CN102573901A - 重组禽副粘病毒疫苗及其制备和使用方法 - Google Patents

重组禽副粘病毒疫苗及其制备和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明包括工程化APMV组合物或疫苗。所述疫苗或组合物可以是重组APMV组合物或疫苗。本发明包括用于修饰APMV的基因组以产生重组APMV的方法；利用此类方法制备的经修饰的APMV；DNA和蛋白质序列；以及利用这样的重组APMV感染细胞和宿主动物的方法。

Description

重组禽副粘病毒疫苗及其制备和使用方法
通过引用合并入本文
本申请要求保护2009年8月21日提交的美国临时申请系列No.61/235,912的利益。
发明领域
本发明涉及禽副粘病毒(APMV)和APMV序列。本发明涉及用于插入和表达外源基因以用作保护免受多种病原体侵害的安全免疫媒介物的病毒载体。其涉及在反向遗传学体系中用于产生活减毒疫苗的载体疫苗。其还涉及可用于在体外表达载体中产生亚单位或用作待被整合入病毒或质粒类型体内表达载体的序列的多核苷酸。
本发明涉及未修饰的和经修饰的APMV病毒，其制备和使用方法以及某些DNA和蛋白质序列。更具体地，本发明涉及其中病毒的天然基因组已被改变的APMV病毒(″APMV突变体″或“重组APMV”)和涉及制备及使用此类APMV变体或重组APMV的方法。
发明背景
病毒载体疫苗代表疫苗开发的最快速成长领域之一。主要的全球感染性疾病HIV、肺结核(tuberculosis)和疟疾的许多处于临床开发中的疫苗是基于病毒载体。动物的病毒载体疫苗已上市，例如用于陪伴动物(companion animal)和家禽的禽痘病毒疫苗、用于家禽的禽疱疹病毒载体疫苗和用于野生动物的痘苗病毒载体疫苗。但其它家畜类载体疫苗处于开发中。病毒载体疫苗的有利方面是它们可被安全地施用，这是由于使用已被大大减毒并且其本身在动物中不引发疾病的载体主链所致。目前使用的病毒载体的不利方面是母传抗体或因以往感染而获得的抗体的存在。此类抗体将中和载体病毒，从而减少载体疫苗的成功。载体疫苗开发的一个主要动力是最先在亚洲、随后在欧洲和非洲发生的高致病性流感病毒H5N1的出现。已开发了几种载体疫苗候选物，包括禽痘病毒(Taylor等人，1988)、痘苗病毒(Chambers等人，1988)、劳氏肉瘤病毒(Hunt等人，1988)、腺病毒(Tang等人，2002，Gao等人，2006)，委内瑞拉马脑炎病毒(Schultz-Cherry等人、2000)、新城疫病毒(US6,719,979，Veit s等人，2006，Swayne等人，2002，Park等人，2006)、传染性喉气管炎的疱疹病毒(Veits等人2003)，火鸡的疱疹病毒(Darteil等人，1995)以及基于腺病毒的载体疫苗(Hoelscher等人，2008，Toro等人，2007)。已在首次用于实验的鸟中测试了这些载体疫苗的功效，但到目前为止还没有公布关于这些载体疫苗在对所述病毒载体和/或由所述插入物编码的蛋白质有预存免疫的鸟类中的功效的报导。
副粘液病毒科包括人(麻疹，腮腺炎，副流感和呼吸道合胞病毒)和动物病原体(新城疫病毒和牛瘟病毒)，所述病毒对公共卫生以及全球经济造成重大影响(Lamb等人，2007)。该病毒科的成员定义为具有单组分(monopartite)反义单链RNA基因组。副粘液病毒科由两个亚科即副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)和肺炎病毒亚科(Pneumovirinae)组成。根据最近的重新分类，副粘病毒亚科包括5个属即麻疹病毒属(Morbillivirus)、亨尼波病毒属(Henipavirus)、Rubulavirus、呼吸系病毒属(Respirovirus)和Avulavirus，而肺炎病毒亚科包括肺炎病毒属(Pneumovirus)和偏肺病毒属(Metapneumovirus)(Mayo，2002)。禽副粘病毒(APMV)被分类在腮腺炎病毒属中，包括已使用血凝抑制(HI)试验(Alexander，1988)确定的9个抗原上不同的血清型。在这9个血清型中，属于APMV-1亚型的分离株可引起商业家禽的灾难性疾病，并且被分类为速发型新城疫病毒(NDV)。NDV的更温和形式被称为中发型和缓发型分离株，其中后一种形式在家禽中大多无症状。属于APMV-2、3、6和7的分离株也与家禽的疾病相关。具体地，APMV-2和3的分离株引起的感染可引发轻度呼吸性疾病和蛋质量和数量上的问题(Bankows ki等人，1981；Redmann等人，1991；Tumova等人，1979；Zhang等人，2007)。已知APMV-6和7的分离株感染火鸡、鸭和候鸟并且可诱导呼吸性疾病，所述疾病可牵涉继发感染(Saif等人，1997；Shortridge等人，1980)。在另一方面，已从鸭、水禽和其它野生鸟类分离了APMV-4、5、8和9的分离株，但所述鸟类在病毒感染后极少显示临床症状(Alexander等人，1983；Capua等人，2004；Gough等人，1984；Maldonado等人，1995；Shortridge等人，1980)。
几个NDV分离株的完整基因组序列已被确定并且用于阐释NDV毒力的各种决定簇(de Leeuw等人，1999；Krishnamurthy等人，1998；Zou等人，2005)。在最近两年中，除APMV1外的几种APMV序列已被公布，例如APMV-2的GenBank登录号EU338414、APMV-3的EU403085、APMV-4的FJ177514、APMV-6的EU622637、APMV-7的FJ231524、APMV-8的FJ215863、FJ215864和FJ619036、APMV-9的EU910942。除了序列信息外，关于致病因子知之甚少。APMV 2-9的分离株大部分是从候鸟分离的。有趣地，鲜见用此类分离株对鸡进行实验性感染的报导(Saif等人，1997)。由于这些APMV在野生鸟类中广泛传播，并且在某些情况下已从有时引起它们死亡(Saif等人，1997；Shihmanter等人，1998；Shihmanter等人，1998)的商业鸟群中(Zhang等人，2007)分离到所述APMV，因此需要了解关于它们在禽类中的毒力的知识。
大多数APMV分离株引起相对轻度的疾病，所述疾病在伴随细菌或病毒感染存在时可恶化，这可能导致经济影响。具体地，APMV-2最早在1956年作为二级病原体从南加利福尼亚的受急性喉气管炎影响的鸡中分离到(Bankowski等人，1960)。由于该血清型的许多株已从几个鸟类物种分离到，这表明APMV-2在世界上被广泛传播(Andral等人，1984；Bradshaw等人，1979；Fleury等人，1979；Goodman等人，1988；Lang等人，1975；Lipkind等人，1982；Lipkind等人，1979；Zhang等人，2006)。Bankowski等人报导了产蛋雌火鸡对APMV-2的自然以及人工暴露造成了孵化率和家禽产率(poultry yield)的显著下降(Bankowski等人，1981)。APMV-4分离的最初实例是从美国密西西比候鸟迁栖所经路径上的猎人杀死的野生鸭(Webster等人，1976)以及在家禽的流行性感冒监测分析(influenza surveillance programs of poultry)期间在香港从鸡、鸭和鹅(Alexander等人，1979)分离到。除了来自患有出血性肠炎的环颈鸭的分离株(Gough等人，1984)外，所有其它分离株在家禽中似乎是非致病性的，并且发现它们在全世界的水禽中具有广泛分布(Stanislawek等人，2002；Tumova等人，1989；Yamane等人，1982)。Gough等人报导在用来自环颈鸭的分离株鼻内接种1周龄小鸭子和2周龄鸡后未获得临床体征，并且HI滴度极低(1：8或更低)(Gough等人，1984)。类似地，作为流感监测项目的结果，APMV-6的第一个分离株也是来自香港的家禽，并且据报导在鸡中是非致病性的(基于来自实验性感染的鸡的低HI滴度)(Shortridge等人，1980)。然而，已报导了导致轻度呼吸性疾病和产蛋问题的火鸡APMV-6感染(Alexander，2003)。
APMV-8(鹅/特拉华/1053/76)最早在美国从猎人杀死的加拿大鹅(黑额黑雁(Brantacanadensis))分离而来(Rosenberger等人，1974)。南西班牙的猎鸟的血清学研究(1990至1992)显示，APMV-8抗体在达到43％的测试血清中大量存在(Maldonado等人，1995)。就APMV感染测定新西兰的活的健康驯化野鸭的状态的另一个血清学研究显示，APMV-8抗体在56％的测试血清中存在(Stanislawek等人，2002)。Warke等人(2008)描述了16％至31％的被研究鸡血清可能本来具有APMV-8抗体。但因现有的抗APMV1的高滴度，假阳性HI测试的可能性也可能存在，因为血清在HI测定中不能非常特异性地反应。除当就禽流感病毒研究群体时分离的APMV-8的少数水禽分离株外(Stallknecht等人，1991)，一直缺乏关于该病毒的流行和致病性的信息。
用于NDV的负链RNA基因组的反向遗传学体系的开发使得可能将外源基因序列插入基因组，从而使得可能产生用于接种和基因治疗的重组NDV载体(Krishnamurthy等人，2000；Peeters等人，1999；Roemer-Oberdoerfer等人，1999)。已报导了表达外源病毒蛋白例如流感病毒A型的H1亚型的HA蛋白(Nakaya等人，2001)、传染性腔上囊病病毒的VP2蛋白(IBDV)(Huang等人，2004)、H5亚型(Veits等人，2006；Ge等人，2007)和亚型H7(Park等人，2006)的禽流感染病毒血凝素的重组NDV载体。然而，仅在SPF禽中证明了大多数此类疫苗的功效。NDV在家禽中引起灾难性疾病，导致家禽工业的严重经济损失。因此在世界上大多数国家常规地给商业鸡接种抗NDV的疫苗。因此，来自已免疫的亲代群体的鸡具有高水平的母传抗体。常规活NDV疫苗即使在这些抗体存在的情况下也提供保护作用。然而，重组NDV疫苗(具有外源基因插入)与活NDV疫苗相比较通常更加减毒，它们的功效在NDV母传抗体存在的情况下可被削弱。因此，存在对可为用于表达异源抗原的安全疫苗提供基础的载体疫苗平台的需要。理想地，重组疫苗可诱导强体液免疫反应，可适用于大量施用，并且廉价。
发明概述
本发明涉及包含(i)重组APMV和(ii)药用或兽医学可接受的载体的疫苗或组合物。本发明包括用于修饰APMV的基因组以产生重组APMV病毒或APMV病毒载体的方法；通过此类方法制备的经修饰的APMV；DNA和蛋白质序列；以及利用此类重组APMV感染细胞和宿主动物以引起所述细胞和宿主动物扩增外源DNA和由该外源DNA编码的蛋白质(包括抗原性蛋白质)的方法。
本发明的一个方面涉及APMV病毒、参与制备经修饰的或重组的病毒的DNA和蛋白质序列。本发明的一个实施方案涉及APMV-2、4、6或8的基因组和蛋白质序列。
本发明的另一个方面涉及经修饰的重组APMV病毒(所述病毒具有增强的安全性、强体液免疫反应)以及制备此类重组病毒的方法。
本发明的另一个方面涉及与已知的APMV或其它重组疫苗相比具有升高的安全水平的重组APMV病毒疫苗或组合物。
在另一个方面，本发明提供了用于在宿主中表达基因产物的未修饰的和经修饰的APMV病毒载体。
本发明的另一个方面涉及通过将来自任何来源的DNA插入APMV基因组的基因间区域或非必需区域而修饰的重组APMV病毒。根据本发明使用具有编码和表达抗原的异源基因的合成地修饰的APMV病毒重组体来产生新型组合物或疫苗，
本发明的另一个方面涉及提供反向遗传学体系的APMV病毒载体，其中所述载体可在不同的宿主动物中用作主链用于重组疫苗或组合物。
在一个方面，本发明涉及用于在以组合物或疫苗接种的宿主动物中诱导免疫反应的药物组合物或疫苗，所述组合物或疫苗包括药用可接受的载体和经修饰的APMV重组病毒或病毒载体。在本发明的另一个方面，所述重组APMV病毒或病毒载体在病毒基因组的非必需区域内包括编码来源于病原体的抗原性蛋白质的异源DNA，其中当给宿主施用时，所述组合物或疫苗能够诱导特异于由所述病原体编码的蛋白质的免疫反应。
本发明的另一个方面涉及用于在动物中诱导对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括用含有经修饰的重组APMV病毒或病毒载体(所述载体包含和表达所述动物的病原体的抗原决定簇)的疫苗或药物组合物接种动物。本发明的另一个方面涉及在初免-加强方案中诱导动物的对抗原的免疫反应的方法。
本发明的另一个方面涉及通过向细胞引入经修饰的重组APMV病毒来在体外细胞培养物中表达基因产物的方法，其中所述基因可以是来源于病原体的抗原性蛋白。
附图概述
可结合附图理解通过举例给出的下列详细描述，这些实例并不意在将本发明限定于所描述的具体实施方案，其中：
图1是显示在用APMV-2、4、6于含胚鸡蛋中进行实验性感染后从鸡的几个器官进行的病毒分离列表。
图2是显示在用APMV-2、4、6进行实验性感染后鸡的几个器官的组织学结果列表。
图3描述了利用APMV-2、4或6实验性接种的SPF鸡中的HI抗体滴度。对感染后第2、4、7、14和25天收获的鸡血清样品进行HI测试以分析HI抗体的存在情况。
