KR101146545B1

KR101146545B1 - 수중유 에멀젼을 포함하는 백신 제형물

Info

Publication number: KR101146545B1
Application number: KR1020067001685A
Authority: KR
Inventors: 알렉시스 기 앙드레 파리소; 스테파니 마리-까뜨린느 데스구이으-블셰; 로버트 엠 노드그렌; 까뜨린느 샤르이르
Original assignee: 메리얼 리미티드
Priority date: 2003-07-24
Filing date: 2004-07-26
Publication date: 2012-07-05
Also published as: WO2005009462A3; HK1083764A1; DE602004013331D1; CA2533581C; RU2006105506A; CN1852735A; EP1651265A2; US20100062019A1; HRP20080235T3; US7371395B2; BRPI0412855A; KR20060069429A; AU2004259034A1; ATE392905T1; PL1651265T3; BRPI0412855B1; NZ545289A; US20080187555A1; US7608279B2; DK1651265T3

Abstract

본 발명은 박테리아 또는 바이러스 현탁액, 특히 농축되고 비-정제 또는 약하게 정제된 것들의 존재 하에 증가된 안정성을 가진 신규 수중유 (O/W) 에멀젼을 제공한다. 본 발명의 에멀젼은 하나 이상의 면역원 및, 특히 불활성화된 병원체, 약화된 병원체, 하위단위, 재조합 발현 벡터, 및 플라스미드 또는 그의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 면역원을 포함하는 약학적 조성물의 전달을 위한 비히클로서 작용할 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 주사가능한 수중유 (O/W) 에멀젼을 제공한다 :

(1) 불활성화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 박테리아 (Mycoplasma hyopneumoniae bacterium), 불활성화된 돼지 써코바이러스 유형 2 (inactivated porcine circovirus type 2, PCV-2) 바이러스 또는 그의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는 면역원을 함유하는 수용액 ;

(2) 광유 ;

(3) 비-이온성 친지성 계면활성제 ; 및

(4) 소르비탄의 에톡실화 지방산 디에스테르를 포함하는 낮은 HLB 값 (일반적으로 11 내지 13 의 HLB 값) 을 갖는 비-이온성 친수성 계면활성제 ;

(5) 13 내지 40 의 높은 HLB 값을 갖는 비-이온성 친수성 계면활성제.

Description

수중유 에멀젼을 포함하는 백신 제형물 {VACCINE FORMULATIONS COMPRISING AN OIL-IN-WATER EMULSION}

본 출원은 그 전체가 참조로써 삽입된 내용인 [US Provisional App. No. 60/490,345 filed 24 July 2003] 을 우선하여 청구한다.

본 발명은 수중유 (oil-in-water) 에멀젼, 아쥬반트 (adjuvant) 로서의 그의 용도, 및 동일물을 포함하는 약학적, 면역학적, 또는 백신 조성물에 관한 것이다.

백신에서 아쥬반트의 용도는 잘 알려져 있다. 아쥬반트는, 그것이 백신 항원과 조합될 때, 백신 항원만에 의해 유도된 반응에 비해 백신 항원에 대한 면역 반응을 증가시키는 화합물이다. 항원 면역원성을 촉진하는 전략 중에서도, 백신 항원을 입자화하는 것, 백신 항원을 중합하거나 또는 유화시키는 것, 백신 항원을 캡슐화하는 방법, 숙주의 선천선 사이토카인 반응을 증가시키는 방법, 및 항원 제시 세포에 백신 항원을 표적화하는 방법이 있다 (Nossal, 1999, In : Fundamental Immunology. Paul (Ed.), Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa.; Vogel and Powell, 1995, In : Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach. Powell and Newman (Eds.), Plenum Press, NY, N. Y. p. 141). 백신 항원의 면역원성을 향상시키는 데 있어 아쥬반트가 본질적인 역할 을 하기 때문에, 백신 제형물 내의 아쥬반트의 용도는 사실상 편재해 있다 (상기의 Nossal, 1999 ; 상기의 Vogel and Powell, 1995 ; 참조로써 본원에 삽입된 교시인 PCT publication WO 97/18837 또한 참조). 당업계에 잘 알려진 통상적인 아쥬반트는 사실상 다양하다. 그것들은 예를 들어, 수-불용성 무기염, 리포좀, 미쉘 또는 에멀젼, 즉, 프로인드 (Freund's) 아쥬반트로 이루어질 수 있다. 기타 아쥬반트는 [상기 언급된 Vogel and Powell, 1995] 에서 찾아볼 수 있다. 아쥬반트 작용의 단일 기작이 없더라도, 본질적인 특징은 백신 항원만에 의해 유도되는 반응에 비해 백신 항원에 대한 면역 반응을 확연히 증가시키는 그의 능력이다 (상기의 Nossal, 1999 ; 상기의 Vogel and Powell, 1995). 이 점에서, 일부 아쥬반트는 체액성 면역 반응에 있어서 더욱 효과적이며 ; 다른 아쥬반트는 세포-매개성 면역 반응을 증가시키는데 더욱 효과적이고 (상기의 Vogel and Powell, 1995) ; 아쥬반트의 또다른 군은 백신 항원에 대한 체액성 및 세포-매개성 면역 반응 둘 다 증가시킨다 (상기의 Vogel and Powell, 1995).

일반적으로, 백신 제형물에 사용되는 에멀젼은 오일, 수용액 및 계면활성제의 혼합물을 포함한다. 일부 에멀젼은 Span 80

과 같은 친지성 계면활성제 및 Tween 80

과 같은 친수성 계면활성제를 혼입한다. 이러한 에멀젼은 또한 이온성 계면활성제 성질을 가진 것으로 알려진 레시틴 (lecithin) 또는 사포닌 (saponin) 과 같은 화합물을 함유할 수 있다.

그러나, 특히, 저장 또는 수송 동안에 백신 아쥬반트로서 사용되는 에멀젼에서 안정성의 문제점을 관찰할 수 있다. 이는 특히, 이러한 조성물이 농축 면역 원, 특히 비-정제된 농축 면역원을 함유하고 있을 때 확실하다. 전형적으로, 이는 비활성화된 (사멸된) 백신 내에서 사용되는 아쥬반트의 경우이다. 이러한 문제점은, 면역원이 동일한 부피의 희석제 내에서 더욱 잘 농축되기 때문에, 다가 백신 조성물에서 더욱 더 확실하다.

아쥬반트 용도가 갖는 또다른 문제점은, 주사 위치에서의 독성 또는 국소 염증과 같은 부작용의 위험성과 관련되어 있다. 예를 들어, 국소 염증 반응 및/또는 육아종 (granulomae) 은 주사 후에 생길 수 있다. 그러한 부반응을 제한하기 위해, 에멀젼 내의 계면활성제 및 기타 성분이 감소될 수 있으나 ; 그런 다음, 상기 감소는 백신 조성물의 안정성의 감소를 초래할 수 있다. 따라서, 증가된 안전성 및 안정성을 가진 신규 아쥬반트 및 그러한 아쥬반트를 함유하는 백신 조성물에 대한 요구가 있다.

본 발명의 첫번째 구현예는, 박테리아 또는 바이러스 현탁액, 특히 농축 및 비-정제 또는 약하게 정제된 것들의 존재 하에 증가된 안정성을 가진 신규 수중유 (O/W) 에멀젼을 제공한다.

본 발명의 또다른 구현예는, 더욱 특히 면역원일 수 있는 하나 이상의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물의 전달을 위한 비히클로서 작용하는, 안정하고 안전하며 쉽게 투여가능한, 특히 주사가능한 O/W 에멀젼을 제공한다.

본 발명의 또다른 구현예는, 면역원에 의해 유도되는 면역 반응을 증가시키기 위한 아쥬반트로서 작용하는 안정하고, 안전하며 주사가능한 O/W 에멀젼을 제공한다. 특히, 본 발명은, 면역원을 함유하는 백신 조성물에서 사용될 때, 면역원에 대한 백신접종의 세포성 면역 반응, 체액성 면역 반응 또는, 바람직하게는 둘 다를 증가시키는 신규 아쥬반트를 제공한다.

본 발명의 또다른 구현예는, O/W 에멀젼을 포함하는 안정하고, 안전하며 면역원성인 조성물 또는 백신을 제공한다.

본 발명의 추가의 구현예는, 본 발명의 아쥬반트를 사용한 백신 조성물의 제조 방법 ; 그렇게 해서 수득된 백신 조성물 ; 및 그의 사용 방법을 제공한다.

본 발명의 더욱 또다른 구현예는, 첫 바이알에 면역원 또는 기타 약학적 생성물, 및 두번째 바이알에 본 발명에 따라 제작된, 사용 전에 면역원 또는 기타 백신 생성물과 혼합되도록 고안된 아쥬반트를 포함하는 키트를 제공한다.

한 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 주사가능한 수중유 (O/W) 에멀젼을 제공한다 :

(1) 면역원을 함유하는 수용액 ;

(2) 광유 ;

(3) 비-이온성 친지성 계면활성제 ;

(4) 소르비탄의 에톡실화 지방산 디에스테르를 포함하는 낮은 HLB 값 (일반적으로 11 내지 13 의 HLB 값을 가짐) 을 가진 비-이온성 친수성 계면활성제.

또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 주사가능한 수중유 (O/W) 에멀젼을 제공한다 :

(1) 면역원을 함유하는 수용액 ;

(2) 13 초과 40 미만, 특히 HLB ≥ 13.5, 및 바람직하게는 HLB ≥ 14 의 높은 친수성-친지성 밸런스 (HLB) 값을 가진 비-이온성 친수성 계면활성제 ;

(3) 광유 ;

(4) 비-이온성 친지성 계면활성제 ;

(5) 낮은 HLB 값 (약 9 내지 약 13 의 HLB 값) 을 가진 비-이온성 친수성 계면활성제.

또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 백신접종에 면역 반응을 유도하기에 적합한 하나 이상의 면역원을 함유하는 신규 에멀젼을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 본 발명은 추가로 에멀젼이 면역원에 의해 유도되는 면역 반응을 증가시키는, 특히 세포성 반응, 체액성 반응 또는 바람직하게는 둘 다를 증가시키는 아쥬반트로서 작용하는, 그러한 조성물을 제공한다.

또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 백신 조성물의 제조 방법을 제공하는데, 여기서 면역원, 특히 동결건조된 형태 또는 수용액 내에 있는 면역원은 본 발명에 따른 아쥬반트와 혼합된다. 면역원은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다 : 불활성화된 병원체, 약화된 병원체, 하위-단위 항원, 플라스미드를 포함하여 재조합 발현 벡터 등. 병원체는 기원이 박테리아, 바이러스, 원생동물 또는 진균일 수 있거나 또는 면역원은 항독소 (antitoxin) 를 구성할 수 있다.

또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은, 본 발명의 백신 조성물을 백신접종하기 위해 투여하는 것을 포함하는, 병원체에 대한 백신접종에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.

또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은, 2 개 이상의 바이알, 첫번째 바이알에 면역원, 특히 동결건조된 형태 또는 수성 매질 내 수용액 내의 면역원, 및 두번째 바이알에 본 발명에 따른 아쥬반트 또는 에멀젼을 포함하는 키트를 제공한다.

본 개시물 및 특히 청구항 내에서, "포함하다 (comprises)", "포함된(comprised)", "포함하는 (comprising)" 등과 같은 용어는 U.S. 특허법에서의 그러한 용어의 것인 의미를 가질 수 있고 ; 예를 들어, 그것들은 "포함하다 (includes)", "포함된 (included)", "포함하는 (including)" 등을 의미할 수 있고 ; "본질적으로 이루어진" 및 "본질적으로 이루어지다" 와 같은 용어는 U.S. 특허법에 의해 그러한 것들에 기술된 의미를 가지며, 예를 들어 그것들은 원소가 명시적으로 언급되지 않도록 하나, 선행 기술 분야에서 발견되거나 또는 본 발명의 기본적 또는 신규 특징에 영향을 미치는 원소를 배제한다고 명시되어 있다.

상기 및 기타 구현예는 하기 상세한 설명으로부터 개시되거나 또는 분명해지고, 그에 포함된다.

당업자에게 있어서 그의 최상의 형태를 포함하여 본 발명의 전체 및 가능한 개시는, 수반하는 도면을 참조하는 것을 포함하여 명세서의 나머지 부분에 더욱 특히 나타나 있으며, 여기서 :

도 1 은 실시예 3 에 따라 백신접종한 후 28 일째에 시도된 새끼돼지의 폐 병변 등급 (lung lesion score) 을 예시한 것이다. 평균값은 박스의 십자모양의, 하위 4분위수 및 상위 4분위수이고, 통계적 평균은 박스 내의 수평선이며, 최 소 내지 최대값은 수직선으로 나타나 있다.

도 2 는 실시예 4 에 따라 백신접종한 후 20 주째에 시도된 새끼돼지의 폐 병변 등급을 예시한 것이다. 평균값은 박스의 십자모양의, 하위 4분위수 및 상위 4분위수이고, 통계적 평균은 박스 내의 수평선이며, 최소 내지 최대값은 수직선으로 나타나 있다.

도 3 은 실시예 6 에 따른 시도 후의 임상 등급으로 나타내어진 임상 질환의 경과를 묘사한 도를 제공한다.

도 4 는 필드 효율 시험 (field efficacy trial) 의 결과를 묘사한 것으로, 여기서 새끼를 낳기 전에 일단 본 발명에 따라 제작된 PCV-2 백신 조성물로 백신접종된 돼지들에서 태어난 새끼 돼지 (n = 889 마리의 새끼 돼지) 는 백신접종되지 않은 돼지에서 태어난 대조군 새끼 돼지 (n = 713) 에 비해 이유후 다발계통 소모 증후군 (postweaning multisystem wasting syndrome, PMWS) 으로 인한 사망률에서의 확실한 감소 (75% 감소) 를 나타내었다.

