H14S)，用AvRII+PacI双酶切骨架质粒pBRAd△E3GFP使之线性化，凝胶回收纯化大片段，共电转化大肠杆菌BJ5183(stratagene公司)感受态细胞。PCR鉴定筛选阳性的菌落接种含Amp的LB培养基培养，质粒小抽试剂盒抽提质粒，进行酶切鉴定，PCR及酶切均正确的质粒送测序，将修饰的Hexon全基因测通，验证基因突变是否成功及重组过程中质粒是否有碱基突变或缺少，获得重组质粒；
(4)、将上述重组得到的质粒AsisI酶切线性化后转染AD293细胞，拯救包装得到重组病毒，大量培养并CsCl密度梯度离心纯化得到重组病毒粒子rAd3EGFP、rAd3H7、rAd3H14、rAd3H55。经过纯化的病毒粒子稀释到1×1012VPs/ml，测定OD260/OD280比值约1.2-1.4，内毒素检测<10EU/ml。重组病毒rAd3EGFP、rAd3H7、rAd3H14、rAd3H55在HEp-2细胞中连续传代10代后提取病毒基因组进行酶切鉴定、测序鉴定，表明重组病毒基因组保持稳定，没有基因缺少、重组现象，重组病毒的六邻体序列没有突变。
对上述制备得到的六邻体置换的重组腺病毒rAd3H14、rAd3H55和rAd3H7的生长增殖等特性进行了分析。接种不同浓度的重组腺病毒培养2天，收集病毒后接种293细胞检测其感染性病毒颗粒数，结果表明嵌合型病毒产量与rAd3EGFP无显著差异(图1)。
试验例1重组腺病毒rAd3H14、rAd3H55和rAd3H7免疫原性试验
为分析六邻体嵌合型腺病毒重组腺病毒rAd3H14、rAd3H55和rAd3H7的免疫原性，分别使用用嵌合体腺病毒重组腺病毒rAd3H14、rAd3H55和rAd3H7免疫小鼠，共免疫三次，采集血清后进行细胞微量中和实验。rAd3H14和rAd3H55免疫小鼠分别诱导出强烈的抗HAdV14和HAdV55的中和抗体，其效价约4096，与野生型腺病毒HAdV14和HAdV55相近(P>0.05,Dunn's Multiple Comparison Test)，也与rAd3EGFP免疫小鼠诱导的抗HAdV3中和效价无显著差异(图2、图3)。
试验例2重组腺病毒rAd3H14、rAd3H55、rAd3H7与rAd3EGFP混合培养特性分析
四种重组腺病毒rAd3H14、rAd3H55、rAd3H7与rAd3EGFP各以相同量100TCID50混合后，接种24孔板进行培养，于接种后不同时间收集病毒产物，用分别针对rAd3H14、rAd3H55、rAd3H7与rAd3EGFP的Q-PCR体系进行检测，分析不同嵌合体病毒在混合培养过程中的复制特性。结果表明四种重组腺病毒混合后培养过程中都能有效复制，复制效率相近，无显著差异(图4)。
四种重组腺病毒各以相同量混合后，大量接种细胞培养(30个100mm皿)并纯化。纯化的混合型病毒取1×109VPs用型别特异Q-PCR检测四种重组腺病毒各自的基因组拷贝数，重复检测3次取平均值，结果表明四种重组腺病毒的基因组拷贝数相近，无显著差异(图5)。
用型别特异的3型腺病毒六邻体单抗MAb-3D7(发明人制备，见文献Xingui Tian,Minglong Liu,Xiaobo Su,Zaixue Jiang,Qiang Ma,Xiaohong Liao,Xiao Li,ZhichaoZhou,Chenyang Li,Rong Zhou.Mapping the epitope of neutralizing monoclonalantibodies against human adenovirus type 3.Virus Res.2015 Jun9；208:66-72.doi:10.1016/j.virusres.2015.06.002.)，及A7R4、A14R1、A55R4抗血清，进行ELISA实验检测混合培养纯化的重组腺病毒，抗A3H蛋白抗血清作为阳性对照，抗PBS抗血清作为阴性对照，结果在纯化的混合型腺病毒中，四种型别的六邻体都可以检测到(图6)。
试验例3重组腺病毒rAd3H14、rAd3H55、rAd3H7与rAd3EGFP混合作为4价腺病毒疫苗免疫小鼠
为探讨这四种重组腺病毒是否能作为一种四价的腺病毒候选疫苗使用，采用以下两种方式混合：
一种是rAd3EGFP、rAd3H7、rAd3H14、rAd3H55等四种重组腺病毒在体外同比例混合后接种细胞进行大量培养，纯化，获得的混合型腺病毒免疫小鼠；
