KR101292874B1

KR101292874B1 - 신규 백신 제형물

Info

Publication number: KR101292874B1
Application number: KR1020077026615A
Authority: KR
Inventors: 알렉시스 기 앙드레 파리소; 스테파니 마리-까뜨린 데스굴레-블레셰; 까뜨린 샤레이르; 끌로드 쟝 마리 룰레
Original assignee: 메리얼 리미티드
Priority date: 2005-04-15
Filing date: 2006-04-13
Publication date: 2013-08-05
Also published as: DK1888107T3; CY1113104T1; AU2010206041A1; CN101184501A; BRPI0610633A2; CA2604432A1; PL1888107T3; US7691368B2; AU2006236711B2; IL186600A; JP5093902B2; EP1888107A2; AU2006236711A1; JP2008536860A; MY144189A; AU2010206041B2; SI1888107T1; WO2006113373A3; US20060233831A1; BRPI0610633B1

Abstract

본 발명은 수중유 (oil-in-water) 에멀션, 보조제로서의 이의 용도, 및 이를 포함할 수 있는 약학적, 면역학적 또는 백신 조성물에 관한 것이다. 한 구현예에서, 수중유 (O/W) 에멀션은 면역원을 함유한 수용액, 광물성 오일, 비이온성 친유성 에톡시화 지방 알코올 및 비이온성 친수성 계면활성제를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 수중유 (O/W) 에멀션은 면역원을 함유한 수용액, 비이온성 친유성 계면활성제, 광물성 오일 및 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 보조제를 사용하여 백신 조성물을 제조하는 방법, 이와 같이 수득된 백신 조성물 및 사용 방법을 포함한다.

Description

신규 백신 제형물 {NOVEL VACCINE FORMULATIONS}

관련된 출원

본 출원은 2005년 4월 15일에 출원된 미국 출원 일련번호 11/107,000에 대해 우선권을 주장하고, 이의 내용은 참고로서 본원에 명백하게 포함된다.

참고로서 포함

본원에서 또는 본원에 참고로서 포함된 임의의 문헌에서 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조자 지시, 설명, 제품 명세서 및 제품 시트와 함께, 상기 출원, 및 거기에 또는 이의 실행 도중에 인용된 모든 문헌 ("출원 인용된 문헌"), 및 상기 출원 인용된 문헌에 인용되거나 참고된 모든 문헌, 및 본원에 인용되거나 참고된 모든 문헌 ("본원에 인용된 문헌"), 및 본원에 인용된 문헌에서 인용되거나 참고된 모든 문헌은 본원에 참고로서 포함되고, 본 발명의 실행에 사용될 수 있다.

본 발명은 수중유 (oil-in-water) 에멀션, 보조제로서 이의 용도, 및 이를 포함한 약학적, 면역학적 또는 백신 조성물에 관한 것이다.

백신에서 보조제의 용도는 잘 알려져 있다. 보조제는, 백신 면역원과 결합되는 경우, 백신 면역원에 대한 면역 반응을 증가시키는 화합물이다. 단백 질, 당단백질 또는 펩티드의 면역원성을 증진시키는 전략 중에 백신 면역원을 에멀션화시키는 것이 있다 ([Nossal 1999, Fundamental Immunology. Paul (Ed.), Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, Pa.]; [Vogel 및 Powell, 1995, Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach. Powell 및 Newman (Eds.), Plenum Press, NY, N.Y. p.141]). 백신 면역원의 면역원성을 개선하는데 있어서의 보조제의 중요한 역할로 인하여, 백신의 제형물에서 보조제의 사용은 사실상 보편적이다 ([상기 Nossal, 1999]; [상기 Vogel 및 Powell, 1995]; 이의 교시는 본원에 참고로서 포함됨). 당업계에 잘 알려진 종래의 보조제는 사실상 다양하다. 이는, 예를 들어, 수불용성 무기염, 리포솜, 미셀 또는 에멀션, 즉, 프로인트 보조제 (Freund's adjuvant) 로 이루어질 수 있다. 다른 보조제는 전술된 [Vogel 및 Powell, 1995]에서 발견할 수 있다. 보조제 작용의 단일 메커니즘이 없더라도, 본질적인 특징은 백신 면역원으로만 유도된 반응에 비하여 백신 면역원에 대한 면역 반응을 상당히 증가시킬 수 있다는 것이다 ([상기 Nossal, 1999]; [상기 Vogel 및 Powell, 1995]). 이에 관해서, 일부 보조제는 체액성 면역 반응을 증가시키는데 보다 효율적이고; 다른 보조제는 세포성 면역 반응을 증가시키는데 보다 효율적이며 [상기 Vogel 및 Powell, 1995]; 또 다른 군의 보조제는 백신 항원에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응 모두를 증가시킨다 [상기 Vogel 및 Powell, 1995].

일반적으로, 백신 제형물에 사용된 에멀션은 오일, 수용액 및 계면활성제의 혼합물을 포함한다. 일부 에멀션은 Span 80^?과 같은 친유성 계면활성제 및 Tween 80^?과 같은 친수성 계면활성제를 포함한다. 이러한 에멀션은 또한 이온성 계면활성제 특성을 가진 것으로 알려진 레시틴 (lecithin) 또는 사포닌 (saponin) 과 같은 화합물을 포함할 수 있다.

그러나, 특히 저장 또는 수송 동안에, 백신 보조제로서 사용된 에멀션에서 안정성의 문제점을 발견할 수 있다. 면역원의 용액 또는 현탁액에 존재하는 리파아제 또는 에스테라제 효소 활성이 에멀션의 계면활성제를 가수분해할 수 있고 보조제의 안정성을 결핍시킬 수 있다. 리파아제 또는 에스테라제는 예를 들어 바이러스를 성장시키는데 사용된 세포 배양물 또는 박테리아에서 올 수 있다. 특히, 이는 상기 조성물이 농축 면역원, 특히 비정제 농축 면역원을 함유하는 경우에 현실화된다. 통상적으로, 이는 비활성 (사멸된) 백신에 사용된 보조제의 경우이다. 면역원이 동일한 부피의 희석제에서 더욱 농축되기 때문에, 이러한 문제점은 다가 백신 조성물에서 더욱더 중요하다.

보조제 사용의 또 다른 문제점은 주사 부위에서 독성 또는 국소 염증과 같은 부작용의 위험과 관련되어 있다. 예를 들어, 국소 염증 반응 및/또는 육아종 (granulomae) 은 주사 후에 발생될 수 있다. 이러한 부작용을 제한하기 위해서, 에멀션 중 계면활성제 및 다른 성분을 감소시킬 수 있으나; 이러한 감소는 이어서 백신 조성물의 안정성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 안전성 및 안정성이 증가된 신규 보조제 및 이러한 보조제를 함유한 백신 조성물이 필요하다.

본 출원에서 임의의 문헌의 인용 또는 확인은 이러한 문헌이 본 발명에 대한 선행 기술로서 가능하도록 허용하는 것은 아니다.

발명의 개요

제 1 구현예에서, 본 발명은 박테리아, 기생충 또는 바이러스 현탁액, 특히 농축되고 비정제되거나 약하게 정제된 현탁액의 존재 하에서 안정성이 증가된 신규 수중유 (O/W) 에멀션을 제공한다.

본 발명의 또 다른 구현예는, 더욱 특히는 면역원일 수 있는, 하나 이상의 활성 성분을 포함한 약학적 조성물의 전달용 담체로서 작용하는, 안정하고 안전하며 용이하게 투여가능한, 특히 주사가능한 O/W 에멀션을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 구현예는 면역원에 의해 유도된 면역 반응을 증가시키는 보조제로서 작용하는, 안정하고 안전하며 주사가능한 O/W 에멀션을 제공한다. 특히, 본 발명은, 신규 보조제가 면역원을 함유한 백신 조성물에 사용된 경우, 면역원에 대한 백신접종자의 세포성 면역 반응, 체액성 면역 반응, 또는 유리하게는 두 반응 모두를 증가시키는 신규 보조제를 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 구현예는, O/W 에멀션을 포함한, 안정하고 안전한 면역원성 조성물 또는 백신을 제공한다.

본 발명의 추가의 구현예는 본 발명의 보조제를 사용하여 백신 조성물을 제조하는 방법; 이와 같이 수득된 백신 조성물; 및 이의 사용 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 또 다른 구현예는 제 1 바이알에 면역원 또는 다른 제약품을 포함하고, 제 2 바이알에 본 발명에 따라 제조된 보조제를 포함하며, 상기 보조제는 사용 전에 면역원 또는 다른 백신 제품과 혼합되도록 고안된 키트를 제공한다.

한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함할 수 있는 수중유 (O/W) 에멀션을 제공한다:

(1) 면역원을 함유한 수용액;

(2) 광물성 오일;

(3) 비이온성 친유성 에톡시화 지방 알코올;

(4) 에톡시화 지방 알코올, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 또는 이의 임의의 조합의 군으로부터 선택된 비이온성 친수성 계면활성제.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함할 수 있는 수중유 (O/W) 에멀션을 제공한다:

(1) 면역원을 함유한 수용액;

(2) 에톡시화 지방 알코올, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 또는 이의 임의의 조합의 군으로부터 선택된 비이온성 친유성 계면활성제;

(3) 광물성 오일;

(4) 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올.

본 발명에 따라 제조된 에멀션은 2 개의 상이한 계면활성제 군 (친유성 및 친수성 계면활성제) 의 구성원 중에서 선택된 2 이상의 계면활성제의 조합에 기초하고, 각각의 군에 속하는 하나 이상의 계면활성제를 사용할 수 있다.

또한, 또 다른 유리한 구현예에서, 본 발명은 백신접종자 내에서 면역 반응을 유도하기에 적합한 하나 이상의 면역원을 함유할 수 있는 신규 에멀션을 포함한 백신 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 에멀션이 보조제로서 면역원에 의해 유도된 면역 반응, 특히 세포성 반응, 체액성 반응, 또는 유리하게는 두 반응 모두를 증가시키도록 작용하는 이러한 조성물을 제공한다.

