CN102807989B - 犬科和/或猫科动物疫病重组活载体疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于RNA病毒拯救技术的，制备犬科和/或猫科动物疫病重组活载体疫苗的方法，其基于反向遗传操作系统构建了可表达犬科和/或猫科动物疫病主要保护性抗原的重组病毒表达载体。利用该表达载体和辅助质粒共同转染狂犬病病毒复制许可宿主细胞，拯救重组病毒从而制备多价活载体疫苗。病毒生长曲线显示，拯救的母本病毒与表达犬科和/或猫科动物主要疫病病原保护性抗原基因的重组病毒生长动力学无明显差异，为成功制备犬科和/或猫科动物主要疫病基因重组活载体疫苗奠定了基础。

Description

犬科和/或猫科动物疫病重组活载体疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及一种基于RNA病毒拯救技术的，制备犬科和/或猫科动物疫病重组活载体疫苗的方法。

背景技术

随着我国人民生活水平的提高和生活方式的改变，犬科动物饲养数量与种类急剧上升。据不完全统计，我国目前家养犬约1亿5千万只。尽管在部分大城市中犬、猫等动物饲养已纳入政府管理（包括疫病防疫），但是动物传染病的迅速传播与蔓延已成为制约我国养殖业和宠物业发展的巨大障碍。一方面犬瘟热、犬传染性肝炎、犬冠状病毒性肠炎等传染性疾病严重威胁着宠物健康；另一方面宠物与人类密切接触，宠物源性狂犬病、流感、弓形虫病、包虫病、钩体病和布鲁氏菌病等人兽共患病严重影响人类健康和安全。农业部已将狂犬病、布鲁氏菌病和包虫病作为主要人兽共患病列入《国家动物疫病防治中长期规划（2011-2020）》。目前，我国犬、猫等动物疫病防控技术相对落后，主要表现在新型疫苗品种少、工艺落后、创新性不强，缺少国际竞争力，从而导致我国的动物疫苗市场主要依赖于国外产品的进口。

基因重组活载体疫苗是利用基因工程技术将外源基因插入细菌或病毒（通常为弱毒疫苗株）载体并使之表达的活疫苗。该疫苗免疫动物后可刺激机体产生广泛的细胞免疫、体液免疫，甚至粘膜免疫。此外，如果载体中可同时插入多个外源基因，即可制成能够同时预防多种疾病的联合疫苗。简言之，重组活载体疫苗兼备灭活疫苗和弱毒疫苗的优点（成本低、免疫原性好/安全性高等），是未来疫苗发展的主要方向之一。

狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）引起的一种严重侵害中枢神经的重要人畜共患传染病，感染谱极为广泛，包括狐、狼、鼠、洗熊、猫、蝙蝠、兔、牛、羊、马、犬等动物，以肉食目的犬科和猫科动物最为易感。狂犬病病毒属于弹状病毒科狂犬病毒属，为不分节段的负链RNA病毒，基因组编码五种结构蛋白，分别为核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）和聚合酶蛋白（L）。由于狂犬病病毒具有基因组简单，便于操作、可插入长片段外源基因而不影响自身复制，病毒便于培养和纯化等优点，被广泛用于疫苗载体的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种犬科和/或猫科动物疫病重组活载体疫苗的制备方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种重组真核表达载体，其携带有狂犬病病毒弱毒疫苗株基因组全长cDNA序列且含有至少一个外源基因表达盒。

前述的重组真核表达载体，所述外源基因表达盒位于该重组真核表达载体中狂犬病病毒弱毒疫苗株基因组中的磷蛋白（P）基因和基质蛋白（M）基因之间的非编码区。外源基因表达盒中含有的外源基因表达元件包括模仿磷蛋白（P）基因的转录终止序列PE和转录起始序列PS，以及外源酶切位点，便于引入外源基因序列。

前述的重组真核表达载体，在所述外源基因表达盒中插入的外源基因为标记基因、犬科和/或猫科动物疫病病原主要保护性抗原基因，或它们的组合。其中，标记基因优选为荧光标记基因，如编码EGFP蛋白的基因；所述犬科和/或猫科动物疫病病原主要保护性抗原基因优选为编码犬细小病毒（CPV）VP2蛋白、犬瘟热病毒（CDV）H或F蛋白等的基因。

