CN105695422A - 表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用 - Google Patents

表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达J亚群禽白血病病毒(ALV-J)Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用，属于医学或兽医学技术领域。本发明利用重组克隆技术，将包含ALV-J Gag和Env基因以及CAG启动子序列的基因片段CAG-ALVGE插入到鸡马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的US2基因内部，构建获得在US2基因内部插入CAG-ALVGE表达框的重组粘粒，由其拯救获得表达ALV-J Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株。研究表明，本发明获得的疫苗株具有与亲本毒814疫苗株同等的体外复制能力以及良好的遗传稳定性，并且能够同时抵抗MDV超强毒株以及ALV-J超强毒株的攻击。由此可见，本发明获得的表达ALV-J Gag和Env基因的重组MDV疫苗株可以用于制备预防或治疗禽白血病和鸡马立克氏病的药物。

Description

表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一种重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用，特别涉及一种表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法和应用，本发明属于医学或兽医学技术领域。
背景技术
禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)引起的禽类造血组织中某些细胞成分过度增生的肿瘤性疾病。根据致病性和宿主的不同，ALV被划分为A-J10个亚群，其中A-D为外源性病毒，主要感染蛋鸡，A、B亚群主要诱发鸡的淋巴细胞白血病。J亚型禽白血病病毒(ALV-J)是由英国的Payne于1991年首次从肉用型鸡中分离出来的一个新的囊膜亚群(Payne,L.N.,Brown,S.R.,Bumstead,N.,Howes,K.,Frazier,J.A.,Thouless,M.E.,1991.Anovelsubgroupofexogenousavianleukosisvirusinchickens.TheJournalofgeneralvirology72(Pt4),801-807.)。该病毒可通过水平传播和垂直迅速地感染整个鸡群，其水平传播能力明显强于其他亚群。目前ALV的主要防治途径是通过种群检测淘汰阳性感染鸡只，达到种群净化切断垂直传播的途径，来减少该病给养殖业带来的损失。但是，由于我国的养殖模式多样性，养殖场数量多、分布散等特点，在我国地方鸡群中实施ALV-J的净化需要若干世代，周期长，且花费高，要实现对我国的商品代鸡群以及地方品系鸡群的完全净化，几乎是不可能完全实现的。因此探索ALV-J净化过程中的适用技术和疫苗药物使用可以缩短净化周期，加快净化进程，极具应用价值和实践意义。
马立克氏病(MD)是由马立克氏病病毒(MDV)引起的一种鸡的传染性肿瘤病，以淋巴组织增生和肿瘤形成为特征。马立克氏病是鸡的主要疾病之一，也是国内外50年代以来最受重视的鸡病。MDV属于α-疱疹病毒亚科马立克氏病样病毒属，是一种细胞结合性疱疹病毒，其基因组为线状双股DNA，约为180kb。该病可引起鸡发生多发性淋巴瘤，导致鸡只衰竭、死亡，同时损伤鸡体的免疫器官，产生严重的免疫抑制，易并发其他疾病。该病病程较长，并且发生该病后常导致整个鸡群的淘汰，一旦发生该病，损失往往特别巨大。疫苗是控制该病的主要手段，在种鸡群、蛋鸡群中MD疫苗是必须使用的疫苗，肉鸡群中使用该疫苗可以较大幅度地提高养殖效率(Morgan,R.W.,Cantello,J.L.,McDermott,C.H.,1990.TransfectionofchickenembryofibroblastswithMarek'sdiseasevirusDNA.Aviandiseases34,345-351.)。MDV血清I型弱毒疫苗814株是一株自然弱毒株，该疫苗株自从上世纪80年代研制成功以来，已安全使用30余年，没有任何不良反应(孙百明.马立克氏病的免疫及疫苗研究进展.中国预防兽医学报，2011，33:988-991.)。814疫苗株具有良好的免疫原性，保护效果与CVI988/Rispens株相当。同时，814疫苗株也是我国自主研制的，唯一有效应用的、具有自主产权的MD疫苗。
鸡马立克氏病(MD)和禽白血病(ALV)是两种主要的危害禽类的免疫抑制性疾病，其在国内的广泛流行给我国养禽业带来了巨大的经济损失。近年来，两种病毒的混合感染造成的危害更加严重，也增加了防控的难度。
重组活载体疫苗是用基因工程技术将病毒或细菌构建成一个载体，然后把外源基因插入其中使之表达的活疫苗。该类疫苗诱导机体产生的免疫比较广泛，包括体液免疫和细胞免疫，甚至粘膜免疫；更为重要的，活载体疫苗可以同时表达多种抗原，制成多价或多联疫苗，起到“一针防多病”的效果，是当今和未来疫苗研发的主要方向之一。作为疱疹病毒，MDV较大的基因组便于外源基因的插入，是活载体疫苗研究的理想载体。在之前的研究中，申请者成功建立了MDV弱毒疫苗株(814株)的多片段感染性克隆拯救系统，为MDV活载体疫苗的研制奠定了基础。本研究探索以MDV弱毒疫苗株为载体，研制表达ALV-J保护性抗原的重组MDV活载体疫苗，可以起到同时预防MD和ALV-J的效果，具有重要现实意义。
本发明在前期建立的MDV弱毒疫苗株多片段拯救系统的基础上，建立了MDV弱毒疫苗814株感染性重组克隆系统(公开号为CN104830883A)。此外，本发明人通过在MDV基因组的US2、US10、UL45/46等区域插入GFP荧光蛋白基因来比较外源基因在MDV不同复制非必需区的表达水平，结果发现US2区域是一个很好的表达外源基因的MDV复制非必需区。将ALV-Jgag和env基因表达框架插入MDVUS2基因中，构建了表达gag和env基因的重组MDV疫苗株，且US2基因缺失后不影响MDV的复制和致病性。
本发明通过MDV弱毒疫苗814株感染性重组克隆系统，构建了表达ALV-J保护性抗原的重组活载体疫苗，在国内外研究中尚属首创。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株及其构建方法，本发明构建得到的疫苗株能使动物体产生良好的对抗ALV的抗体，同时还不影响MDV的免疫效果。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明发明人在前期建立的MDV弱毒疫苗株多片段拯救系统的基础上，建立了MDV弱毒疫苗814株感染性重组克隆系统，以利于外源基因向MDV基因组的插入。然后，将含有ALVGag和Env基因的表达框架插入MDVUS2基因中(US2基因是MDV的复制非必需基因，缺失后不影响MDV的复制和致病性)，构建了表达Gag和Env基因的重组MDV疫苗株，研究表明，本发明构建的重组病毒疫苗株rMDV-ALVGE可以稳定表达Gag和Env蛋白，并具有良好的遗传稳定性。该重组病毒rMDV-ALVGE与亲本病毒具有完全一致的复制特性，免疫动物后可以诱导产生ALV-J特异性抗体反应，并显著降低ALV-J感染造成的病毒血症，同时不影响其本身对MDV的免疫保护效果。