유리한 구현예에서, 항원 또는 면역원은 마이코플라스마 (Mycoplama), 유리하게는 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 (Mycoplasma hyopneumoniae), 돼지 서코바이러스 (porcine circovirus), 유리하게는 돼지 서코바이러스 2, 또는 헬리코박터 (Helicobacter), 유리하게는 헬리코박터 서도 (Helicobacter cerdo ) 또는 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori ) 이거나 이들에서 유래된다.

또 다른 유리한 구현예에서, 본 발명은 면역원, 특히 동결 건조된 형태의 또는 수용액 중의 면역원이 본 발명에 따른 보조제와 혼합되는 백신 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 면역원은 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다: 비활성 병원체, 약독화 병원체, 부단위 (sub-unit) 항원, 플라스미드를 포함한 재조합 발현 벡터 등. 병원체는 원천적으로 박테리아성, 바이러스성, 원생동물성, 기생충성 또는 진균성일 수 있거나, 또는 면역원은 톡소이드 (toxoid) 일 수 있다.

또 다른 유리한 구현예에서, 본 발명은 백신접종자에게 본 발명의 백신 조성물을 투여하는 것을 포함한, 백신접종자 내에서 병원체에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.

또 다른 유리한 구현예에서, 본 발명은, 2 개 이상의 바이알을 포함하고, 제 1 바이알에 면역원, 특히 동결 건조 형태의 또는 수성 매질 용액 중 면역원을 그리고 제 2 바이알에 본 발명에 따른 보조제 또는 에멀션을 포함한 키트를 제공한다.

본 개시물 및 특히 청구항에서, "포함하다 (comprise)", "포함된 (comprised)", "포함한 (comprising)" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 상기 용어에 부여되는 의미를 가질 수 있고; 예컨대, 이는 "포함하다 (include)", "포함된 (included)", "포함한 (including)" 등을 의미할 수 있고; "본질적으로 이루어진" 및 "본질적으로 이루어지다" 와 같은 용어는 미국 특허법에 의해 이들에 부여되는 의미를 가지며, 예컨대 이는 구성 요소를 명백하게 열거하지는 않지만, 선행 기술 분야에서 발견되거나 또는 본 발명의 기본적이거나 신규한 특징에 영향을 미치는 구성 요소는 배제한다는 것이다.

이러한 그리고 기타 구현예는 하기 상세한 설명에 개시되거나 이로부터 명백해지고 이에 포함된다.

상세한 설명

편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 문단 및 청구항에서 사용된 특정 용어를 여기에 모아둔다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "동물"은 인간을 포함한 모든 척추 동물을 포함한다. 또한, 배아 및 태아 단계를 포함한 모든 성장 단계 내 개별 동물을 포함한다. 특히, 용어 "척추 동물"은, 이에 제한되지 않지만, 인간, 개과 (예컨대, 개), 고양이과 (예컨대, 고양이); 말과 (예컨대, 말), 소과 (예컨대, 소), 돼지과 (예컨대, 돼지), 양과 (예컨대, 양), 염소과 (예컨대, 염소), 토끼뿐 아니라 조류를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "조류"는, 이에 제한되지 않지만, 닭 (브리더 (breeder), 브로일러 (broiler) 및 레이어 (layer)), 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 꿩, 앵무새, 되새류, 매, 까마귀, 및 타조, 에뮤 (emu) 및 화식조를 포함한 평흉류와 같은 분류학상 조강 (Aves) 의 임의의 종 또는 아종을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "돼지" 또는 "새끼 돼지"는 돼지과 기원의 동물에 속하지만, "암퇘지"는 번식 나이이고 번식 가능한 암컷을 지칭한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "독성"은 동물 숙주 내에 전염성을 보유하고 있는 분리물에 관한 것이다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비활성 백신"은 복제 또는 증식이 더 이상 가능하지 않은 전염성 유기체 또는 병원체를 함유한 백신 조성물을 포함한다. 병원체는 원천적으로 박테리아, 바이러스, 원충, 기생충 또는 진균일 수 있다. 고압, 화학적 처리 (예를 들어, 티메로살 또는 포르말린으로의 처리), 초음파분해, 방사선, 열, 또는 면역원성을 유지하면서 유기체의 복제 또는 증식을 방지하기에 충분한 임의의 기타 종래 방법을 포함하는 다양한 방법으로 비활성화를 이룰 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역원성"은 면역원 또는 면역원들에 대한 숙주 동물 내에서 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 의미한다. 이러한 면역 반응은 특정 전염성 유기체에 대해 백신에 의해 유도된 방어 면역의 기초를 형성한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역 반응"은 동물 내에서 유도된 반응을 지칭한다. 면역 반응은 세포성 면역 (CMI); 체액성 면역을 지칭하거나 두 반응 모두를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 면역계의 일부에 제한된 반응을 고려한다. 예를 들어, 본 발명의 백신 조성물이 증가된 감마 인터페론 반응을 특이적으로 유도할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원" 또는 "면역원"은 숙주 동물 내에서 특정 면역 반응을 유도하는 물질을 의미한다. 항원은 사멸되거나 약독화되거나 살아있는 전체 유기체; 유기체의 부단위 또는 부분; 면역원성을 갖는 삽입물을 함유하는 재조합 벡터; 숙주 동물에 제시될 때 면역 반응을 유도할 수 있는 DNA 부분 또는 절편; 단백질, 당단백질, 지단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 에피토프, 합텐 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 대안적으로, 면역원 또는 항원은 독소 또는 항독소를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "다가"는 동일한 종으로부터 (예컨대, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에의 상이한 분리물), 상이한 종으로부터 (예컨대, 파스튜렐라 헤몰리티카 (Pasteurella hemolytica) 및 파스튜렐라 물토시다 (Pasteurella multocida) 에서의 분리물) 의 하나 초과의 항원을 함유한 백신, 또는 상이한 속으로부터의 항원들의 조합을 함유한 백신 (예를 들어, 파스튜렐라 물토시다, 살모넬라, 대장균, 헤모필루스 솜너스 (Haemophilus somnus) 및 클로스트리디움 (Clostridium) 으로부터의 항원을 포함한 백신) 을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보조제"는 백신에 첨가되어 백신의 면역원성을 증가시키는 물질을 의미한다. 보조제의 작용 메커니즘은 충분히 이해되지는 않는다. 일부 보조제는 항원을 서서히 방출하여 면역 반응을 강화한다고 이해되고, 반면에 다른 보조제는 다음과 같은 메커니즘 중 임의의 것에 의해 이의 효과를 전달할 수 있다: 특히 항원-제시 세포 (APC) 에 대한 세포성 침윤, 염증 및 주사 부위에의 수송 (trafficking) 을 증가시키거나; 부자극 신호 (costimulatory signal) 또는 주요조직 적합 유전자 복합체 (MHC) 발현을 상향 조절함으로써 APC의 활성 상태를 증진시키거나; 항원 제시를 강화하거나; 또는 간접적 효과을 위하여 시토킨 방출을 유도함. 제공된 백신 면역원에 가장 적절한 보조제는 방어 면역에 필요한 면역 반응 종류에 상당한 정도로 의존할 것이다. 보조제 선택은 다소 경험적일 수 있다. 공지된 백신 보조제는, 이에 제한되지 않지만, 오일 및 물 에멀션 (예를 들어, 완전 프로인트 보조제 및 불완전 프로인트 보조제), 특히 수중유 에멀션, 유중수 에멀션, 수중유중수 (water-in-oil-in-water) 에멀션을 포함한다. 또한, 이는 예를 들어 사포닌, 수산화알루미늄, 덱스트란 설페이트, 카르보머, 알긴산나트륨, "AVRIDINE" (N,N-디옥타데실-N,N'-비스(2-히드록시에틸)-프로판디아민), 파라핀 오일, 뮤라밀 디펩티드, 양이온성 지질 (예컨대, DMRIE, DOPE 및 이의 조합) 등을 포함한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 운반체"와 "약학적으로 허용가능한 담체 (vehicle)"는 호환가능하고, 심각한 부작용 없이 숙주에게 주사될 수 있는 백신 면역원을 함유하기 위한 유체 담체를 지칭한다. 당업계에 공지된, 적합한 약학적으로 허용가능한 운반체는, 이에 제한되지 않지만, 무균수, 식염수, 포도당 또는 완충액을 포함한다. 운반체는, 이에 제한되지 않지만, 희석제, 안정화제 (즉, 당 및 아미노산), 보존제, 습윤제, 유화제, pH 완충제, 점도 강화 첨가제, 착색제 등을 포함하는 조제 (auxiliary agent) 를 포함할 수 있다. 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 운반체 또는 담체 또는 부형제는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 운반체 또는 담체 또는 부형제는 0.9 % NaCl (예컨대, 식염수) 용액 또는 인산염 완충액일 수 있다. 또한, 투여량 및 투여 부피는 본원에 일반적인 설명에서 논의되고, 불필요한 실험 없이, 당업계에서의 지식과 함께 본 개시물로부터 당업자에 의해 결정될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "백신 조성물"은 숙주 내에서 면역 반응을 유도하는데 유용한 약학적으로 허용가능한 담체 내 하나 이상의 항원 또는 면역원을 포함한다. 수용 동물의 연령, 성별, 체중, 종 및 상태, 및 투여 경로와 같은 요인을 고려하여, 의학 또는 수의학 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 그리고 잘 알려진 투여량으로 백신 조성물을 투여할 수 있다. 투여 경로는 점막 투여 (예컨대, 경구, 비상, 안구) 또는 비경구 경로 (예컨대, 피내, 근육내, 피하) 를 통하여 경피적일 수 있다. 숙주에의 생성물의 비경구 투여를 위해, 유침 시린지 또는 무침 주사기가 사용될 수 있다. 백신 조성물을 단독으로 투여할 수 있거나, 다른 치료 또는 요법과 공동-투여 또는 순차-투여할 수 있다. 투여 형태는 무균 현탁액 또는 에멀션과 같은 비경구, 피하, 피내 또는 근육내 투여 (예컨대, 주사 투여) 용 현탁액 및 제제를 포함할 수 있다. 백신 조성물은 분무로 투여될 수 있거나, 식품 및/또는 물에 혼합될 수 있거나, 무균수, 생리식염수, 포도당 등과 같은 적합한 운반체, 희석제 또는 부형제와의 혼합물로 전달될 수 있다. 원하는 제제 및 투여 경로에 따라, 상기 조성물은 습윤 또는 유화제, pH 완충제, 보조제, 겔화 또는 점도 강화 첨가제, 보존제, 착향제, 착색제 등과 같은 보조 물질을 함유할 수 있다. 불필요한 실험 없이, 적합한 제제를 제조하는데 ["Remington's Pharmaceutical Sciences", 1990]과 같은 표준 약학 교과서를 참고할 수 있다.