图4显示利用APMV-8实验性感染的SPF鸡和鸭内的HI抗体滴度。利用剂量为106EID50的APMV-8鼻感染鸡和鸭。在感染后第2、4、7、14和28天收集血清样品，利用APMV-8抗原通过HI测试分析所述样品。HI血清滴度(以log2表示)示于左轴上。
图5显示在利用APMV-8的初免/加强接种方案过程中SPF鸡中HI抗体滴度的发展情况。在第1天(初免)和第14天(加强)利用剂量为106EID50的APMV-8感染1日龄SPF鸡。在第一次感染后第7天和第14天获得血清样品，在第二次感染后第7天和第14天获得血清样品。对血清进行HI测试。HI血清滴度(以log2表示)示于左轴上。
图6显示通过琼脂糖凝胶电泳分析RT-PCR产物。在感染后第2天从非感染的鸭(C1-C5)和APMV-8感染的鸭(I1-I5)获取气管组织。将组织匀浆，制备RNA以用于RT-PCR。平行制备水对照(W)。在1.5％琼脂糖凝胶上分离反应产物。通过使用100bp分子量梯度(New Eng l andBiolabs)作为片段大小的对照。DNA片段的大小显示于右边。
图7是显示来自用APMV-8实验性感染的鸡和鸭的病毒分离列表。在含胚鸡蛋中进行鸡组织的病毒分离，通过RT-PCR检测来自鸭组织的病毒RNA。
图8是显示在用APMV-8感染鸡和北京鸭后几个器官的组织学检查结果的列表。
图9显示在用不同剂量的APMV-8感染后在SPF鸡中HI抗体滴度的发展情况。在第1天用不同感染剂量(ID)的APMV-8感染或用病毒转运液(VTM)模拟感染1日龄SPF鸡。在感染后第7天和第14天获取血液，通过HI测试分析获得的血清样品。HI血清滴度(以log2表示)示于左轴上。血清样品的几何平均滴度(GMT)示于最底行。
图10显示在用不同剂量的APMV-8感染后北京鸭中HI抗体滴度的发展情况。在第1天用不同感染剂量(ID)的APMV-8感染或用病毒转运液(VTM)模拟感染1日龄SPF北京鸭。在感染后第7天和第14天获取血液，通过HI测试分析获得的血清样品。HI血清滴度(以log2表示)示于左轴上。血清样品的几何平均滴度(GMT)示于最底行。
图11是显示相应D N A和蛋白质序列的SEQ ID NO的列表。
图12描述了APMV-8株(APMV-8：SCWDS ID：MA-7，从野鸭分离的)的全长基因组序列和全长APMV-8基因组的遗传图谱。
图12描述了编码APMV-8核蛋白(NP)的DNA序列(SEQ ID NO：2)和NP蛋白序列(SEQ ID NO：3)。
图13描述了编码APMV-8磷蛋白(P)的DNA序列(SEQ ID NO：4)和P蛋白序列(SEQ ID NO：5)。
图14描述了编码APMV-8基质蛋白(M)的DNA序列(SEQ ID NO：6)和M蛋白序列(SEQ ID NO：7)。
图15描述了编码APMV-8融合蛋白(F)的DNA序列(SEQ ID NO：8)和F蛋白序列(SEQ ID NO：9)。
图16描述了编码APMV-8血凝素/神经氨酸苷酶(HN)的DNA序列(SEQ ID NO：10)和HN蛋白序列(SEQ ID NO：11)。
图17描述了编码APMV-8聚合酶(L)的DNA序列(SEQ ID NO：12)和L蛋白序列(SEQ ID NO：13)。该APMV-8L(1)蛋白是从位于SEQ I D NO：1的位置8273-8275处的ATG密码子翻译的。
图18描述了APMV-8聚合酶(L)的蛋白质序列(2)(SEQ ID NO：14)。该APMV-8L(2)蛋白是从位于SEQ ID NO：1的位置8297-8299处的ATG密码子翻译的。SEQ ID NO：14不包含SEQ ID NO：13的前8个氨基酸。
图19A是APMV-8反向遗传学体系的流程图。图19B描述了APMV-8病毒在MDCK细胞中的复制结果。
图20描述了在APMV-8接种2周后商业肉鸡的HI测试结果。
图21描述了在APMV-8接种4周后商业肉鸡的HI测试结果。
图22显示在卵内接种(in ovo vaccination)后第18天HI测试的结果(研究1)。
图23描述了在卵内接种后第19天HI测试的结果(研究2)。
图24显示了在卵内接种后第18天HI测试的结果(研究3)。
图25描述了5’-全长基因组(5’-FLG)和3’-全长基因组(3’-FLG)序列，包括侧翼序列。
图26描述了pcNDA-NP，pcNDA-P，pcDNA-L和pcDNA3-T7的质粒图谱。
图27描述了pUC18-MG-APMV-8和pCITE4A-EGFP的质粒图谱。
图28描述了pUC57-FL-APMV-8的质粒图谱。
图29描述了微型基因组APMV-8序列。
图30显示NP蛋白质序列比对以及DNA和蛋白质水平上的序列同一性。
图31显示P蛋白序列比对以及DNA和蛋白质水平上的序列同一性。
图32显示M蛋白序列比对以及DNA和蛋白质水平上的序列同一性。
图33显示F蛋白序列比对以及DNA和蛋白质水平上的序列同一性。
图34显示HN蛋白序列比对及DNA和蛋白质水平上的序列同一性。
图35显示L蛋白序列比对以及DNA和蛋白质水平上的序列同一性，
发明详述
应理解在本公开内容，特别是在权利要求中，术语例如“包含”、“包括”、“含有”等可具有美国专利法中所赋予的意义；例如，它们可意指“包括”、“包含”、“含有”等；并且术语例如“基本上由......组成”和“基本上由......构成”具有美国专利法中所赋予的意义，例如，它们允许有未明确记载的要素，但排除在现有技术中发现的或影响本发明的基本或新特征的要素。
除非另外指出，否则按照常规惯用法使用技术术语。分子生物学中的常见术语的定义可见于Benjamin Lewin的Genes V，由OxfordUniversity Press，1994(ISBN 0-19-854287-9)出版；Kendrew等人(eds.)，The Encyclopedia of Molecular Biology，由BlackwellScience Ltd.，1994(ISBN 0-632-02182-9)出版；和Robert A.Meyers(ed.)，Molecular Biology and Biotechnology：a ComprehensiVe DeskReference，由VCH Publishers，Inc.，1995(ISBN 1-56081-569-8)出版。
除非另外明确地指出，否则单数“一种/个(a)”、“一种/个(an)”、“该/所述(the)”包括所指物的复数形式。类似地，除非另外明确地指出，单词“或”意指包括“和”。单词“或”意指特定列表的任一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合。
应指出，在本公开内容和所述权利要求和/或段落中，术语“禽副粘病毒”或“APMV”可互换使用，意指和包括APMV-1、APMV-2、APMV-3、APMV-4、APMV-5、APMV-6、APMV-7、APMV-8及APMV-9。
术语“动物”在本文中包括所有哺乳动物、鸟类和鱼。本文中使用的动物可选自马科动物(例如，马)、犬科动物(例如，狗、狼、狐狸、丛林狼(coyote)、豺(jackal))、猫科动物(例如，狮子、老虎、家猫、野猫、其它大型猫科动物以及其它猫科动物包括猎豹和山猫)、牛类动物(例如，牛)、猪类(例如，猪)、羊类(例如，绵羊、山羊、美洲驼、野牛)、禽类(例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、雉、鹦鹉、雀、鹰、鸦、鸵鸟、食火鸟(emu)和食火鸡)、灵长类动物(例如，原猴、跗猴、猴、长臂猿、猿)、人和鱼。术语“动物”还包括处于所有发育阶段(包括胚胎期和胎儿期)中的个体动物。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，意指连续氨基酸残基的聚合物。
术语“核酸”、“核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，是指RNA、DNA、cDNA(互补DNA)或cRNA(互补RNA)及其衍生物，例如包含经修饰主链的形式。应理解，本发明提供了包含与本文中描述的序列互补的序列的多核苷酸。本发明中涉及的“多核苷酸”包括正向链(5’至3’)和反向互补链(3’至5’)。根据本发明的多核苷酸可以以不同的方式制备(例如，通过化学合成，通过基因克隆等)并且可采取不同形式(例如，线性或分支的，单链或双链的，或其杂交体、引物、探针等)。
术语“基因组DNA”或“基因组”可互换使用，是指宿主生物的可遗传的遗传信息。基因组DNA包括细胞核的DNA(也指染色体DNA)，而且还包括质体(例如，叶绿体)和其它细胞器(例如，线粒体)的DNA。本发明中涉及的基因组DNA或基因组也指病毒的RNA。所述RNA可以是正链或负链RNA。本文中涉及的术语“基因组DNA”包括包含与本文中描述的序列互补的序列的基因组DNA。术语“基因组DNA”也指信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)和互补RNA(cRNA)。本文中使用的术语“基因组RA(核酸)”包括RNA、mRNA、cRNA、DNA和cDNA，
术语“基因”被广泛地用于指与生物学功能相关的任何多核苷酸区段。因此，基因或多核苷酸包括内含子和外显子(如在基因组序列中)或只是编码序列(如在cDNA中)，例如开放阅读框(ORF)，其始于起始密码子(甲硫氨酸密码子)、终于终止信号(终止密码子)。基因和多核苷酸还可包括调节它们的表达(例如转录起始、翻译和转录终止)的区域。因此，还包括的是启动子和核糖体结合区(一般地，这类调控元件位于编码序列或基因的起始密码子上游约60至250个核苷酸；Doree SM等人.；Pandher K等人.；ChungJY等人)、转录终止子(一般地，终止子位于编码序列或基因的终止密码子的下游约50个核苷酸内；Ward C K等人)。基因或多核苷酸还指表达mRNA或功能RNA、或者编码特定蛋白质以及包括调控序列的核酸片段。
本文中使用的术语“异源DNA”是指来源于不同生物体例如与受者不同的细胞类型或不同的物种的DNA。该术语还指宿主DNA的相同基因组上的DNA或其片段，其中将所述异源DNA插入基因组内与其原始位置不同的区域。
如本文中所使用的，术语“抗原”或“免疫原”意指诱导宿主动物的特定免疫反应的物质。抗原可包括杀死的、减毒的或活的完整生物体；生物体的亚单位或部分；包含具有免疫原性性质的插入物的重组载体；能够在呈递至宿主动物后诱导免疫反应的一段DNA或DNA片段；多肽、表位、半抗原或其任何组合。可选择地，免疫原或抗原可包括毒素或抗毒素。
本文中使用的术语“免疫原性蛋白质或肽”包括具有免疫活性的多肽，其意义是所述多肽在当给宿主施用时其能够引发针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫反应。优选所述蛋白质片段是这样的片段，所述片段具有与完整蛋白质大体上相同的免疫活性。因此，根据本发明的蛋白质片段包含至少一个表位或抗原决定簇或基本上由或由其组成。“免疫原性”蛋白质或多肽，如本文中所使用的，包括该蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。“免疫原性片段”意指包括一个或多个表位，从而引发上述免疫反应的蛋白质片段。可使用本领域内公知的许多表位作图技术鉴定此类片段。参见，例如，Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris，Ed.，1996)。例如，线性表位可通过例如在固体支持物上同时合成大量肽(所述肽对应于蛋白质分子的部分)，将所述肽与抗体反应(同时肽仍然连接于支持物上)来确定。此类技术在本领域内是已知的，并且描述于例如美国专利No.4,708,871；Geysen等人，1984；Geysen等人，1986。类似地，构象表位可通过例如利用诸如x射线晶体学和2维核磁共振测定氨基酸的空间构象来容易地鉴定。参见，例如，EpitopeMapping Protocol s，同上。
术语“免疫原性蛋白质或肽”还涉及对序列的缺失、添加和置换，只要所述多肽能够产生如本文中定义的免疫反应即可。术语“保守性改变”意指用另一个生物学上相似的残基对氨基酸残基的置换，或核酸序列中核苷酸的置换从而所编码的氨基酸残基不改变或为另一个生物学上相似的残基)。在这方面，特别优选的置换通常在性质上是保守的，即在氨基酸的家族内发生的置换。例如，氨基酸通常被分成4个家族：(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性-赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性-甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时分类为芳香族氨基酸。保守性改变的实例包括一个疏水残基例如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸对另一个疏水残基的置换，或一个极性残基对另一个极性残基的置换，例如精氨酸对赖氨酸的置换、谷氨酸对天冬氨酸的置换或谷氨酰胺对天冬酰胺的置换等；或用结构上相关的、对生物活性不具有重大影响的氨基酸对氨基酸的类似保守替换。因此，与参照分子具有大体上相同的氨基酸序列但具有最少氨基酸置换、基本上不影响蛋白质的免疫原性的蛋白质在所述参照多肽的定义内。通过这些修饰产生的所有多肽包括在本文中。术语“保守性改变”还包括使用取代的氨基酸替代未取代的亲代氨基酸，只要针对该取代的多肽产生的抗体也与该未被取代的多肽免疫反应即可。
