CN109295095A - 一种热稳定的基因viii型新城疫弱毒株外源基因表达载体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及兽医病毒分子生物学领域，公开了一种热稳定的基因Ⅷ型新城疫弱毒株外源基因表达载体，所述表达载体是新城疫病毒NDV‑rAHR09‑GFP‑1，它的保藏号为CCTCC NO:V201844。研究表明，NDV‑rAHR09‑GFP‑1在自然条件下具有良好的热稳定性，56℃、90min仍保持血凝活性和感染能力，能稳定表达GFP基因。

Description

一种热稳定的基因VIII型新城疫弱毒株外源基因表达载体
技术领域
本发明属于兽医病毒分子生物学技术，具体涉及一种热稳定的基因VIII型新城疫弱毒株外源基因表达载体。
背景技术
新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)的成员[Mayo,M.A.2002.Virus taxonomy-Houston 2002.ArchVirol 147:1071-1076.]。NDV有囊膜，基因组为单股、负链、不分节段的RNA病毒，基因组结构模式为：3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋；(L)即核蛋白(NP)，P，M，F，HN和L蛋白。根据对鸡的毒力，NDV毒株可以为强毒(Velogenic)、中等毒力(mesogenic)和弱毒(Lentogen)三种类型。已有大量研究阐明了病毒致病性的分子决定因素[Huang Z,Krishnamurthy S,Panda A,Samal SK.Newcastle disease virus V protein isassociated with viral pathogenesis and functions as an alpha interferonantagonist.Journal of virology 2003 Aug；77(16):8676-85.]，其中大部分是关于F和HN蛋白对病毒毒力的作用，特别是一致认为F蛋白裂解位点处的氨基酸序列是病毒毒力的主要决定因素[Seal BS.Nucleotide and predicted amino acid sequence analysis ofthe fusion protein and hemagglutinin-neuraminidase protein genes amongNewcastle disease virus isolates.Phylogenetic relationships among theParamyxovirinae based on attachment glycoprotein sequences.Funct IntegrGenomics 2004 Oct；4(4):246-57.]。NDV毒力差异的分子基础主要决定于F0蛋白的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列，强毒的裂解位点两端有成对的碱性氨基酸序列，其模式基序为112GR/K-R-Q-K/R-R-F117；弱毒的裂解位点则缺少聚碱性氨基酸序列，其模式基序为112-E/G-R/K-Q-E/G-R-L117。
新城疫病毒(NDV)弱毒作为载体表达外源蛋白，以此作疫苗可以引起广泛的保护性免疫反应，包括体液免疫和细胞免疫，以及全身和粘膜免疫，其安全性已在许多动物模型中得到证实(Huang,Z.,Elankumaran,S.,Panda,A.,Samal,S.K.,2003.RecombinantNewcastle disease virus as a vaccine vector.Poult.Sci.82,899–906.Ge,J.,Wang,X.,Tao,L.,Wen,Z.,Feng,N.,Yang,S.,Xia,X.,Yang,C.,Chen,H.,Bu,Z.,2011.Newcastledisease virus-vectored rabies vaccine is safe,highly immunogenic,and provideslong-lasting protection in dogs and cats.J.Virol.85,8241–8252.Duan,Z.,Xu,H.,Ji,X.,Zhao,J.,2015.Recombinant Newcastle disease virus-vectored vaccinesagainst human and animal infectious diseases.Future Microbiol.10,1307–1323.)。NDV作为一种安全高效的疫苗载体，学术上已经得到认可，NDV弱毒株是潜在的病毒载体，可用于开发用于动物和/或人类的抗原传递疫苗(Kim SH,Samal SK.Newcastle diseasevirus as a vaccine vector for development of human and veterinaryvaccines.Viruses 2016；8:E183.)。
NDV具有许多作为活毒疫苗载体的优点。NDV作为负链RNA病毒，与其同源的RNA病毒不发生重组现象，这使载体更稳定和安全；在大多数情况下，这些病毒不会因大量表达外源基因而引起自身复制的严重减弱；另外，作为负链RNA病毒的致弱疫苗对人和动物无致病性，是一种安全载体，与那些基因组需要编码大量蛋白的病毒如腺病毒、疱疹病毒载体相比，NDV仅编码七种蛋白，因此在免疫时载体蛋白对表达的外源蛋白影响较小。
