ES2867457T3 - Vacuna recombinante contra paramyxovirus aviar y procedimiento de fabricación y utilización de la misma - Google Patents

Vacuna recombinante contra paramyxovirus aviar y procedimiento de fabricación y utilización de la misma Download PDF

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Abstract

Procedimiento para producir un vector viral APMV-8 (paramyxovirus aviar 8) recombinante, en el que el procedimiento comprende la introducción en el genoma de APMV-8 de un polinucleótido aislado en una región no esencial del genoma de APMV-8, en el que la región no esencial se selecciona de las regiones que consisten en la región no traducida ubicada en dirección 5' del marco de lectura abierto de NP, regiones intergénicas entre dos marcos de lectura abiertos del genoma de APMV-8 y la región no traducida ubicada en dirección 3' del marco de lectura abierto de L, en el que el APMV-8 comprende un polinucleótido que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO:1 o un polinucleótido complementario a un polinucleótido que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1, en el que el polinucleótido aislado es heterólogo y codifica y expresa un antígeno derivado de un patógeno, y en el que el vector viral APMV-8 recombinante es capaz de provocar una respuesta inmune que es específica del antígeno.

Description

DESCRIPCIÓN
Vacuna recombinante contra paramyxovirus aviar y procedimiento de fabricación y utilización de la misma CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] En el presente documento se describen paramixovirus aviar (APMV) y secuencias de APMV. También se describen en el presente documento vectores virales para la inserción y expresión de genes exógenos para su uso como vehículos de inmunización seguros para proteger contra una variedad de patógenos, vacunas de vectores en un sistema de genética inversa para la producción de vacunas vivas atenuadas, polinucleótidos que se pueden utilizar para la producción de subunidades en un vector de expresión in vitro o como secuencias para ser integradas en un vector de expresión in vivo de tipo viral o plásmido.
[0002] También se describen en el presente documento virus APMV sin modificar y modificados, procedimientos de fabricación y uso del mismo, y ciertas secuencias de ADN y proteínas. Más en particular, en el presente documento se describen virus APMV en los que se ha alterado el genoma de origen natural del virus ("mutantes de APMV" o "APMV recombinante") y procedimientos de fabricación y uso de tales mutantes de APMV o APMV recombinante. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0003] Las vacunas de vectores virales representan una de las áreas de más rápido crecimiento en el desarrollo de vacunas. Muchas vacunas en desarrollo clínico para las principales enfermedades infecciosas a nivel mundial, el VIH, la tuberculosis y la malaria, están basadas en vectores virales. Las vacunas de vectores virales para los animales ya están en el mercado, por ejemplo, las vacunas de vectores de la viruela aviar para animales de compañía y aves de corral, vacunas de vectores del virus del herpes aviar para aves de corral, y vacunas de vectores de virus vaccinia para la vida silvestre. Pero otras vacunas de vector para el ganado están en desarrollo. La ventaja de las vacunas de vectores virales es que pueden administrarse de forma segura debido a la utilización de un esqueleto del vector que está fuertemente atenuada y no causa la enfermedad en el propio animal. La desventaja de los vectores virales utilizados en la actualidad es la existencia de derivados de la madre o anticuerpos adquiridos debido a una infección pasada. Estos anticuerpos neutralizan el virus vector y por lo tanto disminuyen el éxito de la vacuna de vector. Un gran impulso para el desarrollo de vacunas de vectores fue la aparición del virus de la gripe H5N1 altamente patógeno que apareció por primera vez en Asia y más tarde en Europa y África. Se han desarrollado varias vacunas de vectores candidatas incluyendo vacunas de vectores basados en virus de la viruela aviar (Taylor et al, 1988), virus vaccinia (Chambers et al., 1988), virus del sarcoma de Rous (Hunt et al, 1988), adenovirus (Tang et al., 2002, Gao et al, 2006), virus de la encefalitis equina venezolana (Schultz-Cherry et al, 2000), virus de la enfermedad de Newcastle (US6,719,979, Veits et al., 2006, Swayne et al, 2002, Park et al, 2006), virus del herpes de laringotraqueitis infecciosa (Veits et al., 2003), virus del herpes de pavo (Darteil et al., 1995) y adenovirus (Hoelscher y otros, 2008, Toro et al, 2007). La eficacia de estas vacunas de vectores ha sido probada en aves sin tratamiento previo, pero hasta ahora no hay informes publicados sobre la eficacia de estas vacunas de vectores en aves con una inmunidad preexistente al vector viral y/o a la proteína codificada por el inserto.
[0004] La familia de virus Paramyxoviridae incluye patógenos humanos (virus de sarampión, paperas, parainfluenza y sincitial respiratorio) y patógenos animales (virus de la enfermedad de Newcastle y el virus de la peste bovina) que causan un impacto significativo en la salud pública, así como la economía global (Lamb et al., 2007). Los miembros de esta familia de virus se definen por tener un genoma de ARN monocatenario, de sentido negativo, “monopartito”. La familia Paramyxoviridae consiste en dos subfamilias, a saber Paramyxovirinae y Pneumovirinae. Debido a la reciente reclasificación, la subfamilia Paramyxovirinae incluye cinco géneros, es decir, Morbillivirus, Henipavirus, Rubulavirus, Respirovirus y Avulavirus, mientras que Pneumovirinae incluye Pneumovirus y Metapneumovirus (Mayo, 2002). Los paramixovirus aviar (APMV) se clasifican en el género Avulavirus y comprenden nueve serotipos antigénicamente diferentes que han sido definidos mediante pruebas de inhibición de la hemaglutinación (HI) (Alexander, 1988). De los nueve serotipos, los aislamientos que pertenecen al subtipo APMV-1 pueden causar una enfermedad devastadora en la avicultura comercial y se clasifican como virus de la enfermedad de Newcastle velogénica (NDV). Las formas más leves de NDV se designan como aislamientos mesógenos y lentógenos, en los que la última forma es principalmente asintomática en aves de corral domésticas. Los aislados que pertenecen a APMV-2, 3, 6 y 7 también se han asociado con la enfermedad en las aves de corral. Específicamente, las infecciones por aislados de APMV-2 y 3 pueden causar una enfermedad respiratoria leve y problemas en la calidad y cantidad de los huevos (Bankowski et al, 1981; Redmann et al, 1991; Tumova et al, 1979; Zhang et al, 2007). Se ha conocido que los aislados de APMV-6 y 7 infectan pavos, patos y aves migratorias y pueden inducir la enfermedad respiratoria que puede complicarse por una infección secundaria (Saif et al, 1997; Shortridge et al, 1980). Por otro lado, los aislados de APMV-4, 5, 8 y 9 han sido aislados de patos, aves acuáticas y otras aves salvajes, pero las aves rara vez muestran signos clínicos después de la infección viral (Alexander et al, 1983; Capua et al, 2004; Gough et al, 1984; Maldonado et al, 1995; Shortridge et al, 1980).
[0005] Las secuencias genómicas completas de varios aislados de NDV se han establecido y utilizado para dilucidar los diversos determinantes de virulencia de NDV (de Leeuw et al., 1999; (Krishnamurthy et al, 1998; Zou et al, 2005) En los últimos dos años se han publicado varias secuencias de APMV distintas de APMV1, tales como número de acceso GenBank EU338414 para APMV-2, EU403085 para APMV-3, FJ177514 para APMV-4, EU622637 para APMV-6, FJ231524 para APMV-7, FJ215863, FJ215864 y FJ619036 para APMV-8, EU910942 para APMV-9. Además de la información de la secuencia, no se sabe mucho acerca de los factores de virulencia. Los aislados de APMV 2-9 en su mayoría han sido aislados de aves migratorias. Curiosamente, hay muy pocos informes de infección experimental de pollos con dichos aislados (Saif et al., 1997). Dado que estos APMV circulan ampliamente en aves salvajes y en ciertos casos se han aislado de grupos comerciales (Zhang et al., 2007) que a veces causan la enfermedad en ellos (Saif et al, 1997; Shihmanter et al, 1998; Shihmanter et al, 1998), se necesita conocimiento acerca de su virulencia en aves de corral.
[0006] La mayoría de los aislados de APMV causan una enfermedad relativamente leve que puede ser exacerbada en presencia de infecciones bacterianas o virales concomitantes que podrían dar lugar a un impacto económico. En particular, el APMV-2 fue aislado por primera vez como un patógeno secundario en 1956 de los pollos afectados por la laringotraqueitis aguda en el sur de California (Bankowski et al., 1960). Desde entonces numerosas cepas de este serotipo se han aislado de varias especies de aves, lo que significa que el APMV-2 está ampliamente diseminado en todo el mundo (Andral et al, 1984; Bradshaw et al, 1979; Fleury et al, 1979; Goodman et al, 1988; Lang et al, 1975; Lipkind et al, 1982; Lipkind et al, 1979; Zhang et al., 2006). Bankowski et. al. describió que la exposición natural, así como artificial, de las gallinas pavo ponedoras a APMV-2 causó una disminución pronunciada en la capacidad de eclosión y el rendimiento de las aves de corral (Bankowski ct al., 1981). Los ejemplos iniciales de aislamiento de APMV-4 eran de patos salvajes cazados en la ruta migratoria del Mississippi en los Estados Unidos (Webster et al., 1976) y de pollos, patos y gansos en Hong Kong durante los programas de vigilancia de la gripe de las aves de corral (Alexander et al., 1979). Además de un aislado de una cerceta anillada que sufría de enteritis hemorrágica (Gough et al, 1984), todos los otros aislados eran aparentemente no patógenos en aves de corral y se encontró que tenían una amplia distribución entre las aves acuáticas en todo el mundo (Stanislawek et al., 2002; Tumova et al, 1989; Yamane et al, 1982). Gough et al. describió que no había signos clínicos y se obtuvieron títulos de HI muy bajos (1:8 o menos) después de la inoculación intranasal de patos de una semana de vida y pollos de dos semanas de vida con el aislado de una cerceta anillada (Gough et al, 1984). Del mismo modo, los primeros aislados de APMV-6 eran también de las aves de corral en Hong Kong como resultado de un programa de vigilancia de la gripe y se indicó que no eran no patógenos en pollos basado en los títulos bajos de HI de pollos infectados experimentalmente (Shortridge et al., 1980). Sin embargo, ha habido informes de infección con APMV-6 de pavos que conducen a problemas de producción de huevos y enfermedad respiratoria leve (Alexander, 2003).
[0007] El APMV-8 (Goose/Delaware/1053/76) se aisló por primera vez en los Estados Unidos de un ganso de Canadá matado por un cazador (Branta canadensis) (Rosenberger et al., 1974). Una encuesta serológica (1990­ 1992) de aves de caza en el sur de España mostró una prevalencia notable de anticuerpos contra APMV-8 en hasta el 43% de los sueros ensayados (Maldonado et al., 1995). Otro estudio serológico para determinar el estado de patos silvestres vivos y sanos en Nueva Zelanda para la infección por APMV reveló la presencia de anticuerpos contra APMV-8 en el 56% de los sueros ensayados (Stanislawek et al., 2002). Warke et al (2008) describió que entre el 16% y el 31% de los sueros de pollo investigados podría haber tenido anticuerpos contra APMV-8. Pero debido a altos títulos existentes contra APMV1 es posible la probabilidad de una prueba de HI de falsos positivos, ya que los sueros no reaccionan muy específicamente en el ensayo de HI. Con la excepción de unas pocas aves acuáticas aisladas de APMV-8 aislado, mientras las poblaciones eran investigadas para encontrar el virus de la gripe aviar (Stallknecht et al., 1991), ha habido una escasez de información sobre la prevalencia y patogenicidad de este virus.
[0008] El desarrollo de sistemas de genética inversa para el genoma de ARN de cadena negativa del NDV ha hecho que sea posible insertar secuencias de genes exógenos en el genoma, por lo que es posible la creación de vectores recombinantes de NDV para la vacunación y la terapia génica (Krishnamurthy et al., 2000; Peeters et al, 1999; Roemer-Oberdoerfer et al, 1999). Se han descrito vectores recombinantes de NDV que expresan las proteínas virales exógenas, tales como la proteína HA del subtipo H1 del virus de la gripe A (Nakaya et al., 2001), la proteína VP2 del virus de la bursitis infecciosa (IBDV) (Huang et al., 2004), la hemaglutinina del virus de la gripe aviar del subtipo H5 (Veits et al, 2006; Ge et al, 2007) y del subtipo H7 (Park et al, 2006). Sin embargo, la eficacia de la mayoría de estas vacunas se ha demostrado sólo en aves SPF. NDV causa una enfermedad devastadora de las aves de corral que conduce a graves pérdidas económicas en la industria avícola. Por lo tanto, los pollos comerciales son vacunados rutinariamente contra el NDV en la mayoría de países del mundo. Debido a esto, los pollos de grupos parentales inmunizados tienen un alto nivel de anticuerpos de origen materno. Las vacunas de NDV vivas convencionales proporcionan protección incluso en presencia de estos anticuerpos. Sin embargo, las vacunas de NDV (con inserciones de genes exógenos) están generalmente más atenuados en comparación con las vacunas vivas de NDV y su eficacia puede verse afectada en presencia de anticuerpos maternos de NDV. Por lo tanto, existe la necesidad de una plataforma de vacunas de vector que pueda proporcionar la base para vacunas seguras para la expresión de antígenos heterólogos. Idealmente, la vacuna recombinante puede inducir una respuesta inmune humoral fuerte, puede ser aplicable mediante la administración en masa, y es barata.
[0009] El documento WO 2009/101149 A2 describe el uso de cepas de APMV, que incluyen APMV 1-8, por sus propiedades oncolíticas en el tratamiento del cáncer. Este documento describe además que, con fines de formación de imágenes y como biomarcadores, se pueden insertar en el APMV transgenes que codifican genes informadores que incluyen péptidos antígeno de virus comunes.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
[0010] En un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para producir un vector viral APMV-8 recombinante, en el que el procedimiento comprende la introducción en el genoma de APMV-8 de un polinucleótido aislado en una región no esencial del genoma de APMV-8, en el que además la región no esencial se selecciona de las regiones que consisten en la región no traducida ubicada en dirección 5' del marco de lectura abierto de NP, regiones intergénicas entre dos marcos de lectura abiertos del genoma de APMV-8 y la región no traducida ubicada en dirección 3' del marco de lectura abierto de L, en el que además el APMV-8 comprende un polinucleótido que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO:1 o un polinucleótido complementario a un polinucleótido que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1, en el que además el polinucleótido aislado es heterólogo y codifica y expresa un antígeno derivado de un patógeno, y en el que además el vector viral APMV-8 recombinante es capaz de provocar una respuesta inmune que es específica del antígeno.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un virus APMV-8 recombinante que comprende:
un polinucleótido que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1 o un polinucleótido complementario a un polinucleótido que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1;
que comprende además un polinucleótido aislado insertado en una región no esencial del genoma de APMV-8, en el que la región no esencial se selecciona de las regiones que consisten en la región no traducida ubicada en dirección 5' del marco de lectura abierto de NP, regiones intergénicas entre dos marcos de lectura abiertos del genoma de APMV-8, y la región no traducida ubicada en dirección 3' del marco de lectura abierto de L, en el que el polinucleótido aislado es heterólogo y codifica y expresa un antígeno derivado de un patógeno, y en el que el virus APMV-8 recombinante es capaz de provocar una respuesta inmune que es específica del antígeno.
[0011] En el presente documento se describe una vacuna o composición que comprende (i) un APMV recombinante y (ii) un portador farmacéutica o veterinariamente aceptable. En el presente documento también se describen procedimientos para modificar el genoma de APMV para producir un virus APMV o un vector viral AMPV recombinante; APMV modificado preparado por tales procedimientos; secuencias de ADN y proteínas; y procedimientos para infectar células y animales huésped con dicho APMV recombinante para provocar la amplificación de ADN exógeno y las proteínas codificadas por el ADN exógeno, incluyendo proteínas antigénicas, por dichas células y animales huésped.
