CN109295095A - 一种热稳定的基因viii型新城疫弱毒株外源基因表达载体 - Google Patents
一种热稳定的基因viii型新城疫弱毒株外源基因表达载体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109295095A CN109295095A CN201811244137.6A CN201811244137A CN109295095A CN 109295095 A CN109295095 A CN 109295095A CN 201811244137 A CN201811244137 A CN 201811244137A CN 109295095 A CN109295095 A CN 109295095A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- ndv
- virus
- plasmid
- gfp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/18143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及兽医病毒分子生物学领域,公开了一种热稳定的基因Ⅷ型新城疫弱毒株外源基因表达载体,所述表达载体是新城疫病毒NDV‑rAHR09‑GFP‑1,它的保藏号为CCTCC NO:V201844。研究表明,NDV‑rAHR09‑GFP‑1在自然条件下具有良好的热稳定性,56℃、90min仍保持血凝活性和感染能力,能稳定表达GFP基因。
Description
技术领域
本发明属于兽医病毒分子生物学技术,具体涉及一种热稳定的基因VIII型新城疫弱毒株外源基因表达载体。
背景技术
新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)的成员[Mayo,M.A.2002.Virus taxonomy-Houston 2002.ArchVirol 147:1071-1076.]。NDV有囊膜,基因组为单股、负链、不分节段的RNA病毒,基因组结构模式为:3′-NP-P-M-F-HN-L-5′,依次编码6种结构蛋白:核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋;(L)即核蛋白(NP),P,M,F,HN和L蛋白。根据对鸡的毒力,NDV毒株可以为强毒(Velogenic)、中等毒力(mesogenic)和弱毒(Lentogen)三种类型。已有大量研究阐明了病毒致病性的分子决定因素[Huang Z,Krishnamurthy S,Panda A,Samal SK.Newcastle disease virus V protein isassociated with viral pathogenesis and functions as an alpha interferonantagonist.Journal of virology 2003 Aug;77(16):8676-85.],其中大部分是关于F和HN蛋白对病毒毒力的作用,特别是一致认为F蛋白裂解位点处的氨基酸序列是病毒毒力的主要决定因素[Seal BS.Nucleotide and predicted amino acid sequence analysis ofthe fusion protein and hemagglutinin-neuraminidase protein genes amongNewcastle disease virus isolates.Phylogenetic relationships among theParamyxovirinae based on attachment glycoprotein sequences.Funct IntegrGenomics 2004 Oct;4(4):246-57.]。NDV毒力差异的分子基础主要决定于F0蛋白的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列,强毒的裂解位点两端有成对的碱性氨基酸序列,其模式基序为112GR/K-R-Q-K/R-R-F117;弱毒的裂解位点则缺少聚碱性氨基酸序列,其模式基序为112-E/G-R/K-Q-E/G-R-L117。
新城疫病毒(NDV)弱毒作为载体表达外源蛋白,以此作疫苗可以引起广泛的保护性免疫反应,包括体液免疫和细胞免疫,以及全身和粘膜免疫,其安全性已在许多动物模型中得到证实(Huang,Z.,Elankumaran,S.,Panda,A.,Samal,S.K.,2003.RecombinantNewcastle disease virus as a vaccine vector.Poult.Sci.82,899–906.Ge,J.,Wang,X.,Tao,L.,Wen,Z.,Feng,N.,Yang,S.,Xia,X.,Yang,C.,Chen,H.,Bu,Z.,2011.Newcastledisease virus-vectored rabies vaccine is safe,highly immunogenic,and provideslong-lasting protection in dogs and cats.J.Virol.85,8241–8252.Duan,Z.,Xu,H.,Ji,X.,Zhao,J.,2015.Recombinant Newcastle disease virus-vectored vaccinesagainst human and animal infectious diseases.Future Microbiol.10,1307–1323.)。NDV作为一种安全高效的疫苗载体,学术上已经得到认可,NDV弱毒株是潜在的病毒载体,可用于开发用于动物和/或人类的抗原传递疫苗(Kim SH,Samal SK.Newcastle diseasevirus as a vaccine vector for development of human and veterinaryvaccines.Viruses 2016;8:E183.)。
NDV具有许多作为活毒疫苗载体的优点。NDV作为负链RNA病毒,与其同源的RNA病毒不发生重组现象,这使载体更稳定和安全;在大多数情况下,这些病毒不会因大量表达外源基因而引起自身复制的严重减弱;另外,作为负链RNA病毒的致弱疫苗对人和动物无致病性,是一种安全载体,与那些基因组需要编码大量蛋白的病毒如腺病毒、疱疹病毒载体相比,NDV仅编码七种蛋白,因此在免疫时载体蛋白对表达的外源蛋白影响较小。
随着反向遗传技术的发展,活病毒作为载体逐渐成为研究热点。反向遗传技术是指在生物体体外构建RNA病毒的感染性克隆,通过逆转录的方式将病毒基因组RNA转成cDNA,并使其在RNA聚合酶启动子控制下,通过体外转录的方式产生病毒RNA,转染哺乳动物细胞可拯救到活的病毒。1999年Peeters等人首次建立了NDV的反向遗传平台,他们首先在体外构建具有感染性的分子克隆,然后将NDV的全长cDNA插入转录载体,该转录载体还含有T7RNA聚合启动子,再将其与表达NP、P、L基因的三个辅助表达质粒共转染能够启动T7启动子的细胞系中,最后收取转染产物接种9-11日龄鸡胚,使病毒在鸡胚中增殖,最终拯救出具有感染性的病毒。该反向遗传平台的建立为以NDV作为外源基因表达载体的构建打下了基础。