본 발명은 한 구현예에서 하기를 포함할 수 있는 신규 수중유 (O/W) 보조제 또는 에멀션을 제공한다:

(1) 숙주 내에서 면역 반응을 유도할 수 있는 백신 항원 또는 면역원을 함유한 수용액;

(2) 비이온성 친유성 에톡시화 지방 알코올;

(3) 광물성 오일;

(4) 에톡시화 지방 알코올, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 및/또는 이의 임의의 조합의 군으로부터 선택된 비이온성 친수성 계면활성제.

본 발명은 또 다른 구현예에서 하기를 포함할 수 있는 신규 수중유 (O/W) 보조제 또는 에멀션을 제공한다:

(2) 에톡시화 지방 알코올, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 및/또는 이의 임의의 조합의 군으로부터 선택된 비이온성 친유성 계면활성제;

(3) 광물성 오일;

(4) 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올.

본 발명에 따라 제조된 에멀션은 2 개의 상이한 계면활성제 군 (친유성 및 친수성 계면활성제) 의 구성원 중에서 선택된 2 이상의 계면활성제의 조합에 기초하고, 각 군에 속하는 하나 이상의 계면활성제를 사용할 수 있다.

친유성 에톡시화 지방 알코올은 분자량의 약 43 % (w/w) 이하의 에틸렌 옥시드 (EO) 를 포함할 수 있는 에톡시화 지방 알코올일 수 있다. 친유성 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 (POE-POP 블록 공중합체) 는 약 35 % (w/w) 이하의 에틸렌 옥시드를 포함할 수 있는 공중합체이다.

친수성 에톡시화 지방 알코올은 약 43 % (w/w) 초과의 에틸렌 옥시드 (EO) 를 포함한 에톡시화 지방 알코올일 수 있다. 친수성 POE-POP 블록 공중합체는 약 55 % (w/w) 이상의 에틸렌 옥시드를 포함한 공중합체이다.

비이온성 친수성 계면활성제에 대해, 지방 알코올은 탄소수 9 내지 22의 지방 알코올일 수 있고, 유리하게는 올레일, 세틸, 스테아릴, 이소스테아릴, 라우릴 알코올 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 유리하게는 올레일 알코올, 더욱 유리하게는 EO가 5 내지 21 개인 올레일 알코올일 수 있다. POE-POP 블록 공중합체는 MW가 약 3000 내지 16000이다.

비이온성 친수성 계면활성제의 군은, 이에 제한되지 않지만, 에톡시화 지방 알코올: Brij^? 76 [스테아레트-10], Brij^? 56 [세테트-10], Brij^? 96/97 [올레트-10], Brij^? 98 [올레트-20], Brij^? 721 [스테아레트-21], Brij^? 58 [세테트-20], Brij^? 35 [라우레트-23], Brij^? 78 [스테아레트-20] (Uniqema), Volpo^? N5 [올레트-5], Volpo^? CS6 [세테아레트-6], Volpo^? CS12 [세테아레트-12], Volpo^? CS20 [세테아레트-20], Volpo^? CS25 [세테아레트-25], Volpo^? CS23 [세테아레트-23] (Croda), BL9-EX [라우레트-9], BC-7 [세테트-7], BT-5 [C12-14 파레트-5], BT-7 [C12-14 파레트-7], BT-9 [C12-14 파레트-9], BT-12 [C12-14 파레트-12], BD-10 [C12-15 파레트-10], BO-7V [올레트-7], BC5.5 [세테트-6], BL-21 [라우레트-21], BL-25 [라우레트-25], BC-15TX [세테트-15], BC-23 [세테트-23], BC-25TX [세테트-25], BO-15V [올레트-15], BO-50V [올레트-50], BB-20 [베헤네트-20] (Nikko Chemicals) 및 이의 조합, POE-POP 블록 공중합체: Lutrol^? F127 [폴록사머 407], Lutrol^? F68 [폴록사머 188], Lutrol^? F108 [폴록사머 338], Lutrol^? F98 [폴록사머 278], Lutrol^?F87 [폴록사머 227], Lutrol^? F88 [폴록사머 228], Lutrol^? F77 [폴록사머 207], Lutrol^? F38 [폴록사머 108] (BASF), Tetronics^?T1307, Tetronics^?T1107, Tetronics^?T908 (BASF) 및 이의 조합을 포함한다.

비이온성 친유성 계면활성제에 대하여, 지방 알코올은 탄소수 9 내지 22의 지방 알코올이고, 유리하게는 올레일, 세틸, 스테아릴, 이소스테아릴, 라우릴 알코올 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 유리하게는 올레일 알코올, 더욱 유리하게는 EO가 1 내지 4 개인 에톡시화 올레일 알코올이다. POE-POP 블록 공중합체는 MW가 약 1000 내지 약 8000이다.

비이온성 친유성 계면활성제의 군은, 이에 제한되지 않지만, 에톡시화 지방 알코올: Brij^?30 [라우레트-4], Brij^?92/93 [올레트-2], Brij^?72 [스테아레트-2], Brij^?52 [세테트-2] (Uniqema), Volpo^? L3 [C12-13 파레트-3], Volpo^? N3 [올레트-3], Volpo^?L4 [C12-13 파레트-4] (Croda), BS-4 [스테아레트-4], BD-2 [C12-15 파레트-2], BD-4 [C12-15 파레트-4], BT-3 [C12-14 파레트-3] (Nikko Chemicals) 및 이의 조합, POE-POP 블록 공중합체: Pluronic^? L121 [폴록사머 401], Pluronic^?L101 [폴록사머 331], Pluronic^?L81 [폴록사머 221], Pluronic^?L62 [폴록사머 182], Pluronic^?L43 [폴록사머 123], Pluronic^?P103 [폴록사머 333], Pluronic^?L123 [폴록사머 403], Lutrol^?L63 [폴록사머 183], Lutrol^?P122 [폴록사머 402], Lutrol^?L92 [폴록사머 272], Lutrol^?L72 [폴록사머 202], Lutrol^?L42 [폴록사머 122], Lutrol^?L61 [폴록사머 181] (BASF), Tetronics^?T1301, Tetronics^?T701, Tetronics^?T901 (BASF) 및 이의 조합을 포함한다.

본 발명의 계면활성제는 동물 또는 식물 기원의 지방 알코올을 가질 수 있다. 한 가지 기원을 다른 것으로 변경하는 것은 에멀션의 제형물에서 조금만 조절하여도 간단하게 행할 수 있다.

본 발명에 따른 에멀션은 계면활성제의 총 농도가, 에멀션의 부피 당 중량으로, 약 0.2 % 내지 약 6.5 %, 특히 약 1 % 내지 약 6 %, 유리하게는 약 1.5 % 내지 약 5 %, 더욱 유리하게는 약 2 % 내지 약 3 %이다.

이러한 에멀션은 점도가 낮고 용이하게 주사가능하다.

유리한 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함할 수 있는 수중유 (O/W) 에멀션을 제공한다:

(2) 비이온성 친유성 에톡시화 지방 알코올;

(3) 광물성 오일;

(4) 약 43 % 초과 및 약 71 % (w/w) 미만의 에틸렌 옥시드를 포함한 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올;

(5) 약 71 % (w/w) 이상의 에틸렌 옥시드를 포함한 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올.

약 43 % 초과 및 약 71 % (w/w) 미만의 에틸렌 옥시드를 포함한 에톡시화 지방 알코올은 유리하게는 EO가 5 내지 14 개인 에톡시화 올레일 알코올이다. 약 71 % (w/w) 이상의 에틸렌 옥시드를 포함한 지방 알코올은 유리하게는 EO가 15 개 이상인 에톡시화 올레일 알코올이다.

이러한 유리한 구현예에서, 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올의 농도는 일반적으로 약 1.0 % 내지 약 5.0 %, 특히 약 1.5 % 내지 약 4.5 %, 더욱 유리하게는 약 2.0 % 내지 약 3.5 % 이다 (백분율은 에멀션의 부피에 대한 중량 (w/v) 으로 나타냄). 비이온성의 높은 친수성 에톡시화 지방 알코올에 대한 농도는 일반적으로 약 0.01 % 내지 약 3.0 %, 특히 약 0.05 % 내지 약 2.5 %, 더욱 유리하게는 약 0.1 % 내지 약 2.0 % (w/v) 이다. 비이온성 친유성 에톡시화 지방 알코올의 농도는 일반적으로 약 0.1 % 내지 약 2.5 %, 특히 약 0.2 % 내지 약 2.0 %, 유리하게는 약 0.2 % 내지 약 1.5 %, 더욱 유리하게는 약 0.2 % 내지 약 1.2 % (w/v) 이다.

(2) 비이온성 친유성 에톡시화 지방 알코올;

(3) 광물성 오일;

(4) 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올;

(5) 비이온성 친수성 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체.