“宿主细胞”表示已被遗传改变或能够通过施用外源多核苷酸例如重组质粒或载体而被遗传改变的原核或真核细胞。当指遗传改变的细胞时，该术语是指原始改变的细胞和其后代。可将包含期望的序列的多核苷酸插入适当的克隆或表达载体，然后可将所述载体引入适当的宿主细胞以进行复制和扩增。可利用本领域已知的任何方法将多核苷酸引入宿主细胞。可利用许多适当方法中的任何方法将包含目的多核苷酸的载体引入宿主细胞，所述方法包括直接摄入、胞吞、转染、f-交配、电穿孔、利用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质进行的转染；微粒轰击；脂转染；以及感染(其中载体是感染性的，例如逆转录病毒载体)。引入载体或多核苷酸的选择通常取决于宿主细胞的特征。
对组合物或疫苗的“免疫反应”是在宿主中产生针对目的组合物或疫苗的细胞/或抗体介导的免疫反应。通常，“免疫反应”包括但不限于下列效应中的一种或多种：特异于包含在目的组合物或疫苗中的(一种或多种)抗原的抗体、B细胞、辅助T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生。优选，宿主将显示治疗性或保护性免疫反应，从而对新型感染的抗性得到增强和/或减轻疾病的临床严重度。这样的保护作用可通过由被感染的宿主通常显示的症状的减轻或不存在、被感染宿主的更快的恢复时间和/或更低的病毒滴度来证明。
本发明的一个实施方案提供了APMV-8的基因组DNA序列和编码的蛋白质序列。本发明的APMV-8株的互补基因组DNA(cDNA)序列具有SEQID NO：1中所示的多核苷酸序列。APMV-8基因组cDNA序列(SEQ ID NO：1)与APMV-1基因组DNA(SEQ ID NO：15)具有48％的序列同一性，与APMV-2基因组DNA(SEQ ID NO：16)具有61％的序列同一性，与APMV-3基因组DNA(SEQ ID NO：17)具有47.2％的序列同一性，与APMV-4基因组DNA(SEQID NO：18)具有47.6％的序列同一性，与APMV-6基因组DNA(SEQ ID NO：19)具有52％的序列同一性，与APMV-7基因组DNA(SEQ ID NO：20)具有53％的序列同一性，与APMV-8基因组DNA(SEQ ID NO：37)具有99.1％的序列同一性，与APMV-8基因组DNA(SEQ ID NO：38)具有96.5％的序列同一性，与APMV-8基因组DNA(SEQ ID NO：39)具有96.4％的序列同一性，与APMV-9基因组DNA(SEQ ID NO：40)具有48％的序列同一性。在另一个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO：1、2、4、6、8、10或12所示序列的多核苷酸及其变体或片段。本发明还包括与本文中描述的多核苷酸互补的链。在另一个实施方案中，本发明提供了具有SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13或14中所示序列的多肽及其变体或片段。
此外，来自APMV例如APMV-8、APMV-2、APMV-4、APMV-6株的多核苷酸或多肽的同源物意欲包括在本发明的范围内。如本文中所使用的，术语“同源物”包括直向同源物、类似物和旁系同源物。术语“类似物”是指具有相同或相似功能、但在不相关生物中分别进化的两种多核苷酸或多肽。术语“直向同源物”是指来自不同物种、但通过物种形成从共同祖先基因进化而来的两种多核苷酸或多肽。通常，直向同源物编码具有相同或相似功能的多肽。术语“旁系同源物”是指通过在基因组内复制而关联的两种多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同的功能，但这些功能可以是相关的。野生型APMV多肽的类似物、直向同源物和旁系同源物可以通过翻译后修饰、因氨基酸序列差异或两者而与野生型APMV多肽不同。具体地，本发明的同源物通常与APMV-8的多核苷酸或多肽序列的全部或部分展示至少80-85％、85-90％、90-95％或95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，并且展示相似的功能。
在另一个方面，本发明提供了具有SEQ ID NO：1中所示序列的APMV-8基因组cDNA。在另一个实施方案中，所述多核苷酸是具有SEQ ID NO：1中所示序列的多核苷酸的反向互补链。在另一个实施方案中，所述多核苷酸或本发明多核苷酸的反向互补链与具有SEQ ID NO：1中所示序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在一个实施方案中，本发明提供了编码AMPV-8多肽的多核苷酸的片段，所述多核苷酸例如编码具有SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13或14所示序列的多肽的多核苷酸。在另一个方面，本发明提供了编码多肽或保守变体、等位基因变体、同源物或包含这类多肽之一的至少8个或至少10个连续氨基酸的免疫原性片段或这类多肽的组合的多核苷酸，所述多肽与具有SEQ ID NO：3，5，7，9，11，13或14所示序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，
在另一个方面，本发明提供了具有SEQ ID NO：1、2、4、6、8、10或12所示核苷酸序列的多核苷酸或其变体。在另一个实施方案中，所述多核苷酸是具有SEQ ID NO：1所示序列的多核苷酸的反向互补链。在另一个方面，本发明提供了与SEQ ID NO：1、2、4、6、8、10或12所示序列的多核苷酸之一具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多核苷酸或其反向互补链，或其变体。
在另一个方面，本发明提供了与具有SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13或14所示序列的多肽具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多肽。在另一个方面，本发明提供上文中鉴定的APMV多肽(SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13或14)的片段和变体，其可由本领域技术人员使用公知的分子生物学技术来容易地制备。
变体是具有与SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13或14所示氨基酸序列有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列的同源多肽。
变体包括等位基因变体。术语“等位基因变体”是指包含多态性的多核苷酸或多肽，所述多态性导致蛋白质的氨基酸序列改变并且存在于天然群体(例如，病毒种类或变种)中。此类天然等位基因变异通常可导致多核苷酸或多肽内1-5％的差异。等位基因变体可通过对许多不同物种的目的核酸序列进行测序来鉴定，这可通过使用杂交探针鉴定这些物种内相同基因座来容易地进行。任何和所有此类核酸变异以及因天然等位基因变异而产生的并且不改变目的基因功能活性的所得氨基酸多态性或变异意欲包括在本发明的范围内。
关于序列的术语“同一性”可以是指例如相同核苷酸或氨基酸的位置数目除以两个序列中更短序列的核苷酸或氨基酸数目，其中可按照Wilbur和Lipman算法(Wilbur和Lipman)测定这两个序列的比对。两个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性，或两个核苷酸序列之间的序列同一性可使用Vector NTI软件包(Invitrogen，1600Faraday Ave.，Carlsbad，CA)来测定。当RNA序列被称为与DNA序列相似，或具有一定程度的序列同一性或同源性时，DNA序列中的胸苷(T)被认为与RNA序列中的尿苷(U)等同。因此，RNA序列在本发明的范围内并且可以从DNA序列衍生而来，其中DNA序列中的胸苷(T)被视为与RNA序列中的尿苷(U)等同。
在一个方面，本发明涉及用于在用疫苗或组合物接种的宿主动物中诱导免疫反应的药物组合物或疫苗，所述疫苗或组合物包含药用可接受载体和经修饰的APMV重组病毒或病毒载体。在本发明的另一个方面，所述重组APMV病毒或病毒载体在病毒基因组的非必需区域内包括异源DNA序列，所述异源DNA序列编码来源于病原体的抗原性蛋白质，其中所述组合物或疫苗当给宿主施用时能够诱导特异于由该病原体编码的所述蛋白质的免疫反应。
“载体”是指包含待被体外或体内递送至靶细胞的异源多核苷酸的重组DNA或RNA质粒、噬菌体或病毒。所述异源多核苷酸可包括用于预防或治疗目的的目的序列，并且任选地可以以表达盒的形式存在。如本文中所使用的，载体不一定能够在最终的靶细胞或受试者中复制。该术语包括用于克隆的载体以及病毒载体。
术语“工程改造的”或“重组的”意指非天然存在的或以非天然发现的排列方式与另一个多核苷酸相连接的半合成或合成来源的多核苷酸。
术语“非必需区域”是指病毒基因的区域，所述区域不是病毒在组织培养中复制和增殖所必需的，并且其缺失或失活可降低在多种动物系统中的毒力。任何非必需区域或其部分可从APMV基因缺失，或可将外源序列插入其中，由缺失或插入而引起的重组APMV的活力和稳定性可用于确定缺失的区域或其部分是否确实是非必需的。在一个实施方案中，APMV基因组的非必需区域是APMV-2、4、6或8基因组上的不编码聚合酶(L)的任何区域。在另一个实施方案中，非必需区域包括编码非必需蛋白质的开放阅读框。在这方面，开放阅读框选自核蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)和血凝素/神经氨酸苷酶(HN)。在一个实施方案中，非必需区域位于NP基因的上游。在另一个实施方案中，非必需区域位于L基因的下游。在另一个实施方案中，非必需区域是非编码区或基因间区域。在这方面，非编码或基因间区域可以是APMV-2、4、6或8基因组上的NP与P基因之间、P与M基因之间、M与F基因之间或F与HN基因之间的区域。在另一个实施方案中，非必需区域可在SEQ ID NO：1的核苷酸位点1-140、1526-1692、2910-3085、4195-4498、6130-6382、8116-8272、8116-8289或15013-15342的区域中。
在另一个方面，本发明包括APMV嵌合体，其中APMV载体的一个部分或完整的基因或者几个部分或完整的基因被来自其它病毒(特别是属于副粘液病毒科的病毒)的相似基因替代。
在本发明的一个实施方案中，所述疫苗或药物组合物包括抗原，所述抗原选自禽病原体，包括、但不限于鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、传染性支气管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、鸡产蛋下降综合征病毒(EDS)或传染性腔上囊病病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽腺病毒、马雷克病病毒(MDV)、禽痘病毒、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭细小病毒、禽流感病毒、APMV例如APMV-1等，及其组合。
在另一个实施方案中，所述疫苗或药物组合物包括抗原，所述抗原选自猫科动物病原体，例如但不限于猫疱疹病毒(FHV)、猫杯状病毒(FCV)、猫白血病病毒(FeLV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猫科动物细小病毒(FPV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、狂犬病病毒等，及其组合。
在另一个实施方案中，本发明的疫苗或药物组合物包括抗原，所述抗原选自犬病原体，包括但不限于狂犬病病毒、犬疱疹病毒(CHV)、犬细小病毒(CPV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬副流感病毒2(CPI2)、犬冠状病毒、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、出血性黄疸钩端螺旋体(Leptospiraicterohaemorragiae)、感冒伤寒性钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、支气管炎博德特菌(Bordetella bronchiseptica)等，及其组合。
在另一个实施方案中，所述疫苗或药物组合物包括抗原，所述抗原选自马科动物病原体，例如马疱疹病毒(1型或4型)、马流感病毒、破伤风病毒、西尼罗病毒、马动脉病毒等，或其组合。