随着反向遗传技术的发展，活病毒作为载体逐渐成为研究热点。反向遗传技术是指在生物体体外构建RNA病毒的感染性克隆，通过逆转录的方式将病毒基因组RNA转成cDNA，并使其在RNA聚合酶启动子控制下，通过体外转录的方式产生病毒RNA，转染哺乳动物细胞可拯救到活的病毒。1999年Peeters等人首次建立了NDV的反向遗传平台，他们首先在体外构建具有感染性的分子克隆，然后将NDV的全长cDNA插入转录载体，该转录载体还含有T7RNA聚合启动子，再将其与表达NP、P、L基因的三个辅助表达质粒共转染能够启动T7启动子的细胞系中，最后收取转染产物接种9-11日龄鸡胚，使病毒在鸡胚中增殖，最终拯救出具有感染性的病毒。该反向遗传平台的建立为以NDV作为外源基因表达载体的构建打下了基础。
第一个新城疫重组病毒诞生于2000年由Krishnmurphy等人以中等毒力毒株Beaudette C株为载体，将氯霉素乙酰转移酶(CAT)成功插入到其全长cDNA的HN基因和L基因之间的非编码区而成功获得重组病毒。此后，以NDV作为载体表达各种外源基因的重组病毒不断有报道(Kang-Seuk Choi，NDV vectored vaccine，Clin Exp Vaccine Res，2017；6:72-82，https://doi.org/10.7774/cevr.2017.6.2.72)。目前，公开报道作为载体的NDV毒株均是不耐热的毒株，以它们为载体所构建的重组疫苗毒株均不具有耐热性。然而作为弱毒活疫苗，在保存、运输过程中需要冷链维持，一般是在疫苗中添加耐热保护剂，但技术复杂且成本高。本身具有耐热性的毒株则可减少对冷链的依赖，对于热带及偏远乡村地区有效使用疫苗有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种热稳定的基因VIII型新城疫弱毒株外源基因表达载体。
本发明利用反向遗传操作系统，基于新城疫病毒(NDV)耐热毒株HR09的基因组序列，构建了耐热的可表达外源基因的NDV基因VIII型弱毒载体表达系统，表达GFP基因的重组病毒鉴定结果说明，该表达系统能够有效表达外源基因，重组病毒具有耐热特性。
本发明所述的一种热稳定的基因Ⅷ型新城疫弱毒株外源基因表达载体，是新城疫病毒NDV-rAHR09-GFP-1，它的保藏号为CCTCC NO:V201844。
本发明以耐热的NDV毒株HR09为基础，利用反向遗传操作系统对病毒F基因突变，并在P基因和M基因之间构建合适的插入位点，建立了一个表达外源基因的载体系统，经插入GFP基因，获得了耐热的稳定表达GFP的重组病毒NDV-rAHR09-GFP-1。
所述NDV-rAHR09-GFP-1的具体构建步骤如下：
(1)基因Ⅷ型耐热NDV/HR09株反向遗传操作系统的建立与致弱株拯救
构建耐热的NDV/HR09株基因组cDNA的全长克隆以及含有该毒株NP、P和L基因的3个真核表达载体，经共转染BSR-T7/5细胞，拯救获得感染性克隆NDV/rHR09株，获救病毒耐热性测定结果显示，56℃处理60min仍有血凝活性，测定NDV/rHR09株的MDT值、ICPI值，证明其仍为NDV强毒株，证明成功构建了NDV/HR09株反向遗传操作系统。设计两对引物，经Overlap PCR的方法将NDV/rHR09毒株F蛋白裂解位点第112、115和117位的碱性氨基酸突变成与弱毒株相关的非碱性氨基酸，构建全长cDNA转录载体prNDV/HR09，将转录载体prNDV/HR09与3个辅助表达质粒共转染BSR-T7/5细胞，拯救出病毒NDV/rAHR09。经56℃、45min处理，NDV/rAHR09株仍具有血凝性，MDT值>120h，ICPI值为0.057。表明NDV/HR09株已经成功致弱，并保留了原毒株的耐热性。
(2)外源基因插入位点的确定与含PmeI酶切位点的全长质粒p-VHR09的构建
经文献比较，选择NDV/HR09株的P基因和M基因之间的基因间隔区域作为外源基因的插入区域。由于HR09株在该区域没有合适的酶切位点供外源基因插入，经分析，确定通过定点突变的方法改造出一个在基因组中唯一的Pmel酶切位点供外源基因插入。
PmeI酶切位点为GTTTAAAC，NDV/HR09株基因P与基因M间隔区位于基因组序列3081-3296之间，本发明在基因组序列3227-3234之间(序列为GGTTAATC)进行定点突变，改造出一个PmeI酶切位点，构建相应的质粒，便于进行外源基因的插入。该酶切位点在基因组中是唯一的。
再利用上述反向遗传操作系统，以含有新构建的酶切位点的质粒替换致弱的HR09株全长克隆上的相应片段，构建成功具有PmeI酶切位点、F基因裂解位点序列突变致弱的HR09株全长质粒p-VHR09。
(3)耐热重组病毒NDV-rAHR09-GFP-1的拯救与鉴定
从pEGFP-N1质粒扩增GFP基因，添加NDV基因的起始序列和基因终止序列，利用无缝克隆技术与质粒p-VHR09进行重组，获得包含GFP基因的全长cDNA转录载体pNDV-rAHR09-GFP-1(构建模式如图6)。经鉴定后，与辅助质粒共转染细胞，获得重组病毒NDV-rAHR09-GFP-1，经细胞培养观察GFP表达情况，并对拯救病毒进行血凝试验和耐热试验，证明载体病毒的稳定性。
利用该载体系统可有效表达外源基因，经GFP基因检验，证明其有效。
构建的重组病毒具有较好的耐热性，56℃、90min仍有血凝活性，作为重组疫苗可以减少对冷链的依赖，有重要的经济价值。
附图说明
图1是HR09株全基因组cDNA转录载体的构建示意图
图2是RT-PCR分段扩增的全基因组6个片段电泳图。M：200bp；1-6分别为V1，R1，R2，R3，L1，V2片段。
图3是NDV/HR09株全基因组cDNA转录载体酶切鉴定结果。M:DL15000 1.质粒pNDV/HR09；2、3经HpaI酶切后的pNDV/HR09
图4是辅助质粒共转染后GFP表达效果图。
图5是病毒感染性克隆PCR鉴定结果图。M:200bp Marker 1、2:引物9扩增片段