另一种是将这四种重组腺病毒分别单独培养和纯化，再以相同比例混合后免疫小鼠。
两种方法每次使用的总病毒量为1×1010VPs/只鼠，肌肉注射，共免疫两次后收集抗血清，进行体外细胞微量中和实验，检测抗血清对各型别腺病毒的中和效价(图7)。
结果表明两种方法均可以诱导出对四种血清型腺病毒的中和抗体应答，中和效价各为500-1000，其中对3型腺病毒的中和效价最高，对7型最低，但差异不显著，可能是由于所有四种重组腺病毒都带有3型腺病毒的fibre、penton base等结构蛋白。而对其它3种血清型腺病毒的中和效价无显著差异。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种重组腺病毒，其特征在于，其六邻体具有如SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ IDNo:5、或SEQ ID No:6所示的碱基序列。
2.一种四价重组腺病毒疫苗，其特征在于，其包括重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株，所述重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株的六邻体分别具有如SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5、SEQ ID No:6所示的碱基序列。
3.一种四价重组腺病毒疫苗，其特征在于，其包括重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株，所述重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株、以及重组55型腺病毒株的六邻体分别具有如SEQ ID No:7、SEQ ID No:8、SEQ ID No:9、SEQ ID No:10所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求2或3所述的四价重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗中重组3型腺病毒株、重组7型腺病毒株、重组14型腺病毒株和重组55型腺病毒株的病毒颗粒数比为1：1：1：1。
5.根据权利要求2或3所述的四价重组腺病毒疫苗，其特征在于，所述疫苗对3型、7型、14型和55型腺病毒的中和效价均为500-1000。
6.根据权利要求2或3所述的四价重组腺病毒疫苗，其特征在于，1ml疫苗中含有的病毒颗粒数为1012vps。
7.权利要求2-6任一项所述的四价重组腺病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、利用ClaI+BamHI双酶切穿梭质粒pBRHexonL/R和腺病毒Ad7、Ad14和Ad55的六邻体基因，连接，转化，分别获得腺病毒Ad7、Ad14和Ad55的穿梭质粒H7-pBRH3S、H14-pBRH3S和H55-pBRH3S；所述腺病毒Ad7、Ad14和Ad55的六邻体基因分别具有如SEQ ID No:4、SEQ IDNo:5和SEQ ID No:6所示的碱基序列；
(2)、用AvRII+PacI双酶切骨架质粒pBRAd△E3GFP使之线性化，凝胶回收纯化大片段；用EcoRI+SalI分别双酶切步骤(1)的穿梭质粒H7-pBRH3S、H14-pBRH3S和H55-pBRH3S，将线性化的骨架质粒的大片段和经双酶切的穿梭质粒共电转化细菌BJ5183，获得重组质粒，再经AsisI酶切线性化后转染AD293细胞，拯救包装，得到重组腺病毒rAd3H7、rAd3H14、和rAd3H55；骨架质粒pBRAd△E3GFP经AsisI酶切线性化后转染AD293细胞，拯救包装得到重组腺病毒rAd3EGFP；
(3)、将纯化后的重组腺病毒rAd3EGFP、rAd3H7、rAd3H14、rAd3H55按1:1:1:1的病毒颗粒数比例混合，灭活，即得。
8.根据权利要求7所述的四价重组腺病毒疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(3)中采用β-内丙脂进行灭活。
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