在另一个实施方案中，所述疫苗或药物组合物包括抗原，所述抗原选自牛、绵羊或山羊病原体，例如狂犬病病毒、牛轮状病毒、牛副流感病毒3型(bPIV-3)、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、牛瘟病毒(RPV)、小反刍动物瘟疫病毒(Peste des PetitsRuminants virus)(PPRV)、恶性卡他热病毒、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBR)、大肠杆菌、多杀巴斯德菌(Pasteurellamultocida)、溶血巴斯德菌(Pasteurellahaemolytica)等，及其组合。
在另一个实施方案中，所述疫苗或药物组合物包括抗原，所述抗原选自猪病原体，例如但不限于猪流感病毒(SIV)、猪环状病毒2型(PCV-2)、猪繁殖呼吸障碍综合征病毒(PRRS)、假性狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、FMDV、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、红班丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopa thiae)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、支气管炎博德特菌(Bordetellabronchiseptica)、大肠杆菌等，及其组合。
重组病毒的构建在本领域是公知的，如描述于例如美国专利No.4,769,330、4,722,848、4,603,112、5,174,993和5,756,103、6,719,979中。具体地，可在两个步骤中构建重组APMV病毒。首先，将待插入病毒的目的基因(例如来自APMV-1(NDV)或禽流感病毒或其它生物体的抗原的开放阅读框)置于大肠杆菌(E.coli)质粒构建体中，该质粒构建体中插入有与APMV的cDNA的一部分同源的cDNA。分开地，待插入的cDNA基因序列之前有启动子区(基因起始区)，之后有特异于APMV载体的基因末端区域。该基因起始/外源抗原/基因末端DNA片段侧翼连接含有独特限制性内切酶切割位点的与APMV-8cDNA同源的cDNA片段。随后通过在大肠杆菌细菌中生长来扩增所得的质粒构建体，分离质粒构建体。然后将重组质粒用于限制性内切酶消化以切出侧翼连接有与APMV-8cDNA同源的cDNA的所述基因起始/外源抗原/基因末端DNA片段，将该片段连接至适当切割的APMV-8全长构建体中。
将含有目的基因的全长构建体与含有用于表达APMV核蛋白(NP)、APMV磷蛋白(P)和APMV RNA聚合酶(L)以及T7RNA聚合酶的多核苷酸的质粒一起转染入细胞。所有APMV cDNA构建体处于T7聚合酶启动子的控制之下。如
Figure BDA0000151614140000191
等人，1999中所述和如图19A中所示进行感染性病毒的拯救。可通过不同的方法(包括包含T7RNA聚合酶的表达盒的质粒DNA、表达T7RNA聚合酶的重组病毒(例如鸡痘或金丝雀痘病毒)的转染)或在表达T7RNA聚合酶的细胞中获得T7RNA聚合酶在转染细胞中的表达。在另一个方面，用于表达APMV核蛋白(NP)、APMV磷蛋白(P)以及APMV RNA聚合酶(L)和全长病毒cRNA的多核苷酸处于人巨细胞病毒的立即早期启动子的控制之下。如Inoue K，等人，2003中所述进行病毒的拯救。
通过修饰的感染性病毒成功地表达插入的目的cDNA(外源cDNA或异源cDNA)需要两个条件。首先，为使所述经修饰的病毒保持存活，必须将插入物引入病毒的基因组的区域。插入cDNA表达的第二个条件是存在允许所述基因在病毒背景中表达的调控序列(例如：基因起始区、基因终止区、启动子、增强子、多聚腺苷酸化信号、基因间和非翻译区域)。
一般而言，利用在真核细胞中具有功能的强启动子是有利的。在一个实施方案中，用于通过病毒RNA聚合酶转录病毒mRNA的启动子是“基因起始序列”。“基因起始序列”是L蛋白结合并且将下游定位的病毒RNA转录成病毒mRNA的结合位点。
在一个实施方案中，本发明提供了施用治疗有效量的APMV疫苗以将抗原、表位或免疫原递送入靶细胞并且表达。治疗有效量的确定对于本领域技术人员来说是常规实验。在一个实施方案中，APMV疫苗制剂包含含有多核苷酸的表达载体以及药用或兽医学可接受的载体、媒介物或赋形剂，所述多核苷酸编码抗原、表位或免疫原。在另一个实施方案中，所述药用或兽医学可接受的载体、媒介物或赋形剂有利于转染和/或促进载体或蛋白质的保存。
所述药用或兽医学可接受的载体或媒介物或赋形剂对于本领域技术人员来说是公知的。例如，药用或兽医学可接受载体或媒介物或赋形剂可以为0.9％NaCl(例如，盐水)溶液或磷酸缓冲液。可用于本发明的方法的其它药用或兽医学可接受载体或媒介物或赋形剂包括但不限于聚-(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药用或兽医学可接受载体或媒介物或赋形剂可以是有利于所述载体(或从本发明的载体体外表达的蛋白质)的施用，或有利于所述载体(或蛋白质)的转染和/或改善其保存的任何化合物或化合物的组合。剂量和剂量体积在本文综述部分有论述，并且可由本领域技术人员结合本领域知识通过阅读本公开内容来确定，而不需要任何过度实验。
在另一个实施方案中，药用或兽医学可接受的载体、赋形剂或媒介物可以是油包水乳剂。适当的油包水乳剂的实例包括在4℃下稳定并且为流体的基于油的油包水疫苗乳剂，其包含；6至50v/v％的含抗原水相，12至25v/v％、50至94v/v％的全部或部分含有不可代谢的油(例如，矿物油例如石蜡油)和/或可代谢的油(例如，植物油或脂肪酸、多元醇或醇酯)的油相，0.2至20p/v％的表面活性剂，3至8p/v％的后者全部或部分为聚甘油酯，或存在于聚甘油酯的混合物中，所述聚甘油酯为聚甘油(聚)蓖麻油酸酯，或聚氧乙烯蓖麻油或其它氢化聚氧乙烯蓖麻油。可用于油包水乳剂中的表面活性剂的实例包括乙氧基化脱水山梨糖醇酯(例如，可从AppliChem，Inc.，Cheshire，CT获得的聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯(TWEEN
Figure BDA0000151614140000201
)和可从Sigma Aldrich，St.Louis，MO获得的脱水山梨糖醇酯(例如，脱水山梨糖醇单油酸酯(SPAN))。此外，关于油包水乳剂，也参见美国专利No.6,919,084。在某些实施方案中，含抗原水相包括含有一种或多种缓冲剂的盐水溶液。适当的缓冲溶液的实例为磷酸缓冲盐溶液。在一个实施方案中，油包水乳剂可以为水/油/水(W/O/W)三重乳剂(参见，例如，美国专利No.6,358,500)。其它适当的乳剂的实例描述于美国专利No.7,371,395中。
根据本发明的药物组合物和疫苗可包括一种或多种佐剂或基本上由其组成。用于本发明实施的适当的佐剂为(1)丙烯酸或甲基丙烯酸、顺丁烯二酸酐的聚合物和烯基衍生共聚物，(2)免疫刺激序列(I SS)，例如具有一个或多个非甲基化CpG单位的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman等人，1996；WO98/16247)，(3)水包油乳剂，例如由M.Powell，M.Newman，Plenum Press(1995)出版的“Vaccine Design，The Subunitand Adjuvant Approach”中第147页上描述的SPT乳剂，和相同著作中第183页上描述的乳剂MF59，(4)包含季铵盐的阳离子脂质，例如DDA，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂苷或(8)通过引用并入本申请中的任何文献中论述的其它佐剂，或(9)其任何组合或混合物。
特别适合于病毒载体的水包油乳乳剂(3)可基于：液态石蜡(欧洲药典型类型)、类异戊二烯油例如角鲨烷、角鲨烯、由烯烃例如异丁烯或癸烯的寡聚化而产生的油、酸或具有直链烷基的醇的酯，例如植物油、油酸乙酯、丙二醇、二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯或分支的脂肪醇或酸的酯，特别地异硬脂酸酯。将油与乳化剂组合用于形成乳剂。乳化剂可以是非离子型表面活性剂，例如：(一方面)脱水山梨糖醇、二缩甘露醇(例如无水甘露醇油酸酯)、甘油、聚甘油或丙二醇与(另一方面)油酸、异硬脂酸、蓖麻酸或羟硬脂酸的酯，所述酯任选地被乙氧基化，或为聚氧丙烯聚氧乙烯共聚物嵌段，例如Pluronic，例如L121。在(1)型佐剂聚合物中，优选交联的丙烯酸或甲基丙烯酸(特别是通过糖或多元醇的聚链烯基醚(polyalkenylether)交联的)的聚合物。此类化合物称为卡波姆(Pharmeuropa，第8卷，no.2，June 1996)。本领域技术人员也可参考美国专利No.2,909,462，其提供了此类通过具有至少3个羟基(优选不超过8个这样的基团)的多羟基化合物交联的丙烯酸聚合物，至少3个羟基的氢原子被具有至少两个碳原子的不饱和脂肪族基团取代。优选基团为包含2至4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它乙烯系不饱和基团。不饱和基团还可包含其它取代基，例如甲基。以名称Carbopol(BFGoodrich，Ohio，USA)销售的产物是特别适合的。它们通过烯丙基蔗糖或通过烯丙基季戊四醇交联。在它们当中，可提及的有卡波姆974P、934P和971P。
关于顺丁烯二酸酐-烯基衍生物共聚物，优选EMA(Monsanto)，其为直链或交联的乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物，它们例如通过二乙烯醚交联。也可参考J.Fields等人，1960。
关于结构，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA优选由具有下式的基本单位形成：
Figure BDA0000151614140000221
其中：
-R1和R2可以相同或不同，表示H或CH3
-x＝0或1，优选x＝1
-y＝1或2，其中x+y＝2.
对于EMA，x＝0并且y＝2；对于卡波姆，x＝y＝1。
此类聚合物在水或生理盐溶液(20g/l NaCl)中是可溶的，并且可以例如利用苏打(NaOH)将pH调整至7.3至7.4以提供其中可掺入表达载体的佐剂溶液。最终的免疫或疫苗组合物中的聚合物浓度可为0.01至1.5％w/v，0.05至1％w/v以及0.1至0.4％w/v。
本发明的另一个方面涉及用于在动物中诱导对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括用包含经修饰的重组APMV病毒(所述病毒包含和编码所述动物的病原体的所述抗原)的疫苗或药物组合物接种所述动物。本发明的另一个方面涉及用于在初免-加强施用方案中诱导动物中对抗原的免疫反应的方法，所述方法由使用至少一种共同多肽、抗原、表位或免疫原进行的至少一个初次施用和至少一个加强施用组成。初次施用中使用的免疫组合物或疫苗在性质上可以是与用作加强剂的免疫组合物或疫苗相同，或可以与其不同。在本发明的初免-加强方案的一个方面，施用包含本发明的重组APMV病毒(病毒载体)的组合物或疫苗，然后施用包含抗原的灭活病毒疫苗或组合物、或包含亚单位(蛋白质、抗原)的疫苗或组合物、包含或表达抗原的DNA质粒疫苗或组合物。同样地，初免-加强方案可包括施用包含抗原的灭活病毒疫苗或组合物、或包含亚单位(蛋白质、抗原)的疫苗或组合物、或包含或表达抗原的DNA质粒疫苗或组合物，然后施用包含本发明重组APMV病毒(病毒载体)的组合物或疫苗。还应指出，初次和第二次施用都可包括包含本发明重组APMV病毒(病毒载体)的组合物或疫苗。
初次施用可包括疫苗的基于相同病毒载体的免疫组合物的一次或多次施用。类似地，加强施用可包括疫苗的基于相同病毒载体的免疫组合物的一次或多次施用。初免和加强的施用途径可以是相同的或不同的。类似地，存在于初免和加强中的保护性基因的来源可以相同或不同(例如，不同株系)。
优选每隔1至6周，更具体地相隔约3周进行各次施用。根据优选模式，也预期每年一次的加强，优选使用疫苗的基于病毒载体的免疫组合物进行。动物在第一次施用时优选为至少1日龄。
可使用多种施用途径，例如皮下或肌内、皮内、经皮肤、喷雾、饮用水、滴眼剂、鼻内、口服、口饵(oral bait)、卵内(in ovo)或组合(例如，眼鼻、口鼻)。
本发明现进一步通过下列非限定性实例进行描述。
实施例
实施例1APMV-2，APMV-4和APMV-6
A.病毒和禽类
将1日龄SPF(无特殊病原体)鸡(Merial，Gainesville，GA)关养在正压Horsfall-Baur隔离单元中。随意提供饲料和水，每天检查禽类2次。从野生禽类分离用于实验研究的病毒(APMV-2、4和6)，由国家兽医服务实验室(National Veterinary Service Laboratory)(NVSL，AmesIowa，USA)对其进行分类。通过尿囊途径接种，在9日龄含胚SPF鸡蛋(SunRise Farms，Catskill，NY，USA)中扩增病毒。在接种后第3天收获尿囊液，将其等分，于-80℃下贮存。使用标准血清(NVSL，Ames，Iowa，USA)，通过HI测试确认APMV亚型。通过将尿囊液的10倍系列稀释液接种在含胚SPF蛋中来确定每一个分离株的50％卵感染剂量(EID50)。按照由Reed和Muench(Reed，LJ等人，1938，Am.J.Epidemiol.
