CN112852762B - 新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株及其构建方法，属于病毒疫苗株构建技术领域。本发明新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株的构建方法，是将副粘病毒科VII型新城疫病毒的N、F基因与同属于副粘病毒科的犬瘟热病毒的P、M、H、L基因进行重组，将新型冠状病毒S1基因插入重组病毒的P基因与M基因之间获得新型冠状病毒肺炎副粘病毒的全基因组；通过反向遗传操作构建而成。本发明构建的新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株能够稳定高效表达新冠S1蛋白，注射动物后能够诱导机体产生抗体。而且，可以在禽类和犬类中进行实验，能够节约时间、降低成本，同时由于其产量大，更利于实际生产。

Description

新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株及其构建方法
技术领域
本发明属于病毒疫苗株构建技术领域，具体涉及一株新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株及其构建方法。
背景技术
2019年以来，新冠病毒肆虐，在全球广泛传播，造成了大量的人员伤亡。目前虽有疫苗问世，但产量较低，远远不能满足市场需要。目前有研究表明，新冠S蛋白在病毒感染以及诱导产生中和抗体方面有重要作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一株新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株及其构建方法。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株的构建方法，将VII型新城疫病毒的N、F基因与犬瘟热病毒的P、M、H、L基因进行重组，将新冠病毒S1基因插入重组病毒的P基因与M基因之间获得新型冠状病毒肺炎副粘病毒的全基因组；通过反向遗传操作构建而成。
在本发明的一个实施例中，所述反向遗传操作为：将构建的新型冠状病毒肺炎副粘病毒的全基因组重组载体与分别包含NP、P、L基因的三个辅助重组质粒转染能够表达T7RNA聚合酶的细胞系；经培养获得新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株。
在本发明的一个实施例中，所述能够表达T7 RNA聚合酶的细胞系是由T7 RNA聚合酶基因与PCI-neo载体连接后，转染BHK-21细胞获得的。
上述方法构建的新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株，保藏编号为CCTCC NO:V202119，地址为中国武汉，武汉大学的中国典型培养物保藏中心。
上述新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株在制备疫苗中的应用。
在上述方案的基础上，所述疫苗对2019-nCoV引起的新型冠状病毒肺炎具有预防保护作用。
本发明技术方案的优点
本发明将新冠病毒S1基因插入重组病毒载体，构建的新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株能够稳定高效表达新冠S1蛋白，注射动物后能够诱导机体产生抗体。该种方法改造的疫苗株可以方便在鸡胚中繁殖且操作简单，成本低、产量大，更利于实际生产。而且该疫苗株也可以在禽类和犬类中进行实验，能够节约时间、降低成本。
此外，现有痘病毒、腺病毒载体存在预存免疫，疱疹病毒的亲神经性可能导致安全问题。本发明中采用的犬瘟热病毒属于副粘病毒科病毒，麻疹病毒属，对哺乳动物细胞具有侵染性但对人不致病，犬瘟热病毒能够稳定表达外源蛋白，而且非人为情况下几乎不会发生基因突变现象，是一种良好的疫苗载体。新城疫病毒属于副粘病毒科病毒，可以在哺乳动物细胞或者9-11日龄鸡胚中繁殖培养，具有操作简单，成本低、产量大等优点。最终，本发明方法构建的疫苗株在细胞质进行复制，不会整合到宿主基因组中，且病毒载体几乎不发生基因突变，安全性高；可在鸡胚上增殖，生产成本低。
附图说明
图1新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株表达S1蛋白的鉴定。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株的构建方法
(1)表达T7 RNA聚合酶细胞系的建立
取BL21菌种摇菌，提质粒。设计引物(下划线表示酶切位点)：
T7-F：5’-CTGCTCGAGCCACCATGAACACGATTAACATCGCTAAGAACGAC-3’(SEQ ID NO:1)；
T7-R：5’-CTGTCTAGATTACGCGAACGCGAAGTCCGACTCTAAGATGT-3’(SEQ ID NO:2)；
酶切位点为：上游Xho I，下游Xba I(划线标出)；以提取的BL21的质粒为模板进行扩增，回收目的片段，约2.6kb。将PCI-neo载体与回收目的片段分别进行双酶切，胶回阳性片段，用T4连接酶进行连接、转化，质粒小提后进行PCR及酶切鉴定，选阳性质粒送生工测序。获得含有T7 RNA聚合酶基因的重组质粒。
用含6％胎牛血清的DMEM培养BHK-21细胞，接种6孔板，待细胞长至70％左右时按照脂质体转染试剂盒说明书将制备的携带T7 RNA聚合酶基因的重组质粒对BHK-21细胞进行转染。转染24小时后，换成含700ng/mL的G418培养基加压筛选。传至25代时提取细胞RNA，反转录后进行RT PCR鉴定。最终获得可稳定持续表达T7 RNA聚合酶基因的BHK-21细胞系。
