CN113045674A - 一种人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白及其制备、应用 - Google Patents

一种人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白及其制备、应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113045674A
CN113045674A CN202110344848.6A CN202110344848A CN113045674A CN 113045674 A CN113045674 A CN 113045674A CN 202110344848 A CN202110344848 A CN 202110344848A CN 113045674 A CN113045674 A CN 113045674A
Authority
CN
China
Prior art keywords
thr
ala
ser
pro
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110344848.6A
Other languages
English (en)
Inventor
李巍
王永梅
丁维龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Supaibo Biotechnology Nanjing Co ltd
Original Assignee
Supaibo Biotechnology Nanjing Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Supaibo Biotechnology Nanjing Co ltd filed Critical Supaibo Biotechnology Nanjing Co ltd
Priority to CN202110344848.6A priority Critical patent/CN113045674A/zh
Publication of CN113045674A publication Critical patent/CN113045674A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/075—Adenoviridae

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

本发明一种人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白及其制备、应用，涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。通过计算机分析人腺病毒3型、7型、11型、14型及55型六邻体蛋白的氨基酸序列，比较筛选出同源性较高的蛋白片段，片段之间用两个甘氨酸和一个丝氨酸进行连接，形成一个多抗原片段串联的融合蛋白，全长411个氨基酸，选择原核偏爱的密码子，化学合成该融合蛋白的全长基因，利用基因工程技术表达制备该融合蛋白。表达的融合蛋白可用于HAdV疫苗、抗体或抗原检测试剂的研制等。

Description

一种人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白及其制备、 应用
技术领域
本发明人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白及其制备、应用涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。本发明是将人腺病毒（HAdV） 3型、7型 、11型、14型及55型高同源性抗原表位蛋白片段串联，利用基因工程技术，制备含有五个血清型腺病毒强抗原表位的融合蛋白。通过计算机分析，从五个血清型腺病毒六邻体蛋白的前中段筛选出同源性较高的抗原表位的蛋白片段，蛋白片段之间用两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，串联成一个多抗原表位融合蛋白。化学合成该融合蛋白的基因序列，并利用基因工程技术表达该融合蛋白。表达的融合蛋白可用于HAdV抗体的检测及疫苗的研制等。
背景技术
人腺病毒，即HAdV（Human Adenovirus），是一种在幼儿园、学校等高密度人群具有高危害性的病毒。腺病毒主要引起呼吸道疾病，但也可感染消化道、泌尿道、眼部、心肌等部位而引起疾病。腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，属腺病毒科，基因组全长34.7kb，衣壳呈规则的20面体结构，直径80-100nm。核心由双股DNA及蛋白质组成，外有核壳，上有252个颗粒，由240个六邻体和12个五联体组成。六邻体上的表位是区别不同血清型的标准，是病毒对免疫选择压力最敏感的部位。
目前，实验室检测腺病毒感染的方法一般有两种。一是通过聚合酶链式反应特异性检测腺病毒核酸，该法较复杂，不易操作，且腺病毒分型较困难。二是利用酶联免疫吸附实验检测血清中的特异性IgM及IgG抗体。腺病毒感染后可诱发较强的免疫反应，产生特异性抗体。一般发病后1周，患者体内的IgM开始产生，7-10天IgG开始产生，随后逐渐升高。因此可利用特异性抗原检测血清中的特异性抗体。但目前一种抗原通常只能检测一种型别的腺病毒抗体，所以在检测血清内HAdV抗体时需要使用多种抗原来提高抗体检测率，确诊感染类型，提高了检测成本，并且仍存在一定的假阴性概率。研制多抗原表位基因重组抗原是建立腺病毒特异抗体快速检测试剂的发展方向，也是研制疫苗的发展方向。
发明内容
本发明目的是针对上述不足之处提供一种人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白，人腺病毒（HAdV）外壳的六邻体蛋白上具有多种表位，是病毒体对免疫选择压力最敏感的部位，诱导机体产生多种特异性抗体，所以该蛋白是用作抗原研制人腺病毒（HAdV）抗体检测试剂的理想蛋白。
通过计算机分析腺病毒六邻体蛋白的氨基酸序列，分别筛选出五个血清型腺病毒含有通用的强抗原表位的蛋白片段，蛋白片段之间用两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，串联成一个多抗原表位融合蛋白。化学合成该融合蛋白的基因序列，并利用基因工程技术表达该融合蛋白。表达的融合蛋白可用于HAdV抗体或抗原的检测，及疫苗的研制等。
本发明是化学合成人腺病毒（HAdV）由腺病毒3型、7型、11型、14型及55型的通用抗原表位融合蛋白的基因序列，利用基因工程技术，制备含有五种类型通用的腺病毒抗原表位的融合蛋白。通过计算机分析人腺病毒3、7、11、14和55型六邻体蛋白的氨基酸序列，筛选出同源性较高的前135个氨基酸片段，且五个血清型腺病毒同源性较高的前135个氨基酸的差异性片段含有强抗原表位。所以将五个血清型的腺病毒六邻体蛋白的前135个氨基酸片段之间用两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，串联成一个多抗原表位融合蛋白，全长411个氨基酸。选用原核生物偏爱的密码子，将融合蛋白翻译成相应的核苷酸序列，化学合成全长基因序列。利用基因工程技术表达纯化该融合蛋白。该融合蛋白可用于疫苗及HAdV抗体或抗原的检测，及用于免疫制备抗HAdV单抗和多抗等。
人腺病毒（HAdV）五个血清型通用抗原表位融合蛋白及其制备、应用是采取以下步骤实施的：
1.人腺病毒五个血清型通用抗原表位的筛选及融合蛋白基因片段的化学合成：
利用ANTHWIN等软件分析人腺病毒3型、7型、11型、14型和55型六邻体蛋白的氨基酸序列，筛选出五个血清型腺病毒六邻体蛋白中具有较高同源性的蛋白片段。各蛋白片段之间用两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，串联成一个多抗原表位融合蛋白。选用原核生物偏爱的密码子，将融合蛋白翻译成相应的核苷酸序列。在融合蛋白基因片段的5'端增加了BamH I酶切位点（下画线部分），在3'端增加终止密码子和Xho I酶切位点（下画线部分）。使合成的基因片段易于克隆至质粒pET-28a(+)内的BamH I和Xho I酶切位点内。化学合成该融合蛋白的全长基因序列。
筛选的腺病毒3型抗原表位氨基酸序列：
第1～135位aa：
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ala Tyr Met His Ile
Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln
Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Met Gly Asn Lys Phe
Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg
Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp
Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp
Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg Gly
Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala
Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp；
筛选的腺病毒7型抗原表位氨基酸序列：
第1～135位aa：
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ala Tyr Met His Ile
Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln
Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Met Gly Asn Lys Phe
Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg
Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp
Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp
Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg Gly
Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala
Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp；
筛选的腺病毒11型抗原表位氨基酸序列：
第1～135位aa：
Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro Gln Trp Ala Tyr Met His Ile
Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln
Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Asn Leu Gly Asn Lys Phe
Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg
Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp
Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp
Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg Gly
Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala
Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Ala Ser Gln Trp；
筛选的腺病毒14型抗原表位氨基酸序列：
第1～135位aa：
Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro Gln Trp Ala Tyr Met His Ile
Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln
Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Asn Leu Gly Asn Lys Phe
Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg
Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp
Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp
Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg Gly
Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala
Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Ala Ser Gln Trp；
筛选的腺病毒55型抗原表位氨基酸序列：
第1～135位aa：
Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro Gln Trp Ala Tyr Met His Ile
Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln
Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Asn Leu Gly Asn Lys Phe
Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg
Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp
Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp
Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg Gly
Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala
Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp；
融合蛋白氨基酸序列（411aa）：
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ala Tyr Met His Ile
Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln
Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Met Gly Asn Lys Phe
Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg
Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp
Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp
Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg Gly
Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala
Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp
Gly Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro Gln Trp Ala Tyr
Met His Ile Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly
Leu Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Asn Leu Gly
Asn Lys Phe Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr
Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp
Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala
Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp
Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser
Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr
Ser Gln Trp Gly Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro Gln
Trp Ala Tyr Met His Ile Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu
Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe
Asn Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His
Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val
Pro Val Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr
Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr
Phe Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys
Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala
Pro Asn Thr Ser Gln Trp；
化学合成的融合蛋白的DNA序列（1248bp）
GGA TCC ATG GCT ACA CCC TCA ATG ATG CCA CAA TGG GCG TAT ATG CAC ATT GCC GGTCAA GAC GCG TCC GAA TAC CTC TCT CCG GGT CTG GTT CAA TTT GCC AGA GCC ACC GAC ACC TATTTC AGC ATG GGT AAT AAG TTC CGT AAT CCG ACG GTT GCA CCG ACG CAT GAT GTT ACC ACA GATCGT AGC CAA CGT CTG ATG CTG CGC TTT GTT CCG GTG GAC CGC GAG GAC AAC ACC TAC TCC TACAAG GTG CGT TAC ACC CTG GCG GTC GGT GAC AAC CGT GTC CTG GAT ATG GCG TCT ACC TTT TTCGAT ATT CGT GGT GTA CTT GAC CGC GGA CCG AGC TTC AAA CCG TAT AGC GGC ACC GCA TAC AACAGC CTG GCG CCG AAA GGC GCA CCA AAT ACG AGC CAA TGG GGT GGC AGC ATG GCT ACT CCG AGCATG TTA CCG CAG TGG GCG TAT ATG CAC ATC GCA GGC CAG GAT GCA AGC GAA TAT CTG TCT CCGGGT CTG GTG CAG TTC GCG CGT GCT ACC GAC ACC TAC TTC AAC CTG GGC AAC AAA TTC CGC AACCCG ACC GTT GCG CCG ACG CAC GAC GTG ACG ACC GAC CGT TCC CAA CGT CTG ATG CTG CGT TTCGTG CCG GTC GAT CGT GAG GAT AAC ACG TAC TCG TAC AAA GTA CGT TAT ACC TTG GCT GTG GGCGAC AAC CGT GTT CTC GAT ATG GCG AGT ACC TTT TTT GAT ATC CGC GGC GTA TTG GAC CGC GGTCCG TCT TTC AAG CCG TAC TCT GGC ACT GCG TAT AAC AGC CTG GCT CCG AAG GGT GCA CCG AATACT TCA CAG TGG GGC GGT AGC ATG GCC ACC CCG AGC ATG CTG CCT CAG TGG GCA TAC ATG CATATC GCG GGT CAG GAT GCT TCG GAG TAC TTG AGC CCT GGT TTG GTT CAG TTT GCG CGG GCT ACCGAC ACC TAT TTT AAC CTG GGT AAT AAA TTT CGT AAT CCG ACC GTT GCG CCG ACC CAT GAT GTGACC ACC GAT CGA TCC CAG CGT TTG ATG CTG CGT TTC GTG CCG GTT GAC CGC GAA GAT AAC ACTTAT TCC TAT AAG GTG CGC TAC ACC CTT GCG GTT GGT GAC AAC CGC GTC CTG GAC ATG GCT TCCACC TTT TTC GAC ATT CGT GGC GTG TTG GAC AGA GGC CCG AGT TTT AAG CCG TAT AGC GGT ACGGCC TAC AAT TCC CTG GCG CCA AAA GGC GCC CCA AAT GCA AGC CAA TGG TAA CTC GAG。
2．表达人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白重组质粒的构建:
提取质粒pET-28a（＋）（美国Novagen公司产品）,用 BamH I和Xho I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段, 溶于去离子水内。用BamH I和Xho I双酶切化学合成的人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白基因片段，电泳回收后, 溶于去离子水内。取上述酶切后DNA片段，插入到载体pET-28a（＋）内的BamH I和Xho I位点之间，表达五种类型腺病毒通用型抗原表位的融合蛋白。
3．重组质粒的筛选与鉴定：
将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含卡那霉素(60μg／mL)LB平板，置37℃过夜。次日随机挑取转化菌落和对照菌(质粒pET-28a（+）转化菌)，提取质粒，用BamH I和Xho I双酶切验证，1.0%的琼脂糖凝胶电泳结果表明，切下1248bp的目的基因片段。同时，将含有该基因片段的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有连接在一起的五种类型腺病毒抗原表位基因片段，序列完全正确。
构建的重组质粒表达含有五个血清型腺病毒抗原表位的融合蛋白，全长445个氨基酸，各片段之间由两个甘氨酸和一个丝氨酸连接,其氨基酸序列如下：
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val
Pro Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Glu Glu Met
Gly Arg Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ala
Tyr Met His Ile Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro
Gly Leu Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Met
Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val
Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val
Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu
Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe
Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr
Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn
Thr Ser Gln Trp Gly Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro
Gln Trp Ala Tyr Met His Ile Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr
Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr
Phe Asn Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr
His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe
Val Pro Val Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg
Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser
Thr Phe Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe
Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly
Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp Gly Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser
Met Leu Pro Gln Trp Ala Tyr Met His Ile Ala Gly Gln Asp Ala
Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr
Asp Thr Tyr Phe Asn Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro Thr Val
Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Met
Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr
Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp
Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly
Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala
Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp。
4．表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定：
将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含3mL LB培养基(含卡那毒素60μg／mL)的试管内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5mmol/L,继续振荡培养诱导4h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测,重组子表达相对分子量为50 kD的HAdV融合蛋白，而对照菌BL21(DE3)无此蛋白带。
5．人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白的纯化：
1）人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白工程菌的超声裂解
将诱导表达融合蛋白的工程菌离心(8000 rpm、15min、4℃)收菌，菌体重悬于原培养液1／10体积的细菌裂解液(20 mmol/L PB pH7.4、5% 甘油)内，冰浴超声破菌，离心收集沉淀，沉淀内为表达的腺病毒抗原表位融合蛋白包涵体。
2）人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白的变性
用30ml 的包涵体洗液对包涵体进行重悬、洗涤，包涵体洗液为1xPBS pH7.4、1% TritonX-100, 冰浴条件下超声悬浮包涵体，直至沉淀全部悬浮，离心收集沉淀包涵体。用8 mol/L尿素、1xPBS pH7.4变性溶液，将包涵体进行重悬溶解，冰浴条件下超声破碎至完全溶解。8000 rpm、15min、4℃，离心收集上清。
3）镍柱亲和层析纯化
用1xPBS pH7.4对Ni-NTA Resin进行洗涤，除去多余的20%乙醇，用0.22μm滤膜将上步离心收集的上清进行过滤，去除杂质后与Ni-NTA Resin混合，让腺病毒通用型抗原表位融合蛋白与Ni-NTA Resin结合，玻璃棒搅拌结合1.5h。然后将上述混合液上柱，用平衡液进行清洗，再依次用含8mol/L尿素的20、40、100、200、500 mmol/L 咪唑洗脱液的洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白，用12％SDS－PAGE电泳检测各峰蛋白，确定哪个洗脱峰含表达的腺病毒抗原表位融合蛋白。结果显示，100mmol/L 咪唑洗脱蛋白峰为腺病毒抗原表位融合蛋白。
4）人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白的复性
将纯化得到的变性融合蛋白依次置于含6，4，3，2，1，0 mol/L 尿素的PBS pH7.4透析液中依次进行透析复性。
6. 将表达的人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白，用于疫苗、HAdV抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HAdV单抗和多抗等。
7．将五个血清型腺病毒六邻体蛋白的高同源性蛋白片段连接，以融合蛋白的形式进行表达、制备。
8．通过基因重组技术，利用酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备腺病毒抗原表位融合蛋白。
英文缩写说明：HAdV(Human adenovirus):人腺病毒; EDTA: 四甲基乙二胺；IPTG：异丙基硫代半乳糖苷 ； DTT：二硫苏糖醇； SDS：十二烷基磺酸纳；PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳； PB：磷酸盐缓冲液； kD：千道尔顿。
本发明与现有技术相比具有的优点：
1．将五个血清型腺病毒通用型抗原表位蛋白片段融合表达，比分别使用单独的蛋白片段更方便、经济。用融合蛋白作抗原检测抗HAdV抗体时，不再需要分别制备这些蛋白片段，也不需要调整这些抗原的使用比例，因此应用方便且成本较低。
2．目前没有腺病毒基因工程亚单位疫苗，亟待研制。我们利用基因工程技术表达制备含有多种腺病毒六邻体抗原表位的融合蛋白，为研制基因工程疫苗奠定基础。基因工程疫苗具有安全、成本低的优点。
附图说明
以下将结合附图对本发明作进一步说明：
图1是分子生物学软件对腺病毒3、7、11、14、55型六邻体蛋白抗原表位进行分析的结果。结果显示，腺病毒六邻体蛋白前135个氨基酸同源性较高。
图2是五个血清型腺病毒六邻体蛋白前135个氨基酸B细胞表位预测图。
图3是表达五个血清型腺病毒抗原表位融合蛋白的重组质粒构建流程图。
图4是表达腺病毒抗原表位融合蛋白重组菌的SDS-PAGE分析结果。将构建的重组质粒转化到大肠杆菌中，挑单菌落后筛选高产菌株的SDS-PAGE电泳图。M：蛋白marker；阴：含pET-28a（+）质粒的阴性对照菌；1-6：人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白重组菌，六个重组子均表达相对分子量为50kDa的融合蛋白，即图中箭头标示的位置。
图5是表达人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白纯化复性后的SDS-PAGE分析结果。M：蛋白Marker；1：纯化后的腺病毒抗原表位融合蛋白，浓度为0.5mg/mL，相对分子量50kDa；2：浓度为0.5mg/mL的 BSA。
图6是人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白抗血清效价的ELISA结果。
图7是人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白配伍不同的免疫佐剂免疫消暑，其细胞免疫ELISA结果比较分析。
图8是以人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白为抗原，ELISA法检测其抗原性结果。
图9是以人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白为抗原，研制的腺病毒抗体检测试纸条特异性结果。
具体实施方式
本发明实施方式的详细说明：
腺病毒六邻体蛋白抗原表位的分析、基因合成及表达
通过计算机分析腺病毒3型、7型、11型、14型及55型六邻体蛋白的氨基酸序列，分别筛选出其中同源性较高的蛋白片段。 将五个血清型腺病毒六邻体蛋白前135个氨基酸分别用两个甘氨酸和一个丝氨酸进行连接，串联成一个多抗原表位融合蛋白。选用原核生物偏爱的密码子，将融合蛋白翻译成相应的核苷酸序列。化学合成该融合蛋白的全长基因序列，并将其克隆至质粒pET-28a(+)内的BamH I / Xho I位点，表达腺病毒抗原表位融合蛋白。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选获得了高效表达腺病毒抗原表位融合蛋白的工程菌。
材料与方法
1.菌种与质粒：
宿主菌BL21(DE3)及表达载体pET-28a(+)为美国Novagen公司产品。
2.分子生物学试剂：
限制性内切酶BamH I、Xho I、及T4 DNA连接酶为TaKaRa公司产品。质粒纯化试剂盒及从琼脂糖凝胶内回收DNA片段的试剂盒为TaKaRa公司产品。DTT及IPTG为TaKaRa公司产品。其它试剂为进口或国产分析纯试剂。
3.基因片段的合成：
由大连TaKaRa公司帮助合成。
4. 基因克隆方法：
DNA的酶切、连接、电泳；质粒的提取、转化； 蛋白的SDS-PAGE分析等一般分子克隆方法按常规方法进行。其它试剂盒按说明书进行操作。
5. DNA序列分析：
用TaKaRa公司质粒纯化试剂盒纯化质粒，用DNA全自动测序仪测序。
结果
1．HAdV六邻体蛋白抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成：
利用ANTHWIN等软件，通过计算机分析腺病毒3型、7型、11型、14型及55型六邻体蛋白的氨基酸序列，发现前135个氨基酸具有高度同源性。将各型别腺病毒六邻体蛋白前135个氨基酸之间用两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，串联成一个多抗原表位融合蛋白。选用原核生物偏爱的密码子，将融合蛋白翻译成相应的核苷酸序列。在融合蛋白基因序列的5'端增加了BamH I酶切位点，在3'端增加Xho I酶切位点。化学合成该融合蛋白的全长基因序列。
融合蛋白氨基酸序列（411aa）：
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ala Tyr Met His Ile
Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln
Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Met Gly Asn Lys Phe
Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg
Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp
Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp
Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg Gly
Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala
Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp
Gly Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro Gln Trp Ala Tyr
Met His Ile Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly
Leu Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Asn Leu Gly
Asn Lys Phe Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr
Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp
Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala
Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp
Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser
Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr
Ser Gln Trp Gly Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro Gln
Trp Ala Tyr Met His Ile Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu
Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe
Asn Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His
Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val
Pro Val Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr
Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr
Phe Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys
Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala
Pro Asn Thr Ser Gln Trp；
化学合成的融合蛋白的DNA序列（1248bp）
GGA TCC ATG GCT ACA CCC TCA ATG ATG CCA CAA TGG GCG TAT ATG CAC ATT GCC GGTCAA GAC GCG TCC GAA TAC CTC TCT CCG GGT CTG GTT CAA TTT GCC AGA GCC ACC GAC ACC TATTTC AGC ATG GGT AAT AAG TTC CGT AAT CCG ACG GTT GCA CCG ACG CAT GAT GTT ACC ACA GATCGT AGC CAA CGT CTG ATG CTG CGC TTT GTT CCG GTG GAC CGC GAG GAC AAC ACC TAC TCC TACAAG GTG CGT TAC ACC CTG GCG GTC GGT GAC AAC CGT GTC CTG GAT ATG GCG TCT ACC TTT TTCGAT ATT CGT GGT GTA CTT GAC CGC GGA CCG AGC TTC AAA CCG TAT AGC GGC ACC GCA TAC AACAGC CTG GCG CCG AAA GGC GCA CCA AAT ACG AGC CAA TGG GGT GGC AGC ATG GCT ACT CCG AGCATG TTA CCG CAG TGG GCG TAT ATG CAC ATC GCA GGC CAG GAT GCA AGC GAA TAT CTG TCT CCGGGT CTG GTG CAG TTC GCG CGT GCT ACC GAC ACC TAC TTC AAC CTG GGC AAC AAA TTC CGC AACCCG ACC GTT GCG CCG ACG CAC GAC GTG ACG ACC GAC CGT TCC CAA CGT CTG ATG CTG CGT TTCGTG CCG GTC GAT CGT GAG GAT AAC ACG TAC TCG TAC AAA GTA CGT TAT ACC TTG GCT GTG GGCGAC AAC CGT GTT CTC GAT ATG GCG AGT ACC TTT TTT GAT ATC CGC GGC GTA TTG GAC CGC GGTCCG TCT TTC AAG CCG TAC TCT GGC ACT GCG TAT AAC AGC CTG GCT CCG AAG GGT GCA CCG AATACT TCA CAG TGG GGC GGT AGC ATG GCC ACC CCG AGC ATG CTG CCT CAG TGG GCA TAC ATG CATATC GCG GGT CAG GAT GCT TCG GAG TAC TTG AGC CCT GGT TTG GTT CAG TTT GCG CGG GCT ACCGAC ACC TAT TTT AAC CTG GGT AAT AAA TTT CGT AAT CCG ACC GTT GCG CCG ACC CAT GAT GTGACC ACC GAT CGA TCC CAG CGT TTG ATG CTG CGT TTC GTG CCG GTT GAC CGC GAA GAT AAC ACTTAT TCC TAT AAG GTG CGC TAC ACC CTT GCG GTT GGT GAC AAC CGC GTC CTG GAC ATG GCT TCCACC TTT TTC GAC ATT CGT GGC GTG TTG GAC AGA GGC CCG AGT TTT AAG CCG TAT AGC GGT ACGGCC TAC AAT TCC CTG GCG CCA AAA GGC GCC CCA AAT GCA AGC CAA TGG TAA CTC GAG。
2． 人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白重组质粒的构建：
提取质粒pET-28a（＋）（美国Novagen公司产品），用BamH I和Xho I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段, 溶于去离子水内。用BamH I和Xho I双酶切化学合成的人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白基因片段，电泳回收后, 溶于去离子水内。取上述酶切后DNA片段，插入到载体pET-28a（＋）内的BamH I和Xho I位点之间，表达含有五个血清型腺病毒抗原表位的融合蛋白。构建流程见图3。
3．重组质粒的筛选与鉴定：
将上步连接的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，将转化产物涂布含卡那霉素60μg／mL的LB平板，置37℃过夜。次日随机挑选5个转化子菌落，分别接种到含4 mL液体LB培养基（含卡那霉素60μg／mL）的试管内，置37℃振荡培养6h，取菌液1mL，离心收菌。分别用50μL去离子水悬浮菌体，沸水煮5min, 离心，4℃，12000rpm ，5min, 取含有质粒的上清1μL用作PCR模板, PCR扩增含融合蛋白基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长1248bp的基因片段。PCR 反应浓度为：质粒模板1μL、上下游引物各1μL、10x Buffer 5.0μL、 2.5 mmol/L dNTP 4.0μL、Taq DNA 聚合酶0.5μL (2.5 U)、去离子水37.5μL,总体积50μL。扩增条件为：94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 60秒，30个循环；最后72℃延伸7分钟。 取PCR扩增产物5μL,用1.2％的Agarose凝胶检测, 转化子扩增出1248bp的目的基因片段。证实，均含有五个血清型腺病毒抗原表位基因片段的串联基因。
提取转化子的质粒，测定质粒内的五个血清型腺病毒抗原表位基因片段的串联基因序列，DNA序列分析证实，重组质粒含有五个血清型腺病毒抗原表位基因片段，序列完全正确。
构建的重组质粒表达含有五个血清型腺病毒抗原表位的融合蛋白，全长445个氨基酸，片段之间由两个甘氨酸和一个丝氨酸连接,其氨基酸序列如下：
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val
Pro Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Glu Glu Met
Gly Arg Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ala
Tyr Met His Ile Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro
Gly Leu Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Met
Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val
Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val
Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu
Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe
Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr
Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn
Thr Ser Gln Trp Gly Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro
Gln Trp Ala Tyr Met His Ile Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr
Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr
Phe Asn Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr
His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe
Val Pro Val Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg
Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser
Thr Phe Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe
Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly
Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp Gly Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser
Met Leu Pro Gln Trp Ala Tyr Met His Ile Ala Gly Gln Asp Ala
Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr
Asp Thr Tyr Phe Asn Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro Thr Val
Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Met
Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr
Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp
Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly
Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala
Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp。
4．表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定：
将上述转化子接种至含3mL LB培养基(含卡那毒素60μg／mL)的试管内，37℃振荡培养3h，加IPTG至终浓度0.5mmol/L, 继续振荡培养诱导4h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测, 6个转化子表达相对分子量为50 kD的腺病毒抗原表位融合蛋白（图4）。
人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白的纯化
根据人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白的氨基酸序列，分析其理化特性，确定适当的纯化方法。经计算机分析，腺病毒抗原表位融合蛋白的等电点为pH4.865, 因此我们决定在pH为7.4的1xPBS缓冲液内，用镍离子亲和层析柱纯化。具体步骤如下：
材料和方法
1.主要试剂:
Ni-NTA Resin为金斯瑞公司产品，IPTG、DTT为TaTaRa公司产品。其它试剂为国产或进口分析纯试剂。
2. 腺病毒抗原表位融合蛋白工程菌的诱导表达及超声裂解