上述犬科和/或猫科动物疫病是指犬瘟热（CDV）、犬细小病毒性肠炎（CPV）、犬传染性肝炎（CAV）、犬冠状病毒性肠炎（CCV）等中的一种或多种。

前述的重组真核表达载体，其含有CMV或T7启动子序列。前述的重组真核表达载体，优选出发载体为pcDNA3.1(+)或pCI等。

前述的重组真核表达载体，优选所述狂犬病病毒弱毒疫苗株为狂犬病病毒SRV9株。（Genbank中的Accession No.AF499686）

本发明还提供一种犬科和/或猫科动物疫病重组活载体疫苗的制备方法，包括以下步骤：1）构建上述重组真核表达载体；2）构建可表达狂犬病病毒弱毒疫苗株的核蛋白（N）、磷蛋白（P）、糖蛋白（G）和聚合酶蛋白（L）的辅助质粒；其中，编码所述核蛋白、磷蛋白、糖蛋白、聚合酶蛋白的基因可位于同一质粒上或分别位于不同质粒上；3）将1）和2）中构建好的重组真核表达载体和辅助质粒共转染狂犬病病毒的病毒复制许可宿主细胞，如BSR细胞或NA细胞，培养一段时间后收获病毒上清，纯化即得。其中，2）中辅助质粒的出发质粒优选pCI等。

本发明还提供制备狂犬病病毒弱毒疫苗株的拯救病毒的方法，包括以下步骤：1）构建上述重组真核表达载体；2）构建可表达狂犬病病毒弱毒疫苗株的核蛋白、磷蛋白、糖蛋白和聚合酶蛋白的辅助质粒；其中，编码所述核蛋白、磷蛋白、糖蛋白、聚合酶蛋白的基因可位于同一质粒上或分别位于不同质粒上；3）将1）和2）中构建好的重组真核表达载体和辅助质粒共转染狂犬病病毒的病毒复制许可宿主细胞，如BSR细胞或NA细胞，获得拯救病毒。其中，2）中辅助质粒的出发质粒优选pCI等。

本发明进一步提供采用上述方法获得的狂犬病病毒弱毒疫苗株的拯救病毒在制备犬科和/或猫科动物多价活载体疫苗中的应用。

本发明提供的基于RNA病毒拯救技术的，制备犬科和/或猫科动物疫病重组活载体疫苗的方法，其基于反向遗传操作系统构建了可表达犬科和/或猫科动物疫病主要保护性抗原的重组病毒表达载体。利用该表达犬科和/或猫科动物疫病主要保护性抗原的重组病毒表达载体和辅助质粒共同转染狂犬病病毒复制许可宿主细胞，拯救重组病毒从而制备多价活载体疫苗。病毒生长曲线显示，拯救的母本病毒与表达犬科和/或猫科动物主要疫病病原保护性抗原基因的重组病毒生长动力学无明显差异，为成功制备犬科和/或猫科动物主要疫病基因重组活载体疫苗奠定了基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中狂犬病病毒SRV9疫苗株全长基因组cDNA载体pCI-SRV9的构建示意图。

图2为本发明实施例1中狂犬病病毒SRV9疫苗株外源基因表达载体的构建示意图；其中，A为pD-SRV9，B为pD-SRV9-PMIn，C为pD-SRV9-sPMIn。

图3为本发明实施例1中拯救的病毒感染BSR细胞的直接免疫荧光照片；其中，A为rSRV9感染的BSR细胞，B为rSRV9-PMIn感染的BSR细胞，C为rSRV9-sPMIn感染的BSR细胞，D为未感染的BSR细胞。

图4为本发明实施例2中表达eGFP基因的狂犬病病毒SRV9疫苗株载体构建示意图；其中，A为pD-SRV9，B为pD-SRV9-PM-eGFP，C为pD-SRV9-sPM-eGFP。

图5为本发明实施例2中拯救的病毒感染BSR细胞的直接免疫荧光照片；其中，A为rSRV9-PM-eGFP感染的BSR细胞，B为rSRV9-sPM-eGFP感染的BSR细胞，C为未感染的BSR细胞。

