CN114381440B - 一组基于同义突变和/或缺失突变的a型流感病毒致弱毒株及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一组基于同义突变和/或缺失突变的A型流感病毒致弱毒株及其制备方法和应用。本发明所述致弱毒株通过对M2基因进行修饰获得;所述修饰包括对A型流感病毒M基因中M2基因和M1基因重叠的部分进行同义突变,保证M1氨基酸序列的完整和不变;或,所述修饰包括在对A型流感病毒M基因中M2基因和M1基因重叠的部分进行同义突变,保证M1氨基酸序列的完整和不变的同时,在M2基因删除部分核苷酸序列。本发明所述致弱毒株稳定性强,多次传代不会发生回复突变,安全性高,对细胞系的依赖不强,在疫苗生产过程中具有较强的优势。
Description
技术领域
本发明涉及病毒致弱技术领域,具体涉及一组基于同义突变和/或缺失突变的A型流感病毒致弱毒株及其制备方法和应用。
背景技术
流感是一种常见的急性呼吸道传染病,由流感病毒引起。尽管目前的治疗措施和流感疫苗接种已经较为普遍,但每年流感季节性流行严重威胁人群健康。接种疫苗是预防流感的主要手段,现有流感疫苗主要包括灭活疫苗和减毒疫苗,但都存在很大不足。
灭活苗一般是当季流行病毒与快速复制毒株一起按比例接种鸡胚培养,由于流感病毒遗传漂变,导致流感灭活疫苗每年度需要根据当季流行的毒株进行毒种更新,否则就面临保护力严重下降的问题。这就导致疫苗的生产难度加大、供应量有限。减毒毒株可以用细胞生产,生产难度更低,效率会大大提高,目前主要的流感减毒疫苗是温度敏感性减毒毒株,在25~33℃时可高效复制,但在37~39℃时则复制受限。这类减毒疫苗则面临着保护力不稳定的缺陷,有报道显示在不同年份提供的保护力差异从18~80%不等。因此,急需开发新型的流感病毒减毒策略。
人流感病毒分为A、B、C三型,A型流感病毒抗原性易发突变,多次引起世界性大流行,致病性较强。A型流感病毒(InfluenzaAvirus)属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)流行性感冒病毒属。A型流感病毒根据抗原决定簇进行分类,即血球凝集素(HA,H1~H18)和神经氨酸酶(NA,N1~N11)。基质蛋白M在A型流感病毒中丰度仅次于HA和NA,有多个文献报道它是病毒生命周期的关键元件。但目前仍缺少高效的A型流感病毒减毒策略。
发明内容
本发明的目的在于提供一组基于同义突变和/或缺失突变的A型流感病毒致弱毒株及其制备方法和应用。本发明所述致弱毒株稳定性强,安全性高,对细胞系的依赖不强,在疫苗生产过程中具有较强的优势。
本发明提供了一组基于同义突变和/或缺失突变的A型流感病毒致弱毒株,所述致弱毒株通过对M2基因进行修饰获得;
所述修饰包括对A型流感病毒M基因中M2基因和M1基因重叠的部分进行同义突变,保证M1氨基酸序列的完整和不变;
或,所述修饰包括在对A型流感病毒M基因中M2基因和M1基因重叠的部分进行同义突变,保证M1氨基酸序列的完整和不变的同时,在M2基因删除部分核苷酸序列。
优选的是,所述致弱毒株的背景毒株包括A/Puerto Rico/8/1934病毒。
优选的是,所述同义突变包括将M基因的第715位碱基到第760位碱基突变为如SEQID NO.1所示的核苷酸序列。
优选的是,所述缺失突变为在M基因第761位碱基到第982位碱基缺失任意位置和长度的核苷酸序列。
优选的是,所述缺失突变包括:从M基因第767位碱基起,缺失8、28、51、73、91或111个核苷酸。
优选的是,所述修饰后,M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2~8所示。
本发明还提供了上述技术方案所述致弱毒株的构建方法,包括以下步骤:
构建含修饰后M2基因的质粒,获得同义突变质粒或同义突变+del质粒;
利用反向遗传系统,将表达流感病毒基因组片段和蛋白的质粒混合后转染细胞,收获病毒,得到A型流感病毒致弱毒株;
所述质粒包括同义突变质粒或同义突变+del质粒、PB2质粒、PB1质粒、PA质粒、NP质粒、NS质粒、HA质粒和NA质粒;
所述质粒还包括表达PR8-M2蛋白的质粒。
优选的是,构建所述同义突变质粒或同义突变+del质粒所需的引物序列如SEQ IDNO.9~15所示。
优选的是,所述同义突变质粒含如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或同义突变+del质粒分别含如SEQ ID NO.3~8所示的核苷酸序列。
本发明还提供了上述技术方案所述致弱毒株或上述技术方案所述构建方法构建得到的致弱毒株在制备流感减毒疫苗中的应用。
本发明提供了一组基于同义突变和/或缺失突变的A型流感病毒致弱毒株。本发明所述毒株稳定性强,多次传代不会发生回复突变,安全性高。本发明所述A型流感病毒致弱毒株在正常MDCK细胞中按常规接种剂量接种时,生长受限,毒性显著降低。此外,本发明的毒株具备特殊的生长特性,在MDCK细胞系中高滴度接种时,仍能够正常复制增殖,也能够在鸡胚中正常生长,对细胞系的依赖不强,在疫苗生产过程中具有较强的优势。低剂量接种MDCK细胞病毒不能生长,高剂量接种MDCK细胞病毒可以生长,显示了病毒的限制性增殖能力,相比一过性感染,该能力预示着病毒拥有更好的诱导免疫效果。