从接种有1号工程菌的LB平板上，用牙签挑单菌落，接种到含200mL LB液体培养基的三角烧瓶内，加卡那霉素至终浓度50µg/mL,置37℃摇床内培养过夜。次日，将菌液接种到4个分别含200mLLB液体培养基的三角烧瓶，每瓶接种菌液50mL,置37℃摇床内振荡培养1小时，然后加IPTG至终浓度0.1mmol/L, 诱导表达4小时。
将诱导表达融合蛋白的1000mL工程菌离心(8000 rpm、30 min、4℃)收菌，菌体重悬于100mL的细菌裂解液(20 mmol/L PB pH7.4、10 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、5% 甘油)内，冰浴超声破菌10 min，离心(8000 rpm、30 min、4℃) 收集沉淀。
3. 腺病毒通用型抗原表位融合蛋白的变性
用30ml 的包涵体洗液对包涵体进行重悬、洗涤，包涵体洗液为1xPBS pH7.4、1% TritonX-100, 冰浴条件下超声悬浮包涵体，直至沉淀全部悬浮，离心收集沉淀包涵体。用8 mol/L尿素、1xPBS pH7.4变性溶液，将包涵体进行重悬溶解，冰浴条件下超声破碎至完全溶解。8000 rpm、15min、4℃，离心收集上清。
4. 镍柱亲和层析纯化
用1xPBS pH7.4对Ni-NTA Resin进行洗涤，除去多余的20%乙醇，用0.22μm滤膜将上步离心收集的上清进行过滤，去除杂质后与Ni-NTA Resin混合，让腺病毒通用型抗原表位融合蛋白与Ni-NTA Resin结合，玻璃棒搅拌结合1.5h。 将层析柱依次用去离子水、平衡液冲洗，然后将上述混合液上柱，用7倍柱体积的平衡液进行平衡清洗，再依次用含8 mol/L尿素的20、40、100、200、500 mmol/L咪唑洗脱液的洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白，用12％ SDS－PAGE电泳检测各峰蛋白，确定哪个洗脱峰含表达的腺病毒抗原表位融合蛋白。结果显示，100 mmol/L 咪唑洗脱蛋白峰为腺病毒抗原表位融合蛋白。
5. 腺病毒通用型抗原表位融合蛋白的复性
将纯化得到的变性融合蛋白依次置于含6，4，3，2，1，0 mol/L 尿素的PBS pH7.4透析液中依次进行透析复性。
结果
将不同浓度咪唑从镍柱上洗脱的蛋白进行SDS-PAGE分析，由电泳结果可知，腺病毒通用型抗原表位融合蛋白存在于100 mmol/L 咪唑洗脱蛋白峰中。
将100 mmol/L 咪唑洗脱蛋白峰通过透析复性浓缩处理，SDS-PAGE测定融合蛋白浓度，可知纯化所得的融合蛋白浓度为0.5mg/mL（图5）。
人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白的鉴定及应用
将纯化的人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白用作免疫原，免疫BALB/c小鼠，制备抗血清。实验结果显示，该融合蛋白具有很好的免疫原性和抗原性，可用作腺病毒疫苗的研究或抗体检测试剂的开发。
材料和方法
1. 人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白：本发明制备。
2. 酶联反应材料:
酶联板为深圳产96孔板，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG购自Sigma公司。其它材料为酶联反应的常规材料。
2.融合蛋白抗血清制备：
将融合蛋白与弗氏佐剂和铝佐剂充分混合乳化后，腹腔注射免疫小鼠。之后每隔两周，将融合蛋白与弗氏佐剂和铝佐剂混合乳化后，进行加强免疫。共免疫4次。第4次免疫后两周，眼眶取血，制备抗血清。
3.融合蛋白体液免疫检测：
采用间接ELISA法对融合蛋白免疫原性进行检测。基本步骤为：用CBS缓冲液（pH9.6）稀释融合蛋白至终浓度为5μg/mL，包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃孵育过夜；之后用1‰ PBST充分洗板5次，10%的小牛血清（FBS）作为封闭液，每孔加150μL，37℃封闭2h；1‰ PBST 充分洗板5次，融合蛋白抗血清按如下比例梯度稀释（稀释液为10%的小牛血清）1:5000，1:10000，1:20000，1:40000，1:80000，1:160000，1:320000，1:640000，100μL/孔，37℃孵育2h，阴性血清按1:10000稀释作为对照；1‰ PBST充分洗板5次；加1：5000稀释（稀释液为10%的小牛血清）的羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃孵育1h；1‰ PBST 充分洗板5次，加入TMB显色液，50μL /孔，37℃，避光反应10min；加入1mol/L 的HCl，50µL/孔，终止反应；酶标仪测定各孔A450值，若P/N>2.1，即可判定结果阳性。
4.融合蛋白细胞免疫检测：
采用双抗体夹心法对小鼠免疫后血清中四个细胞因子IL-2、IL-5、IL-10、TNF-α的分泌水平进行检测。在已包被小鼠相应细胞因子单抗的微孔中依次加入一定浓度稀释的小鼠血清(一抗)，再与HRP标记的细胞因子抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物。酶标仪测定A450值。
5.融合蛋白的抗原性检测：
利用ELISA法检测门诊患者血清与腺病毒融合蛋白的结合能力。将融合蛋白用CBS缓冲液包被96孔酶标板，将分别按1:100、1：1000、1:1000、1:10000、1:1000000比例稀释的患者血清做为一抗，山羊抗人IgM-HRP做为二抗，检测五个血清型腺病毒感染患者血清中的IgM。
6.抗体检测试纸条的研制：
金标腺病毒融合抗原和金标兔IgG混合包被在结合垫上，将羊抗人IgM和山羊抗兔IgG包被于NC膜上，分别作为检测线(IgM)和质控线(C)。将试剂条室温干燥，浸泡于5%的胎牛血清中进行封闭，将玻璃纤维素膜、NC维膜、吸水材料依次粘在白色塑料衬板上，组装胶体金试纸条，使用组装好的试纸条检测五个血清型腺病毒感染患者血清及健康人血清, 同时检测呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、 H3N2流感病毒等4种呼吸道病原体感染血清进行对照。根据检测线有无显色判断试纸条的特异性
结果
1.间接ELISA法检测腺病毒通用型抗原表位融合蛋白的体液免疫效果
将纯化的腺病毒通用型抗原表位融合蛋白用CBS缓冲液稀释包被酶标板，检测用腺病毒抗原表位融合蛋白免疫小鼠得到的抗血清。结果显示，人腺病毒通用型抗原表位融合蛋白血清抗体效价为1：160000。说明腺病毒抗原表位融合蛋白免疫机体后，能够有效的刺激机体产生抗体，具有较好的体液免疫效果，为进一步研制腺病毒疫苗奠定基础（图6）。
2. 双抗体夹心法检测腺病毒通用型抗原表位融合蛋白的细胞免疫效果
通过测定融合蛋白免疫小鼠的细胞因子水平，评价其细胞免疫效果。取第四次免疫后小鼠抗血清，利用双抗体夹心法检测细胞因子的分泌情况，以阴性血清为对照，对铝佐剂组组和弗式佐剂组小鼠血清细胞因子分泌情况进行比较分析。与阴性血清相比，铝佐剂组能提高IL-5、IL-10的分泌水平(p<0.05)。弗式佐剂组能提高IL-10的分泌水平(p<0.05)。铝佐剂组、弗式佐剂组对IL-10的分泌有促进作用(p<0.05)，对IL-2、TNF- α分泌水平的促进与阴性血清比没有显著性差异。铝佐剂组比弗式佐剂组显著促进IL-5的分泌(p<0.01)。相比弗式佐剂，铝佐剂可以较好的刺激小鼠细胞免疫（图7）。
3.间接ELISA法检测腺病毒通用型抗原表位融合蛋白的抗原性
用腺病毒融合蛋白作为检测抗原，ELISA法检测五个血清型腺病毒感染患者血清及健康人血清。由ELISA结果可知，腺病毒融合蛋白能够有效地检测出患者血清中腺病毒3型、7型、11型、14型和55型IgM抗体。可见融合蛋白有良好的抗原性（图8）。
4.抗体检测试纸条的研制
利用制备的融合抗原做抗原研制了金标免疫层析检测试纸条，检测五个血清型腺病毒感染患者血清及健康人血清, 同时检测呼吸道合胞病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体、H3N2流感病毒等四种呼吸道病原体感染血清进行对照。结果表明，研制的试纸条与五个血清型腺病毒感染患者血清均有反应，与其他四种呼吸道病原体感染血清及正常人血清没有交叉反应，表明研制的IgM抗体检测试纸条有较好的腺病毒抗体检出谱和较好的特异性（图9）。
人腺病毒(HAdV)五个血清型通用抗原表位融合蛋白序列表见附件文档：核苷酸或氨基酸序列表计算机可读载体。
序列表
<110> 李巍
<120> 人腺病毒五个血清型通用抗原表位嵌合蛋白及其制备、应用
<141> 2021-03-31
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 411
<212> PRT
<213> HAdv
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)...(411)
<223> 含人腺病毒五个血清型通用抗原表位。
<400> 1
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ala Tyr Met His Ile Ala
1 5 10 15
Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala
20 25 30
Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Met Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro
35 40 45
Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu
50 55 60
Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr
65 70 75 80
Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met
85 90 95
Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser
100 105 110
Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly
115 120 125
Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp Gly Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser Met
130 135 140
Leu Pro Gln Trp Ala Tyr Met His Ile Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu
145 150 155 160
Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr
165 170 175
Phe Asn Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His
180 185 190
Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro
195 200 205
Val Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu
210 215 220
Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp
225 230 235 240
Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly
245 250 255
Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr Ser Gln
260 265 270
Trp Gly Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro Gln Trp Ala Tyr
275 280 285
Met His Ile Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu
290 295 300
Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Asn Leu Gly Asn Lys
305 310 315 320
Phe Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg
325 330 335
Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp Asn
340 345 350
Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg
355 360 365
Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp
370 375 380
Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu
385 390 395 400
Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp
405 410
<210> 2
<211> 1242
<212> DNA
<213> HAdv
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(1239)
<223> 人工合成的基因片段，编码含有人腺病毒五个血清型通用抗原表位的嵌合蛋白。
<220>
<221> misc_feature
<222> (1240)...(1242)
<223> 合成基因时增加的终止密码子。
<400> 2
ggatccatgg ctacaccctc aatgatgcca caatgggcgt atatgcacat tgccggtcaa 60
gacgcgtccg aatacctctc tccgggtctg gttcaatttg ccagagccac cgacacctat 120
ttcagcatgg gtaataagtt ccgtaatccg acggttgcac cgacgcatga tgttaccaca 180
gatcgtagcc aacgtctgat gctgcgcttt gttccggtgg accgcgagga caacacctac 240
tcctacaagg tgcgttacac cctggcggtc ggtgacaacc gtgtcctgga tatggcgtct 300
acctttttcg atattcgtgg tgtacttgac cgcggaccga gcttcaaacc gtatagcggc 360
accgcataca acagcctggc gccgaaaggc gcaccaaata cgagccaatg gggtggcagc 420
atggctactc cgagcatgtt accgcagtgg gcgtatatgc acatcgcagg ccaggatgca 480
agcgaatatc tgtctccggg tctggtgcag ttcgcgcgtg ctaccgacac ctacttcaac 540
ctgggcaaca aattccgcaa cccgaccgtt gcgccgacgc acgacgtgac gaccgaccgt 600
tcccaacgtc tgatgctgcg tttcgtgccg gtcgatcgtg aggataacac gtactcgtac 660
aaagtacgtt ataccttggc tgtgggcgac aaccgtgttc tcgatatggc gagtaccttt 720
tttgatatcc gcggcgtatt ggaccgcggt ccgtctttca agccgtactc tggcactgcg 780
tataacagcc tggctccgaa gggtgcaccg aatacttcac agtggggcgg tagcatggcc 840
accccgagca tgctgcctca gtgggcatac atgcatatcg cgggtcagga tgcttcggag 900
tacttgagcc ctggtttggt tcagtttgcg cgggctaccg acacctattt taacctgggt 960
aataaatttc gtaatccgac cgttgcgccg acccatgatg tgaccaccga tcgatcccag 1020
cgtttgatgc tgcgtttcgt gccggttgac cgcgaagata acacttattc ctataaggtg 1080
cgctacaccc ttgcggttgg tgacaaccgc gtcctggaca tggcttccac ctttttcgac 1140
attcgtggcg tgttggacag aggcccgagt tttaagccgt atagcggtac ggcctacaat 1200
tccctggcgc caaaaggcgc cccaaatacg agccaatggt aa 1242

Claims (3)

1.一种人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白，由腺病毒3型、7型、11型、14型及55型抗原表位蛋白片段连接而成，蛋白片段之间用甘氨酸和丝氨酸连接，融合蛋白全长411个氨基酸，氨基酸序列如下：
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ala Tyr Met HisIle Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu ValGln Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Met Gly Asn LysPhe Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr AspArg Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg GluAsp Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val GlyAsp Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile ArgGly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly ThrAla Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr Ser GlnTrp Gly Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro Gln Trp AlaTyr Met His Ile Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser ProGly Leu Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Asn LeuGly Asn Lys Phe Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp ValThr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro ValAsp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr LeuAla Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe PheAsp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro TyrSer Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro AsnThr Ser Gln Trp Gly Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser Met Leu ProGln Trp Ala Tyr Met His Ile Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu TyrLeu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr TyrPhe Asn Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro ThrHis Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg PheVal Pro Val Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val ArgTyr Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met Ala SerThr Phe Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser PheLys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys GlyAla Pro Asn Thr Ser Gln Trp。
2.权利要求1所述的人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白，利用基因工程技术表达、制备该蛋白，具体方法如下：
腺病毒抗原表位蛋白片段的筛选：
利用ANTHWIN等软件分析人腺病毒3型、7型、11型、14型和55型六邻体蛋白的氨基酸序列，筛选出五个血清型腺病毒六邻体蛋白中具有较高同源性的蛋白片段，各蛋白片段之间用两个甘氨酸和一个丝氨酸连接，串联成一个多抗原表位融合蛋白，选用原核生物偏爱的密码子，将融合蛋白翻译成相应的核苷酸序列，在融合蛋白基因片段的5'端增加了BamH I酶切位点，在3'端增加终止密码子和Xho I酶切位点，使合成的基因片段易于克隆至质粒pET-28a(+)内的BamH I和Xho I酶切位点内，化学合成该融合蛋白的全长基因序列；
人腺病毒3型抗原表位氨基酸序列：
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ala Tyr Met His IleAla Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val GlnPhe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Met Gly Asn Lys PheArg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp ArgSer Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu AspAsn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly AspAsn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg GlyVal Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr AlaTyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp；
人腺病毒7型抗原表位氨基酸序列：
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ala Tyr Met His IleAla Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val GlnPhe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Met Gly Asn Lys PheArg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp ArgSer Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu AspAsn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly AspAsn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg GlyVal Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr AlaTyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp；
人腺病毒11型抗原表位氨基酸序列：
Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro Gln Trp Ala Tyr Met His IleAla Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val GlnPhe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Asn Leu Gly Asn Lys PheArg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp ArgSer Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu AspAsn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly AspAsn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg GlyVal Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr AlaTyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp；
