CN113005100B - 一种改变囊膜病毒热稳定性的遗传改造方法及重组病毒与其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种改变囊膜病毒热稳定性的遗传改造方法及重组病毒与其应用。该方法包括如下步骤:比较囊膜病毒的多序列,得出显著影响待改造病毒株的吸附蛋白电荷值的氨基酸突变;分析所述氨基酸突变对吸附蛋白电荷的改变值,筛选其中可显著增加或减少吸附蛋白负电荷的氨基酸突变组合;运用病毒的遗传操作技术,在转录质粒水平对囊膜病毒进行突变改造,拯救并获得耐热改造的重组囊膜病毒。本发明首次以人工突变的方式显著改变了囊膜病毒的耐热特性。本发明可广泛应用于囊膜病毒疫苗株的耐热改造,在研发耐热、安全、高效的囊膜病毒疫苗方面具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术及微生物学领域,具体而言,涉及一种改变囊膜病毒热稳定性的遗传改造方法及其应用。更具体地,本发明涉及一种通过吸附蛋白基因的电荷相关氨酸组合突变以改变病毒热稳定性的遗传改造方法和耐热改造后的重组病毒以及改重组病毒在耐热疫苗制备方面的应用。
背景技术
囊膜是指包被在病毒外壳的、由蛋白质、多糖和脂类构成的类脂双层膜,也称包膜。被囊膜包裹的病毒统称为囊膜病毒。囊膜主要来源于宿主细胞膜(磷脂层和膜蛋白),也包含有一些病毒自身的糖蛋白。囊膜的主要功能是帮助病毒进入宿主细胞。自然界中,许多病毒都属于囊膜病毒,如新冠病毒、寨卡病毒、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、登革热病毒、狂犬病毒、人免疫缺陷病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、非洲猪瘟病毒、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒等。这些病毒给人类和动物健康造成严重威胁的同时,也影响到了全球经济和社会的发展。
疫苗是传染病防控的重要手段之一,全病毒灭活疫苗、弱毒活疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗、DNA疫苗等常规/新型疫苗在传染病防控中起到了重要作用。但是,绝大多数疫苗株存在耐热性能较差和冷藏条件要求高的问题,不能在室温下保存,必须依赖冷链系统在低温下保持活性。而疫苗冷链系统的建设和维护费用高昂。据统计,目前人类疫苗免疫计划的80%费用消耗在冷链的建设和维护上。全球免疫成本有14%至20%源自疫苗的低温储存需求。即使在冷链条件下,每年仍有17%-37%的疫苗因为运输和保存不当而面临失效风险。由此导致的免疫不完全或免疫失败现象普遍存在,这种情况在冷链系统不完善的发展中国家和热带地区国家显得尤为突出。因此,研发可常温保存的耐热疫苗是当前疫苗研发的重点方向之一。
在耐热疫苗研发方面以耐热冻干保护剂研究较为成熟。国外通过添加耐热冻干保护剂的方式已经使得大部分疫苗实现了2~8度保存。国内这方面研究起步相对较晚,仅有部分疫苗实现了2~8度保存。此外,筛选或改造耐热毒株也是耐热疫苗研发的方向之一,但由于自然界中具有优良耐热特性的弱毒株资源稀缺,导致此类研究相对滞后。仅有少数疫苗株具有耐热特性,如新城疫病毒V4株、TS09-C株等。
早在1966年,澳大利亚学者Simmons从8周龄有溃疡的鸡腺胃中分离到新城疫V4自然低毒耐热株。此后,研究人员一直致力于NDV V4株的耐热选育及其生物学特性的研究,相继有I-2、HB92、TS09-C株等新耐热株的研究报道。冻干的V4疫苗在27-32度保存14天后,病毒效价仅从1010.4下降至109.3每瓶。V4疫苗拌料后可在21-27度稳定保存至少三周。将I-2疫苗株与1%明胶混合,在22度保存12周后,仍具有较好的免疫保护效力。新城疫耐热疫苗在冷链系统不完善的发展中国家和热带地区国家得到了广泛应用。对这一优良的耐热毒株资源进行发掘与利用,探究其耐热机理,用于改造其他非耐热疫苗株,将对疫苗研发产生深远的影响。