附图说明
图1为本发明提供的A型流感病毒M基因修饰示意图;
图2为本发明提供的病毒生长曲线图;
图3为本发明提供的PR8-同义突变-del8在MDCK细胞中生长特性结果图;
图4为本发明提供的PR8-同义突变-del28在MDCK细胞中生长特性结果图;
图5为本发明提供的PR8-同义突变-del51在MDCK细胞中生长特性结果图;
图6为本发明提供的PR8-同义突变-del73在MDCK细胞中生长特性结果图;
图7为本发明提供的PR8-同义突变-del91在MDCK细胞中生长特性结果图;
图8为本发明提供的PR8-同义突变-del111在MDCK细胞中生长特性结果图;
图9为本发明提供的PR8-同义突变毒株在MDCK细胞中的生长特性结果图;
图10为本发明提供的流感同义突变或同义突变+del毒株及PR8野生型毒株免疫后小鼠体重检测结果图;
图11为本发明提供的流感同义突变或同义突变+del毒株免疫后的攻毒实验。
具体实施方式
本发明提供了一组基于同义突变和/或缺失突变的A型流感病毒致弱毒株,所述致弱毒株通过对M2基因进行修饰获得;
所述修饰包括对A型流感病毒M基因中M2基因和M1基因重叠的部分进行同义突变,保证M1氨基酸序列的完整和不变;
或,所述修饰包括在对A型流感病毒M基因中M2基因和M1基因重叠的部分进行同义突变,保证M1氨基酸序列的完整和不变的同时,在M2基因删除部分核苷酸序列。
A型流感病毒M基因包括M1和M2,存在可变剪接,共用部分序列,如图1所示。本发明将M2与M1基因重叠的部分胞外区序列进行同义突变,保持M1氨基酸序列不变,而M2蛋白由于序列改变,将产生多个未知突变或提前终止,导致M2功能受损。在M2基因删除部分核苷酸序列,可能导致病毒核酸水平功能改变,形成新的生长特性。多个核苷酸序列的同义突变和/或缺失突变一般认为不可能发生回复突变,因此毒株的稳定性强。本发明针对M1和M2共有的核酸序列进行同义突变,或在此基础上对M2基因进行缺失,造成病毒核酸水平的的功能改变,形成新的病毒生长特性,达到致弱A型流感病毒的目的,可用于减毒疫苗的生产。
在本发明中,所述致弱毒株的背景毒株优选包括A/Puerto Rico/8/1934病毒。本发明优选利用反向遗传技术,在A/Puerto Rico/8/1934病毒背景下拯救病毒,并检测其在正常细胞以及M2过表达细胞的生长特性及减毒效果。理论上来讲,M2损伤的毒株是不能在普通MDCK细胞里生长的,通常是在MDCK-M2细胞里扩增,但本发明所述毒株在高滴度接种条件下却能在MDCK里生长,显示了病毒的限制性增殖能力,相比一过性感染,该能力预示着病毒拥有更好的诱导免疫效果。
在本发明中,所述同义突变优选包括将M基因的第715位碱基到第760位碱基突变为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列:GCGTACCAAAAGCGTATGGGTGTTCAAATGCAGAGATTTAAATAAG。
在本发明中,所述缺失突变优选为在M基因第761位碱基到第982位碱基缺失任意位置和长度的核苷酸序列。本发明优选在同义突变的同时,在M2基因(确保M1完整表达)缺失多个碱基,导致M2功能受损,病毒毒性降低,同时提高了毒株的稳定性,多次传代不会发生回复突变。
在本发明中,所述缺失突变优选包括:从M基因第767位碱基起,缺失8、28、51、73、91或111个核苷酸。
在本发明中,所述修饰后,M基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.2~8所示。
本发明所述致弱的方式为在流感病毒保守基因M1-M2基因共有序列上进行同义突变,或在同义突变基础上同时进行缺失突变,删除基因序列的一部分。本发明对M1和M2基因的共有序列区域进行同义突变,包含了长达46个bp的区域,保证M1蛋白序列不变的情况下,M2发生多个氨基酸突变;在此基础上再删除8~111个核苷酸序列,这种情况下毒株多次传代将不可能发生回复突变,毒株的生产稳定性更好。
本发明对M基因(SEQ ID NO.16)的修饰方法具体如下:大写字母表示M2编码序列,下划线部分表示M1和M2共有的序列,加粗部分为同义突变区域,小括号“()”表示删除区域。
即,同义突变的区域如加粗部分,位于M1-M2基因共有序列,即M2基因胞外区部分碱基,即M基因的第715-760位碱基:GCGTACCAAAAGCGTATGGGTGTTCAAATGCAGAGATTTAAATAAG(SEQ ID NO.1)。
在M2基因删除的部分核苷酸序列包括:
ACTATTGC(del8,SEQ ID NO.17),
ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCT(del28,SEQ ID NO.18),
ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTT(del51,SEQ IDNO.19),
ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCA(del73,SEQ ID NO.20),
ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGTCGCTTTAAAT(del91,SEQ ID NO.21),
或,
ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGTCGCTTTAAATACGGACTGAAAGGAGGGCCT(del111,SEQ ID NO.22)。
本发明还提供了上述技术方案所述致弱毒株的构建方法,包括以下步骤:
构建含修饰后M2基因的质粒,获得同义突变质粒或同义突变+del质粒;
利用反向遗传系统,将表达流感病毒基因组片段和蛋白的质粒混合后转染细胞,收获病毒,得到A型流感病毒致弱毒株;
所述质粒包括同义突变质粒或同义突变+del质粒、PB2质粒、PB1质粒、PA质粒、NP质粒、NS质粒、HA质粒和NA质粒;
所述质粒还包括表达PR8-M2蛋白的质粒。
本发明构建含修饰后M2基因的质粒,获得同义突变质粒或同义突变+del质粒。在本发明中,构建所述同义突变质粒或同义突变+del质粒所需的引物序列优选如SEQ IDNO.9~15所示。在本发明中,所述同义突变质粒含如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或同义突变+del质粒优选分别含如SEQ ID NO.3~8所示的核苷酸序列。
获得同义突变质粒或同义突变+del质粒质粒后,本发明利用反向遗传系统,将表达流感病毒基因组片段和蛋白的质粒混合后转染细胞,收获病毒,得到A型流感病毒致弱毒株;所述质粒包括同义突变质粒或同义突变+del质粒、PB2质粒、PB1质粒、PA质粒、NP质粒、NS质粒、HA质粒和NA质粒;所述质粒还包括表达PR8-M2蛋白的质粒。
本发明所述构建方法利用反向遗传技术,可在特定细胞中拯救获得低毒性的流感病毒,为制备生产流感减毒疫苗提供了新的选择。
本发明还提供了上述技术方案所述致弱毒株或上述技术方案所述构建方法构建得到的致弱毒株在制备流感减毒疫苗中的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的一组基于同义突变和/或缺失突变的A型流感病毒致弱毒株及其制备方法和应用做进一步详细的介绍,本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1.构建M1-同义突变和M1-同义突变+del缺陷型质粒
M1-同义突变片段由基因合成实现,具体序列如下:GCGTACCAAAAGCGTATGGGTGTTCAAATGCAGAGATTTAAATAAG(SEQ ID NO.1)。合成后的序列用常规分子生物学方法连接到pFlu载体上,称为同义突变质粒。
定义M1-同义突变基础上缺失不同长度序列del8,del28,del51,del73,del91,del111缺陷型质粒统称为同义突变+del质粒。
针对所要构建的缺陷型质粒,设计如下引物:
表1引物序列
del8-F | ttaaataagcctctccgcaaatatcattgggatcttg(SEQ ID NO.9) |
del28-F | ttaaataagcctctctgcacttgacattgtggattcttg(SEQ ID NO.10) |
del51-F | ttaaataagcctctcgatcgtctttttttcaaatg(SEQ ID NO.11) |
del73-F | ttaaataagcctctctttaccgtcgctttaaatacg(SEQ ID NO.12) |
del91-F | ttaaataagcctctcacggactgaaaggagggccttct(SEQ ID NO.13) |
del111-F | ttaaataagcctctctctacggaaggagtgccaaag(SEQ ID NO.14) |
PR8delR | ctctccatcacttgaaccgttg(SEQ ID NO.15) |
以包含A型流感病毒(A/Puerto Rico/8/1934)M基因的载体质粒(以pFlu载体为基础,采用常规重组载体构建方法构建得到)为模板,以表1中所展示的每个上游引物和共同的下游引物PR8delR配对,按照PrimerSTAR说明书分别扩增得到M1-同义突变+del片段。将扩增得到的片段按照HiFi DNAAssembly试剂盒说明书要求,进行同源重组克隆。对克隆产物涂布LB氨苄平板后挑菌并鉴定,鉴定所用引物为:gctggtctgaaaaatgatcttcttg(SEQ ID NO.23)。最终得到缺陷型同义突变+del质粒。
2.缺陷型流感病毒拯救及制备