图6是NDV-rAHR09-GFP-1构建示意图。
图7是NDV-rAHR09-GFP-1酶切鉴定图；
M：DL15000
1：Hpal,酶切NDV-rAHR09-GFP-1条带正确，
2：pmel酶切p-VHR09条带正确，
3：pmel酶切rHR09没有酶切位点，未切开正确。
图8是重组病毒CEF培养荧光观察图。
本发明的新城疫病毒NDV-rAHR09-GFP-1于2018年7月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉大学；分类命名为：新城疫病毒NDV-rAHR09-GFP-1；保藏编号为CCTCC NO:V201844。
具体实施方式
一、基因Ⅷ型耐热NDV/HR09株反向遗传操作系统的建立
试验涉及的主要试验材料与方法如下：
NDV/HR09(Cao Y,Liu Q,Zhang X,Hu H,Wu Y.2017.Complete genome sequenceof heatresistantNewcastle disease virus strain HR09.Genome Announc 5:e01149-17.https://doi.org/10.1128/genomeA.01149-17.)，GenBank登录号MF285077。
细胞及鸡胚：能稳定表达T7RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞和微基因组TVT-LGT由中国农业科学院上海兽医研究所惠赠，TVT7R(0.0)转录载体由本实验室保存，SPF鸡胚由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供。
实验试剂：细胞培养基DMEM购自上海源培生物科技有限公司，新生胎牛血清购自GIMINI公司，Easytaq DNA聚合酶、pEASYTM-Blunt克隆载体、pCR2.1克隆载体、Trans-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；TRIzol Reagent、M-MLV反转录体系、高保真DNA聚合酶、dNTP购自北京全式金生物技术有限公司，DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司，DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司，Q5限制性内切酶(ApaⅠ、BsmBⅠ、MluⅠ、BbsⅠ、SpeⅠ、NotⅠ、XbaⅠ)等购自NEB公司，T4DNA Ligase、限制性内切酶FspAⅠ购自Thermo Fisher公司。EndoFree Plasmid Midi Kit购自北京康为世纪生物科技有限公司。其它普通生化试剂均为国产分析纯试剂。
主要仪器设备：PCR仪(美国Applied Biosystems公司)，恒温金属浴(杭州博日科技有限公司)，台式高速离心机及微量移液器(德国eppendorf公司)，电泳仪及凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。
引物设计与合成：根据NDV/HR09的全基因序列(GenBank登录号MF285077)，运用Primer Premier5.0软件设计6对引物对其全基因进行分段扩增，构建示意图见图1。将基因组13048位碱基作为拯救病毒的分子标记。引物序列见表1，辅助质粒构建引物见表2，引物均由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。
表1 NDV/HR09株全长cDNA分段扩增引物
表2构建NDV/HR09辅助质粒所用引物
1.HR09株全基因组cDNA各片段的克隆与测序
按照文献的方法提取病毒RNA并进行反转录。以获得的cDNA为模板，目的片段L1用高保真DNA聚合酶扩增，其余目的片段均用Q5酶进行扩增。
PCR反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳对所有PCR产物进行检测，紫外线下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，切碎，并参照DNA凝胶回收试剂盒说明书，对扩增的目的片段进行回收，按照pEASYTM-Blunt Cloning Kit说明书进行，将回收的产物与pEASY TM-Blunt克隆载体放置于1.5mL的指形管中连接(片段L1的胶回收产物与pCR2.1载体连接)，每管加入30μL Trans-T1感受态细胞，轻轻混匀，立即放入冰中，冰浴30min；42℃水浴锅中热激30s，放置冰上冷却5min；加入600μL LB培养基，37℃摇床上按照200r/min的转速振荡1h，取出后5000r/min离心5min；剩余约100μL上清，将沉淀重悬后涂布在含氨苄青霉素的LB平板上，37℃温箱倒置培养12～16h；次日挑选5个单菌落分别接种含氨苄青霉素的LB液体培养基培养过夜。按照pEASYTM-Blunt Cloning Kit说明书提供的方法，用引物M13F和M13R通过PCR方法进行鉴定。PCR鉴定阳性的克隆送至安徽通用公司测序。测序正确的克隆分别命名为T-R1、T-R2、T-R3、T-V1、T-V2、T-NP、T-P、T-L1、T-L2、T-L3。
对NDV/HR09全长基因组进行分段扩增，获得共6个DNA片段，经鉴定，片段大小与预期一致(如图2)。
2.NDV/HR09株全基因组cDNA转录载体的构建
NDV/HR09全基因组各片段重组质粒的提取：将含有各目的片段克隆的母液分别接种含氨苄青霉素的LB培养基进行培养，利用EndoFree Plasmid Midi Kit，按照使用说明书提取质粒，并进行浓度和纯度的测定。