[0012] Un aspecto descrito en el presente documento se refiere al virus APMV, secuencias de ADN y proteínas implicadas en la fabricación de un virus modificado o recombinante. Una realización descrita en el presente documento se refiere a la secuencia genómica y de proteína de APMV-2, 4, 6 u 8.
[0013] Otro aspecto descrito en el presente documento se refiere a un virus APMV recombinante modificado, cuyos virus presentan una seguridad mejorada, una fuerte respuesta inmunitaria humoral, y a un procedimiento de fabricación de dichos virus recombinantes.
[0014] Otro aspecto descrito en el presente documento se refiere a una vacuna o composición de virus APMV recombinante que tiene un mayor nivel de seguridad en comparación con APMV conocido o otras vacunas recombinantes.
[0015] En otro aspecto, en el presente documento se describen vectores viral APMV no modificados y modificados para expresar un producto génico en un huésped.
[0016] Otro aspecto descrito en el presente documento se refiere a un virus AMPV recombinante modificado por la inserción en el mismo de ADN de cualquier fuente en la región intergénica o la región no esencial del genoma de APMV. Los virus APMV modificados sintéticamente recombinantes que contienen genes heterólogos que codifican y expresan un antígeno, se utilizan tal como se describen en el presente documento para crear nuevas composiciones o vacunas.
[0017] Otro aspecto descrito en el presente documento se refiere a un vector viral APMV que proporciona un sistema de genética inversa, en el que el vector se puede utilizar como un esqueleto para vacunas recombinantes o composiciones en diferentes animales huésped.
[0018] En un aspecto, en el presente documento se describe una composición farmacéutica o de vacuna para inducir una respuesta inmunológica en un animal huésped inoculado con la composición o vacuna, incluyendo la composición o vacuna un portador farmacéuticamente aceptable y un virus recombinante o vector viral APMV modificado. En aún otro aspecto descrito en el presente documento, el virus o vector viral APMV recombinante incluye, dentro de una región no esencial del genoma del virus, un ADN heterólogo que codifica una proteína antigénica derivada de un patógeno en el que la composición o vacuna cuando se administra a un huésped, es capaz de inducir una respuesta inmunológica específica a la proteína codificada por el patógeno.
[0019] Otro aspecto descrito en el presente documento se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un animal a un antígeno, cuyo procedimiento comprende inocular al animal con una vacuna o una composición farmacéutica que contiene un virus o vector viral APMV recombinante modificado que comprende y expresa el determinante antigénico de un patógeno para dicho animal. Sin embargo, otro aspecto descrito en el presente documento se refiere a un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un animal para un antígeno en un régimen de sensibilización-refuerzo.
[0020] Otro aspecto descrito en el presente documento se refiere a un procedimiento para expresar un producto génico en un cultivo celular in vitro mediante la introducción en la célula de un virus APMV recombinante modificado, en el que el gen puede ser una proteína antigénica derivada de un patógeno.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0021] La siguiente descripción detallada, proporcionada a modo de ejemplo, y que no pretende limitar la invención a realizaciones específicas descritas, puede entenderse conjuntamente con las figuras que se acompañan, en las que: La figura 1 es una tabla que muestra el aislamiento del virus a partir de varios órganos de pollos después de la infección experimental con APMV-2, 4, 6 en huevos de pollo embrionados.
La figura 2 es una tabla que muestra los resultados histológicos de varios órganos de pollos después de la infección experimental con APMV-2, 4, 6.
La figura 3 representa los títulos de anticuerpos HI de pollos SPF inoculados experimentalmente con APMV-2, 4 o 6. Las muestras de suero de pollo recogidas en los días 2, 4, 7, 14 y 28 después de la infección fueron sometidas a la prueba de HI para analizar la presencia de anticuerpos HI.
La figura 4 muestra los títulos de anticuerpo HI en pollos SPF y patos infectados experimentalmente con APMV-8. Los pollos y los patos fueron infectados por vía oronasal con una dosis de 106 EID50 de APMV-8. Se recogieron muestras de suero en los días 2,4, 7, 14, y 28 después de la infección y se analizaron mediante la prueba HI con el antígeno APMV-8. Los títulos séricos de HI (en log 2) se muestran en el eje izquierdo.
La figura 5 muestra el desarrollo de los títulos de anticuerpos HI de pollos SPF durante un esquema de vacunación de sensibilización/refuerzo con APMV-8. Se infectaron pollos SPF de 1 día de vida en el día 1 (sensibilización) y el día 14 (refuerzo) con una dosis de 106 EID50 de APMV-8. Las muestras de suero se obtuvieron en el día 7 y 14 después de la primera infección y los días 7 y 14 después de la segunda infección. Los sueros se sometieron a la prueba de HI. Los títulos séricos de HI (en log2) se muestran en el eje izquierdo.
La figura 6 muestra el análisis de los productos de RT-PCR mediante electroforesis en gel de agarosa. Se tomaron tejidos traqueales en el día 2 después de la infección de patos no infectados (C1-C5) y patos infectados con AMPV-8 (I1-I5). Los tejidos se homogeneizaron y el ARN se preparó para RT-PCR. Se preparó un control de agua (W) en paralelo. Los productos de reacción se separaron en un gel de agarosa al 1,5%. El tamaño del fragmento se controló mediante el uso de la escalera de 100 pb (New England Biolabs). Los tamaños de los fragmentos de ADN se muestran a la derecha.
La figura 7 es una tabla que muestra el aislamiento del virus de pollos y patos infectados experimentalmente con APMV-8. El aislamiento del virus a partir de tejido de pollo se llevó a cabo en huevos de pollo embrionados y la detección de ARN viral a partir de tejido de pato por RT-PCR.
La figura 8 es una tabla que muestra los resultados del examen histológico de varios órganos después de la infección de pollo y patos Pekín con APMV-8.
La figura 9 muestra el desarrollo de los títulos de anticuerpos HI en pollos SPF después de la infección con diferentes dosis de APMV-8. Se infectaron pollos SPF de 1 día de vida el día 1 con diferentes dosis infecciosas (ID) de APMV-8 o con una simulación con medio de transporte de virus (VTM). Se extrajo sangre en el día 7 y 14 después de la infección y las muestras de suero obtenidas se analizaron por la prueba de HI. Los títulos séricos HI (en log2) se muestran en el eje izquierdo. El título medio geométrico (GMT) de las muestras de suero se muestra en la fila más baja.
La figura 10 muestra el desarrollo de los títulos de anticuerpos HI de patos Pekín después de la infección con diferentes dosis de APMV-8. Se infectaron patos Pekín SPF de 1 día de vida en el día 1 con diferentes dosis infecciosas (ID) de APMV-8 o con una simulación con medio de transporte de virus (VTM). Se extrajo sangre en el día 7 y 14 después de la infección y las muestras de suero obtenidas se analizaron por la prueba de HI. Los títulos séricos HI (en log2) se muestran en el eje izquierdo. El título medio geométrico (GMT) de las muestras de suero se muestra en la fila más baja.
La figura 11 es una tabla que muestra las SEQ ID NOs de las correspondientes secuencias de ADN y proteínas. La figura 12 representa la secuencia del genoma de longitud completa de la cepa de APMV-8 (APMV-8: SCWDS ID: MA-7, aislado de una Mallard) y un mapa genético del genoma de APMV-8 de longitud completa.
La figura 12 representa la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 2) que codifica la nucleoproteína (NP) de APMV-8 y la secuencia de la proteína NP (SEQ ID NO: 3).
La figura 13 representa la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 4) que codifica la fosfoproteína (P) de APMV-8 y la secuencia de la proteína P (SEQ ID NO: 5).
La figura 14 representa la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 6) que codifica la proteína de matriz (M) de APMV-8 y la secuencia de la proteína M (SEQ ID NO: 7).
La figura 15 representa la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 8) que codifica la proteína de fusión (F) de APMV-8 y la secuencia de la proteína F (SEQ ID NO: 9).
La figura 16 representa la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 10) que codifica la hemaglutinina/neuraminidasa (HN) de APMV-8 y la secuencia de la proteína HN (SEQ ID NO: 11).
La figura 17 representa la secuencia de ADN (SEQ ID NO: 12) que codifica la polimerasa (L) de APMV-8 y la secuencia de proteína L (SEQ ID NO: 13). Esta proteína L(1) de APMV-8 se traduce a partir del codón ATG situado en las posiciones 8273-8275 de la SEQ iD NO: 1.
La figura 18 representa la secuencia de proteína (2) de de la polimerasa (L) de APMV-8 (SEQ ID NO: 14). Esta proteína L(2) de APMV-8 se traduce a partir del codón ATG situado en las posiciones 8297-8299 de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 14 no contiene los primeros 8 aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
La figura 19A es un diagrama de flujo del sistema de genética inversa de APMV-8. La figura 19B representa el resultado de la replicación del virus APMV-8 en células MDCK.
La figura 20 representa el resultado de la prueba HI de pollos jóvenes comerciales 2 semanas después de la vacunación de APMV-8.
La figura 21 representa el resultado de la prueba HI de pollos jóvenes comerciales 4 semanas después de la vacunación de APMV-8.
La figura 22 muestra los resultados de la prueba HI después de la vacunación in ovo en el día 18 (estudio 1).
La figura 23 representa los resultados de la prueba HI después de la vacunación in ovo en el día 19 (estudio 2). La figura 24 muestra los resultados de la prueba HI después de la vacunación in ovo en el día 18 (estudio 3).
La figura 25 representa las secuencias del genoma de longitud completa 5' (5' FLG) y del genoma de longitud completa 3' (3'-FLG), incluyendo las secuencias de franqueo.
La figura 26 representa los mapas plasmídicos de pcNDA-NP, pcNDA-P, pcDNA-L, y pcDNA3-T7.
La figura 27 representa los mapas plasmídicos de pUC18-MG-APMV-8 y pCITE4A-EGFP.
La figura 28 representa el mapa plasmídico de pUC57-FL-APMV-8.
La figura 29 representa la secuencia del minigenoma de APMV-8.
La figura 30 muestra la alineación de secuencias de proteína NP y la identidad de secuencia en los niveles de ADN y proteínas.
La figura 31 muestra la alineación de secuencias de proteína P y la identidad de secuencia en los niveles de ADN y proteínas.
La figura 32 muestra la alineación de secuencias de proteína M y la identidad de secuencia en los niveles de ADN y proteínas.
La figura 33 muestra la alineación de secuencias de proteína F y la identidad de secuencia en los niveles de ADN y proteínas.
La figura 34 muestra la alineación de secuencias de proteína HN y la identidad de secuencia en los niveles de ADN y proteínas.
La figura 35 muestra la alineación de secuencias de proteín L y la identidad de secuencia en los niveles de ADN y proteínas.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION
[0022] Se observa que en esta descripción y particularmente en las reivindicaciones, términos tales como "comprende", "comprenden", "que comprende" y similares pueden tener el significado que se le atribuye en la ley de Patentes de Estados Unidos; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluyen", "que incluye", y similares; y los términos, tales como "que consiste esencialmente en" y "consisten esencialmente en” tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de EE.UU., por ejemplo, permiten elementos no citados de manera explícita, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan a una característica básica o novedosa de la invención.
[0023] A menos que se indique lo contrario, los términos técnicos se usan de acuerdo con el uso convencional. Las definiciones de términos comunes en biología molecular pueden encontrarse en Benjamin Lewin, Genes V. publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (Is Bn 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
[0024] Los términos singulares "un", "una", y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. La palabra "o" significa cualquier miembro de una lista en particular y también incluye cualquier combinación de los miembros de esa lista.
[0025] Se observa en esta descripción y en las reivindicaciones y/o párrafos adjuntos, el término "paramixovirus aviar" o "APMV" se usan de forma intercambiable, y se refiere e incluye APmV-1, APMV-2, APMV-3, APMV-4, APMV-5, APMV-6, APMV-7, APMV-8, y APMV-9.
[0026] El término "animal" se utiliza en el presente documento para incluir todos los mamíferos, aves y peces. El animal tal como se usa en el presente documento se puede seleccionar del grupo que consiste en equino (por ejemplo, caballos), canino (por ejemplo, perros, lobos, zorros, coyotes, chacales), felino (por ejemplo, leones, tigres, gatos domésticos, gatos salvajes, otra gatos grandes, y otros felinos incluyendo guepardos y linces), bovino (por ejemplo, ganado), porcino (por ejemplo, de cerdo), ovino (por ejemplo, ovejas, cabras, llamas, bisontes), aviar (por ejemplo, pollo, pato, ganso, pavo, codorniz, faisán, loro, pinzones, halcón, cuervo, avestruz, emu y casuario), primate (por ejemplo, prosimio, tersio, mono, gibón, simio), seres humanos, y peces. El término "animal" también incluye un animal individual en todas las etapas del desarrollo, incluyendo etapas embrionarias y fetales.
[0027] Los términos "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en este documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos consecutivos.
[0028] Los términos "ácido nucleico", "nucleótido", y "polinucleótido" se usan indistintamente y se refieren a ARN, ADN, ADNc (ADN complementario), o ARNc (ARN complementario) y sus derivados, tales como los que contienen esqueletos modificados. Se debe entender que en el presente documento se describen polinucleótidos que comprenden secuencias complementarias a las descritas en el presente documento. El "polinucleótido" contemplado en la presente descripción incluye tanto la cadena directa (5' a 3 ') como la cadena complementaria inversa (3' a 5'). Los polinucleótidos descritos en el presente documento pueden prepararse de diferentes maneras (por ejemplo, mediante síntesis química, por clonación de genes, etc.) y pueden adoptar diversas formas (por ejemplo, lineal o ramificado, de cadena simple o doble, o un híbrido de los mismos, cebadores, sondas, etc.).
[0029] El término "ADN genómico" o "genoma" se usa de manera intercambiable y se refiere a la información genética heredable de un organismo huésped. El ADN genómico comprende el ADN del núcleo (también denominado como ADN cromosómico), pero también el ADN de los plástidos (por ejemplo, cloroplastos) y otros orgánulos celulares (por ejemplo, las mitocondrias). El ADN genómico o genoma contemplado también se refiere al ARN de un virus. El ARN puede ser un ARN de cadena positiva o un ARN de cadena negativa. El término "ADN genómico" incluye el ADN genómico que contiene secuencias complementarias a las descritas en el presente documento. El término "ADN genómico" también se refiere a ARN mensajero (ARNm), el ADN complementario (ADNc), y el ARN complementario (ARNc). El término "RA genómico (ácido nucleico)" como se usa en este documento incluye ARN, ARNm, ARNc, ADN y ADNc.
[0030] El término "gen" se utiliza ampliamente para referirse a cualquier segmento de polinucleótido asociado con una función biológica. Por lo tanto, los genes o polinucleótidos incluyen intrones y exones como en la secuencia genómica, o sólo las secuencias de codificación como en ADNc, tal como un marco de lectura abierto (ORF), partiendo del codón de iniciación (codón de metionina) y terminando con una señal de terminación (codón de parada). Los genes y polinucleótidos también pueden incluir regiones que regulan su expresión, tales como el inicio de la transcripción, traducción y terminación de la transcripción. Por lo tanto, también se incluyen los promotores y regiones de unión a ribosomas (en general, estos elementos reguladores se encuentran aproximadamente entre 60 y 250 nucleótidos en dirección 5' del codón de inicio de la secuencia codificante o gen; Doree SM et al.; Pandher K et al.; Chung JY et al.), terminadores de la transcripción (en general el terminador se encuentra dentro de aproximadamente 50 nucleótidos en dirección 3' del codón de parada de la secuencia codificante o gen; Ward, CK et al.). Un gen o polinucleótido también se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa ARNm o ARN funcional, o codifica una proteína específica, y que incluye secuencias reguladoras.
[0031] El término "ADN heterólogo" tal como se utiliza en el presente documento se refiere al ADN derivado de un organismo diferente, tal como un tipo de célula diferente o de una especie diferente al receptor. El término también se refiere a ADN o fragmento del mismo en el mismo genoma del ADN huésped en los que se inserta el ADN heterólogo en una región del genoma que es diferente de su ubicación original.