第一个新城疫重组病毒诞生于2000年由Krishnmurphy等人以中等毒力毒株Beaudette C株为载体,将氯霉素乙酰转移酶(CAT)成功插入到其全长cDNA的HN基因和L基因之间的非编码区而成功获得重组病毒。此后,以NDV作为载体表达各种外源基因的重组病毒不断有报道(Kang-Seuk Choi,NDV vectored vaccine,Clin Exp Vaccine Res,2017;6:72-82,https://doi.org/10.7774/cevr.2017.6.2.72)。目前,公开报道作为载体的NDV毒株均是不耐热的毒株,以它们为载体所构建的重组疫苗毒株均不具有耐热性。然而作为弱毒活疫苗,在保存、运输过程中需要冷链维持,一般是在疫苗中添加耐热保护剂,但技术复杂且成本高。本身具有耐热性的毒株则可减少对冷链的依赖,对于热带及偏远乡村地区有效使用疫苗有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题,本发明提供一种热稳定的基因VIII型新城疫弱毒株外源基因表达载体。
本发明利用反向遗传操作系统,基于新城疫病毒(NDV)耐热毒株HR09的基因组序列,构建了耐热的可表达外源基因的NDV基因VIII型弱毒载体表达系统,表达GFP基因的重组病毒鉴定结果说明,该表达系统能够有效表达外源基因,重组病毒具有耐热特性。
本发明所述的一种热稳定的基因Ⅷ型新城疫弱毒株外源基因表达载体,是新城疫病毒NDV-rAHR09-GFP-1,它的保藏号为CCTCC NO:V201844。
本发明以耐热的NDV毒株HR09为基础,利用反向遗传操作系统对病毒F基因突变,并在P基因和M基因之间构建合适的插入位点,建立了一个表达外源基因的载体系统,经插入GFP基因,获得了耐热的稳定表达GFP的重组病毒NDV-rAHR09-GFP-1。
所述NDV-rAHR09-GFP-1的具体构建步骤如下:
(1)基因Ⅷ型耐热NDV/HR09株反向遗传操作系统的建立与致弱株拯救
构建耐热的NDV/HR09株基因组cDNA的全长克隆以及含有该毒株NP、P和L基因的3个真核表达载体,经共转染BSR-T7/5细胞,拯救获得感染性克隆NDV/rHR09株,获救病毒耐热性测定结果显示,56℃处理60min仍有血凝活性,测定NDV/rHR09株的MDT值、ICPI值,证明其仍为NDV强毒株,证明成功构建了NDV/HR09株反向遗传操作系统。设计两对引物,经Overlap PCR的方法将NDV/rHR09毒株F蛋白裂解位点第112、115和117位的碱性氨基酸突变成与弱毒株相关的非碱性氨基酸,构建全长cDNA转录载体prNDV/HR09,将转录载体prNDV/HR09与3个辅助表达质粒共转染BSR-T7/5细胞,拯救出病毒NDV/rAHR09。经56℃、45min处理,NDV/rAHR09株仍具有血凝性,MDT值>120h,ICPI值为0.057。表明NDV/HR09株已经成功致弱,并保留了原毒株的耐热性。
(2)外源基因插入位点的确定与含PmeI酶切位点的全长质粒p-VHR09的构建
经文献比较,选择NDV/HR09株的P基因和M基因之间的基因间隔区域作为外源基因的插入区域。由于HR09株在该区域没有合适的酶切位点供外源基因插入,经分析,确定通过定点突变的方法改造出一个在基因组中唯一的Pmel酶切位点供外源基因插入。
PmeI酶切位点为GTTTAAAC,NDV/HR09株基因P与基因M间隔区位于基因组序列3081-3296之间,本发明在基因组序列3227-3234之间(序列为GGTTAATC)进行定点突变,改造出一个PmeI酶切位点,构建相应的质粒,便于进行外源基因的插入。该酶切位点在基因组中是唯一的。
再利用上述反向遗传操作系统,以含有新构建的酶切位点的质粒替换致弱的HR09株全长克隆上的相应片段,构建成功具有PmeI酶切位点、F基因裂解位点序列突变致弱的HR09株全长质粒p-VHR09。
(3)耐热重组病毒NDV-rAHR09-GFP-1的拯救与鉴定
从pEGFP-N1质粒扩增GFP基因,添加NDV基因的起始序列和基因终止序列,利用无缝克隆技术与质粒p-VHR09进行重组,获得包含GFP基因的全长cDNA转录载体pNDV-rAHR09-GFP-1(构建模式如图6)。经鉴定后,与辅助质粒共转染细胞,获得重组病毒NDV-rAHR09-GFP-1,经细胞培养观察GFP表达情况,并对拯救病毒进行血凝试验和耐热试验,证明载体病毒的稳定性。
利用该载体系统可有效表达外源基因,经GFP基因检验,证明其有效。
构建的重组病毒具有较好的耐热性,56℃、90min仍有血凝活性,作为重组疫苗可以减少对冷链的依赖,有重要的经济价值。
附图说明
图1是HR09株全基因组cDNA转录载体的构建示意图
图2是RT-PCR分段扩增的全基因组6个片段电泳图。M:200bp;1-6分别为V1,R1,R2,R3,L1,V2片段。
图3是NDV/HR09株全基因组cDNA转录载体酶切鉴定结果。M:DL15000 1.质粒pNDV/HR09;2、3经HpaI酶切后的pNDV/HR09
图4是辅助质粒共转染后GFP表达效果图。
图5是病毒感染性克隆PCR鉴定结果图。M:200bp Marker 1、2:引物9扩增片段
图6是NDV-rAHR09-GFP-1构建示意图。
图7是NDV-rAHR09-GFP-1酶切鉴定图;
M:DL15000
1:Hpal,酶切NDV-rAHR09-GFP-1条带正确,
2:pmel酶切p-VHR09条带正确,
3:pmel酶切rHR09没有酶切位点,未切开正确。
图8是重组病毒CEF培养荧光观察图。
本发明的新城疫病毒NDV-rAHR09-GFP-1于2018年7月21日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏单位地址:中国武汉大学;分类命名为:新城疫病毒NDV-rAHR09-GFP-1;保藏编号为CCTCC NO:V201844。
具体实施方式
一、基因Ⅷ型耐热NDV/HR09株反向遗传操作系统的建立
试验涉及的主要试验材料与方法如下:
NDV/HR09(Cao Y,Liu Q,Zhang X,Hu H,Wu Y.2017.Complete genome sequenceof heatresistantNewcastle disease virus strain HR09.Genome Announc 5:e01149-17.https://doi.org/10.1128/genomeA.01149-17.),GenBank登录号MF285077。
细胞及鸡胚:能稳定表达T7RNA聚合酶的BSR-T7/5细胞和微基因组TVT-LGT由中国农业科学院上海兽医研究所惠赠,TVT7R(0.0)转录载体由本实验室保存,SPF鸡胚由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供。