NDV/HR09基因组5’端及3’端的连接：质粒T-V1和T-V2经NotⅠ和MluⅠ双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下分别回收2300bp和6100bp左右的目的片段，T4连接酶连接后，转化感受态细胞，鉴定阳性的克隆命名为T-V。质粒T-V用BsmBI酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收4500bp片段，转录载体TVT7R(0.0)用BbsI酶切电泳后回收3100bp片段，利用T4连接酶连接，转化感受态细胞，鉴定阳性的克隆命名为TVT-V。
NDV/HR09基因组TM(2296nt～13048nt)的连接：以质粒T-R1和T-R2为模板，R1-F/R2-R为引物，Overlap PCR扩增R12片段，预期片段大小为4519bp。扩增片段连接pCR2.1克隆载体，转化感受态细胞，挑取载体SpeⅠ位点位于R12片段下游的克隆测序。正确的克隆命名为T-R12。
用限制性内切酶BsmBⅠ和SpeⅠ分别对质粒T-R12和T-R3进行双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下分别回收8500bp和2800bp左右的目的片段，T4连接酶连接后，转化感受态细胞，鉴定阳性的克隆命名为TR123。
质粒TR123与TL2经SpeⅠ和FspAⅠ双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收12300bp和3500bp左右的片段，T4连接酶进行连接，转化感受态细胞，菌液PCR以及酶切鉴定阳性克隆，命名为TM。
含NDV/HR09株全基因组cDNA的转录载体的获取：质粒TM与TVT-V分别经ApaⅠ和MluⅠ双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收10kb和9kb左右的条带，T4连接酶连接后，转化感受态细胞。从而构建了含有NDV基因组cDNA全长的转录载体pNDV/HR09。
NDV/HR09株全基因组cDNA转录载体的鉴定：对转录载体通过酶切鉴定。经分析转录载体上的酶切位点分布，利用限制性内切酶HpaⅠ酶切鉴定，电泳检测酶切条带是否与预期条带大小一致。酶切体系为：灭菌超纯水12μL、HpaⅠ1μL、Cutsmart buffer 2μL、质粒DNA5μL(1μg)。
构建好的NDV/HR09全基因组cDNA转录载体经酶切鉴定，HpaⅠ酶切后获得2个条带，即4949bp和13348bp，电泳结果和预期一致(图3)。
3.辅助质粒的构建与鉴定
辅助质粒pCI-NP构建：在基因组103nt-1643nt位设计引物，扩增NP基因，该片段5’端添加XbaⅠ酶切位点，连接pEASYTM-Blunt克隆载体。测序结果正确的克隆经XbaⅠ和NotⅠ双酶切后，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收1500bp左右的条带，用T4连接酶连接到同样经XbaⅠ和NotⅠ双酶切的pCI-neo载体中，转化感受态细胞，PCR以及酶切鉴定阳性克隆，命名为pCI-NP。
辅助质粒pCI-P构建：在基因组1874nt-3096nt位设计引物，扩增P基因，该片段5’端添加XbaⅠ酶切位点，连接pEASYTM-Blunt克隆载体。测序结果正确的克隆经XbaⅠ和NotⅠ双酶切后，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收1200bp左右的条带，用T4连接酶连接到同样经XbaⅠ和NotⅠ双酶切的pCI-neo载体中，转化感受态细胞，PCR以及酶切方法鉴定阳性克隆，命名为pCI-P。
辅助质粒pCI-L构建：质粒T-L2经FspAI和NotⅠ酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收3500bp左右的条带，用T4连接酶连接到同样经FspAI和NotⅠ酶切后线性T-L1中，转化感受态细胞后，鉴定到的阳性克隆命名为T-L12。
质粒T-L12与T-L3经MluⅠ和NotⅠ双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收8500bp和2000bp左右的片段，T4连接酶进行连接，转化感受态细胞，PCR以及酶切方法鉴定阳性克隆，命名为T-L123。
质粒T-L123经SpeⅠ和NotⅠ双酶切后，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外线的照射下回收6600bp左右的条带，连接到同样经XbaⅠ和NotⅠ双酶切的pCI-neo载体中，T4连接酶进行连接，转化感受态细胞，PCR以及酶切方法鉴定阳性克隆，从而构建成辅助质粒pCI-L。
辅助质粒的鉴定：pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒与微型基因组TVT-LGT共转染BSR-T7/5细胞48h后，在倒置荧光显微镜下观察是否能看到GFP基因的表达。细胞转染方法参考X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent说明书。
pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒与微型基因组TVT-LGT共转染BSR-T7/5细胞48h后，在倒置荧光显微镜下能看到GFP基因的表达(图4)，说明pCI-NP、pCI-P和pCI-L在BSR-T7/5细胞中均能得到表达，能与微型基因组形成RNPs结构，从而启动微型基因组的复制和转录。
4病毒感染性克隆的获得与鉴定