친수성 에톡시화 지방 알코올은 유리하게는 약 43 % 초과 및 약 71 % (w/w) 미만의 에틸렌 옥시드를 포함한 지방 알코올, 더욱 유리하게는 EO가 5 내지 14 개인 에톡시화 올레일 알코올이다. 비이온성 POE-POP 블록 공중합체는 유리하게는 70 % (w/w) 이상의 에틸렌 옥시드를 포함할 수 있다.

이러한 유리한 구현예에서, 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올의 농도는 일반적으로 약 1.0 % 내지 약 5.0 %, 특히 약 1.5 % 내지 약 4.5 %, 더욱 유리하게는 약 2.0 % 내지 약 3.5 % 이다 (백분율은 에멀션의 부피에 대한 중량 (w/v) 으로 나타냄). 비이온성 POE-POP 블록 공중합체에 대한 농도는 일반적으로 약 0.01 % 내지 약 2.0 %, 더욱 특히 약 0.1 % 내지 약 1.5 % (w/v) 이다. 비이온성 친유성 에톡시화 지방 알코올의 농도는 일반적으로 약 0.1 % 내지 약 2.5 %, 특히 약 0.2 % 내지 약 2.0 %, 유리하게는 약 0.2 % 내지 약 1.5 %, 더욱 유리하게는 약 0.2 % 내지 약 1.2 % (w/v) 이다.

일반적으로, 본 발명에 따른 에멀션은 상전이 온도 (PIT) 가 25 ℃ 이상, 특히 약 28 ℃ 내지 약 65 ℃, 더욱 특히 약 33 ℃ 내지 약 60 ℃의 범위일 수 있다.

PIT 는 유중수 에멀션이 수중유 에멀션으로 변하거나 또는 탈상 (de-phase) (에멀션의 분열 및 2 상의 분리) 되는 온도이다. PIT 값은 다양한 방법, 예를 들어 시각적 관찰 또는 전도도로 측정될 수 있다. 에멀션을 에멀션의 PIT 미만의 온도, 예를 들어 약 25 ℃의 온도에서 수조에 놓는다. 온도를 점진적으로 증가시킨다. 에멀션의 시각적 외관의 변화는, 대조 에멀션과 비교하여, 특히 유동성, 2 상으로의 분리, 표면으로의 오일상 이동으로 인한 표면 외관의 변화로 관찰된다. 시각적 외관의 변화가 관찰되는 온도가 에멀션의 PIT 값이다. 대안적으로, PIT는, 수성상으로서의 생리식염수에 대해, 약 5-15 밀리지멘스/센티미터 (mS/cm)의 전도도 값 (수중유 에멀션) 에서 약 0 mS/cm의 값 (유중수 에멀션) 으로의 신속한 이동에 의해 측정되고, 이는 표면 근처에서 에멀션 내에 놓인 탐침으로 측정된다. 전이가 관찰되는 온도가 에멀션의 PIT 값이다. 당업자는 불필요한 실험 없이, 각각의 농도를 포함해서, 계면활성제 및 오일의 조합을 결정하여, 본 발명에 따른 에멀션, 특히 PIT 값이 상기 정의된 범위 내에 있는 에멀션을 제조할 수 있을 것이다.

일반적으로, 본 발명에 따른 에멀션은, 에멀션의 부피 당 부피 (v/v) 로, 약 2 % 내지 약 50 %의 오일(들) 및 계면활성제를 포함한 오일상, 특히 약 4 % 내지 약 40 %, 유리하게는 약 8 % 내지 약 35 %, 더욱 유리하게는 약 15 % 내지 약 30 %의 오일상을 포함할 수 있다. 정의에 의하면, 본 명세서에서의 값의 범위는, 다른 지시가 없는 한, 항상 범위의 한계값을 포함한다.

사용된 오일은, 이에 제한되지 않지만, 이소파라핀계 오일 및/또는 나프텐계 오일과 같은 파라핀 오일, 스쿠알란 (squalane), 스쿠알렌 (squalene), 프리스탄 (pristane), 폴리이소부텐, 수소화 폴리이소부텐, 폴리데센, 폴리이소프렌, 폴리이소프로펜 등을 포함한 광물성 오일일 수 있다. 본 발명에서 유용한 하나의 유리한 광물성 오일은 탄소수가 15 초과, 유리하게는 15 내지 32이고 방향족 화합물이 없는 선형 또는 분지형 탄소 사슬을 포함한 오일을 포함할 수 있다. 이러한 오일은, 예를 들어, MARCOL^? 52 또는 MARCOL^? 82 (Esso) 또는 "DRAKEOL^? 6VR" (Penreco) 이라는 명칭 하에 시판되는 것일 수 있다.

또한, 오일은 본원에 기재된 오일 중에서 선택된 2 이상의 오일을 임의의 비율로 포함한 오일의 혼합물일 수 있다. 또한, 오일의 혼합물은 전술한 오일 중에서 선택된 하나 이상의 오일 및 하나 이상의 식물성 오일을 포함할 수 있고, 이 식물성 오일은 오일상의 약 0.1 % 내지 약 33 %, 유리하게는 약 5 % 내지 약 15 % v/v 를 나타낸다. 이러한 식물성 오일은, 생분해성이고, 유리하게는, 저장 온도 (약 +4 ℃) 에서 액체이거나 적어도 상기 온도에서 액체인 에멀션을 제공할 수 있는, 올레산이 풍부한 불포화 오일이다. 예를 들어, 식물성 오일은 땅콩 오일, 견과 오일, 해바라기 오일, 홍화 오일, 대두 오일, 달맞이꽃 오일 등일 수 있다.

일반적으로, 본 발명은, 이에 제한되지 않지만, 무균수, 생리식염수, 포도당, 완충제 등을 포함한, 적합한 수의학적으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한 수용액을 사용하는 것을 계획한다. 또한, 상기 담체, 부형제 또는 희석제는 폴리올, 글루시드 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다. 또한, 담체, 부형제 또는 희석제는 예를 들어, 아미노산, 펩티드, 산화방지제, 살균제, 살균성 화합물을 포함할 수 있다. 상기 수용액은 정량적으로 오일 및 계면활성제에 첨가되어, 본 발명에 따른 100 % 부피의 에멀션이 수득된다.

본 발명은 파라핀 오일; 비이온성 친유성 계면활성제로서 EO가 2 내지 3 개인 에톡시화 올레일 알코올; 비이온성 친수성 계면활성제로서 EO가 5 내지 6 개인 에톡시화 올레일 알코올; 및 비이온성 친수성 계면활성제로서 EO가 약 70 내지 80 %이고 MW가 약 9800 내지 16000인 POE-POP 블록 공중합체를 포함한 에멀션을 계획한다. 특히, 파라핀 오일의 농도가 약 5 % 내지 약 50 %, 유리하게는 약 15 % 내지 약 30 % (v/v) 이고; EO가 2 내지 3 개인 에톡시화 올레일 알코올의 농도가 0.1 % 내지 1.5 %, 유리하게는 0.1 % 내지 1.2 % (w/v) 이고; EO가 5 내지 6 개인 에톡시화 올레일 알코올의 농도가 1 % 내지 5 %, 유리하게는 1 % 내지 4 % (w/v) 이고; EO가 약 70 내지 80 %이고 MW가 약 9800 내지 16000인 POE-POP 블록 공중합체의 농도가 0.01 % 내지 2 %, 유리하게는 0.05 % 내지 1.5 % (w/v) 이다.

본 발명에 따른 제 2 구현예에서, 에멀션은 파라핀 오일; 비이온성 친유성 계면활성제로서 EO가 2 내지 3 개인 에톡시화 올레일 알코올; 비이온성 친수성 계면활성제로서 EO가 10 개인 에톡시화 올레일 알코올; 및 비이온성 친수성 계면활성제로서 EO가 약 70 내지 80 %이고 MW가 약 9800 내지 16000인 POE-POP 블록 공중합체를 포함한다. 특히, 파라핀 오일의 농도가 5 % 내지 50 %, 유리하게는 15 % 내지 30 % (v/v) 이고; EO가 2 내지 3 개인 에톡시화 올레일 알코올의 농도가 0.2 % 내지 3 %, 유리하게는 0.5 % 내지 3 % (w/v) 이고; EO가 10 개인 에톡시화 올레일 알코올의 농도가 0.2 % 내지 3 %, 유리하게는 0.5 % 내지 3 % (w/v)이고; EO가 약 70 내지 80 %이고 MW가 약 9800 내지 16000인 POE-POP 블록 공중합체의 농도가 0.01 % 내지 2 %, 유리하게는 0.05 % 내지 1.5 % (w/v) 이다.

본 발명에 따른 제 3 구현예에서, 에멀션은 파라핀 오일, 비이온성 친유성 계면활성제로서 EO가 2 내지 3 개인 에톡시화 올레일 알코올 및 비이온성 친수성 계면활성제로서 EO가 5 내지 6 개인 에톡시화 올레일 알코올을 포함한다. 특히, 파라핀 오일의 농도가 5 % 내지 50 %, 유리하게는 15 % 내지 35 % (v/v) 이고; EO가 2 내지 3 개인 에톡시화 올레일 알코올의 농도가 0.1 % 내지 3 %, 유리하게는 0.5 % 내지 2 % (w/v) 이고; EO가 5 내지 6 개인 에톡시화 올레일 알코올의 농도가 1 % 내지 5 %, 유리하게는 2.0 % 내지 4.5 % (w/v) 이다.

이에 제한되지 않지만, 알루미늄; CpG 올리고뉴클레오티드 (ODN), 특히 ODN 2006, 2007, 2059, 2216 또는 2135 ([Pontarollo R.A. 등 , Vet . Immunol . Immunopath, 2002, 84: 43-59]; [Wernette C.M. 등, Vet . Immunol . Immunopath , 2002, 84: 223-236]; [Mutwiri G. 등, Vet . Immunol . Immunopath , 2003, 91: 89-103]; [Kerkmann M. 등, J. Immunol ., 2003, 170: 4465-4474]); 폴리A-폴리U ["Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach", Michael F. Powell 및 Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6: 03]; 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDA) ["Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach", Michael F. Powell 및 Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, volume 6: 157]; N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-히드록시에틸)프로판디아민 (예컨대, Avridine^?) [Ibid, p. 148], 카르보머, 키토산 (예를 들어, 미국 특허 일련번호 5,980,912 참조) 을 포함한 다른 화합물을 임의로 공-보조제로서 에멀션에 첨가할 수 있다.