27：493-497)描述的方法计算滴度。
B.实验性感染
通过眼鼻途径用106EID50/鸡感染每组25只1日龄SPF鸡。利用PBS(磷酸缓冲盐溶液)模拟接种对照组的鸡。在感染后(p.i.)第2、4、7、14和28天，通过翅静脉给每组5只鸡放血以收集血清样品，用CO2使其无痛致死，然后进行尸检。收集气管、肺、胰腺和肠的组织样本。对于每一种器官，使用一对新的无菌剪刀和镊子。将一半组织样品置于装有病毒转运培养基(1X最小必需培养基，7.5％碳酸氢钠，15mM HEPES，1％胎牛血清，4,000U/ml青霉素，400μg/ml庆大霉素，8μg/ml两性霉素B，4,000μg/ml链霉素，1000μg/ml硫酸卡那霉素)的LysingMatrix D管(MP Biomedicals，Solon，OH)中。将另外一半组织样品于10％缓冲的福尔马林中进行固定，将其包埋在石蜡中。用Mayer’s苏木精和伊红(H&E)染色石蜡包埋组织的切片。
结果显示，在感染后第4天和第7天，在用APMV-2或APMV 4感染的禽类中观察到较轻的腹泻。在尸检过程中，用APMV-2感染的禽类在感染后第2和第4天显示稍微扩大的胰腺。在任何组中未观察到其它肉眼损伤。
C.血清学
将血凝集(HA)和血凝集抑制(HI)测试分别用于检测尿囊液中的病毒和分析收集的血清样品中HI抗体的存在情况。使用重悬浮于PBS中的0.8％鸡红细胞通过标准方法进行所述测试。利用稀释血清恒定抗原法(diluted-serum constant-antigen method)进行HI测试。对于每一个血清稀释度使用8个HA单位的病毒抗原。
在感染后第2、4、7、14和28天检查HI抗体滴度。在感染后第7天(1/5)、第14天(5/5)、第28天(5/5)在APMV-2感染禽类的血清样品中观察到阳性HI滴度(≥1∶16)。有趣地，只有用APMV-4感染的一只鸡产生了HI滴度，所述滴度在实验过程中在感染后第14天被认为是阳性的。类似地对于APMV-6，5只鸡中有2只仅在感染后第28天产生1∶16的HI滴度。模拟物接种的禽类对于针对用于本实验的所有3种APMV的HI抗体保持阴性。此外，为了排除交叉污染，测试所有血清的抗其它两种抗原的HI抗体，均呈阴性。
D.病毒分离
使用
Figure BDA0000151614140000251
(MP Biomedicals，Solon，OH)以4.0M/S的设置匀浆收集在Lysing Matrix D管(MP Biomedicals，Solon，OH，USA)中的组织样品两次，进行20秒。在室温下孵育15分钟后，以2000g在4℃离心匀浆的样品20分钟。将50μl的所得上清液接种于2ml胰蛋白胨磷酸盐肉汤(TPB)(DIFCO，Bect on Dickenson，Sparks，MD，USA)(补充有10％水化乳白蛋白(hydrolactalbumin))中后，通过在定轨摇床上于37℃温育过夜测试无菌度。使用0.45μm注射器式滤器(Whatman Inc.，Florham Park，NJ，USA)过滤非无菌样品。将样品于-80℃下贮存。通过将0.1ml接种入9日龄含胚SPF鸡蛋的尿囊腔中来进行病毒分离。在37.5℃下温育3天后，收获尿囊液，并且就HA产生的凝血活性的存在进行测试。
为了分析病毒复制的位点，通过含胚蛋中的病毒分离来分析几个器官(气管、肺、肠、胰腺)的感染性病毒(图1)。总体上，只在少数鸡中检测到复制病毒。简而言之，在第2天从气管、肺和胰腺中回收到APMV-4，而从肺和胰腺中分离出APMV-6。在第4天，从气管和肺中分离出APMV-2，而从所有测试的器官(除肠外)分离出APMV-6。在第7天，从单个肠样品分离出APMV-2，从胰腺分离出APMV-4，而从肺和胰腺样品分离出APMV-6。令人惊讶地，在感染后第14天未分离出病毒，然而在感染后第28天，可从胰腺分离出APMV-2、4和6。从模拟物接种的禽类中未分离出病毒。使用如由NVSL提供的标准血清通过HI测试确认了后面分离的病毒的身份。
为了评估所研究病毒的病理潜能，分析所获得的器官的显微镜损伤(图2)。在感染后第2天，在所有感染的鸡中观察到除呼吸上皮上的纤毛丢失外还有卡他性气管炎和轻度肠炎。在感染后第4天，APMV-2感染的鸡在气管中显示增加的肥大粘液腺数目和呼吸上皮的局灶性溃疡。在感染后第4天，APMV-4感染的禽类显示高度表明呼吸道感染(例如轻度气管炎、轻度至中度多病灶淋巴细胞性胰腺炎以及还有局灶性BALT(支气管相关淋巴样组织)增生)的变化。关于APMV-6感染鸡的器官的研究显示了气管的变化，例如与病毒刺激一致的卡他性和溃疡性气管炎以及局灶性胰腺炎。在感染后第7天，APMV-2感染的鸡显示表示愈合的局灶性气管变薄(tracheal attenuation)或呼吸上皮的替换。被APMV-4感染的禽类显示轻度BALT增生，然而被APMV-6感染的禽类显示囊性肠病变、局灶性肠炎和胰腺的淋巴细胞性浸润。除了轻度淋巴细胞性肠炎和轻度GALT增生外，在感染后第14天，被APMV-2感染的禽类也显示愈合的变化，例如气管变薄。在感染后第14天，来自用APMV-4或6感染的鸡的器官样品显示表明病毒感染(例如轻度间质性肺炎、卡他性气管炎和BALT或GALT增生)的变化。在感染后第28天，获自感染鸡的所有研究样品显示损伤，例如GALT增生、淋巴细胞性胰腺炎和淋巴细胞性支气管炎。在第2天，对照组的禽类显示可归因于环境因素的轻度卡他性气管炎。
图3显示来自APMV-4或APMV-6感染的SPF鸡的低HI滴度(在第14天达到1∶32)，表明只有APMV-2感染引发可表征为血清阳性的HI反应。然而，直至感染后第7天从感染的禽类的气管、肺、肠和胰腺以及直至感染后第28天从胰腺回收到所有3种病毒。利用APMV-2、4或6的感染在所有感染的禽类中显示特征性组织病理学损伤(概述于图2中)，表明利用病毒抗原的刺激。感染禽类的病毒分离和组织学特征明确地描述了病毒在感染的鸡中的向性(从第1天至第7天为气管和肺，从第7天以后为肠、肺和胰腺)。直至感染后第28天在胰腺中检测到所有分离株，但在感染后第14天不可能分离到病毒。这表明研究的APMV可能保持，后来被重新激活。因此，病毒载体可能存在于感染的群体中。只有APMV-2诱导HI抗体，而未检测到用APMV-4和6感染的鸡的HI抗体。
实施例2APMV-8
A.病毒和禽类
将1日龄SPF鸡(Merial，Gainesville，GA，USA)和北京鸭(MetzerFarms，Gonzales，CA，USA)关养在正压Horsfall Baur隔离单元中。随意提供饲料和水，每天检查禽类两次。从野鸭分离用于实验研究的APMV-8病毒(APMV-8：SCWDS ID：MA-7)，由国家兽医服务实验室(NVSL，Ames Iowa，USA)对其进行分类。通过尿囊途径接种，在9日龄含胚SPF鸡蛋中扩增病毒。在接种后第3天收获尿囊液，将其合并，等分，于-80℃下贮存。使用由国家兽医服务实验室(Ames，IA，USA)提供的标准血清通过HI测试确认APMV-8亚型。通过将尿囊液的10倍系列稀释液接种在含胚SPF蛋中来确定EID50。按照由Reed和Muench(Reed，LJ等人，1938，Am.J.Epidemiol.27：493-497)描述的方法计算滴度。
B.实验性感染
通过眼鼻途径用稀释在PBS中的106EID50/禽感染每组25只1日龄SPF鸡或北京鸭。利用PBS模拟接种对照鸡或鸭组的禽类。在感染后(dp.i.)第2、4、7、14和28天，通过肱静脉给每组5只禽类放血以收集血清样品，用CO2人道地使其无痛致死，然后进行尸检。收集气管、肺、胰腺和肠(十二指肠)的组织样本。对于每一种器官，使用一对新的无菌剪刀和镊子。将一半组织样品置于装有病毒转运培养基(1X最小必需培养基，7.5％碳酸氢钠，15mM HEPES，1％胎牛血清，4,000U/ml青霉素，400μg/ml庆大霉素，8μg/ml两性霉素B，4,000μg/ml链霉素，1000μg/ml硫酸卡那霉素)的Lysing Matrix D管(MP Biomedicals，Solon，0H，USA)中。将另外一半组织样品固定于10％缓冲的福尔马林中，进行常规处理，包埋、切片以及用苏木精和伊红(H&E)染色。
C.病毒分离
使用Fastprep-24(MP Biomedicals)以4.0M/S的设置匀浆收集在Lysing Matrix D管中的组织样品两次，进行20秒。在室温下温育匀浆的样品15分钟，然后以2000xg在4℃离心匀浆的样品20分钟。将50μl所获得的上清液接种于2ml无菌TPB(补充有10％水乳白蛋白(hydrolactalbumin))中，然后，在定轨摇床上于37℃温育过夜，以测试无菌度。使用0.45μm注射器式滤器(Whatman Inc.)过滤非无菌样品。将样品于-80℃下贮存。通过将0.1ml接种入9日龄含胚SPF鸡蛋的尿囊腔中来进行病毒分离。在37.5℃下温育3天后，收获尿囊液，并且通过HA测试凝血活性的存在情况。
D.血清学
将血凝集(HA)和血凝集抑制(HI)测试分别用于检测尿囊液中的病毒和分析收集的血清样品中HI抗体的存在情况。使用重悬浮于PBS中的0.8％鸡红细胞通过标准方法进行所述测试。利用稀释血清恒定抗原法进行HI测试，对于每一个血清稀释度使用8个HA单位的病毒抗原。如先前所述(Brugh，1978)测定几何平均滴度。
图4显示了APMV-8感染的SPF鸡和鸭中的HI抗体滴度。利用剂量为106EID50的APMV-8口鼻感染鸡和鸭。在感染后第2、4、7、14和28天收集血清样品，使用APMV-8抗原通过HI测试分析所述样品。HI血清滴度(以log2表示)示于左轴上。
E.APMV-8在鸡中的致病指数
为了评估APMV-8的毒力，按照世界动物卫生组织(OIE，2008)对于新城疫病毒的方法测定脑内致病指数(ICPI)。如先前所述(Swayne等人，1998)使用10-1至10-8的APMV-8系列稀释物测定鸡胚的平均死亡时间。
含胚蛋的平均死亡时间(MDT)的测定以及脑内致病指数(ICPI)的评估是病毒的致病性的重要度量。关于含胚蛋的MDT，在7天的时间后没有一个接种的蛋的胚胎死亡，从而APMV-8分离株可被分类为缓发型的。使用用10-6稀释度接种的蛋的尿囊液通过HA测试确认病毒的存在。所有脑内接种的鸡在观察的时间内未显示临床体征，ICPI值为0，导致缓发型表型。
F.APMV-8加强剂接种
用106EID50/禽经眼鼻途径感染每组10只1日龄SPF鸡。用PBS模拟接种对照鸡组的禽。在第一次感染后14天，用相同剂量再次感染禽。在第一次感染后第2、4、7和14天以及在第二次感染后第2天和第4天，通过使用9日龄含胚SPF鸡蛋从气管拭子分离病毒来监控感染性病毒的存在。利用每一次接种后第0、7和14天收集的血清样品的HI滴度监控抗体反应。
为了研究第二免疫是否允许产生更可持续的HI滴度，进行初免/加强方案实验(图5)。在第一次感染后第7天，所有10只禽都显示64至1024之间的HI(GMT 207)。在第一次感染后第14天滴度下降(GMT 84)，但在初始感后第14天进行加强感染后滴度升高。在加强接种后第7天，GMT增加至137，在第二次感染后第14天再次减小至GMT为73。可在第一次感染后第2天(5/10只禽)和第4天(4/10只禽)从气管拭子分离到感染性病毒。在第二次感染后，在感染后第2天和第4天从获得的拭子未分离到病毒。
G.利用RT-PCR检测病毒RNA
在组织样品匀浆、然后使用High Pure RNA分离试剂盒(Roche，Mannheim，Germany)分离RNA后检测组织样品的病毒RNA。按照制造商的说明书，使用Supercript III One Step RT-PCR试剂盒，利用PlatinumTaq(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)将引物对(8NPf1，8NPr，参见表1)用于RT-PCR。在1％琼脂糖凝胶上分析所获得的反应产物(图6)。在感染后第2天从未感染的鸭(C1-C5)和APMV-8感染的鸭(I1-I 5)获取气管组织。将组织匀浆，制备RNA以进行RT-PCR。平行地制备水对照(w)。在1.5％琼脂糖凝胶上分离反应产物。通过使用100bp分子量梯度(NewEngland Biolabs，Boston，MA，USA)作为片段大小的对照。DNA片段的大小示于右边。
表1用于RT-PCR的寡核苷酸以检测组织样品中的病毒RNA
Figure BDA0000151614140000301
H.鸡和鸭中最小感染剂量的确定
为了确定在鸡中足以检测到血清转化(seroconversion)的病毒滴度，用不同剂量的APMV-8感染1日龄SPF鸡。如上所述关养禽类。各自用101、102、103、104、105或106EID50感染每组10只鸡。将病毒稀释在VTM中。用VTM接种一组，将其用作对照。在感染后第7天和第14天经肱静脉对禽类放血。基于在鸡实验中获得的结果，用不同量的病毒感染3日龄的北京鸭。感染剂量选择为103、104、105或106EID50/鸭。一组用VTM模拟感染。在经腿静脉感染后第7天和第14天给禽类放血。如上所述通过HI分析血清样品中病毒特异性抗体的存在情况。
I.鸭和鸡中致病性的测定
在实验过程中，在鸡和鸭中未观察到临床体征。在尸检过程中，在感染后第2天和第4天，3只感染的鸡显示稍微扩大的胰腺和发炎的十二指肠。在任何组中未观察到其它肉眼损伤。
通过研究血清中的HI滴度而在感染后第2、4、7、14和28天检查血清学反应(图4)。APMV-8感染的鸡的血清样品显示阳性HI滴度(≥16)，其始于感染后第7天(5/5，GMT：111)、感染后第14天(5/5，GMT：48)和感染后第28天(5/5，GMT：48)。APMV-8感染的鸭的血清样品也在感染后第7(5/5，GMT 21)、14(5/5，GMT 28)和28(4/5，GMT 14)天显示阳性HI滴度(≥16)。对于鸡，HI滴度范围在32与256之间，而对于鸭，其范围在16与64之间。假接种的禽类在两个物种中、在所有研究的时间点上对于针对APMV-8的HI抗体保持阴性。
