RU2592544C2 - Способ получения рекомбинантного вирусного вектора apmv-8 - Google Patents
Способ получения рекомбинантного вирусного вектора apmv-8 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2592544C2 RU2592544C2 RU2012110576/10A RU2012110576A RU2592544C2 RU 2592544 C2 RU2592544 C2 RU 2592544C2 RU 2012110576/10 A RU2012110576/10 A RU 2012110576/10A RU 2012110576 A RU2012110576 A RU 2012110576A RU 2592544 C2 RU2592544 C2 RU 2592544C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- apmv
- virus
- sequence
- day
- chickens
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 title claims abstract description 28
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 51
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 148
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 124
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 120
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 53
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 24
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 9
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 5
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 claims description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 53
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 35
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 135
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 131
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 89
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 71
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 71
- 241000724287 Apple mosaic virus Species 0.000 description 68
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 55
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 44
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 44
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 39
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 39
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 37
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 description 37
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 37
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 37
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 36
- 241001493169 Avian avulavirus 2 Species 0.000 description 35
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 35
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 33
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 32
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 30
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 30
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 29
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 29
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 29
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 28
- 241000029382 Avian avulavirus 6 Species 0.000 description 27
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 26
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 26
- 241001135673 Avian avulavirus 4 Species 0.000 description 25
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 23
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 21
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 21
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 19
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 19
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 18
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 17
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 17
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 17
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 16
- 206010044302 Tracheitis Diseases 0.000 description 16
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 16
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 16
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 16
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 16
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 15
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 14
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 14
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 14
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 14
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 14
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 13
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 13
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 238000011161 development Methods 0.000 description 12
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 12
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 11
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 11
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 10
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 9
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 8
- 206010033645 Pancreatitis Diseases 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 8
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 8
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 8
- 241001227084 Avian avulavirus 3 Species 0.000 description 7
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 7
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 7
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 7
- 206010064097 avian influenza Diseases 0.000 description 7
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 241000751561 Avian avulavirus 7 Species 0.000 description 6
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 6
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 6
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 description 6
- 208000002979 Influenza in Birds Diseases 0.000 description 6
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 6
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 6
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 6
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 6
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 5
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 101150118742 NP gene Proteins 0.000 description 5
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 5
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 5
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 5
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 5
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 5
- 241000282421 Canidae Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 241000711502 Paramyxovirinae Species 0.000 description 4
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 4
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000223 polyglycerol Polymers 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 4
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical class OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 3
- 241000035315 Avulavirus Species 0.000 description 3
- 241001440741 CHER virus Species 0.000 description 3
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 3
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 3
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 description 3
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 3
- 241000701063 Gallid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 3
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 3
- 101150062031 L gene Proteins 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 3
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 3
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 3
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 3
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 3
- 210000001533 respiratory mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N squalane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N Acrylic acid Chemical compound OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 241001545522 Aguacate virus Species 0.000 description 2
- 235000006576 Althaea officinalis Nutrition 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- 241001492342 Anatid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000712005 Bovine respirovirus 3 Species 0.000 description 2
- 241000272828 Branta canadensis Species 0.000 description 2
- 241000680578 Canid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000712083 Canine morbillivirus Species 0.000 description 2
- 241000701931 Canine parvovirus Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000701087 Felid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000714201 Feline calicivirus Species 0.000 description 2
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000711475 Feline infectious peritonitis virus Species 0.000 description 2
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241000701925 Feline parvovirus Species 0.000 description 2
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101150039660 HA gene Proteins 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 101150008820 HN gene Proteins 0.000 description 2
- 108090001102 Hammerhead ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 2
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 2
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 2
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 2
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 2
- VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N Isobutene Chemical compound CC(C)=C VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 2
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 101150084044 P gene Proteins 0.000 description 2
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 2
- 241000711904 Pneumoviridae Species 0.000 description 2
- 241000711902 Pneumovirus Species 0.000 description 2
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 210000001643 allantois Anatomy 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002585 base Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-M decanoate Chemical compound CCCCCCCCCC([O-])=O GHVNFZFCNZKVNT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 2
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 2
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 2
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 description 2
- 238000010562 histological examination Methods 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 2
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 201000009837 laryngotracheitis Diseases 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 2
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 2
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M octanoate Chemical compound CCCCCCCC([O-])=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 238000009374 poultry farming Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 210000005092 tracheal tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 229940023147 viral vector vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 2
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZORQXIQZAOLNGE-UHFFFAOYSA-N 1,1-difluorocyclohexane Chemical compound FC1(F)CCCCC1 ZORQXIQZAOLNGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XDOFQFKRPWOURC-UHFFFAOYSA-N 16-methylheptadecanoic acid Chemical class CC(C)CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O XDOFQFKRPWOURC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RFIMISVNSAUMBU-UHFFFAOYSA-N 2-(hydroxymethyl)-2-(prop-2-enoxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(CO)(CO)COCC=C RFIMISVNSAUMBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMHYVXGZRGOICM-AUYXYSRISA-N 2-[(z)-octadec-9-enoyl]oxypropyl (z)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC UMHYVXGZRGOICM-AUYXYSRISA-N 0.000 description 1
- JVTIXNMXDLQEJE-UHFFFAOYSA-N 2-decanoyloxypropyl decanoate 2-octanoyloxypropyl octanoate Chemical compound C(CCCCCCC)(=O)OCC(C)OC(CCCCCCC)=O.C(=O)(CCCCCCCCC)OCC(C)OC(=O)CCCCCCCCC JVTIXNMXDLQEJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIHBGTRZFAVZRV-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyoctadecanoic acid Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCC(O)C(O)=O KIHBGTRZFAVZRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WLAMNBDJUVNPJU-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutyric acid Chemical compound CCC(C)C(O)=O WLAMNBDJUVNPJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- GHUXAYLZEGLXDA-UHFFFAOYSA-N 8-azido-5-ethyl-6-phenylphenanthridin-5-ium-3-amine;bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 GHUXAYLZEGLXDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001455214 Acinonyx jubatus Species 0.000 description 1
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 1
- 244000208874 Althaea officinalis Species 0.000 description 1
- 241000272522 Anas Species 0.000 description 1
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 241000700663 Avipoxvirus Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000157302 Bison bison athabascae Species 0.000 description 1
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 1
- 241001227615 Bovine foamy virus Species 0.000 description 1
- 241000711895 Bovine orthopneumovirus Species 0.000 description 1
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 description 1
- 206010006811 Bursitis Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001293028 Callonetta leucophrys Species 0.000 description 1
- 241000178270 Canarypox virus Species 0.000 description 1
- 241000711506 Canine coronavirus Species 0.000 description 1
- 241001353878 Canine parainfluenza virus Species 0.000 description 1
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 1
- 241000725585 Chicken anemia virus Species 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 241001533384 Circovirus Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000684283 Duck parvovirus Species 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186810 Erysipelothrix rhusiopathiae Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 241000287227 Fringillidae Species 0.000 description 1
- 101710160621 Fusion glycoprotein F0 Proteins 0.000 description 1
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241001194612 Goose paramyxovirus SF02 Species 0.000 description 1
- 241000035314 Henipavirus Species 0.000 description 1
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 1
- 241000598171 Human adenovirus sp. Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000282620 Hylobates sp. Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- 241001550390 Leptospira interrogans serovar Canicola Species 0.000 description 1
- 241001518154 Leptospira kirschneri serovar Grippotyphosa Species 0.000 description 1
- 241001208284 Leucophrys Species 0.000 description 1
- 241000721701 Lynx Species 0.000 description 1
- 241001293418 Mannheimia haemolytica Species 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 241001502481 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000351643 Metapneumovirus Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000712045 Morbillivirus Species 0.000 description 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 1
- 241000204045 Mycoplasma hyopneumoniae Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241001661006 Pepper cryptic virus 2 Species 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000027954 Poultry disease Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 241000287531 Psittacidae Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000018569 Respiratory Tract disease Diseases 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 241001113283 Respirovirus Species 0.000 description 1
- 206010051497 Rhinotracheitis Diseases 0.000 description 1
- 241000711897 Rinderpest morbillivirus Species 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241001533467 Rubulavirus Species 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241001428894 Small ruminant morbillivirus Species 0.000 description 1
- NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N Sorbitan monooleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O NWGKJDSIEKMTRX-AAZCQSIUSA-N 0.000 description 1
- 241000251131 Sphyrna Species 0.000 description 1
- 241000168914 Strepsirrhini Species 0.000 description 1
- 101710106388 Structural protein VP1 Proteins 0.000 description 1
- 241000272534 Struthio camelus Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108091012456 T4 RNA ligase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000288940 Tarsius Species 0.000 description 1
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000838698 Togo Species 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- QYKIQEUNHZKYBP-UHFFFAOYSA-N Vinyl ether Chemical compound C=COC=C QYKIQEUNHZKYBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 201000006449 West Nile encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010057293 West Nile viral infection Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 241000720387 Yucaipa virus Species 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940086737 allyl sucrose Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012550 audit Methods 0.000 description 1
- 241000701792 avian adenovirus Species 0.000 description 1
- 108010029566 avian influenza A virus hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N bvdv Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CN=CN1 PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229960001631 carbomer Drugs 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 208000037902 enteropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- 229940052303 ethers for general anesthesia Drugs 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000002194 fatty esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010211 hemagglutination inhibition (HI) assay Methods 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000017555 immunoglobulin mediated immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 208000028774 intestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 208000008417 malignant catarrh Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 1
- JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N n-Triacontane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC JXTPJDDICSTXJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFFLGGQVNFXPEV-UHFFFAOYSA-N n-decene Natural products CCCCCCCCC=C AFFLGGQVNFXPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 229940060184 oil ingredients Drugs 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid group Chemical group C(CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC)(=O)O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000006384 oligomerization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920002643 polyglutamic acid Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 229940010310 propylene glycol dioleate Drugs 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 229940102127 rubidium chloride Drugs 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000001593 sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229940035049 sorbitan monooleate Drugs 0.000 description 1
- 235000011069 sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229940032094 squalane Drugs 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical class 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960000834 vinyl ether Drugs 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2760/18143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18151—Methods of production or purification of viral material
- C12N2760/18152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2999/00—Further aspects of viruses or vectors not covered by groups C12N2710/00 - C12N2796/00 or C12N2800/00
- C12N2999/007—Technological advancements, e.g. new system for producing known virus, cre-lox system for production of transgenic animals
Abstract
Настоящее изобретение относится к области генной инженерии и касается способа получения рекомбинантного вирусного вектора парамиксовируса птиц - 8 (APMV-8). Способ включает введение в несущественный участок генома APMV-8 гетерологичной последовательности ДНК, где вирусный вектор APMV-8 включает полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 1 или полинуклеотид, комплементарный полинуклеотиду с последовательностью SEQ ID NO: 1, причем несущественный участок выбирается из группы, включающей нетранслируемый участок, расположенный перед открытой рамкой считывания NP, межгенные участки между двумя открытыми рамками считывания генома APMV-8 и нетранслируемый участок, расположенный после открытой рамки считывания L. Представленное изобретение может быть использовано в качестве вакцины для животных. 3 з.п. ф-лы, 35 ил., 9 табл., 7 пр.
Description
Область техники
Настоящее изобретение касается парамиксовирусов птиц (avian paramyxoviruses, APMV) и последовательностей APMV. Настоящее изобретение касается вирусных векторов для встраивания и экспрессии чужеродных генов для применения в качестве безопасных носителей при иммунизации для защиты от множества патогенов. Оно касается векторной вакцины в системе «обратной генетики» для производства живых ослабленных вакцин. Оно также касается полинуклеотидов, которые могут применяться для продукции субъединиц в экспрессионном векторе in vitro или последовательностей для интегрирования в вирусный или плазмидный тип экспрессионного вектора в системе in vivo.
Настоящее изобретение касается немодифицированного и модифицированного вируса APMV, способов его получения и применения и определенных последовательностей ДНК и белков. Более конкретно, настоящее изобретение касается вируса APMV, в котором исходный природный геном вируса был изменен («мутанты APMV» или «рекомбинантный APMV») и способов получения и применения таких мутантов APMV или рекомбинантного APMV.
Уровень техники
Вакцины на основе вирусных векторов представляют собой одну из наиболее быстро развивающихся областей в разработке вакцин. Многие вакцины, находящиеся на стадии клинических разработок, для основных глобальных инфекционных заболеваний, ВИЧ, туберкулеза и малярии, созданы на основе вирусных векторов. Вакцины на основе вирусных векторов для животных уже представлены на рынке, например, вакцины на основе авипоксвирусных векторов для домашних животных и домашней птицы, векторные вакцины на основе герпесвирусов птиц для домашней птицы и вакцины на основе вируса коровьей оспы для диких животных. Другие векторные вакцины для домашних животных находятся в стадии разработки. Преимущество вакцин на основе вирусных векторов заключается в том, что их можно безопасно применять, поскольку в них используется векторная основа, которая является сильно ослабленной и не может сама по себе вызвать заболевание у животного. Недостатком применяемых в настоящее время вирусных векторов является существование полученного от матери иммунитета или антител, появившихся в результате перенесенной инфекции. Эти антитела будут нейтрализовать векторный вирус и, следовательно, уменьшать успешность применения векторной вакцины. Одним из главных стимулов для разработки векторных вакцин было появление высокопатогенного вируса гриппа H5N1, появившегося сначала в Азии, а позднее в Европе и в Африке. Было разработано несколько векторных вакцин-кандидатов, включая векторные вакцины на основе поксвируса птиц (Taylor et al, 1988), вируса коровьей оспы (Chambers et al., 1988), вируса саркомы Рауса (Hunt et al, 1988), аденовирусов (Tang et al., 2002, Gao et al, 2006), вируса венесуэльского энцефалита лошадей (Schultz-Cherry et al, 2000), вируса болезни Ньюкасла (US6,719,979, Veits et al., 2006, Swayne et al, 2002, Park et al, 2006), герпесвируса инфекционного ларинготрахеита (Veits et al. 2003), герпесвируса индеек (Darteil et al., 1995) и аденовируса (Hoelscher et al, 2008, Того et al, 2007). Эффективность этих векторных вакцин была протестирована на незараженных птицах, но до настоящего времени не было опубликовано сообщений об эффективности этих векторных вакцин у птиц с уже имеющимся иммунитетом к вирусному вектору и/или к белку, кодируемому вставкой.
Семейство вирусов Paramyxoviridae включает как патогены человека (вирусы кори, свинки, парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус), так и животных (вирус болезни Ньюкасла и вирус чумы рогатого скота), которые оказывают значительное влияние на здоровье населения и на глобальную экономику (Lamb et al., 2007). Установлено, что члены этого семейства имеют однокомпонентный отрицательно направленный (с отрицательной полярностью) одноцепочечный РНК-геном. Семейство Paramyxoviridae состоит из двух подсемейств, а именно Paramyxovirinae и Pneumovirinae. Согласно недавней ревизии классификации подсемейство Paramyxovirinae включает пять родов, а именно Morbillivirus, Henipavirus, Rubulavirus, Respirovirus и Avulavirus, тогда как Pneumovirinae включает Pneumovirus и Metapneumovirus (Mayo, 2002). Парамиксовирусы птиц (APMV) относятся к роду Avulavirus и включают девять антигенно различающихся серотипов, которые были определены с помощью тестов ингибирования гемагглютинации (HI) (Alexander, 1988). Среди этих девяти серотипов изоляты, принадлежащие к подтипу APMV-1, могут вызывать опустошительное заболевание в промышленном птицеводстве и классифицируются как велогенный (с высокой вирулентностью) вирус болезни Ньюкасла (Newcastle disease virus, NDV). Более умеренные формы NDV обозначаются как мезогенные (средней вирулентности) и лентогенные (со сниженной вирулентностью) изоляты, где последняя форма у домашней птицы является обычно бессимптомной. Изоляты, относящиеся к APMV-2, 3, 6 и 7, также являются связанными с заболеванием домашней птицы. В частности, инфекции изолятами APMV-2 и 3 могут вызывать умеренное респираторное заболевание и проблемы с качеством и количеством яиц (Bankowski et al., 1981; Redmann et al., 1991; Tumova et al., 1979; Zhang et al., 2007). Известно, что изоляты APMV-6 и 7 инфицируют индеек, уток и перелетных птиц и могут вызывать респираторное заболевание, которое может осложняться вторичной инфекцией (Saif et al., 1997; Shortridge et al., 1980). С другой стороны, изоляты APMV-4, 5, 8 и 9 были выделены из уток, водоплавающей птицы и других диких птиц, но эти птицы редко демонстрируют клинические признаки, характерные для вирусной инфекции (Alexander et al., 1983; Capua et al., 2004; Gough et al., 1984; Maldonado et al., 1995; Shortridge et al., 1980).
Были получены полные геномные последовательности нескольких изолятов NDV, которые использовали для выявления различных детерминант вирулентности NDV (de Leeuw et al., 1999; Krishnamurthy et al., 1998; Zou et al., 2005). В последние два года было опубликовано несколько последовательностей APMV, которые отличаются от APMV1, такие как GenBank accession number EU338414 для APMV-2, EU403085 для APMV-3, FJ177514 для APMV-4, EU622637 для APMV-6, FJ231524 для APMV-7, FJ215863, FJ215864 и FJ619036 для APMV-8, EU910942 для APMV-9. Кроме информации о последовательностях, о факторах вирулентности известно не очень много. Изоляты APMV 2-9 главным образом были выделены из перелетных птиц. Интересно отметить, что имеется всего несколько сообщений об экспериментальном заражении цыплят такими изолятами (Saif et al., 1997). Поскольку эти APMV широко циркулируют среди диких птиц и в некоторых случаях были выделены из промышленных популяций домашней птицы (Zhang et al., 2007), что иногда вызывает заболевание в этих популяциях (Saif et al., 1997; Shihmanter et al., 1998; Shihmanter et al., 1998), знание их вирулентности в отношении домашней птицы является необходимым.
Большинство из изолятов APMV вызывает относительно слабое заболевание, которое может усиливаться в присутствии сопутствующих бактериальных или вирусных инфекций, что может приводить к экономическим потерям. В частности, APMV-2 был впервые изолирован как вторичный патоген в 1956 году в Южной Калифорнии из цыплят, пораженных острым ларинготрахеитом (Bankowski et al., 1960). Впоследствии были выделены многочисленные штаммы этого серотипа из нескольких видов птиц, что означает, что APMV-2 является широко распространенным по всему миру (Andral et al., 1984; Bradshaw et al., 1979; Fleury et al., 1979; Goodman et al., 1988; Lang et al., 1975; Lipkind et al., 1982; Lipkind et al., 1979; Zhang et al., 2006). Bankowski et. al. сообщили, что естественное или искусственное экспонирование несущихся индеек с APMV-2 вызывает резкое снижение вылупляемости птенцов и выхода птицы (Bankowski et al., 1981).
Первыми примерами изоляции APMV-4 были таковые из убитых охотниками диких уток на путях перелета на Миссисипи и Соединенных Штатах (Webster et al., 1976) и из кур, уток и гусей в Гонконге в ходе программ мониторинга гриппа у домашней птицы (Alexander et al., 1979). Не считая изолята из кольчатого чирка, пораженного геморрагическим энтеритом (Gough et al., 1984), все другие изоляты из домашней птицы были по внешним признакам непатогенными и, как было установлено, имеют широкое распространение среди водоплавающей птицы по всему миру (Stanislawek et al., 2002; Tumova et al., 1989; Yamane et al., 1982). Gough et al. сообщили, что после внутриназальной инокуляции однонедельным утятам и двухнедельным цыплятам изолята из кольчатого чирка не наблюдалось клинических проявлений и были получены очень низкие титры HI (1:8 или ниже) (Gough et al., 1984). Подобно этому, первые изоляты APMV-6 были также получены из домашней птицы в Гонконге в результате проведения программы мониторинга гриппа и сообщалось, что у кур они являются непатогенными на основании низких титров HI из экспериментально зараженных кур (Shortridge et al., 1980). Однако были сообщения о том, что инфекция APMV-6 у индеек приводит к умеренному респираторному заболеванию и проблемам с производством яиц (Alexander, 2003).