实验试剂:细胞培养基DMEM购自上海源培生物科技有限公司,新生胎牛血清购自GIMINI公司,Easytaq DNA聚合酶、pEASYTM-Blunt克隆载体、pCR2.1克隆载体、Trans-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;TRIzol Reagent、M-MLV反转录体系、高保真DNA聚合酶、dNTP购自北京全式金生物技术有限公司,DNA凝胶回收试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司,DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司,Q5限制性内切酶(ApaⅠ、BsmBⅠ、MluⅠ、BbsⅠ、SpeⅠ、NotⅠ、XbaⅠ)等购自NEB公司,T4DNA Ligase、限制性内切酶FspAⅠ购自Thermo Fisher公司。EndoFree Plasmid Midi Kit购自北京康为世纪生物科技有限公司。其它普通生化试剂均为国产分析纯试剂。
主要仪器设备:PCR仪(美国Applied Biosystems公司),恒温金属浴(杭州博日科技有限公司),台式高速离心机及微量移液器(德国eppendorf公司),电泳仪及凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。
引物设计与合成:根据NDV/HR09的全基因序列(GenBank登录号MF285077),运用Primer Premier5.0软件设计6对引物对其全基因进行分段扩增,构建示意图见图1。将基因组13048位碱基作为拯救病毒的分子标记。引物序列见表1,辅助质粒构建引物见表2,引物均由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。
表1 NDV/HR09株全长cDNA分段扩增引物
表2构建NDV/HR09辅助质粒所用引物
1.HR09株全基因组cDNA各片段的克隆与测序
按照文献的方法提取病毒RNA并进行反转录。以获得的cDNA为模板,目的片段L1用高保真DNA聚合酶扩增,其余目的片段均用Q5酶进行扩增。
PCR反应结束后,利用1%琼脂糖凝胶电泳对所有PCR产物进行检测,紫外线下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶,切碎,并参照DNA凝胶回收试剂盒说明书,对扩增的目的片段进行回收,按照pEASYTM-Blunt Cloning Kit说明书进行,将回收的产物与pEASY TM-Blunt克隆载体放置于1.5mL的指形管中连接(片段L1的胶回收产物与pCR2.1载体连接),每管加入30μL Trans-T1感受态细胞,轻轻混匀,立即放入冰中,冰浴30min;42℃水浴锅中热激30s,放置冰上冷却5min;加入600μL LB培养基,37℃摇床上按照200r/min的转速振荡1h,取出后5000r/min离心5min;剩余约100μL上清,将沉淀重悬后涂布在含氨苄青霉素的LB平板上,37℃温箱倒置培养12~16h;次日挑选5个单菌落分别接种含氨苄青霉素的LB液体培养基培养过夜。按照pEASYTM-Blunt Cloning Kit说明书提供的方法,用引物M13F和M13R通过PCR方法进行鉴定。PCR鉴定阳性的克隆送至安徽通用公司测序。测序正确的克隆分别命名为T-R1、T-R2、T-R3、T-V1、T-V2、T-NP、T-P、T-L1、T-L2、T-L3。
对NDV/HR09全长基因组进行分段扩增,获得共6个DNA片段,经鉴定,片段大小与预期一致(如图2)。
2.NDV/HR09株全基因组cDNA转录载体的构建
NDV/HR09全基因组各片段重组质粒的提取:将含有各目的片段克隆的母液分别接种含氨苄青霉素的LB培养基进行培养,利用EndoFree Plasmid Midi Kit,按照使用说明书提取质粒,并进行浓度和纯度的测定。
NDV/HR09基因组5’端及3’端的连接:质粒T-V1和T-V2经NotⅠ和MluⅠ双酶切,酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测,在紫外线的照射下分别回收2300bp和6100bp左右的目的片段,T4连接酶连接后,转化感受态细胞,鉴定阳性的克隆命名为T-V。质粒T-V用BsmBI酶切,酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测,在紫外线的照射下回收4500bp片段,转录载体TVT7R(0.0)用BbsI酶切电泳后回收3100bp片段,利用T4连接酶连接,转化感受态细胞,鉴定阳性的克隆命名为TVT-V。
NDV/HR09基因组TM(2296nt~13048nt)的连接:以质粒T-R1和T-R2为模板,R1-F/R2-R为引物,Overlap PCR扩增R12片段,预期片段大小为4519bp。扩增片段连接pCR2.1克隆载体,转化感受态细胞,挑取载体SpeⅠ位点位于R12片段下游的克隆测序。正确的克隆命名为T-R12。
用限制性内切酶BsmBⅠ和SpeⅠ分别对质粒T-R12和T-R3进行双酶切,酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测,在紫外线的照射下分别回收8500bp和2800bp左右的目的片段,T4连接酶连接后,转化感受态细胞,鉴定阳性的克隆命名为TR123。
质粒TR123与TL2经SpeⅠ和FspAⅠ双酶切,酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测,在紫外线的照射下回收12300bp和3500bp左右的片段,T4连接酶进行连接,转化感受态细胞,菌液PCR以及酶切鉴定阳性克隆,命名为TM。
含NDV/HR09株全基因组cDNA的转录载体的获取:质粒TM与TVT-V分别经ApaⅠ和MluⅠ双酶切,酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测,在紫外线的照射下回收10kb和9kb左右的条带,T4连接酶连接后,转化感受态细胞。从而构建了含有NDV基因组cDNA全长的转录载体pNDV/HR09。
NDV/HR09株全基因组cDNA转录载体的鉴定:对转录载体通过酶切鉴定。经分析转录载体上的酶切位点分布,利用限制性内切酶HpaⅠ酶切鉴定,电泳检测酶切条带是否与预期条带大小一致。酶切体系为:灭菌超纯水12μL、HpaⅠ1μL、Cutsmart buffer 2μL、质粒DNA5μL(1μg)。
构建好的NDV/HR09全基因组cDNA转录载体经酶切鉴定,HpaⅠ酶切后获得2个条带,即4949bp和13348bp,电泳结果和预期一致(图3)。
3.辅助质粒的构建与鉴定
辅助质粒pCI-NP构建:在基因组103nt-1643nt位设计引物,扩增NP基因,该片段5’端添加XbaⅠ酶切位点,连接pEASYTM-Blunt克隆载体。测序结果正确的克隆经XbaⅠ和NotⅠ双酶切后,酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测,在紫外线的照射下回收1500bp左右的条带,用T4连接酶连接到同样经XbaⅠ和NotⅠ双酶切的pCI-neo载体中,转化感受态细胞,PCR以及酶切鉴定阳性克隆,命名为pCI-NP。