ALV-J的宿主范围十分广泛，几乎感染所有品系的鸡。该病毒的传播主要有水平传播和垂直传播两种形式。垂直传播的鸡从鸡胚中获得病毒，机体会产生免疫耐受，病毒可在体内长期存在，且长期保持较高的病毒血症和持续向外界排毒。本发明结果表明，rMDV-ALVGE重组疫苗不仅能够在免疫后产生一定水平的中和抗体，而且能够明显降低已感染ALV-J的鸡群中病毒血症的发生率，对已感染鸡体内的ALV-J病毒具有一定的清除作用。因此，该重组疫苗在阻断ALV-J的水平传播和垂直传播中均能起到一定作用。
由此可见，本发明获得的表达ALVGag和Env基因的重组MDV疫苗株rMDV-ALVGE可以用于制备预防或治疗禽白血病和鸡马立克氏病的药物。
具体的，本发明的一种表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株，其是将包含J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因和CAG启动子序列的表达框架CAG-ALVGE插入到鸡马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的US2基因内部，获得在US2基因内部插入CAG-ALVGE表达框架的重组粘粒，由其拯救获得表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株，其中，US2基因缺失了其中第15至630位的核苷酸，代之以插入CAG-ALVGE表达框架，所述的CAG-ALVGE表达框架的结构为CMV增强子-鸡β-actin启动子-Gag基因-IRES2序列-Env基因-sv40PolyA。
在本发明的一个具体实施例中，所述的CAG-ALVGE表达框架的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。
在本发明的一个具体实施例中，所述的表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株，命名为rMDV-ALVGE，分类命名为马立克氏病病毒(Marek'sdiseasevirus)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为:CGMCCNo.12010，保藏时间为2016年1月14日。
进一步的，本发明还提出了一种构建所述表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株的方法，包括以下步骤：
(1)构建马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遗传操作系统
所述系统包含5个分别依次含有马立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因组1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位核苷酸序列的重组粘粒，其中所述的马立克氏病病毒弱毒疫苗814株全基因组序列的GeneBank登录号为JF742597，所述系统中的5个重组粘粒是通过将马立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因组1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位核苷酸序列与pCC1Fos载体连接后得到的，分别命名为p814-1、p814-2、p814-3、p814-4以及p814-5，其中p814-5包含马立克氏病病毒的US2基因，US2基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；
(2)含有CAG-ALVGE表达框架的重组突变粘粒p814-5US2ALVGE的构建
在步骤(1)构建得到的重组粘粒p814-5中的US2基因内部插入CAG-ALVGE表达框架并替换US2基因的第15至630位核苷酸得到含有CAG-ALVGE表达框架的重组突变粘粒p814-5US2ALVGE，CAG-ALVGE表达框架的结构为CMV增强子-鸡β-actin启动子-Gag基因-IRES2序列-Env基因-sv40PolyA；
(3)表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株的拯救
对得到的重组粘粒p814-1、p814-2、p814-3、p814-4以及p814-5US2ALVGE五个粘粒进行线性化处理，通过磷酸钙转染方法将五个粘粒共转染次代CEF，置于37℃培养箱中培养，转染4h后，弃掉细胞上清，用DMEM将细胞洗一遍；加入2ml甘油休克液，室温孵育2min；用DMEM洗涤3次后，加入含10％FBS的DMEM完全培养液培养，休克12h后，将细胞培养液换为含3％FBS、1％双抗的DMEM继续培养，转染4-5天后盲传2代可观察到细胞病变的出现，拯救出的重组病毒即为表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株。
在本发明中，优选的，含有CAG-ALVGE表达框架的重组突变粘粒p814-5US2ALVGE的构建，包括以下步骤：
(1)pKSKanccdB质粒的构建
以R1F和R1R为引物，从pDEST22中扩增得到attR1序列；以P6KanF和p6KanR为引物，从pMOD6中扩增得到卡那霉素抗性基因(Kan)；以ccdBR2F和ccdBR2R为引物，从pDEST22中扩增得到ccdB-attR2基因；分别纯化上述得到的3个DNA片段，并以此3个片段为模板，以R1F和ccdBR2R为引物，扩增得到attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架，将得到的attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架利用XbaI和HindIII酶切位点克隆入pBluescriptIIKS(+)载体，获得pKSKanccdB；
R1F：GCGTCTAGAGATGATGAAGATACCCCACCA(XbaI)
R1R：GTGTGCGTCGGGTGATGCTGCCAA
P6KanF：TTGGCAGCATCACCCGACGCACACATCTCAACCATCATCG
P6KanR：ATCTGGCTTTTAGTAAGCCGGATCCACCGAGCTCGAATTCGATGAA
ccdBR2F：GGATCCGGCTTACTAAAAGCCAGAT
ccdBR2R：GCGAAGCTTCGGCCATCAAACCACTTTGTACAAG(HindIII)
(2)带有Kan/ccdB抗性基因的重组突变粘粒p814-5US2KanccdB的构建
以US2hmL和US2hmR为引物从pKSKanccdB中扩增带有同源重组臂的attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架：
US2hmL：5’-ATCTAATTGGTAGCAAGTAGGTCTGTCGAATAACAGCTAATGACTACCGGGGGTGGGTCGAATCAAACAAGTTTGT-3’，
US2hmR：5’-TGGGTGTGCCCATAATCGCCAGAGCTGCAGACCTATTCCGTTTTGCCAAAGCGGCCATCAAACCACTTTGTACAAG-3’；
用Counter-SelectionBACModificationKit试剂盒将所扩增的片段克隆入p814-5中的US2基因中，替换814株基因组US2基因序列的第15-630位核苷酸序列，代之以attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架，获得重组突变粘粒p814-5US2KanccdB；