본 발명의 기타의 목적, 특징 및 측면은 하기의 상세한 설명에 개시되어 있거나, 그것으로부터 명백하다. 본 논의는 예시적인 구현의 설명일 뿐 본 발명의 예시적 구조에서 구현되는 폭넓은 측면들을 한정하려는 의도가 아님은 당업자에게는 말할 필요도 없다. 사실상, 본 발명의 범주 또는 취지에서 벗어나지 않으면서 본 발명에서 다양한 변경 및 변동이 행해질 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 한 구현예의 일부로서 예시되거나 기재되는 특징들이 다른 구현예에서 사용되어 또 다른 구현예를 낳을 수 있다. 그러한 변경 및 변동은 첨부된 청구항 및 이들의 균등물의 범주에 속하는 한 본 발명에 포함된다. 본 출원을 통틀어 인용된 모든 참고문헌, 공개 특허, 및 특허의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 반영되어 있다.

편의상, 명세서, 실시예, 및 첨부된 청구항에 이용되는 특정 용어를 여기에 모아둔다.

본원에서 사용하는 바와 같이, "동물" 이라는 용어에는 인간을 포함한 모든 척추 동물이 포함된다. 또한 배아 및 태아 단계를 포함하는 모든 발생 단계의 개개의 동물이 포함된다. 특히, "척추 동물" 이라는 용어에는 인간, 개과 (예를 들어, 개), 고양이과 (예를 들어, 고양이); 말과 (예를 들어, 말), 소과 (예를 들어, 소), 돼지과 (예를 들어, 돼지), 뿐만 아니라 조류가 포함되지만, 여기에 한정되지는 않는다. 본원에 사용되는 바와 같이 "조류" 라는 용어는 닭류 (브리더 (breeders), 브로일러 (broilers) 및 레이어 (layers)), 칠면조류, 오리류, 거위, 메추라기, 꿩류, 앵무새류, 되새류, 매류, 까마귀류 및 타조, 에뮤 및 화식조를 포함한 평흉류와 같은 분류학상 아바 (ava) 강의 임의의 종 또는 아종을 가리키지만, 여기에 한정되지는 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "돼지" 또는 "새끼 돼지" 라는 용어는 돼지과 기원의 동물을 의미하는 반면, "암퇘지" 는 번식 연령이며 번식 능력이 있는 암컷을 가리킨다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "독성 (virulent)" 이라는 용어는 동물 숙주 내에서의 전염능을 보유하는 분리된 것 (isolate) 을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "비활성화된 백신" 이라는 용어는 더이상 복제 또는 성장할 수 없는 전염성 유기체 및 병원체를 함유하는 백신 조성물을 의미한다. 병원체는 그 기원이 세균성, 바이러스성, 원생동물성 또는 진균성일 수 있다. 그의 면역원성을 유지하면서 유기체의 복제 또는 성장을 예방하기에 충분한, 냉동-해동, 화학적 처리 (예를 들어, 티메로살 또는 포르말린으로의 처리), 초음파분해, 방사선, 열 또는 임의의 기타 통상의 수단을 포함하여 다양한 방법에 의해 비활성화를 수행할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "면역원성" 이라는 용어는 항원 또는 항원들에 대하여 숙주 동물 내에서 면역 반응을 생성할 수 있음을 의미한다. 이런 면역 반응은, 특정한 전염성 유기체에 대하여 백신에 의해 유도되는 방어 면역의 기초를 형성한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "면역 반응" 이라는 용어는 동물 내에서 유도되는 반응을 말한다. 면역 반응은 세포성 면역 (CMI) ; 체액성 면역을 말할 수 있거나 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 면역계의 일부로 한정된 반응을 계획한다. 예를 들어, 본 발명의 백신 조성물은 증가된 감마 인터페론 반응을 특이적으로 유도할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "항원" 또는 "면역원" 이라는 용어는 숙주 동물 내에서 특이적 면역 반응을 유도하는 물질을 의미한다. 항원은 죽은, 약화된 또는 살아있는 전체 유기체 ; 유기체의 일부 또는 하위단위 ; 면역원성 특성이 있는 삽입물을 함유하는 재조합 벡터; 숙주 동물에 제시될 때 면역 반응을 유도할 수 있는 DNA 절편 또는 조각 ; 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 에피토프, 합텐, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 대안적으로는, 면역원 또는 항원은 독소 또는 항독소를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "다가" 라는 용어는 동일 종 (즉, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 (Mycoplasma hyopneumonia) 의 상이한 분리물) 또는, 상이한 종 (즉, 파스튜렐라 헤모라이티카 (Pasteurella hemolytica) 및 파스튜렐라 뮬토시다 (Pasteurella multocida) 둘 다로부터의 분리물) 으로부터의 항원을 하나를 초과하여 포함하는 백신, 또는 상이한 속 (예를 들어, 파스튜렐라 뮬토시다, 살모넬라, 대장균, 헤모필러스 솜너스 (Haemophilus somnus) 및 클로스트리디움 (Clostridium)) 으로부터의 항원의 조합을 함유하는 백신을 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "아쥬반트" 라는 용어는 백신에 첨가되어 백신의 면역원성을 증가시키는 물질을 의미한다. 아쥬반트의 작동 기작이 완전히 알려진 것은 아니다. 일부 아쥬반트는 항원을 천천히 방출하여 면역 반응을 강화시킨다고 여겨지는 반면, 다른 아쥬반트는 본래 강력한 면역성을 타고났으며 시너지 작용을 한다고 여겨진다. 공지된 백신 아쥬반트에는 오일 및 물 에멀젼 (예를 들어, 완전 프로인드 (Freund's) 아쥬반트 및 불완전 프로인드 아쥬반트), 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum), 바실루스 칼메트 게린 (Bacillus Calmette Guerin), 수산화알루미늄, 글루칸, 덱스트란 술페이트, 산화철, 알긴산나트륨, 박토(Bacto)-아쥬반트, 특정 합성 중합체 예컨대 폴리아미노산 및 아미노산 공-중합체, 사포닌, "REGRESSIN" (Vetrepharm, Athens, Ga.), "AVRIDINE" (N,N-디 옥타데실-N',N'-비스(2-히드록시에틸)-프로판디아민), 파라핀 오일, 무라밀 디펩티드 등이 포함되지만, 여기에 한정되지는 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용가능한 담체" 및 "약학적으로 허용가능한 운반체" 라는 용어는 교환가능하며, 부작용없이 숙주에 주입될 수 있는, 백신 항원을 함유하기 위한 유체 운반체를 가리킨다. 업계에 공지된 약학적으로 허용가능한 적합한 담체에는 멸균수, 염수, 글루코오스, 덱스트로오스, 또는 완충액이 포함되지만, 여기에 한정되지는 않는다. 담체는 희석제, 안정화제 (즉, 당 및 아미노산), 방부제, 습윤제, 유화제, pH 완충제, 증점제, 색소 등을 포함하는 보조제를 포함할 수 있지만, 여기에 한정되지는 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "백신 조성물" 이라는 용어는 숙주 내에서 면역 반응을 유도시키는데 유용한, 약학적으로 허용가능한 운반체 내의 하나 이상의 항원 또는 면역원을 포함한다. 백신 조성물은 나이, 성별, 중량, 종 및 수령 동물의 상태, 및 투여 경로와 같은 인자를 고려하여, 의학 또는 수의학 당업자에게 주지되어 있는 기술에 의해 주지되어 있는 투여량으로 투여될 수 있다. 투여 경로는 경피적, 점막을 통한 투여 (예를 들어, 경구, 비강, 항문, 질) 또는 비경구 경로를 통해서 (피내, 근육내, 피하, 정맥내, 또는 복강내) 일 수 있다. 백신 조성물은 단독으로 투여될 수 있거나, 다른 치료 또는 요법과 동시-투여 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 투여 형태에는 현탁액, 시럽 또는 엘릭시르, 및 비경구, 피하, 피내, 근육내 또는 정맥내 투여 (예를 들어, 주사액 투여) 용 제제 예컨대 멸균 현탁액 또는 에멀젼이 포함될 수 있다. 백신 조성물은 스프레이로서 투여되거나 식품 및/또는 물에 혼합되거나 적합한 담체, 희석제 또는 부형제 예컨대 멸균수, 생리식염수, 글루코오스 등과의 부가혼합물로 전달될 수 있다. 상기 조성물은 원하는 제제 및 투여 경로에 따라, 습윤 또는 유화제, pH 완충제, 아쥬반트, 겔화 또는 증점 첨가제, 방부제, 풍미제, 색소 등과 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 불필요한 실험을 거치지 않고 적합한 제제를 제조하는데 "Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990" 과 같은 표준 약학 교과서를 참고할 수 있다.

본 발명은 하기를 함유하는 신규의 수중유 (O/W) 아쥬반트 또는 에멀젼을 제공한다:

(1) 숙주 내에서 면역 반응을 유도할 수 있는 백신 항원 또는 면역원을 함유하는 수용액 ;

(2) 친수성-친지성 밸런스 (HLB) 값이 13 초과 내지 40 미만 (HLB > 13, 특히 HLB ≥ 13.5, 바람직하게는 HLB ≥ 14) 인 비이온성 친수성 계면활성제 ;

(3) 광유 ;

(4) 비이온성 친지성 계면활성제 ; 및

(5) 낮은 HLB 값 (HLB 값 9 내지 13) 을 갖는 비이온성 친수성 계면활성제.

본 발명에 따라 제조된 에멀젼은 세 가지 상이한 군의 계면활성제 구성원 중에서 선택된 3 개 이상의 계면활성제의 조합을 기반으로 하고, 각각의 군에 속하는 하나 이상의 계면활성제를 사용하는 것이 가능하다.

바람직한 구현예에서, 에멀젼 (본 명세서에서 이것은 달리 지시하지 않는다 면 모든 성분을 포함하는 최종 에멀젼을 의미한다) 중 비이온성 친수성 계면활성제 (5) 의 농도는, 에멀젼의 부피에 의한 중량 (w/v) 백분율로서 표현하여, 1 % 내지 8 %, 특히 1.5 % 내지 6 %, 바람직하게는 2 % 내지 5 %, 더욱 바람직하게는 2.5 % 내지 4 % 이다.

이런 군의 계면활성제는 HLB 값이 낮은 (HLB 값 9 내지 13) 비이온성 친수성 계면활성제를 포함한다. 이런 군에는 소르비탄의 에톡실화된 지방산 모노에스테르 (특히 에톡실기가 5 개) (예를 들어, 에톡실화된 소르비탄 모노올레에이트 예컨대 Tween 81^®), 소르비탄의 에톡실화된 지방산 디에스테르, 소르비탄의 에톡실화된 지방산 트리에스테르 (특히 에톡실기가 20 개) (예를 들어, 에톡실화된 소르비탄 트리올레에이트 예컨대 Tween 85^®), 에톡실화된 소르비탄 트리스테아레이트 예컨대 Tween 65^®, 에톡실화된 지방 알코올 (특히 에톡실기가 5-10 개) (예를 들어, Brij 76^®, Brij 56^®, Brij 96^®), 에톡실화된 지방산 (특히 에톡실기가 5-10 개) (예를 들어, Simulsol 2599^®, Myrj 45^®), 에톡실화된 피마자 오일 (특히 에톡실기가 25-35 개) (예를 들어, Arlatone 650^®, Arlatone G^®), 및 이들의 조합이 포함되지만, 여기에 한정되지는 않는다.

소르비탄의 에톡실화된 지방산 디에스테르 및 소르비탄의 에톡실화된 지방산 트리에스테르, 뿐만 아니라 두 종의 조합이 바람직하다. 지방산은 바람직하게 는 올레에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 이소스테아레이트, 라우레이트 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 바람직한 소르비탄의 에톡실화된 지방산 트리에스테르에는 에톡실화된 소르비탄 트리올레에이트 예컨대 Tween 85^®, 또는 에톡실화된 소르비탄 트리스테아레이트 예컨대 Tween 65^® 가 포함된다.

바람직한 구현예에서, 비이온성 친수성 계면활성제 (2) 의 농도는, 에멀젼의 부피에 의한 중량 (w/v) 백분율로 표현하여, 일반적으로 0.1 % 내지 1.5 %, 특히 0.2 % 내지 1.4 %, 바람직하게는 0.3 % 내지 1.3 %, 더욱 바람직하게는 0.4 % 내지 1.2 % 이다.

이런 제 2 군의 계면활성제는 친수성-친지성 밸런스 (HLB) 값이 높은 (HLB > 13, 특히 HLB ≥ 13.5, 바람직하게는 HLB ≥ 14) 비이온성 친수성 계면활성제를 포함한다. 이런 군에는 소르비탄의 에톡실화된 지방산 모노에스테르 (특히 에톡실기가 20 개) (예를 들어, 에톡실화된 소르비탄 모노라우레이트 예컨대 Tween 20^®, 에톡실화된 소르비탄 모노팔미테이트 예컨대 Tween 40^®, 에톡실화된 소르비탄 모노스테아레이트 예컨대 Tween 60^®, 에톡실화된 소르비탄 모노올레에이트 예컨대 Tween 80^®), 에톡실화된 지방 알코올 (특히 에톡실기가 15-30 개) (예를 들어, Brij 78^®, Brij 98^®, Brij 721^®), 에톡실화된 지방산 (특히 에톡실기가 15-30 개) (예를 들어, Myrj 49^®, Myrj 51^®, Myrj 52^®, Myrj 53^®), 비이온성 블록-공중합체 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 공중합체 (POE-POP), 예컨대 Lutrol F127^®, Lutrol F68^®), 및 이들의 조합이 포함된다.

비이온성 블록-공중합체에 있어서, 백분율은 더 낮을 수 있고, 특히 0.1 % 내지 0.5 %, 더욱 특히 0.2 % 내지 0.4 % (에멀젼의 부피에 의한 중량 (w/v)) 일 수 있다.