또한, 본 발명은 하나 이상의 항원 또는 면역원 및 본 발명에 따라 제조된 보조제 또는 에멀션을 포함한 백신 조성물 또는 면역학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 면역원은 에멀션 형성 도중에 혼입될 수 있거나, 대안적 구현예에서, 면역원은 이후에, 예를 들어, 사용 직전에, 에멀션에 첨가될 수 있다.

사용된 수용액의 전체량이 처음 제조된 에멀션에 존재할 수 있다. 또는 상기 수용액 중 일부분만이 사용되어 에멀션을 형성할 수 있고, 수용액 중 잔여량은 면역원 혼입과 함께 첨가된다. 면역원 또는 항원은 동결 건조된 형태이거나 또는 다른 적절한 고체 형태로 존재하고, 이어서 에멀션과 혼합될 수 있거나, 대안적으로 항원은 용액, 특히 수용액에 존재할 수 있고, 이 용액은 에멀션과 혼합된다.

계면활성제는 유리하게는 용해도에 따라 오일 또는 수용액에 첨가된다. 예를 들어, 비이온성 친유성 계면활성제는 본 발명에 따른 오일에 첨가되지만 비이온성 친수성 계면활성제는 수용액에 첨가된다.

에멀션화는 당업자에게 공지된 종래의 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한 구현예에서, 에멀션은 에멀션의 PIT 미만의 온도, 특히 실온, 예컨대 약 30 ℃에서 제조될 수 있다. 기계적 교반, 예컨대 높은 전단력을 생성할 수 있는, 로터-스테터 (rotor-stator) 를 장착한 터빈으로 수상 및 오일상을 함께 혼합한다. 유리하게는, 낮은 회전 속도로 교반을 개시하고 일반적으로 오일 내로의 수용액의 점진적 첨가에 따라 서서히 증가시킨다. 유리하게는, 수용액은 오일에 점진적으로 첨가된다. 오일/수용액의 비율을 조절하여, 예를 들어, 오일 농도가 약 40 % 내지 약 55 % (v/v) 인 유중수 (W/O) 에멀션을 수득할 수 있다. 교반을 정지할 때, 실온으로 냉각하면서 상기 에멀션은 O/W 에멀션으로 점진적으로 변한다 (상전이). 전이 후에 그리고 필요한 경우, 에멀션을 수용액의 첨가로 희석하여, 최종 에멀션으로 원하는 농도의 오일을 수득한다. 상기 에멀션을 약 5 ℃에서 저장할 수 있다.

또 다른 구현예에서, 에멀션은 에멀션의 PIT 초과의 온도에서 제조될 수 있다. 제 1 단계에서, 에멀션의 PIT 초과의 온도에서 수상 및 오일상을 함께 혼합한다. 유리하게는, 수용액이 점진적으로 오일에 첨가된다. 오일/수용액의 비율을 조절하여, 예를 들어, 오일 농도가 약 40 % 내지 약 55 % (v/v) 인 유중수 (W/O) 에멀션을 수득할 수 있다. 예컨대, 스택틱 믹서 또는 마린 헬릭스 (marine helix) (프로펠러) 또는 매우 낮은 회전 속도의 터빈으로, 낮은 전단력으로 또는 전단력 없이 교반하여 에멀션화를 행할 수 있다. 수득된 에멀션은 유중수 (W/O) 에멀션이다. 제 2 단계에서, 에멀션을 PIT 미만으로 점진적으로 냉각한다. 이 단계 도중, 상기 에멀션은 O/W 에멀션으로 변한다 (상전이). 전이 후에 그리고 필요한 경우, 에멀션을 수용액의 첨가로 희석하여, 최종 에멀션으로 원하는 농도의 오일을 수득한다. 상기 에멀션을 약 5 ℃에서 저장할 수 있다.

에멀션 중 오일 방울의 크기는 약 100 nm 내지 약 500 nm일 수 있다. 에멀션을, 예를 들어, 보조제로 사용하여 백신 조성물 또는 약학적 조성물을 제형화할 수 있다. 또한, 상기 에멀션을 용매로서 사용하여 건조된 생성물, 특히 예를 들어 약독화 미세유기체 또는 살아있는 재조합 벡터를 함유한 동결 건조된 생성물을 용해시킬 수 있다.

특정 구현예에서, 예비-에멀션은 수용액의 일부분으로만 제조된다. 이러한 예비-에멀션을 약제 또는 면역원, 유리하게는 면역원과 같은 활성 성분의 현탁액의 첨가로 희석하여 최종 조성물을 수득할 수 있다. 대안적으로, 예비-에멀션을 수용액으로 희석할 수 있고 동결 건조된 생성물과 같은 건조된 생성물을 용해시키는데 사용될 수 있다.

본 발명에서의 용도에 적합한 면역원 또는 항원은 비활성 병원체, 약독화 병원체, 면역성 부단위 (예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 에피토프, 합텐) 또는 면역성 삽입물을 갖는 플라스미드를 포함하는 재조합 발현 벡터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 면역원은 비활성이거나 사멸된 미세유기체이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 백신 조성물은, 이에 제한되지 않지만, 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 살모넬라 엔테리티스 (Salmonella enteritidis), 전염성 기관지염 바이러스 (IBV), 뉴캐슬병 바이러스 (NDV), 산란 저하증 바이러스 (EDS) 또는 전염성 F 낭병 바이러스 (IBDV), 조류인플루엔자 바이러스 등을 포함한 조류 병원체 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 면역원을 포함한다.

대안적으로, 백신 조성물은, 이에 제한되지 않지만, 고양이 헤르페스바이러스 (FHV), 고양이 칼리시바이러스 (FCV), 고양이 백혈병 바이러스 (FeLV), 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV), 광견병 바이러스 등과 같은 고양이 병원체 및 이의 조합에서 선택된 면역원을 포함한다.

또한 또 다른 구현예에서, 본 발명의 백신 조성물은, 이에 제한되지 않지만, 광견병 바이러스, 개 헤르페스바이러스 (CHV), 개 파보바이러스 (CPV), 개 코로나바이러스, 렙토스피라 카니콜라 (Leptospira canicola), 렙토스피라 익테로헤모라기아에 (Leptospira icterohaemorragiae), 렙토스피라 그립포티포사 (Leptospira grippotyphosa), 보렐리아 버그도르페리 (Borrelia burgdorferi), 보데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica) 등을 포함한 개 병원체 및 이의 조합에서 선택된 면역원을 포함한다.

또한 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 말 헤르페스바이러스 (1 형 또는 4 형), 말 인플루엔자 바이러스, 파상풍, 웨스트 나일 바이러스 등과 같은 말 병원체 및/또는 이의 조합에서 선택된 면역원을 포함한다.

또한 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 광견병 바이러스, 소 로타바이러스, 소 파라인플루엔자 바이러스 3 형 (bPIV-3), 소 코로나바이러스, 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV), 구제역 바이러스 (FMDV), 소 호흡기 세포융합 바이러스 (BRSV), 전염성 소 비기관염 바이러스 (IBR), 대장균 (Escherichia coli), 파스튜렐라 물토시다, 파스튜렐라 헤몰리티카 등과 같은 소 병원체 및 이의 조합에서 선택된 면역원을 포함한다.

또한, 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은, 이에 제한되지 않지만, 돼지 인플루엔자 바이러스 (SIV), 돼지 서코바이러스 2형 (PCV-2), 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 (PRRS), 가성광견병 바이러스 (PRV), 돼지 파보바이러스 (PPV), FMDV, 돼지 콜레라 (HCV), 마이코플라스마 하이오뉴모니아에, 에리시펠로트릭스 루시오파티아에 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 파스튜렐라 물토시다, 보데텔라 브론키셉티카, 대장균, 헬리코박터 서도, 헬리코박터 필로리 등과 같은 돼지 병원체 및 이의 조합에서 선택된 면역원을 포함한다.

본 발명의 유리한 구현예는 약학적으로 허용가능한 담체 중 하나 이상의 면역원 및 에멀션을 포함한 백신 조성물을 제공한다. 바이러스, 박테리아, 진균 등을 포함한 면역원은 적절한 배양 배지 또는 숙주 세포주를 사용한 체외 배양 방법 및 당업자에게 잘 알려진 종래의 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, PRRS는 MA-104 세포주와 같은 적절한 세포주에서 배양될 수 있다 (미국 특허 일련번호 5,587,164; 5,866,401; 5,840,563; 6,251,404 참조). 유사한 방식으로, PCV-2는 PK-15 세포주를 사용하여 배양될 수 있고 (미국 특허 일련번호 6,391,314 참조); SIV는 달걀 상에서 배양될 수 있고 (미국 특허 일련번호 6,048,537); 마이코플라스마 하이오뉴모니아에는 적절한 배양 배지에서 배양될 수 있다 (미국 특허 일련번호 5,968,525; 5,338,543; [Ross R. F. 등, Am . J. Vet . Res., 1984, 45: 1899-1905]).

