CN105985413A

CN105985413A - 新的甲型流感病毒哺乳动物细胞适应株及其制备和应用

Info

Publication number: CN105985413A
Application number: CN201510091993.2A
Authority: CN
Inventors: 孙兵; 徐可; 张宏
Original assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Current assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Priority date: 2015-02-28
Filing date: 2015-02-28
Publication date: 2016-10-05
Also published as: WO2016134678A1

Abstract

本发明公开了一种新的甲型流感病毒哺乳动物细胞适应株及其制备和应用。具体地，本发明提供了能够大幅提高甲型流感病毒株PR8在哺乳动物细胞(尤其是Vero细胞)上生长能力的PR8病毒株突变蛋白及含有其的重组型PR8病毒株，其中将PR8病毒株的NS2蛋白第86位由K突变为R后，所获得的病毒株在Vero细胞上的生长能力较野生型PR8病毒株提高了20-100倍，且该适应株在活体上的致病力没有增强。因此，含有本发明突变蛋白的甲流病毒株能够作为在哺乳动物细胞上高产的疫苗种子株。

Description

新的甲型流感病毒哺乳动物细胞适应株及其制备和应用

技术领域

本发明属于生物技术和免疫学领域；更具体地，本发明涉及甲型流感病毒疫苗哺乳动物细胞适应株的获得方法和适应位点。

背景技术

流感是人类历史上最严重的传染病之一，其主要病原体是流感病毒。它的宿主范围广泛，包括野生鸟类、家禽、各种哺乳动物以及人类。它变异很快，能够改变抗原性以逃避宿主免疫系统的攻击，或者改变自身的药物靶点特征以获得抗药性。这些特点决定了流感病毒能够在人畜间广泛传播，难以控制。除了每年造成季节性流行(epidemic)，还不定期造成大流行(pandemic)，给人类社会带来巨大损失。近百年来，流感病毒有过四次大流行。其中1918年“西班牙”流感大流行，全世界致死2000万人。其后的1957年亚洲流感大流行和1968年的香港流感大流行均造成上百万人死亡和巨大经济损失。1997年高致病性禽流感病毒在东南亚的爆发，不但对养殖业危害巨大，而且对人类致死率极高(达60％)，具有形成重大流行的潜在可能。2009年猪源甲型流感病毒大流行，也造成了世界范围内的恐慌和畜牧业的重大损失。据世界卫生组织(WHO)预测，全球每年平均有1/3的儿童和1/10的成人会感染流感。

流感病毒属于正粘病毒科(orthomyxoviridae)，根据其内部核蛋白(NP)和基质蛋白(M)的抗原性不同，分为A\B\C三型，其中A型是致人类和各种动物流感的主型。A型流感病毒是一种有包膜的单链负链RNA(-ssRNA)病毒，基因组由8条单链负链RNA组成，编码11种以上的蛋白质，包括HA,NA,PA,PB1,PB2,NP,M1,M2,NS1,NS2和PB1-F2等。其中血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是主要的囊膜表面抗原蛋白，HA主要负责使病毒有效入侵细胞，NA主要负责切断出芽的新生病毒颗粒与细胞表面的连接使其顺利释放。PA,PB1,PB2组成聚合酶(RdRp)，负责基因组的复制和转录。核蛋白(NP)与病毒基因组RNA结合，是构成病毒核糖核蛋白复合体(vRNP)的主要成分。基质蛋白(M1)位于囊膜和vRNP之间，负责形成病毒蛋白衣壳。基质蛋白M2形成质子通道，在病毒入侵细胞时，调节内涵体PH值，使HA顺利被剪切。NS1是一个多功能非结构蛋白，在抵抗宿主免疫反应(抗干扰素)、调节宿主细胞周期等方面有重要作用。NS2又名出核转运蛋白(NEP)，可引导vRNP出核。PB1-F2是一个小分子量的多功能非结构蛋白，能够诱导宿主细胞凋亡，影响病毒致病力。

抗击流感最有效的手段是接种流感疫苗。传统的流感疫苗采用鸡胚生产，技术已经相当成熟，而且所得疫苗安全、有效。但是，鸡胚生产疫苗有一些难以克服的缺点，比如：过程繁琐；需要大量的SPF鸡胚，这在流感大流行时难以保证供应；在表面抗原上容易发生突变，可能造成疫苗毒抗原性改变；含有卵清蛋白反应原等。发展哺乳动物二倍体传代细胞培养病毒来生产流感疫苗的技术，可以很好的解决以上问题，也是改进流感疫苗生产现状的重要发展方向。

用于流感病毒疫苗生产研究的细胞系主要有MDCK、Vero、PER.C6等，并已有产品上市。但其中仍有不少问题亟待研究和解决，如：(1)细胞生产疫苗的产量有待提高，包括更加适合在细胞中复制的流感病毒株的开发，更加适宜的细胞培养条件和病毒收获条件的摸索等。(2)病毒在细胞中传代的抗原稳定性评价。(3)细胞生产疫苗的安全性评价。(4)其它可用于流感疫苗生产的细胞系开发。等等。

目前流感疫苗的通用骨架毒株是PR8，它是鸡胚适应株，在鸡胚中复制效率很高，能使与之重配得到的疫苗毒株获得在鸡胚中的高产特性。但PR8并不适合在哺乳动物细胞中扩增，因此有必要针对哺乳动物细胞生产平台开发新的骨架毒株。在WHO推荐的可用于流感病毒疫苗株培养的细胞中，Vero细胞已经被用于多种人用病毒疫苗包括狂犬病毒疫苗和脊髓灰质炎病毒疫苗的生产，培养条件和生产工艺都很成熟，同时已有研究证明Vero培养的流感病毒疫苗株可以激活和鸡胚培养的疫苗株等同的体液免疫反应甚至更高的细胞免疫反应。