APMV-8 (Goose/Delaware/1053/76) был впервые изолирован в США из убитой охотниками Канадской казарки {Branta canadensis) (Rosenberger et al., 1974). Серологические исследования (с 1990 по 1992 годы) пернатой дичи в южной Испании показали значительное преобладание антител против APMV-8 в до 43% протестированных сывороток (Maldonado et al., 1995). Другое серологическое исследование, направленное на выяснение статуса живых здоровых крякв в Новой Зеландии в отношении инфицирования APMV, выявило присутствие антител против APMV-8 в 56% протестированных сывороток (Stanislawek et al., 2002). Warke et al (2008) сообщили, что от 16% до 31% из исследованных сывороток кур могут содержать антитела против APMV-8. Но вследствие наличия высоких титров против APMV1 существует вероятность ложноположительного теста HI, поскольку сыворотки не реагируют высокоспецифично при анализе HI. За исключением нескольких изолятов из водоплавающей птицы, изоляты APMV-8 были получены из популяций при их исследовании на вирус птичьего гриппа (Stallknecht et al., 1991), и сохраняется недостаток информации о широкой распространенности и патогенности этого вируса.
Развитие систем «обратной генетики» (условий обратной транскрипции) для РНК-генома с отрицательной полярностью NDV сделало возможным встраивание последовательностей чужеродных генов в такой геном, таким образом, обеспечивая возможность создания рекомбинантных NDV векторов для вакцинации и генной терапии (Krishnamurthy et al., 2000; Peeters et al., 1999; Roemer-Oberdoerfer et al., 1999). Сообщалось о рекомбинантных NDV векторах, экспрессирующих чужеродные вирусные белки, такие как белок НА подтипа HI вируса гриппа A (Nakaya et al., 2001), VP2 белок вируса инфекционного бурсита (IBDV) (Huang et al., 2004), гемагглютинин подтипа Н5 (Veits et al., 2006; Ge et al., 2007) и подтипа H7 (Park et al., 2006) вируса гриппа птиц. Однако эффективность большинства из таких вакцин была продемонстрирована только на свободных от специфических патогенов (SPF) птицах. NDV вызывает опустошительное заболевание у домашней птицы, приводящее к серьезным экономическим потерям в промышленном птицеводстве. Таким образом, куры в промышленном птицеводстве обычно вакцинируются против NDV в большинстве стран мира. Вследствие этого, цыплята от иммунизированных родителей в промышленных популяциях кур имеют высокий уровень полученных от матери антител. Обычные живые NDV вакцины обеспечивают защиту даже в присутствии этих антител. Однако рекомбинантные NDV вакцины (с вставками чужеродных генов) обычно являются более ослабленными по сравнению с живыми NDV вакцинами, и их эффективность может быть ослаблена в присутствии материнских антител против NDV. Таким образом, существует необходимость в платформе векторной вакцины, которая может обеспечить основу для безопасных вакцин для экспрессии гетерологических антигенов. В идеале рекомбинантная вакцина может индуцировать сильный гуморальный иммунный ответ, может применяться для массового введения и является недорогой.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение касается вакцины или композиции, включающей (i) рекомбинантный APMV и (ii) фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель. Настоящее изобретение включает способы модификации генома APMV для получения рекомбинантного вируса APMV или вирусного вектора на основе APMV; модифицированный APMV, полученный такими способами; последовательности ДНК и белков; и способы инфицирования клеток и животных-хозяев таким рекомбинантным APMV для индукции амплификации экзогенной ДНК и белков, кодируемых экзогенной ДНК, включая антигенные белки, указанными клетками и животными-хозяевами.
Один аспект настоящего изобретения касается вируса APMV, последовательностей ДНК и белков, применяемых при получении модифицированного или рекомбинантного вируса. Одно воплощение настоящего изобретения касается геномной и белковой последовательности APMV-2, 4, 6 или 8.
Другой аспект настоящего изобретения касается модифицированного рекомбинантного вируса APMV, где указанные вирусы имеют повышенную безопасность, сильный гуморальный иммунный ответ, и способа получения таких рекомбинантных вирусов.
Другой аспект настоящего изобретения касается рекомбинантной APMV вирусной вакцины или композиции, имеющей повышенный уровень безопасности по сравнению с известными APMV или другими рекомбинантными вакцинами.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет немодифицированный и модифицированный APMV вирусный вектор для экспрессии продукта гена в хозяине.
Другой аспект настоящего изобретения направлен на рекомбинантный APMV вирус, модифицированный путем вставки в него ДНК из любого источника в межгенный участок или в несущественный участок генома APMV. Синтетически модифицированные рекомбинанты APMV вируса, несущие гетерологические гены, кодирующие и экспрессирующие антиген, применяются согласно настоящему изобретению для создания новых композиций или вакцин.
Другой аспект настоящего изобретения касается APMV вирусного вектора, который предоставляет обратную генетическую систему (систему обратной транскрипции), где указанный вектор может быть применен в качестве каркаса для рекомбинантных вакцин или композиций в различных животных-хозяевах.
В одном аспекте настоящее изобретение касается фармацевтической композиции или вакцины для индукции иммунологического ответа в животном-хозяине, инокулированном данной композицией или вакциной, композиции или вакцины, включающей фармацевтически приемлемый носитель и модифицированный APMV рекомбинантный вирус или вирусный вектор. В еще одном аспекте настоящего изобретения рекомбинантный APMV вирус или вирусный вектор включает, в пределах несущественного участка вирусного генома, гетерологическую ДНК, которая кодирует антигенный белок, происходящий из патогена, где композиция или вакцина при введении хозяину является способной индуцировать иммунологический ответ, специфичный в отношении белка, кодируемого данным патогенном.
Другой аспект настоящего изобретения касается способа индукции иммунологического ответа у животного на антиген, где способ включает инокуляцию животного вакциной или фармацевтической композицией, содержащей модифицированный рекомбинантный APMV вирус или вирусный вектор, который включает и экспрессирует антигенную детерминанту патогена для указанного животного. Еще один аспект настоящего изобретения касается способа индукции иммунологического ответа у животного на антиген в режиме «прайм-буст».
Другой аспект настоящего изобретения касается способа экспрессии продукта гена в клеточной культуре in vitro путем введения в клетку модифицированного рекомбинантного APMV вируса, где ген может представлять собой ген антигенного белка, происходящий из патогена.
Краткое описание фигур
Следующее далее «Осуществление изобретения», выполненное в виде примеров, которое не направлено на ограничение настоящего изобретения описанными конкретными воплощениями, может быть понятным с привлечением сопровождающих фигур, среди которых:
Фигура 1 представляет собой таблицу, показывающую изоляцию вируса из нескольких органов кур после экспериментального инфицирования APMV-2, 4, 6 зародышей куриных яиц.
Фигура 2 представляет собой таблицу, показывающую результаты гистологического исследования некоторых органов кур после экспериментального инфицирования APMV-2, 4, 6.
Фигура 3 показывает титры HI антител у SPF кур (свободных от специфических патогенов), экспериментально инокулированных APMV-2, 4 или 6. Образцы сыворотки крови кур, собранные в дни 2, 4, 7, 14 и 28 после инфицирования, подвергали тесту HI для анализа присутствия HI антител.
Фигура 4 показывает титры HI антител у SPF кур и уток, экспериментально инфицированных APMV-8. Куры и утки были инфицированы ороназально в дозе 106 EID50 APMV-8. Образцы сыворотки крови были взяты в дни 2, 4, 7, 14 и 28 после инфицирования и проанализированы в тесте HI с антигеном APMV-8. Титры HI сывороток крови (в логарифмической шкале log2) показаны на левой оси.
Фигура 5 показывает развитие титров антител HI у SPF кур в ходе схемы вакцинирования «прайм-буст» с APMV-8. Однодневные SPF цыплята были инфицированы в день 1 (первично) и в день 14 (буст) в дозе 106 EID50 APMV-8. Образцы сыворотки крови были взяты в дни 7 и 14 после первого инфицирования и в дни 7 и 14 после вторичного инфицирования. Сыворотку исследовали в тесте HI. Титры HI сывороток (в логарифмической шкале log2) показаны на левой оси.
Фигура 6 показывает исследование продуктов ОТ-ПЦР (обратная транскрипция с последующей ПЦР) с помощью электрофореза в агарозном геле. Ткани трахеи были взяты в день 2 после инфицирования у неинфицированных уток (С1-С5) и инфицированных APMV-8 уток (11-15). Ткани гомогенизировали и готовили РНК для ОТ-ПЦР. Параллельно ставили контроль с водой (W). Продукты реакции разделяли на 1,5% агарозном геле. Размер фрагмента контролировали с использованием лестницы маркеров в 100 п.о. (New England Biolabs). Размеры фрагментов ДНК показаны справа.
Фигура 7 представляет собой таблицу, показывающую выделение вируса из кур и уток, экспериментально инфицированных APMV-8. Выделение вируса из тканей кур было проведено на зародышах куриных яиц, и определение вирусной РНК в тканях уток проводили с помощью ОТ-ПЦР.
Фигура 8 представляет собой таблицу, показывающую результаты гистологического исследования некоторых органов после инфицирования кур и Пекинских уток APMV-8.
Фигура 9 показывает развитие титров HI антител у SPF кур после инфицирования разными дозами APMV-8. Однодневные SPF цыплята были инфицированы в день 1 разными инфицирующими дозами (ID) APMV-8 или ложно инфицированы средой для переноса вируса (virus transport medium, VTM). Кровь брали в дни 7 и 14 после инфицирования, и полученные образцы сывороток крови анализировали в тесте HI. Титры HI сывороток (в логарифмической шкале log2) показаны на левой оси. Средний геометрический титр (geometric mean titer, GMT) образцов сывороток показан в самом нижнем ряду.
Фигура 10 показывает развитие титров антител HI у Пекинских уток после инфицирования разными дозами APMV-8. Однодневные SPF Пекинские утки были инфицированы в день 1 разными инфекционными дозами (ID) APMV-8 или были ложно инфицированы средой для переноса вируса (VTM). Кровь брали в дни 7 и 14 после инфицирования, и полученные образцы сывороток анализировали в тесте HI. Титры сывороток HI (в логарифмической шкале log2) показаны на левой оси. Средний геометрический титр (GMT) образцов сывороток показан в самом нижнем ряду.
Фигура 11 представляет собой таблицу, показывающую SEQ ID Nos соответствующих последовательностей ДНК и белков.
Фигура 12 показывает полную геномную последовательность штамма APMV-8 (APMV-8: SCWDS ID: МА-7, изолирован из кряквы) и генетическую карту полноразмерного генома APMV-8.
Фигура 12А показывает последовательность ДНК (SEQ ID NO:2), кодирующую Нуклеопротеин (NP) APMV-8 и последовательность белка NP (SEQ ID NO:3).
Фигура 13 показывает последовательность ДНК (SEQ ID NO:4), кодирующую Фосфопротеин (Р) APMV-8 и последовательность белка Р (SEQ ID NO:5).
Фигура 14 показывает последовательность ДНК (SEQ ID NO:6), кодирующую Матрикспротеин (М) APMV-8 и последовательность белка М (SEQ ID NO:7).
Фигура 15 показывает последовательность ДНК (SEQ ID NO:8), кодирующую Фьюженпротеин (F) APMV-8 и последовательность белка F (SEQ ID NO:9).
Фигура 16 показывает последовательность ДНК (SEQ ID NO:10), кодирующую Гемагглютинин/нейраминидазу (HN) APMV-8 и последовательность белка HN (SEQ ID NO:11).
Фигура 17 показывает последовательность ДНК (SEQ ID NO:12), кодирующую Полимеразу (L) APMV-8 и последовательность белка L (SEQ ID NO:13). Этот белок L(1) APMV-8 транслируется, начиная с кодона ATG, расположенного в положениях 8273-8275 bSEQ ID NO:1.
Фигура 18 показывает последовательность белка (2) APMV-8 Полимеразы (L) (SEQ ID NO:14). Этот белок L(2) APMV-8 транслируется, начиная с кодона ATG, расположенного в положениях 8297-8299 в SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:14 не содержит первых 8 аминокислот SEQ ID NO:13.
Фигура 19А представляет собой схему системы обратной генетики для вируса APMV-8. Фигура 19В показывает результат репликации вируса APMV-8 в клетках MDCK.
Фигура 20 показывает результат теста HI у коммерчески приобретенных кур-бройлеров через 2 недели после вакцинации APMV-8.
Фигура 21 показывает результат теста HI у коммерчески приобретенных кур-бройлеров через 4 недели после вакцинации APMV-8.
Фигура 22 показывает результаты теста HI после вакцинации in ovo в день 18 (исследование 1).
Фигура 23 показывает результаты теста HI после вакцинации in ovo в день 19 (исследование 2).
Фигура 24 показывает результаты теста HI после вакцинации in ovo в день 18 (исследование 3).
Фигура 25 показывает последовательности 5'-полноразмерного генома (5'-FLG) и 3'-полноразмерного генома (З'-FLG), включая фланкирующие последовательности.
Фигура 26 показывает карты плазмид pcNDA-NP, pcNDA-P, pcDNA-L и pcDNA3-Т7.
Фигура 27 показывает карты плазмид pUC 18-MG-APMV-8 и pCITE4A-EGFP.
Фигура 28 показывает карту плазмиды pUC57-FL-APMV-8.
Фигура 29 показывает последовательность минигенома APMV-8.
Фигура 30 показывает выравнивание последовательностей белка NP и идентичность последовательностей на уровнях ДНК и белка.
Фигура 31 показывает выравнивание последовательностей белка Р и идентичность последовательностей на уровнях ДНК и белка.
Фигура 32 показывает выравнивание последовательностей белка М и идентичность последовательностей на уровнях ДНК и белка.
Фигура 33 показывает выравнивание последовательностей белка F и идентичность последовательностей на уровнях ДНК и белка.
Фигура 34 показывает выравнивание последовательностей белка HN и идентичность последовательностей на уровнях ДНК и белка.
Фигура 35 показывает выравнивание последовательностей белка L и идентичность последовательностей на уровнях ДНК и белка.
Осуществление изобретения
Следует указать, что в настоящем «Осуществлении изобретения», и в особенности в «Формуле изобретения», такие термины как «включает», «включено», «включая» и тому подобное должны иметь значение, приписываемое им Законом о Патентах США; например, они могут означать «содержит в себе», «включает в себя», «включая в себя» и тому подобное; и что термины, такие как «состоя по существу из» и «состоит по существу из» имеют значение, приписываемое им Законом о Патентах США, например они позволяют элементам, которые не были в точности перечислены, входить в них, за исключением элементов, которые известны из предшествующего уровня техники, или которые влияют на основные или новые характеристики настоящего изобретения.
Если не указано по-другому, технические термины используются в соответствии с их обычным значением. Определения обычных терминов в молекулярной биологии можно найти в Benjamin Lewin, Genes V., опубликованной Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликованной Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); и Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликованной VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
Термины в единственном числе включают и множественное число, если из контекста четко не следует другое. Подобно этому, слово «или» включает в себя «и», если контекст четко не указывает на другое. Слово «или» обозначает любого одного члена из определенного списка и также включает любую комбинацию из членов такого списка.
Следует указать, что в настоящем «Осуществлении изобретения» и в прилагаемой «Формуле изобретения» и/или в пунктах, термины «Парамиксовирусы птиц» или «APMV» используются взаимозаменяемо и обозначают и включают в себя APMV-1, APMV-2, APMV-3, APMV-4, APMV-5, APMV-6, APMV-7, APMV-8 и APMV-9.
Термин «животное» в используемом здесь значении включает в себя всех млекопитающих, птиц и рыб. Животное в используемом здесь значении может быть выбрано из группы, состоящей из лошадиных (например, лошадь), псовых (например, собаки, волки, лисы, койоты, шакалы), кошачьих (например, львы, тигры, домашние кошки, дикие кошки, другие крупные кошки, и другие кошачьи, включая гепарда и рысь), бычьих (например, крупный рогатый скот), свиней (например, домашняя свинья), овечьих (например, овцы, козы, ламы, бизоны?), птичьих (например, курица, утка, гусь, индейка, перепелка, фазан, попугай, мелкие птицы (вьюрки), сокол, ворона, африканский страус, эму и казуар), приматов (например, полуобезьяны, долгопят, мартышка, гиббон, человекообразная обезьяна), людей и рыб. Термин «животное» также включает индивидуальное животное на всех стадиях развития, включая эмбриональные и зародышевые стадии.
Термины «полипептид» и «белок» используются здесь взаимозаменяемо для обозначения полимера из соединенных последовательно аминокислотных остатков.
Термины «нуклеиновая кислота», «нуклеотид» и «полинуклеотид» используются взаимозаменяемо и относятся к РНК, ДНК, кДНК (комплементарной ДНК) или кРНК (комплементарной РНК) и их производным, таким как таковые, содержащие модифицированные каркасы. Необходимо понимать, что настоящее изобретение предоставляет полинуклеотиды, включая последовательности, комплементарные к таковым, которые здесь описаны. Описываемые в настоящем изобретении «полинуклеотиды» включают как прямо направленную цепь (от 5' к 3'-концу), так и обратно направленную комплементарную цепь (от 3' к 5'-концу). Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть получены разными способами (например, химическим синтезом, клонированием генов, и т.д.) и могут принимать различные формы (например, линейные или ветвящиеся, одноцепочечные или двухцепочечные, или их гибриды, праймеры, зонды и т.д.).
Термин «геномная ДНК» или «геном» используется взаимозаменяемо и относится к передаваемой по наследству генетической информации организма-хозяина. Геномная ДНК включает ДНК ядра (также обозначается как хромосомная ДНК), а также ДНК пластид (например, хлоропластов) и других клеточных органелл (например, митохондрий). Термины геномная ДНК или геном, применяемые в настоящем изобретении, также относятся к РНК вируса. РНК может представлять собой положительную (положительной полярности) цепь или отрицательную (отрицательной полярности) цепь РНК. Термин «геномная ДНК», применяемый в настоящем изобретении, включает геномную ДНК, содержащую последовательности, которые комплементарны к описываемым здесь последовательностям. Термин «геномная ДНК» также относится к информационной (матричной) РНК (мРНК), комплементарной ДНК (кДНК) и комплементарной РНК (кРНК). Термин «Геномная НК (нуклеиновая кислота)» в используемом здесь значении включает РНК, мРНК, кРНК, ДНК и кДНК.
Термин «ген» широко используется для обозначения любого сегмента полинуклеотида, связанного с биологической функцией. Таким образом, гены или полинуклеотиды включают интроны и экзоны, как в геномной последовательности, или только кодирующие последовательности, как в кДНК, такие как открытая рамка считывания (open reading frame, ORF), начиная со стартового кодона (метионинового кодона) и заканчивая сигналом терминации (стоп-кодоном). Гены и полинуклеотиды также могут включать участки, которые регулируют их экспрессию, например, на уровне инициации транскрипции, трансляции и терминации транскрипции. Таким образом, в данный термин также включаются промоторы и участки связывания с рибосомой (обычно эти регуляторные элементы лежат примерно между 60 и 250 нуклеотидами, расположенными выше стартового кодона кодирующей последовательности или гена; Doree S M et al; Pandher К et al; Chung J Y et al), терминаторы транскрипции (обычно терминатор располагается в пределах примерно 50 нуклеотидов ниже стоп-кодона в кодирующей последовательности или гене; Ward CKef al). Геном или полинуклеотидом также называется фрагмент нуклеиновой кислоты, который экспрессирует мРНК или функциональную РНК, или кодирует определенный белок, и который включает регуляторные последовательности.
Термин «гетерологическая ДНК» в используемом здесь значении относится к ДНК, которая происходит из другого организма, такого как другой тип клеток или другой вид по отношению к реципиенту. Данный термин также относится к ДНК или ее фрагменту из того же самого генома ДНК хозяина, когда гетерологическая ДНК вставлена в участок генома, который отличается от места ее исходной локализации.
В используемом здесь значении термин «антиген» или «иммуноген» обозначает субстанцию, которая индуцирует специфический иммунный ответ у животного-хозяина. Антиген может включать целый организм, убитый, ослабленный или живой; субъединицу или часть организма; рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами; часть или фрагмент ДНК, способный индуцировать иммунный ответ при презентации в животном-хозяине; полипептид, эпитоп, гаптен или любую их комбинацию. Альтернативно этому, иммуноген или антиген могут включать в себя токсин или антитоксин.