细胞和转染用质粒的准备：转染用的BSR-T7/5细胞用1mg/mL的G418进行预筛选培养，于转染前一天将5×105的细胞接种于35mm dish中，约60％～80％铺满时用于转染。转染时用到的所有质粒(TVT/LGT、pNDV/HR09、pCI-NP、pCI-P、pCI-L)均用EndoFree PlasmidMidi Kit提取，提取完测定其浓度和纯度，浓度在0.1μg/μL以上并且纯度在1.8～2.0(OD260/280)，＞2(OD260/230)的质粒用于转染，质粒提取方法按照EndoFree PlasmidMidi Kit说明书进行。
共转染：将NDV基因组cDNA全长的转录载体pNDV/HR09和三个辅助质粒(pCI-NP、pCI-P、pCI-L)共转染准备好的BSR-T7/5细胞，转染60h后将转染样品用封口膜封好，转移到-70度冰箱反复冻融3次，然后将转染细胞刮下，与细胞上清充分混合后接种9～11日龄SPF鸡胚，0.4mL/枚，37℃培养。定时观察鸡胚状态，弃去24h内非正常死亡的鸡胚。96h后将鸡胚置于4℃冰箱，待鸡胚血管收缩后，收集鸡胚尿囊液。
获救病毒的鉴定：HA的测定：收集接胚尿囊液，用新鲜制备的1％鸡红细胞按照OIE标准进行HA测定。将HA检测阳性的鸡胚尿囊液继续在SPF鸡胚上连传2代，收集尿囊液提取病毒的RNA，配置反转录体系进行反转录并灭活后，以其作为模板，用测序的特异性引物9(ND-9)，扩增NDV部分L基因区域长度约1892bp(12362nt～14253nt)，根据突变出的MluI(13048nt)的碱基变化，以确定是否拯救出病毒。获救病毒的耐热性、生物特性参照前述的方法进行。
转染样品接胚后，第一代鸡胚在80h左右死亡，进行血凝试验有血凝性，获救病毒命名为NDV/rHR09，并在SPF鸡胚上继续传2代。收取第3代的鸡胚尿囊液，采用RT-PCR的方法进行检测，根据基因组标志的标记分子，进行最终确定。测序结果表明，基因组第13048位的碱基由G变成了A(图5)，证明病毒的基因组源于转录载体NDV/rHR09。
二、F基因突变与耐热弱毒株全基因组cDNA转录载体的构建
试验所用试剂：细胞培养基DMEM、M199购自上海源培生物科技有限公司，新生小牛血清购自GIMINI公司，TRIzol Reagent、M-MLV反转录体系、Easytaq DNA聚合酶、脂质体Lipofectamine 3000转染试剂购自Invitrogen公司(美国)；High-Fidelity DNAPolymerase购自NEB公司(美国)；pEASYTM-T3克隆载体、DH5a感受态细胞自制、MDT感受态细胞、Trans-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；DNA凝胶回收试剂盒及质粒DNA小量试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司，EndoFree Plasmid Midi Kit购自康为世纪生物有限公司，Ultra One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞公司、Marker、RACE 5’/3’Kit User Manual试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。
主要仪器设备：PCR仪(美国Applied Biosystems公司)，恒温金属浴(杭州博日科技有限公司)，台式高速离心机及微量移液器(德国eppendorf公司)，电泳仪及凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。
1.引物设计与合成
通过引物经Overlap PCR方法，将重组病毒NDV/rHR09的F基因裂解位点处的核苷酸进行突变，从而使相应编码的氨基酸由R112-R-Q-K115-R-F117变为弱毒特征的氨基酸序列：G112-R-Q-G115-R-L117，突变后的构建的质粒命名为prNDV/HR09，引物均由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。引物序列如下：
Rr1-R:5’-AAGGCGCCCCTGTCCCCCCCCACCAGATGTAG-3’(SEQ ID NO.23)
Rr2-F:5’-GGGGGACAGGGGCGCCTTATAGGTGCCGTTATTG-3’(SEQ ID NO.24)
2.片段Rr1和片段Rr2的克隆与测序
以前述获得的重组质粒TR-12为模板，以R1-F(见表1)/Rr1-R，Rr2-F/R2-R(见表1)为引物，扩增获得片段Rr1和片段Rr2。25μL PCR反应体系为：灭菌超纯水15.75μL，5×Q5Buffer 5μL，dNTPs(2.5mmol/L)2μL，上游引物(10μmol/μL)0.5μL，下游引物(10μmol/μL)0.5μL，模板1μL，Q5 0.25μL。
PCR反应循环参数为：98℃预变性30s，98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min，进行30个循环；72℃延伸2min。
PCR反应结束后，用1％琼脂糖凝胶电泳对所有PCR产物进行检测，紫外线下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，切碎，并参照DNA凝胶回收试剂盒说明书，对扩增的目的片段进行回收，按照pEASYTM-Blunt Cloning Kit说明书将回收产物与pEASY TM-Blunt克隆载体放置于1.5mL的指形管中连接(片段L1的胶回收产物与pCR2.1载体连接)，每管加入30μLTrans-T1感受态细胞，轻轻混匀，立即放入冰中，冰浴30min；42℃水浴锅中热激30s，放置冰上冷却5min；加入600μL LB培养基，37℃摇床上按照200r/min的转速振荡1h，取出后5000r/min离心5min；剩余约100μL上清，将沉淀重悬后涂布在含氨苄青霉素的LB平板上，37℃温箱倒置培养12～16h；次日挑选5个单菌落分别接种含氨苄青霉素的LB液体培养基培养过夜。按照pEASY TM-Blunt Cloning Kit说明书方法，用引物M13F和M13R(均为通用引物)通过PCR方法进行鉴定。PCR鉴定阳性的克隆送公司测序。测序正确的克隆分别命名为T-Rr1和T-Rr2。