辅助质粒pCI-P构建:在基因组1874nt-3096nt位设计引物,扩增P基因,该片段5’端添加XbaⅠ酶切位点,连接pEASYTM-Blunt克隆载体。测序结果正确的克隆经XbaⅠ和NotⅠ双酶切后,酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测,在紫外线的照射下回收1200bp左右的条带,用T4连接酶连接到同样经XbaⅠ和NotⅠ双酶切的pCI-neo载体中,转化感受态细胞,PCR以及酶切方法鉴定阳性克隆,命名为pCI-P。
辅助质粒pCI-L构建:质粒T-L2经FspAI和NotⅠ酶切,酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测,在紫外线的照射下回收3500bp左右的条带,用T4连接酶连接到同样经FspAI和NotⅠ酶切后线性T-L1中,转化感受态细胞后,鉴定到的阳性克隆命名为T-L12。
质粒T-L12与T-L3经MluⅠ和NotⅠ双酶切,酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测,在紫外线的照射下回收8500bp和2000bp左右的片段,T4连接酶进行连接,转化感受态细胞,PCR以及酶切方法鉴定阳性克隆,命名为T-L123。
质粒T-L123经SpeⅠ和NotⅠ双酶切后,酶切产物用琼脂糖凝胶电泳检测,在紫外线的照射下回收6600bp左右的条带,连接到同样经XbaⅠ和NotⅠ双酶切的pCI-neo载体中,T4连接酶进行连接,转化感受态细胞,PCR以及酶切方法鉴定阳性克隆,从而构建成辅助质粒pCI-L。
辅助质粒的鉴定:pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒与微型基因组TVT-LGT共转染BSR-T7/5细胞48h后,在倒置荧光显微镜下观察是否能看到GFP基因的表达。细胞转染方法参考X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent说明书。
pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒与微型基因组TVT-LGT共转染BSR-T7/5细胞48h后,在倒置荧光显微镜下能看到GFP基因的表达(图4),说明pCI-NP、pCI-P和pCI-L在BSR-T7/5细胞中均能得到表达,能与微型基因组形成RNPs结构,从而启动微型基因组的复制和转录。
4病毒感染性克隆的获得与鉴定
细胞和转染用质粒的准备:转染用的BSR-T7/5细胞用1mg/mL的G418进行预筛选培养,于转染前一天将5×105的细胞接种于35mm dish中,约60%~80%铺满时用于转染。转染时用到的所有质粒(TVT/LGT、pNDV/HR09、pCI-NP、pCI-P、pCI-L)均用EndoFree PlasmidMidi Kit提取,提取完测定其浓度和纯度,浓度在0.1μg/μL以上并且纯度在1.8~2.0(OD260/280),>2(OD260/230)的质粒用于转染,质粒提取方法按照EndoFree PlasmidMidi Kit说明书进行。
共转染:将NDV基因组cDNA全长的转录载体pNDV/HR09和三个辅助质粒(pCI-NP、pCI-P、pCI-L)共转染准备好的BSR-T7/5细胞,转染60h后将转染样品用封口膜封好,转移到-70度冰箱反复冻融3次,然后将转染细胞刮下,与细胞上清充分混合后接种9~11日龄SPF鸡胚,0.4mL/枚,37℃培养。定时观察鸡胚状态,弃去24h内非正常死亡的鸡胚。96h后将鸡胚置于4℃冰箱,待鸡胚血管收缩后,收集鸡胚尿囊液。
获救病毒的鉴定:HA的测定:收集接胚尿囊液,用新鲜制备的1%鸡红细胞按照OIE标准进行HA测定。将HA检测阳性的鸡胚尿囊液继续在SPF鸡胚上连传2代,收集尿囊液提取病毒的RNA,配置反转录体系进行反转录并灭活后,以其作为模板,用测序的特异性引物9(ND-9),扩增NDV部分L基因区域长度约1892bp(12362nt~14253nt),根据突变出的MluI(13048nt)的碱基变化,以确定是否拯救出病毒。获救病毒的耐热性、生物特性参照前述的方法进行。
转染样品接胚后,第一代鸡胚在80h左右死亡,进行血凝试验有血凝性,获救病毒命名为NDV/rHR09,并在SPF鸡胚上继续传2代。收取第3代的鸡胚尿囊液,采用RT-PCR的方法进行检测,根据基因组标志的标记分子,进行最终确定。测序结果表明,基因组第13048位的碱基由G变成了A(图5),证明病毒的基因组源于转录载体NDV/rHR09。
二、F基因突变与耐热弱毒株全基因组cDNA转录载体的构建
试验所用试剂:细胞培养基DMEM、M199购自上海源培生物科技有限公司,新生小牛血清购自GIMINI公司,TRIzol Reagent、M-MLV反转录体系、Easytaq DNA聚合酶、脂质体Lipofectamine 3000转染试剂购自Invitrogen公司(美国);High-Fidelity DNAPolymerase购自NEB公司(美国);pEASYTM-T3克隆载体、DH5a感受态细胞自制、MDT感受态细胞、Trans-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;DNA凝胶回收试剂盒及质粒DNA小量试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司,EndoFree Plasmid Midi Kit购自康为世纪生物有限公司,Ultra One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞公司、Marker、RACE 5’/3’Kit User Manual试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。
主要仪器设备:PCR仪(美国Applied Biosystems公司),恒温金属浴(杭州博日科技有限公司),台式高速离心机及微量移液器(德国eppendorf公司),电泳仪及凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。
1.引物设计与合成
通过引物经Overlap PCR方法,将重组病毒NDV/rHR09的F基因裂解位点处的核苷酸进行突变,从而使相应编码的氨基酸由R112-R-Q-K115-R-F117变为弱毒特征的氨基酸序列:G112-R-Q-G115-R-L117,突变后的构建的质粒命名为prNDV/HR09,引物均由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。引物序列如下:
Rr1-R:5’-AAGGCGCCCCTGTCCCCCCCCACCAGATGTAG-3’(SEQ ID NO.23)
Rr2-F:5’-GGGGGACAGGGGCGCCTTATAGGTGCCGTTATTG-3’(SEQ ID NO.24)
2.片段Rr1和片段Rr2的克隆与测序
以前述获得的重组质粒TR-12为模板,以R1-F(见表1)/Rr1-R,Rr2-F/R2-R(见表1)为引物,扩增获得片段Rr1和片段Rr2。25μL PCR反应体系为:灭菌超纯水15.75μL,5×Q5Buffer 5μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL,上游引物(10μmol/μL)0.5μL,下游引物(10μmol/μL)0.5μL,模板1μL,Q5 0.25μL。