(2)重组表达载体pBR322-CDV-NPF的构建
提取犬瘟热病毒及VII型新城疫病毒的RNA，设计引物进行RT-PCR，通过酶切及同源重组方法构建重组病毒的全基因组序列，重组病毒的全基因组序列分为8段进行克隆，引物为(下划线表示酶切位点)：
1-F：5’-GGAATTCTAATACGACTCACTATAGACCAAACAGAGAATCTGTGAGG-3’(SEQ ID NO:3)；
1-R：5’-GTAACACTGGTCTTGAATATTCAGTACCCCCAATCAGTGTCG-3’(SEQ ID NO:4)；
2-F：5’-CGACACTGATTGGGGGTACTGAATATTCAAGACCAGTGTTAC-3’(SEQ ID NO:5)；
2-R：5’-CGACGCGTCCGCGGGATGATGCGGGTTGCTTG-3’(SEQ ID NO:6)；
3-F：5’-CATCCCGCGGTAATCGGAAGG-3’(SEQ ID NO:7)；
3-R：5’-CGACGCGTGCCCATGGGGCTTGTCTGTTCG-3’(SEQ ID NO:8)；
4-F：5’-CCCCATGGGCTCCAAACCTTC-3’(SEQ ID NO:9)；
4-R：5’-GACGTGTGACCAGATTGCTTCATGCTCTCGTGGTGGCTCTC-3’(SEQ ID NO:10)；
5-F：5’-GAGAGCCACCACGAGAGCATGAAGCAATCTGGTCACACGTC-3’(SEQ ID NO:11)；
5-R：5’-CGACGCGTGATAAGCTTGTCCAGTGCATCTC-3’(SEQ ID NO:12)；
6-F：5’-GACAAGCTTATCGGGGCCAAAATTG-3’(SEQ ID NO:13)；
6-R：5’-CTAAAGCTTCATCCTCGTCCTG-3’(SEQ ID NO:14)；
7-F：5’-GAAGCTTTAGCCGCTTTCTTGATG-3’(SEQ ID NO:15)；
7-R：5’-CGACGCGTCTGCTAGCAGATATCTGGCTTAG-3’(SEQ ID NO:16)；
8-F：5’-CTGCTAGCAGTCTTGGATTGATTC-3’(SEQ ID NO:17)；
8-R：5’-CGACGCGTACGCGTCAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAA
GGGGTTATGCTAGACCAGACAAAGCTGGGTATGATAAC-3’(SEQ ID NO:18)；
其中第1段(1-F、1-R)和第4段(4-F、4-R)引物是以VII型新城疫病毒为模板扩增；其余均以犬瘟热病毒为模板扩增；扩增完成后，胶回各片段，各段序列通过酶切及同源重组方法构建重组病毒的全基因组序列，并在该全基因组序列上游加入T7起始序列，下游加入T7终止序列，连入PBR322载体，构建重组质粒pBR322-CDV-NPF。
(3)辅助质粒的构建
以上述构建的pBR322-CDV-NPF质粒为模板分别克隆NP，P，L基因，PCR引物如下(下划线表示酶切位点)：
NP-F：5’-GCTCTAGAATGTCGTCTGTTTTCGACGAATAC-3’(SEQ ID NO:19)；
NP-R：5’-TCCCCCGGGTCAGTACCCCCAATCAGTGTC-3’(SEQ ID NO:20)；
P-F：5’-GCTCTAGAATGGCAGAGGAGCAGGCCTATC-3’(SEQ ID NO:21)；
P-R：5’-TCCCCCGGGTCAGTACCCCCAATCAGTGTCG-3’(SEQ ID NO:22)；
L-F：5’-GCTCTAGAATGGACGCCGTCTCAGTGAAC-3’(SEQ ID NO:23)；
L-R：5’-TCCCCCGGGTCAGTGGTTTCTAATCAGTGC-3’(SEQ ID NO:24)；
将胶回收PCR产物及PCI-neo质粒分别用Xba I/Sma I进行双酶切，回收酶切产物，T4DNA连接酶16℃连接4h，连接产物转化XL 10化学感受态细胞，37℃过夜培养。挑单克隆接种在含有氨苄抗性的液体培养基中，37℃，220rmp过夜培养。对单菌落进行PCR鉴定，对阳性克隆进行测序。获得测序正确的质粒，分别命名为pCI-neo-NP，pCI-neo-P，pCI-neo-L。
(4)新型冠状病毒肺炎副粘病毒的全基因组重组载体的构建
由上海生工生物工程有限公司合成新冠的S1基因，该基因的序列为：
Figure BDA0003005866020000041
Figure BDA0003005866020000051
将合成的质粒nCoV2019-iS1干粉离心加入100μL无菌水，取1μL作为模板，设计引物：
nCoV2019-S1-F：5’-GAACTGCTTTCACCATCGTTTAAACTTAAGAAAAAACACGG-3’(SEQ IDNO:26)；
nCoV2019-S1-R：5’-CTAAGTTTTTTATAATTGCGTTTAAACGGGTCAGGAGTTGGTCTG-3’(SEQID NO:27)；
用高保真酶进行扩增，获得新冠S1基因片段，胶回收S1片段。采用Pme I单酶切pBR322-CDV-NPF质粒，将线性化的pBR322-CDV-NPF载体和S1片段进行同源重组，将连接产物转化XL 10化学感受态细胞，37℃过夜培养。挑单克隆接种在含有氨苄抗性的液体培养基中，37℃，220rmp过夜培养。对单菌落进行PCR鉴定，对阳性克隆进行测序。获得正确连入S1基因的表达载体，质粒命名为pBR322-CDV-NPF-S1。
(5)细胞转染和病毒拯救