바람직한 계면활성제 (2) 는 소르비탄의 에톡실화된 지방산 모노에스테르, 예컨대 상기 기재한 것들을 포함한다.

바람직한 구현예에서, 비이온성 친지성 계면활성제 (4) 의 농도는 에멀젼의 부피에 의한 중량 (w/v) 백분율로 표현하여, 0.1 % 내지 2.5 %, 특히 0.2 % 내지 2 %, 바람직하게는 0.2 % 내지 1.5 %, 더욱 바람직하게는 0.2 % 내지 1.2 % 이다.

이런 군의 계면활성제에는 소르비탄의 지방산 에스테르 (예를 들어, Span 20^® 과 같은 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트, 예컨대 Span 40^®, 소르비탄 모노스테아레이트, 예컨대 Span 60^®, 소르비탄 트리스테아레이트, 예컨대 Span 65^®, Span 80^® 과 같은 소르비탄 모노올레에이트, Span 85^® 과 같은 소르비탄 트리올레에이트, 소르비탄 모노이소스테아레이트, 예컨대 Arlacel 987^®, 소르비탄 이소스테아레이트, 예컨대 Crill 6^®), 만니드의 지방산 에스테르 (예를 들어, Montanide 80^®, 만니드 모노올레에이트 (예컨대 Arlacel A^®), 만니드 디올레에이 트, 만니드 트리올레에이트, 만니드 테트라올레에이트), 만니드의 에톡실화된 지방산 에스테르 (에톡실기가 2, 3 또는 4 개) (예를 들어, Montanide 888^®, Montanide 103^®, 에톡실화된 만니드 모노올레에이트, 에톡실화된 만니드 디올레에이트, 에톡실화된 만니드 트리올레에이트, 에톡실화된 만니드 테트라올레에이트), 및 이들의 조합이 포함된다.

지방산은 바람직하게는 올레에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 이소스테아레이트, 라우레이트 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

바람직한 계면활성제 (4) 는 소르비탄의 지방산 에스테르, 특히 상기 기재한 것들, 및 이들의 조합을 포함한다.

본 발명의 계면활성제는 동물 또는 식물 기원의 지방산을 가질 수 있다.

한 가지 기원으로부터 다른 것으로 (예를 들어, 동물성 Tween 80^® 에서 식물성 Tween 80^® 로) 의 변경은 에멀젼의 제형을 조금만 조정해도 간단히 행할 수 있다.

본 발명에 따른 에멀젼은 계면활성제의 전체 농도가, 에멀젼의 부피 당 중량으로, 1.2 % 내지 10 %, 특히 2 % 내지 8 %, 바람직하게는 3 % 내지 7 %, 더욱 바람직하게는 4 % 내지 6 % 일 수 있다.

일반적으로, 본 발명에 따른 에멀젼은 33℃ 이상의 상 전이 온도 (PIT) 를 가질 수 있고, 특히 33℃ 내지 66℃, 더욱 특히 36℃ 내지 60℃, 바람직하게는 37℃ 내지 55℃, 더욱 바람직하게는 38℃ 내지 50℃ 범위이다.

PIT 는 유중수 에멀젼이 수중유 에멀젼으로 바뀌거나 탈-상 (de-phases) (에멀젼이 끊어지고 2 개의 상으로 분리됨) 되는 온도이다. PIT 값은 예를 들어 시각적 관찰 (예를 들어 실시예 2 참고) 에 의해 또는 전도도에 의해서와 같은 다양한 수단에 의해 측정할 수 있다. 에멀젼을 그 에멀젼의 PIT 미만의 온도, 예를 들어 수조 내 약 25 ℃ 에 둔다. 온도가 점차 증가한다. 에멀젼의 시각적 양상의 변화, 특히 유동성, 점도, 두 가지 상으로의 분리, 오일상이 표면으로 이동하여 생기는 표면 양상의 변화를 대조 에멀젼과 비교하여 관찰한다. 이런 시각적 양상이 관찰되는 온도가 그 에멀젼의 PIT 값이다. 대안적으로는, PIT 는 약 5-8 밀리지멘스/센티미터 (mS/cm) (수중유 에멀젼) 의 값에서 약 0 mS/cm (유중수 에멀젼) 의 값으로 전도도를 급속히 변형시켜 측정하며, 전도도는 에멀젼 속에 표면 근처에 놓은 탐침으로 측정한다. 전이가 관찰되는 온도가 그 에멀젼의 PIT 값이다. 당업자는 불필요한 실험을 거치지 않고 각각의 농도를 포함한 계면활성제 및 오일의 조합을 결정하여 본 발명에 따른 에멀젼, 특히 PIT 값이 상기 정의한 범위 내인 에멀젼을 제조할 수 있을 것이다.

본 발명의 특정 구현예에서, 본원에 기재한 바와 같은 에멀젼은 어떠한 이온성 계면활성제 또는 레시틴 또는 사포닌과 같은, 이온성 계면활성제 특성을 갖는 것으로 알려진 어떠한 화합물도 함유하지 않는다. 일반적으로, 본 발명에 따른 에멀젼은, 에멀젼의 부피 당 부피로, 3 % 내지 55 % 의 오일, 특히 5 % 내지 50 % 의 오일, 바람직하게는 10 % 내지 40 % 의 오일, 더욱 바람직하게는, 20 % 내지 40 % 의 오일을 함유할 수 있다. 정의에 의하면, 본 명세서에서 값의 범위는 달리 지시하지 않는다면 항상 그 범위의 한계를 포함한다.

사용하는 오일은 파라핀 오일 예컨대 이소파라핀계 오일 및/또는 나프텐계 오일, 스쿠알렌, 프리스탄, 폴리이소부텐 오일, 수소화된 폴리이소부텐 오일, 폴리데센 오일, 폴리이소프렌 오일, 폴리이소프로펜 오일 등을 포함하는 광유일 수 있지만, 여기에 한정되지는 않는다. 본 발명에 유용한 한 가지 유리한 광유는 탄소 원자수가 15 초과, 바람직하게는 15 내지 32 인 선형 또는 분지형 탄소 사슬을 포함하고 방향족 화합물이 없는 오일을 포함할 수 있다. 그러한 오일은, 예를 들어, "MARCOL 52^®" 또는 "MARCOL 82^®" (Esso 제조, France), 또는 "DRAKEOL 6VR^®" (Penreco 제조, USA) 이라는 이름으로 시판되는 것들일 수 있다.

또한 오일은 본원에 기재된 오일 중 2 개 이상의 오일을 임의의 비율로 포함하는 오일 혼합물일 수 있다. 또한 오일 혼합물은 상기 기재한 오일 중 선택된 하나 이상의 오일 및 하나 이상의 식물성 오일을 함유할 수 있고, 이 식물성 오일은 오일상의 약 0.1 % 내지 약 33 %, 바람직하게는 약 10 % 내지 약 25 % v/v 를 나타낸다. 이러한 식물성 오일은 생분해가능한 올레산이 풍부한 불포화 오일이고 바람직하게는 저장 온도 (약 + 4 ℃) 에서 액체이거나, 적어도 이 온도에서 액체인 에멀젼을 제공할 수 있다. 예를 들어, 식물성 오일은 땅콩 오일, 견과 오일, 해바라기 오일, 홍화 오일, 대두 오일, 오나거 (onager) 오일 등일 수 있다.

바람직한 구현예에서, 친수성 계면활성제 (2) 및 (5) 는 바람직하게는 분자 의 동일한 친수성 부분을 가지는 계면활성제를 포함한다. 예를 들어, 친수성 계면활성제 (2) 및 (5) 각각에 대하여 소르비탄의 에톡실화된 지방산 에스테르를 사용한다. 예를 들어, HLB 값이 낮은 비이온성 친수성 계면활성제로서 Tween 85^® 을 선택한 경우, HLB 값이 높은 비이온성 친수성 계면활성제가 유리하게는 Tween 80^® 과 같은 에톡실화된 소르비탄으로 구성된 친수성 부분을 가질 것이다.

일반적으로, 본 발명은 멸균수, 생리식염수, 글루코오스, 완충액 등을 포함하지만 여기에 한정되지는 않는 적합한 수의학적 또는 약학적으로 허용가능한 운반체, 부형제, 또는 희석제를 함유하는 수용액의 사용을 계획한다. 운반체, 부형제 또는 희석제는 또한 폴리올, 글루시드 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다. 운반체, 부형제 또는 희석제는 또한, 예를 들어, 아미노산, 펩티드, 항산화제, 살균제, 정균성 (bacteriostatic) 화합물을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 에멀젼 100 부피% 를 수득하는 양으로 수용액을 오일 및 계면활성제에 첨가한다.

에멀젼의 친수성-친지성 밸런스 (HLB) 은 계면활성제의 친수력 또는 친지력을 추정하게 해 준다. 양친매성 분자의 HLB 는 일반적으로 하기와 같이 계산된다:

HLB 는 0 (가장 친지성인 분자에 있어서) 내지 20 (가장 친수성인 분자에 있어서) 의 범위의 값을 가진다. 계면활성제의 화학적 조성 (특히, 예를 들어, 에톡실기 또는 알켄 산화물의 첨가) 에 따라, 이 추정은 변할 수 있고, HLB 값의 영역이 증가할 수 있다 (예를 들어, Lutrol F68^® 은 HLB 가 29 이다). 계면활성제 혼합물에 있어서는, 혼합물의 HLB 는 중량비로 밸런스를 맞춘, 각각의 계면활성제의 HLB 의 합이다:

본 발명에 따라 제조한 에멀젼의 한 가지 구현예에서, 에멀젼의 최종 HLB 는 약 9 내지 약 12, 바람직하게는 약 9.5 내지 약 11.5, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 약 11.5 이다.

본 발명은 파라핀 오일 (특히 에멀젼의 부피 당 부피 (v/v) 로서 표현한 농도가 약 10 % 내지 약 40 %, 바람직하게는 약 20 % 내지 약 40 % 임); 소르비탄 지방산 모노에스테르 (비이온성 친지성 계면활성제로서), 소르비탄의 에톡실화된 지방산 트리에스테르 (HLB 값이 낮은 비이온성 친수성 계면활성제로서); 및 소르비탄의 에톡실화된 지방산 모노에스테르 (HLB 값이 높은 비이온성 친수성 계면활성제로서) 를 함유하는 에멀젼을 계획한다. 특히 소르비탄 지방산 모노에스테르는 소르비탄 모노올레에이트 (특히 에멀젼의 부피 당 중량 (w/v) 으로 표현한 농도가 0.2 % 내지 1.5 %, 바람직하게는 0.2 % 내지 1.2 % 임) 이고, 소르비탄의 에톡실화된 지방산 트리에스테르는 소르비탄의 에톡실화된 트리올레에이트 (특히 농도가 2 % 내지 5 %, 바람직하게는 2.5 % 내지 4 % w/v 임) 이고, 소르비탄의 에톡실화된 지방산 모노에스테르는 에톡실화된 소르비탄 모노올레에이트 (특히 농도가 0.3 % 내지 1.3 %, 바람직하게는 0.4 % 내지 1.2 % w/v 임) 이다. 예를 들어, 에멀젼은 파라핀 오일을 에멀젼의 부피 당 약 29.3 부피% 로, 소르비탄 모노올레에이트를 에멀젼의 부피 당 0.6 중량% 로, 소르비탄의 에톡실화된 트리올레에이트를 에멀젼의 부피 당 3.4 중량% 로, 그리고 에톡실화된 소르비탄 모노올레에이트를 에멀젼의 부피 당 0.75 중량% 로 함유한다.

본 발명에 따른 두번째 구현예에서, 상기 에멀젼은 파라핀 오일 (특히, 농도가 10% 내지 40%, 바람직하게는 20% 내지 40% v/v 임), 소르비탄 지방산 모노에스테르 (비이온성 친지성 계면활성제로서), 소르비탄의 에톡실화된 지방산 트리에스테르 (HLB 값이 낮은 비이온성 친수성 계면활성제로서) 및 비이온성 블록-공중합체 (HLB 값이 높은 비이온성 친수성 계면활성제로서)를 함유한다. 특히, 상기 소르비탄 지방산 모노에스테르는 소르비탄 모노올레에이트 (특히, 농도가 0.2% 내지 1.5%, 바람직하게는 0.2% 내지 1.2% w/v 임)이고, 상기 소르비탄의 에톡실화된 지방산 트리에스테르는 소르비탄의 에톡실화된 트리올레에이트 (특히, 농도가 2 % 내지 5%, 바람직하게는 2.5% 내지 4% w/v 임)이고, 상기 비이온성 블록-공중합체는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 중합체 (POE-POP) (특히, 농도가 0.1% 내지 0.5%, 바람직하게는 0.2% 내지 0.4% w/v 임)이다. 예를 들면, 상기 에멀젼은 파라핀 오일을 약 29.3% v/v 로, 소르비탄 모노올레에이트를 0.6% w/v 로, 소르비탄의 에톡실화된 트리올레에이트를 3.4% w/v 로 및 에톡실화된 소르비탄 모노올레에이트를 0.25% w/v 로 함유한다.

특정 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 주사가능한 수중유 (O/W) 에멀 젼으로 계획된다:

(1) 약물 또는 면역원과 같은 활성 성분, 바람직하게는 면역원을 함유하는 수용액 ;

(2) 광유 ;

(3) 비이온성 친지성 계면활성제 ; 및

(4) 소르비탄의 에톡실화된 지방산 디에스테르로 이루어진, 낮은 HLB 값 (HLB 값이 11 내지 13 일 수 있음) 을 갖는 비이온성 친수성 계면활성제.