Термин «иммуногенный белок или пептид» в используемом здесь значении включает в себя полипептиды, которые являются иммунологически активными в том смысле, что при введении такого белка хозяину он способен вызывать иммунный ответ гуморального и/или клеточного типа, направленный против этого белка. Предпочтительно белковый фрагмент является таким, что он обладает практически такой же иммунологической активностью, как и целый белок. Таким образом, белковый фрагмент согласно настоящему изобретению включает в себя или состоит, по меньшей мере, из одного эпитопа или антигенной детерминанты. «Иммуногенный белок или пептид» в используемом здесь значении включает в себя полноразмерную последовательность белка, ее аналог или ее иммуногенные фрагменты. Под «иммуногенным фрагментом» понимается фрагмент белка, который включает в себя один или более эпитопов и, таким образом, вызывает иммунологический ответ, описанный выше. Такие фрагменты могут быть идентифицированы с использованием любого набора методов эпитопного картирования, хорошо известных в данной области техники. Смотри, например, Epitope Mapping Protocols в Methods in Molecular Biology, Vol.66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Например, линейные эпитопы могут быть определены, например, путем конкурентного синтеза большого числа пептидов на твердых подложках, пептидов, соответствующих участкам белковой молекулы, и анализа реагирования этих пептидов с антителами в условиях, когда пептиды еще остаются связанными с подложками. Такие методы известны в данной области техники и описаны, например, в Патенте США No. 4708871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. Подобно этому, конформационные эпитопы легко идентифицируются путем определения пространственной конформации аминокислот с помощью, например, рентгеновской кристаллографии и двухмерного ядерного магнитного резонанса. Смотри, например, Epitope Mapping Protocols, supra.
Термин «иммуногенный белок или пептид» дополнительно включает в себя делеции, вставки и замены в последовательности, до тех пор, пока полипептид функционирует в плане индукции иммунологического ответа, как здесь определено. Термин «консервативная вариация (замена)» означает замену аминокислотного остатка на другой биологически сходный остаток, или замену нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, такую, что кодируемый аминокислотный остаток не изменится или будет заменен на другой биологически сходный остаток. В этом отношении особенно предпочтительные замены будут, как правило, консервативными в природе, то есть, это такие замены, которые имеют место в пределах одного семейства аминокислот. Например, аминокислоты обычно подразделяются на четыре семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) щелочные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цист(е)ин, серии, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируются как ароматические аминокислоты. Примеры консервативных вариаций включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин на другой гидрофобный остаток, или замену одного полярного остатка на другой полярный остаток, например, замену аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту, или глутамина на аспарагин, и тому подобное; или подобную консервативную замену одной аминокислоты на структурно сходную аминокислоту, что не будет оказывать значительного влияния на биологическую активность. Белки, имеющие в значительной степени одинаковую аминокислотную последовательность в качестве референтных (эталонных) молекул, но имеющие минорные аминокислотные замены, которые не влияют значительно на иммуногенность белка, попадают, таким образом, под определение референтного полипептида. Все полипептиды, полученные путем таких модификаций, являются включенными в это определение. Термин «консервативная вариация» также включает использование замененной аминокислоты на месте незамененной исходной аминокислоты, при условии, что антитела, полученные против полипептида с заменой, также являются иммунореактивными в отношении незамещенного полипептида.
Термин «клетка-хозяин» обозначает прокариотическую или эукариотическую клетку, которая была генетически изменена или способна быть генетически измененной путем введения экзогенного полинуклеотида, такого как рекомбинантная плазмида или вектор. При обозначении генетически измененных клеток данный термин относится как к исходно измененной клетке, так и к ее потомству. Полинуклеотиды, включающие желаемую последовательность, могут быть вставлены в подходящий вектор для клонирования или экспрессионный вектор, и данный вектор в свою очередь может быть введен в подходящую клетку-хозяина для репликации и амплификации. Полинуклеотиды могут быть введены в клетку-хозяина любым способом, известным в данной области техники. Векторы, содержащие представляющие интерес полинуклеотиды, могут быть введены в клетку-хозяина с помощью любого набора подходящих методов, включая прямой перенос (поглощение), эндоцитоз, трансфекцию, спаривание (f-mating), электропорацию, трансфекцию с помощью хлорида кальция, хлорида рубидия, фосфата кальция, ДЭАЭ-декстрана или других соединений; бомбардировку микропулями; липофекцию; и инфицирование (когда вектор является инфекционным, например, как в случае ретровирусного вектора). Выбор вводимых в клетку векторов или полинуклеотидов часто будет зависеть от свойств клетки-хозяина.
«Иммунологический ответ» на композицию или вакцину представляет собой развитие в хозяине клеточного и/или опосредованного антителами иммунного ответа на представляющую интерес композицию или вакцину. Как правило, «иммунологический ответ» включает, но этим не ограничивается, один или более из следующих эффектов: продукцию антител, В-клеток, клеток Т-хелперов и/или цитотоксичных Т-клеток, нацеленных специфически на антиген или антигены, включенные в представляющую интерес композицию или вакцину. Предпочтительно, хозяин будет демонстрировать либо терапевтический, либо защитный иммунологический ответ, так что устойчивость к новой инфекции будет повышена и/или клиническая тяжесть заболевания будет снижена. Такая защита будет проявляться либо в ослаблении, либо в отсутствии симптомов, обычно наблюдаемых у инфицированного хозяина, более быстром времени восстановления и/или сниженном титре вируса у инфицированного хозяина.
Одно воплощение настоящего изобретения предоставляет последовательность геномной ДНК и кодирующие белковые последовательности APMV-8. Последовательность комплементарной геномной ДНК (кДНК) штамма APMV-8 настоящего изобретения имеет полинуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID NO:1. Последовательность геномной кДНК APMV-8 (SEQ ID NO:1) имеет 48% идентичности последовательности с геномной ДНК APMV-1 (SEQ ID NO:15), 61% идентичности последовательности с геномной ДНК APMV-2 (SEQ ID NO:16), 47,2% идентичности последовательности с геномной ДНК APMV-3 (SEQ ID NO:17), 47,6% идентичности последовательности с геномной ДНК APMV-4 (SEQ ID NO:18), 52% идентичности последовательности с геномной ДНК APMV-6 (SEQ ID NO:19), 53% идентичности последовательности с геномной ДНК APMV-7 (SEQ ID NO:20), 99,1% идентичности последовательности с геномной ДНК APMV-8 (SEQ ID NO:37), 96,5% идентичности последовательности с геномной ДНК APMV-8 (SEQ ID NO:38), 96,4% идентичности последовательности с геномной ДНК APMV-8 (SEQ ID NO:39), 48% идентичности последовательности с геномной ДНК APMV-9 (SEQ ID NO:40). В другом воплощении, настоящее изобретение предоставляет полинуклеотид с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10 или 12, и его вариант или фрагмент. Настоящее изобретение дополнительно включает комплементарную цепь к описанному здесь полинуклеотиду. В еще одном воплощении настоящее изобретение предоставляет полипептид с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 или 14, и его вариант или фрагмент.
Более того, гомологи полинуклеотидов или полипептидов из APMV, например, из штаммов APMV-8, APMV-2, APMV-4, APMV-6, являются входящими в рамки настоящего изобретения. В используемом здесь значении термин «гомологи» включает ортологи, аналоги и паралоги. Термин «аналоги» относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, которые имеют одинаковую или сходную функцию, но которые эволюционировали независимо в неродственных организмах. Термин «ортологи» относится к двум полинуклеотидам или полипептидам из разных организмов, которые эволюционировали из общего предкового гена в процессе видообразования. Как правило, ортологи кодируют полипептиды, имеющие одинаковые или сходные функции. Термин «паралоги» относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, которые связаны родством за счет дупликации в пределах генома. Паралоги обычно имеют разные функции, но эти функции могут быть родственными. Аналоги, ортологи и паралоги полипептида дикого типа APMV могут отличаться от полипептида дикого типа APMV своими посттрансляционными модификациями, различиями в аминокислотной последовательности, или и тем, и другим. В частности, гомологи настоящего изобретения будут, как правило, демонстрировать, по меньшей мере, 80-85%, 85-90%, 90-95%, или 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичности последовательности со всей или с частью последовательностей полинуклеотида или полипептида APMV-8, и будут выполнять сходную функцию.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет геномную кДНК APMV-8 с последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1. В еще одном воплощении полинуклеотид представляет собой обратную комплементарную цепь полинуклеотида с последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1. В еще одном воплощении полинуклеотид или обратная комплементарная цепь полинуклеотида настоящего изобретения имеет, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с полинуклеотидом, имеющим последовательность, показанную в SEQ ID NO:1.
В одном воплощении, настоящее изобретение предоставляет фрагмент полинуклеотида, колирующего полипептид AMPV-8, такой как полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 или 14. В еще одном аспекте настоящее изобретение предоставляет полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с полипептидом, имеющим последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 или 14, или консервативный вариант, аллельный вариант, гомолог или иммуногенный фрагмент, включающий, по меньшей мере, восемь, или, по меньшей мере, десять последовательных аминокислот одного из этих полипептидов, или комбинацию этих полипептидов.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:1, 2, 4, 6, 8, 10 или 12, или его вариант. В еще одном воплощении полинуклеотид представляет собой обратную комплементарную цепь полинуклеотида с последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1. В еще одном аспекте настоящее изобретение предоставляет полинуклеотид или обратную комплементарную цепь полинуклеотида, имеющего, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с одним из полинуклеотидов, имеющим последовательность, показанную в SEQ ID NO:1, 2, 4, 6, 8, 10 или 12, или его вариант.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с полипептидом, имеющим последовательность, показанную в SEQ ID NO:3, 5, 7, 9, 11, 13 или 14. В еще одном аспекте настоящее изобретение предоставляет фрагменты и варианты полипептидов APMV, идентифицированных выше (SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 или 14), которые могут быть легко получены специалистом в данной области техники с использованием хорошо известных методов молекулярной биологии.
Варианты представляют собой гомологичные полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, по меньшей мере, с 75%, 80%, 85%, 90%, 95%>, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9,11, 13 или 14.
Варианты включают в себя аллельные варианты. Термин «аллельный вариант» относится к полинуклеотиду или к полипептиду, содержащему полиморфизмы, которые приводят к изменениям в аминокислотных последовательностях белка, и которые присутствуют в природной популяции (например, вида или варианта вируса). Такие природные аллельные вариации обычно приводят к 1-5% различиям в полинуклеотиде или в полипептиде. Аллельные варианты могут быть идентифицированы путем секвенирования представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты у ряда разных видов, что может быть легко проведено с использованием гибридизационных зондов для идентификации одного и того же генетического локуса у этих видов. Любой и все такие варианты нуклеиновых кислот и появляющиеся в результате этого полиморфизмы или вариации аминокислот, которые являются результатом природной аллельной вариации и которые не изменяют функциональную активность представляющего интерес гена, являются включенными в рамки настоящего изобретения.
Термин «идентичность» в отношении последовательностей может относиться, например, к числу положений с идентичными нуклеотидами или аминокислотами, разделенными некоторым количеством нуклеотидов или аминокислот в более короткой из этих двух последовательностей, где выравнивание этих двух последовательностей может быть проведено в соответствии с алгоритмом Вилбура и Липмана (Wilbur and Lipman). Идентичность последовательностей или сходство последовательностей двух аминокислотных последовательностей, или идентичность последовательностей между двумя нуклеотидными последовательностями может быть определена с помощью пакета программ Vector NTI software package (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, С А). Когда говорится, что последовательности РНК являются сходными или имеют определенную степень идентичности последовательности или гомологии с последовательностями ДНК, тимидин (Т) в последовательности ДНК рассматривается как соответствующий (равный) урацилу (У) в последовательности РНК. Таким образом, последовательности РНК находятся в рамках настоящего изобретения и могут являться производными от последовательностей ДНК с учетом того, что тимидин (Т) в последовательности ДНК рассматривается как соответствующий (равный) урацилу (U) в последовательностях РНК.
В одном аспекте настоящее изобретение касается фармацевтической композиции или вакцины для индукции иммунологического ответа в животном-хозяине, которому введена вакцина или композиция, где вакцина или композиция включает фармацевтически приемлемый носитель и модифицированный рекомбинантный вирус APMV или вирусный вектор. В еще одном аспекте настоящего изобретения рекомбинантный вирус APMV или вирусный вектор включает в себя, в пределах несущественного участка вирусного генома, гетерологическую последовательность ДНК, которая кодирует антигенный белок, происходящий из патогена, где композиция или вакцина при введении хозяину является способной индуцировать иммунологический ответ, специфичный в отношении белка, кодируемого патогеном.
Термин «вектор» относится к рекомбинантной ДНК- или РНК-плазмиде, бактериофагу или вирусу, которые включают гетерологический полинуклеотид, который необходимо доставить в клетку-мишень, либо in vitro, либо in vivo. Гетерологический полинуклеотид может включать представляющую интерес последовательность для целей профилактики или лечения, и может не обязательно находиться в форме экспрессионной кассеты. В используемом здесь значении вектор должен не быть способен к репликации в конечной клетке-мишени или в субъекте. Данный термин включает в себя векторы для клонирования и вирусные векторы.
Термин «генноинженерный» или «рекомбинантный» обозначает полинуклеотид полусинтетического или синтетического происхождения, который либо не встречается в природе, либо соединен с другим полинуклеотидом в таком порядке, который не найден в природе.
Термин «несущественный участок» относится к участку вирусного генома, который не является существенным для репликации и размножения вируса в культуре ткани, и удаление или инактивация которого могут снижать вирулентность в разнообразных животных системах. Любой несущественный участок или его часть могут быть удалены из генома APMV или в них может быть вставлена чужеродная последовательность, и жизнеспособность и стабильность рекомбинантного APMV, полученного в результате такой делеции или вставки, может использоваться для определения того, действительно ли удаленный участок или его часть являются несущественными. В одном воплощении, несущественный участок генома APMV представляет собой любой участок генома APMV-2, 4, 6 или 8, который не кодирует Полимеразу (L). В еще одном воплощении несущественный участок включает в себя открытую рамку считывания, кодирующую несущественный белок. В этом аспекте открытая рака считывания выбирается из группы, состоящей из нуклеопротеина (NP), фосфопротеина (Р), матрикспротеина (М), фьюженпротеина (F), и гемагглютинина/нейраминидазы (HN). В одном воплощении, несущественный участок локализован выше гена NP. В другом воплощении, несущественный участок локализован ниже гена L. В еще одном воплощении, несущественный участок представляет собой некодирующий или межгенный участок. В этом аспекте некодирующий или межгенный участок может быть участком между генами NP и Р, между генами Р и М, между генами М и F, или между генами F и HN в геноме APMV-2, 4, 6 или 8. В еще одном воплощении, несущественный участок может находится в участке положений нуклеотидов 1-140, 1526-1692, 2910-3085, 4195-4498, 6130-6382, 8116-8272, 8116-8289 или 15013-15342 в последовательности SEQ ID NO: 1.
В другом аспекте настоящее изобретение включает химеры APMV, в которых одна часть или целый ген или несколько частей или целых генов вектора APMV заменены подобными генами из других вирусов, в частности вирусов, относящихся к семейству Paramyxoviridae.
В одном воплощении настоящего изобретения вакцина или фармацевтическая композиция включает в себя антиген, выбираемый из группы патогенов птиц, включая, но ими не ограничиваясь, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, вирус инфекционного бронхита (Infectious Bronchitis virus, IBV), вирус болезни Ньюкасла (NDV), вирус синдрома снижения яйценоскости (несучести) (egg drop syndrome virus, EDS), или вирус инфекционного бурсита (Infectious Bursal Disease virus, IBDV), вирус инфекционного ларинготрахеита (Infectious Laryngotracheitis virus, ILTV), аденовирусы птиц, вирус болезни Марека (Marek's disease virus, MDV), вирус оспы кур, вирус энтерита уток (duck enteritis virus, DEV), парвовирусы уток, вирус птичьего гриппа, APMV, такой как APMV-1 и тому подобное, и их комбинации.
В другом воплощении, вакцина или фармацевтическая композиция включают в себя антиген, выбираемый из патогена кошачьих, такого как, но ими не ограничиваясь, герпесвирус кошачьих (FHV), калицивирус кошачьих (FCV), вирус лейкемии кошачьих (FeLV), вирус иммунодефицита кошачьих (FIV), парвовирус кошачьих (FPV), вирус инфекционного перитонита кошачьих (FIPV), вирус бешенства и тому подобное, и их комбинации.
В еще одном воплощении, вакцина или фармацевтическая композиция настоящего изобретения включает в себя антиген, выбираемый из патогена псовых, включая, но ими не ограничиваясь, вирус бешенства, герпесвирус псовых (CHV), парвовирус псовых (CPV), вирус собачьей чумки (CDV), вирус парагриппа 2 псовых (CPI2), коронавирус псовых, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorragiae, Leptospira grippotyphosa, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica и тому подобное, и их комбинации.
В еще одном воплощении, вакцина или фармацевтическая композиция включает в себя антиген, выбираемый из патогена лошадиных, такого как гепресвирус лошадей (тип 1 или тип 4), вирус гриппа лошадей, столбняка, вирус лихорадки Западного Нила, артеривирус лошадей и тому подобное, и их комбинации.
В еще одном воплощении, вакцина или фармацевтическая композиция включает в себя антиген, выбираемый из патогена бычьих, овец или коз, такого как вирус бешенства, ротавирус крупного рогатого скота, вирус парагриппа типа 3 крупного рогатого скота (bPIV-З), коронавирус крупного рогатого скота, вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (BVDV), вирус ящура (FMDV), вирус чумы крупного рогатого скота (Rinderpest virus, RPV), вирус чумы мелких жвачных животных (Peste des Petits Ruminants virus, PPRV), вирусы злокачественной катаральной лихорадки крупного рогатого скота, респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (BRSV), вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота (IBR), Escherichia coli, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica и тому подобное, и их комбинации.
В другом воплощении вакцина или фармацевтическая композиция включает в себя антиген, выбираемый из патогена свиней, такого как, но ими не ограничиваясь, вирус свиного гриппа (SIV), цирковирус свиней типа 2 (PCV-2), вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), вирус ложного бешенства (PRV), парвовирус свиней (PPV), FMDV, Mycoplasma hyopneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli и тому подобное, и их комбинации.
Конструирование рекомбинантного вируса хорошо известно в данной области техники, как описано, например, в Патентах США Nos. 4,769,330, 4,722,848, 4,603, 112, 5,174, 993, и 5,756,103, 6,719,979. В частности, рекомбинантный APMV вирус может быть сконструирован в две стадии. Во-первых, ген, представляющий интерес для вставки в вирус, такой как открытая рамка считывания антигена из APMV-1 (NDV) или вируса птичьего гриппа или другого организма, помещается в плазмидную конструкцию E.coli, в которую вставлена кДНК, гомологичная участку кДНК APMV. Отдельно от этого, кДНК последовательности гена, который должен быть вставлен, предваряется промоторным участком (стартовым участком гена), а за ней следует участок конца гена, который специфичен для вектора APMV. Фрагмент ДНК, состоящий из стартового участка гена/чужеродного антигена/конца гена, фланкируется фрагментом кДНК, гомологичным APMV-8 кДНК, содержащим уникальные сайты (участки) для расщепления ферментами рестрикции. Затем полученная плазмидная конструкция амплифицируется путем выращивания в бактериях E.coli и выделяется. Далее рекомбинантная плазмида используется для расщеплении ферментом рестрикции для вырезания фрагмента ДНК, включающего стартовый участок гена/чужеродный антиген/конец гена, который фланкирован кДНК, гомологичной кДНК APMV-8, и последующего лигирования этого фрагмента в подходящим образом расщепленную полноразмерную конструкцию APMV-8.
Полноразмерная конструкция, содержащая представляющий интерес ген, трансфецируется в клетки вместе с плазмидами, содержащими полинуклеотиды для экспрессии нуклеопротеина (NP) APMV, фосфопротеина (Р) APMV и РНК-полимеразы (L) APMV, а также Т7 РНК-полимеразы. Все кДНК-конструкции APMV находятся под контролем промотора Т7-полимеразы. Сохранение инфекционности вируса осуществляется, как описано в Romer-Oberdorfer et al., 1999, и как показано на фигуре 19А. Экспрессия Т7 РНК-полимеразы в трансфецированных клетках может быть достигнута разными способами, включая трансфекцию плазмидной ДНК, содержащей экспрессионную кассету для Т7 РНК-полимеразы, рекомбинантный вирус (такой как вирус куриной оспы или оспы канареек), экспрессирующий Т7 РНК-полимеразу, или в клетках, которые экспрессируют Т7 РНК-полимеразу. В другом аспекте полинуклеотиды для экспрессии нуклеопротеина (NP) APMV, фосфопротеина (Р) APMV и РНК-полимеразы (L) APMV и полноразмерная вирусная кРНК находятся под контролем истинно раннего промотора цитомегаловируса человека. Сохранение вируса проводится, как описано в Inoue К, et al., 2003.
Успешная экспрессия вставленной представляющей интерес кДНК (чужеродной кДНК или гетерологической кДНК) модифицированным инфекционным вирусом требует двух условий. Во-первых, вставка должна быть введена в участок генома вируса таким образом, чтобы модифицированный вирус оставался жизнеспособным. Вторым условием для экспрессии вставленной кДНК является присутствие регуляторных последовательностей, обеспечивающих экспрессию данного гена в составе вирусного генома (например, начало гена, конец гена, промотор, энхансер, сигналы полиаденилирования, межгенные и нетранслируемые участки).