[0032] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "antígeno" o "inmunógeno" significa una sustancia que induce una respuesta inmune específica en un animal huésped. El antígeno puede comprender un organismo completo, muerto, atenuado o vivo; una subunidad o parte de un organismo; un vector recombinante que contiene un inserto con propiedades inmunogénicas; un trozo o fragmento de ADN capaz de inducir una respuesta inmune tras la presentación a un animal huésped; un polipéptido, un epítopo, un hapteno, o cualquier combinación de los mismos. Alternativamente, el inmunógeno o antígeno puede comprender una toxina o antitoxina.
[0033] El término "proteína o péptido inmunogénico", tal como se usa en el presente documento incluye polipéptidos que son inmunológicamente activos en el sentido de que una vez administrados al huésped, son capaces de provocar una respuesta inmune de tipo humoral y/o celular dirigida contra la proteína. Preferiblemente, el fragmento de proteína es tal que tiene sustancialmente la misma actividad inmunológica que la proteína total. Por lo tanto, un fragmento de proteína descrito en el presente documento comprende o consiste esencialmente en o consiste en al menos un epítopo o determinante antigénico. Una proteína o polipéptido "inmunogénico", tal como se usa en el presente documento, incluye la secuencia de longitud completa de la proteína, análogos de la misma, o fragmentos inmunogénicos de la misma. Por "fragmento inmunogénico" se entiende un fragmento de una proteína que incluye uno o más epítopos y de este modo provoca la respuesta inmunológica descrita anteriormente. Tales fragmentos pueden identificarse usando cualquier número de técnicas de mapeo de epítopos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Por ejemplo, los epítopos lineales pueden determinarse mediante, por ejemplo, la síntesis simultánea de un gran número de péptidos sobre soportes sólidos, los péptidos correspondientes a partes de la molécula de proteína, y la reacción de los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos están todavía unidos a los soportes. Tales técnicas se conocen en el sector y se describen en, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos. No. 4.708.871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. De manera similar, los epítopos conformacionales son fácilmente identificables mediante la determinación de la conformación espacial de aminoácidos, tales como mediante, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear de 2 dimensiones. Véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols, supra.
[0034] El término "proteína o péptido inmunogénico" contempla además deleciones, adiciones y sustituciones a la secuencia, siempre que el polipéptido funcione para producir una respuesta inmunológica tal como se define en el presente documento. El término "variación conservativa" se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar, o la sustitución de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico de tal manera que el residuo de aminoácido codificado no cambia o es otro residuo biológicamente similar. A este respecto, las sustituciones particularmente preferidas serán generalmente de naturaleza conservativa, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos. Por ejemplo, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos - aspartato y glutamato; (2) básicos- lisina, arginina, histidina; (3) no polares - alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga -glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Los ejemplos de variaciones conservativas incluyen la sustitución de un resto hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrófobo, o la sustitución de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, y similares; o una sustitución conservativa similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado que no tendrá un efecto importante sobre la actividad biológica. Las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a la inmunogenicidad de la proteína están, por lo tanto, dentro de la definición del polipéptido de referencia. Todos los polipéptidos producidos por estas modificaciones se incluyen en el presente documento. El término "variación conservativa" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido parental no sustituido siempre que los anticuerpos producidos contra el polipéptido sustituido también inmunorreaccionen con el polipéptido no sustituido.
[0035] Una "célula huésped" se refiere a una célula procariota o eucariota que ha sido alterada genéticamente, o es capaz de ser alterada genéticamente mediante la administración de un polinucleótido exógeno, tal como un plásmido o vector recombinante. Cuando se hace referencia a células genéticamente modificadas, el término se refiere tanto a la célula originalmente alterada como a la progenie de la misma. Los polinucleótidos que comprenden una secuencia deseada pueden insertarse en una vector dclonación o e expresión adecuado, y el vector a su vez se puede introducir en una célula huésped adecuada para la replicación y amplificación. Los polinucleótidos pueden introducirse en células huésped mediante cualquier medio conocido en la técnica. Los vectores que contienen los polinucleótidos de interés pueden introducirse en la célula huésped mediante cualquiera de una serie de medios adecuados, incluyendo captación directa, endocitosis, transfección, f-apareamiento, electroporación, transfección con cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE dextrano, u otras sustancias; bombardeo con microproyectiles; lipofección; y la infección (donde el vector es infeccioso, por ejemplo, un vector retroviral). La elección de los vectores o polinucleótidos de introducción dependerá a menudo de características de la célula huésped.
[0036] Una "respuesta inmunológica" a una composición o vacuna es el desarrollo en el huésped de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a una composición o vacuna de interés. Por lo general, una "respuesta inmunológica" incluye, pero no se limita a, uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares, y/o células T citotóxicas, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferentemente, el huésped mostrará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora, tal que la resistencia a una nueva infección se verá reforzada y/o la gravedad clínica de la enfermedad se verá reducida. Dicha protección se demostrará por una reducción o falta de los síntomas normalmente mostrados por un huésped infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o un título viral disminuido en el huésped infectado.
[0037] Una realización descrita en el presente documento es la secuencia de ADN genómico y secuencias de proteínas codificadas de APMV-8. La secuencia de ADN genómico complementario (ADNc) de la cepa de APMV-8 de la presente invención tiene una secuencia de polinucleótido como se expone en SEQ ID NO: 1. La secuencia de ADNc genómico de APMV-8 (SEQ ID NO: 1) tiene un 48% de identidad de secuencia con el ADN genómico de APMV-1 (SEQ ID NO: 15), un 61% de identidad de secuencia con el ADN genómico de APMV-2 (SEQ ID NO: 16), un 47,2% de identidad de secuencia con el ADN genómico de APMV-3 (SEQ ID NO: 17), un 47,6% de identidad de secuencia con el ADN genómico de APMV-4 (SEQ ID NO: 18), un 52% de identidad de secuencia con el ADN genómico de APMV-6 (SEQ ID NO: 19), un 53% de identidad de secuencia con el ADN genómico de APMV-7 (SEQ ID NO: 20), un 99,1% de identidad de secuencia con el ADN genómico de APMV-8 (SEQ ID NO: 37), un 96,5% de identidad de secuencia con el ADN genómico de APMV-8 (SEQ ID NO: 38), un 96,4% de identidad de secuencia con el ADN genómico de APMV-8 (SEQ ID NO: 39), un 48% de identidad de secuencia con el ADN genómico de APMV-9 (SEQ ID NO: 40). En otra realización, en el presente documento se describe un polinucleótido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10 o 12, y una variante o fragmento de las mismas. En el prsente documento se describe además una cadena complementaria a un polinucleótido descrito en este documento. En aún otra realización, en el presente documento se describe un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 14, y la variante o fragmento de las mismas.
[0038] Además, en el presente documento se describen homólogos de los polinudeótidos o polipéptidos de APMV, por ejemplo cepas APMV-8, APMV-2, APMV-4, APMV-6. Como se usa en el presente documento, el término "homólogos" incluye ortólogos, análogos y parálogos. El término "análogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que tienen la misma o similar función, pero que han evolucionado por separado en organismos no relacionados. El término "ortólogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos de diferentes especies, pero que han evolucionado a partir de un gen ancestral común por especiación. Normalmente, los ortólogos codifican polipéptidos que tienen las mismas o similares funciones. El término "parálogos" se refiere a dos polinucleótidos o polipéptidos que están relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos usualmente tienen diferentes funciones, pero estas funciones pueden estar relacionadas. Los análogos, ortólogos y parálogos de un polipéptido de APMV de tipo salvaje pueden diferir del polipéptido de APMV de tipo salvaje por modificaciones posteriores a la traducción, por diferencias en la secuencia de aminoácidos, o por ambos. En particular, los homólogos descritos en el presente documento mostrarán generalmente al menos el 80-85%, 85-90%, 90-95%, o 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidad de secuencia con todo o parte de la secuencias de polinucleótidos o polipéptidos de APMV-8, y mostrarán una función similar.
[0039] En otro aspecto, en el presente documento se describe un ADNc genómico de APMV-8 que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1. En aún otra realización, el polinucleótido es una cadena complementaria inversa del polinucleótido que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1. En aún otra realización, el polinucleótido o una cadena complementaria inversa de un polinucleótido descrito en el presente documento tiene al menos un 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1.
[0040] En una realización, en el presente documento se describe un fragmento de polinucleótido que codifica un polipéptido de AMPV-8, tal como un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia como la expuesta en la SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 14. En aún otro aspecto, en el presente documento se describe un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene al menos un 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96 %, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 14, o una variante conservadora, una variante alélica, un homólogo o un fragmento inmunogénico que comprende al menos ocho o al menos diez aminoácidos consecutivos de uno de estos polipéptidos, o una combinación de estos polipéptidos.
[0041] En otro aspecto, en el presente documento se describe un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos como se expone en SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10, o 12, o una variante de las mismas. En aún otra realización, el polinucleótido es una cadena complementaria inversa del polinucleótido que tiene la secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1. En aún otro aspecto, en el presente documento se describe un polinucleótido o una cadena complementaria inversa de un polinucleótido que tiene al menos un 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con uno de un polinucleótido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 1, 2, 4, 6, 8, 10, o 12, o una variante de las mismas.
[0042] En otro aspecto, en el presente documento se describe un polipéptido que tiene al menos un 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido que tiene una secuencia como se expone en SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 14. En aún otro aspecto, en el presente documento se describen fragmentos y variantes de los polipéptidos de APMV identificados anteriormente (SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 14) que fácilmente se pueden preparar por un experto en la técnica usando técnicas de biología molecular bien conocidas.
[0043] Las variantes son polipéptidos homólogos que tienen una secuencia de aminoácidos con al menos un 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 14.
[0044] Las variantes incluyen variantes alélicas. El término "variante alélica" se refiere a un polinucleótido o un polipéptido que contiene polimorfismos que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de una proteína y que existen dentro de una población natural (por ejemplo, una especie o variedad de virus). Tales variaciones alélicas naturales pueden dar lugar típicamente al 1-5% de varianza en un polinucleótido o un polipéptido. Las variantes alélicas pueden identificarse por secuenciación de la secuencia de ácido nucleico de interés en un número de diferentes especies, que pueden llevarse a cabo fácilmente utilizando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético en esas especies. En el presente documento se describen cualquiera y todas dichas variaciones de ácido nucleico y polimorfismos o variaciones de aminoácidos resultantes que son el resultado de la variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de gen de interés.
[0045] El término "identidad" con respecto a secuencias puede referirse a, por ejemplo, el número de posiciones con nucleótidos o aminoácidos idénticos dividido por el número de nucleótidos o aminoácidos en la más corta de las dos secuencias en las que se puede determinar la alineación de los dos secuencias de acuerdo con el algoritmo de Wilbur y Lipman (Wilbur y Lipman). La identidad de secuencia o similitud de secuencia de dos secuencias de aminoácidos, o la identidad de secuencia entre dos secuencias de nucleótidos se pueden determinar utilizando el paquete de software Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA). Cuando las secuencias de ARN se dice que son similares o tienen un grado de identidad u homología de secuencia con secuencias de ADN, la timidina (T) en la secuencia de ADN se considera igual a uracilo (U) en la secuencia de ARN. Por lo tanto, las secuencias de ARN descritas en el presente documento pueden derivarse de secuencias de ADN, considerándose la timidina (T) en la secuencia de a Dn igual a uracilo (U) en las secuencias de ARN.
[0046] En un aspecto, en el presente documento se describe una composición farmacéutica o vacuna para inducir una respuesta inmunológica en un animal huésped inoculado con la vacuna o composición, incluyendo la vacuna o la composición un portador farmacéuticamente aceptable y un virus o vector viral recombinante de APMV. En aún otro aspecto descrito en el presente documento, el virus o vector viral recombinante de APMV incluye, dentro de una región no esencial del genoma del virus, una secuencia de ADN heterólogo que codifica una proteína antigénica derivada de un patógeno en el que la composición o vacuna cuando se administra a un huésped, es capaz de inducir una respuesta inmunológica específica a la proteína codificada por el patógeno.
[0047] Un "vector" se refiere a un plásmido de ADN o ARN recombinante, bacteriófago, o virus que comprenden un polinucleótido heterólogo para ser liberado a una célula diana, ya sea in vitro o in vivo. El polinucleótido heterólogo puede comprender una secuencia de interés para los fines de prevención o terapia, y opcionalmente puede estar en la forma de un casete de expresión. Como se usa en este documento, un vector no necesita ser capaz de replicación en la última célula o materia diana. El término incluye vectores para la clonación, así como vectores virales.
[0048] El término "modificado" o "recombinante" significa un polinucleótido de origen semisintético o sintético que, o bien no se produce en la naturaleza o está ligado a otro polinucleótido en una disposición no encontrada en la naturaleza.
[0049] El término "región no esencial" se refiere a una región del genoma de un virus que no es esencial para la replicación y propagación del virus en cultivo tisular y cuya deleción o inactivación puede reducir la virulencia en una diversidad de sistemas animales. Cualquier región no esencial o parte de la misma puede eliminarse del genoma de APMV o puede insertarse una secuencia extraña en el mismo, y la viabilidad y estabilidad del APMV recombinante resultante de la deleción o inserción se pueden utilizar para determinar si una región eliminada o porción de la misma es de hecho esencial. En una realización, la región no esencial del genoma de APMV es cualquier región del genoma de APMV-2, 4, 6, o 8 que no codifica la polimerasa (L). En aún otra realización, la región no esencial comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteína no esencial. En este aspecto, el marco de lectura abierto se selecciona del grupo que consiste en nucleoproteína (NP), fosfoproteína (P), proteína de matriz (M), proteína de fusión (F), y la hemaglutinina/neuraminidasa (HN). En una realización, la región no esencial se encuentra en dirección 5' del gen de NP. En otra realización, la región no esencial está situada en dirección 3' del gen de L. En aún otra realización, la región no esencial es una región no codificante o región intergénica. En este aspecto, la región no codificante o intergénica puede ser una región entre los genes de NP y P, entre los genes de P y M, entre los genes de M y F o entre los genes de F y HN en el genoma de APMV-2, 4, 6, o 8. En aún otra realización, la región no esencial puede estar en la región de las posiciones de nucleótidos 1 - 140, 1526 - 1692, 2910 - 3085, 4195 -4498, 6130 -6382, 8116 - 8272, 8116 -8289, o 15013 - 15342 de la SEQ ID NO: 1.
[0050] En otro aspecto, en el presente documento se describen quimeras de APMV en las que una parte o el gen completo o varias partes o genes completos del vector de APMV son reemplazados por genes similares de otros virus, en particular los que pertenecen a la familia Paramyxoviridae.
[0051] En una realización descrita en el presente documento, la vacuna o composición farmacéutica comprende un antígeno seleccionado del grupo de patógenos aviares que incluyen, pero no se limitan a, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, virus de la bronquitis infecciosa (IBV), virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), virus del síndrome de caída del huevo (EDS), o el virus de la bursitis infecciosa (IBDV), el virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV), adenovirus aviares, virus de la enfermedad de Marek (MDV), virus de la viruela aviar, virus de la enteritis de los patos (DEV), parvovirus de pato, virus de la gripe aviar, APMV, tal como APMV-1, y similares, y combinaciones de los mismos.
[0052] En otra realización, la vacuna o composición farmacéutica comprende un antígeno seleccionado entre un patógeno felino, tal como, pero no limitado a, virus de herpes felino (FHV), calicivirus felino (FCV), virus de la leucemia felina (FeLV), virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), parvovirus felino (FPV), virus de peritonitis infecciosa felina (FIPV), virus de la rabia, y similares, y combinaciones de los mismos.
[0053] En aún otra realización, la vacuna o composición farmacéutica descrita en el presente documento comprende un antígeno seleccionado de un patógeno canino incluyendo, pero no limitado a, virus de la rabia, virus del herpes canino (CHV), parvovirus canino (CPV), virus del moquillo canino (CDV), parainfluenza canina 2 (CPI2), coronavirus canino, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorragiae, Leptospira grippotyphosa, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica y similares, y combinaciones de los mismos.