(3)pENTR1入门载体的构建
将pENTR-gus质粒中的gus基因删除，替换为BglII-SalI-XbaI-NotI-EcoRI-KpnI-SmaI-SacI-HindIII-BamHI十个酶切位点，获得入门载体，命名为pENTR1；
(4)pCAGGS-ALVGE表达质粒的构建
以IRESF:5’-TTTATCGATGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGT-3’和IRESR:5’-TTTCCCGGGTGTGGCCATATTATCATCGTGTTTTTC-3’为引物，以pIRES2-EGFP为模板，扩增获得IRES2片段，克隆入pCAGGS载体，构建获得pCAGGS-IRES2；
用引物gag-F：5’-TTTGAGCTCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGGTGA-3’和gag-R：5’-TTTGAGCTCCTATAAATTTGTCAAGCGGAGC-3’，以质粒pBluscriptII-JL093为模板，扩增获得gag基因；
用引物env-F：5’-TTTCCCGGGGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGGCATTTCTGACTGGGCACCC-3’和env-R：5’-TTTGAGCTCCTACAGTTGCTCCCTAATTCTA-3’，以质粒pBluscriptII-JL093为模板，扩增获得env基因；
将gag以及env的PCR产物分别经SacI单酶切和SmaI和XhoI双酶切后，克隆入pCAGGS-IRES2载体多克隆位点，构建得到pCAGGS-gag-IRES2-env，简称为pCAGGS-ALVGE，其中gag-IRES2-env基因位于CAG启动子下游，SV40PolyA上游，位于pCAGGS载体的1719-1736位核苷酸之间；
其中，质粒pBluscriptII-JL093是通过将ALV-J毒株的全基因组cDNA序列克隆入pBluescriptII载体得到的；
(5)ALVGE入门表达质粒pENTR1-ALVGE的构建
将步骤(4)构建的pCAGGS-ALVGE表达质粒用SalI和BamHI进行双酶切，酶切产物回收后获得ALVGE表达框架，将获得的ALVGE表达框架通过SalI和BamHI酶切位点克隆入pENTR1入门载体，获得ALVGE入门表达质粒pENTR1-ALVGE；
(6)含有ALVGE表达框架的重组突变粘粒p814-5US2ALVGE的构建
将步骤(5)构建的ALVGE入门表达质粒pENTR1-ALVGE与重组突变粘粒p814-5US2KanccdB利用LRClonaseTMIIEnzymeMix进行LR反应，使上述重组突变粘粒中的Kan-ccdB表达框架替换为pENTR1-ALVGE质粒中的CAG-ALVGE表达框架，从而获得在MDV基因组的US2基因中插入CAG-ALVGE表达框架的重组粘粒p814-5US2ALVGE。
在本发明的一个具体实施例中，所述的CAG-ALVGE表达框架的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。
再进一步的，本发明还提出了所述表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株在制备预防和治疗鸡马立克氏病和禽白血病药物中的用途。
本发明以MDV血清1型弱毒疫苗814株为载体，构建了表达ALVGag和Env基因的重组病毒。与其他病毒载体相比，814疫苗株载体具有无可比拟的优势：1)814疫苗株是目前应用最广泛的血清1型MDV疫苗株之一，与CVI988/Rispens株免疫效果相当，能对目前流行的MDV特超强毒(vv+MDV)提供良好的保护，免疫效果显著强于HVT疫苗；2)814疫苗株是一株自然弱毒株，性状稳定，自上世纪80年代研制成功以来，安全适应30余年，无任何不良反应；3)作为疱疹病毒科成员，MDV具有持续性感染的特性，有利于在体内长期表达外源抗原，激发机体产生较强的免疫应答反应；4)MDV为专一的细胞结合型病毒，通过细胞与细胞之间的直接接触进行传播，因此受母源抗体干扰较小；5)本发明的重组疫苗不仅能够在免疫后产生一定水平的中和抗体，而且能够明显降低已感染ALV-J的鸡群中病毒血症的发生率，对已感染鸡体内的ALV-J病毒具有一定的清除作用。
本发明的重组疫苗株的研究成功不仅有助于加快我国鸡群中ALV-J的净化工程，同时也大大提高了MDV疫苗株的价值。尤其是在MDV和ALV混合感染比较严重地区应用该重组疫苗，可以起到同时防控这两种病毒的效果，为鸡马立克氏病和禽白血病这两种免疫抑制病的协同防治提供了一种新的思路。
附图说明
图1为MDV基因组DNA片段脉冲场电泳图；
其中，M，低范围PFGMarker；1，MDV基因组DNA；2，基因组DNA剪切后片段；3，回收后35-48kbDNA；
图2为pCC1Fos载体图谱；
图3为拯救毒rMDV和原MDV疫苗株病毒在CEF细胞上产生的细胞病变；
其中，rMDV：MDV疫苗株拯救毒；MDV：原MDV疫苗株病毒；Mock：正常未接毒细胞；
图4为拯救毒rMDV和原MDV疫苗株病毒基因组DNA的HindIII酶切图谱；
其中，M1：低范围PFGMarker；M2：15kbDNA分子量标记；rMDV：MDV疫苗株拯救毒；MDV：原MDV疫苗株病毒；
图5为pKSKanccdB质粒图谱；
图6为重组突变粘粒p814-5US2KanccdB结构示意图；
图7为入门载体pENTR1图谱；
图8为目的基因表达质粒pCAGGS-ALVGE图谱；
图9为入门表达质粒pENTR1-ALGE图谱；
图10为在MDV疫苗株814基因组US2基因内部插入ALVGE表达框架的重组突变粘粒p814-5US2-ALVGE图谱；
图11为重组病毒和原MDV疫苗株病毒在CEF细胞上产生的细胞病变；
其中，rMDV-ALVGE：表达Gag和Env基因的重组MDV；MDV：原MDV疫苗株病毒；Mock：正常未接毒细胞；
图12为重组病毒和原MDV疫苗株病毒在CEF细胞上形成的病毒粒子；
其中，rMDV-ALVGE：表达Gag和Env基因的重组MDV；MDV：原MDV疫苗株病毒；Mock：正常未接毒细胞；
图13为重组病毒和原MDV疫苗株病毒基因组DNAPCR鉴定；
其中，rMDV-ALVGE：表达Gag和Env基因的重组MDV；MDV：原MDV疫苗株病毒；DL15000:15000bp分子量Marker；
图14为间接免疫荧光试验检测目的基因的Gag和Env的表达情况；
其中，rMDV-ALVGE：表达Gag和Env基因的重组MDV；MDV：原MDV疫苗株病毒；Mock：正常未接毒细胞；
图15为Westernblot检测目的基因Gag和Env的表达情况；
其中，rMDV-ALVGE：表达Gag和Env基因的重组MDV；MDV：原MDV疫苗株病毒；CEF：正常未接毒CEF细胞；
图16为PCR法检测外源基因Gag和Env在重组病毒传代中的遗传稳定情况；
其中，rMDV-ALVGE_P5，P10，P15，P20分别为第5、10、15、20代重组病毒；MDV：原MDV疫苗株病毒；DL15000：15000bp分子量Marker；
图17为间接免疫荧光试验检测外源基因Gag和Env在重组病毒传代中的稳定表达情况；
其中，rMDV-ALVGE_P5，P10，P20分别为第5、10、20代重组病毒；Mock：正常未接毒细胞；
图18为重组病毒rMDV-ALVGE和亲本毒MDV在CEF上的复制曲线；
其中，rMDV-ALVGE：表达Gag和Env基因的重组MDV；MDV：亲本MDV病毒；