将293T细胞接种在六孔板(Thermo Fisher),待细胞密度达到70~80%时进行转染。将表达8个流感基因组片段的质粒(PB2、PB1、PA、NP、同义突变或同义突变+del、NS、HA、NA)和表达全长PR8-M2蛋白的质粒按照2:1混合后,用LTX转染试剂盒进行转染,转染体系滴入准备好的293T细胞中,放入37℃二氧化碳培养箱培养。
转染48-72h后,将细胞在-80℃冻融,收集上清并接种于MDCK-M2细胞,放入37℃病毒培养箱培养。每天观察病变情况,病变达到一定程度后收集病毒,分装到病毒保存管中。
取一部分病毒测序鉴定确保M基因为所设计的缺陷型,其余冻存于-80℃备用。所得到M缺陷型流感病毒分别命名为同义突变,同义突变-del8,同义突变-del28,同义突变-del51,同义突变-del73,同义突变-del91和同义突变-del111流感重组病毒。
3.病毒生长曲线
将MDCK-M2细胞铺于24孔板,待细胞长满单层后,将M缺陷型流感病毒株及对照组以感染复数(MOI)为0.001的剂量接种细胞,感染2h后,弃掉24孔板中的液体,用PBS洗涤后加入含2%FBS的DMEM培养基维持细胞生长,置37℃、5%CO2,培养箱中培养。
分别在感染后12、24、36、48、60和72h收获病毒,将收获的不同时间点的病毒液作连续10倍倍比稀释后,每个稀释度做4个重复,分别接种于96孔板中长至单层的MDCK-M2细胞中,感染2h后换成2%FBS的DMEM培养液维持细胞的生长,48h后观察细胞病变,测定不同时间点收集的缺陷型流感病毒株的毒价,应用Reed-Muench方法计算其TCID50,数据分析完成后,绘制M缺陷型流感重组病毒的生长曲线。
病毒生长曲线结果如图2所示,同义突变和同义突变+del毒株与野生型毒株相比,48h内生长速度显著降低,但在过表达M2的MDCK细胞仍能够达到较高的复制速率,获得较高的病毒滴度。
4.M2缺陷型病毒在MDCK细胞的生长特性
将MDCK细胞铺于24孔板,待细胞长满单层后,将M缺陷型流感病毒株从感染复数(MOI)为0.001(250TCID50)起,按梯度增加接种细胞,置于37℃5%CO2培养箱进行培养。
96h后观察细胞病变情况,并进行血凝检测,研究发现同义突变、同义突变-del病毒在高剂量接种时可以在MDCK细胞中复制,达到较高的血凝价。
图3为PR8-同义突变-del8在MDCK细胞中生长特性结果图;
图4为PR8-同义突变-del28在MDCK细胞中生长特性结果图;
图5为PR8-同义突变-del51在MDCK细胞中生长特性结果图;
图6为PR8-同义突变-del73在MDCK细胞中生长特性结果图;
图7为PR8-同义突变-del91在MDCK细胞中生长特性结果图;
图8为PR8-同义突变-del111在MDCK细胞中生长特性结果图;
图9为PR8-同义突变毒株在MDCK细胞中的生长特性结果图。
5.接鸡胚生长情况(生长特性)
选用10日龄的SPF鸡胚,标记出气室和胚胎的位置,在气室接近胚体处用酒精进行消毒,穿一个小孔,用注射器插入适当的深度,注入0.1ml病毒液后用石蜡封口,放回孵育箱中孵育,每天定时检卵一次,去除24h时死亡的胚胎,对其他鸡胚进行观察,72h后取尿囊液进行血凝检测。检测结果如表3所示。
表3血凝检测结果
M2缺陷型病毒接种鸡胚,72h后鸡胚全部存活,可见其致弱效果显著;其中除PR8-M1同义突变-del111的65号鸡胚血凝价为0外,在其余鸡胚中能达到较高的血凝价,为后续疫苗生产提供了一种选择。
采用同义突变和同义突变+del的方法对流感病毒基因组进行改造,拯救获得的病毒株在细胞水平和鸡胚中的生长特性表明,这些缺陷型病毒株在正常MDCK细胞中复制能力受限,但不是一过性复制,作为疫苗使用时可能有利于诱导更好的保护力。
6.M2缺陷型病毒在小鼠体内减毒效果评价
用5周龄BALB/C雌性小鼠(维通利华),每组8只小鼠,在鼻内分别接种获得的M2缺陷型病毒:PR8-同义突变、PR8-同义突变+del8、PR8-同义突变+del28、PR8-同义突变+del51、PR8-同义突变+del73、PR8-同义突变+del91、PR8-同义突变+del111。以106TCID50/50μL每只小鼠的剂量对小鼠进行滴鼻(鼻腔免疫接种),对照组小鼠滴加等体积PBS。接种后记录14天内小鼠的体重变化和感染症状,接种3天后从每组取3只小鼠,对小鼠的肺部和鼻甲骨研磨液的病毒载量进行检测。
流感M2缺陷型毒株及PR8野生型毒株免疫后小鼠体重检测结果如图10,流感病毒野生型毒株PR8接种小鼠后,体重直线下降,第5天后小鼠死亡;而M2缺陷型毒株免疫小鼠后,部分毒株(如同义突变、同义突变-del8、同义突变-del28)导致小鼠体重短暂下降,然后在14天内得到恢复;毒株同义突变-del73导致小鼠体重短暂下降,迅速回升并超过初始体重;部分毒株(同义突变-del51、同义突变-del91、同义突变-del111)对小鼠体重无显著影响。
表4小鼠免疫野生型和M2缺陷型病毒后鼻甲和肺组织病毒载量