转染前一天，将适量步骤(1)构建的表达T7 RNA聚合酶的BHK-21细胞传代至6孔板，加入不含双抗的培养基。第二天细胞密度约为80％左右时进行转染，将步骤(3)构建的pCI-neo-NP，pCI-neo-P，pCI-neo-L三个辅助质粒及步骤(4)构建的pBR322-CDV-NPF-S1质粒转染细胞，60小时后收集细胞上清。将细胞上清过0.22μm滤膜后接种9-11日龄鸡胚，3天后收尿囊液进行血凝试验，效价在7-8log2之间。取200μL尿囊液按照RNA提取试剂盒说明进行RNA提取，反转录后进行RT-PCR扩增S1基因，将PCR产物送测序。，测序结果与重组后序列一致，表明病毒拯救成功。
将上述成功拯救的病毒于2021年2月11日保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏编号为CCTCC NO:V202119，保藏名称为：重组表达新冠病毒S1蛋白的副粘病毒株(rCNDV-S)地址为中国.武汉.武汉大学。
实施例2新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株生物活性鉴定
采用Western Blot试验检测S1蛋白的表达：将实施例1构建的转染pBR322-CDV-NPF-S1质粒后的细胞上清液作为样品组，空载体转染的细胞上清作为对照组，进行WesternBlot检测。将样品组、对照组及蛋白marker进行电泳，至溴酚蓝染料处于凝胶末端时停止电泳，进行转膜，转膜过程中保持低温。转膜后用脱脂奶粉封闭1小时。加入适量能够与新冠S1蛋白受体区结合的一抗37℃孵育1小时，TBST清洗4次后加入带有荧光标记的能够与一抗结合的二抗，37℃孵育1小时，TBST清洗4次。1:1加入发光液，显影。
结果为对照组无条带，样品组有明显条带如图1所示。说明样品组中S1蛋白表达，并且表达的S1蛋白具有免疫学活性。
实施例3新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株动物免疫原性
将本发明制备的新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株免疫兔子，每只兔子通过点眼滴鼻免疫104EID50剂量的病毒液，共免疫30只；同时设置生理盐水对照组10只；分别饲养于不同隔离器中。19天后对免疫动物进行采血，将血液1500r离心5分钟，取血清进行抗体检测。
以比格犬为模型的动物免疫原性试验方法同上。
实验结果：采用本发明制备的新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株处理的动物血清中均能检测到抗体，对照组无抗体。说明本发明制备的新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株能够诱导兔子和比格犬产生免疫应答，对动物具有保护作用。
实施例4新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株的稳定性
取实施例3方法免疫的兔子的肺部组织进行研磨，生理盐水稀释后，随机另取5只健康的兔子每只接种100μL，编号为1-5。7天后将1-5号兔子肺部组织研磨后用生理盐水稀释，无菌处理后，再另随机接种5只健康兔子，编号6-10。依次类推，最后将25-30号兔子肺部组织研磨后用生理盐水稀释，接种最后5只健康兔子，编号31-35。对7组兔子进行重组病毒检测，同时提取RNA反转录成cDNA，进行RT-PCR扩增S1基因，如有阳性基因则送生工生物进行测序。
以比格犬为动物模型的稳定性试验方法同上。
实验结果：进行动物稳定性试验的35只兔子和35只比格犬中均可检测到重组病毒。分析比对S1基因的测序结果，与插入载体的S1基因序列相同，说明该重组病毒并未发生突变，传代稳定，也没有发生病毒的毒力返强现象。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 青岛海华生物医药技术有限公司
青岛海润检测股份有限公司
<120> 新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株及其构建方法
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgctcgagc caccatgaac acgattaaca tcgctaagaa cgac 44
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgtctagat tacgcgaacg cgaagtccga ctctaagatg t 41
<210> 3
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaattctaa tacgactcac tatagaccaa acagagaatc tgtgagg 47
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtaacactgg tcttgaatat tcagtacccc caatcagtgt cg 42
<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgacactgat tgggggtact gaatattcaa gaccagtgtt ac 42
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgacgcgtcc gcgggatgat gcgggttgct tg 32
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catcccgcgg taatcggaag g 21
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgacgcgtgc ccatggggct tgtctgttcg 30