关于提升疫苗热稳定性的报道,大多是采用添加耐热保护剂的方式。例如,申请号为CN201510583080.2的专利文献“一种流感病毒亚单位疫苗保护剂及其应用”公开了以蔗糖、精氨酸、谷氨酸钠和基因重组人血白蛋白为主要成分的疫苗保护剂;申请号为CN201210489259.8的专利文献“禽流感血凝素抗原保护剂及提高胚液中禽流感血凝素稳定性的方法”公开了由甘氨酸、异亮氨酸、乳糖等组成的疫苗保护剂。病毒遗传操作技术的快速发展使得对囊膜病毒进行点突变修饰、插入外源基因、基因片段交换等基因操作成为可能。申请号为201210090099.4的专利文献“新城疫病毒耐热或疫苗载体系统及其应用”公开了新城疫病毒耐热活疫苗载体系统和通过HN基因交换改造病毒热稳定性的方法。
所有的蛋白具有电荷属性,其电荷性质与蛋白溶液的pH值和蛋白自身的等电点(pI)有关。当蛋白溶液的pH值大于pI,蛋白带负电荷,反之则带正电荷。pI值是由蛋白的带电荷氨基酸的组成决定的。带电荷氨基酸共有7个,分为两类。带负电荷氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和酪氨酸,带正电荷氨基酸有赖氨酸、精氨酸和组氨酸。这些氨基酸在蛋白质中所占的比例决定了蛋白质的pI值,也就决定了在固定pH值下的蛋白电荷情况。蛋白的电荷性质与许多生化过程有关,如蛋白的折叠、与细胞膜、细胞质和细胞核等的结合、亚细胞定位等。许多蛋白的浓缩也是利用了蛋白的电荷性质进行的。但是,未见关于蛋白电荷性质与病毒热稳定性关系的研究报道。
发明内容
本发明为解决上述技术问题提供一种提升囊膜病毒热稳定性的遗传改造方法及重组病毒与其应用。
为了实现上述发明目的,本发明采用的方案如下:
一种改变囊膜病毒热稳定性的遗传改造方法,包括如下步骤:比较囊膜病毒的至少一株耐热株、至少一株非耐热株与待改造病毒株的吸附蛋白氨基酸序列,得出所述至少一株耐热株和至少一株非耐热株的N个位点相较于待改造病毒株的相同位点具有可影响蛋白电荷值的氨基酸突变;
分析所述N个位点的氨基酸突变对吸附蛋白电荷的改变值ΔCh,筛选出改变值ΔCh>0.04和ΔCh<-0.04的M个位点的氨基酸突变;
从M个位点的氨基酸突变中选取ΔCh<-0.04的P个氨基酸突变的位点和/或从M个位点的氨基酸突变中选取ΔCh>0.04的Q个氨基酸突变;
从所述P个氨基酸突变的位点中任意选择三个或三个以上的氨基酸突变位点和/或从所述Q个氨基酸突变的位点中任意选择三个或三个以上的氨基酸突变位点,以待改造的吸附蛋白转录质粒为模板,对其包含的所述三个或三个以上的每个氨基酸进行氨基酸突变,获得改造的吸附蛋白基因的转录质粒;
将改造后的吸附蛋白基因的转录质粒进行囊膜病毒的拯救。
优选地,对所述从P个氨基酸突变的位点中选择的三个或三个以上的每个位点氨基酸进行氨基酸突变的原则为:当位点氨基酸为带正电荷氨基酸时,将其突变为不带电荷氨基酸或带负电荷氨基酸;当位点氨基酸为不带电氨基酸时,将其突变为带负电荷氨基酸;对所述从Q个氨基酸突变的位点中选择的三个或三个以上的每个位点氨基酸进行氨基酸突变的原则为:当位点氨基酸为带负电荷氨基酸时,将其突变为不带电荷氨基酸或带正电荷氨基酸;当位点氨基酸为不带电氨基酸时,将其突变为带正电荷氨基酸。
优选地,所述带负电荷氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。
优选地,所述带正电荷氨基酸为赖氨酸和精氨酸。
优选地,所述的任意选择三个或三个以上的氨基酸突变位点对吸附蛋白电荷改变值ΔCH<-3.0或者ΔCH>3.0。
优选地,所述的囊膜病毒为新城疫病毒、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、SARS冠状病毒、登革热病毒、狂犬病毒、人免疫缺陷病毒或鸡传染性支气管炎病毒。
优选地,所述的吸附蛋白基因为血凝素-神经氨酸酶基因、血凝素基因、囊膜糖蛋白基因或突触蛋白基因。