因此，本领域迫切需要开发一种适应于Vero细胞培养的流感病毒疫苗株。

发明内容

本发明第一方面，提供了一种甲型流感病毒出核转运蛋白NS2的突变蛋白，其特征在于，所述的突变蛋白的第86位氨基酸由K突变为R。

在另一优选例中，所述的突变蛋白第1-85位与SEQ ID NO.:3所述蛋白的1-85位相同。

在另一优选例中，所述的突变蛋白第87-111位与SEQ ID NO.:3所述蛋白的87-111位相同。

在另一优选例中，所述的突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，含有所述突变蛋白的甲型流感病毒株PR8较野生型PR8病毒株在哺乳动物细胞上的生长能力提高至少20倍，较佳地为至少50倍，更佳地为至少80-100倍。

在另一优选例中，所述的突变蛋白还包括所基于所述突变蛋白进行改造而得到的衍生蛋白，其中，所述的衍生蛋白包括在所述突变蛋白的基础上经过一个或几个(通常为1-10个，较佳地为1-8个，更佳地为1-6个、1-5个、1-3个或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代后的含有NS2第86位氨基酸由K变为R突变的衍生蛋白。

在另一优选例中，所述的衍生蛋白还包括在所述突变蛋白的C末端和/或N末端添加或缺失一个或几个(通常为1-10个，较佳地为1-8个，更佳地为1-6个、1-5个、1-3个或1-2个)氨基酸。

在另一优选例中，含有所述衍生蛋白的流感病毒株与含所述突变蛋白NS2的流感病毒株在哺乳动物细胞上具有相当的生长能力(即含有所述衍生蛋白的流感病毒株为含所述突变蛋白NS2的流感病毒株在哺乳动物细胞上的生长能力的90-100％)。

在另一优选例中，所述的哺乳动物细胞包括Vero细胞、MDCK细胞、PER.C6。

本发明第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码权利要求1-2任一所述的突变蛋白。

在另一优选例中，所述的多核苷酸如SEQ ID NO.:1所示，其中编码NS2_K86R的cDNA为1-27位连接500-838位。

本发明第三方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的表达载体为质粒、病毒载体。

在另一优选例中，所述的表达载体为pHW2000质粒。

本发明第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的表达载体，或所述的宿主细胞的染色体整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞还含有能够表达野生型PR8甲型流感病毒株(除NS2蛋白以外)蛋白的多个表达载体。

本发明第五方面，提供了一种重组型PR8甲型流感病毒株，所述PR8甲型流感病毒株NS2蛋白的第86位氨基酸突变由K突变为R。

在另一优选例中，所述的重组型PR8甲型流感病毒株除了NS2蛋白第86位氨基酸外，其他蛋白的氨基酸序列与野生型PR8甲型流感病毒株相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的重组型PR8甲型流感病毒株还包括其衍生毒株，且所述的衍生毒株在哺乳动物细胞上的生长能力为所述重组型PR8甲型流感病毒株在哺乳动物细胞上的生长能力的95-100％。

在另一优选例中，所述重组型PR8甲型流感病毒株在哺乳动物细胞上的生长能力为野生型PR8甲型流感病毒株的至少20倍，较佳地为至少50倍，更佳地为至少80-100倍。

本发明第六方面，提供了一种病毒拯救系统，所述病毒拯救系统含有表达甲型流感病毒出核转运蛋白NS2突变蛋白的表达载体。

在另一优选例中，所述的病毒拯救系统还含有一个或多个表达野生型PR8甲型流感病毒株所需蛋白的其他表达载体。

在另一优选例中，所述一个或多个表达野生型PR8甲型流感病毒株所需蛋白的其他表达载体包括表达选自下组蛋白的载体：RNA多聚酶PB2(SEQ ID NO.:41)、RNA多聚酶PB1(SEQ ID NO.:42)、RNA多聚酶PA(SEQ ID NO.:43)、血凝素HA(SEQ ID NO.:44)、核外壳核蛋白NP(SEQ ID NO.:45)、神经酰胺酶NA(SEQID NO.:46)、基质蛋白M1(SEQ ID NO.:47)、非结构蛋白NS1(SEQ ID NO.:48)、和基质蛋白M2(SEQ ID NO.:49)。

在另一优选例中，所述的野生型PR8甲型流感病毒株的序列如SEQ ID NO.:50-57所示。

在另一优选例中，所述的表达载体为质粒。

在另一优选例中，所述的病毒拯救系统含有表达SEQ ID NO.:2、和SEQ IDNOs.:41-49所示蛋白的表达载体。

本发明第一方面所述突变蛋白或其编码基因、本发明第四方面所述表达载体或本发明第五方面所述宿主细胞、本发明第六方面所述宿主细胞的用途，用于制备本发明第六方面所述的重组型PR8病毒株。

本发明第七方面，提供了一种制备本发明第五方面所述重组型PR8甲型流感病毒株的试剂盒，所述的试剂盒中含有本发明第六方面所述的病毒拯救系统。

在另一优选例中，所述病毒拯救系统含有表达所述重组型PR8甲型流感病毒株所需的表达载体，其中，所述的表达载体中多核苷酸编码的NS2蛋白为突变蛋白。

在另一优选例中，所述的表达载体中的多核苷酸还编码PR8甲型流感病毒株的其他蛋白。

本发明第八方面，提供了一种制备本发明第五方面所述重组型PR8甲型流感病毒株的方法，包括步骤：

(a)提供本发明第六方面所述的病毒拯救系统，其含有表达甲型流感病毒出核转运蛋白NS2突变蛋白的表达载体，和表达野生型PR8甲型流感病毒株所需蛋白的其他表达载体；所述野生型PR8甲型流感病毒株所需蛋白的其他表达载体包括表达选自下组蛋白的载体：RNA多聚酶PB2、RNA多聚酶PB1、RNA多聚酶PA、血凝素HA、核外壳核蛋白NP、神经酰胺酶NA、基质蛋白M1和M2、和非结构蛋白NS1；

(b)将步骤(a)中的病毒拯救系统转染宿主细胞，培养所述的宿主细胞，从而获得本发明第五方面所述的重组型PR8甲型流感病毒株。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了来自WSN病毒的NS基因能够促进PR8病毒在Vero细胞上的生长。(A)PR8同WSN病毒的重组病毒在Vero细胞上的空斑图。(B)PR8同WSN病毒的重组病毒在Vero细胞上的生长曲线。