图19为重组病毒rMDV-ALVGE免疫后ELISA抗体检测；
其中，rMDV-ALVGE：表达Gag和Env基因的重组MDV；Negativecontrol：空白对照组；
图20为重组病毒rMDV-ALVGE免疫后ALV-J中和抗体检测；
其中，rMDV-ALVGE：表达Gag和Env基因的重组MDV；Negativecontrol：空白对照组；
图21为重组病毒rMDV-ALVGE免疫鸡攻毒ALV-J后病毒血症发生率；
其中，rMDV-ALVGE：表达Gag和Env基因的重组病毒；Challengecontrol：不免疫攻毒对照组；Negativecontrol：空白对照组；
图22为重组病毒rMDV-ALVGE免疫鸡攻毒ALV-J后法氏囊体重比(F/Bratios)。
其中，rMDV-ALVGE：表达Gag和Env基因的重组病毒；Challengecontrol：不免疫攻毒对照组；Negativecontrol：空白对照组；
图23为ALV-J感染鸡免疫重组病毒rMDV-ALVGE后病毒血症发生率。
其中，rMDV-ALVGE：表达Gag和Env基因的重组病毒；Challengecontrol：攻毒ALV-J后不免疫组；Negativecontrol：空白对照组。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1MDV疫苗814株基因组Fosmid文库的构建
马立克氏病病毒弱毒疫苗814株(Zhang,F.,Liu,C.J.,Zhang,Y.P.,etal.Comparativefull-lengthsequenceanalysisofMarek'sdiseasevirusvaccinestrain814.ArchVirol.2012,157(1):177-183.)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存，提供。所述的马立克氏病病毒弱毒疫苗814株全基因组序列的GenBank登录号为JF742597。
按照Epicentre公司CopyControlTMFosmidLibraryProductionKit试剂盒说明进行MDV基因组Fosmid文库的构建。方法如下：
将MDV疫苗814株病毒基因组DNA用物理方法即用200μL移液器吸头反复抽吸50-100次，通过脉冲场电泳(BioRad公司CHEFXAPulsedFieldElectrophoresisSystem系统，条件为：电泳缓冲液0.5×TBE，胶浓度1％，程序5-220kb)分析，至其片段长度在30-50kb之间(图1)。将剪切后的DNA用End-RepairEnzymeMix(Epicentre公司)进行平末端化和5’磷酸化修饰。取末端修饰后的DNA进行脉冲场电泳，条件如上所述。回收大小为35-48kb之间的基因组DNA片段(图1)。取回收后DNA与pCC1Fos载体(图2)连接。将连接产物用包装试剂MaxPlaxLambdaPackagingExtracts(购自Epicentre公司)包装，转染大肠杆菌EPI300-T1R(购自Epicentre公司)。将菌液涂布于含12.5μg/ml氯霉素的LB平板上培养过夜，统计菌落数量，计算粘粒文库的滴度(cfu/ml)，结果为1.8×106cfu/ml。
从培养平板上挑取300个克隆，碱裂解法提取粘粒，用引物pCC1F：5’-GGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGG-3’和pCC1R：5’-CTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGC-3’对重组粘粒进行基因组测序。结果共获得273个克隆有MDV基因片段的重组粘粒，插入片段长度在32-46kb之间。以每个插入片段30kb计算，该273个克隆对MDV814疫苗株基因组的覆盖率为47.6(273×30kb/172kb)，表明其足以覆盖MDV全基因组。即成功构建MDV疫苗814株基因组Fosmid文库。
实施例2病毒拯救
根据重组粘粒末端测序分析，从中选取6组5粘粒组合。每个组合中的5个粘粒均克隆有MDV疫苗814株基因组DNA片段，含有相互重叠区域并可拼接覆盖完整MDV基因组。用QIAGEN公司中提试剂盒提取所选择的粘粒DNA。用NotI(NEB公司)对提取的粘粒进行线性化处理：NotI内切酶100U，粘粒10μg，37℃作用2h。酶切产物用酚-氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀制备转染用MDV基因组DNA。
采用磷酸钙转染方法将5段MDV基因组DNA片段共转染次代CEF细胞。CEF细胞的制备方法如下：取9-10日龄SPF鸡胚，无菌取出鸡胚，放置到盛有Hank’s液(购自HyClone)的平皿中洗涤，去除头、四肢和内脏，用剪刀剪碎；用Hank’s液洗涤两次，加入0.25％的胰酶(4mL/胚)，37℃孵育10min；弃尽胰酶，加入含5％FBS、1％双抗的DMEM培养液(购自HyClone)，反复吹打使细胞分散。用6层纱布过滤后制成8×105细胞/mL的细胞悬液，分装于细胞培养瓶中于37℃温箱中培养。
磷酸钙转染过程如下：将培养16-18h的原代CEF细胞用胰酶消化下来，用含10％FBS、无双抗的DMEM洗涤两次，分装到60mm培养皿中(4×106细胞/皿)。在1.5mlEP管中混合388μl灭菌水、50μlDNA(包含5个浓度均为200ng/μl的MDV基因组DNA片段，每个片段10μl即2μg)、62μl2MCaCl2；在另一个1.5mlEP管中加入500μl2×HBS缓冲液；将CaCl2-DNA混合液逐滴缓慢加入到2×HBS缓冲液中，混匀；室温孵育30min。将制备的磷酸钙-DNA沉淀逐滴加入到制备的次代CEF细胞上，置于37℃培养箱中培养。转染4h后，用2ml甘油休克液(15％甘油，1×HBS)休克2min，加入含10％FBS的DMEM完全培养液培养。休克12h后，将细胞培养液换为含3％FBS、1％双抗的DMEM继续培养。
转染4-6天后，观察细胞病变的产生情况。结果表明，所选取的6组粘粒组合转染CEF细胞后均可出现MDV典型细胞病变。选取重复性较好的一组粘粒组合，进行后续的试验。收获此组5粘粒共转染拯救的病毒，命名为rMDV。将rMDV与原MDV疫苗株病毒分别接种CEF细胞，培养4-6天后观察，发现rMDV在CEF细胞上产生的蚀斑形态和大小与原MDV疫苗株病毒无明显差异(图3)。提取拯救毒rMDV和原MDV疫苗株病毒基因组DNA，HindIII(NEB公司)酶切后，用脉冲场电泳分析其酶切图谱，表明拯救毒rMDV基因组物理图谱与原病毒MDV完全一致(图4)。说明所选择的5粘粒组合成功拯救MDV。
本发明人将所选择的5个粘粒分别命名为p814-1、p814-2、p814-3、p814-4、p814-5，其所插入的DNA片段分别为MDV疫苗814株基因组的第1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位。这5个重组粘粒所含有的DNA片段能相互重叠且能覆盖全MDV基因组，其中p814-5包含MDV基因组的US2基因(US2基因核苷酸序列参见SEQIDNo.2)。
实施例3在MDV基因组US2基因内部插入CAG-ALVGE表达框架(SEQIDNo.1)的重组突变粘粒的构建
基于上述已建立的MDV多片段粘粒拯救系统，在所选择的5粘粒组成员p814-5中MDV基因组的US2基因内部，具体地，US2基因共813bp，本发明中，US2基因缺失了其中第15至630位核苷酸，代之以插入CAG-ALVGE表达框架(CAG-ALVGE表达框架的核苷酸序列为SEQIDNO.1，其结构为CMV增强子-鸡β-actin启动子-Gag基因-IRES2序列-Env基因-sv40PolyA)，构建1个重组突变粘粒p814-5US2ALVGE。