[0054] En aún otra realización, la vacuna o composición farmacéutica comprende un antígeno seleccionado entre un patógeno equino, tal como virus del herpes equino (tipo 1 o tipo 4), virus de la gripe equina, tétano, virus del Nilo Occidental, arterivirus equino y similares, o combinaciones de los mismos.
[0055] En aún otra realización, la vacuna o composición farmacéutica comprende un antígeno seleccionado entre un patógeno bovino, ovino o caprino, tales como virus de la rabia, rotavirus bovino, virus parainfluenza bovino tipo 3 (bPIV-3), coronavirus bovino, virus de la diarrea viral bovino (BVDV), virus de la enfermedad de pies y boca (FMDV), virus de la peste bovina (RPV), virus de la peste de pequeños rumiantes (PPRV), virus de la fiebre catarral maligna, virus sincitial respiratorio bovino (BRSV), virus de la rinotraqueitis infecciosa bovina (IBR), Escherichia coli, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica y similares, y combinaciones de los mismos.
[0056] En aún otra realización, la vacuna o composición farmacéutica comprende un antígeno seleccionado entre un patógeno porcino, tal como, pero no limitado a, virus de la gripe porcina (SIV), circovirus porcino tipo 2 (PCV-2), virus del síndrome respiratorio reproductivo porcino (PRRS), virus de la pseudorrabia (PRV), parvovirus porcino (PPV), FMDV, Mycoplasma hyopneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli y similares, y combinaciones de los mismos.
[0057] La construcción de virus recombinante es bien conocida en la técnica, tal como se describe en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos Nos. 4.769.330, 4.722.848, 4.603.112, 5.174.993, y 5.756.103, 6.719.979. Específicamente, un virus APMV recombinante se puede construir en dos etapas. En primer lugar, el gen de interés a insertar en el virus, tal como un marco de lectura abierto de un antígeno de un APMV-1 (NDV) o virus de la gripe aviar o de otro organismo, se coloca en un constructo de plásmido de E. coli en el cual se inserta ADNc homólogo a una sección de ADNc del APMV. Por separado, la secuencia del gen de ADNc para ser insertado está precedido por una región promotora (región de inicio de gen) y seguido por una región final de gen que es específica para el vector de APMV. El fragmento de ADN de inicio de gen/antígeno exógeno/final del gen está flanquado por un fragmento de ADNc homólogo de ADNc de APMV-8 que contiene sitios de escisión por enzima de restricción única. El constructo de plásmido resultante se amplifica a continuación por crecimiento en bacterias E. coli y se aisla. A continuación, el plásmido recombinante se utiliza en un digesto de enzima de restricción para cortar el fragmento de ADN de inicio de gen/antígeno exógeno/final del gen que está flanqueado por ADNc homólogo de ADNC de APMV-8 y este fragmento se ligó en el constructo de longitud completa adecuadamente escindido de APMV-8.
[0058] El constructo de longitud completa que contiene el gen de interés se transfecta en células junto con los plásmidos que contienen polinucleótidos para la expresión de la nucleoproteína (NP) de APMV, la fosfoproteína (P) de AMPV y la ARN polimerasa (L) de APMV, así como la T7 ARN polimerasa. Todos los constructos de ADNc de APMV están bajo el control del promotor de T7 polimerasa. El rescate del virus infeccioso se realiza como se describe en Romer-Oberdorfer et al., 1999 y como se muestra en la figura 19A. La expresión de la T7 ARN polimerasa en las células transfectadas se puede obtener por diferentes medios que incluyen la transfección de ADN de plásmido que contiene un casete de expresión de la T7 ARN polimerasa, el virus recombinante (como la viruela aviar o el virus de la viruela del canario) que expresa la T7 ARN polimerasa o en las células que expresan la T7 ARN polimerasa. En otro aspecto, los polinucleótidos para la expresión de la nucleoproteína (NP) de APMV, la fosfoproteína (P) de APMV (P) y la ARN polimerasa (L) de APMV y el ARNc viral de longitud completa están bajo el control del promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano. El rescate del virus se lleva a cabo como se describe en Inoue K, et al., 2003.
[0059] La expresión con éxito del ADNc insertado de interés (ADNc exógeno o ADNc heterólogo) por el virus infeccioso modificado requiere dos condiciones. En primer lugar, la inserción debe introducirse en una región del genoma del virus con el fin de que el virus modificado permanezca viable. La segunda condición para la expresión del ADNc insertado es la presencia de secuencias reguladoras que permitan la expresión del gen en la base viral (por ejemplo: regiones de inicio de gen, parada de gen, promotor, potenciador, señales de poliadenilación, intergénica y no traducidas).
[0060] En general, es ventajoso emplear un fuerte promotor funcional en células eucariotas. En una realización, el promotor utilizado para la transcripción de ARNm viral por la ARN polimerasa viral es la "secuencia de inicio del gen". La "secuencia de inicio del gen" es el sitio de unión para que la proteína L se una y transcriba el ARN viral situado en dirección 3' en el ARNm viral.
[0061] En una realización, en el presente documento se describe la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una vacuna de APMV para la administración y expresión de un antígeno, epítopo o inmunógeno en una célula diana. La determinación de la cantidad terapéuticamente eficaz es experimentación rutinaria para un experto en la materia. En una realización, la formulación de vacuna de APMV comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un antígeno, epítopo o inmunógeno y un portador, vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable. En otra realización, el portador, vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable facilita la transfección y/o mejora la conservación del vector o proteína.
[0062] Los portadores o vehículos o excipientes aceptables farmacéutica o veterinariamente son bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, un portador o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una solución de NaCl al 0,9% (por ejemplo, solución salina) o un tampón fosfato. Otros portadores o vehículos o excipientes farmacéutica o veterinariamente aceptables que se pueden utilizar para los procedimientos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, poli-(L-glutamato) o polivinilpirrolidona. El o portador o vehículo o excipiente farmacéutica o veterinariamente aceptable pueden ser cualquier compuesto o combinación de compuestos que facilitan la administración del vector (o proteína expresada a partir de un vector in vitro), o facilitar la transfección y/o mejorar la conservación del vector (o proteína). Las dosis y volúmenes de dosis se describen en el presente documento en la descripción general y también pueden determinarse por el experto en la materia a partir de esta descripción en relación con el conocimiento en la técnica, sin experimentación indebida.
[0063] En otra realización, el portador, excipiente o vehículo farmacéutica o veterinariamente aceptable puede ser una emulsión de agua-en-aceite. Ejemplos de emulsiones de agua-en-aceite adecuadas incluyen emulsiones vacunales de agua-en-aceite a base de aceite que son estables y fluidas a 4°C que contienen: de 6 a 50% v/v de una fase acuosa que contiene el antígeno, de 12 a 25% v/v, de 5o a 94% v/v de una fase oleosa que contiene en total o en parte un aceite no metabolizable (por ejemplo, aceite mineral, tal como aceite de parafina) y/o aceite metabolizable (por ejemplo, aceite vegetal, o ácido graso, un poliol o ésteres de alcohol), de 0,2 a 20% p/v de tensioactivos, de 3 a 8% p/v, estando el último en total o en parte, o en una mezcla, ya sea de ésteres de poliglicerol, siendo dichos ésteres de poliglicerol (poli)ricinoleatos de poliglicerol, o aceites de ricino polioxietilenados o aceites de ricino polioxietilenados hidrogenados. Ejemplos de tensioactivos que pueden usarse en una emulsión de aguaen-aceite incluyen ésteres de sorbitán etoxilados (por ejemplo, monooleato de sorbitán con polioxietileno (20) (TWEEN 80®), disponible de AppliChem, Inc., Cheshire, CT) y ésteres de sorbitán (por ejemplo, monooleato de sorbitán (SPAN 80®), disponible de Sigma Aldrich, St. Louis, MO). Además, con respecto a una emulsión de aguaen-aceite, véase también la patente de Estados Unidos N° 6.919.084. En algunas realizaciones, la fase acuosa que contiene el antígeno comprende una solución salina que comprende uno o más agentes tamponantes. Un ejemplo de una solución tamponante adecuada es solución salina tamponada con fosfato. En una realización, la emulsión de agua-en-aceite puede ser una emulsión triple agua/aceite/agua (W/O/W) (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.358.500). Se describen ejemplos de otras emulsiones adecuadas en la patente de Estados Unidos N° 7.371.395.
[0064] Las composiciones farmacéuticas y vacunas descritas en el presente documento pueden comprender o consistir esencialmente en uno o más adyuvantes. Los adyuvantes adecuados para uso en la práctica de la presente invención son (1) polímeros de ácido acrílico o metacrílico, anhídrido maleico y polímeros de derivados de alquenilo, (2) secuencias inmunoestimulantes (ISS), tales como secuencias de oligodesoxirribonucleótidos que tienen una o más unidades de CpG no metiladas (Klinman et al, 1996;. WO98 / 16247), (3) una emulsión de aceite en agua, tal como la emulsión SPT descrita en la pág 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, y la emulsión MF59 descrita en la pág 183 de la misma obra, (4) lípidos catiónicos que contienen una sal de amonio cuaternario, por ejemplo, DDA (5) citocinas, (6) hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio, (7) saponina u (8) cualquier combinación o mezclas de los mismos.
[0065] La emulsión de aceite en agua (3), que es especialmente apropiada para vectores virales, puede basarse en: aceite de parafina líquida ligero (tipo farmacopea europea), aceite de isoprenoide, tales como escualano, escualeno, aceite resultante de la oligomerización de alquenos, por ejemplo, isobuteno o deceno, ésteres de ácidos o alcoholes que tienen un grupo alquilo de cadena lineal, tales como aceites vegetales, oleato de etilo, propilenglicol, di(caprilato/caprato), tri(caprilato/caprato) de glicerol y dioleato de propilenglicol, o ésteres de alcoholes o ácidos grasos ramificados, especialmente ésteres de ácido isoesteárico. El aceite se utiliza en combinación con emulsionantes para formar una emulsión. Los emulsionantes pueden ser tensioactivos no iónicos, tales como: ésteres de, por un lado, sorbitán, manida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), glicerol, poliglicerol o propilenglicol y, por otro lado, ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, estando dichos ésteres opcionalmente etoxilados , o bloques de copolímero de polioxipropileno-polioxietileno, tales como Pluronic, por ejemplo, L121. Entre los polímeros adyuvantes del tipo (1), se da preferencia a polímeros de ácido acrílico o metacrílico reticulado, especialmente reticulado por polialquenil éteres de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos son conocidos bajo el nombre de carbómero (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, junio de 1996). Un experto en la materia también puede hacer referencia a la patente de Estados Unidos N° 2.909.462, que proporciona tales polímeros acrílicos reticulados por un compuesto polihidroxílico que tiene al menos tres grupos hidroxilo, preferiblemente no más de ocho de dichos grupos, estando los átomos de hidrógeno de al menos tres grupos hidroxilo sustituidos por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos dos átomos de carbono. Los radicales preferidos son aquellos que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo vinilos, alilos y otros grupos etilénicamente insaturados. Los radicales insaturados también pueden contener otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos vendidos bajo el nombre Carbopol (BF Goodrich, Ohio, Estados Unidos) son especialmente adecuados. Se reticulan mediante alil sacarosa o alil pentaeritritol. Entre éstos, se hace referencia a Carbopol 974P, 934P y 971 P.
[0066] En cuanto a los copolímeros derivados de anhídrido maleico-alquenilo, se da preferencia a EMA (Monsanto), que son copolímeros de etileno-anhídrido maleico de cadena lineal o reticulados y están, por ejemplo, reticulados por divinil éter. También se hace referencia a J. Fields et al., 1960.
[0067] Con respecto a la estructura, los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y EMA están formados preferentemente por unidades básicas que tienen la siguiente fórmula:
Figure imgf000013_0001
en la que:
-R1 y R2, que pueden ser iguales o diferentes, representan H o CH3
-x = 0 o 1, preferiblemente x = 1
-y = 1 o 2, con x y = 2.
para EMA, x = 0 y y = 2 y para carbómeros x = y = 1.
[0068] Estos polímeros son solubles en agua o solución salina fisiológica (20 g/l de NaCl) y el pH se puede ajustar a 7,3 a 7,4, por ejemplo, mediante sosa (NaOH), para proporcionar la solución adyuvante en la que se pueden incorporar el vector o vectores de expresión. La concentración de polímero en la composición inmunológica o de vacuna final puede oscilar entre 0,01 y 1,5% p/v, entre 0,05 y 1% p/v, y entre 0,1 y 0,4% p/v.
[0069] Otro aspecto descrito en el presente documento es un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un animal a un antígeno, cuyo procedimiento comprende inocular al animal con una vacuna o una composición farmacéutica que incluye un virus de APMV modificado recombinante que comprende y codifica el antígeno de un patógeno para dicho animal. Aún otro aspecto descrito en el presente documento es un procedimiento para inducir una respuesta inmunológica en un animal a un antígeno en un régimen de administración de sensibilización-refuerzo, que se compone de al menos una administración de sensibilización o primaria y al menos una administración de refuerzo usando al menos un polipéptido, antígeno, epítopo o inmunógeno común. La composición inmunológica o vacuna utilizada en la administración de sensibilización o primaria puede ser la misma, pueden ser de naturaleza diferente de las utilizadas como refuerzo. En un aspecto del protocolo de sensibilizaciónrefuerzo descrito en el presente documento, una composición o vacuna que comprende el virus (vector viral) APMV recombinante descrita en el presente documento se administra seguido por la administración de una vacuna viral inactivada o composición que comprende un antígeno, o una vacuna o la composición que comprende una subunidad (proteína, antígeno), o una vacuna de ADN plasmídico o composición que contiene o expresa un antígeno. Del mismo modo, un protocolo de sensibilización-refuerzo puede comprender la administración de una vacuna viral inactivada o composición que comprende un antígeno, o una vacuna o composición que comprende una subunidad (proteína, antígeno), o una vacuna de ADN plasmídico o composición que contiene o expresa un antígeno, seguido de la administración de una composición o vacuna que comprende el virus (vector viral) APMV recombinante descrita en el presente documento. Se observa además que las administraciones primaria y secundaria pueden comprender la composición o vacuna que comprende el virus (vector viral) APMV recombinante descrita en el presente documento.
[0070] La administración primaria puede comprender una o más administraciones de las mismas composiciones inmunológicas de vacunas basadas en vectores virales. Del mismo modo, la administración de refuerzo puede comprender una o más administraciones de la misma composición de vacuna inmunológica o basada en vector viral. La vía de administración de la sensibilización y el refuerzo puede ser la misma o diferente. Del mismo modo, el origen del gen protector presente en la sensibilización y el refuerzo pueden ser el mismo o diferente (cepa diferente, por ejemplo).
[0071] Las diversas administraciones se realizan preferiblemente con 1 a 6 semanas de diferencia, y más particularmente de aproximadamente 3 semanas de diferencia. Según un modo preferido, también se prevé un refuerzo anual, preferiblemente usando la composición inmunológica basada de la vacuna en vector viral. Los animales tienen preferiblemente al menos un día de vida en el momento de la primera administración.
[0072] Se pueden usar una variedad de rutas de administración, tales como por vía subcutánea o por vía intramuscular, intradérmica, transdérmica, aerosol, agua potable, gota ocular, intranasal, cebos orales, orales, in ovo o una combinación (por ejemplo oculonasal, oronasal).