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccccatgggc tccaaacctt c 21
<210> 10
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacgtgtgac cagattgctt catgctctcg tggtggctct c 41
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gagagccacc acgagagcat gaagcaatct ggtcacacgt c 41
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgacgcgtga taagcttgtc cagtgcatct c 31
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gacaagctta tcggggccaa aattg 25
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctaaagcttc atcctcgtcc tg 22
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gaagctttag ccgctttctt gatg 24
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgacgcgtct gctagcagat atctggctta g 31
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctgctagcag tcttggattg attc 24
<210> 18
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgacgcgtac gcgtcaaaaa acccctcaag acccgtttag aggccccaag gggttatgct 60
agaccagaca aagctgggta tgataac 87
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gctctagaat gtcgtctgtt ttcgacgaat ac 32
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcccccgggt cagtaccccc aatcagtgtc 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gctctagaat ggcagaggag caggcctatc 30
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcccccgggt cagtaccccc aatcagtgtc g 31
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gctctagaat ggacgccgtc tcagtgaac 29
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tcccccgggt cagtggtttc taatcagtgc 30
<210> 25
<211> 2043
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒(2019-nCoV)
<400> 25
atgttcgtgt tcctggtgct gctgcctctg gtgagctccc agtgcgtgaa cctgaccacc 60
agaacccagc tgccacctgc ctacaccaac tcctttacca ggggcgtgta ttaccctgac 120
aaggtgttca gaagctccgt gctgcactcc acacaggacc tgttcctgcc attcttttcc 180
aacgtgactt ggttccacgc catccatgtg tctggcacca atggcacaaa gaggtttgac 240
aatccagtgc tgcctttcaa tgacggcgtg tattttgcct ccacagagaa gtctaatatc 300
atcagaggct ggatcttcgg cacaaccctg gattctaaga cccagtccct gctgatcgtg 360
aataatgcca ccaacgtcgt gatcaaggtg tgtgagtttc agttctgcaa cgaccctttc 420
ctgggcgtgt actaccacaa gaataacaag tcttggatgg agtctgagtt ccgggtgtac 480
tctagcgcta ataactgtac cttcgagtac gtgagccagc cctttctgat ggacctggag 540
ggcaagcagg ggaactttaa gaacctgagg gagttcgtgt tcaagaacat tgacggctac 600
tttaagatct attctaagca cacaccaatc aacctggtga gggatctgcc tcagggcttc 660
tccgccctgg agcccctggt ggacctgcct atcggcatca acatcaccag attccagacc 720
ctgctcgctc tgcatagaag ctacctgacc cccggcgaca gctcttccgg atggaccgct 780
ggcgctgccg cctactacgt gggctacctg cagccccgga ccttcctgct gaagtacaat 840