小鼠接种流感野生型病毒或M2缺陷型病毒3天后,取小鼠的肺部组织和鼻甲骨研磨液对病毒载量进行检测。结果显示,接种野生型病毒后在鼻甲和肺组织中检测到较高的病毒滴度,如表4所示;同义突变-del8、同义突变-del51、同义突变-del73等毒株接种3天后,病毒载量显著低于野生型或低于检出限,显示出良好的弱毒性。
7.M2缺陷型病毒在小鼠体内诱导针对流感病毒的血清抗体
用7周龄BALB/C雌性小鼠(维通利华),每组8只小鼠,在鼻内分别接种获得的M2缺陷型病毒:PR8-同义突变、PR8-同义突变+del8、PR8-同义突变+del28、PR8-同义突变+del51、PR8-同义突变+del73、PR8-同义突变+del91、PR8-同义突变+del111。以106TCID50/50μL每只小鼠的剂量对小鼠进行滴鼻(鼻腔免疫接种),对照组小鼠滴加等体积PBS。
免疫后14天对小鼠采血,测量血清抗体效价(血凝抑制价),结果如表5。
表5血凝抑制价结果
免疫原 | 血凝抑制价 |
同义突变 | 26 |
同义突变-del8 | 25 |
同义突变-del28 | 25 |
同义突变-del51 | 25.5 |
同义突变-del73 | 26.5 |
同义突变-del91 | 25 |
同义突变-del111 | 26 |
对照小鼠血清 | 0 |
如表5所示,M2缺陷型的同义突变毒株均在小鼠体内诱导出较高的血凝抑制价,显示出针对流感病毒的血清抗体。
8.M2缺陷型病毒免疫小鼠21天后的攻毒实验
实施例6中所述每组小鼠中选取了同义突变-del8、同义突变-del51、同义突变-del73三组,3只牺牲用于检测病毒载量,其余5只用于攻毒实验。将野生型PR8毒株以106TCID50/50μL每只小鼠的剂量对小鼠进行攻毒,记录从接毒后第1天至第11天的小鼠体重。
从实施例6(图10)可知,小鼠在野生型流感毒株接种后第5天死亡。如图11所示,同义突变-del8、同义突变-del73两种毒株免疫后的小鼠在攻毒后体重基本保持稳定;同义突变-del51毒株免疫后的小鼠攻毒后体重略有降低,并且在观测期间恢复正常体重。这些数据表明本发明的毒株具有作为减毒流感疫苗的潜力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江迪福润丝生物科技有限公司
<120> 一组基于同义突变和/或缺失突变的A型流感病毒致弱毒株及其制备方法和应用
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcgtaccaaa agcgtatggg tgttcaaatg cagagattta aataag 46
<210> 2
<211> 982
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gtactctcta tcatcccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120
gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300
aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360
gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480
tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540
ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600
gaggccatgg aggttgctag tcaggctaga caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660
actcatccta gctccagtgc tggtctgaaa aatgatcttc ttgaaaattt gcaggcgtac 720
caaaagcgta tgggtgttca aatgcagaga tttaaataag cctctcacta ttgccgcaaa 780
tatcattggg atcttgcact tgacattgtg gattcttgat cgtctttttt tcaaatgcat 840
ttaccgtcgc tttaaatacg gactgaaagg agggccttct acggaaggag tgccaaagtc 900
tatgagggaa gaatatcgaa aggaacagca gagtgctgtg gatgctgacg atggtcattt 960
tgtcagcata gagctggagt aa 982
<210> 3
<211> 974
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<211> 954
<212> DNA
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<400> 4