图6为本发明实施例2中rSRV9-PM-eGFP、rSRV9-sPM-eGFP和wtSRV9在BSR细胞上的生长动力学曲线。

图7为本发明实施例3中表达CPV VP2基因的重组病毒的构建示意图；其中，A为pD-SRV9，B为pD-SRV9-VP2。

图8为本发明实施例3中拯救的重组病毒感染BSR细胞的直接免疫荧光照片；其中，A为rSRV9-VP2感染的BSR细胞，B为未感染的BSR细胞。

图9为本发明实施例3中rSRV9-VP2和wtSRV9在BSR细胞上的生长动力学曲线。

图10为本发明实施例4中使用rSRV9-VP2和wtSRV9对ICR小鼠免疫后的抗体表达情况；其中，A为抗狂犬病病毒抗体滴度情况，B为抗细小病毒抗体滴度情况。

图11为本发明实施例1中涉及的质粒pCI载体图谱。

图12为本发明实施例1中涉及的质粒pCDNA3.1(+)载体图谱。

图13为本发明实施例2中涉及的质粒pCI-eGFP质粒图谱。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1表达外源基因的重组狂犬病病毒真核表达载体的构建

1材料与方法

1.1质粒、细胞株、毒株与试剂

质粒pCI（图11）、pCDNA3.1(+)（图12）、狂犬病病毒SRV9株、BSR细胞均购自中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所。BSR细胞以含5%胎牛血清的DMEM培养，狂犬病病毒SRV9株在BSR细胞上扩增，-70℃冻存备用。

Phusion DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶均购自NEB公司，感受态细胞购自Takata公司，凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自Axygen公司，RNA提取用TRIzol、鼠源反转录酶、脂质体均购自Invitrogen公司，胎牛血清购自长春西诺生物科技有限公司。

1.2RNA提取与RT-PCR

使用TRIzol法提取SRV9病毒RNA（按制造商说明进行）。提取的RNA溶于DEPC-H₂O中，进行反转录。反转录过程中所用引物为F1F’、F2F、F3F’、F4F（F1F’、F3F’分别为F1F、F3F去除核酶、酶切位点后的引物）（表1），分别获得末端相互重叠的四段病毒cDNA。

1.3全长cDNA的构建

由上海捷瑞生物有限公司合成一部分HdvRZ的序列：HdvRZ-F（5’-3’）：

GTCGAC

ACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCG

；HdvRZ-R（5’-3’）：

CGCCCTCCCTTAGCCATCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATGCCCAGGT

G TCGAC

。其中下划线为酶切位点(AccI、

)，粗体为保护性碱基，CpoI为HdvRZ序列自带的酶切位点。两段序列退火（95℃变性5min，降至室温，4℃保存）后，经AccI+NotI双酶切，连入pCI载体中，得到的载体命名为pCI-rib。

参照GenBank上SRV9的基因组序列（Accession No.AF499686），将SRV9全长cDNA分为四段，分别设计引物（表1），使用相对应的cDNA进行PCR扩增。同时通过PCR方法在基因组中引入核酶序列，即F1的5’端引入HamRZ序列，F4的3’端引入一部分HdvRZ序列。

表1  SRV9全长分段PCR引物序列

按图1组装SRV9全长cDNA。具体过程如下：通过NheI+MluI双酶切将F3连入pCI中，得到pCI-F3。通过XhoI+BlpI双酶切将F2连入pCI-F3中，得到pCI-F2/3。通过XhoI+MluI双酶切将F2/3连入pCI-rib中，得到pCI-rib-F2/3。通过NheI+XhoI双酶切将F1连入pCI-rib-F2/3中，得到pCI-rib-F1/2/3。通过MluI+CpoI双酶切将F4连入pCI-rib-F1/2/3中，得到pCI-rib-F1/2/3/4，命名为pCI-SRV9。将测序正确的pCI-SRV9经NheI+XhoI双酶切后，连入pCDNA3.1(+)载体中，命名为pD-SRV9。