为了确定鸡和鸭中病毒复制的位点，通过在含胚蛋中分离病毒来分析几个器官(气管、肺、十二指肠和胰腺)的感染性病毒(图7)。在鸡中，在感染后第2天从气管、肺和十二指肠回收到APMV-8。在感染后第4天，从所有分析的器官分离出APMV-8；然而在感染后第7天，只从胰腺中分离出APMV-8。在感染后第14天和第28天，从任何器官都未分离出病毒。从假接种的禽类未分离出病毒。使用由NVSL提供的标准血清通过HI测试确认了后分离的病毒的身份。甚至在9日龄含胚SPF鸡蛋中两次亚传代(subpassage)后在任何时间点上任何收集的鸭组织都未分离出病毒。因此，基于可获得的APMV-8序列信息设计RT-PCR引物，以检测在收集的组织样品中病毒RNA的存在(图7)。在感染后第2天，在气管(图6)、肠和胰腺中检测到病毒RNA，而在感染后第4天在所有分析的器官中检测到病毒RNA。在感染后第7、14和28天，只在气管和肺中检测到病毒RNA。使用获自模拟接种禽类的器官的RNA进行的RT-PCR未扩增到RT-PCR片段，表示这些禽类中不存在APMV-8的扩增。
为了评估被研究的病毒的病理潜能，分析器官中显微镜损伤的存在(图8)。在感染后第2天，在所有感染的鸡中观察到轻度多病灶增生性气管炎。其余器官显示与对照组无差异。APMV-8感染的鸡显示在感染后第4天气管的呼吸上皮的病灶减小或再生(表示愈合)。此外，禽类也显示表示病毒感染的轻度多病灶淋巴细胞性胰腺炎。感染的鸡在感染后第7天显示肺的变化，例如中度至重度的BALT、气管的变化例如卡他性气管炎和多病灶淋巴细胞性胰腺炎。这些发现与抗原性刺激一致。在感染后第14天，在感染的鸡中观察到与愈合一致的气管变化以及表示病毒感染的胰腺变化例如表示病毒感染的淋巴细胞性胰腺炎。在感染后第28天，在一些感染的鸡中只观察到轻度卡他性气管炎和轻度肠炎。在感染的鸭中，在感染后第2天观察到多病灶轻度淋巴细胞性气管炎、肺的变化(间质性肺炎)和肠的变化(淋巴细胞性肠炎)，而在感染后第4天看见与呼吸道感染一致的气管变化。在感染后第7天，感染的鸭显示与病毒感染一致的淋巴细胞性气管炎和胰腺炎，而在感染后第14天观察到的卡他性气管炎表示愈合。此外，感染的鸭在感染后第14天显示淋巴细胞性胰腺炎。后来，在感染后第28天，在感染的鸭的肺中注意到BALT增生以及还有轻度多病灶异嗜性气管炎(heterophilic tracheitis)。两种病理性显微镜损伤都表示病毒感染。在未感染的对照中未观察到被检查器官的变化。
J.诱导免疫反应所需的最小剂量的确定
为了检查诱导鸡中血清转化所必需的最小感染剂量，将APMV-8的10倍稀释物用于感染10只1日龄SPF鸡(图9)。对于HI测试，使用4个HA单位，其导致被视为阳性的阈值16。在感染后第14天获取的血清样品显示为103的EID50足以在4/10只鸡中诱导被认为是阳性的免疫反应(GMT 11)。在用104的EID50感染后第14天，10只禽中有9只显示≥16的滴度(GMT 34)。利用105和106的EID50的感染在感染后第14天在所有禽中诱导≥16的HI滴度，GMT分别为73和137。
基于该结果，用从103/禽的剂量EID50直至106/禽的剂量EID50的APMV-8感染8只鸭的每一只(图10)。8只鸭中有6只在感染后第14天产生显著的滴度(≥16)，在用104/禽的EID50感染后GMT为14。在感染后第14天，用105/禽的EID50感染的6/8只鸭和用106/禽的EID50感染的7/8鸭产生显著的滴度(≥16)，GMT分别为17和23。
实施例3APMV-8的全长序列的确定
为了确定APMV-8的全长序列，最初需要病毒RNA序列信息。为此，通过使用引物(APMV-polyT，参见表1)克隆病毒基因组的3’-末端，所述引物包含基于APMV1(Genbank登录号AF077761)、APMV-2(Genbank登录号EU338414)和APMV-6(Genbank登录号EF569970)的可获得的3’-序列的简并序列。使用Hi gh Pure RNA分离试剂盒(Roche，Mannheim，Germany)从尿囊液纯化病毒RNA。按照制造商的说明书，使用5’RACESystem for Rapid Amplification of cDNA Ends 2.0版(Invitrogen)扩增序列。获得几个片段，将其进行凝胶洗脱，克隆入Topo TA克隆载体(Invitrogen)，对阳性选择的克隆进行测序。在针对NCBI数据库进行的nblast搜索中分析获得的核苷酸序列，显示无相似性。针对NCBI数据库的tblastx搜索显示与禽副粘病毒2(APMV-2/鸡/加利福尼亚/Yucaipa/56，Genbank登录号EU338414)的核蛋白呈现83％的相似性，以及与禽副粘病毒6株(APMV-6/鹅/远东/4440/2003，Genbank登录号EF569970)的核蛋白呈现56％的相似性。利用该引物，使用5’RACE Systemfor Rapid Amplification of cDNA Ends 2.0版(Invi trogen)进行引物步移法。5’-RACE产生约800bp的片段。通过使用该技术，基于来自先前序列的序列信息(其已被用于描述新型寡核苷酸)获得新的序列信息。也通过5’-RACE法确定病毒基因组的5’-末端。在用T4RNA连接酶1(New England Biolabs)连接RNA后获得病毒基因组的3’-末端。利用High Pure RNA分离试剂盒(Roche)再次纯化连接反应物，使用Superscript III One Step RT-PCR试剂盒，利用Platinum Taq(Invitrogen)进行RT-PCR。将获得的cDNA片段克隆入pCR2.1载体(Invitrogen)中，并且对其进行测序。在两个方向上对来自每一个克隆片段的3个质粒进行测序，获得每核苷酸有6个覆盖度的序列。
被分析的APMV-8株的全长基因组序列为15342个核苷酸，这与对于副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)的六规则(the rule ofsix)(Calain，P.&Roux，L.，1993)一致。已检测到6个开放阅读框(ORF)，它们编码蛋白质。使用蛋白质序列与其它禽副粘病毒的蛋白质的相似性将蛋白质的顺序确定为3’-NP-P-M-F-HN-L-5’(基因组序列SEQ ID NO：1以5’至3’方向的反基因组形式存在)。这些蛋白质的ORF的推定起始和终止密码子以及理论分子量(Swiss Institute of Bioinformatics ExPASv网站)示于表2中。
表2由APMV-8序列编码的蛋白质的参数
通过确定NP基因的推定基因起始序列(前导序列)和L蛋白的推定基因末端序列(尾随序列)来确定推定的基因组前导序列和尾随序列。前导序列位于核苷酸1至核苷酸55。NP基因的推定基因起始序列(nt 56-63)终止了其前导序列。尾随序列位于病毒基因组中的最后基因末端序列之后。由于RNA聚合酶基因的两个推定基因末端序列(nt 15161-15171或15288-15297)的存在，已鉴定了两个推定的尾随序列(nt15172-15342或nt 15289-15342)。推定的基因起始序列(含有多聚G的序列)和基因末端序列(用于多聚腺苷酸化的信号序列)以及基因间序列的位置概述于表3中。
表3    APMV-8的推定基因起始、基因间和基因末端序列的序列和定位
Figure BDA0000151614140000341
表4SEQ ID NO与DNA和蛋白质序列
 SEQ ID NO   基因名称   类型
  1   APMV-8基因组序列   DNA或RNA
  2   APMV-8核蛋白(NP)   DNA或RNA
  3   APMV-8核蛋白(NP)   蛋白质
  4   APMV-8磷蛋白(P)   DNA或RNA
  5   APMV-8磷蛋白(P)   蛋白质
  6   APMV-8基质蛋白(M)   DNA或RNA
  7   APMV-8基质蛋白(M)   蛋白质
  8   APMV-8融合蛋白(F)   DNA或RNA
  9   APMV-8融合蛋白(F)   蛋白质
  10   APMV-8血凝素/神经氨酸苷酶(HN)   DNA或RNA
  11   APMV-8血凝素/神经氨酸苷酶(HN)   蛋白质
  12   APMV-8聚合酶(L)DNA   DNA或RNA
  13   APMV-8聚合酶(L)蛋白1   蛋白质
  14   APMV-8聚合酶(L)蛋白2   蛋白质
APMV-8的推定的基因起始序列是保守的，其包含多聚(C)5序列，后接3’-GCU-5’序列。唯一例外是病毒RNA聚合酶的推定的基因起始序列(3’-CUCCCGCU-5’)。推定的基因末端序列也是保守的，并且在基因组病毒5’序列中包含多聚(U)6序列(表5)。
表5APMV-8的基因起始和基因末端序列
  基因名称   序列(5-3’反基因组方向)   SEQ  ID NO
  基因起始   NP基因 CCCCCGCUUCUGUCA   24
  P基因 CCCCCGCUGGAGUUA   25
  M基因 CCCCCGCUUCUGUGC   26
  F基因 CCCCCGCUUUAGAAC   27
  HN基因 CCCCCGCUGGGUAAA   28
  L CUCCCGCUGGAGAUG   29
  基因末端   NP基因 AACUAAAUUCUUUUUU   30
  P基因 UAACUAAUUCUUUUUU   31
  M基因 AGGAUUAAUAUUUUUU   32
  F基因 CUAUAAAUUAUUUUUU   33
  HN基因 UACUUAAUUCUUUUUU   34
  L基因(1) ACUAAAAUUCUUUUUU   35
  L基因(2) UUAUUGAUUUUUUUUU   36
这些序列是基于对于禽腮腺炎病毒属的其它副粘病毒描述的序列预测的(Chang等人，2001，Nayak等人，2008，Jeon等人，2008)。对于RNA聚合酶的ORF存在两个可能的起始密码子。第一个起始密码子(nt8273-8275)位于HN ORF与病毒RNA聚合酶ORF之间的基因末端-基因间区域-基因起始区域内。这使得该起始密码子可能性很小，但并非不可能。第二个起始密码子(8297-8299)位于基因末端-基因间区域-基因起始区域的下游，并且可能充当起始密码子用于起始APMV-8的RNA聚合酶的翻译。
APMV-8的基因组的长度为15342nt。这比APMV-1(SQ ID NO：15，15186nt，de Leeuw&Peeters，1999)、APMV-2(SEQ ID NO：16，14，904nt，Subbiah等人，2008)和APMV-4(SEQ ID NO：18，15054nt，Nayak等人，2008)大，而比APMV-3(SEQ ID NO：17，16，272nt，Kumar等人，2008)和APMV-9(SEQ ID NO：20，15，438nt，Samuel等人，2009)小。前导序列的55nt的长度似乎在所有APMV之间是保守的(Krishnamurthy&Samal，1998，de Leeuw&Peeters，1999，Subbiah等人，2008，Nayak等人，2008，Kumar等人，2008，Samuel等人，2009)，而尾随序列似乎在长度上是可变的。对于APMV-8，病毒基因的基因起始和基因末端序列也是高度保守的(如表5中显示的)。对于APMV-2(Subbiah等人，2008)、APMV-3(Kumar等人，2008)、APMV-4(Jeon等人，2008，Nayak等人，2008)、APMV-6(Chang等人，2001)和最近对于APMV-9(Samuel等人，2009)的序列也有这样的描述。全长序列的核苷酸数是6的倍数，这与6对于副粘病毒的基因组的作用一致(Kolakofsky等人，1998)。
APMV-1、2、3、4、6、8和9基因组序列之间的序列同一性示于表6中。
表6APMV-1，2，3，4，6，7，8和9的基因组之间的序列同一性百分比
Figure BDA0000151614140000361
[0101]使用Vector NTI 11.0(PC)软件包(Invitrogen，1600FaradayAve.，Carlsbad，CA)测定两个核酸或多肽序列之间的百分比序列同一性。将缺口开放罚分15和缺口延伸罚分6.66用于测定两个核酸的同一性百分比。用缺口开放罚分10和缺口延伸罚分0.1测定两个多肽的百分比同一性。基于更短的序列计算百分比同一性。
实施例4利用APMV-8株接种1日龄肉鸡
按照下面显示的表7将20只1日龄的肉鸡分成两组。
在第1天，给1日龄鸡放血以使用血凝集抑制测定法(HI测试)来测定针对新城疫病毒(NDV)和APMV-8的抗体状态。这一测试使用来自NDV株Lasota或APMV-8感染的SPF蛋的尿囊液进行。将4个HA单位的NDV株Lasota或APMV-8和1％鸡红细胞用于HI测试。所得的HI滴度显示鸡的血清包含针对NDV的HI抗体，但无可检测的针对APMV-8病毒的抗体。
表7.1日龄肉鸡的感染/接种
Figure BDA0000151614140000371
在第1天，通过鼻途径用106EID50的APMV-8株感染10只鸡的组1，组2的10只鸡不被感染，用作对照。
在感染后14天(第14天)，给鸡放血，再次分析所获得的血清样品中针对NDV和APMV-8的HI抗体的存在(图20)。结果显示，APMV-8接种的鸡显示使用APMV-8作为抗原的HI滴度。APMV-8特异性HI滴度为128至2048。针对NDV的HI滴度下降至低于16的HI滴度，从而它们被认为不是NDV阳性的。此结果显示针对NDV的鸡母传抗体未阻止APMV-8的感染，从而这类抗体不太可能干扰APMV-8接种。