gagaacggaa ccatcaccga cgccgtggac tgtgctctgg accccctgag cgagaccaag 900
tgcactctga agtccttcac cgtggagaag ggcatctacc agacttctaa ctttcgggtg 960
cagcctaccg agtccattgt gcggttccct aacatcacta atctgtgccc attcggcgag 1020
gtgtttaacg ccacccggtt cgctagcgtg tacgcctgga acaggaagcg catctccaac 1080
tgtgtggccg actactctgt gctgtacaat tctgccagct tttctacctt caagtgttac 1140
ggcgtgagcc caacaaaact gaacgacctg tgctttacca acgtgtacgc cgacagcttc 1200
gtgatcaggg gcgatgaggt gagacagatc gcccctggcc agaccggcaa gatcgccgac 1260
tataactaca agctgcctga tgatttcacc ggatgcgtga tcgcctggaa ctctaacaat 1320
ctggatagca aggtgggcgg gaattacaac tacctgtaca gactgttcag aaagtccaac 1380
ctgaagcctt tcgagcggga catctccacc gagatctacc aggctggatc aaccccctgc 1440
aacggcgtgg agggctttaa ttgttacttt cccctgcagt cttacggctt ccagcccacc 1500
aacggcgtgg gctaccagcc ttatagagtg gtggtgctga gctttgagct gctgcacgcc 1560
cctgccaccg tgtgcggccc taagaagtct acaaacctgg tgaagaataa gtgcgtgaac 1620
tttaatttca acggcctgac cggcaccggc gtgctgaccg agagcaacaa gaagttcctg 1680
cccttccagc agttcggaag ggacatcgcc gatacaaccg acgccgtgag agacccacag 1740
accctggaga tcctggacat caccccttgt agctttggcg gcgtgagcgt gatcacccct 1800
ggcaccaaca cctccaacca ggtggccgtg ctgtaccagg acgtgaattg cactgaggtg 1860
cctgtggcta tccacgctga ccagctgacc cctacctgga gagtgtatag caccggatcc 1920
aacgtgttcc agaccagagc tggctgcctg atcggcgctg agcacgtgaa taacagctat 1980
gagtgtgaca tccccatcgg cgccggcatc tgcgctagct accagaccca gaccaactcc 2040
tga 2043
<210> 26
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gaactgcttt caccatcgtt taaacttaag aaaaaacacg g 41
<210> 27
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ctaagttttt tataattgcg tttaaacggg tcaggagttg gtctg 45

Claims (6)

1.一株新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株的构建方法，其特征在于，将副粘病毒科VII型新城疫病毒的N、F基因与同属于副粘病毒科的犬瘟热病毒的P、M、H、L基因进行重组，将新型冠状病毒S1基因插入重组病毒的P基因与M基因之间获得新型冠状病毒肺炎副粘病毒的全基因组；通过反向遗传操作构建而成。
2.根据权利要求1所述新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株的构建方法，其特征在于，所述反向遗传操作为：将构建的新型冠状病毒肺炎副粘病毒的全基因组重组载体与分别包含NP、P、L基因的三个辅助重组质粒转染能够表达T7 RNA聚合酶的细胞系；经培养获得新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株。
3.根据权利要求2所述新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株的构建方法，其特征在于，所述能够表达T7 RNA聚合酶的细胞系是由T7 RNA聚合酶基因与PCI-neo载体连接后，转染BHK-21细胞获得的。
4.权利要求1-3任一项所述方法构建的新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株，其特征在于，保藏编号为CCTCC NO:V202119，地址为中国武汉，武汉大学的中国典型培养物保藏中心。
5.权利要求4所述新型冠状病毒肺炎副粘病毒疫苗株在制备疫苗中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述疫苗对2019-nCoV引起的新型冠状病毒肺炎具有预防保护作用。
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