본 발명에 따른 에멀젼은 20 이하의 에톡시기를 포함할 수 있는 소르비탄의 에톡실화된 지방산 디에스테르를 함유한다. 상기 지방산은 동물 또는 식물 기원일 수 있고, 올레에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 이소스테아레이트, 라우레이트, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 에톡실화된 지방산은 바람직하게는 올레에이트이다. PIT 와 같은 에멀젼의 일반적 특성뿐만 아니라 다른 요소는, 전술한 것 이외에는 동일한 특징을 가질 수 있다.

바람직하게는, 계면활성제 (4)는 에톡실화 소르비탄 디올레에이트, 에톡실화 소르비탄 디스테아레이트 또는 에톡실화 소르비탄 디이소스테아레이트, 에톡실화 소르비탄 디팔미테이트, 에톡실화 소르비탄 디라우레이트, 및 이들의 조합과 같은 소르비탄의 에톡실화된 지방산 디에스테르를 함유한다.

선택적으로, 명반 (alum); CpG 올리고뉴클레오티드 (ODN), 특히 ODN 2006, 2007, 2059 또는 2135 [Pontarollo R.A. 등, Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 43-59; Wernette C.M. 등, Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 223-236; Mutwiri G. 등, Vet, Immunol. Immunopath, 2003, 91: 89-103]; 폴리A-폴리U [Michael F. Powell 및 Mark J. Newman, "Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach", Pharmaceutical Biotechnology, 6: 03]; 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDA) [Michael F. Powell 및 Mark J. Newman, "Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach", Pharmaceutical Biotechnology, volume 6: 157], N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-히드록시에틸)프로판디아민 (예컨대, Avridine

) (Ibid, p. 148), 카르보머, 키토산 (예를 들면, US 특허 일련번호 제 5,980,912 호 참조)를 포함하나 이에 제한되지 않는, 다른 화합물을 보조-아쥬반트로서 상기 에멀젼에 첨가할 수 있다.

본 발명은 또한 하나 이상의 항원 또는 면역원, 및 아쥬반트 또는 본 발명에 따라 제조된 에멀젼을 함유하는 백신 조성물 또는 면역 조성물의 제조 방법을 제공한다. 상기 면역원은 에멀젼 제형물 중에 혼입될 수 있거나, 또 다른 구현예에서는, 상기 면역원은 이후에, 예를 들면, 사용 직전에, 에멀젼에 첨가될 수 있다.

이용되는 수용액의 전량이 최초로 제조된 에멀젼 내에 존재할 수 있다. 또는, 상기 수용액의 일부만이 에멀젼을 형성하는데 이용되고, 수용액의 나머지 양은 면역원 혼입 후에 첨가될 수 있다. 상기 면역원 또는 항원은 동결건조 형태 또는 다른 적절한 고체 형태로 존재하고, 이어서, 상기 에멀젼과 혼합될 수 있거나, 선택적으로는, 상기 항원은 용액, 특히 수용액이고, 상기 용액은 에멀젼과 혼합될 수 있다.

계면활성제는 바람직하게는 그의 용해도에 따라 오일 또는 수용액에 첨가된다. 예를 들면, 상기 비이온성 친지성 계면활성제는 본 발명에 따른 오일에 첨가되는 반면, HLB 값이 높은 비이온성 친수성 계면활성제는 수용액에 첨가된다.

당업계의 일반적 기술로 공지된 통상적인 방법에 따라 에멀젼화를 실시할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 에멀젼은 에멀젼의 PIT 미만의 온도, 특히 실온, 예를 들면, 약 25 ℃ 에서 제조될 수 있다. 예를 들면, 높은 전단력을 생성할 수 있는 회전자-고정자 (rotor-stator)를 갖춘 터빈을 사용하는 기계적 교반에 의해 상기 수상 및 오일상을 함께 혼합한다. 바람직하게는, 낮은 회전 속도로 교반을 시작하여, 일반적으로 수용액의 오일 내로의 점진적 첨가에 따라 서서히 증가시킨다. 바람직하게는, 수용액을 오일에 점진적으로 첨가한다. 오일/수용액 비를 조절하여, 예를 들면, 약 40% 내지 약 55% 의 오일 농도 (v/v)로 유중수 (W/O) 에멀젼을 수득할 수 있다. 교반을 멈추었을 때, 상기 에멀젼은 O/W 에멀젼으로 점자 변해간다 (상 전이). 전이 후, 필요한 경우, 수용액을 첨가함으로써 상기 에멀젼을 희석시켜, 최종 에멀젼 내에서 목적된 오일 농도를 수득한다. 상기 에멀젼을 약 5℃ 에서 보관할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 에멀젼의 PIT 보다 높은 온도에서 에멀젼을 제조할 수 있다. 제 1 단계에서, 수상 및 오일상을 에멀젼의 PIT 보다 높은 온도에서 함께 혼합한다. 바람직하게는, 수용액을 오일에 점진적으로 첨가한다. 오일/수용액 비를 조절하여, 예를 들면, 약 40% 내지 약 55% 의 오일 농도 (v/v)로 유중수 (W/O) 에멀젼을 수득할 수 있다. 예를 들면, 정적 혼합기 또는 마린 헬릭스 (marine helix)를 이용하거나 또는 터빈을 매우 낮은 회전 속도로 이용하여, 낮은 전단력으로 또는 전단력 없이 교반함으로써 에멀젼화를 수행할 수 있다. 수득된 에멀젼은 유중수 (W/O) 에멀젼이다. 제 2 단계에서, 상기 에멀젼을 PIT 미만으로 점차적으로 냉각시킨다. 상기 단계 중, 에멀젼은 O/W 에멀젼으로 바뀐다 (상 전이). 전이 후, 필요한 경우, 수용액을 첨가함으로써 상기 에멀젼을 희석화시켜, 최종 에멀젼 내에서 목적된 오일 농도를 수득한다. 상기 에멀젼을 약 5℃ 에서 보관할 수 있다.

에멀젼 내의 액적 (droplet) 크기는 약 100 nm 내지 약 500 nm 일 수 있다. 상기 에멀젼을, 예를 들면, 아쥬반트로서 사용하여 백신 조성물 또는 약학 조성물을 제형화할 수 있다. 또한, 상기 에멀젼을 용매로서 이용하여, 예를 들면, 약화된 미생물 또는 살아있는 재조합 벡터를 함유하는 건조 생성물, 특히, 동결건조된 생성물을 용해시킬 수 있다.

특정 구현예에서, 수용액의 일부만을 이용하여 예비-에멀젼 (pre-emulsion)을 제조한다. 약물 또는 면역원과 같은 활성 성분, 바람직하게는 면역원의 현탁액을 첨가함으로써 상기 예비-에멀젼을 희석하여, 최종 조성물을 수득할 수 있다. 선택적으로, 상기 예비-에멀젼을 수용액으로 희석하고, 동결건조 생성물과 같은 건조 생성물을 용해시키는데 이용할 수 있다.

본 발명에 이용하기에 적합한 면역원 또는 항원은 비활성화된 병원체, 약화된 병원체, 면역원성 하위단위 (예를 들면, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 에피토프, 합텐), 또는 면역원성 삽입물을 갖는 플라스미드를 포함하는 재조합 발현 벡터 로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 면역원은 비활성화되거나 또는 죽은 미생물이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 백신 조성물은, 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리티디스 (Salmonella enteritidis), 전염성 기관지염 바이러스 (IBV), 뉴캐슬병 바이러스 (NDV), 산란 저하 증후군 바이러스 (EDS) 또는 전염성 F 낭병 바이러스 (IBDV)를 포함하나 이에 제한되지 않는, 조류 병원체, 조류 인플루엔자 바이러스 등, 및 이들의 조합의 군으로부터 선택되는 면역원을 포함한다.

선택적으로, 상기 백신 조성물은, 고양이 헤르페스바이러스 (FHV), 고양이 칼리시바이러스 (FCV), 고양이 백혈병 바이러스 (FeLV), 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV), 광견병 바이러스 등과 같으나 이에 제한되지는 않는, 고양이 병원체, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 면역원을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 백신 조성물은, 광견병 바이러스, 개 헤르페스바이러스 (CHV), 개 파르보바이러스 (CPV), 개 코로나바이러스, 렙토스피라 카니콜라 (Leptospira canicola), 렙토스피라 이크테로헤모라지에 (Leptospira icterohaemorragiae), 렙토스피라 그립포티포사 (Leptospira grippotyphosa), 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 브로데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica) 등이 포함되나 이에 제한되지 않는 개 병원체, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 면역원을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은, 말 헤르페스바이러스 (1 형 또는 4 형), 말 인플루엔자 바이러스, 파상풍, 웨스트 나일 바이러스 등과 같은 말 병원체, 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 면역원을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은, 광견병 바이러스, 소 로타바이러스, 소 파라인플루엔자 바이러스 3 형 (bPIV-3), 소 코로나바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV), 구제역 바이러스 (FMDV), 소 호흡기 세포융합 바이러스 (BRSV), 전염성 소 비기관염 바이러스 (IBR), 대장균 (Escherichia coli), 파스튜렐라 물토시다 (Pasteurella multocida), 파스튜렐라 헤모라이티카 (Pasteurella haemolytica) 등과 같은 소 병원체 및 이들의 조합으로부터 선택되는 면역원을 포함한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 돼지 인플루엔자 바이러스 (SIV), 돼지 써코바이러스 2 형 (PCV-2), 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRS), 가성광견병 바이러스 (PRV), 돼지 파르보바이러스 (PPV), FMDV, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 (Mycoplasma hyponeumoniae), 에리시펠로트릭스 루시오파티아 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 파스튜렐라 물토시다, 보르데텔라 브론키셉티카, 대장균 등과 같으나 이에 제한되지 않는 돼지 병원체, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 면역원을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예는 약학적으로 허용가능한 운반체에 하나 이상의 면역원 및 에멀젼을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 바이러스, 박테리아, 진균 등을 포함하는 면역원은 적절한 배양 배지 또는 숙주 세포주 및 당업계에 일반적인 기술로 공지된 통상적인 방법을 이용하는 시험관 배양 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, MA-104 세포주와 같은 적절한 세포주 내에서 PRRS 를 배 양할 수 있다 (특히, US 특허 일련번호 제 5,587,164; 5,866,401; 5,840,563; 6,251,404 호 참조). 유사한 방식으로, PCV-2 는 PK-15 세포주를 이용하여 배양될 수 있고 (US 특허 일련번호 제 6,391,314 호 참조); SIV 는 달걀 상에서 배양될 수 있고 (US 특허 일련번호 제 6,048,537 호); 마이코플라즈마 하이오뉴모니아는 적절한 배양 배지 내에서 배양될 수 있다 (US 일련번호 제 5,968,525; US 5,338,543 호; Ross R. F. 등, Am. J. Vet. Res., 1984, 45:1899-1905).

비활성화된 면역 또는 백신 조성물을 얻기 위해, 상기 병원체는 바람직하게는 채취 후 비활성화되고, 임의로, 예를 들면, 포르말린 또는 포름알데히드, 베타-프로피오락톤, 에틸렌이민, 이원성 에틸렌이민 (BEI), 티메로살 (thimerosal) 등을 이용하는 화학적 처리 및/또는 물리적 처리 (예를 들면, 열처리 또는 초음파분해)에 의해 정화시킨다. 비활성화된 방법은 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들면, PRRS 바이러스는 베타-프로피오락톤 처리 (Plana-Duran 등, Vet. Microbiol., 1997, 55: 361-370) 또는 BEI 처리 (US 특허 일련번호 제 5,587, 164 호)에 의해 비활성화될 수 있고; PCV-2 바이러스의 비활성화는 에틸렌이민 처리 또는 베타-프로피오락톤 처리 (US 특허 일련번호 제 6,391,314 호)를 이용하여 달성될 수 있고; 돼지 인플루엔자 바이러스는 Triton 과 같은 세척제 (detergent)를 사용하거나 또는 포름알데히드 처리로 비활성화될 수 있고 (US 특허 일련번호 제 6,048,537 호); 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 박테리아는 포름알데히드 처리 (Ross R. F. supra), 에틸렌이민 또는 BEI 처리 (WO 91/18627 참조), 또는 티메로살 처리 (US 특허 일련번호 제 5,968,525 및 5,338,543 호)에 의해 비활성화될 수 있다.

상기 비활성화된 병원체는 통상적인 농축 기술, 특히, 초여과법 (ultrafiltration)에 의해 농축될 수 있고/있거나, 특히, 겔-여과를 포함하나 이에 제한되지 않는 크로마토그래피 기술, 수크로오스 구배 상의 초원심분리, 또는 특히 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 존재 하에서의 선택적 침전을 이용하는, 통상적인 정제 수단에 의해 정제될 수 있다.

본 발명에 따른 백신 조성물에 유용한 면역원에는 또한 발현 벡터가 포함된다. 상기 벡터에는 폴리뉴클레오티드 벡터 또는 플라스미드와 같은 생체 내 재조합 발현 벡터 (EP-A2-1001025; Chaudhuri P, Res. Vet. Sci. 2001, 70: 255-6), 아데노바이러스 벡터를 포함하나 이에 제한되지 않는 바이러스 벡터, 계두 (fowlpox) (US 특허 일련번호 제 5,174,993; 5,505,941; 및 5,766,599 호) 또는 카나리폭스 벡터 (US 특허 일련번호 제 5,756, 103 호)와 같은 폭스바이러스 벡터 또는 박테리아성 벡터 (대장균 또는 살모넬라균)가 포함되나 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한 다가 면역 조성물 또는 병용 백신 조성물의 제형을 포함한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 제조된 병용 소 세균백신에 유용한 본 발명의 항원에는 마이코플라즈마 보비스 (Mycoplasma bovis), 파스튜렐라균, 특히 파스튜렐라 물토시다 및 파스튜렐라 헤모라이티카, 헤모필러스균 (Haemophilus sp.), 특히, 헤모필러스 솜너스 (H. somnus), 클로스트리디움균 (Clostridium sp.), 살모넬라, 코리네박테리아 (Corynebacterium), 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 스타필로코쿠스 (Staphylococcus), 모락셀라 대장균 (Moraxella, E. coli) 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다.