3.弱毒株全基因组cDNA转录载体pNDV/rAHR09的构建
以T-Rr1和T-Rr2扩增片段为模板，分别用R1-F/Rr1-R，Rr2-F/R2-R为引物，Overlap PCR扩增Rr12片段，预期片段大小为4519bp。反应体系为50μL Overlap PCR体系：灭菌超纯水36.5μL，10×TransTaq HiFiBuffer 5μL，dNTPs(2.5mmol/L)4μL，上游引物1μL，下游引物1μL，T-Rr1扩增片段1μL，T-Rr2扩增片段1μL，TransTaq HiFi DNA polymerase(5U/μL)0.5μL。PCR反应循环参数：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸5min，30个循环；72℃延伸10min。
扩增片段连接pCR2.1克隆载体，转化DH5α感受态细胞，挑取载体SpeⅠ位点位于R12片段下游的克隆测序。正确的克隆命名为T-Rr12。
其余构建过程参考上述反向遗传操作系统构建部分，最终构建获得了病毒基因组cDNA全长转录载体pNDV/rAHR09。
将构建的包括基因组cDNA全长的转录载体prNDV/HR09和三个辅助质粒(pCI-NP、pCI-P、pCI-L)共转染准备好的BSR-T7/5细胞，方法同前述。转染12h后，每个dish中加入10％的无菌尿囊液。转染60h后将转染样品用封口膜封好，转移到-70度冰箱反复冻融3次，然后将转染细胞刮下，与细胞上清充分混合后接种9～11日龄SPF鸡胚，0.4mL/枚，37℃培养。定时观察鸡胚的状态，弃去24h内非正常死亡的鸡胚。96h后将胚置于4℃冰箱，待鸡胚血管收缩后，检测血凝(HA)效价并收集尿囊液，继续传代。
将HA检测阳性的鸡胚尿囊液继续在SPF鸡胚上传2代，收集尿囊液并提取病毒的RNA，反转录后，以其作为模板，用测序的特异性引物4(ND-4)，扩增病毒L基因区域部分序列长度约1755bp(4098nt～5872nt)，根据F基因裂解区域碱基的变化，确定是否拯救出致弱的病毒，最终证明所构建的弱毒株全基因组cDNA转录载体pNDV/rAHR09正确有效。
三、外源基因插入位点的改造
试验试剂：细胞培养基DMEM、M199购自上海源培生物科技有限公司，新生小牛血清购自Gibco公司，TRIzol Reagent、M-MLV反转录体系、Easy Taq DNA聚合酶、脂质体Lipofectamine 3000转染试剂购自Invitrogen公司(美国)；High-Fidelity DNAPolymerase购自NEB公司(美国)；pEASYTM-T3克隆载体、DH5a感受态细胞自制、MDT感受态细胞、Trans-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；DNA凝胶回收试剂盒及质粒DNA小量试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司，EndoFree Plasmid Midi Kit购自康为世纪生物有限公司，Ultra One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞公司、Marker、RACE 5’/3’Kit User Manual试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。Pmel酶购自NEB(北京)公司。
主要仪器设备：PCR仪(美国Applied Biosystems公司)，恒温金属浴(杭州博日科技有限公司)，台式高速离心机及微量移液器(德国eppendorf公司)，电泳仪及凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。
选择NDV/HR09的P基因和M基因之间的基因间隔区作为外源基因的插入区域。由于该区域没有合适的酶切位点供外源基因插入，经过分析研究后，本发明确定通过定点突变的方法改造出一个Pme I酶切位点供外源基因插入。
Pme I酶切位点为GTTTAAAC，NDV/HR09株基因P与M基因间隔区位于基因组序列3081-3296之间，本发明在基因组序列3227-3234之间(序列为GGTTAATC)进行定点突变，改造出一个PmeI酶切位点，便于进行外源基因的插入。
以前述质粒T-R12为模板设计1对突变引物将质粒扩增出来，引物序列为：
T2-PmeI-F：5’-GTTTAAACGTGGTTGTGCAA-3’(SEQ ID NO.25)
T2-PmeI-R：5’-GTTTAAACTAGCAGCTTC-3’(SEQ ID NO.26)
25ulPCR扩增反应体系为：Buffer 5μl，dNTP(2.5mM)2μl，F/R引物(10μM)1μl，模板1μl，Q5酶0.5μl，H2O至50μl。
反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性8s，52℃退火30s，72℃延伸2min，进行30个循环；72℃延伸2min。