[0073] En el presente documento se describen adicionalmente los siguientes ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 APMV-2, APMV-4, y APMV-6
A. Los virus y las aves
[0074] Se colocaron pollos SPF de 1 día de vida (libres de patógenos específicos) (Merial, Gainesville, GA) en unidades de aislamiento Horsfall-Baur con presión positiva. Se proporcionaron alimentación y el agua ad libitum y las aves fueron examinados dos veces al día. Los virus (APMV-2, 4, y 6) utilizados para estudios experimentales fueron aislados de aves silvestres y clasificados por el Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios (NVSL, Ames Iowa, Estados Unidos). Los virus se propagaron en huevos de gallina embrionados SPF de 9 días de vida (Sunrise Farms, Catskill, Nueva York, Estados Unidos) mediante la inoculación por vía alantoidea. El fluido alantoideo se recogió en el día 3 después de la inoculación, se dividió en alícuotas y se almacenó a -80°C. El subtipo de APMV fue confirmado por la prueba de HI usando sueros estándar (NVSL, Ames, Iowa, Estados Unidos). El 50% de la dosis infecciosa del huevo (EID50) para cada aislado se determinó mediante la inoculación de diluciones en serie de 10 veces de fluido alantoideo de huevos SPF embrionados. El título se calculó según el procedimiento descrito por Reed y Muench (Reed, LJ et al, 1938, Am J. Epidemiol 27: 493-497).
B. Infección experimental
[0075] Se infectaron veinticinco pollos SPF de un día de vida por grupo con 106 EID50 por pollo por la vía ocularnasal. Los pollos del grupo de control se inocularon por simulación con PBS (solución salina tamponada con fosfato). En los días 2, 4, 7, 14 y 28 después de la infección se extrajo sangre de cinco aves de cada grupo a través de la vena del ala para recoger muestras de suero, se sacrificaron con CO2, y se hizo la necropsia. Se recogieron muestras de tejido de la tráquea, pulmón, páncreas e intestino. Para cada órgano, se utilizó un nuevo par de tijeras y pinzas estériles. La mitad de la muestra de tejido se colocó en un tubo de Lysing Matrix D (MP Biomedicals, Solon, OH) que contenía medio de transporte viral (1X medio esencial mínimo, bicarbonato de sodio 7,5%, HEPES 15 mM, suero bovino fetal al 1%, 4.000 U/ml penicilina, 400 |ig/ml de gentamicina, 8 |ig/ml de anfotericina B, 4.000 |ig/ml de estreptomicina, 1.000 |ig/ml de sulfato de kanamicina). La segunda mitad de la muestra de tejido se fijó en formalina al 10% tamponada y se embebió en cera de parafina. Las secciones de los tejidos incluidos en parafina se tiñeron con hematoxilina de Mayer y eosina (H & E).
[0076] Los resultados mostraron que la diarrea leve se observó el día cuatro y el siete después de la infección en las aves infectadas con APMV-2 o APMV 4. Durante la necropsia, las aves infectadas con APMV-2 mostraron un páncreas ligeramente agrandado en el día dos y cuatro después de la infección. No se observaron otras lesiones macroscópicas en cualquier otro grupo.
C. Serología
[0077] Las pruebas de hemaglutinación (HA) e inhibición de la hemaglutinación (HI) se utilizaron para detectar el virus en el fluido alantoico y analizar la presencia de anticuerpos HI en muestras de suero recogidas, respectivamente. Las pruebas se realizaron mediante procedimientos estándar utilizando 0,8% de glóbulos rojos de pollo resuspendidas en PBS. La prueba de HI se realizó por el procedimiento de antígeno constante en suero diluido. Se utilizaron ocho unidades HA de antígeno viral para cada dilución de suero.
[0078] Los títulos de anticuerpos HI fueron investigados en el día 2, 4, 7, 14, y 28 después de la infección. Se observaron títulos positivos HI (> 1:16) en muestras de suero de aves infectadas con APMV-2 en el día 7 (1/5), día 14 (5/5), y el día 28 después de la infección (5/5). Curiosamente, sólo un pollo infectado con APMV-4 desarrolló un título de H i que ha sido considerado como positivo durante el transcurso del experimento en el día 14 después d ela infección. De manera similar para APMV-6, dos pollos de cinco desarrollaron un título de HI de 1:16, sólo en el día 28 después de la infección. Las aves inoculadas con simulación permanecieron negativos para anticuerpos HI para los tres APMV utilizados en este experimento. Además, para excluir la contaminación cruzada todos los sueros se ensayaron para anticuerpos HI contra los otros dos antígenos y permanecieron negativos.
D. Aislamiento del virus
[0079] Las muestras de tejido recogidas en los tubos de Lysing Matrix D (MP Biomedicals, Solon, OH, Estados Unidos) se homogeneizaron dos veces usando la Fastprep®-24 (MP Biomedicals, Solon, OH) en una configuración de 4,0 M/S durante 20 segundos. Después de la incubación durante 15 min a temperatura ambiente, las muestras homogeneizadas se centrifugaron durante 20 min a 2000 g a 4°C. La esterilidad se ensayó después de la inoculación de 50 |il del sobrenadante obtenido en 2 ml de caldo de fosfato de triptosa (TPB) (DIFCO, Becton Dickenson, Sparks, MD, Estados Unidos) suplementado con hidrolactoallbúmina al 10% mediante incubación a 37°C en un agitador orbital durante la noche. Las muestras no estériles se filtraron con filtros de jeringa de 0,45 |im (Whatman Inc., Florham Park, NJ, Estados Unidos). Las muestras se almacenaron a -80°C. El aislamiento del virus se realizó por inoculación de 0,1 ml en la cavidad alantoidea de huevos de pollo SPF embrionados de 9 días de vida.
Después de la incubación durante tres días a 37,5°C, se recogió el fluido alantoideo y se ensayó para la presencia de actividad hemaglutinante por HA.
[0080] Para analizar los sitios de la replicación del virus, se analizaron varios órganos (tráquea, pulmón, intestino, páncreas) para el virus infeccioso por aislamiento del virus en huevos embrionados (Figura 1). En general, la replicación del virus sólo se detectó en algunos pollos. Brevemente, se recuperó APMV-4 en el día 2 de la tráquea, pulmón y páncreas mientras APMV-6 se aisló de pulmón y páncreas. En el día 4, se aisló APMV-2 de tráquea y pulmón, mientras que APMV-6 se aisló de todos los órganos analizados, excepto el intestino. En el día 7, a PmV-2 se aisló de una sola muestra de intestino, APMV-4 se aisló del páncreas, mientras que APMV-6 se aisló de las muestras de pulmón y el páncreas. Sorprendentemente, en el día 14 después de la infección no se aisló ningún virus, mientras que en el día 28 después de la infección, se pudieron aislar APMV-2, 4 y 6 del páncreas. No se aisló el virus de las aves inoculadas con simulación. La identidad del virus aislado de nuevo se confirmó mediante la prueba de HI usando sueros estándar como los proporcionados por NVSL.
[0081] Para evaluar el potencial patológico de los virus investigados, se analizaron las lesiones microscópicas en los órganos obtenidos (Figura 2). En el día 2 después de la infección, se observó una traqueítis catarral además de la pérdida ciliar del epitelio respiratorio y una enteritis leve en todos los pollos infectados. En el día 4 después de la infección, los pollos infectados con APMV-2 mostraron un mayor número de glándulas mucosas hipertróficas en la tráquea y ulceraciones focales del epitelio respiratorio. Las aves infectadas con APMV-4 mostraron cambios muy sugestivos de una infección respiratoria, tal como traqueítis leve, pancreatitis linfocítica multifocal leve a moderada y también una hiperplasia de BALT (tejido linfoide asociado a los bronquios) focal en el día 4 después de la infección. La investigación sobre los órganos de pollos infectados con APMV-6 revelaron cambios traqueales, tales como traqueítis catarral y ulcerosa y una pancreatitis focal que son consistentes con una estimulación viral. En el día 7 después de la infección, los pollos infectados con APMV-2 mostraron una atenuación traqueal focal o sustitución del epitelio respiratorio como indicativo de curación. Las aves infectadas con APMV-4 mostraron hiperplasia de BALT leve, mientras que las aves infectadas con APMV-6 mostraron enteropatía quística, enteritis focal y la infiltración linfocitaria en el páncreas. Además de enteritis linfocítica leve e hiperplasia de GALT leve, las aves infectadas por APMV-2 también mostraron cambios en la curación, tales como la atenuación de la tráquea en el día 14 después de la infección. Las muestras de órganos de pollos infectados con APMV-4 o 6 mostraron cambios sugestivos de infección viral, tales como la neumonía intersticial leve, traqueítis catarral e hiperplasia de BALT o GALT en el día 14 después de la infección. Todas las muestras investigadas obtenidas a partir de pollos infectados mostraron lesiones, tales como hiperplasia de GALT, pancreatitis linfocítica y bronquitis linfocítica en el día 28 después de la infección. En el día 2, las aves del grupo de control mostraron una traqueítis catarral suave que podría atribuirse a factores ambientales.
[0082] La Figura 3 muestra títulos bajos de HI (hasta 1:32 en el día 14) de pollos SPF infectados con APMV-4 o APMV-6, lo que indica que sólo la infección con APMV-2 provocaba una respuesta de HI que podría ser caracterizada como seropositiva. Sin embargo, los tres virus se recuperaron de la tráquea, los pulmones, el intestino y el páncreas de las aves infectadas hasta el día 7 después de la infección y del páncreas hasta el día 28 después de la infección. La infección con APMV-2, 4, o 6 mostró lesiones histopatológicas características (que se resumen en la figura 2) en todas las aves infectadas, indicativo de la estimulación con un antígeno viral. El aislamiento viral y perfiles histológicos de las aves infectadas representaban claramente el tropismo de los virus en las aves infectadas (la tráquea y los pulmones desde el día 2 hasta el día 7 y el intestino, pulmón y páncreas desde el día 7 en adelante). Se detectaron todos los aislados en el páncreas hasta 28 días después de la infección, pero el aislamiento del virus no fue posible en el día 14 después de la infección. Esto indicó que el APMV investigado probablemente puede persistir y luego reactivarse. Por lo tanto, los portadores del virus pueden estar presentes en los grupos infectados. Sólo APMV-2 indujo anticuerpos de HI, mientras que no se detectaron anticuerpos de HI de pollos infectados con APMV-4 y 6.
Ejemplo 2 APMV-8
A. Los virus y las aves
[0083] Se colocaron pollos SPF de 1 día de vida (Merial, Gainesville, GA, Estados Unidos) y patos Pekín (Metzer Farms, Gonzales, CA, Estados Unidos) en unidades de aislamiento Horsfall-Baur con presión positiva. Se proporcionaron alimentación y el agua ad libitum y las aves fueron examinados dos veces al día. El virus APMV-8 (APMV-8: SCWDS ID: MA-7) utilizado para los estudios experimentales se aisló de una Mallard y se clasificó por el Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios (NVSL, Ames Iowa, Estados Unidos). Los virus se propagaron en huevos de gallina embrionados SPF de 9 días de vida mediante la inoculación por vía alantoidea. Los fluidos alantoideos se recogieron en el día 3 después de la inoculación, se agruparon, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80°C. El subtipo de APMV-8 fue confirmado por la prueba de HI usando sueros estándar proporcionados por el Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios (Ames IA, Estados Unidos). La EID50 se determinó mediante la inoculación de diluciones en serie de 10 veces de fluido alantoideo en huevos SPF embrionados. El título se calculó según el procedimiento descrito por Reed y Muench (Reed, LJ et al, 1938, Am J. Epidemiol 27: 493-497).
B. Infección experimental
[0084] Se infectaron veinticinco pollos SPF o patos Pekín de un día de vida por grupo por la vía ocular-nasal con 106 EID50 por ave diluido en PBS. Las aves del grupo de pollos o patos de control se inocularon por simulación con PBS. Se extrajo sangre de cinco aves de cada grupo a través de la vena braquial para recoger muestras de suero, se sacrificaron humanamente con CO2, y se hizo la necropsia a los dos, cuatro, siete, catorce y veintiocho días después de la infección. Se recogieron muestras de tejido de la tráquea, pulmón, páncreas e intestino (duodeno). Para cada órgano, se utilizó un nuevo par de tijeras y pinzas estériles. La mitad de la muestra de tejido se colocó en un tubo de Lysing Matrix D (MP Biomedicals, Solon, OH, Estados Unidos) que contenía medio de transporte viral (1X medio esencial mínimo, bicarbonato de sodio 7,5%, HEPES 15 mM, suero bovino fetal al 1%, 4.000 U/ml penicilina, 400 |ig/ml de gentamicina, 8 |ig/ml de anfotericina B, 4.000 |ig/ml de estreptomicina, 1.000 |ig/ml de sulfato de kanamicina). La segunda mitad de la muestra de tejido se fijó en formalina al 10% tamponada y se procesó de forma rutinaria, se embebió, se seccionó y se tiñó con hematoxilina y eosina.
C. Aislamiento de virus
[0085] Las muestras de tejido recogidas en los tubos de Lysing Matrix D se homogeneizaron dos veces usando la Fastprep®-24 (MP Biomedicals) en una configuración de 4,0 M/S durante 20 segundos. Las muestras homogeneizadas se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente y a continuación se centrifugaron durante 20 min a 2000 g a 4°C. Se inocularon 50 |il del sobrenadante obtenido en 2 ml de TFB suplementado con hidrolactoallbúmina al 10% mediante incubación a 37°C en un agitador orbital durante la noche para ensayar la esterilidad. Las muestras no estériles se filtraron con filtros de jeringa de 0,45 |im (Whatman Inc.. Las muestras se almacenaron a -80°C. El aislamiento del virus se realizó por inoculación de 0,1 ml en la cavidad alantoidea de huevos de pollo SPF embrionados de 9 días de vida. Después de la incubación durante tres días a 37,5°C, se recogió el fluido alantoideo y se ensayó para la presencia de actividad hemaglutinante por HA.
D. Serología
[0086] Las pruebas de hemaglutinación (HA) y de inhibición de la hemaglutinación (HI) se utilizaron para detectar el virus en el fluido alantoico y analizar la presencia de anticuerpos de HI en muestras de suero recogidas, respectivamente. Las pruebas se realizaron mediante procedimientos estándar utilizando 0,8% de glóbulos rojos de pollo resuspendidas en PBS. La prueba de HI se realizó por el procedimiento de antígeno constante en suero diluido. Se utilizaron ocho unidades HA de antígeno viral para cada dilución en suero. Se determinó el título medio geométrica como se ha descrito previamente (Brugh, 1978).
[0087] La figura 4 muestra los títulos de anticuerpos HI de pollos SPF y patos infectados con APMV-8. Los pollos y los patos se infectaron por vía oro-nasal con una dosis de 106 EID50 de APMV-8. Se recogieron muestras de suero en los días 2, 4, 7, 14, y 28 después de la infección y se analizaron mediante la prueba de HI con el antígeno de APMV-8. Los títulos séricos de HI (en log 2) se muestran en el eje izquierdo.
E. Índices de patogenicidad de APMV-8 en pollo
[0088] Para evaluar la virulencia de APMV-8, se determinó el índice de patogenicidad intracerebral (IPIC) según los procedimientos de la Organización Mundial de Salud Animal (OIE, 2008) para el virus de la enfermedad de Newcastle. Se determinó el tiempo muerto medio (MDT) en embriones de pollo como se ha descrito previamente (Swayne et al., 1998) usando una dilución en serie de APMV-8 de 10' 1 a 10' 8.
[0089] La determinación del tiempo muerto medio (MDT) en huevos embrionados, así como la evaluación del índice de patogenicidad intracerebral (IPIC) es una medida importante para la patogenicidad del virus. Con respecto al MDT en huevos embrionados, ninguno de los embriones de los huevos inoculados murió después del período de 7 días y por lo tanto el aislado de APMV-8 puede ser clasificado como lentógeno. La presencia de virus se confirmó por la prueba de HA usando el fluido alantoico de huevos inoculados con la dilución de 10' 6. Todos los pollos inoculados por vía intracerebral no mostraron signos clínicos durante el tiempo de observación dando lugar a un valor ICPI de cero, lo que da lugar a un fenotipo lentógeno.
F. Vacunación de refuerzo de APMV-8
[0090] Se infectaron por vía óculo-nasal diez pollos SPF de un día de vida por grupo con 106 EID50 por ave. Las aves del grupo de pollo de control se inocularon por simulación con PBS. Las aves fueron infectadas de nuevo con la misma dosis 14 días después de la primera infección. La presencia de virus infecciosos se controló en los días 2, 4, 7 y 14 después de la primera infección y los días 2 y 4 después de la segunda infección por aislamiento del virus a partir de frotis traqueales utilizando huevos SPF embrionados de 9 días de vida. La respuesta de los anticuerpos se monitorizó mediante el título de HI de muestras de suero recogidas en los 0, 7, y 14 días después de cada vacunación.
