CN112111466B - 一种耐热h1n1亚型流感病毒突变株及其制备方法与应用 - Google Patents

一种耐热h1n1亚型流感病毒突变株及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种耐热H1N1亚型流感病毒突变株及其制备方法和应用，属分子生物学技术及微生物学领域。具体而言，涉及一种通过点突变来增强流感病毒热稳定性的方法及其应用。本发明利用RNA病毒的反向遗传操作技术，以H1N1亚型流感病毒非耐热PR8‑E株为母本株，依次将其HA蛋白的第2、91、158、252和516位氨基酸进行点突变，拯救并获得了流感病毒突变株rPR8‑HA‑N5。突变株有着与母本PR8‑E株相似的生长曲线、病毒增殖滴度和小鼠致病性，但突变株病毒的热稳定性得到了显著性增强。该方法为流感病毒的耐热改造提供了新的思路，在开发热稳定性好、方便保存、免疫原性优良的疫苗方面有广泛的前景。

Description

一种耐热H1N1亚型流感病毒突变株及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术及微生物学领域，具体而言，涉及一种耐热H1N1亚型流感病毒突变株及其制备方法与应用。
背景技术
流行性感冒是由流感病毒(Influenza virus)引起的以侵害呼吸系统为主的呼吸道疾病，在世界范围内广泛流行，严重威胁着公共卫生安全和养殖业的健康发展。流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)流感病毒属(Influenza Virus)成员，为分节段负链RNA、有囊膜病毒。病毒的基因组包含8个基因片段：PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS。按照血清型可将流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)和丁(D)四个型。按照血凝素(Hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)的结构和序列特性，可以将A型流感病毒分为18个HA亚型和11个NA亚型。由于流感病毒的RNA聚合酶蛋白在RNA合成过程中的矫正能力较弱，因此基因组的突变频率较高，以致发生抗原漂移。另外，流感基因组是分节段的，不同亚型的流感病毒在感染同一个细胞时会发生基因片段的重组，引发抗原转变，这两种情况的发生，都增加了流感的防控难度。
目前，尚无针对流感病毒的特效药，现有几种抗流感的药物，具有抑制病毒的能力，但都具有一定程度的毒副作用。接种流感疫苗被认为是预防和控制流感流行的最经济和行之有效的方法。世卫组织(WHO)早在1947年就建立起流感监测系统，通过流行病学调查和监测数据分析，预测下次流感季流行的毒株，及早为开发做好充分准备。现阶段国内外常用的流感疫苗包括：全病毒灭活疫苗、裂解疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗，在研疫苗包括：DNA疫苗、mRNA疫苗、重组载体疫苗、病毒样颗粒疫苗、通用疫苗等。其中，使用最为广泛的是全病毒灭活疫苗和减毒活疫苗。灭活疫苗的免疫原性强、有较长的免疫保护期、受母源抗体影响小。减毒活疫苗可引发较好的细胞免疫、产生免疫反应速度快。这些疫苗在流感防控中起到了重要作用。
疫苗的有效抗原成分是保证其免疫效果的关键。然而现有疫苗株的热稳定性普遍较差，此类疫苗需要严格的低温保藏和冷链运输，每年有大量的额外费用花费在疫苗的保藏和运输上。即便如此，由于使用、保存不当等问题导致疫苗免疫效力下降、甚至失效问题仍时有发生。据不完全统计，部分种类疫苗由于热稳定性差的原因，最终有近50％被废弃。因此，提升疫苗株的热稳定性，研发耐热疫苗，是新型疫苗研发的重要方向之一。
关于提升流感疫苗热稳定性的报道，大多是采用添加耐热保护剂的方式。例如，申请号为CN201510583080.2的专利文献“一种流感病毒亚单位疫苗保护剂及其应用”公开了以蔗糖、精氨酸、谷氨酸钠和基因重组人血白蛋白为主要成分的疫苗保护剂；申请号为CN201210489259.8的专利文献“禽流感血凝素抗原保护剂及提高胚液中禽流感血凝素稳定性的方法”公开了由甘氨酸、异亮氨酸、乳糖等组成的疫苗保护剂。反向遗传操作技术的快速发展使得对流感病毒进行点突变修饰、插入外源基因、基因片段交换等基因操作成为可能。关于流感病毒的反向遗传操作文献较多，但极少有涉及到对流感病毒进行点突变耐热改造方法的报道。
发明内容
本发明为解决上述技术问题提供一种耐热H1N1亚型流感病毒突变株及其制备方法与应用。
为了实现上述发明目的，本发明采用的方案如下：
一种耐热H1N1亚型流感病毒突变株rPR8-HA-N5，该耐热毒突变株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：V202043，保藏时间为2020年7月31日。
优选地，所述的耐热流感病毒突变株rPR8-HA-N5是以H1N1亚型流感病毒PR8-E株为母本株，在其HA基因中引入5个氨基酸突变：第2位的赖氨酸突变为谷氨酸，第91位的精氨酸突变为丝氨酸、第158位的赖氨酸突变为丙氨酸、第252位的赖氨酸突变为谷氨酸、第516位的赖氨酸突变为谷氨酸，得到所述耐热流感病毒突变株rPR8-HA-N5。所述耐热流感病毒突变株rPR8-HA-N5的HA蛋白基因序列为SEQ ID NO:1。