1.4外源基因表达载体的构建

通过PCR方法在SRV9基因组中的磷蛋白（P）基因和基质蛋白（M）基因之间引入外源基因表达元件，根据引入元件的具体位置不同，构建了两种外源基因表达载体，一种为在P基因的终止密码子后、poly A前（2425nt处）引入外源基因表达元件，命名为pD-SRV9-PMIn；另一种为在P基因的poly A后、基因M的起始序列前（2477nt处）引入外源基因表达元件，命名为pD-SRV9-sPMIn。

pD-SRV9-PMIn构建方法如下：以pCI-SRV9为模板，分别以PM1F、PM1R和PM2F、PM2R为引物（序列见表2），得到PCR产物PM1、PM2。通过NheI+KpnI双酶切将PM1连入pCI载体中，得到pCI-PM1。通过BsiWI+NotI双酶切将PM2连入pCI-PM1中，得到pCI-PM12。通过AvrII+BstZ17I双酶切将pCI-PM12替换pCI-SRV9的相应位置片段，得到pCI-SRV9-PMIn。将测序正确的pCI-SRV9-PMIn经NheI+XhoI双酶切后，连入pCDNA3.1(+)载体中，命名为pD-SRV9-PMIn。

pD-SRV9-sPMIn构建方法如下：以pCI-SRV9为模板，分别以PM1F、sPM1R和sPM2F、PM2R为引物，得到PCR产物sPM1、sPM2。通过NheI+KpnI双酶切将sPM1连入pCI载体中，得到pCI-sPM1。通过BsiWI+NotI双酶切将sPM2连入pCI-sPM1中，得到pCI-sPM12。通过AvrII+BstZ17I双酶切将pCI-sPM12替换pCI-SRV9的相应位置片段，得到pCI-SRV9-sPMIn。将测序正确的pCI-SRV9-sPMIn经NheI+XhoI双酶切后，连入pCDNA3.1(+)载体中，命名为pD-SRV9-sPMIn。

表2  进行载体改造设计的引物序列

注：粗体为保护性碱基

1.5辅助质粒的构建

分别对N、P、G、L1、L2、L3进行PCR扩增，引物序列见表3。N、P、G分别经NheI+SmaI双酶切后，连入pCI中，得到pCI-N、pCI-P、pCI-G。将L分为三段，即L1、L2、L3。L2经NheI+MluI双酶切后，连入pCI中，得到pCI-L2；L3经MluI+SmaI双酶切后，连入pCI-L2中，得到pCI-L2/L3；L1经NheI+BlpI双酶切后，连入pCI-L2/L3中，得到pCI-L。再将pCI-N、pCI-P、pCI-G、pCI-L分别经NheI+XhoI双酶切后，连入pCDNA3.1(+)载体中，并分别命名为pD-N、pD-P、pD-G、pD-L。

表3  辅助质粒PCR所用引物序列

注：粗体为保护碱基，斜体为Kozak序列，灰体为终止密码子

1.6病毒拯救

分别将全长质粒pD-SRV9、pD-SRV9-PMIn、pD-SRV9-sPMIn与辅助质粒pD-N、pD-P、pD-G、pD-L共转染BSR细胞，其中，全长质粒和辅助质粒N、P、L、G的量分别为2.5μg、0.625μg、0.3125μg、0.125μg、0.1875μg，操作方法如下：转染前一天，将BSR细胞转移至六孔板中，在5%DMEM培养基中37℃培养，当细胞密度达到90%以上时进行转染。将构建成功的全长质粒同辅助质粒按一定量加入250μL OPTI-MEM中，混匀；取10μL脂质体LipofectamineTM2000加入250μL OPTI-MEM中，混匀，室温静置5分钟。然后将脂质体与质粒混匀，室温静置20分钟。期间用OPTI-MEM洗六孔板细胞两次，然后加入1.5mL OPTI-MEM/孔。最后将脂质体-质粒混合液加入六孔板细胞内，置于37℃CO₂培养箱中培养4h，吸弃转染液，加入5%DMEM继续培养。第3天更换新鲜培养液，第7天进行检测：将上清接种至96孔板，培养2天后以FITC标记的鼠抗狂犬病病毒N蛋白单克隆抗体对拯救获得的病毒进行检测。