[0091] Con el fin de investigar si una segunda inmunización permitiría el desarrollo de un título de HI más sostenible, se realizó un experimento de esquema de sensibilización/refuerzo (Figura 5). En el día 7 después de la primera infección, todas las diez aves mostraron un HI que variaba de 64 a 1024 (GMT 207). El título se redujo en el día 14 después de la primera infección (GMT 84), pero aumentó después de la infección de refuerzo en el día 14 después de la infección inicial. En el día 7 después de la vacunación de refuerzo, el GMT aumentó a 137 y disminuyó de nuevo a un GMT de 73 en el día 14 después de la segunda infección. El virus infeccioso pudo ser aislado de frotis traqueales en el día 2 (5/10 aves) y el día 4 (4/10 aves) después de la primera infección. Después de la segunda infección ningún virus se aisló de los frotis tomados en el día 2 y 4 después de la infección.
G. Detección de ARN viral por RT-PCR
[0092] La detección de ARN viral a partir de muestras de tejido se realizó después de la homogeneización de muestras de tejido, seguido de aislamiento de ARN usando el kit de aislamiento de ARN muy puro (Roche, Mannheim, Alemania). Se usó un par de cebadores (8NPf1, 8NPr, ver tabla 1) en una RT-PCR usando el kit de RT-PCR Supercript III One Step con Platinum Taq (Invitrogen, Carlsbad, CA, Estados Unidos) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los productos de reacción obtenidos se analizaron en un gel de agarosa al 1% (Figura 6). Los tejidos traqueales se recogieron en el día 2 después de la infección de patos no infectados (C1-C5) y patos infectados con APMV-8 (11-15). Los tejidos se homogeneizaron y se preparó el ARN para RT-PCR. Se preparó en paralelo un control de agua (W). Los productos de reacción se separaron en un gel de agarosa al 1,5%. El tamaño del fragmento se controló mediante el uso de la escalera de 100 pb (New England Biolabs, Boston, MA, Estados Unidos). Los tamaños de los fragmentos de ADN se muestran a la derecha.
Tabla 1 Oligonucleótidos utilizados para la RT-PCR para la detección de ARN viral en muestras de tejido Nombre Secuencia Orientación Ubicación* SEQ ID NO APMV-poliT TTTTTTTTTTTTTTTTTTACCAAACAR sentido 1-14 21
RGAA
8NPf1 CAGGAGACCTGATGTTGCCTCAAC sentido 200-223 22
8NPr GCAGGCGATCTATAGTCTCTGATAG antisentido 618-642 23
H. Determinación de la dosis infecciosa mínima en pollos y patos
[0093] Con el fin de determinar qué título viral sería suficiente en pollos para detectar una seroconversión, se infectaron pollos SPF de un día de vida con diferentes dosis de APMV-8. Las aves fueron colocadas como se describe anteriormente. Diez pollos por grupo se infectaron cada uno con 101, 102, 103, 104 , 105, o 106 EID50. El virus se diluyó en VTM. Un grupo se inoculó con VTM y sirvió como control. Las aves se hicieron sangrar en el día 7 y 14 después de la infección a través de la vena braquial. Sobre la base de los resultados obtenidos durante el experimento con pollo, se infectaron patos Pekín de tres días de vida con diferente cantidad de virus. La dosis de infección se elegió como 103 , 104 , 105 , o 106 EID50 por pato. A un grupo se simuló la infección con VTM. Las aves se hicieron sangrar en el día 7 y 14 después de la infección a través de la vena de la pierna. En la muestra de suero se analizó la presencia de anticuerpos específicos de virus por HI como se describe anteriormente.
I. Determinación de la patogenicidad en patos y pollos
[0094] Durante los experimentos, no se observaron signos clínicos en pollos y patos. Durante la necropsia, tres pollos infectados mostraron ligeramente u páncreas agrandado y el duodeno inflamado en el día dos y cuatro después de la infección. No se observaron otras lesiones macroscópicas en ningún grupo.
[0095] La respuesta serológica se examinó en los días 2,4, 7, 14, y 28 después de la infección mediante investigación de los títulos de HI en el suero (Figura 4). Las muestras de suero de pollos infectados con APMV-8 mostraron títulos de HI positivos (> 16) a partir del día 7 después de la infección (5/5, GMT: 111), 14 días después de la infección (5/5, GMT: 48), y 28 días después de la infección (5/5, GMT: 48). Las muestras de suero de patos infectados con APMV-8 también mostraron títulos de HI positivos (> 16) a los 7 (5/5, GMT 21), 14 (5/5, GMT 28), y 28 (4/5, GMT 14) días después de la infección. Los títulos de HI variaron de 32 a 256 para los pollos, mientras que para los patos el rango fue de 16 a 64. Las aves inoculadas con simulación se mantuvieron negativos para anticuerpos de HI para APMV-8 en todos los puntos de tiempo investigados en ambas especies.
[0096] Para determinar los sitios de la replicación del virus en pollos y patos, se analizaron varios órganos (tráquea, pulmón, duodeno y páncreas) para el virus infeccioso mediante aislamiento del virus en huevos embrionados (Figura 7). En los pollos, se recuperó APMV-8 a los 2 días después de la infección de la tráquea, pulmón, y el duodeno. A los 4 días después de la infección, se aisló APMV-8 de todos los órganos analizados; mientras que a los 7 días después de la infección, se aisló APMV-8 sólo del páncreas. A los 14 y 28 días después de la infección no se aisló ningún virus de ningún órgano. No se aisló el virus de las aves inoculadas con simulación. La identidad del virus aislado de nuevo se confirmó mediante la prueba de HI usando sueros estándar proporcionados por NVSL. Ningún virus fue aislado de niguno de los tejidos de pato recogidos en cualquier punto en el tiempo, incluso después de dos subpases en huevos de gallina SPF embrionados de 9 días de vida. Por lo tanto, los cebadores de RT-PCR se diseñaron basándose en la información de secuencia de APMV-8 disponible para detectar la presencia de ARN viral en las muestras de tejido recogidas (Figura 7). A los 2 días después de la infección se detectó ARN viral en la tráquea (Figura 6), el intestino y el páncreas, mientras que se detectó ARN viral a los 4 días después de la infección en todos los órganos analizados. A los 7, 14, y 28 días después de la infección, se detectó ARN viral sólo en la tráquea y el pulmón. La RT-PCR utilizando ARN obtenido a partir de órganos de aves inoculadas por simulación no dio como resultado la amplificación de un fragmento de RT-PCR, lo que indica la ausencia de APMV-8 en estas aves.
[0097] Para evaluar el potencial patológico del virus investigado, los órganos se analizaron para la presencia de lesiones microscópicas (Figura 8). A los 2 días después de la infección, se observó una traqueítis proliferativa multifocal leve en todos los pollos infectados. Los órganos restantes no mostraron diferencias con el grupo control. Los pollos infectados con APMV-8 mostraron atenuación focal o regeneración del epitelio respiratorio en la tráquea a los 4 días después de la infección como indicativo de curación. Además, las aves también mostraron pancreatitis linfocítica multifocal suave, lo que indicaba una infección viral. Los pollos infectados mostraron cambios en el pulmón a los 7 días después de la infección, tal como BALT moderada a severa, cambios traqueales, tales como traqueítis catarral y pancreatitis linfocítica multifocal. Estos resultados son consistentes con una estimulación antigénica. A los 14 días después de la infección, se observaron cambios traqueales consistentes con la curación y cambios pancreáticos, tales como la pancreatitis linfocítica, sugestiva de infección viral en los pollos infectados. A los 28 días después de la infección, sólo se observaron una traqueítis catarral leve y una enteritis leve en algunos de los pollos infectados. En patos infectados, se observaron traqueítis multifocal linfocítica leve, cambios en los pulmones (neumonía intersticial) y cambios intestinales (enteritis linfocítica) a los 2 días después de la infección, mientras que los cambios traqueales compatibles con infección respiratoria se observaron a los 4 días después de la infección. A los 7 días después de la infección, los patos infectados mostraron traqueítis linfocítica y pancreatitis consistente con la infección viral, mientras que la traqueítis catarral observada fue sugestivo de curación a los 14 días después de la infección. Además, patos infectados mostraron una pancreatitis linfocítica a los 14 días después de la infección. Más tarde, a los 28 días después de la infección, en el pulmón de los patos infectados se observaron una hiperplasia de BALT y también una traqueítis heterófila multifocal leve. Ambas lesiones microscópicas patológicas eran indicativas de una infección viral. En los controles no infectados no se observaron cambios en los órganos examinados.
J. Determinación de la dosis mínima necesaria para la inducción de una respuesta inmune
[0098] Con el fin de examinar la dosis infecciosa mínima que es necesaria para inducir una seroconversión en el pollo, se utilizaron diluciones de diez veces de APMV-8 para infectar diez pollos SPF de un día de vida (Figura 9). Para la prueba de HI, se utilizaron 4 unidades HA que dan lugar a un umbral de 16 para ser considerado como positivo. Las muestras de suero tomadas en el día 14 después de la infección mostraron que una EID50 de 103 era suficiente para inducir una respuesta inmune en 4/10 pollos que se consideraba como positiva (GMT 11). En el día 14 después de la infección con una EID50 de 104 nueve de diez aves mostraron un título > 16 (GMT 34). La infección con una EID50 de 105 y 106 indujo un título de HI de > 16 en el día 14 después de la infección en todas las aves con un GMT de 73 y 137, respectivamente.
[0099] Basándose en este resultado, se infectaron 8 patos cada uno con APMV-8 a partir de una dosis EID50 de 103 por ave hasta una dosis EID50 de 106 por ave (Figura 10). Seis de los ocho patos desarrollaron títulos significativos (> 16) 14 días después de la infección con un GMT de 14 después de la infección con una EID50 de 104/ave. En el día 14 después de la infección 6/8 patos infectados con una EID50 de 105/ave y 7/8 patos infectados con una EID50 de 106/ave desarrollaron títulos significativos (> 16) con un GMT de 17 y 23, respectivamente.
Ejemplo 3 Determinación de la secuencia de longitud completa de APMV-8
[0100] Para la determinación de la secuencia de longitud completa de APMV-8, es necesario inicialmente información de la secuencia de ARN viral. Con este fin, se clonó el extremo 3' del genoma viral mediante el uso de un cebador (APMV-polyT, véase la tabla 1), que contenía una secuencia degenerada basada en secuencias 3' de APMV1 (Genbank N° de acceso AF077761), APMV-2 (Genbank n° de acceso EU338414), y APMV-6 (Genbank N° de acceso EF569970). El ARN viral se purificó a partir de fluido alantoideo utilizando el kit de aislamiento de ARN muy puro (Roche, Mannheim, Alemania). La secuencia se amplificó usando el sistema 5' RACE para amplificación rápida de extremos de ADNc Version 2.0 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se obtuvieron varios fragmentos, se eluyeron en gel y se clonaron en el vector de clonación Topo TA (Invitrogen) y se secuenciaron los clones seleccionados positivos. Las secuencias de nucleótidos obtenidas se analizaron en una búsqueda nblast frente a la base de datos NCBI que dio como resultado ninguna similitud. Una búsqueda tblastx frente a la base de datos NCBI mostró similitudes con la nucleoproteína del 83% de similitud de un paramixovirus aviar 2 (APMV-2/Pollo/California/Yucaipa/56, n° de acceso GenBank EU338414) y de 56% de similitud de una cepa de paramixovirus aviar 6 (APMV-6/Ganso/Lejano Oriente/4440/2003, N° de acceso GenBank EF569970). Usando este cebador, se empleó el procedimiento de “primer walking” utilizando el sistema 5' RACE para amplificación rápida de extremos de ADNc Version 2.0 (Invitrogen). El 5'-RACE produjo un fragmento de aproximadamente 800 pb. Usando esta técnica, se obtuvo nueva información de secuencia basándose en la información de la secuencia de la secuencia anterior que ha sido usada para el diseño de nuevos oligonucleótidos. El extremo 5' del genoma viral también se determinó por el procedimiento 5'-RACE. Se obtuvo el extremo 3' del genoma viral después de la ligadura del ARN con t 4 ARN ligasa1 (New England Biolabs). La reacción de ligación se purificó de nuevo con kit de aislamiento de ARN muy puro (Roche) y se realizó una RT-PCR usando el kit de RT-PCR Superscript III One Step con Platinum Taq (Invitrogen). El fragmento de ADNc obtenido se clonó en el vector pCR2.1 (Invitrogen) y se secuenció. Se secuenciaron tres plásmidos de cada fragmento clonado en ambas direcciones, dando lugar a la secuencia de cobertura 6x por nucleótido.
[0101] La secuencia del genoma de longitud completa de la cepa de APMV-8 analizada tiene 15.342 nucleótidos, esto es de acuerdo a la regla de seis (Calain, P. y Roux, L., 1993) para Paramyxovirinae. Se han detectado seis marcos de lectura abierta (ORF) y codifican proteínas. El orden de las proteínas se determinó como 3'-NP-P-M-F-HN-L-5' (la secuencia del genoma SEQ ID NO: 1 está en la orientación antigenómica 5' a 3') usando similitudes de la secuencia de la proteína a las proteínas de otros paramixovirus aviar. Los posibles codones de inicio y parada de los ORF y el peso molecular teórico (página web del Instituto Suizo de Bioinformática ExPASy) de las proteínas se muestran en la tabla 2.
Tabla 2 Parámetro de las proteínas codificadas por la secuencia de APMV-8
Proteína codón de inicio Codón de parada PM teórico (kD) nucleoproteína (NP) 141-143 1524-1526 51,2 fosfoproteína (P) 1693-1695 2908-2910 43,5 proteína de matriz (M) 3076-3078 4193-4195 40,6 proteína de fusión (F) 4499-4501 6128-6130 58,5 hemaglutinina/neuraminidasa 6383-6385 8114-8116 63,5
(HN)
polimerasa (L) 8273-8275 o 8297-8299 15011-15013 254.6
253.6
[0102] Las posibles secuencias genómicas líder y trailer fueron determinadas mediante la determinación de la posible secuencia de inicio de gen del gen de NP (líder) y la posible secuencia del fin del gen de la proteína L (trailer). La secuencia líder se encuentra desde el nucleótido 1 al nucleótido 55. La posible secuencia de inicio del gen (nt 56-63) del gen de NP termina la secuencia líder. La secuencia trailer se localiza detrás de la última secuencia de fin de gen en el genoma viral. Debido a la presencia de dos posibles secuencias de fin de gen para el gen de la ARN polimerasa (nt 15161-15171 o 15288-15297) se han identificado dos secuencias trailer (nt 15172­ 15342 o nt 15289-15342). La ubicación de la posible secuencia de inicio de gen (secuencias que contienen poli G) y secuencias de fin de gen (secuencia señal para una poliadenilación) y las secuencias intergénicas se resumieron en la Tabla 3.
Tabla 3 Secuencia y ubicación de posible secuencia de inicio de gen, intergénica y fin de gen de APMV-8
Figure imgf000019_0001
Tabla 4 SEQ ID NO v secuencias de ADN y de proteínas.
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[0103] Las posibles secuencias de inicio de gen para APMV-8 se conservaron conteniendo una secuencia poli(C)5 seguida de una secuencia 3'-GCU-5'. La única excepción es la posible secuencia de inicio de gen para la ARN polimerasa viral (3'-CUCCCGCU-5'). Las posibles secuencias de fina de gen también se conservaron y contenían una secuencia de poli(U)6 en la secuencia viral genómica 5' (Tabla 5).