在感染后14天(第14天)，使组1和组2的鸡分开。再次用106EID50的APMV-8株感染组1(组1-1)和组2(组2-1)各自的5只鸡(表7)，每一组中的剩下的5只鸡(组1-2和组2-2)不被感染。本实验经设计用以研究鸡的后一感染对感染是否具有影响以及第二次感染(加强接种)是否会增加抗体滴度。14天后(第28天)，给所有鸡再次放血，研究血清中APMV-8和NDV抗体的存在。血清滴度(图21)显示，第14天的第一次接种(组2-1)诱导了范围在32至512之间的APMV-8特异性抗体滴度。在只在第1天接种的鸡(组1-2)中，抗体滴度下降至范围在128至512之间的滴度。在已在第1天和第14天接种的鸡(组1-1)中，APMV-8特异性抗体滴度不增加，表明用于第二次感染的病毒被第一次感染诱导的APMV-8特异性抗体中和。未接种对照(组2-2)的血清不包含APMV-8特异性HI抗体。在第28天，NDV抗体进一步下降，20只鸡中只有11只鸡显示针对NDV抗原的任何HI滴度，而在第14天有14只鸡显示抗NDV的低抗体滴度。
实施例5含胚SPF蛋的卵内接种
进行本研究以测试利用APMV-8的卵内接种是否导致鸡的抗体反应以及卵内接种是否干扰孵化率和存活率(livability)。
在研究1中，在孵育的第18天使用INOVOJECT(Pfizer AnimalHealth，NY，USA)，利用APMV-8病毒株卵内接种108枚SPF蛋。将病毒稀释在0.9％无菌NaCl盐水中。稀释病毒的返滴定(backt itration)显示105.5EID50/100μl的滴度。作为对照，用0.9％无菌NaCl盐水接种108枚蛋。用于接种的体积为100l/蛋。从对照组孵化出80只鸡，从APMV-8接种的组孵化出45只鸡。将来自每一个组的10只鸡转移到一个Horsefall-Bauer单元中。此外，将APMV-8接种组的鸡与对照组的5只鸡共同混合在Horsefall-Bauer单元中，以测试接种后APMV-8的传播。随意提供水和饲料。在孵化后14天和28天，采集血液样品，使用4个HA单位和1％的鸡红细胞测试针对APMV-8的HI抗体的存在情况。结果(图22)显示，在孵育的第18天卵内接种导致免疫反应，如通过测试的血清样品中HI滴度的存在表明的。在孵育后14天，在卵内接种的组中观察到256至4048的HI滴度。在接触的鸡的血清中，在与来自接种组的鸡接触后14天观察到256至2048的HI商度，表明用于接种的病毒排毒(shedding)。对照组不显示任何特异于APMV-8的HI滴度。14天后，再次给鸡放血，其在APMV-8接种组中显示256至4096的滴度，并且在APMV-8接触组中显示256至1024的滴度。对照组未显示APMV-8HI抗体的存在，
在研究2中，在孵育的第19天使用INOVOJECT卵内接种88枚SPF(无特殊病原体)蛋。将APMV-8病毒株稀释在0.9％无菌NaCl盐水中。如在稀释的病毒的返滴定后观察到的，病毒的滴度为105.75EID50/100μl。作为对照，用0.9％无菌NaCl盐水接种88枚SPF蛋。用于接种的体积为100μl/蛋。从对照组(NaCl)孵化出74只鸡，从APMV-8接种的组孵化出76只鸡。将来自每一个组的10只鸡转移到一个Horsefall-Bauer单元中。随意提供水和饲料。在孵化后14天，采集血液样品，使用4个HA单位和1％的鸡红细胞测试针对APMV-8的HI抗体的存在。结果(图23)显示，在孵育的第19天进行卵内接种导致了免疫反应，具有特异于APMV-8的HI滴度。在孵育后14天，在APMV-8卵内接种的组中观察到256至4048的HI滴度。对照组未显示任何特异于APMV-8的HI滴度。在孵育后第28天再次给鸡放血。APMV-8接种的组的HI滴度在512至4096的范围内(图23)，而对照鸡的血清仍然为APMV-8阴性。
在第3个研究中，在孵育的第18天使用INOVOJECT分别用103.5EID50和104.5EID50卵内接种组1和组2的108枚SPF蛋。将APMV-8病毒株稀释在0.9％无菌NaCl盐水中。在第三组中，用0.9％无菌NaCl盐水接种108枚SPF蛋作为对照。从组1孵化出83只鸡，从组2孵化出79只鸡，从组3孵化出88只鸡(参见表8)。在孵化后，将来自每一个组的10只鸡转移到一个Horsefall-Bauer单元中。随意提供水和饲料。在孵化后，用100μl体积的106EID50APMV-8病毒在颈部皮下接种来自组3的10只鸡。在孵育后14天，采集血液样品，使用4个HA单位和1％的鸡红细胞(CRBS)测试针对APMV-8的HI抗体的存在。结果(图24)显示，在孵育的第18天卵内接种导致了免疫反应，具有特异于APMV-8的HI滴度。在孵育后14天，在APMV-8卵内接种的组中观察到4096至16384的HI滴度。对照组未显示任何特异于APMV-8的HI滴度。用APMV-8皮下接种的组显示滴度在64至4096之间范围的血清转化。在孵育后第28天再次给鸡放血，测试APMV-8特异性HI抗体的存在。在孵育后第4周的HI滴度下降，范围在512至4096之间。对照组不显示任何特异于APMV-8的HI滴度。皮下接种的组的HI滴度显示范围在32至256之间的HI滴度。
表8
  组1   组2   组3(对照)
  SPF蛋   108   108   108
  孵化的鸡   83   79   88
  在孵育的第18天利用APMV-8接种   103.5EID50100μl/蛋   104.5EID50100μl/蛋   0.9％无菌NaCl盐水
实施例6APMV-8株的反向遗传学的开发和表达异源基因的APMV-8突变体的产生
包含APMy-8的NP、P和L基因的表达质粒的构建
为了建立用于副粘病毒的反向遗传学体系，必需建立表达参与病毒RNA复制的蛋白质的质粒。将3个APMV-8蛋白(核蛋白NP、磷蛋白P、RNA依赖性RNA聚合酶蛋白或蛋白L)的开放阅读框(ORF)克隆入真核表达载体pcDNA3(Invitrogen，California，USA)。为此，使用High PureRNA分离试剂盒(Roche，Basel，Switzerland)纯化包含APMV-8的尿囊液的RNA。使用Titan One Tube RT-PCR试剂盒(Roche)将纯化的RNA用于逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。使用适当的引物对：[NP(NP-FP，NP-RP)、P(P-FP，P-RP)、L(L-FP，L-RP)，参见表9]扩增这些蛋白质的ORF。在0.7％琼脂糖凝胶上分离反应产物，按照制造商提供的方案使用QIAquick Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)从凝胶洗脱反应产物。将RT-PCR片段与适当的限制性内切酶(NP和P利用Eco RI/NotI；L利用Kpn I/NotI)一起温育，再次凝胶洗脱，将其连接至用适当的限制性内切酶切割的真核表达载体pcDNA 3中。将连接反应物转化入Top10F细胞(Invitrogen)，用适当的限制性内切酶消化从Top10F细胞收获的质粒DNA(参见上文)。对包含具有适当大小的DNA片段的质粒(pcDNA-NP、pcDNA-P、pcDNA-L)进行测序。
表9.用扩增RNP复合物的蛋白质的基因的引物
Figure BDA0000151614140000411
a引物序列包含用于克隆的限制性内切酶切割位点。限制性内切酶位点以粗体标示出。起始和终止密码子以斜体字突出。病毒特异性序列以下划线标示。
b根据病毒信使RNA的引物序列方向。
c位置在显示的全长基因组中是病毒特异性序列。
包含APMV-8的全长基因组的质粒的构建
为了产生包含全长APMV-8基因组的质粒，基于两个不同部分(5’-FLG，3’-FLG，参见图25)产生的共有序列合成(Genscript，New York，USA)病毒的cDNA基因组。从核苷酸1-5564合成病毒序列的5’-部分(5’-FLG，SEQ ID NO：47)。在此APMV-8序列之前为由CMV-IE启动子组成的序列盒、随后为用于XmaI的限制性酶切割序列(用于可能的随后克隆方法)和锤头核酶序列。在该序列的5’-末端和3’-末端，分别添加Not I和Sac II的限制性内切酶切割位点。序列(核苷酸5503-15342)的合成的3’-部分(3’-FLG，SEQ ID NO：48)后接肝炎δ核酶序列和牛生长激素的poly-A信号序列。为了克隆目的，在3’-FLG的5’-末端添加用于Not I限制性内切酶的序列，并且在该序列的3’-末端添加用于Sac II的限制性内切酶的序列。唯一的限制性内切酶(Bmt I)的序列位于5’-FLG与3’-FLG的交叠部分(核苷酸5503-5564)内，该酶在全长序列的核苷酸5541处切割。将DNA的两个部分(5’-FLG，3’-FLG)分开地连接至质粒pUC57(Genscript)中，得到质粒pUC57/5’-FLG和pUC57/3’-FLG。为了将两个片段克隆在一起，用Bmt I和Sac II切割pUC57/5’-FLG，凝胶洗脱含有5’-FLG的质粒。平行地，用相同的酶切割pUC57/3’-FLG，洗脱片段3’-FLG。随后将3’-FLG连接至含有5’-FLG的质粒中，获得包含处于CMV-IE启动子控制下的APMV-8基因组的全长cDNA序列的质粒(pUC57-FL-APMV-8)。
包含APMV-8微小基因组的质粒的构建
使用由Conze lmann等人(J Virol.68：713-719，1994)描述的方法，构建包含APMV-8微小基因组的所有功能元件的质粒(pMG-APMV-8)。质粒pMG-APMV-8包含侧翼连接有T7启动子和反基因组δ肝炎病毒核酶序列的APMV-8基因组尾随区和前导区(Collins，等人，PNAS USA88：9663-9667，1991)。该反基因组δ肝炎病毒核酶序列后接T7转录终止子序列。以反义方向定位的加强型绿色荧光蛋白的编码序列位于在尾随区与前导区之间。3个额外的G残基位于尾随信号之前，紧接T7启动子之后。该插入物侧翼连接限制性内切酶切割位点Eco RI和Not I，将其平端克隆入质粒pUC57。将该构建体亚克隆入质粒pUC18。为此，随后用Eco RI和Hind III切割质粒pMG-APMV-8，凝胶洗脱适当的片段，将其连接至适当切割的质粒pUC18中，获得puC18-MG-APMV-8。通过测序确认插入物的存在。
允许表达T7聚合酶的表达质粒的产生
为了产生编码T7DNA依赖性RNA聚合酶(T7聚合酶)的质粒，通过Genscript合成编码序列(GenBank登录号AY264778)。修饰T7聚合酶序列(SEQ ID NO：49)以最优化用于在真核系统中表达的密码子用法和除去序列中的可能的剪接供体/受体位点。T7聚合酶编码序列侧翼连接有EcoRI(5’)和NotI(3’)位点。将合成的片段平端克隆入载体pUC57(pCU57-T7)。用EcoRI/NotI切割该质粒，凝胶洗脱T7聚合酶编码片段。随后将此片段克隆入真核表达载体pcDNA3(Invit rogen)，获得pcDNA3-T7。通过测序验证所述片段在载体pcDNA3-T7中的存在。
通过使用处于T7启动子控制之下的内部核糖体进入位点产生表达 加强型绿色荧光蛋白的质粒
为了测试T7聚合酶的功能性，使用质粒pEGFP-N1(Cl ontech，California，USA)和下述引物对通过PCR扩增加强型绿色荧光蛋白(EGFP)的开放阅读框：
EGFP-FP(CCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG)SEQ ID NO：50和
EGFP-RP(CCGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG)SEQ ID NO：51。
凝胶洗脱所获得的PCR片段，将其与限制性内切酶BamHI和Not I一起温育。凝胶洗脱反应产物，将其连接至适当切割的载体pCITE 4A(Novagen)中。将获得的质粒(pCITE4A-EGFP)用于随后的实验。使用Lipofectin 2000(Invitrogen)将质粒pCITE4A-EGFP和pcDNA3-T7单独或组合地转染入生长在24孔板中的鸡细胞系DF1中。转染后24小时，除去培养基，加入无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)。使用倒置荧光显微镜Axiovert 40CFL(Zeiss，Jena，Germany)评估细胞。只在用两种质粒共转染的组织培养板的孔中观察到绿色荧光。该结果显示两种质粒pCITE4A-EGFP和pcDNA3-T7都具有功能。
使用微小基因组质粒验证表达的病毒蛋白NP、P和L的功能性
用pcDNA3-T 7、pUC18-MG-APMV-8、pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L共转染DF1细胞以验证表达的NP、P和L蛋白的功能性。转染后24小时，除去培养基，加入无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)。使用倒置荧光显微镜Axiovert 40CFL(Zeiss，Jena，Germany)评估细胞。只在用5种质粒共转染的组织培养板的孔中观察到绿色荧光。该结果表明，表达的病毒蛋白NP、P和L有功能将APMV-8微小基因组转录成mRNA和表达由pUC18-MG-APMV-8编码的EGFP蛋白。
从包含APMV-8的全长序列的质粒拯救AMPV8病毒
用pUC57-FL-APMV-8、pcDNA-NP、pcDNA-P和pcDNA-L共转染DF1细胞。在48至96小时后，在10日龄的含胚蛋中接种DF1细胞的上清液以扩增病毒。在3至5天后，收获尿囊液，使用1％的鸡红细胞测试其血凝集活性(HA)。将对于HA活性测试为阳性的尿囊液用于3个操作。1)用尿囊液感染DF1细胞，并且在用APMV-8特异性抗血清感染后36小时在间接免疫荧光测定中测试其中APMV-8蛋白表达的存在情况。2)利用血凝集抑制测定，使用APMV-8特异性鸡血清(由National CentralVeterinary Laboratory，Ames，Iowa，USA提供)测试尿囊液的APMV-8特异性。3)使用APMV-8特异性寡核苷酸通过RT-PCR鉴定拯救病毒。通过在反应过程中省略RT步骤来验证病毒cDNA的不存在。在含胚SPF鸡蛋中进一步扩增在所有3个测定中测试为阳性的样品，