图2显示了携带单点突变的PR8病毒在Vero细胞上的生长。(A)WSN NS基因同PR8 NS基因相比存在的不同突变位点。(B)携带不同NS突变位点的PR8病毒在Vero细胞上的生长曲线。

图3显示了NS2 K86R突变促进了PR8病毒在Vero细胞上的生长。(A)PR8、WSN、PR8-WSN NS和PR8-NS2_K86R病毒在Vero细胞上复制48小时产生的病毒滴度。(B)PR8、WSN、PR8-WSN NS和PR8-NS2_K86R病毒在Vero细胞上的空斑图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次获得了一个能够大幅提高甲型流感病毒株PR8在哺乳动物细胞(尤其是Vero细胞)上生长能力的PR8病毒株突变蛋白，其中将PR8病毒株的NS2蛋白第86位由K突变为R后，所获得的病毒株在Vero细胞上的生长能力较野生型PR8病毒株提高了20-100倍，且该适应株在活体上的致病力没有增强。因此，含有本发明突变蛋白的甲流病毒株能够作为在哺乳动物细胞上高产的疫苗种子株。在此基础上，完成了本发明。

NS2蛋白及其突变蛋白

如本文所用，术语“出核转运蛋白NS2”、“NS2蛋白”可互换使用，均指甲型流感病毒野生型PR8病毒株的出核转运蛋白，其定义为本领域普通技术人员通常理解的含义。NS2蛋白主要介导流感病毒vRNP由细胞核输出到细胞质的过程；此外，NS2蛋白可以参与调控流感聚合酶的活性从而影响病毒的跨种传播能力。最近研究发现，NS2可以同宿主细胞膜上的蛋白F1Fo-ATPase相互作用来促进流感病毒生活周期的包装和释放过程。优选的，所述NS2蛋白的序列如SEQ ID NO.:3所示。

本发明提供了甲型流感病毒株PR8 NS2蛋白的突变蛋白(或“本发明蛋白”、“突变型出核转运蛋白”)，其中，所述的突变蛋白序列与NS2蛋白的氨基酸序列相比，第86位氨基酸由K突变为R。优选地，本发明突变蛋白如SEQ ID NO.:2所示。

含有本发明突变蛋白的PR8病毒株具有在哺乳动物细胞上高速生长的活性特点。优选地，本发明蛋白还包括功能特性相同或相近的衍生蛋白。本领域技术人员可知，在多肽(蛋白)的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。

优选地，所述的衍生蛋白包括将所述突变蛋白经过一个或几个(通常为1-10个，较佳地为1-8个，更佳地为1-6个、1-5个、1-3个或1-2个)氨基酸的缺失、添加和/或取代后的衍生蛋白；和/或所述的衍生蛋白还包括在所述突变蛋白的C末端和/或N末端添加或缺失一个或几个(通常为1-10个，较佳地为1-8个，更佳地为1-6个、1-5个、1-3个或1-2个)氨基酸；通常，这些衍生蛋白与本发明突变蛋白的序列相同性或同源性可以是90％以上，优选为95％-98％，更佳地为99％。其中，含有本发明衍生蛋白的重组型PR8病毒株，其也同样具有在哺乳动物细胞上高速生长的活性，例如与含有本发明突变蛋白的病毒株具有90-100％不如细胞动物上高速生长的活性(能力)。

在本发明中，所述的衍生蛋白中氨基酸残基的取代为保守性取代，优选地，这些保守性取代可以根据表1所示的氨基酸替换而产生：

表1

初始残基	代表性的取代残基	优选的取代残基
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，以SEQ ID NO:1为例，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2序列的多肽，但与SEQ ID NO:1中相应编码区序列有差别的核酸序列。

本发明的突变蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

重组型PR8甲型流感病毒株

本发明还提供了一种甲型流感的重组型PR8甲型流感病毒株(简称重组型PR8病毒株)。本发明重组型病毒株与野生型PR8病毒株的区别在于，所述病毒中的NS2蛋白为本发明突变蛋白，即第86位氨基酸由K突变为R，且所述的重组型PR8病毒株在哺乳动物细胞(如Vero细胞)上的生长能力较野生型毒株提高至少20倍，较佳为50-80倍，更佳地为100倍；而重组型PR8病毒株的除了该突变位点外，其他结构与野生型PR8病毒株相同或基本相同，即重组型PR8病毒株的其他蛋白与野生型相同，其中，所述其他蛋白包括RNA多聚酶PB2、RNA多聚酶PB1、RNA多聚酶PA、血凝素HA、核外壳核蛋白NP、神经酰胺酶NA、基质蛋白M1和M2、和非结构蛋白NS1。

应理解，当保留了NS2蛋白第86位的突变位点，重组型PR8病毒株的其他蛋白也可根据现有技术中保守性的位点替换(如根据表1)、添加和/或删除氨基酸，获得同样具有Vero细胞适应性(高生长速度特性)(如95％-100％适应性)的衍生毒株。

此外，在获得了本发明重组型PR8病毒株后，用于生产制造疫苗过程中合理传代次数后所获得的衍生毒株(如氨基酸序列未发生足以改变毒株性质的改变的衍生毒株)也应当在本发明的范围内。

如本文所用，术语“野生型PR8甲型流感病毒株”或“野生型PR8病毒株”指的是目前市售可得的PR8毒株，或优选根据已知PR8的基因序列采用反向遗传学方法构建的病毒株。本发明采用的PR8病毒株由PR8病毒基因通过反向遗传学方法构建，其中，PR8病毒株的基因来自于Vaccine 20(2002)3165–3170作者赠送,具体序列信息见附件，野生型PR8病毒全基因序列如SEQ ID NO.:50-57所示，其中，SEQ ID NO.:50-55所示的基因编码SEQ ID NO.:41-46所示的蛋白，SEQ ID NO.:56编码SEQ ID NO.:47、49所示的蛋白，SEQ ID NO.:57编码SEQ ID NO.:48所示的蛋白。经鉴定，本发明突变蛋白除了编码野生型PR8病毒NS2蛋白第86位的核苷酸不同，其余基因序列均与野生型病毒株的基因相同。