优选地,所述囊膜糖蛋白基因为E、GP、G或gp120。
所述的遗传改造方法得到的重组病毒。
所述的重组病毒在热稳定性疫苗制备方面的应用。
本发明的有益效果是:
1)本发明以囊膜病毒的全基因组质粒为基础,对其吸附蛋白基因进行电荷相关氨基酸组合突变,以显著改变其电荷值,通过病毒拯救,获得新的病毒突变株。耐热试验结果表明,病毒突变株的耐热特性明显高于或显著低于母本毒株,证实了本发明可以显著改变囊膜病毒的热稳定性。
2)相对于常规的囊膜病毒株,耐热改造后的囊膜病毒热稳定性更好,以其制备的活疫苗在保存和运输过程可以不过分依赖低温和冷链运输设备,不需要添加耐热保护剂就可以延长疫苗的保质期,降低成本,同时有利于疫苗在高温地区和冷藏设备不足的地区进行大规模推广和应用。同样,也可以通过本发明的改造方法,实现改造后疫苗株的热稳定性降低,减弱其在免疫动物体内的存活能力,可降低其毒力,用于开发冷适应弱毒疫苗株。
3)受宿主、环境等压力的影响,囊膜病毒的吸附蛋白具有较大的变异性,其普遍存在一定数量的电荷相关氨基酸突变,这类突变未对蛋白的结构和功能造成显著影响。因此,这为本发明选取电荷相关的氨基酸突变提供了大量素材,可以从中挑选优化的电荷氨基酸突变进行病毒的热稳定性改造,也进一步表明了本发明可以适用于大多数囊膜病毒。
附图说明
图1为新城疫病毒耐热株与非耐热株的吸附蛋白序列比对。
图2为电荷相关氨基酸突变对新城疫病毒吸附蛋白电荷值的影响分析。
图3为新城疫病毒TS09-C耐热株的耐热改造。
图4为四种类型电荷相关氨基酸突变对新城疫病毒热稳定性的影响分析。
图5为新城疫病毒LaSota非耐热株的耐热改造。
图6为流感病毒耐热株与非耐热株的吸附蛋白序列比对。
图7为流感病毒PR8-E株的耐热改造示意图。
图8为流感病毒PR8-E耐热改造后的热稳定性测定。
具体实施方式
以下结合附图和实施例进一步对本发明进行说明,但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
本实施例提供一种提升新城疫病毒热稳定性的遗传改造方法,包括如下步骤:
S101:
比较新城疫病毒的3株耐热株、4株非耐热株和待改造病毒株TS09-C的HN蛋白氨基酸序列;所述3株耐热株为V4,I-2,Ulster株,所述4株非耐热株为LaSota,Mukteswwar,HB1103,HN1107株;
如图1所示,所述3株耐热株和4株非耐热株一共有85个位点相较于TS09-C株的相同位点具有氨基酸突变。但是由于耐热株和非耐热株的85个位点中有42个位点的突变不会改变吸附蛋白的电荷值,故排除,仅选择剩余的N为43个会影响HN蛋白电荷的突变位点。
S102:分析所述剩余的43个突变位点的每个氨基酸突变对TS09-C株吸附蛋白电荷的改变值ΔCh,如图2所示,有29个氨基酸突变显著影响到了HN蛋白的电荷值,其改变值ΔCh>0.04或ΔCh<-0.04,其余14个氨基酸突变影响值过小。
S103:从这29个位点中筛选出ΔCh<-0.04的10个氨基酸突变位点;以及ΔCh>0.04的19个氨基酸突变位点。
S104:
从所述耐热株的10个氨基酸突变的位点中任意选择三个或三个以上的氨基酸突变位点,以被改造的吸附蛋白,即TS09-C株的HN蛋白的转录质粒为模板,对其包含的所述三个或四个以上的每个氨基酸进行氨基酸突变,获得改造的吸附蛋白的基因组质粒;通过该改造的吸附蛋白的基因组质粒拯救出的病毒的热稳定性得到提高;
下面结合图3说明具体的突变方案。如图3所示,HN-N3是从10个氨基酸的突变位点中选择的3个位点进行突变,突变方案为A145D、R197I和K495E,改造的HN基因组质粒为pTS-HN-N3。与母本TS09-C株相比,其改造后的吸附蛋白HN的ΔCH为-4.0,小于-3.0。
并且,从所述非耐热株的19个氨基酸突变的位点中任意选择三个或三个以上的氨基酸突变位点,以被改造的吸附蛋白,即TS09-C株的HN蛋白的转录质粒为模板,对其包含的所述三个或四个以上的每个氨基酸进行氨基酸突变,获得改造的吸附蛋白的基因组质粒;通过该改造的吸附蛋白的基因组质粒拯救出的病毒的热稳定性得到降低。