본 발명은, 숙주에 본 발명에 따른 면역 조성물 또는 백신 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 숙주, 예를 들면, 동물 내에서 면역 반응을 유도하는 방법을 추가로 제공한다. 이러한 방식으로 유도된 면역 반응은 명백하게 항체 및/또는 세포성 면역 반응, 특히, 감마-인터페론 반응이다.

특히, 본 발명은 동물의 병원성 유기체 감염 (예를 들면, 바이러스, 박테리아, 진균 또는 원충 기생충 (protozoan parasite)에 의한 감염)에 의해 유도되는 증상에 대한 면역화 방법, 또는 예방 또는 감소 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 인간, 개과 (예를 들면, 개), 고양이과 (예를 들면, 고양이), 말과 (예를 들면, 말), 소과 (예를 들면, 소) 및 돼지과 동물 (예를 들면, 돼지) 뿐만 아니라, 닭류, 칠면조류, 오리류, 거위류, 메추라기, 꿩, 앵무새류, 되새류, 매류, 까마귀류 및 평흉류 (타조, 에뮤, 화식조 등)를 포함하나 이에 제한되지 않는, 조류를 포함하나 이에 제한되지 않는, 척추 동물에 유용하다.

본 발명의 특정 구현예에서, 상기 방법은 본 발명에 따라 제조된 백신 조성물을 투여하여 임신한 암컷을 분만 전에 백신 접종하는 것으로 이루어진다. 상기 방법은 추가로 백신 접종 프로토콜에 의해 유도된 방어 항체 유도 및 백신 접종된 임신한 암컷으로부터 그의 자손으로의 상기 방어 항체 전달을 포함한다. 상기 모 항체 (maternal antibody)의 전달은 결과적으로 자손을 병으로부터 방어한다.

본 발명에 따라 제조된 백신 조성물의 투여량은 백신 접종되는 동물의 종 (species), 품종 (breed), 연령, 크기, 백신 접종력 (vaccination history) 및 건강 상태에 따라 다를 것이다. 항원 농도, 추가 백신 성분 및 투여 경로 (즉, 피하, 피내, 경구, 근육내 또는 정맥내 투여)와 같은 다른 요인 또한 유효 투여량에 영향을 줄 것이다. 투여자에 대한 백신 투여량은 백신의 항원 농도, 투여 경로 및 백신 접종되는 동물의 연령 및 상태를 기반으로 하여 용이하게 결정될 수 있다. 각 항원 군은 개별적으로 조정될 수 있다. 선택적으로, 상이한 투여량의 조직적 면역원성 시험뿐만 아니라, LD₅₀ 연구 및 기타 검사 과정을 이용하여 불필요한 실험 없이 본 발명에 따른 백신 조성물의 유효 투여량을 결정할 수 있다. 본원에 기재된 백신 조성물의 사용에 관해 어느 정도의 투여량 및 어느 정도의 부피가 적절한지는 하기에 제시되는 실시예를 통해 용이하게 파악될 것이다. 자연 감염과 연관된 사망률 및 이환률의 감소에 의해 증명되는 바와 같이, 상기 투여량이 자연 감염에 대해 적어도 부분적인 방어 효과를 제공한다는 것이 중요 요소이다. 유사하게, 적정 부피는 당업계에 일반적인 기술을 통해 용이하게 확인된다. 예를 들면, 조류 종에서, 투여 부피는 약 0.1 ml 내지 약 0.5 ml, 유리하게는, 약 0.3 ml 내지 약 0.5 ml 일 수 있다. 고양이, 개 및 말 종에 대해서는, 투여 부피는 약 0.2 ml 내지 약 3.0 ml, 유리하게는 약 0.3 ml 내지 약 2.0 ml, 더욱 유리하게는 약 0.5 ml 내지 약 1.0 ml 일 수 있다. 소 및 돼지 종에 대해서는, 투여 부피는 약 0.2 ml 내지 약 5.0 ml, 유리하게는 약 0.3 ml 내지 약 3.0 ml, 더욱 유리하게는 0.5 ml 내지 약 2.0 ml 일 수 있다.

초기에 또는 최종 투여 이후 장기간 경과 시에, 면역 반응을 강화하기 위하여 주기적인 간격으로 백신 접종을 반복하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 백신 조성물은 비경구적 (즉, 피하, 내피 또는 근육내) 주사로서 투여된다. 상기 조성물은 1 회 투여로 투여되거나, 또는 선택적 구현에서, 약 2 내지 약 6 주, 바람직하게는 약 2 내지 약 5 주의 간격으로 제공되는, 약 2 내지 약 5 회 투여의 반복 투여로 투여될 수 있다. 그러나, 당업자는 투여 횟수 및 백신 접종 사이의 시간 간격이, 백신 접종되는 동물의 연령; 동물의 상태; 면역화 경로; 1 회 투여 당 이용가능한 항원 함량 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 다수의 요인에 따라 달라진다는 것을 인식할 것이다. 초기 백신 접종에 관하여, 상기 기간은 일반적으로 일주 초과, 바람직하게는 약 2 내지 약 5 주일 것이다. 이전에 백신 접종된 동물에 대하여는, 임신 전 또는 임신 중에, 약 일년의 간격으로 제 2 백신 접종을 수행할 수 있다.

본 발명은 또한 Pigjet

, Avijet

, Dermojet

또는 Biojector

(Bioject, Oregon, USA)와 같은 바늘 없는 주사기를 이용하여 백신 조성물을 투여하는 것을 계획한다. 당업자는, 불필요한 실험 없이, 백신 접종되는 동물의 종; 동물의 연령 및 체중 등과 같은 요인과 관련하여 필요한 경우, 상기 주사기의 세부사항을 조정할 수 있다.

본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 방법은 본 발명에 따른 에멀젼으로 제형화된 백신 조성물의 단일 투여를 포함한다. 예를 들면, 하나의 구현예에서, 상기 백신 조성물은 비활성화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 백신이고, 선택적 구 현예는 비활성화된 PCV2 바이러스 조성물을 포함하는 백신을 제공한다. 다른 면역 조성물 또는 백신은, 비활성화된 PRRS 및 SIV 를 포함하나 이에 제한되지 않는, 단일 투여 요법에 이용하는데 적합하다. 특히, 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 백신 조성물에 관하여는, 단일 투여량을 돼지의 출생 내지 도살, 특히 약 3 내지 약 56 일령, 바람직하게는 약 10 내지 약 35 일령, 더욱 바람직하게는 약 15 내지 약 30 일령 사이에 또한 투여할 수 있다. 상기 백신은 기존의 항체의 존재 하에 투여될 수 있다.

추가로, 본 발명은, 본 발명에 따라 제조되고 단백질 또는 펩티드, 항체, 알레르기항원, CpG ODN, 발육 인자, 사이토카인 또는 항생제, 특히 CpG ODN 또는 사이토카인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 면역원을 포함하는, 약학적 조성물을 숙주에 투여하는 것을 포함하는, 숙주, 예를 들면, 동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 약학 조성물은 닭, 돼지 또는 소와 같은 동물 내에서 발육 능력을 개선하는데 이용될 수 있다.

추가로, 본 발명은 면역원과 같은 성분 또는 약학 조성물을 함유하는 제 1 바이알, 및 제 2 바이알 내의 본 발명에 따라 제조된 에멀젼을 포함하는 키트에 관한 것이다. 상기 면역원은 전술한 바와 같이 동결건조된 형태, 건조 형태 또는 수용액일 수 있다.

이제 본 발명은 하기의 비제한 실시예를 통해 추가적으로 기술될 것이다.

실시예 1 : 에멀젼 제조 방법

에멀젼을 하기 기술된 바와 같이 2 단계로 제조하였다 :

제 1 단계 : 제형물을 제조하는 데는 고전단 회전자-고정자 Silverson 유화장치 (직경 10 mm 의 붕해 헤드를 갖춘 L4RT 형) 를 사용하였다. 에멀젼을 제조하기 위해서, 1 부피의 오일상을 25℃ 에서 1 부피의 수성상 #1 과 함께 유화시켰다. 5000 rpm (분 당 회전수) 으로 1 분 동안 진탕하면서, 수성상을 오일상에 첨가하였다. 회전 속도는 1 분 동안 부피의 증가율에 따라 8300 rpm 까지 점진적으로 증가시켰다. 상기 단계 동안 에멀젼은 유중수 에멀젼이었다. TS6 에멀젼에 대해서, 상 조성은 하기와 같았다 :

오일상 (120 ml) :

- 소르비탄 모노올레에이트 (Span 80®) : 1.8% w/v,

- 소르비탄 트리올레에이트 (20 OE) (Tween 85®) : 10.2% w/v,

- 파라핀 오일 (Marcol 82®) : 88% v/v,

수성상 #1 (120 ml) :

- 소르비탄 모노올레에이트 (20 OE) (Tween 80®) 의 20% (w/v) 용액 : 11.25% w/v,

- 포스페이트 이중나트륨 및 단일칼륨 0.02 M 등장성 완충액 (pH 7.8) : 85.75% v/v,

- 수중 1% 나트륨 머큐로티올레이트 (Thiomersal®) : 1.5% v/v.

소르비탄 모노올레에이트 (Span 80®) 및 소르비탄 트리올레에이트 (20 OE) (Tween 85®) 를 오일상에 도입시켰다. 소르비탄 모노올레에이트 (20 OE) (Tween 80®) 는 파라핀 오일에 혼화되지 않았다. Tween 80® 의 20% (w/v) 용액은 백신과 동일한 완충액, 예를 들면, 포스페이트 이중나트륨 및 단일칼륨 0.02 M 등장성 완충액 (pH 7.8) 중에 제조하였다. 나트륨 머큐로티올레이트는 방부제로서 작용하며 에멀젼에 필수적인 것은 아니다.

진탕을 중지하였을 때, 에멀젼은 수중유 에멀젼으로 변화되었다. 에멀젼을 4 시간 이상 동안 5℃ 의 저온실에 두었다. 상기 단계에서, 에멀젼은 오일상을 50% 함유한 예비-에멀젼 (pre-emulsion) 이었다.

제 2 단계 : 면역원 (이하에 기술되는 바와 같은, 비활성화 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 면역원, 또는 PCV-2 면역원) 이 있는 포스페이트 이중나트륨 및 단일칼륨 0.02 M 등장성 완충액 (pH 7.8) 120 ml 로 수성상 #2 를 제조하였다. 제 1 단계에서 제조된 예비-에멀젼을 약 5 ℃ 로 냉각시키고, 동일한 온도에서 1/2 부피의 수성상 #2 를 첨가함으로써 희석한 다음, 1 분 동안 자기 막대를 회전시킴으로써 혼합하였다. TS6 에멀젼 중 최종 계면활성제 농도는 4.75% (w/v) 였다.

본원에서 제조된 바와 같은 TS6 백신은 5℃ 에서 1 년 이상 동안 안정하다.

동일한 제조 방법을 사용하여, 기타 다른 에멀젼을 하기에 기술된 바와 같이 수득할 수 있다 :

TS7 에멀젼

TS7 에멀젼은 오일상 33% 를 함유한 O/W 에멀젼이다. 오일상 (120 ml) 은 Marcol 82® 88% v/v, Span 80® 1.8% w/v 및 Tween 85® 10.2% w/v 를 함유하였다. 수성상 #1 (120 ml) 은 포스페이트 이중나트륨 및 단일칼륨 0.02 M 등장 성 완충액 (pH 7.8) 97.75% v/v, 수중 1% Thiomersal® 1.5% v/v 및 Lutrol F127® 0.75% w/v 를 함유하였다. 수성상 #2 (120 ml) 는, 면역원을 임의 함유한 포스페이트 이중나트륨 및 단일칼륨 0.02 M 등장성 완충액 (pH 7.8) 으로 이루어져 있다. TS7 에멀젼 중 최종 계면활성제 농도는 4.25% w/v 였다.

TS8 에멀젼

TS8 에멀젼은 오일상을 50% 함유한 O/W 에멀젼이다. 오일상 (160 ml) 은 Marcol 82® 92% v/v, Span 85® 1.8% w/v 및 Brij 96® 6.2% w/v 를 함유하였다. 수성상 #1 (160 ml) 은, 면역원을 임의 함유한, 포스페이트 이중나트륨 및 단일칼륨 0.02 M 등장성 완충액 (pH 7.8) 98.5% v/v, 수중 1% Thiomersal® 1.0% v/v 및 Lutrol F127® 0.5% w/v 를 함유하였다. TS8 에멀젼 중 최종 계면활성제 농도는 4.25% w/v 였다.

TS9 에멀젼

TS9 에멀젼은 오일상을 10% 함유한 O/W 에멀젼이다. 오일상 (120 ml) 은 Marcol 82® 60% v/v, Span 40® 17.2% w/v 및 Arlatone 650® 22.8% w/v 를 함유하였다. 수성상 #1 (120 ml) 은 포스페이트 이중나트륨 및 단일칼륨 0.02 M 등장성 완충액 (pH 7.8) 97.5% v/v 및 Tween 20® 2.5% w/v 를 함유하였다. 수성상 #2 는, 면역원을 임의 함유한 포스페이트 이중나트륨 및 단일칼륨 0.02 M 등장성 완충액 (pH 7.8) 400 ml 로 제조하였다. 100 ml 의 예비-에멀젼을 400 ml 의 수성상 #2 로 희석하여 TS9 에멀젼을 수득하였다. TS9 에멀젼 중 최종 계면활성제 농도는 4.25% w/v 였다.