В целом, желательно применять сильный промотор, функциональный в эукариотических клетках. В одном воплощении, промотор, используемый для транскрипции вирусной мРНК вирусной РНК-полимеразой, представляет собой «последовательность старта гена». «Последовательность старта гена» представляет собой сайт связывания для L белка, необходимый для связывания и транскрибирования расположенной ниже вирусной РНК в вирусную мРНК.
В одном воплощении, настоящее изобретение предоставляет введение терапевтически эффективного количества вакцины APMV для доставки и экспрессии антигена, эпитопа или иммуногена в клетку-мишень. Определение терапевтически эффективного количества представляет собой рутинную задачу для специалиста средней квалификации в данной области техники. В одном воплощении, композиция вакцины APMV включает экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид, который кодирует антиген, эпитоп или иммуноген, и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, связующий материал или наполнитель. В другом воплощении, фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, связующий материал или наполнитель облегчают трансфекцию и/или улучшают сохранение вектора или белка.
Фармацевтически или ветеринарно приемлемые носители, или связующие материалы, или наполнители хорошо известны специалисту в данной области техники. Например, фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, или связующий материал, или наполнитель могут представлять собой 0,9% раствор NaCl (то есть, физиологический раствор) или фосфатный буфер. Другие фармацевтически или ветеринарно приемлемые носители, или связующие материалы, или наполнители, которые могут применяться в способах настоящего изобретения, включают, но ими не ограничиваются, поли-(L-глутамат) или поливинилпирролидон. Фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, или связующий материал, или наполнитель могут представлять собой любое соединение или комбинацию соединений, облегчающих введение вектора (или белка, экспрессируемого вектором настоящего изобретения in vitro), или облегчающих трансфекцию и/или улучшающих сохранность вектора (или белка). Дозы и объемы дозировок здесь обсуждаются в общем описании и также могут быть определены специалистом в данной области техники, исходя из прочтения данного «Раскрытия изобретения» с учетом знаний в данной области техники, без какого-либо специального экспериментирования.
В другом воплощении, фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, наполнитель или связующий материал могут представлять собой эмульсию воды в масле. Примеры пригодных эмульсий воды в масле включают водно-масляные эмульсии для вакцинации на масляной основе, которые стабильны и остаются жидкими при 4°С, содержащие: от 6 до 50% (по объему) антиген-содержащей водной фазы, от 12 до 25% (по объему), от 50 до 94% (по объему) масляной фазы, состоящей полностью или частично из неметаболизируемого масла (например, минерального масла, такого как жидкий парафин), и/или метаболизируемого масла (например, растительного масла, или эфиров жирных кислот, полиолов или спиртов), от 0,2 до 20 (p/v) % сурфактантов, от 3 до 8 (p/v) %, последние представлены полностью или частично, или в смеси либо с эфирами полиглицерола, где указанные эфиры полиглицерола являются полиглицерол(поли)рицинолеатами, либо полиоксиэтиленрициновыми маслами, или же гидрированными полиоксиэтиленрициновыми маслами. Примеры сурфактантов, которые могут применяться в эмульсии вода в масле, включают этоксилированные эфиры сорбитана (например, полиоксиэтилен(20)сорбитан моноолеат (TWEEN 80®), доступный от AppliChem, Inc., Cheshire, СТ) и эфиры сорбитана (например, сорбитан моноолеат (SPAN 80®), доступный от Sigma Aldrich, St. Louis, МО). Кроме того, в отношении эмульсии вода в масле, смотри также Патент США No. 6919084. В некоторых воплощениях содержащая антиген водная фаза включает солевой раствор, содержащий один или более буферных агентов. Примером подходящего буферного раствора является фосфатный буферный раствор. В одном воплощении, эмульсия воды в масле может представлять собой тройную эмульсию вода/масло/вода (W/O/W) (смотри, например, Патент США No. 6358500). Примеры других пригодных эмульсий описаны в Патенте США No. 7371395.
Фармацевтические композиции и вакцины согласно настоящему изобретению могут включать в себя или состоять в основном из одного или более адъювантов. Подходящими адъювантами для применения при осуществлении настоящего изобретения являются (1) полимеры акриловой или метакриловой кислоты, малеиновый ангидрид и полимеры производных алкенилов, (2) иммуностимулирующие последовательности (ISS), такие как олигодезоксирибонуклеотидные последовательности, имеющие одну или более неметилированных CpG единиц (Klinman et al., 1996; W098/16247), (3) эмульсии масла в воде, такие как эмульсия SPT, описанная на стр.147 в "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" опубликованной M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, и эмульсия MF59, описанная на стр.183 в той же работе, (4) катионные липиды, содержащие четвертичную соль аммония, например, DDA, (5) цитокины, (6) гидроокись алюминия или фосфат алюминия, (7) сапонин или (8) другие адъюванты, обсуждаемые в любом процитированном здесь документе, которые все включаются в настоящее изобретение путем отсылки, или (9) любые их комбинации или смеси.
Эмульсия масла в воде (3), которая является особенно пригодной для вирусных векторов, может иметь своей основой: легкое жидкое парафиновое масло (Тип Европейской фармакопеи), изопреноидное масло, такое как сквалан, сквален, масло, получаемое при олигомеризации алкенов, например, изобутена или децена, эфиры кислот или спиртов, имеющих алкильную группу с неразветвленной цепью, такие как растительные масла, этилолеат, пропиленгликоль, ди(каприлат/капрат), глицеролтри(каприлат/капрат) и пропиленгликольдиолеат, или эфиры разветвленных жирных спиртов или кислот, особенно эфиры изостеариновой кислоты. Масло используется в комбинации с эмульгирующими агентами для образования эмульсии. Эмульгирующими агентами могут быть неионные сурфактанты, такие как: эфиры, с одной стороны, сорбитана, маннида (например, ангидроманнитололеат), глицерола, полиглицерола или пропиленгликоля и, с другой стороны, олеиновой, изостеариновой, рицинолеиновой или гидроксистеариновой кислот, где указанные эфиры могут не обязательно быть этоксилированы, или представлять собой полиоксипропилен-полиоксиэтилен блок-сополимеры, такие как Плюроник, например, L121. Среди адъювантных полимеров типа (1) предпочтение отдается полимерам поперечно сшитой акриловой или метакриловой кислоты, особенно сшитым полиалкениловыми эфирами Сахаров или полиспиртов. Эти соединения известны под названием карбомер (Pharmeuropa, vol.8, no. 2, June 1996). Специалист в данной области техники может также обратиться к Патенту США No. 2909462, который предоставляет такие акриловые полимеры, поперечно сшитые полигидроксильным соединением, имеющим, по меньшей мере, три гидроксильные группы, предпочтительно не более, чем восемь таких групп, где атомы водорода, по меньшей мере, трех гидроксильных групп заменены на ненасыщенные алифатические радикалы, имеющие, по меньшей мере, два атома углерода. Предпочтительными радикалами являются таковые, которые содержат от 2 до 4 атомов углерода, например, винилы, аллилы и другие этиленированные ненасыщенные группы. Ненасыщенные радикалы могут также содержать другие заместители, такие как метил. Продукты, продаваемые под названием Carbopol (BF Goodrich, Ohio, USA), являются особенно предпочтительными. Они являются поперечно сшитыми аллилсахарозой или аллилпентаэритритолом. Среди них можно указать на Carbopol 974Р, 934Р и 971Р.
В отношении сополимеров, производных малеинового ангидрида/алкенилов, предпочтение отдается EMA (Monsanto), которые представляют собой сополимеры этилен/малеиновый ангидрид с прямой цепью или поперечно сшитые, и которые, например, сшиты дивиниловым эфиром. Можно также сослаться на работу J. Fields et al., 1960.
В отношении структуры, полимеры акриловой или метакриловой кислоты и ЕМА являются предпочтительно образованными из базовых единиц, имеющих следующую формулу:
в которой:
-R1 и R2, которые могут быть одинаковыми или разными, представляют собой Н или СН3
-х=0 или 1, предпочтительно х=1
-у=1 или 2, где х+у=2.
Для ЕМА, х=0иу=2и для карбомеров х=у=1.
Эти полимеры являются растворимыми в воде или физиологическом солевом растворе (20 г/л NaCl) и pH может быть доведен до 7,3-7,4, например, щелочью (NaOH), для получения раствора адъюванта, в который может (могут) быть включен (включены) вектор (векторы) экспрессии. Концентрация полимера в конечной иммунологической композиции или вакцине может находиться в диапазоне между 0,01 и 1,5% (вес/объем) между 0,05 и 1% (вес/объем) и между 0,1 и 0,4% (вес/объем).
Другой аспект настоящего изобретения касается способа индукции иммунологического ответа у животного к антигену, включающего введение животному вакцины или фармацевтической композиции, содержащей модифицированный рекомбинантный вирус APMV, который включает в себя и кодирует антиген патогена для указанного животного. Еще другой аспект настоящего изобретения касается способа индукции иммунологического ответа у животного на антиген в режиме введения «прайм-буст», который включает, по меньшей мере, одно первичное введение и, по меньшей мере, одно бустерное введение с применением, по меньшей мере, одного общего полипептида, антигена, эпитопа или иммуногена. Иммунологическая композиция или вакцина, применяемая при первичном введении, может быть той же самой или может отличаться по своей природе от таковой, используемой при бустерном введении. В одном аспекте протокола «прайм-буст» настоящего изобретения композиция или вакцина, включающая рекомбинантный вирус APMV (вирусный вектор) настоящего изобретения вводится перед последующим введением инактивированной вирусной вакцины или композиции, включающей антиген, или вакцины или композиции, включающей субъединицу (белок, антиген), или ДНК-плазмидной вакцины или композиции, которая содержит или экспрессирует антиген. Подобно этому, протокол «прайм-буст» может включать введение инактивированной вирусной вакцины или композиции, включающей антиген, или вакцины или композиции, включающей субъединицу (белок, антиген), или ДНК-плазмидной вакцины или композиции, которая содержит или экспрессирует антиген, перед последующим введением композиции или вакцины, включающей рекомбинантный вирус APMV (вирусный вектор) настоящего изобретения Следуют дополнительно указать, что оба введения, и первичное, и вторичное, могут включать композицию или вакцину, включающую рекомбинантный вирус APMV (вирусный вектор) настоящего изобретения.
Первичное введение может включать одно или более введений одних и тех же иммунологических композиций вакцины на основе вирусного вектора. Подобно этому, бустерное введение может включать одно или более введений той же иммунологической композиции вакцины на основе вирусного вектора. Пути введения при первичном и бустерном введении могут быть одинаковыми или разными. Подобно этому, происхождение защитного гена, присутствующего в первичном и в бустерном введениях, может быть одним и тем же или разным (например, разные штаммы).
Разные введения проводятся предпочтительно с интервалом от 1 до 6 недель одно от другого, более предпочтительно примерно через 3 недели. Согласно предпочтительной схеме также предусматриваются ежегодные бустерные введения, предпочтительно с применением иммунологической композиции вакцины на основе вирусного вектора. Животные предпочтительно имеют возраст, по меньшей мере, в один день при первом введении.
Может применяться множество путей введения, таких как подкожно или внутримышечно, внутрикожно или трансдермально, в виде спрея, питьевой воды, глазных капель, внутри назально, перорально, с пищей, in ovo, или их комбинация (например, в глаза и нос, в рот и нос).
Настоящее изобретение далее будет детально описано с помощью следующих нелимитирующих примеров.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 APMV-2, APMV-4 и APMV-6
A. Вирусы и Птицы
Однодневные SPF (свободные от специфического антигена) цыплята (Merial, Gainesville, GA) содержались в изолированных клетках Horsfall-Baur под положительным давлением. Корм и вода предоставлялись ad libitum, и птицы осматривались дважды в день. Используемые в экспериментальных исследованиях вирусы (APMV-2, 4 и 6) были выделены из диких птиц и классифицированы в National Veterinary Service Laboratory (NVSL, Ames Iowa, USA). Вирусы размножали в 9-дневных зародышах SPF куриных яиц (SunRise Farms, Catskill, NY, USA) путем инокуляции через аллантоис. Аллантоисную жидкость собирали в день 3 после инокуляции, разделяли на аликвоты и хранили при -80°С. Подтип APMV подтверждали в тесте HI с использованием стандартных сывороток (NVSL, Ames, Iowa, USA). Инфекционная доза для 50% яиц (EID50) для каждого изолята была определена с помощью инокуляции 10-кратных серийных разведений аллантоисной жидкости в зародыши SPF яиц. Титр рассчитывали по методу, описанному Reed and Muench (Reed, LJ et al., 1938, Am. J. Epidemiol. 27:493-497).
B. Экспериментальное инфицирование
По двадцать пять однодневных SPF цыплят в каждой группе инфицировали 10б EID50 на одного цыпленка окулярно-назальным путем (через глаза и нос). Цыплят в контрольной группе ложно инокулировали PBS (фосфатный буферный раствор). В дни 2, 4, 7, 14 и 28 после инфицирования у пяти птиц из каждой группы забирали кровь из плечевой вены для сбора образцов сыворотки, птиц умерщвляли под СО2, и вскрывали. Брали образцы тканей трахеи, легких, поджелудочной железы и кишечника. Для каждого органа использовали новую пару стерильных ножниц и пинцетов. Половину образца ткани помещали в пробирку Lysing Matrix D tube (MP Biomedicals, Solon, OH), содержащую среду для переноса вирусов (IX минимальная основная среда, 7,5% бикарбонат натрия, 15 мМ HEPES, 1% фетальная сыворотка теленка, 4000 Ед/мл пенициллин, 400 мкг/мл гентамицин, 8 мкг/мл амфотерицин В, 4000 мкг/мл стрептомицин, 1000 мкг/мл канамицин сульфат). Вторая половина образца ткани фиксировалась в 10-процентном забуференном формалине и заливалась в парафин. Срезы залитых в парафин тканей прокрашивали гематоксилином Майера и эозином (Н&Е).
Результаты показали, что слабая диарея наблюдалась в день четыре и день семь после инфицирования у птиц, инфицированных APMV-2 или APMV 4. При вскрытии у птиц, инфицированных APMV-2, наблюдалось небольшое увеличение поджелудочной железы в дни два и четыре после инфицирования. Никаких других крупных повреждений ни в одной группе обнаружено не было.
C. Серология
Для выявления вируса в аллантоисной жидкости и анализа присутствия HI антител в собранных образцах сыворотки использовались тесты гемагглютинации (НА) и ингибирования гемагглютинации (HI) соответственно. Тесты проводили стандартным способом, используя 0,8% эритроциты цыплят, ресуспендированные в PBS. Тест HI проводили методом разведения сыворотки при постоянном уровне антигена. Для каждого разведения сыворотки использовали восемь НА единиц вирусного антигена.
Титры HI антител исследовали в дни 2, 4, 7, 14 и 28 после инфицирования. Положительные титры HI (≥1:16) были обнаружены в образцах сыворотки инфицированных APMV-2 птиц в день 7 (1/5), день 14 (5/5)и день 28 после инфицирования (5/5). Интересно отметить, что только один цыпленок, инфицированный APMV-4, показал титр HI, который был оценен как положительный во время всего хода эксперимента в день 14 после инфицирования. Подобно этому для группы APMV-6 два цыпленка из пяти показали титр HI 1:16 только в день 28 после инфицирования. Ложно инфицированные птицы оставались отрицательными на наличие HI антител против всех трех APMV, использованных в этом эксперименте. Кроме того, для исключения перекрестного заражения все сыворотки были протестированы на наличие HI антител против двух других антигенов и показали отрицательные результаты.
D. Выделение вируса
Образцы тканей, собранные в Lysing Matrix D tubes (MP Biomedicals, Solon, OH, USA), были дважды прогомогенизированы с использованием Fastprep®-24 (MP Biomedicals, Solon, ОН) в режиме 4,0 M/S в течение 20 секунд. После инкубации в течение 15 мин при комнатной температуре гомогенизированные образцы центрифугировали 20 мин при 2000xg при 4°С. Стерильность проверяли после инокуляции 50 мкл полученного супернатанта в 2 мл триптозо-фосфатного бульона (ТРВ) (DIFCO, Becton Dickenson, Sparks, MD, USA), обогащенного 10% гидролактальбумина, при инкубации при 37°С на вращающемся (орбитальном) шейкере в течение ночи. Нестерильные образцы фильтровали через 0,45 мкм шприцевые фильтры (Whatman Inc., Florham Park, NJ, USA). Образцы хранили при -80°C. Выделение вируса проводили путем инокуляции 0,1 мл в аллантоисную полость 9-дневных зародышей SPF куриных яиц. После инкубации в течение трех дней при 37,5°С аллантоисную жидкость собирали и анализировали на наличие гемагглютинирующей активности в тесте НА.
Для выявления мест размножения вируса несколько органов (трахея, легкие, кишечник, поджелудочная железа) анализировали на инфекционный вирус путем изолирования вируса из зародышей яиц (фигура 1). В целом, размножающийся вирус был обнаружен только в нескольких цыплятах. Вкратце, APMV-4 был выделен в день 2 из трахеи, легких и поджелудочной железы, тогда как APMV-6 был выделен из легких и поджелудочной железы. В день 4 APMV-2 был выделен из трахеи и легких, тогда как APMV-6 был выделен из всех тестируемых органов за исключением кишечника. В день 7 APMV-2 был выделен из единственного образца кишечника, APMV-4 был выделен из поджелудочной железы, тогда как APMV-6 был выделен из образцов легких и поджелудочной железы. Неожиданно в день 14 после инфицирования вирусы не были выделены, а в день 28 после инфицирования APMV-2, 4 и 6 были выделены из поджелудочной железы. Из ложно инокулированных птиц вирусов выделено не было. Идентичность вновь выделенных вирусов была подтверждена в тесте HI с использованием стандартных сывороток, предоставляемых NVSL.
Для оценки патологического потенциала исследуемых вирусов были проанализированы микроскопические поражения в полученных органах (фигура 2). В день 2 после инфицирования у всех инфицированных цыплят наблюдались катаральный трахеит в комбинации с потерей ресничек в респираторном (мерцательном) эпителии и слабый энтерит. В день 4 после инфицирования инфицированные APMV-2 цыплята демонстрировали увеличенное количество гипертрофированных слизистых желез в трахее и фокальное (очаговое) изъязвление респираторного эпителия. Инфицированные APMV-4 птицы демонстрировали изменения, позволяющие отнести их к респираторной инфекции, такие как слабый трахеит, слабый до умеренного многоочаговый лимфоцитарный панкреатит, а также фокальная гиперплазия ассоциированной с бронхами лимфоидной ткани (BALT, Bronchus-Associated Lymphoid Tissue) в день 4 после инфицирования. Исследование органов инфицированных APMV-6 цыплят выявило изменения в трахее, такие как катаральный и язвенный трахеит, и фокальный панкреатит, что согласуется с поражением вирусом. В день 7 после инфицирования инфицированные APMV-2 цыплята демонстрировали ослабление фокального трахеита или восстановление респираторного эпителия, что является признаками заживления. Птицы, инфицированные APMV-4, демонстрировали слабую гиперплазию BALT, тогда как инфицированные APMV-6 птицы демонстрировали кистозную (пузырчатую) энтеропатию, фокальный энтерит и инфильтрат лимфоцитов в поджелудочную железу. Помимо слабого лимфоцитарного энтерита и слабой гиперплазии GALT, инфицированные APMV-2 птицы также демонстрировали признаки заживления, такие как ослабление поражения трахеи в день 14 после инфицирования. Образцы органов цыплят, инфицированных APMV-4 или 6, демонстрировали изменения, позволяющие сделать вывод о вирусной инфекции, такие как слабая интерстициальная пневмония, катаральный трахеит и гиперплазия BALT или GALT в день 14 после инфицирования. Все исследованные образцы, полученные из инфицированных цыплят, продемонстрировали поражения, такие как гиперплазия GALT, лимфоцитарный панкреатит и лимфоцитарный бронхит в день 28 после инфицирования. В день 2 птицы контрольной группы продемонстрировали слабый катаральный трахеит, который мог быть связан с факторами окружающей среды.