PCR反应循环参数为:98℃预变性30s,98℃变性10s,55℃退火10s,72℃延伸1min,进行30个循环;72℃延伸2min。
PCR反应结束后,用1%琼脂糖凝胶电泳对所有PCR产物进行检测,紫外线下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶,切碎,并参照DNA凝胶回收试剂盒说明书,对扩增的目的片段进行回收,按照pEASYTM-Blunt Cloning Kit说明书将回收产物与pEASY TM-Blunt克隆载体放置于1.5mL的指形管中连接(片段L1的胶回收产物与pCR2.1载体连接),每管加入30μLTrans-T1感受态细胞,轻轻混匀,立即放入冰中,冰浴30min;42℃水浴锅中热激30s,放置冰上冷却5min;加入600μL LB培养基,37℃摇床上按照200r/min的转速振荡1h,取出后5000r/min离心5min;剩余约100μL上清,将沉淀重悬后涂布在含氨苄青霉素的LB平板上,37℃温箱倒置培养12~16h;次日挑选5个单菌落分别接种含氨苄青霉素的LB液体培养基培养过夜。按照pEASY TM-Blunt Cloning Kit说明书方法,用引物M13F和M13R(均为通用引物)通过PCR方法进行鉴定。PCR鉴定阳性的克隆送公司测序。测序正确的克隆分别命名为T-Rr1和T-Rr2。
3.弱毒株全基因组cDNA转录载体pNDV/rAHR09的构建
以T-Rr1和T-Rr2扩增片段为模板,分别用R1-F/Rr1-R,Rr2-F/R2-R为引物,Overlap PCR扩增Rr12片段,预期片段大小为4519bp。反应体系为50μL Overlap PCR体系:灭菌超纯水36.5μL,10×TransTaq HiFiBuffer 5μL,dNTPs(2.5mmol/L)4μL,上游引物1μL,下游引物1μL,T-Rr1扩增片段1μL,T-Rr2扩增片段1μL,TransTaq HiFi DNA polymerase(5U/μL)0.5μL。PCR反应循环参数:94℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸5min,30个循环;72℃延伸10min。
扩增片段连接pCR2.1克隆载体,转化DH5α感受态细胞,挑取载体SpeⅠ位点位于R12片段下游的克隆测序。正确的克隆命名为T-Rr12。
其余构建过程参考上述反向遗传操作系统构建部分,最终构建获得了病毒基因组cDNA全长转录载体pNDV/rAHR09。
将构建的包括基因组cDNA全长的转录载体prNDV/HR09和三个辅助质粒(pCI-NP、pCI-P、pCI-L)共转染准备好的BSR-T7/5细胞,方法同前述。转染12h后,每个dish中加入10%的无菌尿囊液。转染60h后将转染样品用封口膜封好,转移到-70度冰箱反复冻融3次,然后将转染细胞刮下,与细胞上清充分混合后接种9~11日龄SPF鸡胚,0.4mL/枚,37℃培养。定时观察鸡胚的状态,弃去24h内非正常死亡的鸡胚。96h后将胚置于4℃冰箱,待鸡胚血管收缩后,检测血凝(HA)效价并收集尿囊液,继续传代。
将HA检测阳性的鸡胚尿囊液继续在SPF鸡胚上传2代,收集尿囊液并提取病毒的RNA,反转录后,以其作为模板,用测序的特异性引物4(ND-4),扩增病毒L基因区域部分序列长度约1755bp(4098nt~5872nt),根据F基因裂解区域碱基的变化,确定是否拯救出致弱的病毒,最终证明所构建的弱毒株全基因组cDNA转录载体pNDV/rAHR09正确有效。
三、外源基因插入位点的改造
试验试剂:细胞培养基DMEM、M199购自上海源培生物科技有限公司,新生小牛血清购自Gibco公司,TRIzol Reagent、M-MLV反转录体系、Easy Taq DNA聚合酶、脂质体Lipofectamine 3000转染试剂购自Invitrogen公司(美国);High-Fidelity DNAPolymerase购自NEB公司(美国);pEASYTM-T3克隆载体、DH5a感受态细胞自制、MDT感受态细胞、Trans-T1感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;DNA凝胶回收试剂盒及质粒DNA小量试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司,EndoFree Plasmid Midi Kit购自康为世纪生物有限公司,Ultra One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞公司、Marker、RACE 5’/3’Kit User Manual试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。Pmel酶购自NEB(北京)公司。
主要仪器设备:PCR仪(美国Applied Biosystems公司),恒温金属浴(杭州博日科技有限公司),台式高速离心机及微量移液器(德国eppendorf公司),电泳仪及凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。
选择NDV/HR09的P基因和M基因之间的基因间隔区作为外源基因的插入区域。由于该区域没有合适的酶切位点供外源基因插入,经过分析研究后,本发明确定通过定点突变的方法改造出一个Pme I酶切位点供外源基因插入。
Pme I酶切位点为GTTTAAAC,NDV/HR09株基因P与M基因间隔区位于基因组序列3081-3296之间,本发明在基因组序列3227-3234之间(序列为GGTTAATC)进行定点突变,改造出一个PmeI酶切位点,便于进行外源基因的插入。
以前述质粒T-R12为模板设计1对突变引物将质粒扩增出来,引物序列为:
T2-PmeI-F:5’-GTTTAAACGTGGTTGTGCAA-3’(SEQ ID NO.25)
T2-PmeI-R:5’-GTTTAAACTAGCAGCTTC-3’(SEQ ID NO.26)
25ulPCR扩增反应体系为:Buffer 5μl,dNTP(2.5mM)2μl,F/R引物(10μM)1μl,模板1μl,Q5酶0.5μl,H2O至50μl。
反应条件为:98℃预变性30s;98℃变性8s,52℃退火30s,72℃延伸2min,进行30个循环;72℃延伸2min。
PCR反应结束后,取5μl产物加入1μl DpnI酶,37℃反应1h,再转化MDT感受态细胞。具体操作方法:(1)5μl产物加入50μl MDT感受态细胞中;(2)冰上静置30min;(3)42℃热激45s;(4)冰浴2min;(5)加入无抗LB 37℃摇菌培养1h;(6)在含有氨苄抗性的固体平板上培养生长,挑取单克隆菌落,摇菌送测序,选取构建成功的质粒用于构建病毒基因组全长cDNA转录载体。
用限制性内切酶BsmBⅠ和SpeⅠ分别对质粒T-R12和T-R3进行双酶切,分别回收8500bp和2800bp左右的目的片段,T4连接酶连接后,转化大肠杆菌,鉴定阳性的克隆命名为TR123。
质粒TR123和上述构建的pNDV/rAHR09全长质粒同时经过APaI和FspaI双酶切后进行替换,构建成具有Pme I酶切位点的全长质粒p-VHR09。