실시예 2 : 에멀젼의 상 전이 온도 (PIT) 측정

10 ml 의 TS6 에멀젼을 온도가 약 25℃ 인 수조 내 유리관에 넣었다. TS6 에멀젼은 백색의 균질 에멀젼이었다. 수조 내 온도를 점진적으로 증가시켰다. 에멀젼 중의 변화를 시각적으로 관찰하였다 (황갈색 오일상의 표면으로의 이동에 기인하여 에멀젼은 2 개의 분리된 상이 되었다). 상기 변화는 에멀젼 붕괴의 특징이다. 상기 변화가 관찰된 온도를 에멀젼의 PIT 값으로 하였다. TS6 에멀젼에 대한 PIT 는 40 내지 45℃ 인 한편, TS7 에멀젼에 대한 PIT 는 44 내지 49℃ 였다.

실시예 3 : 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 백신 조성물 및 이종 시도

재료 및 방법 : 실시예 1 에 기술된 바와 같이 제조된 TS6 에멀젼, 및 백신 ml 당 8.7 log1O CCU (색 변화 단위) 농도의 비활성화 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 BQ14 균주 (Kobisch M. 등, Ann. Inst. Pasteur Immunol., 1987, 138 : 693 - 705) 를 함유한 백신 조성물을 제형하였다. 모성 항체를 가진 (마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 대한 혈청반응이 양성인 암퇘지로부터 태어난), 3 주령의 새끼 돼지 스물두 (22) 마리를 무작위로 2 개의 군에 할당하였다. 열 (10) 마리 새끼 돼지의 일 군은 0 일째에 근육내 주사에 의해 2 ml 의 백신 조성물로 백신접종한 반면, 열두 (12) 마리 새끼 돼지의 대조군은 백신접종하지 않았다.

실험하는 동안 선택된 간격 (0, 27, 42, 및 56 일째) 으로, 두 군의 새끼 돼지로부터 코 분비물을 채취하여, ELISA 로 항-BQ14 분비 항체를 측정하였다. 27 일째에, 새끼 돼지의 혈액을 채취하여 말초 혈액 단핵 세포 (PBMN) 를 수득하 여, 말초 혈액 내 IFNγ 수준을 측정하였다. 28 일째에, 모든 새끼 돼지를, 대략 6.6 log₁₀ CCU/ml 의 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 Mp88c 균주 (덴마크에서 병든 돼지로부터 단리하여, Kobisch 및 Friis 가 Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1996, 15 : 1569 - 1605 에 기재한 바와 같이 배양한 균주) 를 함유한 용액을 각 비강에 대략 5 mL 씩 적용함으로써 비강내 시도하였다. 24 시간 후에 시도를 반복하였다. 돼지를 희생시켜서 검시함으로써 폐를 수거하였다. 7 개의 폐엽 각각에 대해 병변의 표면적 (전체 폐엽 표면에 대한 % 로서 표현됨) 을 추정함으로써 폐 등급을 측정하였다. 등급은 하기와 같이 배당되었다 :

폐엽 당 폐 병변 표면	등급
0%	0
1 내지 25%	1
26 내지 50%	2
51 내지 75%	3
> 75%	4

총 등급은 각 폐의 개별적인 폐엽에 대해 수득된 등급을 더하여 계산하였는데, 이로써 얻어지는 동물 당 최대 등급은 28 이다.

결과: TS6 백신 제형물로 백신접종된 돼지는 강력한 세포성 반응을 나타내었고, 5 × 10⁵ P 말초 혈액 단핵 세포 (PBMN) 로부터 IFNγ 을 분비하는 스팟의 개수로 나타내었을 때, 대조군보다 유의적으로 높은 것이었다. 백신접종된 군의 돼지는 백신접종되지 않은 대조군에서의 평균 11 개의 스팟 (표준 편차 5) 과 비교할 때 평균 139 개의 스팟 (표준 편차 25) 을 나타내었다.

군	5 × 10 ⁵ PBMNC 에 대한 스팟의 수
TS6 백신 조성물	139 (25)
처리되지 않은 대조군	11 (5)

백신접종군 및 대조군에서의 항-BQ14 분비 항체 수준을 하기 표에 요약하였는데, 결과는 처리되지 않은 대조군과 비교할 때, 백신접종된 돼지가 시도 후 2 내지 3 주째에 유의적으로 높은 분비 항체 수준을 가지는 것으로 나타났다.

군	항-BQ14 분비-항체 (광학 밀도 (OD) 값)
군	D0 (백신접종 전)	D27 (시도 시험 전)	D42 (시도 시험 후 14 일째)	D56 (시도 시험 후 28 일째)
TS6	0.026 ± 0.001	0.033 ± 0.002	0.201 ± 0.089	0.264 ± 0.043
대조군	0.030 ± 0.001	0.031 ± 0.001	0.107 ± 0.028	0.075 ± 0.011

이제 도 1 을 참조하자면, TS6 백신 조성물로 백신접종된 동물은, 평균 폐 등급이 7.8 ± 4.1 (평균 ± 표준 편차) 인 처리되지 않은 대조군과 비교할 때, 2.1 ± 1.9 의 평균 폐 등급을 나타내었다. 이들 결과는 백신 조성물로 백신접종된 돼지의 폐 병변이 백신접종되지 않은 대조군과 비교할 때 유의적으로 감소하였음을 나타내는 것이다.

실시예 4 : 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 이종 시도에 대한 방어 지속기간

재료 및 방법 : 모성 항체를 가진 (마이코플라즈마 하이오뉴모니아에 대한 혈청반응이 양성인 암퇘지로부터 태어난), 3 주령의 새끼 돼지 서른여덟 (38) 마리를 하기와 같이 무작위로 3 개의 군에 할당하였다 :

1 군 (12 마리) 은 실시예 3 에 기술된 바와 같이 0 일째에 근육내 경로를 통해 2 ml 의 백신 조성물로 백신접종되었다.

2 군 (12 마리) 은 0 일째에 근육내 주사에 의해 2 ml 의 시판용 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 비활성화 백신으로 백신접종되었다.

3 군 (14 마리) 은 백신접종되지 않은 대조군으로 사용하였다.

모든 새끼 돼지를 백신접종 후 20 주째에, 비강 당 약 5 ml 의 전술된 바와 같은 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 Mp88c 시도 균주 (6.6 log10 CCU/ml) 로 비강내 시도하였다. 24 시간 후에 시도를 반복하였다. 전술된 바와 같이, 모든 군으로부터 혈액을 채취하여 말초 혈액 단핵 세포 (PBMN) 를 수득하여, IFNγ 수준을 측정하였다. 138 일째에 각 군에 대해서 항-BQ14 IgA 및 IgG1 혈청 항체를 측정하였다. 검시 후, 상기의 실시예 3 에 기술된 바와 같이 폐 등급 (평균 ± 표준 편차) 을 계산하였다.

결과: 이제 도 2 를 참조하자면, TS6 백신 조성물로 백신접종된 1 군으로부터의 새끼 돼지는, 시판용 백신으로 백신접종된 새끼 돼지의 폐 등급 (4.0 ± 5.1) 또는 백신접종된지 않은 대조군의 폐 등급 (6.1 ± 5.8) 보다 통계상 유의적으로 감소된 0.4 ± 0.9 의 평균 폐 등급을 나타내었다.

138 일째에 각 군으로부터 수집된 혈청 내 항-BQ14 IgA 및 IgG1 순환 항체의 평균 결과 (± 표준 편차) 를 하기와 같이 요약하였다 :

군	항-BQ14 IgG (역가)	항-BQ14 IgA
TS6 백신	4.38 ± 0.14	0.56 ± 0.06
시판용 백신	3.09 ± 0.11	0.09 ± 0.01
대조군	2.73 ± 0.08	0.09 ± 0.01

하기 표는 말초 혈액 내 5 × 10⁵ 말초 혈액 단핵 세포 (PBMN) 분비 감마-인터페론 (IFNγ) 에 대한 스팟 수에서의 평균 결과 (± 표준 편차) 를 요약한 것이다 :

군	D28	D138	D152
TS6 백신	81 ± 20	9 ± 2	28 ± 7
시판용 백신	5 ± 2	3 ± 1	6 ± 1
대조군	6 ± 3	2 ± 2	11 ± 8^*
^* 비정상적으로 높은 스팟 수 (109) 를 나타내는 새끼 돼지를 배제한 경우, 대조군의 평균은 4 ± 1 임.

비활성 백신 사용 시에 예상되는 바와 같이, 백신접종 후 138 일째에 검출가능한 항-BQ14 IFNγ 분비 T-세포의 빈도는 28 일째보다 훨씬 낮았다. 흥미롭게도, TS6 로 백신접종된 대부분의 돼지는 138 일째에도 여전히 양성이었는데, 이는 상기 군에서 세포성 반응이 유지됨을 시사하는 것이다. 152 일째 (시도 후 13 일째) 에 순환하는 항-BQ14 IFNγ 분비 T-세포의 빈도는 3 개의 군 사이에서 매우 상이하였다. TS6 로 백신접종된 군은 다른 군들과는 반대로 매우 높은 세포성 반응을 발달시켰다. 상기 결과는, 시도가 TS6 백신에 의해 유도된 면역 기억을 효과적으로 상기시킴을 시사하는 것이다.

실시예 5 : TS6 에멀젼으로 보조된 단일 투여량의 PCV-2 백신 투여 후의 혈청반응 결과

재료 및 방법 : 2 내지 3 개월령 열 마리의 특정 병원균-부재 (SPF) 새끼 돼지를 무작위로 2 개의 군에 할당하였다. 5 마리 새끼 돼지의 일 군은 투여량 당 6.8 log10 CCID₅₀ 의 비활성 PCV-2 (imp 1010 균주) 를 함유한 백신 2 ml 로 근육내 경로를 통해 (0 일째에) 백신접종되었다 (백신접종군). 5 마리 새끼 돼지의 대조군은 백신접종되지 않았다. ELISA 에 의한 PCV-2 ORF2 항체의 적정을 위해, 백신접종 후 D0, D7, D14, D21 및 D28 에 혈액 샘플을 채취하였다.

결과 : 하기 표에 나타낸 바와 같이, 모든 백신접종군은 백신접종 후 7 일부터 40 일까지 유의적인 항-PCV-2 ORF2 항체 반응을 나타내었다:

군	ELISA (log10)	DO	D7	D14	D21	D28
백신접종군	평균 표준 편차	1.00 0.00	2.53 0.89	3.50 0.79	3.45 0.84	3.88 0.37
대조군	평균 표준 편차	1.00 0.00	1.00 0.00	1.00 0.00	1.00 0.00	1.27 1.24

실시예 6 : TS6 에멀젼으로 보조된 PCV-2 백신에 의해 유도된, 시도에 대한 방어

재료 및 방법 : 4 내지 5 일령 열여섯 (16) 마리의 SPF 새끼 돼지를 하기와 같이 무작위로 2 개의 군에 할당하였다 : 8 마리 새끼 돼지의 일 군은 투여량 당 7.55 log10 CCID₅₀ 의 비활성 PCV-2 (imp 1010 균주) 를 함유한 백신 2 ml 로 근육내 주사에 의해 0 및 21 일째에 2 회 백신접종된 반면 (백신접종군), 8 마리 새끼 돼지의 대조군은 백신접종되지 않았다. 모든 새끼 돼지를 35 일 째에, ml 당 약 5.5 log10 CCID₅₀ 으로 함유된 PCV-2 Imp 1011-48285 균주 (ECACC 에, 수탁 번호 V98011608 로 기탁된 것) 를 각 비강에 대략 5 mL 씩 적용함으로써 비강내 시도하였다. ELISA 및 혈청중화 (SN) 연구 둘 다를 수행하여 각 새끼 돼지에 대한 임상학적 등급을 하기와 같이 측정하였다 :

등급	0	1	2
피로	없음	중간	심각
호흡곤란	없음	중간	심각
빈혈 (새끼 돼지의 피부색)	분홍색	백색	황색
기침	없음	있음
식욕감퇴	없음	있음
구토	없음	있음
직장 온도	t < 40 ℃	39.9 ℃ < t < 41 ℃	t > 40.9 ℃
n 주 동안의 체중 증가량이 n-1 주 동안의 체중 증가량보다 많음	그렇다	그렇지는 않지만 > 100 g/일	그렇지는 않지만 < 101 g/일
사망	사망하지 않음	사망함^*
^* 사망한 경우에, 사용된 등급은 사망하기 이전의 날에 대한 값임.

검시 후, 하기와 같이 병변 등급을 계산하였다 :

등급	0	1	2	3
비만도	정상	야위었음	매우 야위었음	구루병
시체의 외관	정상	백색	황색
점막	정상	백색	황색
피하 연결 조직	정상	밝음	황색
표피 임파절	정상	1 비대 및/또는 백색 및/또는 충혈	> 1 비대 및/또는 백색 및/또는 충혈	> 1 매우 비대 및/또는 백색 및/또는 충혈
흉부 객담	없음	밝은 흉강	가시적인 실재
심장	병변 없음	병변
폐	병변 없음	병변
늑막	병변 없음	작은 병변	큰 병변
종격 임파절	정상	1 비대 및/또는 백색 및/또는 충혈	> 1 비대 및/또는 백색 및/또는 충혈	> 1 매우 비대 및/또는 백색 및/또는 충혈
복강	정상	밝음	가시적인 복수액
복막	병변 없음	병변
위	병변 없음	병변	궤양
소장	병변 없음	병변
장	병변 없음	병변
장간 림프 신경절	정상	1 비만 및/또는 백색 및/또는 충혈	>1 비만 및/또는 백색 및/또는 충혈	>1 매우 비만 및/또는 백색 및/또는 충혈
페이어(peyer) 플라크	보이지 않음	오직 하나의 장 분절에서만 보임	여러 장 분절에서 보임	여러 장 분절에서 보이고 매우 중요함
간	병변 없음	병변
신장	병변 없음	병변
방광	병변 없음	병변

결과 : 30 일째 및 63 일째에 ELISA 및 혈청 중화 항체 적정 농도에 의해 수행된 혈청학의 결과는, 처리되지 않은 대조군에서 나타나는 새끼돼지보다 더 높은 수준을 갖는 백신접종된 새끼돼지를 나타내었다. 하기 표는 배설물 스웝 (swab) 및 신경절 조직으로부터의 PCV-2 바이러스 단리 결과를 요약할 뿐 아니라, 백신접종군 및 대조군으로부터의 평균 임상 등급 및 병변 등급을 나타낸다. 결과는 대조군과 비교하여, 백신접종군에서 순환 항체 및 SN 적정 농도 둘 다 높은 수준을 나타내었다. 임상 등급 및 폐 병변 또한 백신접종된 새끼돼지에서 현저히 감소하였다. 시도 후의 임상 등급의 평가를 도 3 에 제시하였다.