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actcatccta gctccagtgc tggtctgaaa aatgatcttc ttgaaaattt gcaggcgtac 720
caaaagcgta tgggtgttca aatgcagaga tttaaataag cctctcgatc gtcttttttt 780
caaatgcatt taccgtcgct ttaaatacgg actgaaagga gggccttcta cggaaggagt 840
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tggtcatttt gtcagcatag agctggagta a 931
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<211> 909
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gtactctcta tcatcccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120
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caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300
aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttaaataagc ctctcgatcg tctttttttc aaatg 35
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ttaaataagc ctctcacgga ctgaaaggag ggccttct 38
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttaaataagc ctctctctac ggaaggagtg ccaaag 36
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<212> DNA
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<400> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gctggtctga aaaatgatct tcttg 25
Claims (6)
1.一组基于同义突变和/或缺失突变的A型流感病毒致弱毒株,其特征在于,所述致弱毒株通过对M2基因进行修饰获得;
所述修饰包括对A型流感病毒M基因中M2基因和M1基因重叠的部分进行同义突变,保证M1氨基酸序列的完整和不变;
或,所述修饰包括在对A型流感病毒M基因中M2基因和M1基因重叠的部分进行同义突变,保证M1氨基酸序列的完整和不变的同时,在M2基因删除部分核苷酸序列;
所述同义突变包括将M基因的第715位碱基到第760位碱基突变为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列;
所述缺失突变包括:从M基因第767位碱基起,缺失8、28、51、73、91或111个核苷酸;所述修饰后,M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2~8所示。
2.根据权利要求1所述的致弱毒株,其特征在于,所述致弱毒株的背景毒株包括A/Puerto Rico/8/1934病毒。
3.权利要求1或2所述致弱毒株的构建方法,包括以下步骤:
构建含修饰后M2基因的质粒,获得同义突变质粒或同义突变+del质粒;
利用反向遗传系统,将表达流感病毒基因组片段和蛋白的质粒混合后转染细胞,收获病毒,得到A型流感病毒致弱毒株;
所述质粒包括同义突变质粒或同义突变+del质粒、PB2质粒、PB1质粒、PA质粒、NP质粒、NS质粒、HA质粒和NA质粒;
所述质粒还包括表达PR8-M2蛋白的质粒。
4.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,构建所述同义突变质粒或同义突变+del质粒所需的引物序列如SEQ ID NO.9~15所示。
5.根据权利要求3所述的构建方法,其特征在于,所述同义突变质粒含如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列或同义突变+del质粒分别含如SEQ ID NO.3~8所示的核苷酸序列。
6.权利要求1或2所述致弱毒株或权利要求3~5任一项所述构建方法构建得到的致弱毒株在制备流感减毒疫苗中的应用。
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