重组突变粘粒p814-5US2ALVGE的构建过程简述如下：
3.1pKSKanccdB质粒的构建
用表1所示的3对引物分别对pDEST22质粒和pMOD6质粒进行多重PCR扩增。
其构建过程简述如下：以R1F和R1R为引物，从pDEST22中扩增得到attR1序列；以P6KanF和p6KanR为引物，从pMOD6中扩增得到卡那霉素抗性基因(Kan)；以ccdBR2F和ccdBR2R为引物，从pDEST22中扩增得到ccdB-attR2基因；分别纯化上述得到的3个DNA片段，并以此3个片段为模板，以R1F和ccdBR2R为引物，扩增得到attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架。将得到的attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架利用XbaI和HindIII酶切位点克隆入pBluescriptIIKS(+)载体，获得pKSKanccdB，如图5所示。
表1用于克隆Kan-ccdB表达框架的PCR引物
引物名称 序列(5’-3’)
R1F GCGTCTAGAGATGATGAAGATACCCCACCA(XbaI)
R1R GTGTGCGTCGGGTGATGCTGCCAA
P6KanF TTGGCAGCATCACCCGACGCACACATCTCAACCATCATCG
P6KanR ATCTGGCTTTTAGTAAGCCGGATCCACCGAGCTCGAATTCGATGAA
ccdBR2F GGATCCGGCTTACTAAAAGCCAGAT
ccdBR2R GCGAAGCTTCGGCCATCAAACCACTTTGTACAAG(HindIII)
3.2带有Kan/ccdB抗性基因的重组突变粘粒p814-5US2KanccdB的构建
用以下引物从pKSKanccdB中扩增带有同源重组臂的attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架，US2hmL：5’-ATCTAATTGGTAGCAAGTAGGTCTGTCGAATAACAGCTAATGACTACCGGGGGTGGGTCGAATCAAACAAGTTTGT-3’，US2hmR：5’-TGGGTGTGCCCATAATCGCCAGAGCTGCAGACCTATTCCGTTTTGCCAA AGCGGCCATCAAACCACTTTGTACAAG-3’。用Counter-SelectionBACModificationKit试剂盒将所扩增的片段克隆入p814-5中的US2基因中，替换814株基因组US2基因序列的第15-630位核苷酸序列，代之以attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架，获得重组突变粘粒p814-5US2KanccdB，其构建模式如图6所示。
3.3pENTR1入门载体的构建
为便于向MDV基因组中插入外源基因表达框架，本发明将pENTR-gus质粒中的gus基因删除，替换为BglII-SalI-XbaI-NotI-EcoRI-KpnI-SmaI-SacI-HindIII-BamHI十个酶切位点，过程如下：以ENTR1F(5’-GAATTCTCGCGGCCGCTCTAGAATCTGTCGACAGATCTGGTTTCTACAGGACGGACCATG-3’)和ENTR1R(5’-GAATTCGGTACCCGGGAGCTCAAGCTTGGATCCGGTGAAAAACCGCAGCAGGGAGG-3’)为引物，以pENTR-gus为模板，进行PCR扩增。将纯化后的PCR产物用EcoR1酶切。酶切产物纯化后，用T4DNA连接酶进行自身连接，转化大肠杆菌，获得入门载体pENTR1(如图7所示)。
3.4pCAGGS-ALVGE表达质粒的构建
以IRESF:5’-TTTATCGATGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGT-3’和IRESR:5’-TTTCCCGGGTGTGGCCATATTATCATCGTGTTTTTC-3’为引物，以pIRES2-EGFP为模板，扩增获得IRES2片段，全长585bp，克隆入pCAGGS载体，构建获得pCAGGS-IRES2。用引物gag-F：5’-TTTGAGCTCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGGTGA-3’和gag-R：5’-TTTGAGCTCCTATAAATTTGTCAAGCGGAGC-3’，以质粒pBluscriptII-JL093为模板，扩增获得gag基因，全长2100bp。用引物env-F：5’-TTTCCCGGGGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGGCATTTCTGACTGGGCACCC-3’和env-R：5’-TTTGAGCTCCTACAGTTGCTCCCTAATTCTA-3’，以质粒pBluscriptII-JL093为模板，扩增获得env基因，全长1707bp。将gag和env的PCR产物分别经SacI单酶切和SmaI和XhoI双酶切后克隆入pCAGGS-IRES2载体多克隆位点，构建得到pCAGGS-gag-IRES2-env(简称为pCAGGS-ALVGE)。其中gag-IRES2-env基因位于CAG启动子下游，SV40PolyA上游，在pCAGGS载体的1719-1736为核苷酸之间，如图8所示。
其中，质粒pBluscriptII-JL093是通过将ALV-J毒株JL093-1的全基因组cDNA序列克隆入pBluescriptII载体得到的。
3.5ALVGE入门表达质粒pENTR1-ALVGE的构建
将上述构建的pCAGGS-ALVGE表达质粒用SalI和BamHI进行双酶切，酶切产物回收后获得ALVGE表达框架。将获得的ALVGE表达框架通过SalI和BamHI酶切位点克隆入pENTR1入门载体，获得ALVGE入门表达质粒pENTR1-ALVGE(如图9所示)。
3.6含有ALVGE表达框架的重组突变粘粒p814-5US2ALVGE的构建
将上述ALVGE入门表达质粒pENTR1-ALVGE与重组突变粘粒p814-5US2KanccdB利用LRClonaseTMIIEnzymeMix进行LR反应，使上述重组突变粘粒中的Kan-ccdB表达框架替换为pENTR1-ALVGE质粒中的CAG-ALVGE表达框架(SEQIDNO.1)，从而获得在MDV基因组的US2基因中插入CAG-ALVGE表达框架的重组粘粒p814-5US2ALVGE(该重组突变粘粒的图谱如图10所示)。具体地，所述CAG-ALVGE表达框架(SEQIDNO.1)替换所述MDV疫苗814株基因组US2基因(SEQIDNo.2)的第15到630位核苷酸片段。
实施例4表达ALV-JGag和Env基因的重组MDV的拯救及鉴定
4.1重组病毒的拯救
用QIAGEN公司的中提试剂盒提取p814-1、p814-2、p814-3、p814-4(由实施例1-2构建和筛选)、p814-5US2ALVGE五个粘粒DNA。用NotI(NEB公司)对提取的粘粒进行线性化处理：NotI内切酶100U，粘粒10μg，37℃作用2h。酶切产物用酚-氯仿-异戊醇抽提，乙醇沉淀制备转染用DNA。