病毒拯救系统

本发明还涉及一种重组的病毒拯救系统，该系统包含甲型流感病毒(如PR8病毒株)拯救所需的流感病毒拯救质粒，能实现流感病毒拯救。对于流感病毒拯救系统，本领域技术人员是了解的，其包括了一系列病毒拯救表达载体(例如质粒)，所述病毒拯救质粒包含了可以实现流感病毒拯救的所有的元件(含病毒蛋白编码序列以及非编码序列)，在转染细胞后可获得病毒蛋白相应的mRNA以及病毒RNA(vRNA)，从而获得重组病毒。

目前，已经有一些商品化的流感病毒拯救质粒，例如pHW2000质粒，其含有polI和polII双重启动子，可以同时实现vRNA转录和mRNA表达。一个完整的病毒拯救系统，通常包括多个病毒拯救质粒，每一质粒上含有至少一种Segment，所述Segment包含至少一种蛋白编码基因，以及用于同时转录出病毒mRNA及病毒RNA(vRNA)的元件。病毒拯救技术目前已经成熟地被应用，例如可参考Erich Hoffmann等，Vaccine 20(2002)3165-3170或Hoffmann，E.等，Proc Natl Acad Sci U S A(2000)97:6108-6113。

作为本发明的优选方式，所述的病毒拯救质粒是polI-polII转录/表达载体，较佳地是pHW2000质粒。病毒拯救技术(Virus Rescue)是一种本领域熟知的技术因此本领域技术人员熟悉哪些病毒拯救质粒是可用的。因此，尽管优选pHW2000质粒，但其它与具有类似元件及类似功能的病毒拯救质粒也可应用于本发明中，例如pHH21。

作为本发明的优选方式，病毒拯救系统包含有8种病毒拯救质粒，分别装载所述的Segment1～Segment8，其中，所述8种病毒拯救质粒中，表达NS2的质粒所含有的核苷酸能够编码本发明突变蛋白。当然，所述的病毒拯救系统还可以仅含有表达本发明突变蛋白的质粒，从而与其他商业化的表达PR8其他蛋白的质粒或载体共同使用。

当将各病毒拯救质粒转染病毒包装细胞，培养经转染的病毒包装细胞，可获得重组流感病毒株。

试剂盒

本发明还包括用于制备重组流感病毒株的试剂盒，所述试剂盒中包括：病毒拯救系统，其包含流感病毒拯救所需的流感病毒拯救质粒，能实现流感病毒拯救；所述的流感病毒拯救质粒中，出核转运蛋白NS2的编码基因是突变型基因，其编码突变型出核转运蛋白NS2，氨基酸序列第86位由K突变为R；作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中，病毒拯救质粒是pHW系列质粒；更佳地，所述pHW系列质粒为pHW2000质粒，包括8个pHW2000质粒，分别装载所述的Segment1～Segment8。

本领域技术人员在获得了所述的试剂盒后，可方便地通过病毒拯救技术，来制备获得重组流感病毒株，该重组流感病毒株是哺乳动物细胞适应性的。

作为本发明的优选方式，所述的试剂盒还包括：病毒包装细胞，作为所述的病毒拯救质粒的受体细胞。较佳地，所述的病毒包装细胞是哺乳动物细胞，例如但不限于Vero细胞，293T细胞，MDCK细胞，COS-1细胞，PER.C6细胞等。最佳地，所述的细胞是Vero细胞。

作为本发明的优选方式，所述的试剂盒还包括其它应用于进行病毒拯救的试剂以及周边试剂，例如但不限于基因转染试剂，PCR扩增试剂，质粒抽提试剂，病毒包装细胞的培养基等。更佳地，所述的试剂盒中还可包括说明使用方法和注意点的使用说明书。

本发明的主要优点在于：

本发明通过一系列病毒重组和增殖实验确定，内部病毒基因编码的病毒蛋白上的一个氨基酸位点：NS2_K86R贡献了流感病毒适应株的在哺乳动物细胞中的生长适应性。通过小鼠和鸡胚致病力实验证明，本发明涉及的位点突变不会增加病毒对小鼠或鸡胚的致死能力。本发明提供了一种高产、安全的Vero细胞适应的改良流感疫苗株，对流感疫苗研究和生产具有重要价值。

本发明涉及流感病毒(Influenza virus)疫苗株同其他流感病毒株重组，获得Vero细胞适应性毒株的方法和决定其获得适应性的一个病毒氨基酸位点。细胞介质培养流感病毒获得疫苗用毒株是流感疫苗生产的必然趋势，Vero细胞因其安全性和可靠性被WHO推荐为流感疫苗生产的备选细胞株，但是大多数流感病毒在该细胞中的扩增能力都有限，因此提高流感疫苗毒株在哺乳动物细胞培养体系中，特别是Vero细胞中的生长速度，将在流感病毒疫苗生产中起到重要作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

材料和方法

反向遗传学获得PR8病毒的方法

以八质粒反向遗传学拯救流感病毒的方法(Hoffmann，E.等，2000.A DNAtransfection system for generation of influenza A virus from eightplasmids.Proc Natl Acad Sci U S A 97:6108-6113)拯救PR8病毒。简要地说，提供分别包含8条PR8病毒基因的反向遗传学表达质粒pHW2000(获自圣犹达儿童研究医院，田纳西大学，美国)，即质粒pHW2000-PR8-HA，pHW2000-PR8-NA，pHW2000-PR8-NS，pHW2000-PR8-M，pHW2000-PR8-NP，pHW2000-PR8-PB1，pHW2000-PR8-PB2，pHW2000-PR8-PA，各病毒基因插入pHW2000的BsmBI位点。8种质粒以等量混合，每种质粒1ug，以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染在6cm培养皿中长至约90％单层的293T细胞。转染48小时后收取上清，感染MDCK细胞，感染后48小时收取上清，在MDCK细胞(购自ATCC)上进行两轮空斑纯化，得到的纯化病毒即为PR8病毒。病毒扩增后，进一步鉴定基因型，确定拯救过程中没有多余突变。