人腺病毒14型抗原表位氨基酸序列：
Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro Gln Trp Ala Tyr Met His IleAla Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val GlnPhe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Asn Leu Gly Asn Lys PheArg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp ArgSer Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu AspAsn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly AspAsn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg GlyVal Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr AlaTyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Ala Ser Gln Trp；
人腺病毒55型抗原表位氨基酸序列：
Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro Gln Trp Ala Tyr Met His IleAla Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val GlnPhe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Asn Leu Gly Asn Lys PheArg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp ArgSer Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu AspAsn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly AspAsn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg GlyVal Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr AlaTyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp；
融合蛋白氨基酸序列：
Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ala Tyr Met His IleAla Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val GlnPhe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Met Gly Asn Lys PheArg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp ArgSer Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu AspAsn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly AspAsn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg GlyVal Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr AlaTyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr Ser Gln TrpGly Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro Gln Trp Ala TyrMet His Ile Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro GlyLeu Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Asn Leu GlyAsn Lys Phe Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val ThrThr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val AspArg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu AlaVal Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe AspIle Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr SerGly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn AlaSer Gln Trp Gly Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro GlnTrp Ala Tyr Met His Ile Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr LeuSer Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr PheAsn Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr HisAsp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe ValPro Val Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg TyrThr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser ThrPhe Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe LysPro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly AlaPro Asn Thr Ser Gln Trp；
化学合成融合蛋白的DNA序列
GGA TCC ATG GCT ACA CCC TCA ATG ATG CCA CAA TGG GCG TAT ATG CAC ATT GCCGGT CAA GAC GCG TCC GAA TAC CTC TCT CCG GGT CTG GTT CAA TTT GCC AGA GCC ACCGAC ACC TAT TTC AGC ATG GGT AAT AAG TTC CGT AAT CCG ACG GTT GCA CCG ACG CATGAT GTT ACC ACA GAT CGT AGC CAA CGT CTG ATG CTG CGC TTT GTT CCG GTG GAC CGCGAG GAC AAC ACC TAC TCC TAC AAG GTG CGT TAC ACC CTG GCG GTC GGT GAC AAC CGTGTC CTG GAT ATG GCG TCT ACC TTT TTC GAT ATT CGT GGT GTA CTT GAC CGC GGA CCGAGC TTC AAA CCG TAT AGC GGC ACC GCA TAC AAC AGC CTG GCG CCG AAA GGC GCA CCAAAT ACG AGC CAA TGG GGT GGC AGC ATG GCT ACT CCG AGC ATG TTA CCG CAG TGG GCGTAT ATG CAC ATC GCA GGC CAG GAT GCA AGC GAA TAT CTG TCT CCG GGT CTG GTG CAGTTC GCG CGT GCT ACC GAC ACC TAC TTC AAC CTG GGC AAC AAA TTC CGC AAC CCG ACCGTT GCG CCG ACG CAC GAC GTG ACG ACC GAC CGT TCC CAA CGT CTG ATG CTG CGT TTCGTG CCG GTC GAT CGT GAG GAT AAC ACG TAC TCG TAC AAA GTA CGT TAT ACC TTG GCTGTG GGC GAC AAC CGT GTT CTC GAT ATG GCG AGT ACC TTT TTT GAT ATC CGC GGC GTATTG GAC CGC GGT CCG TCT TTC AAG CCG TAC TCT GGC ACT GCG TAT AAC AGC CTG GCTCCG AAG GGT GCA CCG AAT ACT TCA CAG TGG GGC GGT AGC ATG GCC ACC CCG AGC ATGCTG CCT CAG TGG GCA TAC ATG CAT ATC GCG GGT CAG GAT GCT TCG GAG TAC TTG AGCCCT GGT TTG GTT CAG TTT GCG CGG GCT ACC GAC ACC TAT TTT AAC CTG GGT AAT AAATTT CGT AAT CCG ACC GTT GCG CCG ACC CAT GAT GTG ACC ACC GAT CGA TCC CAG CGTTTG ATG CTG CGT TTC GTG CCG GTT GAC CGC GAA GAT AAC ACT TAT TCC TAT AAG GTGCGC TAC ACC CTT GCG GTT GGT GAC AAC CGC GTC CTG GAC ATG GCT TCC ACC TTT TTCGAC ATT CGT GGC GTG TTG GAC AGA GGC CCG AGT TTT AAG CCG TAT AGC GGT ACG GCCTAC AAT TCC CTG GCG CCA AAA GGC GCC CCA AAT GCA AGC CAA TGG TAA CTC GAG；
人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白重组质粒的构建：
提取质粒pET-28a（＋），用 BamH I和Xho I双酶切，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于去离子水内，用BamH I和Xho I双酶切化学合成的人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白基因片段，电泳回收后，溶于去离子水内，取上述酶切后DNA片段，插入到载体pET28a（＋）内的BamH I和Xho I位点之间，表达含有五个血清型腺病毒抗原表位的融合蛋白；
重组质粒的筛选与鉴定:
将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，涂布含卡那霉素LB平板，置37℃过夜；次日随机挑取转化菌落和对照菌，质粒pET-28a转化菌，提取质粒，用BamH I和Xho I双酶切验证，1.0%的琼脂糖凝胶电泳结果表明，切下1248bp的目的基因片段；同时，将含有该基因片段的质粒进行DNA序列分析，序列分析证实重组质粒含有连接在一起的五个血清型腺病毒抗原表位基因片段，序列完全正确；
构建的重组质粒表达含有五个血清型腺病毒抗原表位的融合蛋白，全长445个氨基酸，将五个血清型的人腺病毒六邻体蛋白前135个氨基酸片段之间由两个甘氨酸和一个丝氨酸连接,其氨基酸序列如下：
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val
Pro Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Glu Glu Met
Gly Arg Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ala
Tyr Met His Ile Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro
Gly Leu Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Met
Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val
Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe Val Pro Val
Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg Tyr Thr Leu
Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser Thr Phe Phe
Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe Lys Pro Tyr
Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly Ala Pro Asn
Thr Ser Gln Trp Gly Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser Met Leu Pro
Gln Trp Ala Tyr Met His Ile Ala Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr
Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr Asp Thr Tyr
Phe Asn Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro Thr Val Ala Pro Thr
His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Met Leu Arg Phe
Val Pro Val Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr Lys Val Arg
Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met Ala Ser
Thr Phe Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser Phe
Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Gly
Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp Gly Gly Ser Met Ala Thr Pro Ser
Met Leu Pro Gln Trp Ala Tyr Met His Ile Ala Gly Gln Asp Ala
Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala Arg Ala Thr
Asp Thr Tyr Phe Asn Leu Gly Asn Lys Phe Arg Asn Pro Thr Val
Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu Met
Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp Asn Thr Tyr Ser Tyr
Lys Val Arg Tyr Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp
Met Ala Ser Thr Phe Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly
Pro Ser Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala
Pro Lys Gly Ala Pro Asn Thr Ser Gln Trp；
表达融合蛋白工程菌的筛选鉴定：
将含有重组质粒的阳性转化子，接种至含3mL LB培养基的试管内，所述培养基含卡那毒素50μg／mL，37℃振荡培养2h，加IPTG至终浓度0.5mmol/L,继续振荡培养诱导4h，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测,重组子表达相对分子量为50 kD的
人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白，而对照菌BL21(DE3)无此蛋白带；
人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白的纯化：
1）人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白工程菌的超声裂解
将诱导表达融合蛋白的工程菌离心(8000 rpm、15min、4℃)收菌，菌体重悬于原培养液1／10体积的细菌裂解液(20 mmol/L PB pH7.4、5% 甘油)内，冰浴超声破菌，离心收集沉淀，沉淀内为表达的腺病毒抗原表位融合蛋白包涵体；
2）人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白的变性
用30ml 的包涵体洗液对包涵体进行重悬、洗涤，包涵体洗液为1xPBS pH7.4、1%Triton X-100, 冰浴条件下超声悬浮包涵体，直至沉淀全部悬浮，离心收集沉淀包涵体，用8 mol/L尿素、1xPBS pH7.4变性溶液，将包涵体进行重悬溶解，冰浴条件下超声破碎至完全溶解，8000 rpm、15min、4℃，离心收集上清；
3）镍柱亲和层析纯化
用1xPBS pH7.4对Ni-NTA Resin进行洗涤，除去多余的20%乙醇，用0.22μm滤膜将上步离心收集的上清进行过滤，去除杂质后与Ni-NTA Resin混合，让人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白与Ni-NTA Resin结合，玻璃棒搅拌结合1.5h， 将层析柱依次用去离子水、平衡液冲洗，然后将上述混合液上柱，用7倍柱体积的平衡液进行平衡清洗，再依次用含8 mol/L尿素的20、40、100、200、500 mmol/L 咪唑洗脱液的洗脱蛋白，收集各洗脱峰蛋白，用12％ SDS－PAGE电泳检测各峰蛋白，确定哪个洗脱峰含表达的腺病毒抗原表位融合蛋白，结果显示，100 mmol/L 咪唑洗脱蛋白峰为腺病毒抗原表位融合蛋白；
人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白的复性
将纯化得到的变性融合蛋白依次置于含6，4，3，2，1，0 mol/L 尿素的PBS pH7.4透析液中依次进行透析复性。
3.权利要求1所述的人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白，在制备腺病毒疫苗、抗体或抗原检测试剂中的应用。
CN202110344848.6A 2021-03-31 2021-03-31 一种人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白及其制备、应用 Pending CN113045674A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110344848.6A CN113045674A (zh) 2021-03-31 2021-03-31 一种人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白及其制备、应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110344848.6A CN113045674A (zh) 2021-03-31 2021-03-31 一种人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白及其制备、应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113045674A true CN113045674A (zh) 2021-06-29

Family

ID=76516496

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110344848.6A Pending CN113045674A (zh) 2021-03-31 2021-03-31 一种人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白及其制备、应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113045674A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105820257A (zh) * 2016-04-27 2016-08-03 李越希 人腺病毒抗原表位嵌合蛋白及其制备、应用
CN106318916A (zh) * 2016-10-14 2017-01-11 广州呼研所医药科技有限公司 重组腺病毒、和四价腺病毒疫苗及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105820257A (zh) * 2016-04-27 2016-08-03 李越希 人腺病毒抗原表位嵌合蛋白及其制备、应用
CN106318916A (zh) * 2016-10-14 2017-01-11 广州呼研所医药科技有限公司 重组腺病毒、和四价腺病毒疫苗及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN115043948B (zh) 一种猴痘病毒特异性融合蛋白抗原及其制备方法和应用
CN105820257B (zh) 人腺病毒抗原表位嵌合蛋白及其制备、应用
CN110698543A (zh) 一种用于非洲猪瘟病毒抗体检测的双抗原间接elisa试剂盒
CN114236128B (zh) 一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒n蛋白抗体的阻断elisa试剂盒
CN110845582B (zh) 一种猫细小病毒重组蛋白及其单克隆抗体的制备
CN105884902B (zh) 肺炎支原体蛋白抗原表位的融合蛋白及其制备、应用
CN110551187B (zh) 化学合成的h7n9禽流感病毒na蛋白胞外区抗原片段及制备方法和应用
Taherkhani et al. Development of enzyme-linked immunosorbent assays using 2 truncated ORF2 proteins for detection of IgG antibodies against hepatitis E virus
CN112920278A (zh) 一种新型冠状病毒特异性融合蛋白抗原及其制备方法和应用
CN105348391B (zh) 埃可病毒6型vp1蛋白特异性抗原表位及其融合蛋白的制备、应用
CN114685651B (zh) 一种特异识别aav9衣壳蛋白的多克隆抗体及制备方法
CN113018427A (zh) 基于新冠病毒中和抗原表位的多价融合蛋白疫苗
CN116041448A (zh) 新型冠状病毒免疫原性物质、其制备方法和应用
CN110845624A (zh) 一种sumo-cp融合蛋白及其制备方法以及其多克隆抗体的制备方法
CN114088941B (zh) 一种检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的双抗体夹心elisa试剂盒
CN112500494B (zh) 用于新型冠状病毒检测的抗原及其制备方法
CN111621506B (zh) 牛支原体分泌蛋白MbovP0145及其应用
CN105906716B (zh) 埃可病毒9型vp1蛋白特异性抗原表位及其融合蛋白的制备、应用
CN113045674A (zh) 一种人腺病毒五个血清型通用抗原表位融合蛋白及其制备、应用
CN113512098B (zh) 鉴别猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒血清抗体间接elisa方法及其应用
CN111471112B (zh) 一种狂犬病病毒重组抗原和制备方法及其用途
CN109097337B (zh) 可分泌抗Ad3FK单克隆抗体的杂交瘤细胞、单克隆抗体及其制备方法和应用
CN108840914B (zh) 一种具有免疫原性的多肽、其抗体的制备方法以及用途
CN114316034B (zh) 一种全猪源非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体、该单克隆抗体的表位及其应用
CN112521461B (zh) 甲型肝炎病毒重组蛋白的制备及其快速检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210629