PCR反应结束后，取5μl产物加入1μl DpnI酶，37℃反应1h，再转化MDT感受态细胞。具体操作方法：(1)5μl产物加入50μl MDT感受态细胞中；(2)冰上静置30min；(3)42℃热激45s；(4)冰浴2min；(5)加入无抗LB 37℃摇菌培养1h；(6)在含有氨苄抗性的固体平板上培养生长，挑取单克隆菌落，摇菌送测序，选取构建成功的质粒用于构建病毒基因组全长cDNA转录载体。
用限制性内切酶BsmBⅠ和SpeⅠ分别对质粒T-R12和T-R3进行双酶切，分别回收8500bp和2800bp左右的目的片段，T4连接酶连接后，转化大肠杆菌，鉴定阳性的克隆命名为TR123。
质粒TR123和上述构建的pNDV/rAHR09全长质粒同时经过APaI和FspaI双酶切后进行替换，构建成具有Pme I酶切位点的全长质粒p-VHR09。
四、NDV-rAHR09-GFP-1的构建与鉴定
1.GFP目的基因的扩增
以本实验室保存的pEGFP-N1质粒(购自Clontech公司)为模板，设计一对引物扩增GFP基因，同时在GFP基因前加上新城疫病毒特有的基因起始序列和基因终止序列。本发明通过无缝克隆的方法将目的基因整合到载体上，因此在设计引物的上下游各加上插入位点前后各20bp碱基的同源臂，引物设计如下：
T-GFP-F：5-ATGATTGCACAACCACGTTTTTAAGAAAAAATACGGGTAGAAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3(SEQ ID NO.27)
T-GFP-R：5-ATTTTTGAAGCTGCTAGTTTGGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3(SEQ IDNO.28)
利用上述引物进行目的基因扩增、切胶回收目的条带。
2.无缝克隆构建重组病毒cDNA全长转录载体
构建模式见图6。
用PmeI酶切p-VHR09质粒，回收酶切后片段，使用无缝克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物技术有限公司)与GFP基因扩增片段进行重组连接。具体操作按照产品说明书进行。
重组产物转化：
(1)在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞(DH5α)；
(2)取10μl重组产物加入到100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。(重组产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/6)；
(3)42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min；
(4)加入900μlLB培养基(不添加抗生素)，37℃摇菌1h(转速200-250rpm)；
(5)将相应抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热；
(6)5000rpm离心5min，弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀；
(7)37℃培养箱中倒置培养12-16h。
重组质粒的酶切鉴定：
提取全长质粒并通过HpaI酶切鉴定，酶切反应体系：Cutsmart 5μl，HpaI1μl，H2O至50μl，37℃酶切2h。酶切完成后利用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测，观察酶切后目的片段大小。通过分析转录载体上的酶切位点分布，发现HpaI在NDV/HR09全基因组上有2个位点(5108nt，10057nt)，在TVT7R(0.0)和GFP基因上无分布，故酶切后能获得2个条带，即4949bp和14098bp，电泳结果和预期一致。
3.表达GFP基因重组病毒的拯救与鉴定
将构建好的全长重组质粒与三个辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞，对重组病毒进行拯救，具体步骤如下：
(1)质粒和BSR细胞的准备：转染用BSR-T7/5细胞先用1mg/mL的G418进行筛选培养，于转染前一天将5×105的细胞接种于6孔细胞培养板中，细胞密度为70％～90％时用于转染。辅助质粒(pCI-NP、pCI-P、pCI-L)按照EndoFree Plasmid Midi Kit说明书要求提取，-20℃保存备用。
(2)重组病毒拯救：a.取1.5ml的EP管并加入125μl的DMEM培养基；b.加入5μl的P3000，轻轻混匀；c.分别旋转轻轻加入三个辅助质粒pCI-NP(1μg)、pCI-P(0.5μg)、pCI-L(0.5μg)和全长重组质粒，轻轻混匀；d.取1.5ml的EP管并加入125μl的DMEM培养基和3.75μl的Lip3000转染试剂，轻轻混匀；e.将c步骤溶液轻轻加入d试管中，室温静置10-15min。
将混合液轻轻加入BSR-T7/5细胞中，于37℃、5％的CO2培养箱培养。60h后将6孔细胞培养板用封口膜封好，转移到-70℃冰箱反复冻融3次，然后将转染细胞刮下，与细胞上清充分混合后接种9～11日龄SPF鸡胚尿囊液，0.4mL/枚，37℃培养。定时观察鸡胚状态，弃去24h内非正常死亡的鸡胚。96h后将鸡胚置于4℃冰箱，待鸡胚血管收缩后，收集鸡胚尿囊液。
重组病毒的鉴定包括HA检测、测序验证、细胞培养后荧光观察、耐热试验。
a.HA检测：将收集的尿囊液用1％鸡红细胞做血凝(HA)检测，具体操作参考OIE标准方法。每个样品做2个重复，将HA为阳性的样品接种鸡胚扩增培养。结果证明，获得的重组病毒具有血凝性。
b.测序验证：将HA检测为阳性的尿囊液在SPF鸡胚上传两代后，收集尿囊液抽提病毒的RNA，通过RT-PCR扩增出GFP基因，连接T3载体，挑取阳性菌液送去测序鉴定，鉴定结果正确。