病毒空斑纯化、扩增和基因型鉴定

分别将病毒按10倍稀释度以PBS溶液做梯度稀释，稀释液加入6孔板中长至100％的MDCK单层细胞，37℃感染1h，随后每孔加入3ml的overlay培养基(1.5ml 2×DMEM+1.5ml 1.8％Agar+1μg/ml TPCK trypsin)，待overlay培养基凝固后，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养48-72小时至形成肉眼可见的空斑。用枪头挑取单个病毒空斑至1ml PBS中，4℃放置4小时。将此含有单克隆病毒的PBS同上按10倍稀释度做稀释，重复一轮空斑纯化，两轮空斑纯化后的病毒于75cm²细胞培养瓶中单层MDCK细胞以Infection Medium扩增。

收获的病毒以RNeasy RNA抽提试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)抽提病毒RNA，方法见试剂盒说明书(Cat No.52904)，以M-MLV反转录酶(Invitrogen)和流感病毒基因组特异性引物Uni 12(5’-AGCAAAAGCAGG-3’(SEQ ID NO.:20))(Hoffmann，E.，J.Stech，Y.Guan，R.G.Webster，and D.R.Perez.2001.Universal primer set for the full-length amplification of allinfluenza A viruses.Arch Virol 146:2275-89.)反转录，所得病毒cDNA使用含有BsmBI(Bm)或BsaI(Ba)或AarI(Aar)位点的流感病毒片段特异性通用引物进行PCR获得8条病毒基因(Hoffmann，E.，J.Stech，Y.Guan，R.G.Webster，and D.R.Perez.2001.Universal primer set for the full-lengthamplification of all influenza A viruses.Arch Virol 146:2275-89)，克隆至pHW2000载体，测序确定病毒基因序列。

流感病毒片段特异性通用引物序列如下：

用于扩增PB2的引物：

Ba-PB2-F：TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTC；(SEQ ID NO.:4)

Ba-PB2-R：ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT；(SEQ ID NO.:5)

用于扩增PB1的引物：

Aar-PB1-F：TATTCACCTGCTTTAGGGAGCGAAAGCAGGCA；(SEQ ID NO.:6)

Aar-PB1-R：ATATCACCTGCTTTGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT；(SEQ ID NO.:7)

用于扩增PA的引物：

Bm-PA-F：TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTAC；(SEQ ID NO.:8)

Bm-PA-R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT；(SEQ ID NO.:9)

用于扩增HA的引物：

Bm-HA-F：TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGG；(SEQ ID NO.:10)

Bm-HA-R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT；(SEQ ID NO.:11)

用于扩增NP的引物：

Ba-NP-F：TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGTA；(SEQ ID NO.:12)

Ba-NP-R：ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT；(SEQ ID NO.:13)

用于扩增NA的引物：

Ba-NA-F：TATTGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGAGT；(SEQ ID NO.:14)

Ba-NA-R：ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT；(SEQ ID NO.:15)

用于扩增M的引物：

Bm-M-F：TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTAG；(SEQ ID NO.:16)

Bm-M-R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT；(SEQ ID NO.:17)

用于扩增NS的引物：

Bm-NS-F：TATTCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGTG；(SEQ ID NO.:18)

Bm-NS-R：ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT。(SEQ ID NO.:19)

RT-PCR

将提取的RNA中加入2μl 5μg/ml的Uni 12引物，混匀后70℃水浴5分钟。后将此混合物加入逆转录反应体系(M-MLV 5×Buffer 8μl，dNTP 10mM 2μl，RNase 40U/μl 1μl，M-MLV 200U/μl 2μl)，37℃水浴1-2小时，95℃10分钟，得到cDNA产物。

PCR

将cDNA产物加入PCR反应体系(ddH₂O 36μl，10×PCR Buffer 5μl，dNTPMixture[2.5mM]4.0μl，primers[20μM]1.0μl/1.0μl，viral cDNA[100μg/ml]3.0μl，Fusion[FINNZYMES，Cat No.F530L]0.3μl)。按上述体系进行反应，先94℃变性2min，再按以下参数反应34个循环：94℃变性1min，55℃退火30sec，72℃延伸1min，最后72℃延伸7min。将PCR产物上样于DNA琼脂糖凝胶于紫外灯下割胶目的片段，使用胶回收试剂盒(AXYGEN，AxyPrep DNA Gel Extraction Kit，Cat No.AP-GX-250)得到病毒基因。

反向遗传学拯救PR8-WSN NS病毒

反向遗传学方法同前所述。以pHW2000-WSN-NS，pHW2000-PR8-HA，pHW2000-PR8-NA，pHW2000-PR8-M，pHW2000-PR8-NP，pHW2000-PR8-PB1，pHW2000-PR8-PB2，pHW2000-PR8-PA为转染质粒组合，以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染上述8条病毒基因(即WSN的基因NS，以及PR8的基因NP、HA、NA、M、PA、PB1、PB2)于6cm培养皿中长至约90％单层的293T细胞。转染48小时后收取上清，感染MDCK细胞，感染后48小时收取上清，在MDCK细胞上进行两轮空斑纯化，测序确定得到的纯化病毒即为PR8-WSN NS。病毒扩增后，进一步鉴定基因型，确定拯救过程中没有多余突变。

反向遗传学拯救PR8-WSN M病毒

反向遗传学方法同前所述。以pHW2000-WSN-M，pHW2000-PR8-HA，pHW2000-PR8-NA，pHW2000-PR8-NS，pHW2000-PR8-NP，pHW2000-PR8-PB1，pHW2000-PR8-PB2，pHW2000-PR8-PA为转染质粒组合，以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染上述8条病毒基因(也即，WSN的基因M，以及PR8的基因NS、HA、NA、NP、PA、PB1、PB2)于6cm培养皿中长至约90％单层的293T细胞。转染48小时后收取上清，感染MDCK细胞，感染后48小时收取上清，在MDCK细胞上进行两轮空斑纯化，测序确定得到的纯化病毒即为PR8-WSN M。病毒扩增后，进一步鉴定基因型，确定拯救过程中没有多余突变。