Фигура 3 показывает низкие титры HI (до 1:32 в день 14) у SPF цыплят, инфицированных APMV-4 или APMV-6, указывая на то, что только инфекция APMV-2 вызывает HI ответ, который может быть охарактеризован как сероположительный. Тем не менее, все три вируса выделялись из трахеи, легких, кишечника и поджелудочной железы инфицированных птиц вплоть до дня 7 после инфицирования и из поджелудочной железы вплоть до дня 28 после инфицирования. Инфекция APMV-2, 4 или 6 демонстрирует характерные гистопатологические поражения (суммированы в фигуре 2) у всех инфицированных птиц, что указывает на стимуляцию вирусным антигеном. Выделение вирусов и гистологические профили инфицированных птиц четко показывают тропизм вирусов в инфицированных птицах (трахея и легкие в дни от 2 до 7, и кишечник, легкие и поджелудочная железа после дня 7). Все изоляты были выявлены в поджелудочной железе вплоть до дня 28 после инфицирования, но выделение вируса было невозможным в день 14 после инфицирования. Это указывает на то, что исследуемые APMV, по-видимому, могут сохраняться и позднее вновь активироваться. Таким образом, носители вируса могут присутствовать в инфицированных группах/популяциях птицы. Только APMV-2 индуцировал образование HI антител, тогда как HI антитела у цыплят, инфицированных APMV-4 и 6, не определялись.
Пример 2. APMV-8
А. Вирусы и птицы
Однодневные SPF цыплята (Merial, Gainesville, GA, USA) и Пекинские утки (Metzer Farms, Gonzales, CA, USA) содержались в изолированных клетках Horsfall Baur под положительным давлением. Корм и вода предоставлялись ad libitum, и птицы осматривались дважды в день. Используемый в экспериментальных исследованиях вирус APMV-8 (APMV-8: SCWDS ID: МА-7) был изолирован из диких уток (кряква) и классифицирован в National Veterinary Service Laboratory (NVSL, Ames Iowa, USA). Вирус размножали в 9-дневных зародышах SPF куриных яиц путем инокуляции через аллантоис. Аллантоисную жидкость собирали в день 3 после инокуляции, объединяли, разделяли на аликвоты и хранили при -80°С. Подтип APMV-8 подтверждали в тесте HI с использованием стандартных сывороток, предоставляемых National Veterinary Service Laboratory (Ames, IA, USA). Доза EID50 была определена с помощью инокуляции 10-кратных серийных разведений аллантоисной жидкости в зародыши SPF яиц. Титр рассчитывали по методу, описанному Reed andMuench (Reed & Muench, 1938).
B. Экспериментальное инфицирование
По двадцать пять однодневных SPF цыплят или Пекинских уток на группу были инфицированы окулярно-назальным путем 106 EID50 на каждую птицу в растворе PBS. Птиц в контрольных группах цыплят и уток ложно инокулировали PBS. У пяти птиц из каждой группы брали кровь из плечевой вены для сбора образцов сыворотки, птиц гуманно умерщвляли с помощью СО2, и проводили вскрытие в дни 2, 4, 7, 14 и 28 после инфицирования. Брали образцы тканей трахеи, легких, поджелудочной железы и кишечника (двенадцатиперстная кишка). Для каждого органа использовали новую пару стерильных ножниц и пинцетов. Половину образца ткани помещали в пробирку Lysing Matrix D tube (MP Biomedicals, Solon, ОН), содержащую среду для переноса вирусов (IX минимальная основная среда, 7,5% бикарбонат натрия, 15 мМ HEPES, 1% фетальная сыворотка теленка, 4000 Ед/мл пенициллин, 400 мкг/мл гентамицин, 8 мкг/мл амфотерицин В, 4000 мкг/мл стрептомицин, 1000 мкг/мл канамицин сульфат). Вторая половина образца ткани фиксировалась в 10-процентном забуференном формалине и стандартно обрабатывалась, заливалась в воск, были получены срезы, которые прокрашивали гематоксилином и эозином (Н&Е).
C. Выделение вируса
Образцы тканей, собранные в Lysing Matrix D tubes (MP Biomedicals, Solon, OH, USA), были дважды прогомогенизированы с использованием Fastprep®-24 (MP Biomedicals) в режиме 4,0 M/S в течение 20 секунд. Гомогенизированные образцы инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре, после чего центрифугировали 20 мин при 2000xg при 4°С. Стерильность проверяли после инокуляции 50 мкл полученного супернатанта в 2 мл стерильного ТРВ, обогащенного 10% гидролактальбумина, с последующей инкубацией при 37°С на вращающемся (орбитальном) шейкере в течение ночи. Нестерильные образцы фильтровали через 0,45 мкм шприцевые фильтры (Whatman Inc.). Образцы хранили при -80°С. Выделение вируса проводили путем инокуляции 0,1 мл в аллантоисную полость 9-дневных зародышей SPF куриных яиц. После инкубации в течение трех дней при 37,5°С аллантоисную жидкость собирали и анализировали на наличие гемагглютинирующей активности в тесте НА.
D. Серология
Для выявления вируса в аллантоисной жидкости и анализа присутствия HI антител в собранных образцах сыворотки использовались тесты гемагглютинации (НА) и ингибирования гемагглютинации (HI) соответственно. Тесты проводили стандартными способами, используя 0,8% эритроциты цыплят, ресуспендированные в PBS. Тест HI проводили методом разведения сыворотки при постоянном уровне антигена. Для каждого разведения сыворотки использовали восемь НА единиц вирусного антигена. Средний геометрический титр был определен, как описано ранее (Brugh, 1978).
Фигура 4 показывает титры HI антител у SPF цыплят и уток, инфицированных
APMV-8. Цыплята и утки были инфицированы ороназально в дозе 10^ EID50 APMV-8.
Образцы сыворотки брали в дни 2, 4, 7, 14, и 28 после инфицирования и анализировали в тесте HI с антигеном APMV-8. HI титры сыворотки показаны в логарифмической шкале (log2) на левой оси.
E. Показатели патогенности APMV-8 у цыплят
Для оценки вирулентности APMV-8 был определен индекс интрацеребральной патогенности (intracerebral pathogenicity index, ICPI) согласно методу World Organization for Animal Health (OIE, 2008), предложенному для вируса болезни Ньюкасла. Среднее время смерти (mean dead time, MDT) для зародышей цыплят было определено, как описано ранее (Swayne et al., 1998) с использованием серийного разведения APMV-8 от 10-1 до 10-8.
Определение среднего времени смерти (MDT) для зародышей яиц, также как определение индекса интрацеребральной патогенности (ICPI), представляет собой важную характеристику патогенности вируса. Что касается MDT для зародышей цыплят, ни один из зародышей в инокулированных яйцах не умер после 7-дневного периода и, таким образом, данный изолят APMV-8 может быть классифицирован как лентогенный (со сниженной вирулентностью). Присутствие вируса было подтверждено в тесте НА с использованием аллантоисной жидкости из яиц, инокулированных с разведением 10"6. Все цыплята, инокулированные интрацеребрально, не показали клинических признаков за все время наблюдения, что говорит о значении ICPI равном нулю, что свидетельствует о лентогенном фенотипе.
F. Бустерная вакцинация APMV-8
По десять однодневных SPF цыплят на группу были инфицированы окуло-назальным путем в дозе 106 EID50 на птицу. Птицы из контрольной группы цыплят были ложно инокулированы раствором PBS. Птицы были повторно инфицированы той же дозой в день 14 после первого инфицирования. Присутствие инфекционного вируса анализировалось в дни 2, 4, 7 и 14 после первой инфекции и в дни 2 и 4 после второй инфекции путем выделения вируса из мазков из трахеи с использованием 9-дневных зародышей SPF куриных яиц. Ответ антител регистрировали по титру HI в образцах сыворотки, взятых в дни 0, 7 и 14 после каждой вакцинации.
Для исследования того, обеспечивает ли вторая иммунизация более устойчивый титр HI, был проведен эксперимент по схеме «прайм-буст» (фигура 5). В день 7 после первой инфекции, все десять птиц продемонстрировали HI в диапазоне от 64 до 1024 (GMT 207). В день 14 после инфицирования после первой инфекции титр упал (GMT 84), но увеличился после бустерной инфекции в день 14 после первой инфекции. В день 7 после бустерной вакцинации GMT увеличился до 137 и снова снизился до GMT 73 в день 14 после второй инфекции. Инфекционный вирус может быть изолирован из мазков из трахеи в день 2 (5/10 птиц) и в день 4 (4/10 птиц) после первой инфекции. После второй инфекции из мазков, взятых в дни 2 и 4 после инфицирования, вирус изолировать не удалось.
G. Выявление вирусной РНК с помощью ОТ-ПЦР
Определение вирусной РНК в образцах тканей проводили после гомогенизации образцов тканей и последующего выделения РНК с использованием набора High Pure RNA isolation kit (Roche, Mannheim, Germany). При проведении ОТ-ПЦР использовалась пара праймеров (8NPfl, 8NPr, смотри таблицу 1) с использованием набора Supercript III One Step RT-PCR kit с Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями производителя. Полученные продукты реакции анализировали в 1% агарозном геле (фигура 6). Ткани трахеи были взяты в день 2 после инфицирования из неинфицированных уток (С1-С5) и инфицированных APMV-8 уток (11-15). Ткани были прогомогенизированы и РНК приготовлена для ОТ-ПЦР. Параллельно был приготовлен контроль с водой (W). Продукты реакции разделяли в 1,5% агарозном геле. Размер фрагмента контролировали с использованием лестницы маркеров по 100 п.о. (New England Biolabs, Boston, MA, USA). Размеры фрагментов ДНК показаны справа.
Таблица 1 | ||||
Олигонуклеотиды, используемые для ОТ-ПЦР для выявления вирусной РНК в образцах ткани | ||||
Название | Последовательность | Ориентация | ЛокализацияA | SEQ ID NO |
APMV-PolyT | TTTTTTTTTTTTTTTTTTACCAAACAR RGAA | смысловая | 1-14 | 21 |
8NPf1 | CAGGAGACCTGATGTTGCCTCAAC | смысловая | 200-223 | 22 |
8NPr | GCAGGCGATCTATAGTCTCTGATAG | антисмысловая | 618-642 | 23 |
H. Определение минимальной инфекционной дозы для цыплят и уток
Для того чтобы определить, какой вирусный титр будет достаточным у цыплят для выявления сероконверсии, однодневные SPF цыплята были инфицированы разными дозами APMV-8. Птицы содержались, как описано выше. По десять цыплят на группу были инфицированы каждый в дозе 101, 102, 103, 104, 105 или 106 EID50. Вирус разводили VTM. Одна группа была инокулирована VTM и использовалась в качестве контроля. У птиц брали кровь в дни 7 и 14 после инфицирования из плечевой вены. На основании результатов, полученных в эксперименте на цыплятах, трехдневные Пекинские утки были инфицированы разными количествами вируса. Были выбраны инфицирующие дозы 103, 104, 105 или 106 EID50 на одну утку. Одна группа была ложно инфицирована VTM. У птиц брали кровь в дни 7 и 14 после инфицирования из бедренной вены. Образцы сыворотки анализировали на наличие вирус-специфических антител в тесте HI как описано выше.
I. Определение патогенности у уток и цыплят
Во время данных экспериментов у цыплят и уток не наблюдалось клинических признаков. При вскрытии у трех инфицированных цыплят было обнаружено незначительное увеличение поджелудочной железы и воспаление двенадцатиперстной кишки в дни 2 и 4 после инфицирования. Во всех группах не было обнаружено никаких других заметных поражений.
Серологический ответ исследовали в дни 2, 4, 7, 14 и 28 после инфицирования путем определения титров HI в сыворотке (фигура 4). Образцы сыворотки инфицированных APMV-8 цыплят показали положительные титры HI (≥16), начиная с дня 7 после инфицирования (5/5, GMT: 111), 14 дня после инфицирования. (5/5, GMT: 48), и 28 дня после инфицирования (5/5, GMT: 48). Образцы сыворотки инфицированных APMV-8 уток также показали положительные титры HI (≥16) в дни 7 (5/5, GMT 21), 14 (5/5, GMT 28) и 28 (4/5, GMT 14) после инфицирования. Диапазон титров HI для цыплят составил от 32 до 256, тогда как для уток диапазон был от 16 до 64. Ложно инокулированные птицы обоих видов оставались отрицательными на наличие HI антител против APMV-8 во всех временных точках исследования.
Для определения участков размножения вируса у цыплят и уток было проанализировано несколько органов (трахея, легкие, двенадцатиперстная кишка и поджелудочная железа) на наличие инфекционного вируса путем выделения вируса из зародышей яиц (фигура 7). У цыплят APMV-8 был получен в день 2 после инфицирования из трахеи, легких и двенадцатиперстной кишки. В день 4 после инфицирования APMV-8 был выделен из всех проанализированных органов, тогда как в день 7 после инфицирования APMV-8 был выделен только из поджелудочной железы. В дни 14 и 28 после инфицирования ни из одного органа вирус выделить не удалось. Из ложно инокулированных птиц вирус выделить не удалось. Идентичность повторно выделенного вируса была подтверждена в тесте HI с использованием стандартной сыворотки, предоставляемой NVSL. Ни из одной собранной ткани уток не было выделено вируса ни в одной из временных точек даже после двух субпассажей в 9-дневные зародыши SPF куриных яиц. Таким образом, были проведен дизайн праймеров на основе доступной информации о последовательности APMV-8 для выявления присутствия вирусной РНК в собранных образцах тканей (фигура 7). В день 2 после инфицирования вирусная РНК была обнаружена в трахее (фигура 6), кишечнике и поджелудочной железе, тогда как в день 4 после инфицирования вирусная РНК была обнаружена во всех проанализированных органах. В дни 7, 14 и 28 после инфицирования вирусная РНК была обнаружена только в трахее и легких. ОТ-ПЦР с использованием РНК, полученной из органов ложно инокулированных птиц, не привела к амплификации ОТ-ПЦР фрагмента, что говорит об отсутствии APMV-8 у этих птиц.
Для оценки патологического потенциала исследуемого вируса органы были проанализированы на наличие микроскопических повреждений (фигура 8). В день 2 после инфицирования у всех инфицированных цыплят был обнаружен слабый многоочаговый пролиферативный трахеит. В остальных органах не было обнаружено отличий от контрольной группы. Инфицированные APMV-8 цыплята продемонстрировали фокальное восстановление или регенерацию респираторного эпителия в трахее в день 4 после инфицирования, что указывает на заживление. Кроме того, эти птицы также демонстрировали слабый многоочаговый лимфоцитарный панкреатит, что указывает на вирусную инфекцию. Инфицированные цыплята демонстрировали изменения в легких в день 7 после инфицирования, такие как от умеренного до тяжелого BALT, изменения в трахее, такие как катаральный трахеит, и многоочаговый лимфоцитарный панкреатит. Эти наблюдения также согласуются с антигенной стимуляцией. В день 14 после инфицирования у инфицированных цыплят наблюдались изменения в трахее, свидетельствующие о заживлении, и изменения в поджелудочной железе, такие как лимфоцитарный панкреатит, позволяющие сделать заключение о вирусной инфекции. В день 28 после инфицирования наблюдались только слабый катаральный трахеит и слабый энтерит у некоторых инфицированных цыплят. У инфицированных уток наблюдались многоочаговый слабый лимфоцитарный трахеит, изменения в легких (интерстициальная пневмония) и изменения в кишечнике (лимфоцитарный энтерит) в день 2 после инфицирования, тогда как изменения в трахее, свидетельствующие о респираторной инфекции, были видны в день 4 после инфицирования. В день 7 после инфицирования у инфицированных уток наблюдались лимфоцитарный трахеит и панкреатит, свидетельствующие о вирусной инфекции, тогда как наблюдаемый катаральный трахеит позволял сделать вывод о заживлении в день 14 после инфицирования. Кроме того, инфицированные утки демонстрировали лимфоцитарный панкреатит в день 14 после инфицирования. Позже, в день 28 после инфицирования у инфицированных уток в легких отмечались гиперплазия BALT и также слабый многоочаговый нейтрофильный трахеит. Оба патологических микроскопических поражения свидетельствовали о вирусной инфекции. У неинфицированных контрольных птиц не наблюдалось никаких изменений в исследуемых органах.
J. Определение минимальной дозы, необходимой для индукции иммунного ответа
Для определения минимальной инфекционной дозы, которая необходима для индукции сероконверсии у цыплят, для инфицирования десяти однодневных SPF цыплят использовались десятикратные разведения APMV-8 (фигура 9). Для теста HI использовали 4 единицы НА, в результате чего порог, равный 16, рассматривался как положительный. Образцы сыворотки, взятые в день 14 после инфицирования, показали, что доза EID50, составляющая 103, была достаточной для индукции иммунного ответа у 4/10 цыплят, что рассматривалось как положительный результат (GMT 11). В день 14 после инфицирования дозой EID50 104 девять из десяти птиц показали титр ≥16 (GMT 34). Инфицирование дозами EID50 105 и 106 индуцировало титр HI≥16 в день 14 после инфицирования у всех птиц с GMT 73 и 137 соответственно.
На основании этих результатов по 8 уток в каждой группе были инфицированы APMV-8, начиная с дозы EID50 103 на птицу до дозы EID50 106 на птицу (фигура 10). Шесть из восьми уток показали значительные титры (≥16) через 14 дней после инфицирования с GMT 14 при инфицировании дозой EID50 104/птицу. В день 14 после инфицирования 6/8 уток, инфицированных дозой EID50 105/птицу, и 7/8 уток, инфицированных дозой EID50 106/птицу, показали значительные титры (≥16) с GMT 17 и 23 соответственно.
Пример 3. Определение полноразмерной последовательности APMV-8
Для определения полноразмерной последовательности APMV-8 сначала необходима информация о последовательности вирусной РНК. Для этого был клонирован 3'-конец вирусного генома с использованием праймера (APMV-polyT, смотри таблицу 1), который содержал вырожденную последовательность, основанную на доступных 3'-последовательностях APMV1 (Genbank accession No. AF077761), APMV-2 (Genbank accession No. EU338414), и APMV-6 (Genbank accession No. EF569970). Вирусная РНК была очищена из аллантоисной жидкости с использованием набора High Pure RNA isolation kit (Roche, Mannheim, Germany). Данная последовательность была амплифицирована с использованием 5' RACE System для быстрой амплификации концов кДНК Version 2.0 (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Было получено несколько фрагментов, которые элюировали из геля и клонировали в вектор для клонирования Торо ТА (Invitrogen), после чего положительные клоны, отобранные в результате селекции, были просеквенированы. Полученные нуклеотидные последовательности были проанализированы с использованием программы nblast search по базе данных NCBI, что не выявило сходства. Анализ tblastx search по базе данных NCBI показал сходство на 83% с нуклеопротеином из парамиксовируса 2 птиц (APMV-2/Chicken/California/Yucaipa/56, Genbank accession No. EU338414) и сходство на 56%>со штаммом парамиксовируса 6 птиц (APMV-6/Goose/FarEast/4440/2003, Genbank accession No. EF569970). С использованием этого праймера был применен метод блуждающего праймера с использованием 5' RACE System для быстрой амплификации концов кДНК Version 2.0 (Invitrogen). При проведении 5'-RACE был получен фрагмент размером примерно 800 п.о. С использованием этого метода была получена новая информация о последовательности на основе информации о последовательности из предыдущих последовательностей, которая была использована для создания новых олигонуклеотидов. 5'-Конец вирусного генома был также определен методом 5'-RACE. 3'-Конец вирусного генома был получен после лигирования РНК с использованием Т4 РНК-лигазы 1 (New England Biolabs). Продукт реакции лигирования был снова очищен с использованием набора High Pure RNA isolation kit (Roche) и была проведена ОТ-ПЦР с использованием набора Superscript III One Step RT-PCR kit с Platinum Taq (Invitrogen). Полученный фрагмент кДНК был клонирован в вектор pCR2.1 (Invitrogen) и секвенирован. Три плазмиды из каждого клонированного фрагмента были просеквенированы в обоих направлениях, в результате чего каждый нуклеотид в последовательности был прочитан 6 раз.
Полноразмерная геномная последовательность анализируемого штамма APMV-8 составила 15342 нуклеотида, что согласуется с «правилом шести» (Calain, Р. & Roux, L., 1993) для Paramyxovirinae. Было выявлено шесть открытых рамок считывания (ORF), кодирующих белки. Порядок белков был определен как 3'-NP-P-M-F-HN-L-5' (геномная последовательность SEQ ID NO:1 является антигеномной (антисмысловой) и имеет направление от 5' к 3') с использованием подобия белковых последовательностей с белками других парамиксовирусов птиц. Предполагаемые старт- и стоп-кодоны в открытых рамках считывания и теоретический молекулярный вес белков (сайт Swiss Institute of Bioinformatics ExPASy) показаны в таблице 2.