Tabla 5 secuencias de inicio de gen y fin de gen de APMV-8
Figure imgf000020_0001
[0104] Estas secuencias se predijeron en base a secuencias que se describieron para otros paramixovirus del género Avulavirus (Chang et al., 2001, Nayak et al, 2008, Jeon et al., 2008). Hay dos posibles codones de inicio para el ORF de la ARN polimerasa. El primer codón de inicio (nt 8273 a 8275) se localiza en la región fin de gen-región intergánica-inicio de gen entre el ORF de HN y el ORF de la ARN polimerasa viral. Esto hace que este codón de inicio sea improbable, pero no imposible. El segundo codón de inicio (8297 -8299) está en dirección 3' de la región región fin de gen-región intergánica-inicio de gen y puede actuar como codón de iniciación para el comienzo de la traducción de la ARN polimerasa de APMV-8.
[0105] El genoma de APMV-8 tiene 15342 nt de longitud. Este es mayor que APMV-1 (SQ ID NO: 15, 15186 nt, de Leeuw y Peeters, 1999), APMV-2 (SEQ ID NO: 16, 14904 nt, Subbiah et al, 2008), y APMV-4 (SEQ ID NO: 18, 15054 nt, Nayak et al., 2008), y más pequeño que APMV-3 (SEQ ID NO: 17, 16272 nt, Kumar et al., 2008) y APMV-9 (SEQ ID nO: 20, 15438 nt, Samuel et al., 2009). La longitud de 55 nt de la secuencia líder parecía estar conservadas entre todos los APMV (Krishnamurthy y Samal, 1998, de Leeuw y Peeters, 1999, Subbiah et al., 2008, Nayak et al., 2008, Kumar et al., 2008, Samuel et al., 2009), mientras que la secuencia trailer parecía ser de longitud variable. Las secuencias de inicio de gen y fin de gen de los genes virales también estaban altamente conservados para APMV-8 (tal como se muestra en la Tabla 5). Esto se ha descrito también para las secuencias de APMV-2 (Subbiah et al, 2008), APMV-3 (Kumar et al, 2008), APMV-4 (Jeon et al., 2008, Nayak et al, 2008), APMV- 6 (Chang et al, 2001), y recientemente para APMV-9 (Samuel et al., 2009). El número de los nucleótidos de la secuencia de longitud completa es un múltiplo de seis, que está de acuerdo con el papel de seis para los genomas de paramixovirus (Kolakofsky et al., 1998).
[0106] La identidad de secuencia entre las secuencias del genoma de APMV-1, 2, 3, 4, 6, 8, y 9 se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6 Porcentaje de identidad de secuencia entre el genoma de APMV-1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, y 9
Figure imgf000020_0002
[0107] El porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos se determina utilizando el paquete de software Vector NTI 11,0 (PC) (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA). Se utilizan Una penalización de apertura de hueco de 15 y una penalización por extensión de hueco de 6,66 para determinar el porcentaje de identidad de dos ácidos nucleicos. Se utilizan una penalización de apertura de hueco de 10 y una penalización por extensión de hueco de 0,1 para determinar el porcentaje de identidad de dos polipéptidos. El porcentaje de identidad se calculó basándose en la secuencia más corta.
Ejemplo 4 Vacunación de pollso jóvenes de un día de vida con la cepa de APMV-8
[0108] Se separaron veinte pollos jóvenes de un día de vida en dos grupos de acuerdo a la tabla 7 que se muestra a continuación.
[0109] En el día 1, se hicieron sangrar pollos jóvenes de un día de vida para determinar el estado de anticuerpos dirigidos contra el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) y APMV-8 utilizando el ensayo de inhibición de la hemaglutinación (prueba de HI). La prueba se realizó utilizando fluido alantoideo de cualquiera de los huevos de SPF infectados con cepa de NDV Lasota o APMV-8. Se utilizaron cuatro unidades HA de la cepa de NDV Lasota o APMV-8 y 1% de glóbulos rojos de pollo y se utilizaron para la prueba de HI. Los títulos de HI resultantes muestran que el suero de los pollos contenía anticuerpos de HI dirigidos contra NDV pero no anticuerpos detectables contra el virus de APMV-8.
Tabla 7. Infección/vacunación de pollos jóvenes de un día de vida
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[0110] En el día 1, el grupo 1 de 10 pollos se infectó por vía nasal con 106 EID50 de cepa de APMV-8 cepa, grupo 2 de 10 pollos no se infectó sirviendo como control.
[0111] Catorce días después de la infección (día 14), se extrajo sangre de los pollos y las muestras de suero obtenidas se analizaron de nuevo por la presencia de anticuerpos de HI dirigidos contra n Dv y APMV-8 (Figura 20). El resultado mostró que los pollos vacunados con APMV-8 mostraron títulos de HI usando APMV-8 como antígeno. Los títulos de HI específicos de APMV-8 fueron entre 128 y 2048. Los títulos de HI contra NDV se redujeron a un título de HI por debajo de 16, por lo que no se consideraron como NDV positivo. El resultado mostró que los anticuerpos derivados de pollos maternos dirigidos contra NDV no omitían la infección con APMV-8, por lo que la interferencia de tales anticuerpos con la vacunación de APMV-8 es poco probable.
[0112] Catorce días después de la infección (día 14), los pollos en el grupo 1 y el grupo 2 se dividieron. Cinco pollos en cada uno del grupo 1 (grupo 1-1) y del grupo 2 (grupo 2-1) se infectaron de nuevo con EID50 de 106 de la cepa de APMV-8 (tabla 7), los cinco pollos restantes en cada grupo ( grupo 1-2 y grupo 2-2) no se infectaron. Este experimento se diseñó para investigar si una infección posterior de pollos tendría un efecto sobre la infección y si una segunda infección (vacunación de refuerzo) aumentaría el título de anticuerpos. Catorce días más tarde (día 28), todos los pollos se hicieron sangrar de nuevo y el suero se investigó para la presencia de anticuerpos de NDV y APMV-8. Los títulos de suero (Figura 21) mostraron que una primera vacunación en el día 14 (grupo 2-1) indujo títulos de anticuerpos específicos de APMV-8 que variaban de 32 a 512. En los pollos vacunados solamente en el día 1 (grupo 1-2), los títulos de anticuerpos disminuyeron a títulos en un intervalo de 128 a 512. En los pollos que han sido vacunados en el día 1 y el día 14 (grupo 1-1), el título de anticuerpo específico de APMV-8 no aumentó, lo que sugiere que el virus utilizado para la segunda infección se neutralizó por anticuerpos específicos de APMV-8 inducidos por la primera infección. El suero de los controles no vacunados (grupo 2-2) no contenía anticuerpos de HI específicos de APMV-8. En el día 28, los anticuerpos de NDV disminuyeron aún más, sólo 11 pollos de los 20 pollos mostraron algún título de HI con el antígeno de NDV, mientras que en el día 14 catorce pollos mostraron títulos de anticuerpos bajos contra NDV.
Ejemplo 5 Vacunación in ovo de huevos SPF embrionados
[0113] Este estudio se realizó para probar si una vacunación in ovo con APMV-8 daría lugar a una respuesta de anticuerpos en los pollos y si la vacunación in ovo interferiría con la capacidad de eclosión y la durabilidad.
[0114] En el estudio se vacunaron 1.108 huevos SPF in ovo con una cepa del virus APMV-8 utilizando el INOVOJECT (Pfizer Animal Health, Nueva York, EE.UU.) en el día 18 de incubación. El virus se diluyó en una solución salina estéril de NaCl al 0,9%. La titulación por retroceso de virus diluido reveló un título de 1055 de EID50/100 |il. Como control, 108 huevos se inocularon con solución salina estéril de NaCl al 0,9%. El volumen para la inoculación fue de 100 |il por huevo. Ochenta pollos eclosionaron del grupo control y cuarenta y cinco pollos eclosionaron del grupo vacunado con APMV-8. Diez pollos de cada grupo se transfirieron a una unidad Horsefall-Bauer. Además, los pollos del grupo vacunado con APMV-8 y cinco pollos del grupo de control se comezclaron en una unidad de Horsefall-Bauer para poner a prueba la transmisión de APMV-8 después de la vacunación. Se proporcionaron agua y alimento ad libitum. Catorce y veintiocho días después de la eclosión, se tomaron muestras de sangre y se ensayaron para la presencia de anticuerpos de HI dirigidos contra APMV-8 utilizando 4 unidades de HA y 1% de glóbulos rojos de pollo. Los resultados (Figura 22) mostraron que la vacunación in ovo el día 18 de incubación dio lugar a una respuesta inmune tal como se indica por la presencia de títulos de HI en las muestras de suero ensayadas. Catorce días después de la eclosión, se observó un título de HI de 256 a 4048 en el grupo vacunado in ovo. En el suero de los pollos de contacto, se observó un título de HI de 256 a 2048 14 días después del contacto con los pollos del grupo vacunado, lo que indica un cambio del virus utilizado para la vacunación. El grupo control no mostró ningún título de HI específico para APMV-8. Catorce días más tarde, los pollos se hicieron sangrar de nuevo y mostraron títulos de 256 a 4096 en el grupo vacunado con APMV-8 y de 256 a 1024 en el grupo de contacto de APMV-8. El grupo de control no mostró presencia de anticuerpos de HI de APMV-8.
[0115] En el estudio 2, se vacunaron 88 huevos SPF (libres de patógenos específicos) in ovo utilizando el INOVOJECT en el día 19 de incubación. La cepa del virus de APMV-8 se diluyó en una solución salina estéril de NaCl al 0,9%. La titulación de virus diluido reveló un título de 10575 de EID50/100 |il tal como se observó después de una titulación por retroceso del virus diluido. Como control, 88 huevos se inocularon con solución salina estéril de NaCl al 0,9%. El volumen para la inoculación fue de 100 |il por huevo. Setenta y cuatro pollos eclosionaron del grupo control (NaCl) y setenta y seis pollos eclosionaron del grupo vacunado con APMV-8. Diez pollos de cada grupo se transfirieron a una unidad Horsefall-Bauer. Se proporcionaron agua y alimento ad libitum. Catorce días después de la eclosión, se tomaron muestras de sangre y se ensayaron para la presencia de anticuerpos de HI dirigidos contra APMV-8 utilizando 4 unidades de HA y 1% de glóbulos rojos del pollo. Los resultados (Figura 23) mostraron que la vacunación in ovo el día 19 de incubación dio lugar a una respuesta inmune con títulos de HI específicos para APMV-8. Catorce días después de la eclosión, se observó un título de HI de 256 a 4048 en el grupo vacunado in ovo con AMPV-8. El grupo control no mostró ningún título de HI específico para APMV-8. En el día 28 después de la eclosión, los pollos se hicieron sangrar de nuevo. Los títulos de HI para el grupo vacunado con APMV-8 variaba de 512 a 4096 (figura 23), mientras que los sueros de los pollos de control aun eran AMPV-8 negativos.
[0116] En un tercer estudio, se vacunaron in ovo 108 huevos SPF en el grupo 1 y el grupo 2 usando el INOVOJECT en el día 18 de la incubación con EID50 de 1035 y EID50 de 1045 , respectivamente. La cepa de virus APMV-8 se diluyó en solución salina estéril de NaCl al 0,9%. En un tercer grupo, se inocularon 108 huevos SPF con solución salina estéril de NaCl al 0,9% como control. Ochenta y tres pollos eclosionados del grupo 1, setenta y nueve pollos eclosionados del grupo 2, y ochenta y ocho pollos eclosionados en el grupo 3 (véase la tabla 8). Después de la eclosión, diez pollos de cada grupo se transfirieron a una unidad Horsefall-Bauer. El agua y el alimento se proporcionaron ad libitum. Después de la eclosión, diez pollos del grupo 3 fueron vacunados por vía subcutánea en la región del cuello con un volumen de 100 |il de EID50 de 106 de virus APMV-8. Catorce días después de la eclosión, se tomaron muestras de sangre y se ensayó la presencia de anticuerpos dirigidos contraAPMV-8 utilizando 4 unidades HA y 1% de glóbulos rojos de pollo (CRBS). Los resultados (Figura 24) mostraron que la vacunación in ovo el día 18 de incubación dio lugar a una respuesta inmune con títulos de HI específicos para APMV-8. Catorce días después de la eclosión, se observó un título de HI de 4096 a 16384 en los grupos vacunados in ovo de APMV-8. El grupo de control no mostró ningún título de HI específico para APMV-8. El grupo vacunado por vía subcutánea con APMV-8 mostró una seroconversión con un título que variaba de 64 a 4096. Los pollos se hicieron sangrar de nuevo en el día 28 después de la eclosión y se ensayaron para la presencia de anticuerpos de HI específicos de APMV-8. El título de HI a las cuatro semanas después de la eclosión se redujo y varió entre 512 y 4096. El grupo de control no mostró ningún título de HI específico para APMV-8. El título de HI en el grupo que fue vacunado por vía subcutánea mostró títulos de HI que oscilaban entre 32 y 256.
Tabla 8
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Ejemplo 6 Desarrollo de la genética inversa de la cepa de APMV-8 y la generación de APMV-8 mutantes que expresar genes heterólogos
Construcción de los plásmidos de expresión que contienen los genes de NP, P y L de APMV-8
[0117] Para el establecimiento de un sistema de genética inversa para paramixovirus, el establecimiento de plásmidos que expresan las proteínas implicadas en la replicación del ARN viral es esencial. Los marcos de lectura abierta (ORF) de tres proteínas de APMV-8 (nucleoproteína NP, fosfoproteína P, proteína ARN polimerasa dependiente de ARN o proteína L) se clonaron en el vector de expresión eucariota pcDNA3 (Invitrogen, California, EE.UU.). Con este fin, el ARN de fluido alantoideo que contenía APMV-8 se purificó usando el kit de aislamiento de ARN muy puro (Roche, Basilea, Suiza). El ARN purificado se usó para la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) utilizando el kit Titan One Tube RT-PCR (Roche). Los ORFs de las proteínas se amplificron utilizando los pares de cebadores apropiados: [NP (NP-FP, n P-RP), P (P-FP, P-RP), L (L-FP, L-RP), véase la tabla 9]. Los productos de las reacciones se separaron en un gel de agarosa al 0,7% y se eluyeron del gel usando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen, Hilden, Alemania) siguiendo el protocolo proporcionado por el fabricante. Los fragmentos de RT-PCR se incubaron con las enzimas de restricción apropiadas (NP y P con EcoRI/NotI; L con Kpn I/NotI), se eluyó en gel de nuevo y se ligó en el vector de expresión eucariota pcDNA3 escindido con las enzimas de restricción apropiadas. Las reacciones de ligación se transformaron en células Top10F (Invitrogen) y el ADN plásmido recogido de las células Top10F se digirió con las enzimas de restricción apropiadas (véase más arriba). Se secuenciaron plásmidos que contenían fragmentos de ADN (pcDNA-NP, pcDNA-P, pcDNA-L) con el tamaño apropiado.
Tabla 9. Cebador para amplificación de genes para las proteínas de los complejos de RNP
Figure imgf000023_0001
Construcción de un plásmido que contiene el genoma de longitud completa de APMV-8
[0118] Para la generación de un plásmido que contiene el genoma de AMPV-8 de longitud total, se sintetizó el genoma de ADNc del virus (Genscript, Nueva York, Estados Unidos) en base a la secuencia consenso generada en dos partes diferentes (5'FLG, 3'FLG, ver figura 25). La parte 5' (5'-FLG, SEQ ID NO: 47) de la secuencia viral se sintetizó a partir de nucleótidos 1 a 5564. Antes de la secuencia de APMV-8 está un casete de secuencia que consiste en el promotor CMV-IE, seguido por una secuencia de escisión por enzimas de restricción para XmaI (para posibles procedimientos de clonación posteriores) y la secuencia de ribozima hammerhead. En el extremo 5' y el extremo 3' de la secuencia, se añadieron los sitios de escisión por enzimas de restricción para NotI y SacII, respectivamente. La parte 3' sintetizada (3'-FLG, SEQ ID NO: 48) de la secuencia (nucleótidos 5503-15342) está seguida por la secuencia de ribozima de la hepatitis delta y la secuencia señal de poli A de la hormona de crecimiento bovina. Para el objetivo de clonación, se añadió la secuencia para la enzima de restricción Not I en el extremo 5' de 3'-FLG y se añadió la secuencia para la enzima de restricción Sac II en el extremo 3' de la secuencia. Dentro de las partes superpuestas de 5'-FLG y 3'-FLG (nucleótidos 5503-5564), se localizó la secuencia para una enzima de restricción única (Bmt I) que escinde en el nucleótido 5541 de la secuencia de longitud completa. Ambas partes del ADN (5'-FLG, 3'-FLG) se ligaron por separado en el plásmido pUC57 (Genscript) dando como resultado los plásmidos pUC57/5'.FLG y pUC57/3'-FLG. Para clonar ambos fragmentos juntos, se escindió pUC57/5'-FLG con BmtI y Sac II y el plásmido que conteía 5'-FLG se eluyó en gel. En paralelo, se escindió pUC57/3'-FLG con las mismas enzimas y se eluyó el fragmento 3'-FLG. El 3'-FLG se ligó posteriormente en el plásmido que contenía 5' FLG para obtener un plásmido que contiene la secuencia de ADNc de longitud completa del genoma de APMV-8 bajo el control del promotor CMV-IE (pUC57-FL-APMV-8).