2结果

2.1SRV9株全长cDNA感染性克隆的构建

为了构建SRV9株全长cDNA的感染性克隆，将全长分为四个相互重叠的片段，利用片段间相互重叠区域的酶切位点进行拼接入pCI和pCDNA3.1（+）载体中。最终构建得到11928nt的完整cDNA克隆，并在cDNA的5’端引入了HamRZ序列、3’端引入了HdvRZ序列，分别命名为pCI-SRV9、pD-SRV9。质粒pD-SRV9的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.2SRV9全长cDNA感染性克隆的构建

以pCI-SRV9为基础，在磷蛋白（P）基因和基质蛋白（M）基因之间引入了外源基因表达元件，构建了两种外源基因表达载体pD-SRV9-PMIn（图2B）、pD-SRV9-sPMIn（图2C）。元件模仿了P蛋白的转录终止序列PE和转录起始序列PS，并引入了外源酶切位点，便于引入外源基因序列。

2.3辅助质粒的构建

将SRV9的核蛋白（N）基因、磷蛋白（P）基因、糖蛋白（G）基因和聚合酶蛋白（L）基因分别克隆入pCDNA3.1（+）载体中，并在各个结构基因的起始密码子前引入Kozak序列，以增强目的蛋白的表达，在原有终止密码子后额外增加终止密码子，有效终止了mRNA的转录。得到的辅助质粒分别命名为pD-N、pD-P、pD-G、pD-L（核苷酸序列分别如SEQ ID No.4-7所示）。

2.4重组病毒的拯救

分别将质粒pD-SRV9、pD-SRV9-PMIn、pD-SRV9-sPMIn和辅助质粒pD-N、pD-P、pD-G、pD-L共同转染BSR细胞，第7天收获病毒上清，接种96孔板培养两天后，使用FITC标记的鼠抗狂犬病病毒N蛋白单克隆抗体进行直接免疫荧光检测。结果阳性孔（图3A-C分别为拯救的重组病毒rSRV9、rSRV9-PMIn、rSRV9-sPMIn）均有大量散在的绿色荧光，而对照孔（正常细胞孔，图3D）无荧光。

实施例2表达eGFP的重组狂犬病病毒的载体构建及鉴定

1材料与方法

1.1质粒、细胞株、毒株与试剂

质粒pD-SRV9-PMIn、pD-SRV9-sPMIn为实施例1中构建，含有eGFP的质粒pCI-eGFP（图13）由中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所保存。

1.2表达eGFP载体的构建

根据eGFP的序列，通过PCR方法（PCR引物序列见表4）获得两端带有酶切位点的eGFP片段，通过BsiWI+PmeI双酶切将eGFP分别插入pCI-SRV9-PMIn、pCI-SRV9-sPMIn中，得到pCI-SRV9-PM-eGFP、pCI-SRV9-sPMIn-eGFP。再经NheI+XhoI双酶切后，连入pCDNA3.1(+)载体中，分别命名为pD-SRV9-PM-eGFP、pD-SRV9-sPM-eGFP。

表4  引物序列

注：粗体为保护性碱基

1.3病毒拯救

分别将全长质粒pD-SRV9-PM-eGFP、pD-SRV9-sPM-eGFP与辅助质粒共转染BSR细胞，转染用量及方法同实施例1。转染后第7天将六孔板直接放置在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。

1.4病毒生长特性鉴定

将拯救获得的重组病毒rSRV9-PM-eGFP、rSRV9-sPM-eGFP传至F3代后，与母本病毒（wtSRV9）分别单层接种BSR或NA细胞（MOI=0.1），37℃培养1天后，转至33℃继续培养3天，每隔24h收获一次病毒上清，进行病毒滴度测定。

1.5病毒滴度测定

将病毒原液连续10倍稀释后同步接种NA细胞，5%CO₂37℃恒温培养箱培养2天后，在荧光显微镜下观察。以每ml病毒液中所含荧光灶形成单位（FFU）的数量表示病毒滴度。