通过磷酸钙转染方法将五个粘粒共转染次代CEF，病毒拯救过程阐述如下：取9-10日龄SPF鸡胚，无菌取出鸡胚，放置到盛有Hank’s液(购自HyClone)的平皿中洗涤，去除头、四肢和内脏，用剪刀剪碎；用Hank’s液洗涤两次，加入0.25％的胰酶(4mL/胚)，37℃孵育10min；弃尽胰酶，加入含5％FBS、1％双抗的DMEM培养液(购自HyClone)，反复吹打使细胞分散。用6层纱布过滤后制成8×105细胞/mL的细胞悬液，分装于细胞培养瓶中于37℃温箱中培养。
将培养16-18h的原代CEF细胞用胰酶消化下来，制备为次代CEF细胞。在制备次代CEF细胞的同时进行磷酸钙-DNA沉淀的制备。在1.5mlEP管中混合388μl灭菌水、50μlDNA(包含5个浓度均为200ng/μl的MDV基因组DNA片段，每个片段10μl即2μg)、62μl2MCaCl2；在另一个1.5mlEP管中加入500μl2×HBS缓冲液；将CaCl2-DNA混合液逐滴缓慢加入到2×HBS缓冲液中，混匀；室温孵育30min。将制备的磷酸钙-DNA沉淀加入到制备的次代CEF细胞上，置于37℃培养箱中培养。转染4h后，用DMEM将细胞洗一遍；加入2ml甘油休克液(15％甘油，1×HBS)，室温孵育2min；用DMEM洗涤3次后，加入含10％FBS的DMEM完全培养液培养。休克12h后，将细胞培养液换为含3％FBS、1％双抗的DMEM继续培养。转染4-5天后盲传2代可观察到细胞病变的出现，拯救出的重组病毒命名为rMDV-ALVGE，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.12010。
4.2重组病毒的鉴定
从细胞病变、电镜观察和测序三个方面对拯救毒进行鉴定。将rMDV-ALVGE与原MDV疫苗株病毒分别接种次代CEF细胞，培养4-6天后观察比较病毒在感染细胞上产生的蚀斑情况。用透射电镜观察拯救毒rMDV-ALVGE感染细胞中是否存在典型的MDV病毒粒子。用引物gag-F：5’-TTTGAGCTCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGGTGA-3’和US2R：5′-TGGGTGTGCCCATAATCGCCAGAG-3′对重组病毒进行PCR鉴定并测序。
4.3重组病毒目的基因Gag和Env表达情况
将上述拯救获得的重组病毒rMDV-ALVGE与原MDV疫苗株病毒以100PFU接种CEF细胞，培养120h后收集细胞，用p27和gp85单克隆抗体和FITC标记的抗鼠二抗进行间接免疫荧光试验(IFA)。过程如下：将接毒细胞用无水乙醇室温固定20min。用PBST将固定好的培养板洗一遍。加入1:100稀释的p27或gp85单抗，37℃湿盒中孵育1h。用PBST洗5遍。加入1:100稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，37℃湿盒中孵育1h。用PBST洗5遍，于荧光显微镜下观察结果。
同时进行蛋白质印迹(Westernblot)检测：每孔加入500μL细胞裂解液(购自碧云天公司)，4℃裂解30min释放细胞中的Gag和Env蛋白。将细胞裂解所得上清用10％SDS-PAGE分离胶电泳。将蛋白胶用半干转膜仪(Bio-Rad公司)将蛋白转至NC膜。转膜完成后，将膜用p27或gp85单抗和DyLight-800标记的抗鼠二抗(KPL公司)进行Westernblot试验：转膜完成后，将膜置于5％脱脂乳中于4℃封闭过夜。将膜用PBST洗三次，5min/次。将膜用p27或gp85单抗室温孵育1.5h，同样方法洗3-5次。将膜置于红外标记的抗鼠二抗中室温孵育1h，洗涤3-5次。用蛋白质印迹扫描系统观察结果。
4.4重组病毒的遗传稳定性
将重组病毒rMDV-ALVGE在CEF中连续传20代，提取病毒基因组DNA，用引物gag-F和US2R进行PCR和测序鉴定。将病毒接种培养于CEF细胞，进行间接免疫荧光试验，检测目的基因Gag和Env的表达情况。
4.5重组病毒的复制曲线
将重组病毒rMDV-ALVGE和原MDV疫苗株病毒以100PFU剂量接种培养于6孔板中的次代CEF细胞，感染后每隔24h收集病毒(每个时间点每种病毒均做3个重复孔)，直到感染后144h。测定各个时间点所收集病毒的滴度，绘制生长曲线，检测重组病毒rMDV-ALVGE在CEF上的复制曲线是否与亲本毒一致。
结果：
4.6重组病毒rMDV-ALVGE的鉴定
将重组病毒rMDV-ALVGE与原MDV疫苗株病毒分别接种CEF细胞，培养4-6天后观察比较病毒在感染细胞上产生的蚀斑情况。发现重组病毒rMDV-ALVGE在CEF细胞上产生的蚀斑形态和大小与原MDV疫苗株病毒无明显差异(图11)。用透射电镜观察发现，在rMDV-ALVGE感染细胞中可见大量典型的MDV病毒粒子(多数为裸露的未成熟病毒)，与原MDV疫苗株病毒形成的病毒粒子无明显差异(图12)。提取rMDV-ALVGE感染细胞基因组DNA，对重组病毒进行PCR鉴定。结果表明，亲本MDV疫苗株病毒因不含有ALVGE基因表达框架，扩增结果为阴性；重组MDV疫苗株的PCR产物长度为7724bp，包含ALVGE表达盒全长以及表达盒下游的US2基因部分序列(图13)。
4.7目的基因gag和env表达情况
将重组病毒rMDV-ALVGE与原MDV疫苗株病毒分别接种CEF细胞后120h收集细胞，用IFA和WesternBlot检测目的基因gag和env的表达情况。由图14可见，rMDV-ALVGE感染的细胞经p27和gp85单抗检测可见绿色荧光信号，MDV亲本病毒与未接毒细胞未见荧光。WesternBlot结果显示，rMDV-ALVGE感染的细胞可见清晰的gp85和p27蛋白表达条带，大小与预期相符，而亲本病毒和未接毒细胞在相应位置未见蛋白条带(图15)。由上可见，重组病毒rMDV-ALVGE可以成功表达目的基因gag和env。
4.8重组病毒的遗传稳定性
将重组病毒rMDV-ALVGE在CEF中连续传20代。提取第5、10、20代重组病毒基因组DNA，用目的基因上游引物gag-F和下游同源臂引物US2R进行PCR鉴定。结果显示，以上代次病毒均可扩增获得大小为7724bp的目的片段，与预期相符(图16)。将第5、10、20代病毒接种CEF细胞，用间接免疫荧光试验检测重组蛋白的表达。结果表明，以上代次的病毒均可以稳定的表达gag和env目的蛋白(图17)。综上说明，重组病毒rMDV-ALVGE具有良好的遗传稳定性。
4.9重组病毒的复制特性
将重组病毒rMDV-ALVGE和原MDV疫苗株亲本病毒以100PFU接种CEF，每24小时收集细胞，滴定病毒的复制曲线。如图18所示，从生长曲线来看，各时间点rMDV-ALVGE的复制滴度与MDV无明显差异(P＞0.05)。重组病毒与亲本毒均在感染后120h复制滴度达到最高峰，分别为9.46×104PFU/ml和9.52×104PFU/ml。说明rMDV-ALVGE在CEF中的复制特性与亲本MDV疫苗株病毒一致。
实施例5重组MDV疫苗株rMDV-ALVGE的免疫效力试验
5.1重组病毒对ALV-J的免疫保护效力试验
取75只1日龄SPF雏鸡，随机分为5组，每组15只。组1以2000PFU/只剂量颈部皮下接种重组疫苗rMDV-ALVGE，4周龄攻毒ALV-J强毒HLJ09SH5株1000TCID50；组2不免疫，4周龄攻毒ALV-J强毒HLJ09SH5株1000TCID50；组3以2000PFU/只剂量颈部皮下接种重组疫苗rMDV-ALVGE的同时攻毒ALV-J强毒HLJ09SH5株1000TCID50；组4不免疫，1日龄攻毒ALV-J强毒HLJ09SH5株1000TCID50；组5不做任何处理作为实验空白对照组。免疫后每周采血，用IDEXX试剂盒检测ALV-J特异性ELISA抗体；并采集免疫后4周血清进行中和试验，检测ALV中和抗体。中和抗体测定方法为：将无菌分离血清放入56℃水浴锅30min灭活；用不含血清的DMEM以2倍梯度稀释后，加入100TCID50的ALV-JHLJ09SH5株，于37℃作用1h；取约80％满96孔板CEF，甩去培养液，用D-HANK’S液清洗细胞一次，加入血清与病毒混合物，作用2小时后，吸去血清与病毒混合物，加入含2％血清的DMEM继续培养7天后，用IDEXXALV-J抗原检测试剂盒检测，以能完全抑制病毒生长的最大血清稀释度为其中和滴度。