군	백신접종군	대조군
D30 (log10) 에서의 혈청학 ELISA	4.1 ± 0.70	2.8 ± 0.50
D63 (log10) 에서의 혈청학 ELISA	5.2 ± 0.28	3.4 ± 0.67
D30 (log10) 에서의 혈청학 SN	3.4 ± 0.25	1.6 ± 0.23
D63 (log10) 에서의 혈청학 SN	3.7 ± 0.31	2.2 ± 0.53
배설물 내의 PCV-2 (양성 %)	40	61
종격 신경절 내의 PCV-2 (양성 %)	25	100
임상 등급	14	31
병변 등급	9.8	18.8

실시예 7 : TS6-보조된 비활성화 PCV-2 백신으로 1 회 투여량 백신접종 후의 필드 효율 결과

백신 조성물 : TS6 보조제를 실시예 1 에서 기술된 바와 같이 제조하였다. PCV-2 바이러스를 PK/15 세포 상에서 키우고, US 특허 일련 번호 제 6,517,843 호 (Ellis 등; 그의 내용이 본원에 그 전문으로 인용됨) 에서 기술된 바와 같이 바이러스 증식을 수행하였다. 간단하게, 바이러스 배양 마지막에, 감염된 세포를 수확하고, 파쇄하고, 바이러스 수확물을 통상적인 방법으로 비활성화하였다. 예를 들어, 비활성화는 +37℃ 에서 18 시간 동안 0.1% 에틸렌이민으로; +28℃ 에서 24 시간 동안 0.5% 베타-프로피오락톤으로 ; 또는 +4℃ 에서 24 시간 동안 0.2% 및 0.1% 베타-프로피오락톤으로 수행될 수 있다. 비활성화 전의 바이러스 적정 농도가 부적절할 경우, 바이러스 현탁액을 150 - 300 kDa 컷-오프 (cut-off) 의 막을 사용하여 초여과 (ultrafiltration) 하여 농축시켰다. 비활성화된 바이러스 현탁액을 백신을 제형하기 전에 +5℃ 에 저장하였다. 백신의 항원 함량을 투여량 당 2.1 log 10 항원 단위로 조절하였다. 상기 함량을 기재로, ELISA 방법에 의해 최종 생성물 중의 활성 성분의 정량화를 통해 측정된 백신의 활성을 투여량 당 최소 100 ELISA 단위로 독자적으로 조절하였다.

백신접종 프로토콜 : 필드 조건 하에서 백신 조성물의 효율을 시험하기 위해, 새끼돼지에서 PCV-2 감염에 의해 야기되는 이유후 다발계통 소모 증후군 (PMWS) 의 풍토병의 발병을 전형적으로 나타내는 농장을 선택하였다. 새끼를 낳기 2 내지 3 주 전에, 암퇘지를 TS6 보조된 PCV-2 비활성화 백신을 1 회 근육내 주사 (2 ml 투여량) 하여 백신접종하는 2 군으로 나누었다. 2 번째 군은 백신접종되지 않고, 대조군으로 사용되었다. 암퇘지가 새끼를 낳게 하고, 백신접종된 암퇘지 (n = 889) 및 대조군 암퇘지 (n = 713) 로부터의 새끼돼지를 도살 연령까지 사망률을 모니터링하였다.

결과 : 도 4 는 도살 시간까지 새끼돼지에서의 PMWS 경우의 백분율을 묘사하는 그래프를 나타낸다. 그래프에서 볼 수 있는 바와 같이, 비백신접종된 대조군으로부터의 새끼돼지의 경우의 수와 비교하여, 백신접종된 암퇘지에서 태어난 새끼돼지에서의 PMWS 의 경우의 수가 75% 감소되었다. 상기 결과는 PCV-2 감염과 연관된 임상 질환에서 확연한 감소를 나타내고, 분만 직전 TS6 보조된 비활성화 PCV2 백신으로 백신접종된 암퇘지의, 새끼돼지에서의 사망률 및 PCV2 감염과 연관된 사망의 예방 가능성을 나타낸다. 상기 결과는 추가로 본 발명에 따른 백신 조성물의 단지 1 회 투여량을 사용하여 실제 필드 조건에서 새끼돼지 중에서 PMWS 의 확연한 감소를 달성할 수 있다는 것을 논증한다.

실시예 8 : LF2 에멀젼

상기 실시예 1 에서 기술된 방법을 사용하여, 10% 오일상 에멀젼을 함유하고, LF2 라고 지정된 수중유 (O/W) 에멀젼을 제조하였다. 오일상 (100 ml) 은 Marcol 82^® 88% v/v, Span 80^® 1.8% w/v 및 Tween 85^® 10.2% w/v 를 함유하였다. 수성상 #1 (100 ml) 은 포스페이트 이중나트륨 및 단일칼륨 0.02M 등장성 완충액 (pH 7.8) 88.5% v/v 및 Tween 80^® 11.5% w/v 의 20% (w/v) 용액을 함유하였다. 수성상 #2 (400 ml) 는 면역원을 임의 함유하는 포스페이트 이중나트륨 및 단일칼륨 0.02M 등장성 완충액 (pH 7.8) 으로 구성되었다. 100 ml 의 예비-에멀젼을 400 ml 의 수성상 #2 로 희석하여 LF2 에멀젼을 수득하였다. LF2 에멀젼 중의 최종 계면활성제 농도는 1.43% w/v 이었다. LF2 에멀젼의 PIT 는 전도성에 의해 측정된 바와 같이 > 45℃ 였다.

실시예 9 : LF2 에멀젼으로 보조된 돼지 인플루엔자 백신의 투여 후 혈청학 분석

재료 및 방법 : 약 10 주령의 새끼돼지 15 마리 (15) 를 무작위로 3 개의 군으로 할당하였다. 1 군 (백신접종됨) 은 투여량 당 7.7 log10 CCID₅₀ 의 재조합 돼지 인플루엔자 백신 2 ml 로 근육내 주사에 의해 2 번 (0 일 및 28 일째에) 백신접종된 5 마리의 새끼돼지를 갖는다. 상기 재조합 발현 벡터 백신은 H1N1 돼지 플루 바이러스의 핵단백질 (NP) 및 헤마글루티닌 (HA) 을 인코딩하고, 발현하는 카나리폭스 (canarypox) 벡터를 함유하였다. 2 군의 5 마리 새끼돼지를, LF2 에멀젼 (LF2 백신접종된 군) 으로 보조된 2 ml 의 재조합 돼지 인플루엔자 백신 (투여량 당 7.7 log10 CCID₅₀ 에서) 으로 2 번 (0 일 및 28 일째에 근육내 주사에 의해서) 백신접종하였다. 5 마리의 새끼돼지를 비백신접종된 채로 남겨두었다 (대 조군). 혈액 샘플을 헤마글루티닌화 억제 (HI) 적정 농도를 측정하기 위해 백신접종 후, D0, D14, D28, D42 및 D56 에 거두었다.

결과 : 하기 표에서 요약된 바와 같이, 모든 백신접종을 미처리된 대조군과 비교해서, 백신접종 후 42 내지 56 일에 확연한 항-돼지 플루 항체 반응을 나타내었다 (ANOVA, p<0.0001). 그러나, LF2 보조된 백신으로 백신접종된 돼지는 비보조된 재조합 백신을 받은 돼지와 비교하여, 백신-후 42 내지 56 일에 확연한 항체 반응의 증가를 나타내었다 (ANOVA, p<0.0001).

군	HI (log10)	D0	D14	D28	D42	D56
백신접종됨	평균 표준 편차	0.9 0.00	0.9 0.00	0.9 0.00	1.2 0.37	1.2 0.21
LF2 백신접종됨	평균 표준 편차	0.9 0.00	0.9 0.00	0.9 0.00	2.04 0.33	1.92 0.16
대조군	평균 표준 편차	0.9 0.00	0.9 0.00	0.9 0.00	0.9 0.00	0.9 0.00

상기 결과에 의해 논증되는 바와 같이, LF2 에멀젼의 보조 효과는 백신이 비-보조된 백신과 비교해서, 돼지 플루 바이러스에 대해 더 높은 항체 반응을 유도하도록 한다.

실시예 10 : LF2 에멀젼으로 보조된 만헤이미아 헤몰리티카 ( Mannheimia haemolytica ) 백신에 의해 유도되는 방어

재료 및 방법 : 음성 또는 낮은 만헤이미아 헤몰리티카 류코톡신 (leucotoxin) 항체 적정 농도인 20 마리의 (20) 5 개월령의 송아지 (calf) 를, 무작위로 각각 10 마리의 송아지씩 2 개 군으로 할당하였다. LF2 에멀젼을 상기 실시예 8 에서 기술된 바와 같이 제조하였고, 백신을 백신 투여량 당 약 60 내지 70 ELISA 단위 (약 0.34 mL 내지 1.1 mL 의 조 (crude) 비-농축 박테리아 배양물에 상응함) 로 비활성된 만헤이미아 헤몰리티카 (A1 균주) 를 함유하여 제형화하고, LF2 에멀젼으로 보조시켰다. 10 마리 송아지의 대조군은 백신접종되지 않은 반면, 10 마리 송아지의 1 개 군은 0 일째에 2 ml 의 LF2 백신 조성물을 피하 주사하여 백신접종되었다. 백신접종 일 (DO) 로부터 시도일 (D20) 까지, 모든 백신접종된 송아지를 백신접종에 대한 일반적이고 국소적인 반응에 대해 정기적으로 검사하였다. 임상 검사는 전신 반응 (예컨대 무감동, 식욕 감퇴, 다호흡, 타액분비, 떨림), 직장 온도 기록, 및 주사 위치에서의 국소 반응의 측정의 평가를 포함하였다. 송아지 중 어떤 것도 백신에 대해 임의의 전신 반응을 나타내지 않았다. 직장 온도 (℃, 평균 ± 표준 편차) 를 하기 표에 요약하였고, 백신접종된 군에서 백신접종 후 24 시간 내에 피크를 가진 일시적이고 약간의 이상 고열 양상을 관찰하였다.

	D0	D0+4h	D1	D2	D3	D7	D14	D20
백신접종군	39.3 ± 0.3	39.6 ± 0.4	39.5 ± 0.3	39.2 ± 0.3	39.0 ± 0.2	39.0 ± 0.2	39.1 ± 0.3	38.7 ± 0.3
대조군	39.3 ± 0.2	39.3 ± 0.2	39.1 ± 0.2	39.1 ± 0.2	38.9 ± 0.2	39.0 ± 0.2	38.9 ± 0.1	38.7 ± 0.3

백신접종된 송아지에서의 국소 반응 (표면 면적, cm² 로 측정됨, 평균 ± 표준 편차) 은 모든 백신접종된 동물에서 백신접종 후, 약 24 내지 48 시간에 강한 국소 반응이 나타난 다음, D14 까지 약 3 cm² 의 크기로 감소되는 것을 나타내었다. 상기 반응은 D20 까지 대부분 사라졌다. 반응을 하기 표에 요약하였다 :

	D0	D0+4h	D1	D2	D3	D7	D14	D20
백신접종군	0.9 ± 0.4	9.2 ± 12.4	71.3 ± 25.8	72.5 ± 29.3	56.9 ± 18.0	15.9 ± 8.0	2.6 ± 2.6	2.0 ± 1.2

혈액 샘플을 다양한 간격 (D0, D7, D14, D20 및 D28) 으로 모든 동물로부터 수득하고, 만헤이미아 헤몰리티카 A1 류코톡신에 대한 항체 수준을 ELISA (log10 OD₅₀ 에서 적정 농도) 에 의해 수행하였다. 결과는 모든 송아지가 백신접종 전에 음성이라는 것을 나타내었다. D20 까지, 단독 백신접종 후에, 모든 대조군 송아지는 DO 내지 D20 까지 음성으로 남아 있는 반면, 10 마리의 백신접종체 중 8 마리는 혈청반응(sero)-전환되었다. ELISA 결과를 하기와 같이 요약하였다 :

군	ELISA (log10)	DO	D7	D14	D21	D28
백신접종군	평균 표준 편차	< 0.78 0.00	1.11 0.65	1.70 0.90	1.86 0.84	4.00 0.26
대조군	평균 표준 편차	< 0.78 0.00	< 0.78 0.00	< 0.78 0.00	< 0.78 0.00	1.39 1.00

시도 프로토콜 : 모든 송아지를 20 일째에 약 9.2 log 10 CFU/ml (㎖ 당 콜로니 형성 단위) 의 만헤이미아 헤몰리티카 A1 균주를 함유하는 30 ml 의 시도액을 기관내 투여에 의해 시도하였다. 시도를 24 시간 후에 반복하였다. 시도한 날로부터 실험 마지막 날까지, 호흡 곤란을 포함하여 일반적인 임상 징후에 대해 모든 송아지를 매일 검사하였다. 모니터링된 징후는 일반적 상태, 식욕 감퇴, 직장 온도, 코의 배출물, 기침, 호흡률 및 호흡 곤란을 포함하였다. 광범위한 임상 등급은 하기 식에 따라 계산되고, 부분 등급은 하기 표에 제공되었다 :

광범위한 임상 등급 = ∑(부분적인 등급 × 계수) /14

	0	1	2	계수
일반적인 상태	정상	기능 저하	쇠약	×2
음식	정상	감소	식욕 감퇴	×3
기침	없음	심함, 간헐	약함, 자주	×1
코의 배출물	없음	심함	점액성	×2
호흡률	< 35/분	35 - 50/분	> 50/분	×3
직장 온도	< 39.5℃	39.5℃- 40.5℃	> 40.5℃	×3

죽은 동물의 경우, 최대 개별 일일 임상 등급 2 를 적용하였다

폐 병변 등급 (백분율로 표현됨) 을 또한 하기 식을 사용하여 각 송아지에 대해 측정하였다 :

폐 병변 등급 = ∑(엽 상의 병변의 표면/전체 엽의 표면 × 100 × LRM)

(식 중, LRM 은 폐 상대 질량이고, 하기 값을 가짐 :

우전엽 및 우중전엽에 대해 0.11

우중후엽에 대해 0.07

우후엽에 대해 0.35

좌전엽에 대해 0.05

좌중엽에 대해 0.06

좌후엽에 대해 0.32, 및

기 (azygos) 엽에 대해 0.04).