2结果

2.1表达eGFP基因的全长cDNA感染性克隆的构建

以pCI-SRV9-PMIn、pCI-SRV9-sPMIn为基础，构建两种可表达eGFP的表达载体pD-SRV9-PM-eGFP（图4B，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示）、pD-SRV9-sPM-eGFP（图4C）。eGFP起始密码子前添加了Kozak序列，可增强目的蛋白的表达。

2.2表达eGFP的重组狂犬病病毒的拯救

将质粒pD-SRV9-PM-eGFP、pD-SRV9-sPM-eGFP和辅助质粒pD-N、pD-P、pD-G、pD-L共同转染BSR细胞，第7天将六孔板直接放置在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况。结果阳性孔（图5A-B分别为拯救的病毒rSRV9-PM-eGFP、rSRV9-sPM-eGFP感染的BSR细胞）均有大量散在的翠绿色荧光，而对照孔（正常细胞孔，图5C）无荧光。且两者的拯救效率无明显差别。

2.3重组病毒的生物学特性鉴定

分别以BSR细胞测定拯救获得重组病毒（rSRV9-PM-eGFP、rSRV9-sPM-eGFP）和野生型母本病毒（wtSRV9）的生长动力学曲线（图6），结果表明：rSRV9-PM-eGFP、rSRV9-sPM-eGFP在两种细胞的生长性能与wtSRV9无显著差异（p>0.05）。

实施例3表达犬细小病毒VP2基因的重组狂犬病病毒的载体构建及鉴定

1材料与方法

1.1质粒、细胞株、毒株与试剂

质粒pD-SRV9-PM-eGFP为实施例2中构建，犬细小病毒CPV（CR86106株）购自军事医学科学院军事兽医研究所。

1.2DNA提取与PCR

按试剂盒使用说明提取细小病毒DNA。

1.3表达细小病毒VP2重组病毒的构建

根据细小病毒VP2的序列，通过PCR方法（PCR引物序列见表5）获得两端带有酶切位点的VP2片段，通过BsiWI+PmeI双酶切将VP2插入pD-SRV9-PM-eGFP中，得到pD-SRV9-VP2。

表5  引物序列

注：粗体为保护性碱基

1.4病毒拯救

将全长质粒pD-SRV9-VP2与辅助质粒共转染BSR细胞，转染用量及方法同实施例1。转染7天后将上清接种至96孔板，培养两天后以FITC标记的鼠抗狂犬病病毒N蛋白的单克隆抗体对拯救获得的病毒进行检测。

1.5病毒生长特性鉴定

将拯救获得的重组病毒rSRV9-VP2传至F3代后，与母本病毒（wtSRV9）分别单层接种BSR或NA细胞（MOI=0.1），37℃培养1天后，转至33℃继续培养3天，每隔24h收获一次病毒上清，进行病毒滴度测定。

1.6病毒滴度测定

将病毒原液连续10倍稀释后同步接种NA细胞，5%CO₂37℃恒温培养箱培养2天后，以FITC标记的抗狂犬病病毒N蛋白单克隆抗体进行染色，荧光显微镜下观察结果。以每ml病毒液中所含有荧光灶形成单位（FFU）的数量表示病毒滴度。

2结果

2.1表达CPV VP2基因的全长cDNA感染性克隆的构建

以pD-SRV9-PM-eGFP为基础，成功构建了可表达细小病毒VP2的表达载体pD-SRV9-VP2（其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示）。VP2起始密码子前添加了Kozak序列，可增强目的蛋白的表达（图7）。

2.2表达VP2基因的重组狂犬病病毒的拯救

将质粒pD-SRV9-VP2和辅助质粒pD-N、pD-P、pD-G、pD-L共同转染BSR细胞。转染结果表明，阳性孔（图8A）有大量散在的绿色荧光，而对照孔（正常细胞孔，图8B）无荧光。

2.3重组病毒的生物学特性鉴定

分别以BSR细胞测定拯救获得重组病毒rSRV9-VP2和野生型母本病毒（wtSRV9）的生长动力学曲线(图9)，生物统计结果表明：rSRV9-VP2在两种细胞的生长性能与wtSRV9无显著差异（p>0.05）。