四、NDV-rAHR09-GFP-1的构建与鉴定
1.GFP目的基因的扩增
以本实验室保存的pEGFP-N1质粒(购自Clontech公司)为模板,设计一对引物扩增GFP基因,同时在GFP基因前加上新城疫病毒特有的基因起始序列和基因终止序列。本发明通过无缝克隆的方法将目的基因整合到载体上,因此在设计引物的上下游各加上插入位点前后各20bp碱基的同源臂,引物设计如下:
T-GFP-F:5-ATGATTGCACAACCACGTTTTTAAGAAAAAATACGGGTAGAAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3(SEQ ID NO.27)
T-GFP-R:5-ATTTTTGAAGCTGCTAGTTTGGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3(SEQ IDNO.28)
利用上述引物进行目的基因扩增、切胶回收目的条带。
2.无缝克隆构建重组病毒cDNA全长转录载体
构建模式见图6。
用PmeI酶切p-VHR09质粒,回收酶切后片段,使用无缝克隆试剂盒(购自南京诺唯赞生物技术有限公司)与GFP基因扩增片段进行重组连接。具体操作按照产品说明书进行。
重组产物转化:
(1)在冰上解冻克隆用的化学感受态细胞(DH5α);
(2)取10μl重组产物加入到100μl感受态细胞中,轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀),冰上静置30min。(重组产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/6);
(3)42℃水浴热激45sec后,立即置于冰上冷却2-3min;
(4)加入900μlLB培养基(不添加抗生素),37℃摇菌1h(转速200-250rpm);
(5)将相应抗性的LB平板固体培养基在37℃培养箱中预热;
(6)5000rpm离心5min,弃掉900μl上清。用剩余培养基将菌体重悬,用无菌涂布棒在含有正确抗性的平板上轻轻涂匀;
(7)37℃培养箱中倒置培养12-16h。
重组质粒的酶切鉴定:
提取全长质粒并通过HpaI酶切鉴定,酶切反应体系:Cutsmart 5μl,HpaI1μl,H2O至50μl,37℃酶切2h。酶切完成后利用1%琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行检测,观察酶切后目的片段大小。通过分析转录载体上的酶切位点分布,发现HpaI在NDV/HR09全基因组上有2个位点(5108nt,10057nt),在TVT7R(0.0)和GFP基因上无分布,故酶切后能获得2个条带,即4949bp和14098bp,电泳结果和预期一致。
3.表达GFP基因重组病毒的拯救与鉴定
将构建好的全长重组质粒与三个辅助质粒共转染BSR-T7/5细胞,对重组病毒进行拯救,具体步骤如下:
(1)质粒和BSR细胞的准备:转染用BSR-T7/5细胞先用1mg/mL的G418进行筛选培养,于转染前一天将5×105的细胞接种于6孔细胞培养板中,细胞密度为70%~90%时用于转染。辅助质粒(pCI-NP、pCI-P、pCI-L)按照EndoFree Plasmid Midi Kit说明书要求提取,-20℃保存备用。
(2)重组病毒拯救:a.取1.5ml的EP管并加入125μl的DMEM培养基;b.加入5μl的P3000,轻轻混匀;c.分别旋转轻轻加入三个辅助质粒pCI-NP(1μg)、pCI-P(0.5μg)、pCI-L(0.5μg)和全长重组质粒,轻轻混匀;d.取1.5ml的EP管并加入125μl的DMEM培养基和3.75μl的Lip3000转染试剂,轻轻混匀;e.将c步骤溶液轻轻加入d试管中,室温静置10-15min。
将混合液轻轻加入BSR-T7/5细胞中,于37℃、5%的CO2培养箱培养。60h后将6孔细胞培养板用封口膜封好,转移到-70℃冰箱反复冻融3次,然后将转染细胞刮下,与细胞上清充分混合后接种9~11日龄SPF鸡胚尿囊液,0.4mL/枚,37℃培养。定时观察鸡胚状态,弃去24h内非正常死亡的鸡胚。96h后将鸡胚置于4℃冰箱,待鸡胚血管收缩后,收集鸡胚尿囊液。
重组病毒的鉴定包括HA检测、测序验证、细胞培养后荧光观察、耐热试验。
a.HA检测:将收集的尿囊液用1%鸡红细胞做血凝(HA)检测,具体操作参考OIE标准方法。每个样品做2个重复,将HA为阳性的样品接种鸡胚扩增培养。结果证明,获得的重组病毒具有血凝性。
b.测序验证:将HA检测为阳性的尿囊液在SPF鸡胚上传两代后,收集尿囊液抽提病毒的RNA,通过RT-PCR扩增出GFP基因,连接T3载体,挑取阳性菌液送去测序鉴定,鉴定结果正确。
C.细胞培养验证:获救病毒能在鸡胚上稳定传代,收获尿囊液稀释1000倍接种CEF,24h后观察可以看到荧光,见图8。
d.耐热性测定:重组病毒的鸡胚尿囊液,每份500μL,放于56℃金属浴中进行耐热处理;耐热时间间隔为5min、10min、15min、30min、45min、60min、75min,不同时间耐热处理后的尿囊液分别进行HA测定。具体结果见表3,从表中可知,重组病毒经56℃处理120min后仍有较高血凝活性。
表3重组病毒56℃耐热处理后血凝效价
SEQUENCE LISTING
<110> 扬州大学
<120> 一种热稳定的基因VIII型新城疫弱毒株外源基因表达载体
<130>
<160> 28
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
catgctcgac aagctgagca at 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaaaggtgcc aacagcttag tcc 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aagctgttgg cacctttctt ct 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcaggtgttc ctggtatgca gat 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gctagcgttg cttaacactg aatct 25
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
catctttggt gcgcacatct g 21
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgtgcgcac caaagatggt agac 24
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgacgcgtcg agtgcaagag actaatagt 29
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgtctcgtat agggaccaaa cagagaatct gtgaggtac 39
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