所述的耐热流感病毒突变株rPR8-HA-N5的制备方法，包括以下步骤：a.构建H1N1亚型流感病毒PR8-E株的8个基因转录质粒；b.将HA基因转录质粒的第2、91、158、252和516位氨基酸分别突变为谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸；c.将突变的HA基因转录质粒与其他7个基因转录质粒共同转染宿主细胞，获得重组流感病毒突变株。
所述的耐热流感病毒突变株rPR8-HA-N5在制备流感病毒耐热疫苗方面的应用。
本发明的有益效果是：
1)本发明以H1N1亚型流感病毒非耐热株PR8-E株的8个基因转录质粒为基础，将转录质粒中HA基因的第2、91、158、252和516位氨基酸分别突变为谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸，构建出突变的HA基因转录质粒，通过病毒拯救的方法，获得新的重组流感病毒株。生物学特性测定的结果表明，该突变株的耐热特性明显高于PR8-E母本株，而其他特性未发生显著改变，证实了本发明获得了一株耐热改造的、新的流感突变株。
2)相对于其他流感疫苗株，耐热改造后的疫苗株热稳定性更好，以其制备的疫苗在保存和运输过程可以不过分依赖低温和冷链运输设备，不需要添加耐热保护剂就可以延长疫苗的保质期，降低成本，同时有利于疫苗在高温地区和冷藏设备不足的地区进行大规模推广和应用。
附图说明
图1是流感病毒突变株的基因结构示意图。
图2是流感病毒突变株的HA热稳定性测定结果。
图3是流感病毒突变株的细胞增殖曲线。
图4是流感病毒突变株的小鼠致病性结果。
具体实施方式
以下结合附图和实施例进一步对本发明进行说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1H1N1亚型流感病毒突变株HA转录质粒的构建和病毒拯救
1.1突变的HA基因序列
以基因合成的方式获得三种突变的HA基因序列(HA-P5、HA-N5、HA-U5)(图1)。HA-P5的突变方案为53位的S突变为K、71位的N突变为K、159位的S突变为K、222位的N突变为R、228位的T突变为K。HA-N5的突变方案为2位的K突变为E、91位的R突变为S、158位的K突变为A、252位的K突变为E、516位的K突变为E。HA-U5的突变方案为53位的S突变为K、71位的N突变为K、158位的K突变为A、252位的K突变为E、516位的K突变为E。合成后的基因分别连接至克隆质粒上。
以含有合成基因的克隆质粒为模板，用高保真DNA聚合酶
Figure BDA0002704945770000041
GXL DNAPolymerase进行突变HA基因的扩增。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，利用DNA胶回收试剂盒进行特异性目的条带的回收，获得突变的HA基因片段。
1.2突变HA基因转录质粒的连接与鉴定
设计并合成一对PCR引物用于扩增转录质粒pPR8-HA中除HA基因以外的全部序列。通过引物延伸，分别在PCR产物两端引入部分HA基因序列，使该PCR产物能与突变的HA基因片段有可用于同源重组的一致序列。以琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，将PCR扩增条带以DNA纯化试剂盒进行纯化回收，获得PR8-E株HA基因转录质粒(除HA基因外)片段。
按照In-Fusion HD Cloning Kit说明书，将突变的HA基因片段和PR8-E株HA基因转录质粒(除HA基因外)片段进行In-fusion连接，并转化DH5α感受态细胞，涂布抗性LB平板，倒置培养16h后挑取单菌落进行PCR和测序鉴定，对鉴定为阳性的菌落进行扩大培养和质粒的提取，获得了PR8-E株的突变HA基因转录质粒pPR8-HA-P5(对照组)、pPR8-HA-N5(本发明)和pPR8-HA-U5(对照组)。
1.3突变株病毒的拯救
培养293T细胞至80-90％密度时，分别将突变HA基因转录质粒与PR8-E株的其余7个基因转录质粒(pPR8-PB2、pPR8-PB1、pPR8-PA、pPR8-NA、pPR8-NP、pPR8-M和pPR8-NS)共转染进入293T细胞。转染5-6h后，弃去上清，更换维持液(含1μg/ml TPCK处理胰酶的无血清DMEM培养基)。96-120h后，收集培养上清，用0.22μm的滤器过滤培养上清；然后接种9-10日龄SPF鸡胚，培养48-72h，收集病毒鸡胚尿囊液。通过PCR和测序分析验证尿囊液中病毒的点突变情况，结果表明突变毒株的突变位点与预期相符。获得了HA基因点突变的重组H1N1流感病毒株rPR8-HA-P5(对照组)、rPR8-HA-N5(本发明)和rPR8-HA-U5(对照组)。
实施例2
HA基因点突变的重组H1N1流感病毒株的热稳定性试验