在鸡来源外的细胞中扩增APMV-8
将来自不同物种[仓鼠(幼仓鼠肾细胞，BHK-21细胞)、猴(Vero细胞，具有非洲绿猴的肾来源的细胞系)以及犬科动物(马-达二氏犬肾细胞，MDCK)和鹌鹑(鹌鹑肌细胞系QM7)]的细胞培养在24孔组织培养板中，用0.01的感染复数感染所述细胞。感染后24小时用冰冷的乙醇固定细胞，使用来自APMV-8感染的SPF鸡的APMV-8特异性抗血清通过间接免疫荧光分析其中APMV-8特异性蛋白的存在情况。通过使用山羊抗鸡IgY特异性FITC缀合物使抗体的结合可见。未感染的细胞用作阴性对照。只在APMV-8感染的细胞中观察到绿色荧光。这表明APMV-8能够感染除鸡外的物种的细胞。
在胰蛋白酶存在的情况下APMV-8的复制增加。如上所述用APMV-8感染MDCK细胞。感染后，用无血清培养基漂洗细胞，用浓度为1ug/ml的含胰蛋白酶无血清培养基或只用无血清培养基覆盖细胞。感染后24、48和96小时后，除去细胞上清液，如上所述使用间接免疫荧光法测定DF1细胞上的TCID50。获得的数据表明，与胰蛋白酶不存在的情况下相比较，在该酶存在的情况下，APMV-8复制至更高的滴度(图19B)。
该实施例的结果显示，与AMPV-1一样，APMV-8能够渗入不同物种的细胞并且起始其复制循环。因而其是用于多个物种的合适载体。
使用反向遗传学体系产生表达外源基因的重组APMV-8病毒
为了产生表达高致病性禽流感(HPAI)的血凝素(HA)基因的重组APMV-8病毒(病毒载体)，将H5或H7亚型病毒HPAI的HA基因的编码序列插入包含全长APMV-8基因组的质粒中APMV-8基因组的非必需区域内，例如M与F基因之间或P与M基因之间。为此，血凝素开放阅读框的编码序列侧翼连接F基因的所有必需调控序列，包括基因起始序列、5’非编码序列、3’非编码序列和基因终止序列，以因其在质粒构建体中的唯一性而将限制性内切酶切割位点Bsu 36I和Nhe I用于将适当的片段连接入包含全长APMV-8基因组的现有质粒的方式来合成构建体。所得的质粒称为转录质粒，其在全长APMV-8基因组的非必需区域中包含血凝素基因。通过使用该方法，可将多种病毒和细菌抗原的编码序列克隆入APMV-8序列的主链。可被插入APMV-8基因组的其它可能的抗原是新城疫病毒的融合蛋白、禽支气管炎病毒的S蛋白、来自非H5和非H7禽流感病毒的其它血凝素基因、鸡贫血病毒结构蛋白基因VP1、来自传染性喉气管炎病毒的糖蛋白基因。
实施例7动物的接种
通过包含如实施例6中所述的重组APMV-8病毒(病毒载体)的组合物或疫苗的1次、2次施用或初免-加强方案接种动物。对于鸡/鸟类，进行多次施用，例如在D18或D19时进行卵内施用，在1日龄时进行皮下(SC)施用或在不同年龄进行粘膜施用(喷雾剂、饮用水、滴眼剂)。剂量为3至7个log10(优选4-6个l og10EID50)。对于哺乳动物，使用粘膜途径(鼻内、眼内、口服)或胃肠外(IM、SC、无针、经皮肤或皮肤内)途径。剂量为5至9log(优选6-8log)。通常以3-4周的间隔进行两次施用。异源初免-加强(例如，使用蛋白质的加强)也可以是有利的。
针对动物中抗特定抗原攻击评估由组合物或疫苗诱导的保护性效力。通过临床观察和/或组织、血液或粘膜拭子中特定病原体的病毒载量来评估保护性作用。在不同时期从接种的动物采集血液样品，测试其血清学。结果显示，本发明的组合物或疫苗具有免疫原性，并且在接种的动物中提供保护作用。
***
在已如此详细地描述本发明的优选实施方案后，应理解由上述段落定义的本发明不限定于上述描述所示的具体内容，因为其许多明显的变型是可能的，而不背离本发明的精神或范围。
本文中引用或参考的所有文献(“本文中引用的文献”)和引用的文献中引用和参考的所有文献与本文中或通过引用并入本文的任何文献中提及的任何产品的任何制造商说明书、描述、产品说明书以及产品手册(product sbeet)通过引用并入本文，并且可用于本发明的实施，
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Claims (17)

1.一种组合物或疫苗，其包含(i)重组APMV病毒载体和(i i)药用或兽医学上可接受的载体。
2.权利要求1的组合物或疫苗，其中所述APMV为APMV-8、APMV-2、APMV-4或APMV-6。
3.权利要求1或2的组合物或疫苗，其中所述APMV病毒载体包含与具有SEQ ID NO：1中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO：1中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸。
4.权利要求1-3中任一项的组合物或疫苗，其中所述APMV病毒载体还包含编码抗原的分离的多核苷酸，并且其中所述多核苷酸被插入在APMV基因组的非必需区域内。
5.权利要求3的组合物或疫苗，其中所述非必需区域选自下述区域：位于NP开放阅读框上游的非翻译区、APMV基因组的两个开放阅读框之间的基因间区域和位于L开放阅读框下游的非翻译区。
6.用于产生重组APMV病毒载体的方法，其中所述方法包括将分离的多核苷酸在APMV基因组的非必需区域内引入所述APMV基因组。
7.权利要求6的方法，其中所述APMV为APMV-8、APMV-2、APMV-4或APMV-6。
8.权利要求6或7的方法，其中所述APMV包含与具有SEQ ID NO：1中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO：1中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸。
9.权利要求6至8中任一项的方法，其中所述非必需区域选自下述区域：位于NP开放阅读框上游的非翻译区、APMV基因组的两个开放阅读框之间的基因间区域和位于L开放阅读框下游的非翻译区。
10.权利要求6-9中任一项的方法，其中所述方法包括步骤：
a)制备表达NP、P和L基因的表达质粒；
b)制备在全长APMV基因组的非必需区域中包含分离的多核苷酸的转录质粒；
c)将所述表达质粒和转录质粒转染入宿主细胞；
d)从所述宿主细胞拯救/回收感染性APMV病毒。
11.权利要求6-9中任一项的方法，其中所述方法包括步骤：
a)制备表达NP、P和L基因的表达质粒；
b)制备在全长APMV基因组的非必需区域中包含分离的多核苷酸的转录质粒；
c)制备表达T7聚合酶的表达质粒；
d)将所述表达质粒和转录质粒转染入宿主细胞；
e)从所述宿主细胞拯救/回收感染性APMV病毒。
12.用于在动物中诱导针对抗原的免疫反应的方法，包括用包含重组APMV病毒载体的组合物或疫苗接种所述动物，其中所述重组APMV病毒载体包含和表达所述动物的病原体的抗原。
13.权利要求12的方法，其中以初免-加强方案诱导动物的对所述抗原的免疫反应。
14.权利要求12的方法，其中所述动物是禽类、马科动物、犬科动物、猫科动物、猪类、牛类、羊类或人。
15.包含选自下列序列的多核苷酸的未修饰或经修饰的APMV病毒：
a)与具有SEQ ID NO：1中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO：1中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；
b)与编码具有SEQ ID NO：3中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO：2中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO：2中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；
c)与编码具有SEQ ID NO：5中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO：4中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO：4中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；
d)与编码具有SEQ ID NO：7中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO：6中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO：6中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；
e)与编码具有SEQ ID NO：9中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO：8中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO：8中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；
f)与编码具有SEQ ID NO：11中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO：10中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO：10中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；和
g)与编码具有SEQ ID NO：13中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，与编码具有SEQ ID NO：14中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ IDNO：12中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO：12中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸。
16.权利要求15的经修饰的APMV病毒，其还包含插入在APMV基因组的非必需区域中的分离的多核苷酸。
17.一种分离的多核苷酸，其选自：
a)与具有SEQ ID NO：1中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO：1中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；
b)与编码具有SEQ ID NO：3中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO：2中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO：2中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；
c)与编码具有SEQ ID NO：5所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO：4中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO：4中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；
d)与编码具有SEQ ID NO：7中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO：6中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO：6中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；
e)与编码具有SEQ ID NO：9中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO：8中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO：8中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；
f)与编码具有SEQ ID NO：11所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ ID NO：10中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO：10中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸；和
g)与编码具有SEQ ID NO：13中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，与编码具有SEQ ID NO：14中所示序列的多肽的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，与具有SEQ IDNO：12中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸，或与同具有SEQ ID NO：12中所示序列的多核苷酸具有至少90％序列同一性的多核苷酸互补的多核苷酸。
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