如图3所示,HN-P4和HN-P11是从19个氨基酸的突变位点中分别选择的4个位点和11个位点进行突变。突变方案为HN-P4为A62R、N98K、E293K和D494G;HN-P11为E24R、E49G、A62R、N98K、G122R、D147G、N263K、S269R、E293K、Q353R和D494G。改造的HN基因组质粒分别为pTS-HN-P4和pTS-HN-P11。与母本TS09-C株相比,其改造后的吸附蛋白HN的ΔCH分别为4.9和12.9。此处的ΔCH大于3.0。
继续结合图3,作为对照,HN-P2A和HN-P2B是均从19个氨基酸的突变位点中均选择的2个位点进行突变。突变方案为HN-P2A为A62R和N98K,HN-P2B为E293K和D494G。改造的HN基因组质粒分别为pTS-HN-P2A和pTS-HN-P2B。与母本TS09-C株相比,其改造后的吸附蛋白HN的ΔCH分别为1.9、2.9。
步骤S104中病毒具体的构建方法参照如下步骤:
1)突变的HN基因序列
将突变的HN基因序列送至公司合成,以含有突变HN序列的T载体为模板,设计特异性引物:上游引物5’-ATGATGAAAGAGAGGCAAAAAATACATGG-3’,下游引物5’-CTGCTTGAACTCACTCGAGTAATGCG-3’(下划线部分为用于Infusion克隆连接的同源序列)。以高保真DNA聚合酶GXL DNA Polymerase进行改造HN基因的扩增。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,利用DNA胶回收试剂盒进行特异性目的条带的回收,获得突变的HN基因片段。
2)TS09-C转录质粒线性化
设计并合成与一对PCR引物用于扩增TS09-C转录质粒(GenBank登录号:JX110635)中除HN基因以外全部序列(引物5’端引入一段同源序列,使改造的HN基因扩增产物与线性化克隆载体之间具有能够互相同源重组的完全一致的序列):上游引物5’-AGTGAGTTCAAGCAGTACCAAAGCAGCATACAC-3’,下游引物5’-CCTCTCTTTCATCATTCTCTAACGCAACTTGGCTA-3’(下划线部分为用于Infusion克隆连接的同源序列)。PCR反应体系由5×PrimeSTAR GXLBuffer,dNTP Mixture(2.5mM each),上下游Primer(0.2-0.3μM),PrimeSTAR GXLDNAPolymerase,H2O和模板组成。PCR扩增条件为98℃10sec,60℃15sec,68℃1min/kb,35Cycles。以琼脂糖凝胶电泳检测目的条带,将PCR扩增条带以DNA纯化试剂盒进行纯化回收,获得TS09-C株转录质粒(除HN基因)线性化产物。
3)突变株转录质粒的连接与鉴定
按照In-Fusion HD Cloning Kit说明书,将突变的HN基因片段和TS09-C株转录质粒线性化片段进行In-fusion连接,并转化DH5α感受态细胞,涂布抗性LB平板,倒置培养16h后挑取单菌落进行PCR鉴定,对阳性菌落进行扩大培养和质粒的提取。
4)突变株转录质粒的酶切鉴定
将鉴定为阳性的转录质粒用Bam HI限制性内切酶进行酶切鉴定,琼脂糖凝胶电泳检测条带均与预期一致。转录质粒送公司测序分析,表明成功构建了含有突变HN基因的转录质粒。
S105:将改造后的吸附蛋白基因的转录质粒进行囊膜病毒的拯救,具体步骤如下:
转染前一天将生长状态良好的BHK-21细胞转至6孔板,保证转染当天细胞密度达到80%左右,HBSS清洗细胞三次后,更换含有2%血清的DMEM培养基,同时加入0.01MOI的痘病毒,37℃孵育1h。利用Lipofectamine 3000转染试剂将突变的转录质粒和分别表达NP、P、L蛋白的三个辅助质粒共转染至BHK-21细胞,质粒的量分别为1.25μg,0.313μg,0.313μg,0.625μg。转染6h后,HBSS清洗细胞三次,更换含有0.4μg/mL TPCK胰酶、2%青链霉素双抗的DMEM,观察细胞病变情况,待细胞出现明显病变并脱落时,反复冻融三次,采用0.22μm孔径的滤器过滤除去痘病毒,在9-11日龄SPF鸡胚中传代3次,采用HA效价检测和RT-PCR测序方法鉴定新城疫病毒。鉴定正确的新城疫病毒突变株既可用于后续研究。
同时,开展了上述5株新城疫病毒突变株的热稳定性测定。将感染有新城疫病毒突变株的尿囊液分装至EP管,100μL/管,56℃水浴进行热处理,设置3个重复,分别于0、2、5、10、15、30、60、120、180min时取出病毒尿囊液,迅速置于冰上,测定病毒的TCID50,绘制感染力耐热曲线,计算出T90值。结果如图3所示,5株突变病毒rTS-HN-P2A、rTS-HN-P2B、rTS-HN-P4、rTS-HN-P11和rTS-HN-N3的T90值分别为9.4、8.9、4.3、1.5和23.3min,而野生型TS09-C株的T90值为12.7。TS09-C株的热稳定性随着HN蛋白电荷情况的改变而改变,HN蛋白的负电荷越低,病毒的热稳定性越差,反之则越稳定。只改变两个氨基酸位点(rTS-HN-P2A和rTS-HN-P2B),对HN蛋白的电荷影响较小(ΔCH<3.0),导致病毒热稳定性改变不显著。当对新城疫病毒突变3个以上氨基酸时,例如rTS-HN-N3,其ΔCH为-4.0,是小于<-3.0,其病毒的热稳定性得到显著提高;而rTS-HN-P4和rTS-HN-P1,其ΔCH分别为4.9和12.9,其ΔCH大于3.0,其病毒的热稳定性得到显著降低。结果证实通过电荷相关氨基酸点突变的方式,显著增加或减少吸附蛋白的负电荷,可以分别提高或降低病毒的热稳定性。
为了分析电荷相关氨基酸突变是否对病毒的其他生物学特性造成了影响,测定了上述3个突变病毒株的致病性、复制能力等生物学特性。结果表明,3株突变病毒株有着与亲本株相近的细胞(TCID50)和鸡胚(EID50)增殖滴度、相近的鸡胚致病力(MDT/MLD)。因此,HN蛋白的电荷相关氨基酸突变未对病毒的致病、复制等特性造成显著影响。
可以理解的是,带正电荷氨基酸优选赖氨酸和精氨酸进行突变;带负电荷氨基酸优选半胱氨酸和酪氨酸进行突变。
对比例1
通过比较3株耐热株、4株非耐热株和待改造病毒株TS09-C的HN蛋白氨基酸序列;所述3株耐热株为V4,I-2,Ulster株,所述4株非耐热株为LaSota,Mukteswwar,HB1103,HN1107株;如图1所示,相较于TS09-C株,3株耐热株和4株非耐热株共有85个氨基酸位点突变。通过随机组合的方式,拯救获得了5株重组新城疫病毒,其HN基因突变方案分别为(Q8K、T102I、R225H)、(R3S、Q8K、T102I、R225H、P351S)、(R3S、Q8K、P60S、T102I、R225H、M250L、P351S)、(D13E、A145T、E293G)和(D13E、A145T、E293G、D309N、N310S)。耐热测定结果表明,与母本TS09-C株相比,5株重组新城疫病毒的耐热特性未发生明显改变。结果表明,在85个氨基酸突变中,通过随机组合突变的方式未能实现改变病毒的热稳定性。
实施例2
如图4所示,本实施例与实施例1大致相同,不同之处在于选择步骤S103中10个氨基酸突变的位点的其他四个位点,得到两种不同突变方案,利用相同方法构建和拯救的突变病毒rTS-HN-UN4和rTS-HN-PU4。同时,选择步骤S103中19个氨基酸突变的位点的其他四个位点,得到两种不同突变方案,利用相同方法构建和拯救的突变病毒rTS-HN-UP4和rTS-HN-NU4。rTS-HN-UN4的突变方式为四个位点均由不带电氨基酸突变为带负电氨基酸,rTS-HN-PU4的突变方式为四个位点均由带正电氨基酸突变为不带电氨基酸。此外,rTS-HN-UP4的突变方式为四个位点均由不带电氨基酸突变为带正电氨基酸,而rTS-HN-NU4的突变方式为四个位点均由带负电氨基酸突变为不带电氨基酸。点突变新城疫病毒的热稳定性测定结果表明,四种基本的电荷相关氨基酸突变均对病毒的热稳定性造成了显著影响(图6)。其中,rTS-HN-UN4和rTS-HN-PU4的热稳定性得到显著提高,而rTS-HN-UP4和rTS-HN-NU4的稳定性得到显著降低。其进一步证实了HN蛋白电荷的改变与病毒热稳定性之间的关系。可以理解的是,本实施例也可以针对同一个待改造株的四个位点选用不同突变方式的组合。