将分别感染有3株流感病毒突变株的尿囊液，100μL/管，56℃水浴进行热处理，设置3个重复，分别于0、2、5、10、15、30、60、120、180min时取出病毒尿囊液，迅速置于冰上，检测病毒的血凝(HA)效价，统计效价变化情况，得到图2。如图2所示，rPR8-HA-P5株在热处理10min后，其HA效价已下降为0，rPR8-HA-U5在热处理30min后，其HA效价下降5log2，在热处理180min后，其HA效价下降4log2。而对照野生型PR8-E株在热处理30min后，其HA效价下降5log2。因此，与母本PR8-E株相比，三株突变病毒表现出完全不同的HA热稳定性，rPR8-HA-N5株的热稳定性显著提升、rPR8-HA-P5株的热稳定性显著下降，而rPR8-HA-U5的热稳定性未显著改变。因此，在3株突变株中，仅有rPR8-HA-N5株的热稳定性显著提升，比母本PR8-E株提升了约6倍。
实施例3
重组流感病毒rPR8-HA-N5株的增殖特性测定
为分析点突变是否对rPR8-HA-N5株的增殖滴度造成影响，比较了rPR8-HA-N5株与母本PR8-E株在鸡胚和细胞上的增殖情况。以鸡胚接种的方式增殖病毒，rPR8-HA-N5株和PR8-E株都可以达到28以上，鸡胚半数感染剂量分别为109.05和108.90EID50/ml。在细胞上的增殖滴度分别为107.78和107.86TCID50/ml。
进一步测定了rPR8-HA-N5和rPR8-E株的细胞生长曲线。以0.002MOI的剂量将病毒接种至已长为致密单层的293T细胞，孵育1h后弃去上清，PBS洗涤3遍，在感染后的6、12、24、48、72小时吸取培养液上清，进行病毒滴度的测定。具体测定方法为：将病毒液进行10-1到10-8的10倍梯度稀释，每个稀释度取100μl加入到含有单层293T细胞的96孔板中，每个稀释度进行5个重复；感染1小时后，弃去培养液，加入维持液(含1μg/ml TPCK处理胰酶的无血清DMEM培养基)，置37℃，5％CO2培养箱中培养，72h后观察细胞病变；根据细胞病变的孔数来计算每个时间点病毒的滴度。根据测得的病毒滴度和相应的培养时间点，得出点突变流感病毒的细胞生长曲线。结果如图3所示，rPR8-HA-N5和rPR8-E株有相似的的生长曲线，且最终的滴度也无显著差异。表明点突变未对rPR8-HA-N5的增殖滴度造成负面影响。
实施例4
重组流感病毒rPR8-HA-N5株的致病性分析
为分析点突变是否对rPR8-HA-N5株的致病性造成影响，测定了rPR8-HA-N5株与母本PR8-E株在对小鼠的致病性。4周龄小鼠分为3组，每组20只，分别为rPR8-HA-N5组、rPR8-E组和空白对照组，感染方式为肌肉注射，感染剂量为103.0EID50/只。每天观察小鼠的状态，记录死亡情况，并绘制动物的存活曲线。结果如图4所示，在感染后5-7天，3组小鼠均全部死亡，表明突变毒株rPR8-HA-N5具有与rPR8-E亲本株相似的致病性。
实施例5
重组流感病毒rPR8-HA-N5株的免疫原性分析
为分析点突变是否对rPR8-HA-N5的免疫原型造成影响，开展了rPR8-HA-N5株作为灭活疫苗在小鼠上的免疫效果试验。以β-丙内酯对感染有rPR8-HA-N5株的尿囊液进行灭活处理，与一定的免疫佐剂混合后，以肌肉注射的方式接种于小鼠(0.2ml/只)，设置PR8-E株对照组和空白对照组。两周后加免一次，二免后两周采血测定HI抗体水平。结果表明，除空白对照组外，其余两组均为HI抗体阳性。其中rPR8-HA-N5株的平均抗体为26.8，PR8-E组为26.1。因此，rPR8-HA-N5株对小鼠的免疫原性高于母本PR8-E株，可以作为流感耐热疫苗的候选株。
序列表
<110> 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 一种耐热H1N1亚型流感病毒突变株及其制备方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1698
<212> DNA
<213> 流感病毒(Influenza virus)
<400> 1
atggaggcaa acctactggt cctgttaagt gcacttgcag ctgcagatgc agacacaata 60
tgtataggct accatgcgaa caattcaacc gacactgttg acacagtact cgagaagaat 120
gtgacagtga cacactctgt taacctgctc gaagacagcc acaacggaaa actatgtaga 180
ttaaaaggaa tagccccact acaattgggg aaatgtaaca tcgccggatg gctcttggga 240
aacccagaat gcgacccact gcttccagtg agttcatggt cctacattgt agaaacacca 300
aactctgaga atggaatatg ttatccagga gatttcatcg actatgagga gctgagggag 360
caattgagct cagtgtcatc attcgaaaga ttcgaaatat ttcccaaaga aagctcatgg 420