反向遗传学拯救PR8-4P病毒

反向遗传学方法同前所述。以pHW2000-WSN-PA，pHW2000-WSN-NP，pHW2000-WSN-PB1，pHW2000-WSN-PB2,pHW2000-PR8-HA，pHW2000-PR8-NA，pHW2000-PR8-NS，pHW2000-PR8-M，为转染质粒组合，以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染上述8条病毒基因(也即，WSN的基因PA、NP、PB1、PB2，以及PR8的基因HA、NA、M、NS)于6cm培养皿中长至约90％单层的293T细胞。转染48小时后收取上清，感染MDCK细胞，感染后48小时收取上清，在MDCK细胞上进行两轮空斑纯化，测序确定得到的纯化病毒即为PR8-WSN 4P。病毒扩增后，进一步鉴定基因型，确定拯救过程中没有多余突变。

反向遗传学拯救PR8-NS突变病毒

首先构建包含单个点突变NS1_K55E、NS1_D101H、NS1_S103F,I106M、NS1_A171D/NS2_L14M、NS2_E22G、NS1_D189M/NS2_M31I、NS2_E63G、NS1_E221K、NS2_K86R和NS2_H104Q的pHW2000-PR8-NS质粒，根据产品说明书(Cat No 200518)利用QuickChange试剂盒(Stratagene)构建突变。简要的说，先设计一对退火温度在78℃左右的包含突变位点的引物(在下方)，然后直接使用此引物，以质粒pHW2000-PR8-NS作为模版进行PCR，所得到的产物用DpnI(NEB)酶切1小时，将PCR产物直接传化感受态细胞(DH-5α)，所鉴定的阳性克隆既是含有突变后的质粒。突变引物：

NS1_K55E：

正向：GGTCTGGACATCGAGACAGCCACACG(SEQ ID NO.:21)

反向：CGTGTGGCTGTCTCGATGTCCAGACC(SEQ ID NO.:22)

NS1_D101H：

正向：AGGAAATGTCAAGGCACTGGTCCATGCT(SEQ ID NO.:23)

反向：AGCATGGACCAGTGCCTTGACATTTCCT(SEQ ID NO.:24)

NS1_S103F,I106M：

正向：TCAAGGGACTGGTTCATGCTCATGCCCAAGCAGAAAG(SEQ ID NO.:25)

反向：CTTTCTGCTTGGGCATGAGCATGAACCAGTCCCTTGA(SEQ ID NO.:26)

NS1_A171D/NS2_L14M：

正向：CCAGGACATACTGATGAGGATGTCAAAAA(SEQ ID NO.:27)

反向：TTTTTGACATCCTCATCAGTATGTCCTGG(SEQ ID NO.:28)

NS2_E22G：

正向：AAAAATGCAGTTGGGGTCCTCATCGGAG(SEQ ID NO.:29)

反向：CTCCGATGAGGACCCCAACTGCATTTTT(SEQ ID NO.:30)

NS1_D189M/NS2_M31I：

正向：GGACTTGAATGGAATAATAACACAGTTCGAG(SEQ ID NO.:31)

反向：CTCGAACTGTGTTATTATTCCATTCAAGTCC(SEQ ID NO.:32)

NS2_E63G：

正向：CCAAAACAGAAACGGGAAATGGCGGGAA(SEQ ID NO.:33)

反向：TTCCCGCCATTTCCCGTTTCTGTTTTGG(SEQ ID NO.:34)

NS1_E221K：

正向：CAAAACAGAAACGAAAAATGGCGGGAAC(SEQ ID NO.:35)

反向：GTTCCCGCCATTTTTCGTTTCTGTTTTG(SEQ ID NO.:36)

NS2_K86R：

正向：GAAGAAGTGAGACACAGACTGAAGATAACAGAGAA(SEQ ID NO.:37)

反向：TTCTCTGTTATCTTCAGTCTGTGTCTCACTTCTTC(SEQ ID NO.:38)

NS2_H104Q：

正向：TATGCAAGCCTTACAACTATTGCTTGAAGTGG(SEQ ID NO.:39)

反向：CCACTTCAAGCAATAGTTGTAAGGCTTGCATA(SEQ ID NO.:40)

反向遗传学方法同前所述。以pHW2000-PR8-NSmut，pHW2000-PR8-HA，pHW2000-PR8-NA，pHW2000-PR8-PB1，pHW2000-PR8-M，pHW2000-PR8-NP，pHW2000-PR8-PB2，pHW2000-PR8-PA为转染质粒组合，以Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂转染上述8条病毒基因(也即，PR8的基因NS含有上述突变，以及PR8的基因NP、HA、NA、M、PB1、PA、PB2)于6cm培养皿中长至约90％单层的293T细胞。转染48小时后收取上清，感染MDCK细胞，感染后48小时收取上清，在MDCK细胞上进行两轮空斑纯化，测序确定得到的纯化病毒即为PR8-NS mut。病毒扩增后，进一步鉴定基因型，确定拯救过程中没有多余突变。