对所有组的试验鸡(包括1日龄攻毒组和4周龄攻毒组)攻毒后1周、2周3周、4周后采集抗凝血用于病毒血症检测。具体方法如下，将所采集的抗凝血1200g/min离心5min，分离血浆，将分离所得血浆用0.45μm的滤器过滤后，接种到铺满单层CEF细胞的48孔板中，作用2小时候吸取血浆，加入含2％血清的DMEM继续培养7天后，用IDEXXALV抗原检测试剂盒检测。检测阳性的鸡为病毒血症阳性。攻毒4周后剖杀，采集法氏囊和脾脏，称量每只鸡的体重、法氏囊重和脾脏重量，统计囊重比(F/B)，F/B＝(器官重/体重)×1000。
5.2重组病毒对MDV的免疫保护效力试验
取60只SPF莱航鸡平均分为3组，其中2组分别通过颈部皮下接种2000PFU重组病毒rMDV-ALVGE或亲本病毒814疫苗，第三组接种灭菌PBS作为非免疫攻毒对照。另设10只同日龄鸡作为健康对照。免疫后7天，所有试验鸡腹腔注射1000PFU/只MDV超强毒株(Md5株)。攻毒后连续观察试验鸡的发病和死亡情况至攻毒后12周。所有攻毒后死亡的试验鸡以及实验结束时扑杀试验鸡均进行剖检观察大体病变，同时采集肝脏、肾脏、脾脏、胸腺和坐骨神经用10％中性缓冲福尔马林固定之后，按文献方法进行病理学检查。保护指数按照以下公式进行计算：PI(％)＝(％对照组MD阳性率-％免疫组MD阳性率)/％对照组MD阳性率。
结果：
5.3重组病毒rMDV-ALVGE对ALV-J的免疫保护效果
5.3.1ALV-J抗体滴度的检测
将重组病毒rMDV-ALVGE以2000PFU/只剂量接种1日龄SPF鸡，免疫后每周检测ALV-J特异性ELISA抗体，结果如图19所示。免疫后第一周，所有免疫鸡均检测不到抗体。免疫后第二周免疫鸡血清抗体开始转阳；免疫后4周，抗体滴度继续升高，ELISA抗体阳性率达到80％。中和抗体的检测结果表明，免疫后4周，所有免疫鸡均产生ALV-J中和抗体阳性率80％，平均中和抗体滴度为22(图20)。
5.3.2免疫鸡攻毒后病毒血症和法氏囊萎缩情况
免疫后4周对试验鸡攻毒ALV-J，攻毒后连续4周采集抗凝血，检查攻毒后每组试验鸡病毒血症发生率。结果如图21所示，攻毒后1-2周，与不免疫攻毒对照组相比，rMDV-ALVGE免疫组的病毒血症发生率显著降低(P<0.05)。由于ALV-J攻毒大日龄鸡产生一过性病毒血症，攻毒后3-4周，各试验组均未检测到病毒血症。攻毒后4周对各组试验鸡剖检，与正常对照组相比，不免疫攻毒组法氏囊明显萎缩(P<0.05)，而rMDV-ALVGE免疫组试验鸡法氏囊未见明显萎缩(P>0.05)(图22)。
5.3.3重组病毒对ALV-J感染的病毒清除作用
为了探究重组病毒rMDV-ALVGE对已感染ALV-J的鸡是否有病毒清除作用，我们首先对1日龄SPF鸡攻毒ALV-J，而后免疫重组病毒rMDV-ALVGE。ALV-J攻毒后每周采血检测病毒血症发生率。结果表明，与攻毒后不免疫组相比，重组病毒免疫组可以显著降低ALV-J感染鸡病毒血症发生水平(P<0.05)(图23)。
5.4重组病毒rMDV-ALVGE对MDV的免疫保护效果
为确定外源基因插入后是否会影响重组病毒对MDV本身的免疫保护效力，分别用重组病毒rMDV-ALVGE和亲本病毒MDV814疫苗免疫1日龄SPF鸡，免疫后7天用超强毒株Md5株进行攻毒，攻毒后连续观察实验组与对照组试验鸡发病和死亡情况至攻毒后12周。结果显示，rMDV-ALVGE免疫组和814免疫组试验鸡均未出现任何临床症状和显微病变，而非免疫对照组试验鸡出现典型的MD临床症状，死亡率达80％(16/20)，发病后至实验结束仍存活的4只对照组试验鸡经病理学检查可以观察到特征性肿瘤病理变化(表2)。说明重组病毒对MDV的免疫保护效力未受到影响。
表2重组病毒rMDV-ALVGE对MDV的免疫保护效力试验结果
综上所述，rMDV-ALVGE免疫鸡可以诱导产生显著的ALV-J特异性抗体和中和抗体。与不免疫试验鸡相比，rMDV-ALVGE的免疫可以显著降低ALV-J感染鸡病毒血症发生水平，并具有明显的病毒清除作用。同时，rMDV-ALVGE也能够提供良好的对MDV的免疫效果。以上结果表明，重组病毒rMDV-ALVG可以作为一种新型的二联疫苗用于ALV-J和MDV的预防。

Claims (7)

1.表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株，其特征在于是将包含J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因和CAG启动子序列的表达框架CAG-ALVGE插入到鸡马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的US2基因内部，获得在US2基因内部插入CAG-ALVGE表达框架的重组粘粒，由其拯救获得表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株，其中，US2基因缺失了其中第15至630位的核苷酸，代之以插入CAG-ALVGE表达框架，所述的CAG-ALVGE表达框架的结构为CMV增强子-鸡β-actin启动子-Gag基因-IRES2序列-Env基因-sv40PolyA。
2.如权利要求1所述的表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株，其特征在于，所述的CAG-ALVGE表达框架的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。
3.如权利要求1所述的表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株，其特征在于，所述的表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株，命名为rMDV-ALVGE，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.12010。
4.一种构建权利要求1所述的表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)构建马立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遗传操作系统
所述系统包含5个分别依次含有马立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因组1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位核苷酸序列的重组粘粒，其中所述的马立克氏病病毒弱毒疫苗814株全基因组序列的GeneBank登录号为JF742597，所述系统中的5个重组粘粒是通过将马立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因组1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位核苷酸序列与pCC1Fos载体连接后得到的，分别命名为p814-1、p814-2、p814-3、p814-4以及p814-5，其中p814-5包含马立克氏病病毒的US2基因，US2基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；