시도의 결과 : 하기 표에서 제시되는 각 군에 대한 광범위한 임상 등급은, 백신접종된 군이 처리되지 않은 대조군과 비교하여 광범위한 임상 등급에서 확연한 감소를 나타냄을 것을 보여주었다 (p=0.046, ANOVA).

		D20	D21	D22	D23	D24	D25	D26	D27	누적 등급
백신접종됨	평균	0.0	0.7	0.7	0.6	0.6	0.5	0.5	0.5	4.0
백신접종됨	표준편차	0.1	0.4	0.5	0.6	0.8	0.8	0.8	0.8	4.5
대조군	평균	0.1	0.9	1.1	1.0	1.1	1.2	1.2	1.3	8.0
대조군	표준편차	0.1	0.5	0.6	0.8	0.9	0.8	0.8	0.7	4.5

시도로 죽은 모든 동물들은 그들의 폐의 60% 이상이 영향을 받았다는 것을 제시하였다. 대조군의 것에 비해 백신접종된 동물이 폐 병변이 더 낮다는 통계적 경향 (p=0.08) 이 있었다. 그들의 폐의 3 분의 1 초과가 영향을 받은 군 당 동물의 수는, 백신접종체에서 2/10 (20%) 및 대조 동물에서 7/10 (70%) 이었다. 그들의 폐의 3 분의 1 초과가 영향을 받은 동물의 수는, 백신접종된 군에서 확연히더 낮았다 (p=0.03, Fischer's Exact Test, one-tailed). 폐 병변 등급의 결과를 하기 표에 요약하였다 :

백신접종체에서 폐 병변의 개별 백분율	74.8*	대조군에서 폐 병변의 개별 백분율	64.5*
	10.6		7.0
	10.1		78.6*
	10.5		63.1*
	66.4*		44.7
	6.2		60.9
	6.9		48.2
	32.9		0.8
	25.4		59.5*
	8.0		32.9
평균 ± 표준 편차	25.2 ± 25.5	평균 ± 표준 편차	46.0 ± 25.5
* 시도로 죽은 동물들

광범위한 임상 등급 및 폐 병변의 백분율 사이에 매우 뚜렷하고 (p<0.001) 강한 상관관계 (R²=0.86) 가 있었다. 모든 백신접종된 동물이 백신접종 후 약한 이상 고열을 나타내었다 하더라도, 백신접종에 대한 기타 일반적인 반응은 관찰되지 않았다. 백신접종 후 강한 국지 반응이 관찰되었으나, 매우 허용가능한 크기로 재빨리 감소되었고, 검시에서 확연한 병변이 관찰되었다. 상기 결과는 LF2 에멀젼으로 보조된 백신의 안정성을 나타내었다.

평균 임상 등급 및 폐 병변 등급 모두를 나타내는 본 실험의 결과는 대조군과 비교하여 백신접종체에서 확연하게 감소되었고, LF2 에멀젼으로 보조된 만헤이미아 헤몰리티카 백신의 일시 주사가 만헤이미아 헤몰리티카 시도에 대해 투여하지 않은 송아지를 방어함을 나타내었다.

따라서, 본 발명의 바람직한 구현예를 상세하게 기술하는 것은, 상기 단락에 의해 정의된 본 발명이 상기 명세서에 언급된 특정 사항에 제한되는 것이 아니라, 본 발명의 취지 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 그의 많은 명백한 변형이 가능하다는 것으로 이해되어야 한다.

Claims

하기를 포함하는 주사가능한 수중유 (O/W) 에멀젼을 포함하는 백신 조성물 :

(ⅰ) 하나 이상의 면역원을 함유하는 수용액 ;

(ⅱ) 광유 ;

(ⅲ) 비-이온성 친지성 계면활성제 ;

(ⅳ) 13 초과 40 미만의 높은 친수성-친지성 밸런스 (hydrophilic-lipophilic balance, HLB) 값을 갖는 비-이온성 친수성 계면활성제 ; 및

(v) 9 내지 13 의 낮은 친수성-친지성 밸런스 (HLB) 값을 갖는 비-이온성 친수성 계면활성제.
제 1 항에 있어서, 에멀젼의 부피를 기준으로, 높은 HLB 값을 갖는 비-이온성 친수성 계면활성제의 중량 % 농도가 0.1 내지 1.5% (w/v)인 조성물.
제 2 항에 있어서, 비-이온성 친지성 계면활성제, 높은 HLB 값을 갖는 비-이온성 친수성 계면활성제 및 낮은 HLB 값을 갖는 비-이온성 친수성 계면활성제의 총 백분율이 4% 내지 6% (w/v)인 조성물.
제 1 항에 있어서, 에멀젼의 부피를 기준으로, 낮은 HLB 값을 갖는 비-이온성 친수성 계면활성제의 중량 % 농도가 1 내지 8% (w/v)인 조성물.
제 1 항에 있어서, 에멀젼의 부피를 기준으로, 비-이온성 친지성 계면활성제의 중량 % 농도가 0.1 내지 2.5% (w/v)인 조성물.
제 1 항에 있어서, 에멀젼의 부피를 기준으로, 광유는 20% 내지 40% (v/v) 의 농도로 존재하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 에멀젼은 33 내지 66℃ 의 상 전이 온도 (PIT) 를 갖는 조성물.
제 1 항에 있어서, 낮은 HLB 값을 갖는 비-이온성 친수성 계면활성제는 소르비탄의 에톡실화 지방산 트리에스테르, 소르비탄의 에톡실화 지방산 디에스테르, 소르비탄의 에톡실화 지방산 모노에스테르, 에톡실화 지방 알콜, 에톡실화 지방산, 에톡실화 캐스터 오일 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제 8 항에 있어서, 소르비탄의 에톡실화 지방산 트리에스테르, 소르비탄의 에톡실화 지방산 디에스테르 또는 소르비탄의 에톡실화 지방산 모노에스테르의 에스테르는 올레에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 이소스테아레이트, 라우레이트 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제 1 항에 있어서, 비-이온성 친지성 계면활성제는 소르비탄의 지방산 에스테르, 만니드의 지방산 에스테르, 만니드의 디에톡실화 지방산 에스테르, 만니드의 트리에톡실화 지방산 에스테르, 만니드의 테트라에톡실화 지방산 에스테르 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제 10 항에 있어서, 소르비탄의 지방산 에스테르, 만니드의 지방산 에스테르, 만니드의 디에톡실화 지방산 에스테르, 만니드의 트리에톡실화 지방산 에스테르 또는 만니드의 테트라에톡실화 지방산 에스테르의 에스테르는 올레에이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 이소스테아레이트, 라우레이트 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제 1 항에 있어서, 높은 HLB 값을 갖는 비-이온성 친수성 계면활성제는 소르비탄의 에톡실화 지방산 모노에스테르, 에톡실화 지방 알콜, 에톡실화 지방산, 비-이온성 블록-공중합체, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제 12 항에 있어서, 소르비탄의 에톡실화 지방산 모노에스테르는 에톡실화 소르비탄 모노라우레이트, 에톡실화 소르비탄 모노팔미테이트, 에톡실화 소르비탄 모노스테아레이트, 에톡실화 소르비탄 모노올레에이트, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제 1 항에 있어서, 광유는 파라핀 오일, 스쿠알렌, 프리스탄 (pristane), 폴리이소부텐 오일, 수소화된 폴리이소부텐 오일, 폴리데센 오일, 폴리이소프렌 오일, 폴리이소프로펜 오일, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제 1 항에 있어서, 하나 이상의 면역원을 함유하는 수용액, 파라핀 오일, 비-이온성 친지성 계면활성제로서 소르비탄 지방산 모노에스테르, 낮은 HLB 값을 갖는 비-이온성 친수성 계면활성제로서 소르비탄의 에톡실화 지방산 트리에스테르 및 높은 HLB 값을 갖는 비-이온성 친수성 계면활성제로서 비-이온성 블록-공중합체를 포함하는 조성물.
제 15 항에 있어서, 소르비탄 지방산 모노에스테르는 소르비탄 모노올레에이트이고, 소르비탄의 에톡실화 지방산 트리에스테르는 소르비탄의 에톡실화 트리올레에이트이고, 비-이온성 블록-공중합체는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 중합체 (POE-POP) 인 조성물.
제 16 항에 있어서, 에멀젼의 부피를 기준으로, 파라핀 오일은 10% 내지 40% v/v 의 농도로 존재하고, 소르비탄 모노올레에이트는 0.2% 내지 1.5% w/v 의 농도로 존재하고, 소르비탄의 에톡실화 트리올레에이트는 2% 내지 5% w/v 의 농도로 존재하고, POE-POP 는 0.1% 내지 0.5% w/v 의 농도로 존재하는 조성물.
제 16 항에 있어서, 에멀젼의 부피를 기준으로, 파라핀 오일은 29.3% v/v 의 농도로 존재하고, 소르비탄 모노올레에이트는 0.6% w/v 의 농도로 존재하고, 소르비탄의 에톡실화 트리올레에이트는 3.4% w/v 의 농도로 존재하고, POE-POP 는 0.25% w/v 의 농도로 존재하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 면역원은 불활성화된 병원체, 약화된 병원체, 면역원성 하위단위, 재조합 발현 벡터, 및 플라스미드 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제 19 항에 있어서, 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물 기생충 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제 19 항에 있어서, 면역원은 불활성화된 바이러스인 조성물.
제 21 항에 있어서, 면역원은 불활성화된 돼지 써코바이러스 유형 2 (inactivated porcine circovirus type 2, PCV-2) 바이러스인 조성물.
제 19 항에 있어서, 면역원은 불활성화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 박테리아 (Mycoplasma hyopneumoniae bacterium) 인 조성물.
제 19 항에 있어서, 동물에서 병원체에 대한 면역 반응 유도용 백신으로서 사용되는 조성물.
제 19 항에 있어서, 동물에서 병원체에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조용 조성물.
제 24 항 또는 제 25 항에 있어서, 면역원은 불활성화된 마이코플라즈마 하이오뉴모니아 박테리아 (Mycoplasma hyopneumoniae bacterium), 불활성화된 돼지 써코바이러스 유형 2 (inactivated porcine circovirus type 2, PCV-2) 바이러스 또는 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 조성물.
제 25 항에 있어서, 백신 조성물은 일회 처방으로서 투여되는 조성물.
제 25 항 또는 제 27 항에 있어서, 동물은 소, 돼지, 말, 개, 고양이, 닭, 오리 및 칠면조로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
제 25 항 또는 제 27 항에 있어서, 투여는 근육내 (intramuscular, IM), 피내 (intradermal, ID) 또는 피하 (subcutaneous, SC) 주사인 조성물.
제 25 항 또는 제 27 항에 있어서, 투여는 바늘 없는 주사기로 행해지는 조성물.
제 24 항, 제 25 항 또는 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원은 돼지 인플루엔자 바이러스 또는 불활성화된 만헤이미아 헤몰리티카 (Mannheimia haemolytica) 로 이루어진 군으로부터 선택된 조성물.
첫 바이알에 면역원, 및 두번째 바이알에 에멀전을 포함하는 키트로서, 상기 에멀전은 하기를 포함하는 키트:

(ⅰ) 광유 ;

(ⅱ) 비-이온성 친지성 계면활성제 ;

(ⅲ) 13 초과 40 미만의 높은 친수성-친지성 밸런스 (hydrophilic-lipophilic balance, HLB) 값을 갖는 비-이온성 친수성 계면활성제 ; 및

(ⅳ) 9 내지 13 의 낮은 친수성-친지성 밸런스 (HLB) 값을 갖는 비-이온성 친수성 계면활성제.
제 32 항에 있어서, 상기 면역원은 동결건조된 형태 또는 수성 매질 중 용액 내에 있는 키트.
하나 이상의 면역원 및 에멀젼을 포함하는 백신 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 에멀전은 하기를 포함하고:

(ⅰ) 광유 ;

(ⅱ) 비-이온성 친지성 계면활성제 ;

(ⅲ) 13 초과 40 미만의 높은 친수성-친지성 밸런스 (hydrophilic-lipophilic balance, HLB) 값을 갖는 비-이온성 친수성 계면활성제 ; 및

(ⅳ) 9 내지 13 의 낮은 친수성-친지성 밸런스 (HLB) 값을 갖는 비-이온성 친수성 계면활성제,

상기 하나 이상의 면역원이 에멀젼의 형성 중에 혼입되거나, 또는 에멀젼에 첨가되는 방법.