C.细胞培养验证：获救病毒能在鸡胚上稳定传代，收获尿囊液稀释1000倍接种CEF，24h后观察可以看到荧光，见图8。
d.耐热性测定：重组病毒的鸡胚尿囊液，每份500μL，放于56℃金属浴中进行耐热处理；耐热时间间隔为5min、10min、15min、30min、45min、60min、75min，不同时间耐热处理后的尿囊液分别进行HA测定。具体结果见表3，从表中可知，重组病毒经56℃处理120min后仍有较高血凝活性。
表3重组病毒56℃耐热处理后血凝效价
SEQUENCE LISTING
<110> 扬州大学
<120> 一种热稳定的基因VIII型新城疫弱毒株外源基因表达载体
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<170> PatentIn version 3.3
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Claims (1)

1.一种热稳定的基因Ⅷ型新城疫弱毒株外源基因表达载体，是新城疫病毒NDV-rAHR09-GFP-1，它的保藏号为CCTCC NO:V201844。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110499296A (zh) * 2019-08-28 2019-11-26 扬州大学 一种耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法
CN110607285A (zh) * 2019-08-28 2019-12-24 扬州大学 一种耐热的血清4型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1772909A (zh) * 2005-09-02 2006-05-17 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用
CN1880448A (zh) * 2005-09-02 2006-12-20 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株
CN101182494A (zh) * 2007-09-05 2008-05-21 扬州大学 基因vii型新城疫病毒致弱株a-ndv-vii及其构建方法
CN104059942A (zh) * 2013-03-20 2014-09-24 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 新城疫病毒耐热活疫苗载体系统及其应用
CN105420261A (zh) * 2015-10-09 2016-03-23 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 一种新城疫病毒耐热改造方法及应用
CN107034232A (zh) * 2017-04-21 2017-08-11 华南农业大学 Atg16l1基因在增强新城疫病毒的复制能力中的用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1772909A (zh) * 2005-09-02 2006-05-17 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用
CN1880448A (zh) * 2005-09-02 2006-12-20 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株
CN101182494A (zh) * 2007-09-05 2008-05-21 扬州大学 基因vii型新城疫病毒致弱株a-ndv-vii及其构建方法
CN104059942A (zh) * 2013-03-20 2014-09-24 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 新城疫病毒耐热活疫苗载体系统及其应用
CN105420261A (zh) * 2015-10-09 2016-03-23 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 一种新城疫病毒耐热改造方法及应用
CN107034232A (zh) * 2017-04-21 2017-08-11 华南农业大学 Atg16l1基因在增强新城疫病毒的复制能力中的用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘倩: "新城疫病毒耐热株HR09的鉴定与反向遗传操作系统的构建", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *
赵伟: "新城疫病毒VG/GA毒株反向遗传系统的建立及最佳外源基因表达位置的确定", 《中国博士学位论文全文数据库》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110499296A (zh) * 2019-08-28 2019-11-26 扬州大学 一种耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法
CN110607285A (zh) * 2019-08-28 2019-12-24 扬州大学 一种耐热的血清4型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法

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