实施例3
新城疫病毒LaSota株的耐热改造
新城疫病毒LaSota株作为制备低毒力活疫苗的经典毒株,在全球范围内得到了大范围的推广应用,为新城疫的防控做出了重要贡献。然而由于该毒株的热稳定性较差,属于非耐热毒株,因此,以该毒株制备的活疫苗需要冷链系统进行保藏与运输,增加了免疫成本和疫苗失效的风险。应用本发明的方法对LaSota株进行耐热改造及效果测试。
按照实施例1相同的方法,比较新城疫病毒的4株耐热株、3株非耐热株和待改造病毒LaSota株的HN蛋白氨基酸;所述4株耐热株为V4、I-2、Ulster、TS09-C株,所述3株非耐热株为Mukteswar、HB1103和HN1107株;
所述4株耐热株和3株非耐热株一共有85个位点相较于LaSota株的相同位点具有氨基酸突变。但是由于耐热株和非耐热株的85个位点中有42个位点的突变不会改变吸附蛋白的电荷值,故排除,仅选择剩余的N为43个会影响HN蛋白电荷的突变位点。
分析所述剩余的43个突变位点的每个氨基酸突变对LaSota株HN蛋白电荷的改变值ΔCh,有29个突变位点显著影响到了LaSota株HN蛋白的电荷值,其改变值ΔCh>0.04或ΔCh<-0.04,其余14个氨基酸突变影响值过小。
从这29个位点中筛选出ΔCh<-0.04的15个氨基酸位点(R3S、G49E、R62A、K98N、A145D、R197I、R269S、G276D、G293E、S310D、R353Q、N445D、G494D、V495E、R513H),从中分别选取5个位点和10个位点进行耐热改造,具体突变方案如下:HN-N5为G49E、R269S、G293E、R353Q和G494D;HN-N10为G49E、R62A、K98N、A145D、R269S、G293E、R353Q、N445D、G494D和V495E。通过突变HN基因的合成、突变转录质粒的构建及病毒的拯救等一系列过程,获得了重组病毒rLS-HN-N5和rLS-HN-N10(图5)。
耐热改造LaSota株的生物学特性研究
测定了2个LaSota突变株的热稳定性。结果如图5所示,rLS-HN-N5和rLS-HN-N10株的HN蛋白电荷分别为-9.2和-14.2,对照LaSota株的为-4.2;与LaSota株相比,其改造后的HN蛋白ΔCH分别为-5.0和-10.0。rLS-HN-N5、rLS-HN-N10和LaSota株的T90值分别为2.5、9.3和1.5。结果表明,LaSota非耐热株的热稳定性也受到HN蛋白电荷调控,通过增加HN蛋白的负电荷,可以显著提升病毒的热稳定性,两者呈现正相关。同样,HN蛋白的电荷相关氨基酸突变未对LaSota株的致病、复制等特性造成显著影响。因此,本发明成功将非耐热LaSota株改造为耐热病毒株。
耐热改造LaSota株的免疫原性研究
测定了耐热改造最佳的rLS-HN-N10株对鸡的免疫原性。以滴鼻点眼的方式接种两周龄SPF雏鸡,剂量为106.0EID50/只,同时设置两个对照组,分别为母本LaSota组和空白组。免疫两周后经翅静脉采血,分离血清,测定其血凝抑制抗体水平。结果表明,除空白对照组外,其余两组均为HI抗体阳性。其中LaSota组的平均抗体水平为27.2,rLS-HN-N10组的平均抗体水平为27.4。因此,rLS-HN-N10株对鸡的免疫原性略高于母本LaSota株,可以作为新城疫耐热活疫苗的候选毒株。
实施例5
流感病毒PR8-E株的耐热改造