Construcción del plásmido que contiene el minigenoma de APMV-8
[0119] El plásmido que contiene todos los elementos funcionales de un minigenoma para APMV-8 (pMG-APMV-8) se construyó usando el procedimiento descrito por Conzelmann, et al. (J Virol. 68: 713-719, 1994). El plásmido pMG-APMV-8 contiene la región trailer y líder del genoma de APMV-8 que está flanqueada por el promotor t 7 y la secuencia antigenoma del ribozima del virus de la hepatitis delta (Collins, et al, PNAS USA. 88: 9663-9667, 1991). La secuencia antigenoma del ribozima del virus de la hepatitis delta está seguida por una secuencia de terminación de transcripción de T7. Entre la región tráiler y líder está situada la secuencia codificante de la proteína verde fluorescente mejorada en orientación antisentido. Antes de la secuencia trailer y inmediatamente después del promotor T7 se sitúan tres residuos adicionales de G. El inserto está flanqueado por los sitios de escisión de enzimas de restricción EcoRI y NotI y se clonó con extremos romos en el plásmido pUC57. Este constructo se subclonó en el plásmido pUC18. Con este fin, el plásmido pMG-APMV-8 se escindió a continuación con EcoRI y HindIII y el fragmento apropiado se eluyó en gel y se ligó en el plásmido pUC18 escindido apropiadamente al pUC18-MG-APMV-8 obtenido. La presencia del inserto se confirmó mediante secuenciación.
Generación de un plásmido de expresión que permite la expresión de la T7 polimerasa
[0120] Para la generación de un plásmido que codifica la ARN polimerasa dependiente de ADN de T7 (T7 polimerasa), se sintetizó la secuencia de codificación (no. de acceso GenBank AY264778) mediante Genscript. La secuencia de la T7 polimerasa (SEQ ID NO: 49) se modificó para la optimización del uso de codones para la expresión en un sistema eucariota y para eliminar posibles sitios de empalme de donantes/aceptores de la secuencia. La secuencia que codifica la T7 polimerasa estaba flanqueada por un sitio EcoRI (5') y NotI (3'). El fragmento sintetizado se clonó con extremos romo en el vector pUC57 (pCU57-T7). Este plásmido se escindió con EcoRI/NotI y el fragmento codificante de T7 polimerasa se eluyó en gel. El fragmento se clonó a continuación en vector de expresión eucariota pcDNA3 (Invitrogen) para obtener pcDNA3-T7. La presencia del fragmento en el vector pcDNA3-T7 se verificó mediante secuenciación.
Generación de un plásmido para la expresión de la proteína fluorescente verde mejorada con el uso de un sitio de entrada ribosomal interno bajo el control de un promotor T7.
[0121] Para probar la funcionalidad de la T7 polimerasa, el marco de lectura abierto de la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) se amplificó por PCR usando el plásmido pEGFP-N1 (Clontech, California, EE.UU.) y el par de cebadores:
EGFP-FP (CCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG) SEQ ID NO: 50 y
EGFP-RP (CCGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG) SEQ ID NO: 51
[0122] El fragmento de PCR obtenido se eluyó en gel y se incubó con las enzimas de restricción BamHI y NatI. El producto de reacción se eluyó en gel y se ligó en el vector adecuadamente escindido pCITE 4A (Novagen). Se utilizó el plásmido obtenido (pCITE4A-EGFP) para experimentos posteriores. Los plásmidos pCITE4A-EGFP y pcDNA3-T7 se transfectaron solos o en combinación en la línea celular de pollo DF1 cultivada en placas de 24 pocillos utilizando Lipofectin 2000 (Invitrogen). Veinticuatro horas después de la transfección, se retiró el medio y se añadió solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Se evaluaron las células utilizando el microscopio de fluorescencia invertido Axiovert 40 CFL (Zeiss, Jena, Alemania). La fluorescencia verde se observó sólo en los pocillos de la placa de cultivo tisular que fue cotransfectado con ambos plásmidos. Este resultado indica que ambos plásmidos, pCITE4A-EGFP y pcDNA3-T7, eran funcionales.
Validación de la funcionalidad de las proteínas virales expresadas NP, P y L utilizando el plásmido del minigenoma [0123] Se cotransfectaron células DF1 con pcDNA3-T7, pUC18-MG-APMV-8, pcDNA-NP, pcDNA-P, y pcDNA-L para validar la funcionalidad de las proteínas NP, P y L expresadas. Veinticuatro horas después de la transfección, se retiró el medio y se añadió solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Se evaluaron las células utilizando el microscopio de fluorescencia invertido Axiovert 40 CFL (Zeiss, Jena, Alemania). La fluorescencia verde se observó sólo en los pocillos de la placa de cultivo tisular que se cotransfectó con los 5 plásmidos. Este resultado indica que las proteínas virales expresadas NP, P y L eran funcionales para transcribir el minigenoma de APMV-8 en ARNm y expresar la proteína EGFP codificada por pUC18-MG-APMV-8.
Rescate del virus AMPV8 del plásmido que contiene la secuencia de longitud completa de APMV-8
[0124] Se cotransfectaron células DF1 con pUC57-FL-APMV-8, pcDNA-NP, pcDNA-P, y pcDNA-L. Después de 48 a 96 horas, los sobrenadantes de las células DF1 se inocularon en huevos embrionados de 10 días de vida para propagar el virus. Después de 3 a 5 días, el fluido alantoideo se recogió y se ensayó la actividad de hemaglutinación (HA) utilizando 1% de glóbulos rojos de pollo. El fluido alantoideo que dio positivo para la actividad de HA se utilizó para tres procedimientos. 1) Se infectaron células DF1 con el fluido alantoico y se ensayaron 36 horas después de la infección con un antisuero específico de APMV-8 para la presencia de la expresión de proteínas de APMV-8 en un ensayo de inmunofluorescencia indirecta. 2) El fluido alantoideo se ensayó para la especificidad de APMV-8 utilizando un suero de pollo específico de APMV-8 (proporcionado por el Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios, Ames, Iowa, Estados Unidos) mediante un ensayo de inhibición de la hemaglutinación. 3) El virus de rescate fue identificado por RT-PCR usando oligonucleótidos específicos de APMV-8. La ausencia de ADNc viral se verificó mediante la omisión de la etapa de RT durante la reacción. Las muestras que dieron positivo en los tres ensayos se propagaron posteriormente en huevos de pollo SPF embrionados.
Propagación de APMV-8 en células de origen distinto del pollo
[0125] Se cultivaron células de diferentes especies [hámster (células de riñón de cría de hámster, células BHKL-21), mono (células Vero, la línea celular con el origen del riñón de un mono verde africano) y canino (células de riñón canino Madin-Darby, MDCK) y codorniz (línea celular de músculo de codorniz QM7)] en placas de cultivo de tejido de 24 pocillos y se infectaron con una multiplicidad de infección de 0,01. Las células se fijaron con etanol enfriado con hielo 24 horas después de la infección y se analizaron para la presencia de proteínas específicas de APMV-8 mediante inmunofluorescencia indirecta utilizando un antisuero específico de APMV-8 a partir de un pollo SPF infectado con APMV-8. La unión de los anticuerpos se visualizó mediante el uso de un conjugado de FITC con IgY contra pollo de cabra. Las células no infectadas se utilizaron como control negativo. Sólo en las células infectadas con APMV-8 se observó fluorescencia verde. Esto indicó que APMV-8 fue capaz de infectar células de especies distintas de pollo.
[0126] La replicación de APMV-8 se incrementó en presencia de tripsina. Se infectaron células MDCK con APMV-8 como se describe anteriormente. Después de la infección se lavaron las células con medio libre de suero y se recubrieron con medio libre de suero que contenía tripsina en una concentración de 1 ug/ml o con solamente medio libre de suero. Veinticuatro, cuarenta y ocho, noventa y seis horas después de la infección, se extrajeron los sobrenadantes de las células y el se determinó la TCID50 en células DF1 usando inmunofluorescencia indirecta como se describió anteriormente. Los datos obtenidos indicaron que en presencia de tripsina, el APMV-8 se replicó a un título más alto que en ausencia de esta enzima (Figura 19B).
[0127] Los resultados de este ejemplo mostraron que, como AMPV-1, APMV-8 es capaz de penetrar en las células de diferentes especies y de iniciar su ciclo de replicación. Es por lo tanto un vector adecuado para múltiples especies.
Producción de virus APMV-8 recombinante que expresa genes exógenos usando el sistema de genética inversa [0128] Para la generación de un virus (vector viral) APMV-8 recombinante que expresa el gen de la hemaglutinina (HA) de gripe aviar altamente patógena (HPAI), la secuencia codificante para el gen de HA de del virus de HPAI del subtipo H5 o H7 se inserta en las regiones no esenciales, por ejemplo, entre los genes de M y F o entre los genes de P y M del genoma de APMV-8 en el plásmido que contiene el genoma de APMV-8 de longitud total. Para este fin, la secuencia de codificación del marco de lectura abierto hemaglutinina está flanqueado por todas las secuencias reguladoras necesarias del gen de F, que incluye la secuencia de inicio de gen, la secuencia no codificante 5', la secuencia no codificante 3' y la secuencia de parada del gen. El constructo se sintetiza de una manera que los sitios de escisión por enzimas de restricción Bsu 36I y Nhe I se utilizan para la ligación del fragmento apropiado en el plásmido existente que contiene el genoma de APMV-8 de longitud total debido a su singularidad en el constructo de plásmido. El plásmido resultante se denomina plásmido de transcripción que contiene el gen de la hemaglutinina en la región no esencial del genoma de APMV-8 de longitud completa. Usando este enfoque las secuencias codificantes de una variedad de antígeno viral y bacteriano se pueden clonar en el esqueleto de la secuencia de APMV-8. Otros antígenos posibles que podrían ser insertados en el genoma de APMV-8 son la proteína de fusión del virus de la enfermedad de Newcastle, la proteína S del virus de la bronquitis aviar, otros genes de la hemaglutinina de cirus de la gripe aviar que no es H5 ni H7, gen de proteína estructyural VP1 del virus de la anemia del pollo, genes de glicoproteínas del virus de la laringotraqueitis infecciosa.
Ejemplo 7 Vacunación de animales
[0129] Los animales se vacunaron con una, dos administraciones o un régimen de sensibilización-refuerzo de la composición o vacuna que contenía el virus (vector viral) APMV-8 recombinante como se describe en el ejemplo 6. Para los pollos/aves, se realizan varias administraciones, por ejemplo, la administración in ovo a D18 o D19, por vía subcutánea (SC) a animales de un día de vida, o administración en la mucosa (pulverizador, agua potable, gotas para los ojos) a diferentes edades. La dosis es de entre 3 y 7 log10 (preferiblemente 4-6 log10 de EID50). Para los mamíferos, se usan la ruta mucosal (intranasal, intraocular, oral) o parenteral (IM, SC, sin aguja, transdérmicos o intra-dérmicas). La dosis oscila del 5 al 9 log (preferiblemente 6-8 log). Dos administraciones se realizan generalmente con un intervalo de 3-4 semanas. La sensibilización-refuerzo heteróloga (por ejemplo, refuerzo con proteínas) también sería ventajoso.
[0130] La eficacia protectora inducida por la composición o vacuna se evalúa contra la estimuación de patógenos específicos en los animales. El efecto protector se evalúa mediante observaciones clínicas y/o la carga viral del patógeno específico en tejidos, sangre o frotis de la mucosa. Las muestras de sangre de los animales vacunados se toman en varias etapas y se ensayan para serología. Los resultados muestran que la composición o vacuna es inmunogénica y proporciona protección en los animales vacunados.
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Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para producir un vector viral APMV-8 (paramyxovirus aviar 8) recombinante, en el que el procedimiento comprende laintroducción en elgenoma de APMV-8 de un polinucleótido aislado en una región no esencial delgenoma de APMV-8, en elque laregión noesencial se selecciona de lasregiones que consistenen la región no traducida ubicada en dirección 5'del marco de lectura abierto de NP, regiones intergénicas entre dos marcos de lecturaabiertos del genoma de APMV-8 y laregión no traducida ubicada en dirección 3'del marco de lecturaabiertode L,en elque elAPMV-8 comprende un polinucleótidoquetienealmenos un 90% de identidad de secuencia con un polinucleótido que tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO:1 o un polinucleótido complementario aun polinucleótidoquetienealmenos un 90% de identidadde secuenciacon un polinucleótidoque tiene la secuencia establecida en SEQ ID NO: 1, en el que el polinucleótido aislado es heterólogo y codifica y expresa un antígeno derivado de un patógeno, y en el que el vector viral APMV-8 recombinante es capaz de provocaruna respuesta inmune que esespecíficadelantígeno.
2.Procedimiento, según lareivindicación 1,en elque elprocedimientocomprende lasetapasde:
a)prepararplásmidosde expresiónque expresan losgenes NP, P yL;
b) preparar un plásmido de transcripción que comprende un polinucleótido aislado que codifica una proteína antigénicaderivadade un patógeno en una regiónno esencialdelgenoma deAPMV-8 de longitudcompleta; c)transfecciónde losplásmidosde expresiónyelplásmidodetranscripciónen una célulahuésped;
d)rescatar/recuperarelvirusAPMV-8 infecciosode lacélulahuésped.
3.Procedimiento, según lareivindicación 1o2,en elque elprocedimientocomprende lasetapasde:
a)prepararplásmidosde expresiónque expresan losgenes NP, P yL;
b) preparar un plásmido de transcripción que comprende un polinucleótido aislado que codifica una proteína antigénicaderivadade un patógeno en una regiónno esencialdelgenoma deAPMV-8 de longitudcompleta; c)prepararun plásmidode expresiónque expresa lapolimerasaT7;
c)transfecciónde losplásmidosde expresiónyelplásmidodetranscripciónen una célulahuésped;
d)rescatar/recuperarelvirusAPMV-8 infecciosode lacélulahuésped.
4.VirusAPMV-8 recombinanteque comprende:
un polinucleótidoquetienealmenos un 90% de identidadde secuenciacon un polinucleótidoquetienelasecuencia establecidaen SEQ IDNO: 1oun polinucleótidocomplementarioa un polinucleótidoquetienealmenos un 90% de identidadde secuenciacon un polinucleótidoquetienelasecuenciaestablecidaen SEQ IDNO: 1;
que comprende además un polinucleótidoaisladoinsertadoen una región noesencialdelgenoma deAPMV-8, en el que laregiónno esencialseseleccionade lasregionesque consistenen laregiónnotraducidaubicadaen dirección 5'del marco de lectura abierto de NP, regiones intergénicas entre dos marcos de lectura abiertos del genoma de APMV-8, y la región no traducida ubicada en dirección 3' del marco de lectura abierto de L, en el que el polinucleótidoaislado es heterólogoycodificay expresa un antígeno derivado de un patógeno, yen elque elvirus APMV-8 recombinanteescapazde provocaruna respuestainmune que esespecíficadelantígeno.
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