agacgcgtcc gttgtccatg atatgctgt 29
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tcgacgcgtg gtttcaggtt tatatg 26
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cgtctctacc caccaaacaa agatttggtg aatgac 36
<210> 13
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
agactagtag gataatacgg gtaggacatg gc 32
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ttggtgcgca catctggct 19
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
atgtgcgcac caaagatggt agac 24
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cgacgcgtcg agtgcaagag actaatagt 29
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cgacgcgtgg tttcaggttt at 22
<210> 18
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ttaatgagag tacaatcagc taagaagata g 31
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tatctagaga gggagccttc taccaacat 29
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gtcagacgga ggatttggga t 21
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
agtctagacc agtggattag ggcgaagat 29
<210> 22
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gggggcagga acctgttgt 19
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
aaggcgcccc tgtccccccc caccagatgt ag 32
<210> 24
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gggggacagg ggcgccttat aggtgccgtt attg 34
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gtttaaacgt ggttgtgcaa 20
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
gtttaaacta gcagcttc 18
<210> 27
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
atgattgcac aaccacgttt ttaagaaaaa atacgggtag aagccaccat ggtgagcaag 60
ggcgagga 68
<210> 28
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
atttttgaag ctgctagttt ggttacttgt acagctcgtc catgcc 46
Claims (1)
1.一种热稳定的基因Ⅷ型新城疫弱毒株外源基因表达载体,是新城疫病毒NDV-rAHR09-GFP-1,它的保藏号为CCTCC NO:V201844。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811244137.6A CN109295095A (zh) | 2018-10-24 | 2018-10-24 | 一种热稳定的基因viii型新城疫弱毒株外源基因表达载体 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811244137.6A CN109295095A (zh) | 2018-10-24 | 2018-10-24 | 一种热稳定的基因viii型新城疫弱毒株外源基因表达载体 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109295095A true CN109295095A (zh) | 2019-02-01 |
Family
ID=65158485
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811244137.6A Pending CN109295095A (zh) | 2018-10-24 | 2018-10-24 | 一种热稳定的基因viii型新城疫弱毒株外源基因表达载体 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109295095A (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110499296A (zh) * | 2019-08-28 | 2019-11-26 | 扬州大学 | 一种耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法 |
CN110607285A (zh) * | 2019-08-28 | 2019-12-24 | 扬州大学 | 一种耐热的血清4型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1772909A (zh) * | 2005-09-02 | 2006-05-17 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用 |
CN1880448A (zh) * | 2005-09-02 | 2006-12-20 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株 |
CN101182494A (zh) * | 2007-09-05 | 2008-05-21 | 扬州大学 | 基因vii型新城疫病毒致弱株a-ndv-vii及其构建方法 |
CN104059942A (zh) * | 2013-03-20 | 2014-09-24 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 新城疫病毒耐热活疫苗载体系统及其应用 |