除新城疫病毒外,本实施例还选取了H1N1亚型流感病毒PR8-E株进行了耐热改造,该毒株是经典的鸡胚适应株,具有较高的鸡胚增殖滴度,其作为病毒骨架,广泛应用在抗禽流感、人流感的新型疫苗研发中。因此,提升该毒株的热稳定性,有利于开发新型的流感耐热疫苗。
流感病毒PR8-E株的电荷相关氨基酸位点筛选
在NCBI中选取了两个H1N1亚型流感病毒株SC18和FAV09株,分别代表了耐热株(HA蛋白的电荷值为-14.1)和非耐热株(HA蛋白的电荷值为-4.8),PR8-E株也属于耐热株(HA蛋白的电荷值为-8.2)。对这三个毒株的HA蛋白序列进行了比对分析(图6)。结果发现共有93个氨基酸突变,其中有46个突变影响到了HA蛋白的电荷值。进一步分析发现有41个氨基酸突变显著影响到了HA蛋白的电荷值(ΔCh>0.04或ΔCh<-0.04)。其中有16个氨基酸突变对HA蛋白电荷值的影响范围为ΔCh<-0.04,从中挑选了5个突变用于PR8-E株的耐热改造(HA-N5,具体的突变氨基酸位置见图7);剩余有25个氨基酸突变对HA蛋白电荷值的影响范围为ΔCh>0.04,从中选5个氨基酸突变组合用于PR8-E的改造(HA-P5,具体突变位置见图7)。构建了2个突变流感病毒株,分别为rPR8-HA-N5和rPR8-HA-P5。rPR8-HA-P5和rPR8-HA-N5株的HA蛋白电荷变化值ΔCH分别为5.0和-6.9。
流感病毒PR8-E株耐热改造毒株的构建与拯救
以基因合成的方式获得突变的HA基因序列。合成后的基因分别连接至克隆质粒上。以含有合成基因的克隆质粒为模板,用高保真DNA聚合酶GXL DNAPolymerase进行突变HA基因的扩增。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,利用DNA胶回收试剂盒进行特异性目的条带的回收,获得突变的HA基因片段。
设计并合成与一对PCR引物用于扩增PR8-E株HA基因转录质粒pPR8-HA中除HA基因以外的全部序列。通过引物延伸,分别在PCR产物两端引入部分HA基因序列,使该PCR产物能与突变的HA基因片段有可用于同源重组的一致序列。以琼脂糖凝胶电泳检测目的条带,将PCR扩增条带以DNA纯化试剂盒进行纯化回收,获得PR8-E株HA基因转录质粒(除HA基因外)片段。
按照In-Fusion HD Cloning Kit说明书,将突变的HA基因片段和PR8-E株HA基因转录质粒(除HA基因外)片段进行In-fusion连接,并转化DH5α感受态细胞,涂布抗性LB平板,倒置培养16h后挑取单菌落进行PCR和测序鉴定,对鉴定为阳性的菌落进行扩大培养和质粒的提取,获得了PR8-E株的突变HA基因转录质粒。
培养293T细胞至80-90%密度时,分别将突变HA基因转录质粒与PR8-E株的其余7个基因转录质粒(pPR8-PB2、pPR8-PB1、pPR8-PA、pPR8-NA、pPR8-NP、pPR8-M和pPR8-NS)共转染进入293T细胞。转染5-6h后,弃去上清,更换维持液(含1μg/ml TPCK处理胰酶的无血清DMEM培养基)。96-120h后,收集培养上清,用0.22μm的滤器过滤培养上清;然后在接种于9-10日龄SPF鸡胚尿囊腔,培养48-72h,收集病毒鸡胚尿囊液。通过PCR和测序分析验证尿囊液中病毒的点突变情况,结果表明突变毒株的突变位点与预期相符。获得了HA基因点突变的重组H1N1流感病毒株rPR8-HA-P5和rPR8-HA-N5。
耐热改造PR8-E株的生物学特性研究
测定了2个PR8-E突变株的热稳定性。与PR8-E对照株相比,rPR8-HA-P5和rPR8-HA-N5株的HA蛋白电荷变化值ΔCH分别为5.0和-6.9。这两个毒株的感染力耐热性测定结果如图8所示,三个毒株的热稳定性排序为rPR8-HA-N5>PR8-E>rPR8-HA-P5。结果表明,流感病毒的热稳定性也受到其吸附蛋白HA的电荷性质的调控。rPR8-HA-P5的热稳定性降低,而rPR8-HA-N5的热稳定性提高。同样,HA蛋白的电荷相关氨基酸突变未对PR8-E株的致病、复制等特性造成显著影响。因此,本发明成功改变了PR8-E株的热稳定性。