实施例4表达犬细小病毒VP2基因的重组狂犬病病毒的动物免疫试验

1材料与方法

1.1毒株、细胞株与试剂

重组病毒rSRV9-VP2和野生型母本病毒（wtSRV9）为实施例3中拯救所得，鼠神经瘤细胞（NA）、犬细小病毒CPV（CR86106株）均购自军事医学科学院军事兽医研究所。

1.2动物免疫试验

分别用10⁶FFU的重组病毒rSRV9-VP2和野生型母本病毒（wtSRV9）经肌肉注射途径免疫6-8周龄的ICR小鼠（购自军事医学科学院实验动物中心），免疫后第20天采血，分离血清-70℃保存。

分别用10⁷FFU的重组病毒rSRV9-VP2和野生型母本病毒（wtSRV9）经肌肉注射途径免疫3月龄的比格犬（购自军事医学科学院实验动物中心）；首免三周后，分别用相同途径和相同剂量加强免疫。分别于免疫前和首免后14天、21天、28天、35天、42天和49天前肢静脉采血，分离血清-70℃保存。

1.3抗体水平检测

以荧光抗体病毒中和试验（FAVN）测定血清样品中狂犬病病毒中和抗体效价。首先将血清样品置于56℃水浴30min进行灭活，再将血清样品以细胞培养液进行连续3倍稀释（每稀释度体积为50μL），加入50μL含100FFU的狂犬病病毒CVS11株混合，37℃感作1h后，每孔加入约10⁵个NA细胞，37℃5%CO₂环境培养24h，80%丙酮固定30min，以FITC标记的抗狂犬病核蛋白单克隆抗体进行染色，荧光显微镜（Leica DMIRES2）下观察结果。血清每个稀释度设4个平行孔。

以血凝抑制试验测定血清样品中细小病毒抗体滴度。将血清样品置于56℃水浴30min进行灭活，再将样品以20mMPBS（pH 6.5）进行连续两倍稀释（每个稀释度25μL），加入25μL 8个单位血凝抗原（CPV），震荡混匀后置37℃感作1h，加入50μL 0.75%的猪红细胞，经震荡混匀，于4℃静置1h后判定，以能抑制100%红细胞凝集的最高血清稀释度为该血清的血凝抑制效价。

2结果

2.1小鼠免疫试验

将重组病毒rSRV9-VP2和野生型母本病毒（wtSRV9）免疫小鼠后，两种重组病毒均可刺激小鼠机体产生高水平的狂犬病病毒中和抗体，且两者之间无显著差异（P>0.05）。此外，rSRV9-VP2可刺激机体产生细小病毒血凝抑制抗体（图10）。

2.2犬免疫试验

将重组病毒rSRV9-VP2和野生型母本病毒（wtSRV9）免疫犬后14天，即可检测到高水平的狂犬病病毒中和抗体。加强免疫后狂犬病病毒抗体水平进一步提高，至免疫后49天，犬机体内仍维持很高的狂犬病病毒中和抗体。两种病毒在犬体内诱导中和抗体的水平及抗体消长规律无明显差异（P>0.05）（表6）。rSRV9-VP2首免后14天可在犬体内检测到犬细小病毒血凝抑制抗体，加强免疫后细小病毒血凝抑制抗体迅速提高，且在加强免疫后2周达到峰值（表7）。重组病毒rSRV9-VP2的上述免疫活性证明VP2蛋白在重组病毒免疫的动物机体内获得高效表达，从而产生高水平的细小病毒血凝抑制抗体。

表6  免疫犬体内狂犬病病毒中和抗体滴度

表7  重组疫苗免疫犬体内抗细小病毒血凝抑制抗体滴度

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.犬科和/或猫科动物疫病重组活载体疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）构建可表达细小病毒VP2的重组真核表达载体pD-SRV9-VP2，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

2）构建可表达狂犬病病毒弱毒疫苗株SRV9的核蛋白、磷蛋白、糖蛋白和聚合酶蛋白的辅助质粒；其中，编码所述核蛋白、磷蛋白、糖蛋白、聚合酶蛋白的基因可位于同一质粒上或分别位于不同质粒上；

3）将1）和2）中构建好的重组真核表达载体和辅助质粒共转染BSR细胞或NA细胞，培养一段时间后收获病毒上清，纯化即得。

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