비활성 면역학적 또는 백신 조성물을 수득하기 위해, 병원체는 유리하게는 수득 후 비활성되고, 임의로, 예를 들어, 포름알데히드, 베타-프로피올락톤, 에틸렌이민, 이원성 에틸렌이민 (BEI), 티메로살 등을 사용한 화학적 처리 및/또는 물리적 처리 (예컨대, 열처리 또는 초음파분해) 에 의해 정화시킨다. 비활성화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, PRRS 바이러스는 베타-프로피올락톤 처리 [Plana - Duran 등, Vet . Microbiol., 1997, 55: 361-370] 또는 BEI 처리 (미국 특허 일련번호 5,587,164) 로 비활성화될 수 있고; PCV-2 바이러스의 비활성은 에틸렌이민 처리 또는 베타-프로피올락톤 처리 (미국 특허 일련번호 6,391,314) 를 사용하여 달성될 수 있고; 돼지 인플루엔자 바이러스는 Triton과 같은 세척제를 사용하거나 또는 포름알데히드 처리 (미국 특허 일련번호 6,048,537) 로 비활성화될 수 있고; 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 박테리아는 포름알데히드 처리 (상기 Ross R. F.), 에틸렌이민 또는 BEI 처리 (WO 91/18627 참조), 또는 티메로살 처리 (미국 특허 일련번호 5,968,525 및 5,338,543) 로 비활성화될 수 있다.

비활성 병원체는 종래의 농축 기술, 특히 한외여과 (ultrafiltration) 로 농축될 수 있고/있거나 종래의 정제 방법, 특히, 이에 제한되지 않지만, 겔여과를 포함한 크로마토그래피 기술, 서당밀도균배 초원심분리, 또는 특히 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 을 사용하는 선택적 침전을 사용하여 정제될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 백신 조성물에 유용한 면역원은 발현 벡터를 포함한다. "벡터"는 체내 또는 체외에서 표적 세포에 전달하고자 하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 DNA 또는 RNA 플라스미드 또는 수두바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스와 같은 바이러스를 지칭한다. 이종 폴리뉴클레오티드는 치료 목적을 위한 서열을 포함할 수 있고, 임의로 발현 카세트의 형태일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 벡터는 궁극적 표적 세포 또는 대상에서 복제가능할 필요는 없다. 상기 용어는 폴리뉴클레오티드 엔코딩 서열의 번역용 복제 벡터를 포함한다. 또한, 바이러스성 벡터를 포함한다.

용어 "재조합"은, 자연적으로 발생되지 않거나 자연적으로 발견되지 않은 배열의 또 다른 폴리뉴클레오티드와 연결되는, 게놈 cDNA, 반합성 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 발현 벡터는 적절한 세포계에서 단백질의 체외 발현에 사용된 발현 벡터이다. 발현된 단백질은 분비 이후에 또는 이후가 아니라도 배양 상청액 중에서 또는 배양 상청액으로부터 수집될 수 있고 (분비가 없는 경우, 세포 용해가 통상적으로 발생하거나 수행됨), 임의로 한외여과와 같은 농축 방법으로 농축될 수 있고/있거나 친화, 이온 교환 또는 겔 여과형 크로마토그래피 방법과 같은 정제 방법으로 정제될 수 있고, 본 발명에 따른 에멀션에서 제형화될 수 있다.

또한, 본 발명은 다가 면역학적 조성물 또는 조합 백신 조성물의 제형물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 제조된 조합 소 세균 백신 (bacterin) 에 유용한 항원은, 이에 제한되지 않지만, 마이코플라스마 보비스, 파스튜렐라균, 특히 파스튜렐라 물토시다 및 파스튜렐라 해몰리티카, 해모필루스균 (Haemophilus sp.), 특히 해모필루스 솜너스, 클로스트리디움균, 살모넬라, 코리네박테리움 (Corynebacterium), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 스타필로코커스 (Staphylococcus), 모락셀라 (Moraxella), 대장균 등을 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 면역학적 조성물 또는 백신 조성물을 숙주에게 투여하는 것을 포함한, 동물과 같은 숙주 내에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 이러한 방식으로 유도된 면역 반응은 특히 항체 및/또는 세포성 면역 반응, 특히 감마-인터페론 반응이다.

특히, 본 발명은 병원성 유기체에 의한 동물의 감염 (예를 들어, 바이러스, 박테리아, 진균 또는 원생동물 기생충에 의한 감염) 에 대해 면역시키거나 그에 의해 유발된 증상을 방지하거나 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은, 이에 제한되지 않지만, 인간, 개과 (예컨대, 개), 고양이과 (예컨대, 고양이), 말과 (예컨대, 말), 소과 (예컨대, 소), 양과 (예컨대, 양), 염소과 (예컨대, 염소), 돼지과 동물 (예컨대, 돼지) 및 토끼를 포함한 척추 동물뿐 아니라, 이에 제한되지 않지만, 닭, 칠면조, 오리, 거위, 매추라기, 꿩, 앵무새, 되새류, 매, 까마귀 및 주조류 (타조, 에뮤, 화식조 등) 를 포함한 조류에 유용하다.

본 발명의 특정 양태에서, 이러한 방법은 본 발명에 따라 제조된 백신 조성물의 투여에 의한 분만 전 임신한 암컷의 백신접종으로 이루어진다. 또한, 이러한 방법은 백신접종 프로토콜 (protocol) 에 의해 유도된 방어 항체의 유도 및 백신접종된 임신한 암컷으로부터 자식으로의 이러한 방어 항체의 이동을 포함한다. 이러한 모체이행 항체 (maternal antibody) 의 이동은 이후에 병으로부터 자식을 보호한다.

본 발명에 따라 제조된 백신 조성물의 투여량은 백신접종할 동물의 종, 품종, 연령, 크기, 백신접종력 및 건강 상태에 따를 것이다. 또한, 항원 농도, 부가적 백신 성분 및 투여 경로 (즉, 피하, 피내, 경구 또는 근육내 투여) 와 같은 다른 요인은 유효 투여량에 영향을 줄 것이다. 백신의 항원 농도, 투여 경로 및 백신접종할 동물의 연령 및 상태에 기초하여 투여자에게의 백신 투여량은 용이하게 결정될 수 있다. 대안적으로, 상이한 투여량의 조직적인 면역원성 실험뿐 아니라 LD₅₀ 연구 및 다른 검사 방법은 불필요한 실험 없이 본 발명에 따른 백신 조성물을 위한 유효 투여량을 결정하는데 사용될 수 있다. 하기 실시예에서, 어느 정도의 투여량 및 어느 정도의 부피가 본원에 기재된 백신 조성물을 사용하는데 적절한지는 쉽게 명백해질 것이다. 자연적 전염과 관련된 사망률 및 이환률의 감소로 증명되는 바와 같이, 중요한 요인은 상기 투여량이 자연적 전염에 대해 적어도 부분적인 방어 효과를 제공한다는 것이다. 적절한 부피는 또한 당업자에 의해 용이하게 확정된다. 예를 들어, 조류 종에서, 투여 부피는 약 0.1 ml 내지 약 0.5 ml, 유리하게는 약 0.3 ml 내지 약 0.5 ml 일 수 있다. 고양이, 개 및 말 종에 대해서는, 투여 부피는 약 0.2 ml 내지 약 3.0 ml, 유리하게는 약 0.3 ml 내지 약 2.0 ml, 더욱 유리하게는 약 0.5 ml 내지 약 1.0 ml 일 수 있다. 소 및 돼지 종에 대해서는, 투여 부피는 약 0.2 ml 내지 약 5.0 ml, 유리하게는 약 0.3 ml 내지 약 3.0 ml, 더욱 유리하게는 0.5 ml 내지 약 2.0 ml 일 수 있다.

초기에 또는 최종 투약 이후로 장시간이 경과될 때, 면역 반응을 강화하기 위해 주기적 시간 간격으로의 반복적 백신접종이 유리할 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 백신 조성물은 비경구 주사 (즉, 피하, 피내 또는 근육내) 로서 투여된다. 조성물은 1회 투여로서 투여될 수 있거나, 대안적 구현예에서, 약 2 내지 약 6 주, 유리하게는 약 2 내지 약 5 주의 간격으로 제공된 약 2 내지 약 5 회의 반복 투여로 투여될 수 있다. 그러나, 당업자는 투여 횟수 및 백신접종 간의 시간 간격이, 이에 제한되지 않지만, 백신접종된 동물의 연령; 상기 동물의 상태, 특히 모체이행 항체의 존재; 예방주사 경로; 1회 투여 당 사용가능한 항원의 양 등을 포함한 다수의 요인에 따른다는 것을 인지할 것이다. 최초의 백신접종에 대해서, 기간은 일반적으로 1 주 초과, 유리하게는 약 2 내지 약 5 주일 것이다. 전에 백신접종된 동물에 대해서는, 임신 전 또는 도중에, 약 1년 간격으로 추가 백신접종을 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은, 이에 제한되지 않지만, Pigjet^?, Avijet^?, Dermojet^? 또는 Biojector^? (Bioject, Oregon, USA) 와 같은 무침 주사기를 사용하여 백신 조성물을 투여하는 것을 계획한다. 당업자는 불필요한 실험 없이 백신접종할 동물의 종; 동물의 연령 및 체중 등과 같은 요인과 관련하여 요구되는 대로 주사기의 규격을 조정할 수 있다.

본 발명의 한 구현예에서, 상기 방법은 본 발명에 따른 에멀션으로 제형화된 백신 조성물의 단일 투여를 포함한다. 예를 들어, 한 구현예에서, 백신 조성물은 비활성 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 백신이지만, 대안적 구현예는 비활성 PCV2 바이러스 조성물을 포함한 백신을 제공한다. 다른 면역학적 조성물 또는 백신은, 이에 제한되지 않지만, 비활성 PRRS 및 SIV를 포함한 단일 투여 요법에 사용하는데 적합하다. 백신은 이미 존재하는 항체의 존재 하에서 또한 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따라 제조되고 단백질 또는 펩티드, 항체, 알레르겐, CpG ODN, 성장 인자, 시토킨 또는 항생 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 면역원, 특히 CpG ODN 또는 시토킨을 포함한 약학적 조성물을 숙주에게 투여하는 것을 포함한, 동물과 같은 숙주를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이러한 약학적 조성물은 닭, 돼지 또는 젖소와 같은 동물 내 성장 수행을 향상하는데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 면역원 또는 약학적 조성물과 같은 성분을 함유한 제 1 바이알, 및 제 2 바이알 내의 본 발명에 따라 제조된 에멀션을 포함하는 키트에 관한 것이다. 면역원은 본원에 기재된 동결 건조된 형태, 건조된 형태 또는 수용액일 수 있다.