耐热改造PR8-E株的免疫原性研究
为分析点突变是否对rPR8-HA-N5的免疫原型造成影响,开展了rPR8-HA-N5株作为灭活疫苗在小鼠上的免疫效果试验。以β-丙内酯对感染有rPR8-HA-N5株的尿囊液进行灭活处理,与一定的免疫佐剂混合后,以肌肉注射的方式接种于小鼠(0.2ml/只),设置PR8-E株对照组和空白对照组。两周后加免一次,二免后两周采血测定HI抗体水平。结果表明,除空白对照组外,其余两组均为HI抗体阳性。其中rPR8-HA-N5株的平均抗体为26.8,PR8-E组为26.1。因此,rPR8-HA-N5株对小鼠的免疫原性高于母本PR8-E株,可以作为流感耐热疫苗的候选株。
需要说明的是,本发明所述的囊膜病毒并不局限于实施例中的新城疫病毒、流感病毒,还可以适用于麻疹病毒、腮腺炎病毒、SARS冠状病毒、登革热病毒、狂犬病毒、人免疫缺陷病毒或鸡传染性支气管炎病毒等其它囊膜病毒。
Claims (6)
1.一种改变囊膜病毒热稳定性的遗传改造方法,其特征在于,包括如下步骤:比较囊膜病毒的至少一株耐热株、至少一株非耐热株与待改造病毒株的吸附蛋白氨基酸序列,得出所述至少一株耐热株和至少一株非耐热株的N个位点相较于待改造病毒株的相同位点具有可影响蛋白电荷值的氨基酸突变;
分析所述N个位点的氨基酸突变对吸附蛋白电荷的改变值ΔCh,筛选出改变值ΔCh>0.04和ΔCh< -0.04的 M个位点的氨基酸突变;
从M个位点的氨基酸突变中选取ΔCh<-0.04的P个氨基酸突变的位点;从所述P个氨基酸突变的位点中任意选择三个或三个以上的氨基酸突变位点,所述三个或三个以上的氨基酸突变位点对吸附蛋白电荷改变值ΔCH<-3.0;以待改造的吸附蛋白转录质粒为模板,对其包含的所述三个或三个以上的每个氨基酸进行氨基酸突变,获得改造的吸附蛋白基因的转录质粒,将改造后的吸附蛋白基因的转录质粒进行囊膜病毒的拯救,可提高囊膜病毒热稳定性;
其中,对所述从P个氨基酸突变的位点中选择的三个或三个以上的每个位点氨基酸进行氨基酸突变的原则为:当位点氨基酸为带正电荷氨基酸时,将其突变为不带电荷氨基酸或带负电荷氨基酸;当位点氨基酸为不带电氨基酸时,将其突变为带负电荷氨基酸;
或从M个位点的氨基酸突变中选取ΔCh> 0.04的Q个氨基酸突变;从所述Q个氨基酸突变的位点中任意选择三个或三个以上的氨基酸突变位点,所述三个或三个以上的氨基酸突变位点对吸附蛋白电荷改变值ΔCH>3.0;以待改造的吸附蛋白转录质粒为模板,对其包含的所述三个或三个以上的每个氨基酸进行氨基酸突变,获得改造的吸附蛋白基因的转录质粒,将改造后的吸附蛋白基因的转录质粒进行囊膜病毒的拯救,可降低囊膜病毒热稳定性;
其中,对所述从Q个氨基酸突变的位点中选择的三个或三个以上的每个位点氨基酸进行氨基酸突变的原则为:当位点氨基酸为带负电荷氨基酸时,将其突变为不带电荷氨基酸或带正电荷氨基酸;当位点氨基酸为不带电氨基酸时,将其突变为带正电荷氨基酸。
2.如权利要求1所述的遗传改造方法,其特征在于,所述带负电荷氨基酸为天冬氨酸或谷氨酸。
3.如权利要求1所述的遗传改造方法,其特征在于,所述带正电荷氨基酸为赖氨酸和精氨酸。
4.如权利要求1所述的遗传改造方法,其特征在于,所述的囊膜病毒为新城疫病毒、流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、SARS冠状病毒、登革热病毒、狂犬病毒、人免疫缺陷病毒或鸡传染性支气管炎病毒。
5.如权利要求1所述的遗传改造方法,其特征在于,所述的吸附蛋白基因为血凝素-神经氨酸酶基因、血凝素基因、囊膜糖蛋白基因或突触蛋白基因。
6.如权利要求5所述的遗传改造方法,其特征在于,所述囊膜糖蛋白基因为E、GP、G或gp120。
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