(2)含有CAG-ALVGE表达框架的重组突变粘粒p814-5US2ALVGE的构建
在步骤(1)构建得到的重组粘粒p814-5中的US2基因内部插入CAG-ALVGE表达框架并替换US2基因的第15至630位核苷酸得到含有CAG-ALVGE表达框架的重组突变粘粒p814-5US2ALVGE，CAG-ALVGE表达框架的结构为CMV增强子-鸡β-actin启动子-Gag基因-IRES2序列-Env基因-sv40PolyA；
(3)表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株的拯救
对得到的重组粘粒p814-1、p814-2、p814-3、p814-4以及p814-5US2ALVGE五个粘粒进行线性化处理，通过磷酸钙转染方法将五个粘粒共转染次代CEF，置于37℃培养箱中培养，转染4h后，弃掉细胞上清，用DMEM将细胞洗一遍；加入2ml甘油休克液，室温孵育2min；用DMEM洗涤3次后，加入含10％FBS的DMEM完全培养液培养，休克12h后，将细胞培养液换为含3％FBS、1％双抗的DMEM继续培养，转染4-5天后盲传2代可观察到细胞病变的出现，拯救出的重组病毒即为表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于含有CAG-ALVGE表达框架的重组突变粘粒p814-5US2ALVGE的构建，包括以下步骤：
(1)pKSKanccdB质粒的构建
以R1F和R1R为引物，从pDEST22中扩增得到attR1序列；以P6KanF和p6KanR为引物，从pMOD6中扩增得到卡那霉素抗性基因(Kan)；以ccdBR2F和ccdBR2R为引物，从pDEST22中扩增得到ccdB-attR2基因；分别纯化上述得到的3个DNA片段，并以此3个片段为模板，以R1F和ccdBR2R为引物，扩增得到attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架，将得到的attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架利用XbaI和HindIII酶切位点克隆入pBluescriptIIKS(+)载体，获得pKSKanccdB；
R1F：GCGTCTAGAGATGATGAAGATACCCCACCA(XbaI)
R1R：GTGTGCGTCGGGTGATGCTGCCAA
P6KanF：TTGGCAGCATCACCCGACGCACACATCTCAACCATCATCG
P6KanR：ATCTGGCTTTTAGTAAGCCGGATCCACCGAGCTCGAATTCGATGAA
ccdBR2F：GGATCCGGCTTACTAAAAGCCAGAT
ccdBR2R：GCGAAGCTTCGGCCATCAAACCACTTTGTACAAG(HindIII)
(2)带有Kan/ccdB抗性基因的重组突变粘粒p814-5US2KanccdB的构建
以US2hmL和US2hmR为引物从pKSKanccdB中扩增带有同源重组臂的attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架：
US2hmL：5’-ATCTAATTGGTAGCAAGTAGGTCTGTCGAATAACAGCTAATGACTACCGGGGGTGGGTCGAATCAAACAAGTTTGT-3’，
US2hmR：5’-TGGGTGTGCCCATAATCGCCAGAGCTGCAGACCTATTCCGTTTTGCCAAAGCGGCCATCAAACCACTTTGTACAAG-3’；
用Counter-SelectionBACModificationKit试剂盒将所扩增的片段克隆入p814-5中的US2基因中，替换814株基因组US2基因序列的第15-630位核苷酸序列，代之以attR1-Kan-ccdB-attR2表达框架，获得重组突变粘粒p814-5US2KanccdB；
(3)pENTR1入门载体的构建
将pENTR-gus质粒中的gus基因删除，替换为BglII-SalI-XbaI-NotI-EcoRI-KpnI-SmaI-SacI-HindIII-BamHI十个酶切位点，获得入门载体，命名为pENTR1；
(4)pCAGGS-ALVGE表达质粒的构建
以IRESF:5’-TTTATCGATGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGT-3’和IRESR:5’-TTTCCCGGGTGTGGCCATATTATCATCGTGTTTTTC-3’为引物，以pIRES2-EGFP为模板，扩增获得IRES2片段，克隆入pCAGGS载体，构建获得pCAGGS-IRES2；
用引物gag-F：5’-TTTGAGCTCGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGGTGA-3’和gag-R：5’-TTTGAGCTCCTATAAATTTGTCAAGCGGAGC-3’，以质粒pBluscriptII-JL093为模板，扩增获得gag基因；
用引物env-F：5’-TTTCCCGGGGCCACCATGGAAGCCGTCATAAAGGCATTTCTGACTGGGCACCC-3’和env-R：5’-TTTGAGCTCCTACAGTTGCTCCCTAATTCTA-3’，以质粒pBluscriptII-JL093为模板，扩增获得env基因；
将gag以及env的PCR产物分别经SacI单酶切和SmaI和XhoI双酶切后，克隆入pCAGGS-IRES2载体多克隆位点，构建得到pCAGGS-gag-IRES2-env，简称为pCAGGS-ALVGE，其中gag-IRES2-env基因位于CAG启动子下游，SV40PolyA上游，位于pCAGGS载体的1719-1736位核苷酸之间；
其中，质粒pBluscriptII-JL093是通过将ALV-J毒株的全基因组cDNA序列克隆入pBluescriptII载体得到的；
(5)ALVGE入门表达质粒pENTR1-ALVGE的构建
将步骤(4)构建的pCAGGS-ALVGE表达质粒用SalI和BamHI进行双酶切，酶切产物回收后获得ALVGE表达框架，将获得的ALVGE表达框架通过SalI和BamHI酶切位点克隆入pENTR1入门载体，获得ALVGE入门表达质粒pENTR1-ALVGE；
(6)含有ALVGE表达框架的重组突变粘粒p814-5US2ALVGE的构建
将步骤(5)构建的ALVGE入门表达质粒pENTR1-ALVGE与重组突变粘粒p814-5US2KanccdB利用LRClonaseTMIIEnzymeMix进行LR反应，使上述重组突变粘粒中的Kan-ccdB表达框架替换为pENTR1-ALVGE质粒中的CAG-ALVGE表达框架，从而获得在MDV基因组的US2基因中插入CAG-ALVGE表达框架的重组粘粒p814-5US2ALVGE。
6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的CAG-ALVGE表达框架的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。
7.权利要求1-3任一项所述的表达J亚群禽白血病病毒Gag和Env基因的重组鸡马立克氏病病毒疫苗株在制备预防和治疗鸡马立克氏病和禽白血病药物中的用途。
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