이제 다음과 같은 비제한 실시예로서 본 발명을 추가로 기술할 것이다.

실시예 1 : 에멀션 제조 방법

에멀션은 다음과 같이 기재된 2 단계로 제조된다:

제 1 단계: 높은 전단의 로터-스태터 Silverson 에멀션화 장치 (직경이 10 mm인 분해 헤드를 갖춘 L4RT 형) 를 사용하여 제형물을 제조하였다. 에멀션을 제조하기 위해, 1 부피의 오일상을 1 부피의 수상 #1과 35 ℃에서 에멀션화하였다. 1 분 동안 5000 rpm (1 분 당 회전) 의 교반 하에서 수상을 오일상에 첨가하였다. 상기 회전 속도를 1 분 동안 부피의 증가율에 따라 8300 rpm 까지 점진적으로 증가시켰다. 이 단계 도중에, 에멀션은 유중수 에멀션이었다. 최종 LR4 에멀션은 20 %의 오일상을 함유한 O/W 이다. LR4 에멀션에 대해서, 상 조성물은 다음과 같았다:

오일상 (72 ml):

- 올레트-2 (Brij^?92) : 1.8 % w/v,

- 올레트-5 (Volpo^?N5) : 8.2 % w/v,

- 파라핀 오일 (Marcol 82^?) : 87.5 % v/v,

- 보존제 : 2.5 % v/v.

수상 #1 (108 ml):

- 폴록사머 407 (Lutrol^? F127): 0.58 % w/v,

- 2나트륨 및 1칼륨 포스페이트를 함유한 등장 완충액 0.02 M (pH 7.8) : 100.0 % v/v를 위한 충분량.

백신으로서 동일한 완충액, 예를 들어 2나트륨 및 1칼륨 포스페이트를 함유한 등장 완충액 0.02 M (pH 7.8) 중 Lutrol^? F127의 5 % (w/v) 용액을 사용하여 수상 #1를 제조하였다.

교반을 정지하였을 때, 에멀션은 수중유 에멀션으로 변하였다. 상기 에멀션을 5 ℃에서 4 시간 이상 동안 저온실에 놓았다. 이 단계에서, 상기 에멀션은 40 %의 오일상을 함유한 예비-에멀션이었다.

제 2 단계 : 180 ml의 2나트륨 및 1칼륨 포스페이트 등장 완충액 0.02 M pH 7.8 과 면역원(들) (하기와 같은, 비활성 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 면역원 또는 PCV-2 면역원) 으로 수상 #2를 제조하였다. 제 1 단계에서 제조된 예비-에멀션을 약 5 ℃로 냉각하고, 동일한 온도에서 동일한 부피의 수상 #2를 첨가하여 희석시키고, 1 분 동안 자석 막대의 회전으로 혼합하였다. LR4 에멀션 중 최종 계면활성제 농도는 2.18 % (w/v) 이었다.

본원에서 제조된 바와 같은 LR4 백신은 5 ℃에서 1 년 이상 동안 안정하다.

동일한 제조 방법을 사용하여, 다른 에멀션을 하기와 같이 수득할 수 있다:

LR3 에멀션

제 1 단계:

최종 LR3 에멀션은 33 %의 오일상을 함유한 O/W 에멀션이다.

오일상 (120 ml):

- 올레트-2 (Brij^?92) : 6.24 % w/v,

- 올레트-10 (Brij^?96) : 2.76 % w/v,

- 파라핀 오일 (Marcol 82^?) : 89.50 % v/v,

- 보존제 : 1.50 % v/v.

수상 #1 (120 ml):

- 폴록사머 407 (Lutrol^?F127): 1.20 % w/v,

백신으로서 동일한 완충액, 예를 들어 2나트륨 및 1칼륨 포스페이트를 함유한 등장 완충액 0.02 M (pH 7.8) 중 Lutrol^?F127의 5 % (w/v) 용액을 사용하여 수 상 #1을 제조하였다.

교반을 정지하였을 때, 에멀션은 수중유 에멀션으로 변하였다. 상기 에멀션을 5 ℃에서 4 시간 이상 동안 저온실에 놓았다. 이 단계에서, 상기 에멀션은 50 %의 오일상을 함유한 예비-에멀션이었다.

제 2 단계 : 수상 #2 (120 ml) 는 2나트륨 및 1칼륨 포스페이트를 함유한 등장 완충액 0.02 M (pH 7.8) 및 면역원(들)으로 구성된다. 제 1 단계에서 제조된 예비-에멀션을 약 5 ℃로 냉각하고, 동일한 온도에서 절반 부피의 수상 #2를 첨가하여 희석시키고, 1 분 동안 자석 막대의 회전으로 혼합하였다. LR3 에멀션 중 최종 계면활성제 농도는 3.40 % w/v이다.

본원에서 제조된 바와 같은 LR3 백신은 5 ℃에서 1 년 이상 동안 안정하다.

BE1 에멀션 최종 BE1 에멀션은 33 %의 오일상을 함유한 O/W 에멀션이다.

오일상 (120 ml):

- 올레트-2 (Brij^?92) : 3.0 % w/v,

- 올레트-5 (Volpo^?N5) : 9.1 % w/v,

- 파라핀 오일 (Marcol 82^?) : 86.4 % v/v,

- 보존제 : 1.5 % v/v.

수상 #1 (240 ml):

2나트륨 및 1칼륨 포스페이트를 함유한 등장 완충액 0.02 M (pH 7.8) : 100.0 % v/v를 위한 충분량.

수상 #1은 2나트륨 및 1칼륨 포스페이트를 함유한 등장 완충액 0.02 M (pH 7.8) 98.5 % v/v 및 면역원(들)을 포함한다. 사용 전에 BE1 에멀션을 희석하지 않는다. BE1 에멀션 중 최종 계면활성제 농도는 4 % w/v이다.

실시예 2 : 에멀션의 안정성

LR4 및 LR3 조성물은 농축된 면역원(들)의 존재 하에서도 21 ℃에서 9 개월 이상 안정하였다. 에멀션의 입자 크기 분포는 이 기간 동안 변하지 않았다.

실시예 3 : 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 및 PCV -2 조합 백신-조성물 및 새끼 돼지에서의 안전성

물질 및 방법: LR3 또는 LR4 에멀션, 12 항원 단위의 비활성 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 및 2.4 log₁₀ (항원 단위)의 비활성 돼지 서코바이러스 2형/투여를 함유한 두 백신을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 생후 3 주의 새끼 돼지 24 마리를 무작위적으로 2 개의 군으로 나누었다. 군 2의 새끼 돼지 12 마리를 근육내 경로에 의해 4 ml의 LR3 백신 조성물로 0 일째에 백신접종하고, 반면에 군 3의 새끼 돼지 12 마리를 근육내 경로에 의해 4 ml의 LR4 백신 조성물로 0 일째에 백신접종하였다. 군 1은 백신접종하지 않은 대조군에 해당한다. 새끼 돼지들을 매일 모니터링하였다. 주사 2 주 후, 주사 부위 및 국부 손상을 관찰하였다.

처리	쇼크 & 일반적 반응	고열 ℃	매일의 상대적 평균 체중 증가	국부 반응의 크기 (cm³)
군 1 (대조)	반응 없음	-0.1±0.3*	6.5±1.9	0.0±0.0
군 2 (LR3)	반응 없음	0.6±0.5	6.3±1.3	1.8±2.8
군 3 (LR4)	반응 없음	0.1±0.2	6.4±1.7	8.4±11.4

(* 평균 ± 표준편차)

결과: LR3 및 LR4 보조제는 양호한 안전성 프로파일을 나타냈다.

실시예 4 : LR4 에멀션으로 보조된 PCV -2 백신 1 투여량 투여 후의 혈청학적 결과

물질 및 방법: LR4 에멀션, CpG ODN #2216 50 ㎍/투여, 1.5 항원 단위의 비활성 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 및 1.5 log₁₀ (항원 단위)의 비활성 돼지 서코바이러스 2형/투여를 함유한 백신을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 생후 3 주이고 미리 존재하는 높은 모체이행 항체를 가지는 새끼 돼지 40 마리를 무작위적으로 2 개의 군으로 나누었다. 군 2의 새끼 돼지 20 마리를 무침 주사기로 피내 경로에 의해 0.5 ml의 LR4 백신 조성물을 0 일째에 백신접종하였다. 군 1은 백신접종하지 않은 대조군에 해당한다. ELISA에 의한 PCV-2 ORF2 항체의 적정을 위해 백신접종 후 0 일째, 21 일째, 41 일째, 63 일째, 84 일째, 126 일째, 153 일째 및 180 일째에서 혈액 샘플을 채취하였다.

처리	0 일	21 일	41 일	63 일	84 일	126 일	153 일	180 일
군 1	3.08±0.58*	2.57±0.50	2.15±0.58	＜1.51±0.48	＜1.51±0.34	＜1.51±0.17	＜1.51±0.05	＜1.51±0.02
군 2	2.91±0.52	2.35±0.52	2.44±0.35	2.67±0.50	2.60±0.49	2.40±0.49	2.48±0.54	2.43±0.54

(* 평균 ± 표준편차 (log₁₀ 단위))

결과: 다음과 같은 표에 기재된 바와 같이, 백신접종시 모체이행 항체의 존재 하에서도, 모든 백신접종자가 백신접종 후 7 내지 180 일에 유의미한 항-PCV-2 ORF2 항체 반응을 나타냈다.