cccaaccaca acacaaacgg agtaacggca gcatgctccc atgagggggc aagcagtttt 480
tacagaaatt tgctatggct gacggagaag gagggctcat acccaaagct gaaaaattct 540
tatgtgaaca aaaaagggaa agaagtcctt gtactgtggg gtattcatca cccgcctaac 600
agtaaggaac aacagaatat ctatcagaat gaaaatgctt atgtctctgt agtgacttca 660
aattataaca ggagatttac cccggaaata gcagaaagac ccaaagtaag agatcaagct 720
gggaggatga actattactg gaccttgcta gaacccggag acacaataat atttgaggca 780
aatggaaatc taatagcacc aatgtatgct ttcgcactga gtagaggctt tgggtccggc 840
atcatcacct caaacgcatc aatgcatgag tgtaacacga agtgtcaaac acccctggga 900
gctataaaca gcagtctccc ttaccagaat atacacccag tcacaatagg agagtgccca 960
aaatacgtca ggagtgccaa attgaggatg gttacaggac taaggaacac tccgtccatt 1020
caatccagag gtctatttgg agccattgcc ggttttattg aagggggatg gactggaatg 1080
atagatggat ggtatggtta tcatcatcag aatgaacagg gatcaggcta tgcagcggat 1140
caaaaaagca cacaaaatgc cattaacggg attacaaaca aggtgaacac tgttatcgag 1200
aaaatgaaca ttcaattcac agctgtgggt aaagaattca acaaattaga aaaaaggatg 1260
gaaaatttaa ataaaaaagt tgatgatgga tttctggaca tttggacata taatgcagaa 1320
ttgttagttc tactggaaaa tgaaaggact ctggatttcc atgactcaaa tgtgaagaat 1380
ctgtatgaga aagtaaaaag ccaattaaag aataatgcca aagaaatcgg aaatggatgt 1440
tttgagttct accacaagtg tgacaatgaa tgcatggaaa gtgtaagaaa tgggacttat 1500
gattatccca aatattcaga agagtcaaag ttgaacaggg aagaggtaga tggagtgaaa 1560
ttggaatcaa tggggatcta tcagattctg gcgatctact caactgtcgc cagttcactg 1620
gtgcttttgg tctccctggg ggcaatcagt ttctggatgt gttctaatgg atctttgcag 1680
tgcagaatat gcatctga 1698

Claims (5)

1.一种耐热H1N1亚型流感病毒突变株rPR8-HA-N5，所述病毒突变株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：V202043。
2.如权利要求1所述的流感病毒突变株rPR8-HA-N5，其特征在于，所述的流感病毒突变株rPR8-HA-N5是以H1N1亚型流感病毒PR8-E株为母本株，在其HA基因中引入5个氨基酸突变：第2位的赖氨酸突变为谷氨酸，第91位的精氨酸突变为丝氨酸、第158位的赖氨酸突变为丙氨酸、第252位的赖氨酸突变为谷氨酸、第516位的赖氨酸突变为谷氨酸，得到所述耐热流感病毒突变株rPR8-HA-N5。
3.如权利要求1所述的流感病毒突变株rPR8-HA-N5，其特征在于，所述流感病毒突变株rPR8-HA-N5的HA蛋白基因序列为SEQ ID NO:1。
4.如权利要求1至3任一项所述的流感病毒突变株rPR8-HA-N5的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a.构建H1N1亚型流感病毒PR8-E株的8个基因转录质粒；b.将HA基因转录质粒的第2、91、158、252和516位氨基酸分别突变为谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酸；c.将突变的HA基因转录质粒与其他7个基因转录质粒共同转染宿主细胞，获得重组流感病毒突变株rPR8-HA-N5。
5.如权利要求1至3任一项所述的流感病毒突变株rPR8-HA-N5在制备流感病毒耐热疫苗方面的应用。
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