Таблица 2 | |||
Параметры белков, кодируемых последовательностью APMV-8 | |||
Белок | Старт кодон | Стоп кодон | Теоретический молекулярный вес (кДа) |
Нуклеопротеин (NP) | 141-143 | 1524-1526 | 51,2 |
Фосфопротеин (Р) | 1693-1695 | 2908-2910 | 43,5 |
Матрикспротеин (М) | 3076-3078 | 4193-4195 | 40,6 |
Фьюженпротеин (F) | 4499-4501 | 6128-6130 | 58,5 |
Гемагглютинин/нейраминидаза (HN) | 6383-6385 | 8114-8116 | 63,5 |
Полимераза (L) | 8273-8275 или 8297-8299 | 15011-15013 | 254,6 253,6 |
Предполагаемые геномные лидерные и трейлерные последовательности были определены путем определения предполагаемого начала гена для гена NP (лидер) и предполагаемой последовательности конца гена белка L (трейлер). Лидерная последовательность располагается от нуклеотида 1 до нуклеотида 55. Предполагаемая последовательность начала гена (нуклеотиды 56-63) гена NP завершает лидерную последовательность. Трейлерная последовательность локализована позади последовательности конца последнего гена в вирусном геноме. Из-за наличия двух возможных последовательностей конца гена для гена РНК Полимеразы (нуклеотиды 15161-15171 или 15288 -15297) были идентифицированы две предполагаемые трейлерные последовательности (нуклеотиды 15172-15342 или 15289-15342). Локализация предполагаемых последовательностей начала генов (последовательности, содержащие поли-G) и последовательностей концов генов (сигнальная последовательность для полиаденилирования) и межгенные последовательности показаны в таблице 3.
Таблица 3 | |||
Последовательности и расположение предполагаемых начальных участков генов, межгенных участков и концов генов в последовательности APMV-8 | |||
Ген | Начало гена | Конец гена | межгенные участки |
Нуклеопротеин | 56-63 | 1615-1625 | 1626-1627 |
Фосфопротеин | 1628-1635 | 2991-3001 | 3002-3031 |
Матрикспротеин | 3032-3039 | 4404-4416 | 4417-4441 |
Фьюженпротеин | 4442-4449 | 6260-6271 | 6272-6278 |
Гемагглютинин/нейраминидаза | 6279-6287 | 8261-8273 | 8274-8275 |
РНК Полимераза | 8275-8283 | 15161-15171 или 15288-15297 |
Таблица 4 | ||
SEQ ID NO для последовательностей ДНК и белков. | ||
SEQ ID NO | Название гена | Тип |
1 | APMV-8 геномная последовательность | ДНК или РНК |
2 | APMV-8 Нуклеопротеин (NP) | ДНК или РНК |
3 | APMV-8 Нуклеопротеин (NP) | Белок |
4 | APMV-8 фосфопротеин (Р) | ДНК или РНК |
5 | APMV-8 фосфопротеин (Р) | Белок |
6 | APMV-8 Матрикспротеин (М) | ДНК или РНК |
7 | APMV-8 Матрикспротеин (М) | Белок |
8 | APMV-8 Фьюженпротеин (F) | ДНК или РНК |
9 | APMV-8 Фьюженпротеин (F) | Белок |
10 | APMV-8 Гемагглютинин/нейраминидаза (HN) | ДНК или РНК |
11 | APMV-8 Гемагглютинин/нейраминидаза (HN) | Белок |
12 | APMV-8 Полимераза (L) ДНК | ДНК или РНК |
13 | APMV-8 Полимераза (L) белок 1 | Белок |
14 | APMV-8 Полимераза (L) белок 2 | Белок |
Предполагаемые последовательности начальных участков генов для APMV-8 были консервативными и содержали поли-(С)5 последовательность, расположенную перед последовательностью 3'-GCU-5'. Единственным исключением является предполагаемая последовательность начала гена для вирусной РНК-Полимеразы (3'-CUCCCGCU-5'). Предполагаемые последовательности концов генов были также консервативными и содержали поли-(U)6 последовательность на 5'-последовательности генома вируса (таблица 5).
Таблица 5 | |||
Последовательности начальных участков генов и концов генов в APMV-8 | |||
Название гена | Последовательности (5-3' антигеномная (антисмысловая) ориентация) | SEQ ID NO | |
Начало гена | NP ген | CCCCCGCUUCUGUCA | 24 |
Р ген | CCCCCGCUGGAGUUA | 25 | |
М ген | CCCCCGCUUCUGUGC | 26 | |
F ген | CCCCCGCUUUAGAAC | 27 | |
HN ген | CCCCCGCUGGGUAAA | 28 | |
L | CUCCCGCUGGAGAUG | 29 | |
Конец гена | NP ген | AACUAAAUUCUUUUUU | 30 |
Р ген | UAACUAAUUCUUUUUU | 31 | |
М ген | AGGAUUAAUAUUUUUU | 32 | |
F ген | CUAUAAAUUAUUUUUU | 33 | |
HN ген | UACUUAAUUCUUUUUU | 34 | |
L ген(1) | ACUAAAAUUCUUUUUU | 35 | |
L ген (2) | UUAUUGAUUUUUUUUU | 36 |
Эти последовательности были предсказаны на основании последовательностей, которые были описаны для других парамиксовирусов из рода Avulavirus (Chang et al., 2001, Nayak et al, 2008, Jeon et al., 2008). Имеется два возможных стартовых кодона для открытой рамки считывания (ORF) РНК Полимеразы. Первый стартовый кодон (нуклеотиды 8273-8275) локализован в участке конец гена-межгенный участок-начало гена между ORF HN и ORF вирусной РНК Полимеразы. Это делает этот стартовый кодон маловероятным, но не невозможным. Второй стартовый кодон (8297 -8299) расположен ниже участка конец гена-межгенный участок-начало гена и может работать как инициирующий кодон для начала трансляции РНК-Полимеразы APMV-8.
Геном APMV-8 имеет длину 15342 нуклеотида. Это больше, чем APMV-1 (SQ ID NO:15, 15186 нуклеотидов, de Leeuw & Peeters, 1999), APMV-2 (SEQ ID NO:16, 14,904 нуклеотида, Subbiah et al., 2008) и APMV-4 (SEQ ID NO:18, 15054 нуклеотида, Nayak et al., 2008), и меньше чем APMV-3 (SEQ ID NO:17, 16,272 нуклеотида, Kumar et al., 2008) и APMV-9 (SEQ ID NO:20, 15,438 нуклеотидов, Samuel et al., 2009). Длина лидерной последовательности, состоящей из 55 нуклеотидов, вероятно, является консервативной для всех APMV (Krishnamurthy & Samal, 1998, de Leeuw & Peeters, 1999, Subbiah et al., 2008, Nayak et al., 2008, Kumar et al., 2008, Samuel et al., 2009), тогда как трейлерная последовательность, по-видимому, является вариабельной по длине. Последовательности начала генов и конца генов вирусных генов также были высококонсервативны для APMV-8 (как показано в таблице 5). Это также описано для последовательностей APMV-2 (Subbiah et al, 2008), APMV-3 (Kumar et al, 2008), APMV-4 (Jeon et al., 2008, Nayak et al, 2008), APMV-6 (Chang et al, 2001), и недавно для APMV-9 (Samuel et al., 2009). Число нуклеотидов в полноразмерной последовательности кратно шести, что согласуется с «правилом шести» для геномов парамиксовирусов (Kolakofsky et al., 1998).
Идентичность последовательностей между последовательностями геномов APMV-1, 2, 3, 4, 6, 8 и 9 показана в таблице 6.
Таблица 6 | ||||||||||||
Процент идентичности последовательности между геномами APMV-1,2,3,4, 6, 7, 8 и 9 | ||||||||||||
APMV | 1 | 2 | 3 | 4 | 6 | 7 | 8 | 8 | 8 | 8 | 9 | |
SEQ ID NO | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 1 | 37 | 38 | 39 | 40 | |
8 | 1 | 48 | 61 | 47,2 | 47,6 | 52 | 53 | 100 | 99,1 | 96,5 | 96,4 | 48 |
Процент идентичности последовательностей между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или полипептидов определяется с использованием программы Vector NTI 11.0 (PC) software package (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA). Для определения процента идентичности двух нуклеиновых кислот используются gap opening penalty 15 и gap extension penalty 6,66. Для определения процента идентичности двух полипептидов используются gap opening penalty 10 и gap extension penalty 0,1. Процент идентичности рассчитывается на основе более короткой последовательности.
Пример 4. Вакцинация однодневных цыплят-бройлеров штаммом APMV-8
Двадцать однодневных цыплят были разделены на две группы, как показано ниже в таблице 7.
В день 1 у однодневных цыплят брали кровь для определения статуса антител против вируса болезни Ньюкасла (NDV) и APMV-8 с использованием определения ингибирования гемагтлютинации (тест HI). Тест проводили с использованием аллантоисной жидкости из SPF яиц, инфицированных либо штаммом Lasota NDV, либо APMV-8. Для теста HI использовали четыре НА единицы штамма Lasota NDV или APMV-8 и 1% эритроцитов цыплят. Полученные HI титры показывают, что сыворотка цыплят содержала HI антитела против NDV, но не содержала определяемых количеств антител против вируса APMV-8.
Таблица 7 | ||
Инфицирование/вакцинация однодневных цыплят-бройлеров | ||
Обработка | Группа 1 (десять однодневных цыплят) | Группа 2 (контроль) (десять однодневных цыплят) |
День 1: вакцинация штаммом APMV-8 | Да | Нет |
День 14: HI тест | Да | Да |
День 14: вторая вакцинация штаммом APMV-8 (бустер) | 5 цыплят (группа 1-1): 2ая вакцинация/1ая вакцинация. 5 цыплят (группа 1-2): нет 2ой вакцинации /1ая вакцинация | 5 цыплят (группа 2-1): 2ая вакцинация 5 цыплят (группа 2-2): не вакцинировали |
День 28: HI тест | Да | Да |
В день 1 группа 1 из 10 цыплят была инфицирована через нос в дозе 106 EID50 штаммом APMV-8, группа 2 из 10 цыплят не была инфицирована и выступала в качестве контроля.
Через 14 дней после инфицирования (день 14) у цыплят брали кровь, и полученные образцы сыворотки снова анализировали на наличие HI антител против NDV и APMV-8 (фигура 20). Результаты показали, что вакцинированные APMV-8 цыплята показывают HI титры с использованием APMV-8 в качестве антигена. Специфические к APMV-8 HI тиры были между 128 и 2048. Титры HI против NDV снижались до HI титра ниже 16, следовательно, они не рассматривались как NDV-положительные. Результаты показали, что цыплята, получившие от матери антитела против NDV, не избегали инфицирования APMV-8, таким образом, интерференция таких антител с вакцинацией APMV-8 является маловероятной.
Через 14 дней после инфицирования (день 14) цыплята в группе 1 и группе 2 были разделены. По пять цыплят из группы 1 (группа 1-1) и из группы 2 (группа 2-1) были снова инфицированы в дозе 106 EID50 штаммом APMV-8 (таблица 7), а оставшиеся пять цыплят в каждой группе (группа 1-2 и группа 2-2) инфицированы не были. Этот эксперимент был проведен для того, чтобы исследовать, будет ли более позднее заражение влиять на инфекцию, и будет ли второе инфицирование (бустер-вакцинация) увеличивать титр антител. Через четырнадцать дней (день 28) у всех цыплят снова брали кровь, и исследовали сыворотку на наличие антител против APMV-8 и NDV. Титры сыворотки (фигура 21) показали, что первая вакцинация в день 14 (группа 2-1) индуцировала титры специфических антител против APMV-8, находящиеся в диапазоне от 32 до 512. У цыплят, вакцинированных только в день 1 (группа 1-2), титры антител упали до уровня между 128 и 512. У цыплят, которые были вакцинированы в день 1 и в день 14 (группа 1-1), титр антител, специфических для APMV-8, не увеличился, что позволяет предполагать, что используемый для второй вакцинации вирус был нейтрализован антителами, специфическими для APMV-8, индуцированными первой инфекцией. Сыворотка невакцинированных контрольных цыплят (группа 2-2) не содержала HI антител, специфических для APMV-8. В день 28 содержание антител против NDV снизилось еще больше, только 11 цыплят из 20 показали какие-либо титры HI с антигеном NDV, тогда как в день 14 четырнадцать цыплят демонстрировали низкие титры антител против NDV.
Пример 5. In ovo вакцинация зародышей SPF яиц
Это исследование было проведено с целью выяснения, будет ли вакцинация с APMV-8 in ovo приводить к ответу антител у цыплят, и будет ли вакцинация in ovo влиять на их вылупляемость и жизнеспособность.
В исследовании 1, 108 SPF яиц были вакцинированы in ovo вирусом штамма APMV-8 с использованием INOVOJECT (Pfizer Animal Health, NY, USA) в день 18 инкубации. Вирус был разведен стерильным 0,9% раствором NaCl. Обратное титрование разведенного вируса показало титр 105,5 EID50 /100 мкл. В качестве контроля 108 яиц инокулировали стерильным 0,9% раствором NaCl. Объем введения составил 100 мкл на одно яйцо. В контрольной группе вылупилось восемьдесят цыплят, а в вакцинированной APMV-8 группе вылупилось сорок пять цыплят. По десять цыплят из каждой группы пересадили в отдельные клетки Horsefall-Bauer. Кроме того, цыплята из вакцинированной APMV-8 группы и пять цыплят из контрольной группы были посажены вместе в одну клетку Horsefall-Bauer для проверки возможности передачи APMV-8 после вакцинации. Вода и корм предоставлялись ad libitum. Через четырнадцать и через двадцать восемь дней после вылупления были взяты образцы крови и протестированы на присутствие HI антител против APMV-8 с использованием 4 единиц НА и 1% раствора эритроцитов цыплят. Результаты (фигура 22) показали, что вакцинация in ovo в день 18 инкубации яиц вызывает иммунный ответ, на что указывает присутствие титров HI в протестированных образцах сыворотки. Через четырнадцать дней после вылупления наблюдались титры HI от 256 до 4048 у группы, вакцинированной in ovo. В сыворотке контрольных цыплят, контактировавших с вакцинированными цыплятами, через 14 дней после начала контакта наблюдались HI титры от 256 до 2048, что говорит о распространении вируса, применявшегося для вакцинации. В контрольной группе не было обнаружено HI титра, специфического для APMV-8. Еще через четырнадцать дней у цыплят снова брали кровь, в которой были обнаружены титры от 256 до 4096 в вакцинированной APMV-8 группе и от 256 до 1024 в группе, контактировавшей с вакцинированными APMV-8 цыплятами. В контрольной группе HI антител против APMV-8 обнаружено не было.
В исследовании 2, 88 SPF (свободных от специфического антигена) яиц были вакцинированы in ovo с использованием INOVOJECT в день 19 инкубации. Штамм вируса APMV-8 был разведен стерильным 0,9% раствором NaCl. Титр вируса составил 105,75 EID50 /100 мкл, как показало обратное титрование разведенного вируса. В качестве контроля 88 SPF яиц инокулировали стерильным 0,9% раствором NaCl. Объем введения составил 100 мкл на одно яйцо. В контрольной группе (NaCl) вылупилось семьдесят четыре цыпленка, а в группе, вакцинированной APMV-8, вылупилось семьдесят шесть цыплят. По десять цыплят из каждой группы пересадили в отдельные клетки Horsefall-Bauer. Вода и корм предоставлялись ad libitum. Через четырнадцать дней после вылупления были взяты образцы крови и протестированы на присутствие HI антител против APMV-8 с использованием 4 единиц НА и 1% раствора эритроцитов цыплят. Результаты (фигура 23) показали, что вакцинация in ovo в день 19 инкубации яиц приводит к иммунному ответу с HI титрами, специфическими для APMV-8. Через четырнадцать дней после вылупления в группе, вакцинированной APMV-8 in ovo, наблюдался титр HI от 256 до 4048. В контрольной группе не наблюдалось какого-либо титра, специфичного для APMV-8. В день 28 после вылупления у цыплят снова была взята кровь. Титры HI в группе, вакцинированной APMV-8, составили от 512 до 4096 (фигура 23), тогда как сыворотка контрольных цыплят все еще оставалась отрицательной в отношении APMV-8.
В третьем исследовании по 108 SPF яиц в группе 1 и группе 2 были вакцинированы in ovo с использованием INOVOJECT в день 18 инкубации в дозах 103,5 EID50 и 104,5 EID50 соответственно. Штамм вируса APMV-8 был разведен стерильным 0,9% раствором NaCl. В третьей группе 108 SPF яиц были инокулированы стерильным 0,9% раствором NaCl в качестве контроля. В группе 1 вывелось восемьдесят три цыпленка, в группе 2 вывелось семьдесят девять цыплят, и в группе 3 вывелось восемьдесят восемь цыплят (смотри таблицу 8). После вылупления по десять цыплят из каждой группы пересадили в отдельные клетки Horsefall-Bauer. Вода и корм предоставлялись ad libitum. После вылупления десять цыплят из группы 3 были вакцинированы подкожно в шею с использованием 100 мкл 106 EID50 вируса APMV-8. Через четырнадцать дней после вылупления были взяты образцы крови и протестированы на наличие HI антител против APMV-8 с использованием 4 единиц НА и 1% раствора эритроцитов цыплят. Результаты (фигура 24) показали, что вакцинация in ovo в день 18 инкубации приводит к иммунному ответу с титрами HI, специфическими для APMV-8. Через 14 дней после вылупления у группы, вакцинированной in ovo вирусом APMV-8, наблюдались титры HI от 4096 до 16384. В контрольной группе титра HI антител, специфических для APMV-8, обнаружено не было. Группа, вакцинированная APMV-8 подкожно, показала сероконверсию с титром в диапазоне от 64 до 4096. В день 28 после вылупления у цыплят снова брали кровь и тестировали на наличие HI антител, специфических для APMV-8. Титры HI через четыре недели после вылупления снизились и находились в диапазоне от 512 до 4096. В контрольной группе не было обнаружено титра HI, специфического для APMV-8. Титр HI в труппе, которая была вакцинирована подкожно, находился в диапазоне от 32 до 256.
Таблица 8 | |||
Группа 1 | Группа 2 | Группа 3 (контроль) | |
SPF яйца | 108 | 108 | 108 |
Вылупившиеся цыплята | 83 | 79 | 88 |
Вакцинация с АРМУ-8 в день 18 инкубации | 103,5 EID50 100 мкл на 1 яйцо | 104,5 EID50 100 мкл на 1 яйцо | 0,9% стерильный раствор NaCl |
Пример 6. Разработка системы обратной генетики для штамма APMV-8 и создание мутантов APMV-8, экспрессирующих гетерологические гены
Конструирование и экспрессия плазмид, содержащих гены NP, Р, и L вируса APMV-8
Для создания обратной генетической системы для парамиксовирусов необходимо создание плазмид, экспрессирующих белки, участвующие в репликации вирусной РНК. Открытые рамки считывания (ORF) для трех белков APMV-8 (Нуклеопротеин NP, Фосфопротеин Р, белок РНК-зависимая РНК-полимераза или белок L) были клонированы в эукариотический экспрессионный вектор pcDNA3 (Invitrogen, California, USA). Для этого РНК из аллантоисной жидкости, содержащей APMV-8, была очищена с использованием набора High Pure RNA Isolation Kit (Roche, Basel, Switzerland). Очищенная РНК была использована для обратной транскрипции в полимеразной цепной реакции ОТ-ПЦР с использованием набора Titan One Tube RT-PCR Kit (Roche). Открытые рамки считывания белков были амплифицированы с использованием подходящих пар праймеров [NP (NP-FP, NP-RP), Р (P-FP, P-RP), L (L-FP, L-RP), смотри таблицу 9]. Продукты реакции разделяли в 0,7% агарозном геле и элюировали из геля с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с инструкциями производителя. Фрагменты, полученные с помощью ОТ-ПЦР, инкубировали с подходящими ферментами рестрикции (NP и Р с Eco RI/NotI; L с Kpn I/NotI), снова элюировали из геля и лигировали в эукариотический экспрессионный вектор pcDNA3, расщепленный соответствующими ферментами рестрикции. Клетки Topi OF (Invitrogen) трансформировали продуктами реакции лигирования в, и плазмидную ДНК, выделенную из клеток Topi0F, расщепляли соответствующими ферментами рестрикции (смотри выше). Плазмиды, содержащие фрагменты ДНК (pcDNA-NP, pcDNA-Р, pcDNA-L) нужного размера, секвенировали.