CN105420261A (zh) * | 2015-10-09 | 2016-03-23 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种新城疫病毒耐热改造方法及应用 |
CN107034232A (zh) * | 2017-04-21 | 2017-08-11 | 华南农业大学 | Atg16l1基因在增强新城疫病毒的复制能力中的用途 |
-
2018
- 2018-10-24 CN CN201811244137.6A patent/CN109295095A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1772909A (zh) * | 2005-09-02 | 2006-05-17 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用 |
CN1880448A (zh) * | 2005-09-02 | 2006-12-20 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 | 表达传染性法氏囊病毒VP2基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株 |
CN101182494A (zh) * | 2007-09-05 | 2008-05-21 | 扬州大学 | 基因vii型新城疫病毒致弱株a-ndv-vii及其构建方法 |
CN104059942A (zh) * | 2013-03-20 | 2014-09-24 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 新城疫病毒耐热活疫苗载体系统及其应用 |
CN105420261A (zh) * | 2015-10-09 | 2016-03-23 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种新城疫病毒耐热改造方法及应用 |
CN107034232A (zh) * | 2017-04-21 | 2017-08-11 | 华南农业大学 | Atg16l1基因在增强新城疫病毒的复制能力中的用途 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
刘倩: "新城疫病毒耐热株HR09的鉴定与反向遗传操作系统的构建", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 * |
赵伟: "新城疫病毒VG/GA毒株反向遗传系统的建立及最佳外源基因表达位置的确定", 《中国博士学位论文全文数据库》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110499296A (zh) * | 2019-08-28 | 2019-11-26 | 扬州大学 | 一种耐热的血清8b型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法 |
CN110607285A (zh) * | 2019-08-28 | 2019-12-24 | 扬州大学 | 一种耐热的血清4型禽腺病毒基因工程疫苗候选株及其构建方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111575247B (zh) | 一种新城疫嵌合病毒标记疫苗株及其构建方法和应用 | |
US9051584B2 (en) | Heat-resistant newcastle disease virus live vaccine vector system and use thereof | |
CN105420261B (zh) | 一种新城疫病毒耐热改造方法及应用 | |
CN109321535A (zh) | 一种热稳定的新城疫病毒弱毒疫苗候选株 | |
CN109439634B (zh) | 伪狂犬病病毒基因工程弱毒疫苗株及其应用 | |
CN109321534A (zh) | 一种重组基因viii型新城疫病毒弱毒株 | |
Liu et al. | Generation by reverse genetics of an effective attenuated Newcastle disease virus vaccine based on a prevalent highly virulent Chinese strain | |
CN110079541A (zh) | 一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用 | |
WO2021051906A1 (zh) | 一种针对ii类vii型流行ndv株dhn3的感染性重组克隆方法 | |
CN112094824B (zh) | 表达禽腺病毒4型截短Fiber2蛋白的重组新城疫病毒耐热疫苗株及其制备方法与应用 | |
CN110218706B (zh) | 表达h7n9亚型高致病性禽流感病毒ha蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建与应用 | |
WO2020258757A1 (zh) | 一种突变株3型鸭甲肝病毒ch-p60-117c株及构建方法 | |
CN112011521A (zh) | 一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用 | |
CN102757942A (zh) | A型口蹄疫重组疫苗株及其制备方法和应用 | |
CN104195116B (zh) | 一种表达鹅细小病毒vp3基因的重组新城疫病毒及其构建方法 | |
CN112458064A (zh) | 盖他病毒全长感染性克隆、复制子系统及其制备和应用 | |
CN114164184B (zh) | 一种新城疫病毒基因ⅵ型疫苗株及其应用 | |
CN104353070B (zh) | 一种鸡传染性支气管炎病毒的基因工程亚单位疫苗及其制备方法 | |
CN106047823A (zh) | 一种基于反向遗传技术将ibv h120株重组表达ndv hn基因的二联疫苗株 | |
CN109295095A (zh) | 一种热稳定的基因viii型新城疫弱毒株外源基因表达载体 | |
CN109136200B (zh) | 一种重组传染性造血器官坏死病毒及其构建方法与应用 | |
CN102807989B (zh) | 犬科和/或猫科动物疫病重组活载体疫苗的制备方法 | |
CN110205308A (zh) | 一种表达ha基因的重组火鸡疱疹病毒及其应用 | |
CN114292823A (zh) | 携带基因VII型新城疫病毒F和HN基因的重组LaSota疫苗株及其构建方法和应用 | |
US20200237897A1 (en) | Recombinant Bivalent Inactivated Vaccine Against Foot-and-Mouth Disease Virus, Preparation Method and Use Thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190201 |