空斑免疫染色

病毒空斑免疫染色法依据文献(Matrosovich，M.等，New low-viscosityoverlay medium for viral plaque assays.Virol J 3:63)操作。简要地说，Vero或者MDCK细胞在12孔板中培养至100％单层，吸出培养液，PBS洗一遍，将病毒按10倍稀释度做梯度稀释，每孔加入400μl病毒稀释液37℃感染30分钟。30分钟后，吸出病毒感染液，每孔加入2ml Overlay培养液(1：1体积比的2×DMEM[Gibco]：2.4％Avicel[FMC BioPolymer]，以及终浓度1μg/mlTPCK-trypsin[Sigma]和50unit/ml青霉素[Invitrogen]，50μg/ml链霉素[Invitrogen])，37℃、5％CO₂的培养箱中培养48-72小时。取出12孔板，吸出Overlay培养液，PBS洗两遍，加入含有4％多聚甲醛的PBS溶液固定1小时后，吸出固定液，PBS洗三遍，每次5分钟。随后加入穿膜液(含有0.3％TritianX-100的PBS)，室温放置30分钟。吸出穿膜液，PBS洗三遍，每次5分钟，然后加入带有辣根过氧化物酶直标的抗NP蛋白的多抗(购自中国科学院上海生命科学研究院抗体中心)，室温放置1小时。吸出抗体后用含有0.05％Tween-20的PBS洗三次，每次5分钟。最后加入True Blue底物(KPL)进行显色，空斑外围被感染的细胞为蓝色，拍照后用Photoshop软件将图片颜色调整为黑白两色。

病毒滴定

以空斑免疫染色方法，计下空斑数目在10左右的孔中的空斑数目，根据该孔所对应的稀释浓度和感染量，计算得到每ml病毒液含有可形成空斑的病毒量(pfu/ml)。

病毒在细胞中的生长曲线

细胞在6cm培养皿中长至100％单层，以MOI＝0.001接种病毒，37℃感染1小时，吸出感染液，加入4ml Infection Medium(DMEM[Gibco]+0.2％BSA+1μg/ml TPCK-trypsin[Sigma])，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养。在感染后2，24，48，72，96小时各收取含有病毒的细胞上清40μl置入-80℃冰箱中冻存。Vero细胞需要每24h补充加入1μg/ml TPCK-trypsin。病毒滴度在MDCK细胞上滴定，结果按时间绘制成曲线。

血凝抑制实验

小鼠血清取自PR8病毒免疫过的小鼠或者空白小鼠。0.1ml血清加0.4ml受体破坏酶(RDE，购自中国疾控中心)，37℃过夜。56℃灭活30分钟，再加0.5mlPBS至终浓度为10^-1稀释度。处理好的血清在96孔板中2倍梯度稀释，稀释度从2^-1至2^-10。病毒定量按照以下方法进行：病毒用1％的鸡红细胞按照标准步骤做HA滴定。能引起完全血凝的最高稀释度为滴定终点，此稀释度为1HA单位/50μl。此稀释度往前数3个稀释度即为4HA单位/25μl。每孔加入25μl包含4HA单位的指定病毒与稀释好的血清混合，37℃孵育1小时使其充分相互作用，每孔加入50μl 1％鸡红细胞，室温静置30分钟。血清的血凝抑制滴度是能够抑制红细胞凝集的最高稀释度的倒数(Kendal A，P.M.，&Skehel J.1982.Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance..Geneva：World Health Organization.)。

鸡胚致死实验

10日龄SPF级别鸡胚(购自山东SPF实验种鸡场)，照蛋确定鸡胚活力，将100μl 10倍梯度稀释的病毒，10⁶PFU/胚到10²PFU/胚，接种至鸡胚尿囊腔，观察鸡胚存活至接种后48小时。ELD50按照Reed&Muench方法计算(Matsuoka，Y.等，2009.The mouse model for influenza.Curr Protoc Microbiol Chapter15:Unit 15G 3)。

小鼠实验

病毒的小鼠半数致死量(MLD₅₀)按照以下方法进行测定。6-8周龄SPF级别BALB/c雌性小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，每5只为一组，乙醚麻醉，再将10倍梯度稀释的病毒液50μl(含有1×10⁴到1×10¹病毒)通过鼻腔接种滴入小鼠肺部，每天观察小鼠体重变化至感染后第14天。在此14天内，若当小鼠出现明显的病症，比如竖毛和蜷缩，体重下降又超过25％时，即判定小鼠死亡，并因人道主义因素对小鼠实行安乐死(先用乙醚麻醉小鼠后颈部脱臼致死)。MLD50按照Reed&Muench方法计算(Matsuoka，Y.，E.W.Lamirande，and K.Subbarao.2009.The mouse model for influenza.Curr ProtocMicrobiol Chapter 15:Unit 15G 3.)。

实施例1、来源于WSN毒株的NS基因可以促进PR8毒株在Vero细胞上的高速生长。

Vero细胞作为WHO推荐的疫苗生产的哺乳动物细胞系，其安全性已经得到了很好的证明，可是流感疫苗生产使用的骨架病毒株PR8是鸡胚的适应株，对于哺乳动物细胞系Vero的适应性不够好，不能够达到生产的要求。

因此，本发明人将PR8毒株同其他较为适应哺乳动物细胞系的毒株WSN进行重组，改善了PR8在Vero细胞上的适应性。利用反向遗传技术将PR8毒株的基因(除了HA、NA)同WSN进行替换，通过比较空斑大小，只有来自WSN的NS基因替换PR8的NS基因后，重组病毒PR8-WSN NS能够在Vero细胞上形成比PR8更大的空斑(图1A)。而重组病毒PR8-WSN M(来自WSN的M基因替换PR8的M基因)和PR8-WSN 4P(来自WSN聚合酶复合体基因PB1,PB2,PA和NP替换PR8聚合酶复合体基因PB1,PB2,PA和NP)只能形成和PR8类似的针尖样空斑(图1，A)。进一步的，以MOI＝0.001接种病毒，感染Vero细胞，绘制病毒生长曲线，只有PR8-WSN NS病毒的生长速度病明显高于PR8病毒，并接近WSN病毒的生长速度(图1，B)。在感染后24h，PR8-WSN NS的病毒滴度要比PR8病毒高约128倍(PR8-WT和PR8-WSN NS的病毒滴度分别是2.9*10^3pfu/ml和3.7*10^5pfu/ml,)。在感染后48h，PR8-WSN NS的病毒滴度要比PR8病毒高约55倍(PR8-WT和PR8-WSN NS的病毒滴度分别是3.3*10^4pfu/ml和1.8*10^6pfu/ml)(图1，B)。