Таблица 9 | ||||
Праймеры для амплификации генов для белков РНП комплексов | ||||
Название праймера |
Последовательность праймераа | Ориентацияb | Положение0 | SEQ ID NO: |
NP-FP-рс3 | Eco RI ccGAATTCArGTCATCTGTGTTCAATGAGTATCAGG | смысловой | 141-168 | 41 |
NP-RP-рс3 | Not I ccGCGGCCGCTTACCATTCTAGCCCGTTCTC GTATG | анти-смысловой | 1501-1526 | 42 |
P-RP-рс3 | Eco RI ccGAATTCATGGATTTCGCCAATGATGAAG | смысловой | 1693-1714 | 43 |
P-RP-рс3 | Not I ccGCGGCCGCTTACGCATTATATATTGCCTG CTTGACTCG | анти-смысловой | 2881-2910 | 44 |
L-FP-рс3 | Kpn I ccGGTACCATGGATATAAAACAAGTTGACCTG | смысловой | 8292-8320 | 45 |
L-RP-рс3 | Not I ccGCGGCCGCTTATTTCAACTTGATGATTGCACCG | анти-смысловой | 14989-15013 | 46 |
а Последовательность праймера содержит сайты для расщепления ферментом рестрикции, используемым для клонирования. Сайты рестрикции указаны и выделены жирным шрифтом. Старт и стоп кодоны выделены курсивом. Вирус-специфические последовательности подчеркнуты. b Ориентация последовательности праймеров дана в соответствии с вирусной информационной РНК. с Показано положение вирус-специфических последовательностей в полноразмерном геноме вируса. |
Конструирование плазмиды, содержащей полноразмерный геном APMV-8
Для создания плазмиды, содержащей полноразмерный геном APMV-8, была синтезирована кДНК генома вируса (Genscript, New York, USA) на основе созданных консенсусных последовательностей из двух разных частей (5'-FLG, З'-FLG, смотри фигуру 25). 5'-Часть (5'-FLG, SEQ ID NO:47) вирусной последовательности была синтезирована из нуклеотидов 1-5564. Предшествующая последовательность APMV-8 представляет собой последовательность кассеты, состоящей из промотора CMV-IE, расположенной за ним последовательности для расщепления ферментом рестрикции Xmal (для возможных последующих процедур клонирования) и последовательности «хаммерхед» рибозима (в виде головки молотка, hammerhead ribozyme). На 5'-конце и 3'-конце данной последовательности были добавлены сайты для расщепления ферментами
рестрикции Not I и SacII соответственно. Синтезированная 3'-часть (З'-FLG, SEQ ID NO:48) последовательности (нуклеотиды 5503-15342) завершалась последовательностью рибозима гепатита дельта и поли-А сигнальной последовательностью гормона роста быка. Для целей клонирования на 5'-конец З'-FLG была добавлена последовательность для расщепления ферментом рестрикции Not I, и на 3'-конце последовательности была добавлена последовательность для расщепления ферментом рестрикции Sac П.
В пределах перекрывающихся частей 5'-FLG и З'-FLG (нуклеотиды 5503-5564) находилась последовательность для уникального фермента рестрикции (Bmt I), который расщепляет последовательность по нуклеотиду 5541 полноразмерной последовательности. Обе части ДНК (5'-FLG, З'-FLG) были лигированы по отдельности в плазмиду pUC57 (Genscript) с получением плазмид pUC57/5'-FLG и pUC57/3'-FLG. Для клонирования вместе обоих фрагментов pUC57/5'-FLG была расщеплена ферментами Bmtl и Sac II и содержащая 5'-FLG плазмида была элюирована из геля. Параллельно pUC57/3'-FLG была расщеплена теми же ферментами и фрагменты З'-FLG были элюированы из геля. Затем З'-FLG был лигирован в содержащую 5'-FLG плазмиду для получения плазмиды, которая содержит полноразмерную последовательность кДНК генома APMV-8 под контролем промотора CMV-IE (pUC57-FL-APMV-8). Конструирование плазмиды, содержащей минигеном APMV-8
Плазмида, содержащая все функциональные элементы минигенома для APMV-8 (pMG-APMV-8), была сконструирована с использованием метода, описанного Conzelmann, et al. (J Virol. 68:713-719, 1994). Плазмида pMG-APMV-8 содержит трейлерный и лидерный участок генома APMV-8, который фланкирован промотором Т7 и последовательностью рибозима антигенома вируса гепатита дельта (Collins, et al., PNAS USA 88:9663-9667, 1991). После последовательности рибозима антигенома вируса гепатита дельта располагается последовательность терминатора транскрипции Т7. Между трейлерным и лидерным участками располагается кодирующая последовательность усиленного зеленого флуоресцентного белка в антисмысловой ориентации. Перед трейлерной последовательностью и сразу за промотором Т7 располагаются три дополнительных остатка G. Вставка была фланкирована сайтами расщепления ферментов рестрикции Eco RI и Not I и была клонирована по тупым концам в плазмиду pUC57. Эта конструкция была субклонирована в плазмиду pUC18. Для этого плазмида pMG-APMV-8 была расщеплена ферментами Eco RI и Hind III и нужный фрагмент был элюирован из геля и лигирован в расщепленную соответствующим образом плазмиду pUC18 для получения плазмиды puC18-MG-APMV-8. Наличие вставки было подтверждено секвенированием.
Создание экспрессионной плазмиды, обеспечивающей экспрессию Т7-полимеразы
Для создания плазмиды, кодирующей Т7 ДНК-зависимую РНК-полимеразу (Т7 полимеразу), кодирующая последовательность (GenBank accession number AY264778) была синтезирована с использованием Genscript. Последовательность Т7-полимеразы (SEQ ID NO:49) была модифицирована для оптимизации кодонов, используемых для экспрессии в эукариотической системе, и для удаления возможных донорных/акцепторных участков сплайсинга в последовательности. Последовательность, кодирующая Т7-полимеразу, была фланкирована сайтами для EcoRI (5') и NotI (3'). Синтезированный фрагмент был клонирован по тупым концам в вектор pUC57 (pCU57-Т7). Эта плазмида была расщеплена ферментами EcoRI/NotI и кодирующий Т7-полимеразу фрагмент был элюирован из геля. Затем данный фрагмент был клонирован в эукариотический экспрессионный вектор pcDNA3 (Invitrogen) для получения pcDNA3-T7. Наличие фрагмента в векторе pcDNA3-T7 было подтверждено секвенированием. Создание плазмиды для экспрессии усиленного зеленого флуоресцентного белка с использованием внутреннего сайта связывания рибосомы под контролем промотора Т7
Для тестирования функциональной активности Т7-полимеразы методом ПЦР была амплифицирована открытая рамка считывания усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) с использованием плазмиды pEGFP-Nl (Clontech, California, USA) и следующей пары праймеров:
EGFP-FP fCCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG) SEQ ID NO:50 и EGFP-RP CCCGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG) SEQ ID NO:51
Полученный ПЦР-фрагмент был элюирован из геля и проинкубирован с ферментами рестрикции BamHI и NotI. Продукт реакции был элюирован из геля и лигирован в соответствующим образом расщепленный вектор pCITE 4А (Novagen). Полученная плазмида (pCITE4A-EGFP) была использована в последующих экспериментах. Плазмиды pCITE4A-EGFP и pcDNA3-T7 были трансфецированы по отдельности или вместе в клеточную линию кур DF1, выращиваемую в 24-луночных планшетах, с использованием Lipofectin 2000 (Invitrogen). Через двадцать четыре часа после трансфекции среду удаляли и добавляли стерильный фосфатный буферный раствор (PBS). Клетки исследовали с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 40 CFL (Zeiss, Jena, Germany). Зеленая флуоресценция наблюдалась только в лунках планшета с культурой клеток, которые были одновременно трансфецированы обеими плазмидами. Результаты говорят о том, что обе плазмиды, pCITE4A-EGFP и pcDNA3-T7, были функционально активны.
Подтверждение функциональной активности вирусных белков NP. Р и L. экспрессированных с использованием минигеномной плазмиды
Клетки DF1 были котрансфецированы pcDNA3-T7, pUC18-MG-APMV-8, pcDNA-NP, pcDNA-P и pcDNA-L для подтверждения функциональной активности экспрессированных белков NP, Р и L. Через двадцать четыре часа после трансфекции среду удаляли и добавляли стерильный раствор фосфатного буфера (PBS). Клетки исследовали с использованием инвертированного флуоресцентного микроскопа Axiovert 40 CFL (Zeiss, Jena, Germany). Зеленая флуоресценция наблюдалась только в лунках планшета с культурой клеток, которые были трансфецированы всеми 5 плазмидами. Эти результаты указывают, что экспрессированные вирусные белки NP, Р и L были функционально активны и обеспечивали транскрипцию минигенома APMV-8 в мРНК и экспрессию белка EGFP, кодируемого pUC18-MG-APMV-8.
Восстановление вируса AMPV8 из плазмиды, содержащей полноразмерную последовательность APMV-8
Клетки DF1 были котрансфецированы pUC57-FL-APMV-8, pcDNA-NP, pcDNA-P, и pcDNA-L. Через 48-96 часов супернатанты клеток DF1 инокулировали в 1-дневные зародыши яиц для размножения вируса. Через 3-5 дней собирали аллантоисную жидкость и тестировали на гемагглютинацию (НА) с использованием 1% раствора эритроцитов кур. Аллантоисная жидкость, положительная на НА активность, использовалась в трех исследованиях: 1) клетки DF1 инфицировались аллантоисной жидкостью и тестировались через 36 часов после инфекции с APMV-8-специфической антисывороткой на наличие экспрессии белков APMV-8 в непрямом иммунофлуоресцентном анализе. 2) Аллантоисная жидкость тестировалась на специфичность в отношении APMV-8 с использованием APMV-8-специфичной сыворотки кур (предоставлена National Central Veterinary Laboratory, Ames, Iowa, USA) в исследовании ингибирования гемагглютинации. 3) Восстановление вируса было установлено ОТ-ПЦР с использованием специфических для APMV-8 олигонуклеотидов. Отсутствие вирусной кДНК было подтверждено исключением стадии обратной транскрипции во время реакции. Образцы, положительные по всем трем тестам, далее размножались в зародышах SPF куриных яиц. Размножение APMV-8 в клетках, не являющихся куриными клетками
Клетки из разных видов животных [хомячка (клетки почек хомячка, Baby hamster kidney cells, клетки BHK-21), мартышки (Vero cells, клеточная линия, полученная из почек Африканской зеленой мартышки), собаки (клетки почек собаки, Madin-Darby canine kidney cells, MDCK) и перепела (линия мышечных клеток перепела, Quail muscle cell line QM7)] выращивали в 24-луночных планшетах для культивирования тканей и инфицировали многочисленными инфекциями 0,01. Клетки фиксировали ледяным этанолом через 24 часа после инфекции и анализировали на наличие специфических для APMV-8 белков с помощью непрямой иммунофлуоресценции с использованием специфичной к APMV-8 антисыворотки из инфицированных APMV-8 SPF цыплят. Связывание антител визуализировали с использованием ФИТЦ-конъюгата козы, специфичного против IgY цыплят. Неинфицированные клетки использовались в качестве отрицательного контроля. Зеленая флуоресценция наблюдалась только в инфицированных APMV-8 клетках. Это указывает на то, что APMV-8 был способен инфицировать клетки из других видов животных, а не только клетки кур.
Репликация APMV-8 была увеличена в присутствии трипсина. Клетки MDCK были инфицированы APMV-8, как описано выше. После инфекции клетки промывали бессывороточной средой и переносили либо в бессывороточную среду, содержащую трипсин в концентрации 1 мкг/мл, либо в бессывороточную среду без трипсина. Через двадцать четыре, сорок восемь и девяносто шесть часов после инфекции супернатанты клеток удаляли и в клетках DF1 определяли TCID50 с использованием непрямой иммунофлуоресценции, как описано выше. Полученные данные указывают на то, что в присутствии трипсина APMV-8 реплицируется до более высокого титра, чем в отсутствие этого фермента (фигура 19 В).
Результаты этого эксперимента показали, что подобно AMPV-1, APMV-8 способен проникать в клетки разных видов и инициировать свой репликационный цикл. Таким образом, он представляет собой вектор, подходящий для множества видов. Получение рекомбинантного вируса APMV-8, экспрессирующего чужеродные гены, с использованием системы обратной генетики
Для создания рекомбинантного вируса APMV-8 (вирусного вектора), экспрессирующего ген гемагглютинина (НА) высокопатогенного птичьего гриппа (HPAI), кодирующая последовательность гена НА подтипов Н5 или Н7 вируса HPAI была вставлена в несущественные участки, например, между генами М и F или между генами Р и М генома APMV-8, в плазмиду, содержащую полноразмерный геном APMV-8. Для этой цели кодирующая последовательность открытой рамки считывания гемагглютинина фланкировалась всеми необходимыми регуляторными последовательностями гена F, которые включали последовательность старта гена, 5'-некодирующую последовательность, 3'-некодирующую последовательность и последовательность конца гена. Конструкция была синтезирована таким образом, чтобы сайты расщепления ферментами рестрикции Bsu 361 и Nhe I можно было использовать для лигирования нужного фрагмента в существующую плазмиду, содержащую полноразмерный геном APMV-8, за счет их уникальности в плазмидной конструкции. Полученная плазмида представляла собой желаемую траскрипционную плазмиду, которая содержит ген гемагглютинина в несущественном участке полноразмерного генома APMV-8. С использованием этого подхода можно клонировать кодирующие последовательности множества вирусных и бактериальных антигенов в каркас последовательности APMV-8. Другие возможные антигены, которые могут быть вставлены в геном APMV-8, представляют собой слитый белок вируса болезни Ньюкасла, S-белок вируса птичьего бронхита, другие гены гемагглютинина вирусов птичьего гриппа, отличные от Н5 и Н7, ген структурного белка VP1 вируса куриной анемии, гены гликопротеинов из вируса инфекционного ларинготрахеита.
Пример 7. Вакцинация животных
Животные вакцинируются одним, двумя введениями или по схеме «прайм-буст» композицией или вакциной, содержащей рекомбинантный вирус APMV-8 (вирусный вектор), как описано в примере 6. Для цыплят/птиц проводятся разные режимы введения, например, введение in ovo в день 18 или день 19, подкожное введение однодневным птенцам, или мукозальное введение (спрей, питьевая вода, глазные капли) в разном возрасте. Дозировка составляет между 3 и 7 log10 (предпочтительно 4-6 log10 EID50). Для млекопитающих применяется мукозальный (интраназальный, интраокулярный, пероральный) или парентеральный (внутримышечный, подкожный, трансдермальное или внутрикожное введение без иглы) пути введения. Дозировки составляют от 5 до 9 log (предпочтительно 6-8 log). Обычно проводится два введения с интервалом в 3-4 недели. Гетерологический прайм-буст (например, бустерное введение белков) также является предпочтительным.
Эффективность защиты, индуцируемая композицией или вакциной, оценивается против специфического патогена, вводимого животным. Защитная эффективность оценивается путем клинических наблюдений и/или вирусной нагрузки специфического патогена в тканях, крови или мазках слизистых. Образцы крови вакцинированных животных берутся на разных стадиях и тестируются на серологию. Результаты показывают, что композиция или вакцина настоящего изобретения является иммуногенной и обеспечивает защиту вакцинированных животных.
Таким образом, познакомившись с детальным описанием предпочтительных воплощений настоящего изобретения, следует понимать, что настоящее изобретение, описанное выше, не ограничивается приведенными выше конкретными деталями, и что возможно множество очевидных вариаций настоящего изобретения без выхода за рамки или дух настоящего изобретения.
Все процитированные или упомянутые здесь документы («процитированные здесь документы») и все документы, процитированные или упомянутые в процитированных здесь документах, вместе с любыми инструкциями производителей, описаниями, спецификациями продуктов и технологическими картами для любых продуктов, упомянутых здесь или в любом документе, включенном в настоящее изобретение путем отсылки, являются также включенными в настоящее изобретение путем отсылки и могут применяться при осуществлении настоящего изобретения.
Ссылки:
Alexander, 1988. Newcastle disease, p.x, 378 p.In D. J. Alexander (ed.), Developments in veterinary virology. Kluwer Academic, Boston.
Alexander, Characterization of viruses which represent further distinct serotypes (PMV-8 and PMV-9) of avian paramyxoviruses. Arch Virol 78:29-36.
Alexander, et al., 1979. Properties of a newly isolated, serologically distinct avian paramyxovirus. Arch Virol 60:105-13.
Alexander, 2003. Newcastle Disease, other Paramyxoviruses, and Pneumovirus Avian Paramyxoviruses 2-9, p.63-99. In Y. M. Saif (ed.), Diseases of poultry, 11th ed. Iowa State Press, Ames, Iowa.
Andral, et al., 1984. Isolation of avian paramyxovirus 2 and 3 from turkeys in Brittany. Vet Rec 114:570-1.
Bankowski, et al., 1981, Effect of paramyxovirus yucaipa on fertility, hatchability, and poult yield of turkeys. Avian Dis 25:517-20.
Bankowski, et al., 1960. Isolation of an Unidentified Agent from the Respiratory Tract of Chickens. Science 132:292-293.
Bradshaw, et al., 1979. The Epidemiology of Yucaipa Virus in Relationship to the Acute Respiratory Disease Syndrome in Turkeys. Avian Diseases 23:539-542.
Capua, et al., 2004. Isolation of an avian paramyxovirus type 9 from migratory waterfowl in Italy. Vet Rec 155:156.
Chambers, et al., 1988. Protection of chickens from lethal influenza infection by vaccineexpressed hemagglutinin. Virology 167:414-421.
Collins, P. L., et al., 1991. Rescue of synthetic analogs of respiratory syncytial virus genomic RNA and effect of truncations and mutations on the expression of a foreign reporter gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9663-9667
Conzelmann KK, and Schnell M., 1994. Rescue of synthetic genomic RNA analogs of rabies virus by plasmid-encoded proteins. J Virol. 68:713-719
Darteil, R., M. Bublot, E. Laplace, J.F. Bouquet, J.C. Audonnet and M. Riviere (1995). Herpesvirus of turkey recombinant viruses expressing infectious bursal disease virus (IBDV) VP2 immunogen induce protection against an IBDV virulent challenge in chickens. Virology 211,481^90.
de Leeuw, et al., 1999. Complete nucleotide sequence of Newcastle disease virus: evidence for the existence of a new genus within the subfamily Paramyxovirinae. J Gen Virol 80:131-136. Fleury, et al., 1979. Isolation of twenty-three Yucaipa-like viruses from 616 wild birds in Senegal, West Africa. Avian Dis 23:742-4.
Gao, et al., (2006). Protection of mice and poultry from lethal H5N1 avian influenza virus through adenovirus-based immunization. J Virol 80:1959-1964.
Ge, et al., (2007) Newcastle disease virus-based live attenuated vaccine completely protects chickens and mice from lethal challenge of homologous and heterologous H5N1 avian influenza viruses. Journal of Virology, 81(1), 150-158.
Goodman, et al., 1988. Isolation of avian paramyxovirus-2 from domestic and wild birds in Costa Rica. Avian Dis 32:713-7.
Gough, et al., 1984. Avian paramyxovirus type 4 isolated from a ringed teal (Calonetta leucophrys). Vet Rec 115:653.
Hoelscher, et al., (2008). A broadly protective vaccine against globally dispersed clade 1 and clade2H5Nl influenza viruses. J Infect Dis. 197:1185-1188.
Huang, et al., (2004) A recombinant Newcastle Disease Virus (NDV) expressing VP2 protein of Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) protects against NDV and IBDV. Journal of Virology, 78, 10054-10063.
Hunt, et al., (1988). Retrovirus-expressed hemagglutinin protects against lethal influenza virus infections. J Virol 62:3014-3019.
Inoue K, Shoji Y, Kurane I, Iijima T, Sakai T, Morimoto K. (2003). An improved method for recovering rabies virus from cloned cDNA. J Virol Methods. 107:229-236. Krishnamurthy, et al., 1998. Nucleotide sequences of the trailer, nucleocapsid protein gene and intergenic regions of Newcastle disease virus strain Beaudette С and completion of the entire genome sequence. J Gen Virol 79:2419-2424.
Krishnamurthy, S., Huang, Z. & Samal, S. K. (2000) Recovery of a virulent strain of Newcastle disease virus from cloned cDNA: expression of a foreign gene results in growth retardation and attenuation. Virology, 278, 168-182.
Lamb, et al., 2007. Paramyxoviridae: The viruses and Their Replication, p.1449-1496. In B. N. Fields, D. M. Knipe, and P. M. Howley (ed.), Fields' virology 5th ed. Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia.
Lang, G., A. Gagnon, and J. Howell. 1975. The occurrence of Paramyxovirus yucaipa in Canadian poultry. Can Vet J 16:233-7.
Lipkind, et al., 1982. Isolation of yucaipa-like avian paramyxovirus from a wild mallard duck (Anas platyrhinchos) wintering in Israel. Vet Rec 110:15-6.
Lipkind, et al., 1979. The isolation of yucaipa-like paramyxoviruses from epizootics of a respiratory disease in turkey poultry farms in Israel. Vet Rec 105:577-8.
Maldonado, et al., (1995) Serological survey for avian paramyxoviruses from wildfowl in aquatic habitats in Andalusia. Journal of Wildlife Diseases, 31(1), 66-69.
Mayo, et al., 2002. A summary of taxonomic changes recently approved by ICTV. Arch Virol 147:1655-63.
Nayak B, et al., (2008). Molecular characterization and complete genome sequence of avian
paramyxovirus type 4 prototype strain duck/Hong Kong/D3/75. Virol J. 20;5:124.
Park, et al., (2006) Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: Avian influenza and
Newcastle disease. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(21), 8203-8208.
Peeters, et al., (1999) Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA: evidence that
cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. Journal of Virology, 73(6),
5001-5009.
Redmann, et al., 1991. [Isolation of a paramyxovirus-3 from turkeys with respiratory tract disease in Germany]. Dtsch Tierarztl Wochenschr 98:138-41.
Reed, et al., 1938. A SIMPLE METHOD OF ESTIMATING FIFTY PER CENT ENDPOINTS. Am. J. Epidemiol. 27:493-497.
Romer-Oberdorfer, et al., (1999) Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. Journal of General Virology, 80, 2987-2995.
Rosenberger, et al., (1974) Isolation of Newcastle disease and type-A influenza viruses from migratory waterfowl in the Atlantic flyway. Avian Diseases, 18(4), 610-613. Saif, et al., 1997. Natural and Experimental Infection of Turkeys with Avian Paramyxovirus-7. Avian Diseases 41:326-329.
Shihmanter, et al., 1998. Isolation of avian serotype 3 paramyxoviruses from imported caged birds in Israel. Avian Dis 42:829-31.
Shihmanter, et al., 1998. Avian paramyxoviruses serotype 3 isolated from captive birds in Israel: clinical signs, pathology, and antigenic characterization. Avian Dis 42:418-22. Shortridge, et al., 1980. Isolation and properties of viruses from poultry in Hong Kong which represent a new (sixth) distinct group of avian paramyxoviruses. J Gen Virol 49:255-262. Schultz-Cherry, et al., (2000). Influenza virus (A/HK/156/97) hemagglutinin expressed by an alphavirus replicon system protects chickens against lethal infection with Hong Kong-origin H5N1 viruses. Virology 278:55-59.
Stallknecht, et al., (1991) Avian paramyxoviruses from migrating and resident ducks in coastal Louisiana. Journal of Wildlive Diseases. 27:123-128.
Stanislawek, et al., (2002) Avian paramyxoviruses and influenza viruses isolated from mallard ducks (Anas platyrhynchos) in New Zealand. Archives of Virology, V147, 1287-1302. Tang M, et al., 2002. Recombinant adenovirus encoding the HA gene from swine H3N2 influenza virus partially protects mice from challenge with heterologous virus: A/HK/I/68 (H3N2). Arch Virol 147:2125-2141.
Taylor, et al., (1998). Protective immunity against avian influenza induced by a fowlpox virus recombinant. Vaccine 6:504-508.
Того, et al., (2007). Protective avian influenza in ovo vaccination with non-replicating human adenovirus vector. Vaccine 25:2886-2891.
Tumova, et al., 1979. A hitherto unreported paramyxovirus of turkeys. Res Vet Sci 27:135-40. Tumova, et al., 1989. Further evidence of the circulation of PMV-4 and influenza viruses with N2-1957 enzyme in the migratory waterfowls. Acta Virol 33:573-6.
Veits, et al., (2003). Deletion of the non-essential UL0 gene of infectious laryngotracheitis (ILT) virus leads to attenuation in chickens, and UL0 mutants expressing influenza virus haemagglutinin (H7) protect against ILT and fowl plague. J Gen Virol 84:3343-3352. Veits, et al., (2006) Newcastle disease virus expressing H5 hemagglutinin gene protects chickens against Newcastle disease and avian influenza. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103(21), 8197-8202.
Webster, et al., 1976. Ortho- and paramyxoviruses from migrating feral ducks: characterization of a new group of influenza A viruses. J Gen Virol 32:217-25.
Yamane, et al., 1982. Characterization of avian paramyxoviruses isolated from feral ducks in northern Japan: the presence of three distinct viruses in nature. Microbiol Immunol 26:557-68. Zhang, et al., 2007. Serological survey on prevalence of antibodies to avian paramyxovirus serotype 2 in China. Avian Dis 51:137-9.
Zhang, et al., 2006. Isolation, identification, and comparison of four isolates of avian paramyxovirus serotype 2 in China. Avian Dis 50:386-90.
Zou, et al., 2005. Complete Genome Sequence and Biological Characterizations of A Novel Goose Paramyxovirus-SF02 Isolated in China. Virus Genes 30:13-21.
Claims (4)
1. Способ получения рекомбинантного вирусного вектора APMV-8, который включает введение в несущественный участок генома APMV-8 гетерологичной последовательности ДНК, где вирусный вектор APMV-8 включает полинуклеотид с последовательностью SEQ ID NO: 1 или полинуклеотид, комплементарный полинуклеотиду с последовательностью SEQ ID NO: 1.
2. Способ по п. 1, где несущественный участок выбирается из группы, включающей нетранслируемый участок, расположенный перед открытой рамкой считывания NP, межгенные участки между двумя открытыми рамками считывания генома APMV-8 и нетранслируемый участок, расположенный после открытой рамки считывания L.
3. Способ по п. 1 или 2, который включает стадии:
а) получение экспрессионных плазмид, экспрессирующих гены NP, Р и L;
б) получение транскрипционной плазмиды, включающей гетерологичную последовательность ДНК в несущественном участке полноразмерного генома APMV-8;
в) трансфекцию экспрессионных плазмид и транскрипционной плазмиды в клетку-хозяина;
г) выделение/получение инфекционного вируса APMV-8 из клетки-хозяина.
а) получение экспрессионных плазмид, экспрессирующих гены NP, Р и L;
б) получение транскрипционной плазмиды, включающей гетерологичную последовательность ДНК в несущественном участке полноразмерного генома APMV-8;
в) трансфекцию экспрессионных плазмид и транскрипционной плазмиды в клетку-хозяина;
г) выделение/получение инфекционного вируса APMV-8 из клетки-хозяина.
4. Способ по п. 1 или 2, который включает стадии:
а) получение экспрессионных плазмид, экспрессирующих гены NP, Р и L;
б) получение транскрипционной плазмиды, включающей гетерологичную последовательность ДНК в несущественном участке полноразмерного генома APMV-8;
в) получение экспрессионной плазмиды, экспрессирующей полимеразу Т7;
г) трансфекцию экспрессионных плазмид и транскрипционной плазмиды в клетку-хозяина;
д) восстановление/получение инфекционного вируса APMV-8 из клетки-хозяина.
а) получение экспрессионных плазмид, экспрессирующих гены NP, Р и L;
б) получение транскрипционной плазмиды, включающей гетерологичную последовательность ДНК в несущественном участке полноразмерного генома APMV-8;
в) получение экспрессионной плазмиды, экспрессирующей полимеразу Т7;
г) трансфекцию экспрессионных плазмид и транскрипционной плазмиды в клетку-хозяина;
д) восстановление/получение инфекционного вируса APMV-8 из клетки-хозяина.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US23591209P | 2009-08-21 | 2009-08-21 | |
US61/235,912 | 2009-08-21 | ||
PCT/US2010/046179 WO2011022656A2 (en) | 2009-08-21 | 2010-08-20 | Recombinant avian paramyxovirus vaccine and method for making and using thereof |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016112465A Division RU2016112465A (ru) | 2009-08-21 | 2010-08-20 | Рекомбинантная вакцина на основе парамиксовирусов птиц и способ её приготовления и применения |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2012110576A RU2012110576A (ru) | 2013-09-27 |
RU2592544C2 true RU2592544C2 (ru) | 2016-07-20 |
Family
ID=43027613
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016112465A RU2016112465A (ru) | 2009-08-21 | 2010-08-20 | Рекомбинантная вакцина на основе парамиксовирусов птиц и способ её приготовления и применения |
RU2012110576/10A RU2592544C2 (ru) | 2009-08-21 | 2010-08-20 | Способ получения рекомбинантного вирусного вектора apmv-8 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016112465A RU2016112465A (ru) | 2009-08-21 | 2010-08-20 | Рекомбинантная вакцина на основе парамиксовирусов птиц и способ её приготовления и применения |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8486418B2 (ru) |
EP (2) | EP3210622B1 (ru) |
JP (2) | JP6221167B2 (ru) |
KR (1) | KR101745029B1 (ru) |
CN (2) | CN102573901B (ru) |
BR (1) | BR112012003837B8 (ru) |
CA (1) | CA2771540C (ru) |
CL (2) | CL2012000447A1 (ru) |
CO (1) | CO6511253A2 (ru) |
ES (2) | ES2867457T3 (ru) |
HU (2) | HUE033886T2 (ru) |
MX (1) | MX2012002114A (ru) |
PL (2) | PL2467158T3 (ru) |
PT (2) | PT3210622T (ru) |
RU (2) | RU2016112465A (ru) |
SG (2) | SG10201405123WA (ru) |
UA (1) | UA110328C2 (ru) |
WO (1) | WO2011022656A2 (ru) |
ZA (1) | ZA201201245B (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2783430C1 (ru) * | 2022-03-16 | 2022-11-14 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Минигеномная система вируса Пуумала для оценки противовирусной активности ингибиторов РНК-зависимой РНК-полимеразы |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20160015760A1 (en) | 2013-03-14 | 2016-01-21 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Newcastle disease viruses and uses thereof |
US20140341950A1 (en) * | 2013-05-15 | 2014-11-20 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Recombinant avian paramyxovirus vaccine and method for making and using thereof |
JP6857498B2 (ja) | 2014-02-27 | 2021-04-14 | メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーションMerck Sharp & Dohme Corp. | 癌を処置するための併用方法 |
CN104195116B (zh) * | 2014-08-13 | 2018-03-06 | 吉林大学 | 一种表达鹅细小病毒vp3基因的重组新城疫病毒及其构建方法 |
MX2017000869A (es) * | 2014-08-22 | 2017-03-08 | Investigación Aplicada S A De C V | Vacuna emulsionada para obtener formulaciones de inmunoglobulinas igy concentradas; procesos y usos de las mismas. |
MX2017005687A (es) | 2014-11-03 | 2017-08-21 | Merial Inc | Metodos para usar formulaciones para vacuna con microagujas para elicitar en animales inmunidad protectora contra virus de la rabia. |
JOP20190256A1 (ar) * | 2017-05-12 | 2019-10-28 | Icahn School Med Mount Sinai | فيروسات داء نيوكاسل واستخداماتها |
CN107254450A (zh) * | 2017-07-20 | 2017-10-17 | 扬州大学 | 克服鸡新城疫母源抗体影响的嵌合新城疫病毒疫苗载体候选株及构建方法 |
CN111212905A (zh) | 2017-08-18 | 2020-05-29 | 摩登纳特斯有限公司 | Rna聚合酶变体 |
CN108315486A (zh) * | 2018-04-11 | 2018-07-24 | 张薇 | 一种用于检测罗湖病毒的环介导等温扩增引物组及试剂盒 |
JP2021530501A (ja) * | 2018-07-13 | 2021-11-11 | アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ | 癌の治療のためのapmv及びその使用 |
AU2020224103A1 (en) * | 2019-02-20 | 2021-09-16 | Modernatx, Inc. | Rna polymerase variants for co-transcriptional capping |
CN112111467B (zh) * | 2020-09-27 | 2021-06-22 | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种基因vii型新城疫标记疫苗株及其制备方法与应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2162341C1 (ru) * | 2000-03-06 | 2001-01-27 | Открытое акционерное общество "ВЫМПЕЛ КОМПЛЕКС" | Сухая живая вакцина против ньюкаслской болезни и способ ее получения |
US20090041852A1 (en) * | 2006-03-15 | 2009-02-12 | Universiteit Gent | Dry powder compositions and systems for poultry vaccination |
US20090175826A1 (en) * | 2006-06-05 | 2009-07-09 | Elankumaran Subbiah | Genetically-engineered newcastle disease virus as an oncolytic agent, and methods of using same |
WO2009101149A2 (en) * | 2008-02-14 | 2009-08-20 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Anti-tumour effective paramyxovirus |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2909462A (en) | 1955-12-08 | 1959-10-20 | Bristol Myers Co | Acrylic acid polymer laxative compositions |
US4603112A (en) | 1981-12-24 | 1986-07-29 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus |
US4769330A (en) | 1981-12-24 | 1988-09-06 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus and methods for making and using the same |
US4722848A (en) | 1982-12-08 | 1988-02-02 | Health Research, Incorporated | Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus |
US5174993A (en) | 1981-12-24 | 1992-12-29 | Health Research Inc. | Recombinant avipox virus and immunological use thereof |
EP0138854B1 (en) | 1983-03-08 | 1992-11-04 | Chiron Mimotopes Pty. Ltd. | Antigenically active amino acid sequences |
KR100242671B1 (ko) | 1991-03-07 | 2000-03-02 | 고돈 에릭 | 유전학적으로 처리한 백신 균주 |
ES2241042T3 (es) | 1996-10-11 | 2005-10-16 | The Regents Of The University Of California | Conjugados de polinucleotido inmunoestimulador/ molecula inmunomoduladora. |
FR2778858B1 (fr) | 1998-05-20 | 2000-06-16 | Oreal | Emulsion e/h/e stable et son utilisation comme composition cosmetique et/ou dermatologique |
EP0974660A1 (en) * | 1998-06-19 | 2000-01-26 | Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) | Newcastle disease virus infectious clones, vaccines and diagnostic assays |
FR2801607B1 (fr) | 1999-11-26 | 2001-12-28 | Merial Sas | Pneumovirus du canard et vaccins correspondants |
JP4791651B2 (ja) * | 2000-05-18 | 2011-10-12 | 株式会社ディナベック研究所 | 外来遺伝子導入用パラミクソウイルスベクター |
AU2002224815B2 (en) * | 2000-11-02 | 2006-10-12 | Intervet International B.V. | A recombinant newcastle disease virus nucleoprotein mutant as a marker vaccine |
RU2354399C2 (ru) | 2003-07-24 | 2009-05-10 | Мериал Лимитед | Вакцинная композиция и способ индуцирования иммунологического ответа у животного |
KR20090007706A (ko) | 2006-03-15 | 2009-01-20 | 인터벳 인터내셔널 비.브이. | 조류 인플루엔자 바이러스의 h5 헤마글루티닌을 발현하는 재조합 뉴캐슬병 바이러스 |
RU2441070C2 (ru) * | 2006-03-15 | 2012-01-27 | Интервет Интернэшнл Б.В. | Рекомбинантный вирус болезни ньюкастла, экспрессирующий н5 гемаглютинин вируса птичьего гриппа (avian ineluenza) |
DK2414386T3 (en) * | 2009-04-03 | 2016-02-22 | Merial Ltd | Birds of vaccines with newcastle disease virus vectors |
-
2010
- 2010-08-20 WO PCT/US2010/046179 patent/WO2011022656A2/en active Application Filing
- 2010-08-20 EP EP16204538.9A patent/EP3210622B1/en active Active
- 2010-08-20 RU RU2016112465A patent/RU2016112465A/ru not_active Application Discontinuation
- 2010-08-20 BR BR112012003837A patent/BR112012003837B8/pt active Search and Examination
- 2010-08-20 CA CA2771540A patent/CA2771540C/en active Active
- 2010-08-20 KR KR1020127007373A patent/KR101745029B1/ko active IP Right Grant
- 2010-08-20 JP JP2012525730A patent/JP6221167B2/ja active Active
- 2010-08-20 PT PT162045389T patent/PT3210622T/pt unknown
- 2010-08-20 PL PL10747133T patent/PL2467158T3/pl unknown
- 2010-08-20 SG SG10201405123WA patent/SG10201405123WA/en unknown
- 2010-08-20 CN CN201080045564.7A patent/CN102573901B/zh active Active
- 2010-08-20 ES ES16204538T patent/ES2867457T3/es active Active
- 2010-08-20 UA UAA201203242A patent/UA110328C2/ru unknown
- 2010-08-20 EP EP10747133.6A patent/EP2467158B1/en active Active
- 2010-08-20 ES ES10747133T patent/ES2622087T3/es active Active
- 2010-08-20 HU HUE10747133A patent/HUE033886T2/en unknown
- 2010-08-20 PT PT107471336T patent/PT2467158T/pt unknown
- 2010-08-20 SG SG2012011912A patent/SG178523A1/en unknown
- 2010-08-20 HU HUE16204538A patent/HUE053237T2/hu unknown
- 2010-08-20 PL PL16204538T patent/PL3210622T3/pl unknown
- 2010-08-20 CN CN201510564915.XA patent/CN105331633A/zh active Pending
- 2010-08-20 US US12/860,589 patent/US8486418B2/en active Active
- 2010-08-20 MX MX2012002114A patent/MX2012002114A/es active IP Right Grant
- 2010-08-20 RU RU2012110576/10A patent/RU2592544C2/ru active
-
2012
- 2012-02-20 ZA ZA2012/01245A patent/ZA201201245B/en unknown
- 2012-02-21 CL CL2012000447A patent/CL2012000447A1/es unknown
- 2012-03-20 CO CO12046741A patent/CO6511253A2/es unknown
-
2015
- 2015-08-04 CL CL2015002175A patent/CL2015002175A1/es unknown
- 2015-12-17 JP JP2015246684A patent/JP2016041079A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2162341C1 (ru) * | 2000-03-06 | 2001-01-27 | Открытое акционерное общество "ВЫМПЕЛ КОМПЛЕКС" | Сухая живая вакцина против ньюкаслской болезни и способ ее получения |
US20090041852A1 (en) * | 2006-03-15 | 2009-02-12 | Universiteit Gent | Dry powder compositions and systems for poultry vaccination |
US20090175826A1 (en) * | 2006-06-05 | 2009-07-09 | Elankumaran Subbiah | Genetically-engineered newcastle disease virus as an oncolytic agent, and methods of using same |
WO2009101149A2 (en) * | 2008-02-14 | 2009-08-20 | Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft | Anti-tumour effective paramyxovirus |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
PALDURAI A., at al., Complete genome sequences of avian paramyxovirus type 8 strains goose/Delaware/1053/76 and pintail/Wakuya/20/78, VIRUS RESEARCH, 25.03.2009, Vol.142, no. 1-2, pp. 144-153. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2783430C1 (ru) * | 2022-03-16 | 2022-11-14 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Минигеномная система вируса Пуумала для оценки противовирусной активности ингибиторов РНК-зависимой РНК-полимеразы |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2592544C2 (ru) | Способ получения рекомбинантного вирусного вектора apmv-8 | |
EP2785374B1 (en) | Recombinant gallid herpesvirus 3 (mdv serotype 2) vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof | |
RU2752836C2 (ru) | Рекомбинантные hvt-векторы, экспрессирующие множественные антигены патогенов птиц, и содержащие их вакцины | |
KR101715418B1 (ko) | 뉴캐슬 질환 바이러스-벡터를 이용한 조류 백신 | |
US20220105174A1 (en) | Recombinant gallid herpesvirus 3 vaccines encoding heterologous avian pathogen antigens | |
Bertran et al. | Maternal antibody inhibition of recombinant Newcastle disease virus vectored vaccine in a primary or booster avian influenza vaccination program of broiler chickens | |
US11058761B2 (en) | Recombinant vectors expressing antigens of avian influenza virus and uses thereof | |
US20160015801A1 (en) | Recombinant gallid herpesvirus 3 (mdv serotype 2) vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof | |
RU2528750C2 (ru) | Рекомбинантная вакцина на основе инактивированного вирусного вектора | |
CN114828882A (zh) | 多价hvt载体疫苗 | |
US11224649B2 (en) | 4/91 IBV vaccine with heterologous spike protein | |
CN116648259A (zh) | 多价hvt载体疫苗 | |
US20140341950A1 (en) | Recombinant avian paramyxovirus vaccine and method for making and using thereof | |
WO2012153160A1 (es) | Vacuna recombinante contra prrs en vector viral | |
OA19476A (en) | Recombinant vectors expressing antigens of avian influenza virus and uses thereof. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HZ9A | Changing address for correspondence with an applicant |