以上数据表明，来自WSN的NS基因能够使PR8在Vero细胞上的生长速度明显提高，改善了PR8在Vero细胞上的适应性。

实施例2、NS2_K86R突变可以促进PR8在Vero上的高速生长。

为了鉴定NS基因上促进PR8在Vero细胞上快速生长的位点，将PR8毒株的NS基因同WSN毒株的NS基因进行了序列比对。PR8的NS基因同WSN的NS基因在核苷酸序列上共有11个非同义突变，位于其核苷酸的第163,301,308,318,512,537,565,660,661,729,784位(图2，A)。由于NS基因在转录成mRNA的时候会发生选择性剪切，形成2种不同的mRNA，分别编码非结构蛋白NS1和出核转运蛋白NS2(NEP)两个蛋白。这11个核苷酸的突变导致了NS1蛋白上的7个氨基酸突变和NS2蛋白上的6个氨基酸突变(图2，A)。

同过反向遗传学的方法，拯救了以PR8为骨架的分别带有所有上述NS基因非同义突变的毒株(103F和106M因已知通过协同作用稳定NS1蛋白同宿主因子CPSF30的结合而同时突变)。以MOI＝0.001接种病毒，感染Vero细胞，通过比较生长曲线，带有核苷酸163(即NS1_K55E),301(即NS1_D101H),565(即NS1_D189M/NS2_M31I),660(即NS2_E63G)和729(即NS2_K86R)位点突变的毒株在不同程度上促进了PR8在Vero上的生长效率，其中，以NS2_K86R突变的促进作用最强(图2，B)。其他位点的突变对PR8在Vero上的生长并没有很明显的作用。由于在NS2_K86R基础上增加其他有促进作用的突变并不能使得病毒滴度进一步提升，因此，NS2_K86R是最主要的促进PR8病毒在Vero细胞中生长的突变。

进一步分析了病毒在Vero细胞中的滴度，以MOI＝0.001接种病毒，在感染Vero细胞后48小时，含有NS2_K86R突变的PR8病毒(PR8-NS2_K86R)能够得到较高的病毒滴度，是PR8病毒滴度的30倍(图3，A),空斑试验表明，NS2_K86R单点突变已经能够使得PR8病毒产生和WSN类似的较大的明显空斑(图3，B)。

实施例3、NS2_K86R的突变不改变PR8的抗原性，以及对小鼠和鸡胚的致病力。

在哺乳动物细胞培养体系中，PR8高产株(PR8-NS2_K86R)具有比PR8野生型病毒更快的生长速度，本发明人需要衡量它对哺乳动物和禽类的致病力是否也相应提高，这对疫苗安全生产具有重要意义。

为了检测NS2K86R的突变是否会影响PR8骨架表达的HA的抗原性，本发明人使用针对PR8病毒HA蛋白的特异性抗血清进行PR8-NS2_K86R高产株的血凝抑制实验，结果表明，NS2_K86R的突变并不改变高产株HA的抗原特异性(表2)。为了衡量PR8高产株(PR8-NS2_K86R)对鸡胚的致死力是否有变化，本发明人测定了PR8，PR8-NS2_K86R两株病毒的鸡胚半数致死量(ELD50)，结果表明两株病毒的ELD50没有显著差异(表1)，这说明PR8高产株不会提高病毒对鸡胚的致病力。本发明人用6-8周龄的雌性BALB/c小鼠测定了PR8，PR8-NS2_K86R两株病毒的株病毒的小鼠半数致死量(MLD50)(表1)。结果表明，两株病毒的MLD50差异不大。这说明PR8高产株不会提高病毒对哺乳动物的致病力。

表2

结论

本发明通过将PR8毒株同WSN毒株重组，找到了提高病毒在哺乳动物细胞如Vero细胞培养体系中生长速度的一个氨基酸位点突变，即：NS2_K86R。这个点突变可以大大提高PR8毒株在哺乳动物细胞培养体系中的产量，而不会提高其对哺乳动物和鸡胚的致病能力。本发明提供了一种高产、安全的，以哺乳动物细胞为培养介质的，适应性改良疫苗病毒株，对疫苗研究和生产具有重要价值。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.甲型流感病毒出核转运蛋白NS2的突变蛋白，其特征在于，所述的突变蛋白的第86位氨基酸由K突变为R。

2.如权利要求1所述的突变蛋白，其特征在于，所述的突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1-2任一所述的突变蛋白。

4.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体，或所述的宿主细胞的染色体整合有权利要求3所述的多核苷酸。

6.一种重组型PR8甲型流感病毒株，其特征在于，所述PR8甲型流感病毒株NS2蛋白的第86位氨基酸突变由K突变为R。

7.一种病毒拯救系统，其特征在于，所述病毒拯救系统含有表达甲型流感病毒出核转运蛋白NS2突变蛋白的表达载体。

8.权利要求1所述突变蛋白或其编码基因、权利要求5所述表达载体或权利要求6所述宿主细胞、权利要求7所述宿主细胞的用途，其特征在于，用于制备权利要求7所述的重组型PR8甲型流感病毒株。

9.一种制备权利要求6所述重组型PR8甲型流感病毒株的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求7所述的病毒拯救系统。

10.一种制备权利要求6所述重组型PR8甲型流感病毒株的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供权利要求7所述的病毒拯救系统，其含有表达甲型流感病毒出核转运蛋白NS2突变蛋白的表达载体，和表达野生型PR8甲型流感病毒株所需蛋白的其他表达载体；所述野生型PR8甲型流感病毒株所需蛋白的其他表达载体包括表达选自下组蛋白的载体：RNA多聚酶PB2、RNA多聚酶PB1、RNA多聚酶PA、血凝素HA、核外壳核蛋白NP、神经酰胺酶NA、基质蛋白M1和M2、和非结构蛋白NS1；

(b)将步骤(a)中的病毒拯救系统转染宿主细胞，培养所述的宿主细胞，从而获得权利要求6所述的重组型PR8甲型流感病毒株。