실시예 5 : 헬리코박터 제조 방법

배양: 10 %의 소 태아 혈청 (FBS) 이 보충된 브루셀라균 (Brucella) 배양액으로의 5 내지 10 % 접종물을 사용하는, 글리세롤 스톡에서 박테리아를 배양하였다. 37 ℃에서 약 70 rpm으로 진탕하면서, 3종 기체 (85 %의 N₂, 10 %의 CO₂, 5 %의 O₂) 배양기 내 벤트캡 플라스크 (vented cap flask) 에서 배양하였다. 또한, 접종할 때, 진단 시험으로서 TSA + 5% 양 혈액 (SB) 플레이트를 진단 검사로서 취하여 샘플 순도를 측정하였다. 콜로니의 형태는 점 모양이고 투명했다. 3 내지 4 일 동안 배양기에 놓인 플레이트 상에 용혈이 일부 나타났다. 24 내지 36 시간 동안 배양시켜 OD₆₀₀ ＞ 1로 성장시켰다. 성장된 배양물을 TSA + 5% SB 플레이트 상에 취하고, 카탈라아제 및 우레아제 생성에 관해 시험하였다 (헬리코박터 서도는 2 개 모두에 양성임).

원심분리: OD₆₀₀>1로 성장된 배양물을 무균 원심분리 용기에 나누고, 약 8600 g에서 J10 Beckman 로터로 20 분 동안 7500 rpm으로 원심분리하였다. 상청액을 제거하고 세포 펠렛을 1x 인산-완충 식염수 (PBS) 로 세척하였다. 펠렛을 PBS 중에 재현탁시키고 10 ml 백신 바이알에 나누었다.

동결건조: 안정화제 또는 보존제 없이 36 시간 동안 항원 제조물을 동결건조하였다. 잘 형성된 케이크를 관찰하였다.

펩신 침지 (digestion): 펩신 용액 (0.1%) 을 10 mM HCl에서 제조하고, 여과기를 0.2 마이크론 여과기로 2 회 멸균하였다. 동결건조된 항원 제조물을 25 시간 동안 37 ℃에서 펩신으로 침지시키고 (건조된 세포 질량 1 mg 마다 1 ㎍의 펩신을 첨가했음) 완만하게 진탕하였다. 100 ㎕의 시료를 18 및 25 시간에서 TSA + 5% SB 플레이트 (3종 기체 미호기성 배양기 내에 37 ℃에서 배양됨) 상에 분산시키고; 96 시간 후 성장을 보이지 않았고, 이는 펩신 침지가 비활성 효과를 가진다는 것을 나타낸다.

PBS 중화: 펩신 침지 후 항원 제조물은 pH가 약 2.0이어서, 이를 2:1 부피의 PBS로 중화하였다. pH 중화 후, pH는 약 7.0이었다.

실시예 6: 펩신 또는 포르말린으로 처리된 헬리코박터 서도로 제조된 항원 제조물의 제형물

표 1에 나타낸 바와 같이, 일시적으로 바이알 당 10 ml의 LR2 보조제에 동결건조된 박테리아를 용해시켜 백신을 제형화할 것이다. 값은 제형화 후 각 성분의 농도를 반영한다. LR2 에멀션은 실시예 1에 기재된 LR4 에멀션과 균등하다. LR2 에멀션에서, Lutrol F127의 최종 농도는 0.175 % (w/v) 대신에 0.20 % (w/v) 이다.

[표 1] 백신 제형물

성분	구성성분	성분양, 1 ml 당 mg	성분양, 1회 투여량 (2ml) 당 mg
PBS
	NaCl	2	4
	KCl	0.05	0.1
	Na₂HPO₄	0.2875	0.575
	KH₂PO₄	0.05	0.1
	탈이온 H₂O
펩신 (용액)		3.5 ㎍	7.0 ㎍
	HCl	0.042	0.084
헬리코박터 세포		3.5	7.0

실시예 7: 헬리코박터 서도-기재 백신으로의 백신접종을 위한 동물 및 방법

본 연구에 사용된 동물로 PRRSV 및 마이코플라스마 하이오뉴모니아에가 없는 종래의 돼지를 선택하였다. 종래의 새끼 돼지를 그의 어미와 함께 선택하였다. 모든 돼지의 체중을 기록하였다. 상기 돼지를 체중, 성별 및 태생으로 분류하여 각각 5 마리 이상의 돼지의 2 개의 군으로 나누었다. 모든 돼지를 검사하여 건강 상태를 확인하였다. 임상적으로 건강한 동물만을 본 실험에 포함하였다. 모든 돼지를 동일시하였다. 돼지를 이의 어미와 함께 생후 1 주 및 2 주에 백신접종시켰다. 한 군의 돼지는 백신접종을 하고 나머지 한 군은 백신접종하지 않은 대조군이었다. 백신접종한 동물을 각각 어깨 및 엉덩이에 0.5 ml씩 근육내 경로를 통해 1회 (1회 투여 당 2 ml) 투여시켰다. 백신접종하지 않은 대조군은 어떤 주사도 투여하지 않았다.

생후 3 주에서, 모든 돼지를 이유(離乳)시키고 접종시켰다. 각각의 군을 격리 시설 내 격리 우리에 수용하였다. 돼지를 접종 후 약 28일에 검시하였다. 음성 대조군 돼지를 최종 검시일에 검시하였다. 실험 계획은 표 2에 요약되어 있다.

[표 2] 실험 계획

처리 설명	헬리코박터 접종	접종하지 않음
백신접종 군	5 마리의 돼지
음성 대조군		5 마리의 돼지

접종 과정 및 평가: 임상적으로 중병인 경우에는, 동물의 복지에 필요하다고 여겨지는 치료를 해줄 수 있다. 각각의 동물의 이표 (ear tag) 번호, 병의 날 짜, 추정 진단, 치료 처방 계획 및 동물의 소인을 기록할 것이다. 접종 이후에는 치료하지 않았다. 죽어가거나 상처입은 동물을 안락사시켰다. 건강하지 않은 동물 (임상적 병 또는 상처) 을 본 연구에서 제외할 수 있다.

혈청 및 피부 검사: 백신접종 전, 접종 전 그리고 검시시 전방 대정맥에서 혈액을 채취하였다. 헬리코박터 항체 수준을 결정하였다. 피부 검사를 수행하였다.

결과 요인: 돼지를 도착시, 백신접종 전, 접종 전 그리고 각각의 검시시 체중을 재어 잠재적 체중 증가 또는 감소를 평가하였다.

검시: 돼지를 헬리코박터 접종으로 적응시키고 28 DPI에서 검시하였다.

실시예 8: 헬리코박터 분리물

두 박테리아 분리물 (2662 및 1268) 을 스키로우 (Skirrow) 배지 플레이트 상의 호기성 배양 및 계대 (passage) 에 의해 돼지 위점막에서 회수하였다.

위 부위 (분문 및 유문동), 형태 (그람-음성 (Gram-negative) 이고 짧고 구부러진 "갈매기 날개형" ("gull wing-like") 막대), 우레아제 활성, 래빗 항-Hp 항체에 대한 반응성을 근거로, 두 분리물 모두를 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅 프로파일 (Western blotting profile) 에 기반하여 헬리코박터속으로 나누었고, 분리물 2662가 헬리코박터 필로리와 유사함을 발견하고 "헬리코박터 서도"라는 명칭을 부여했다. 분리물 1268은 분리물 2662와 달리 구별되는 프로파일을 가졌다.

실시예 9: 우레아제 활성에 의해 측정된 박테리아 로드 ( load )

[표 3] 우레아제 활성에 의해 측정된 박테리아 로드

군	위점막에서의 우레아제 활성 없음 약함 중간 강함
백신접종 군	4*	0	2	-
감염 대조군	-	1	3	3

(* 식도의 전체 병변부 (grass lesions pars))

실시예 10: 위 염증성 반응

위 염증성 반응 (표 4) 을, 0, 없음; 1, 적음; 2, 보통; 및 3, 중함의 등급으로, 위의 고유층으로의 소낭 및 림프구 침윤에 대해 "점수"화하였다. 각 돼지에 대한 총 염증 점수를 위분문 및 유문동에서 조직학적 점수의 합으로서 계산하였다. 군 평균점수를 이로부터 계산하였다.

[표 4] 위 염증성 반응

군 번호	평균 총점
백신접종 군	3.6
대조군	4.4

실시예 11: 혈청 반응

[표 5] 혈청 반응

군	6 일	제 1 백신접종	14 일	제 2 백신접종	24 일	40 일
백신접종 군	1.0		1.3		81.0	86.5
감염 대조군	1.0		0.8		1.3	4.5
수이박신 (Suivaxyn) 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 + 헬리코박터 서도	6.9		11.8		99.9	97.3
대조군	9.4		6.6		9.1	9.0

헬리코박터 서도 백신은 우레아제 활성의 강도, 조직 절편 조직학적 맹검평가 및 강한 혈청 반응에 기초한 방어 면역의 양호한 지수를 제공하였다. 수이박신, 마이코플라스마 하이오뉴모니아에 및 헬리코박터 서도를 포함한 조합 백신은 유사한 항체 반응을 나타냈다.

또한, 본 발명은 다음과 같은 번호를 매긴 문단으로 기재된다:

1. 하기를 포함하는 수중유 (O/W) 에멀션:

(2) 비이온성 친유성 에톡시화 지방 알코올;

(3) 광물성 오일;

(4) 에톡시화 지방 알코올, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 (POE-POP 블록 공중합체) 및/또는 이의 임의의 조합의 군으로부터 선택된 비이온성 친수성 계면활성제.

2. 하기를 포함하는 수중유 (O/W) 에멀션:

(2) 에톡시화 지방 알코올, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체 (POE-POP 블록 공중합체) 및/또는 이의 임의의 조합의 군으로부터 선택된 비이온성 친유성 계면활성제;

(3) 광물성 오일;

(4) 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올.

3. 친유성 에톡시화 지방 알코올이 분자량의 약 43 % (w/w) 이하의 에틸렌 옥시드 (EO)를 포함하는 문단 1 또는 2의 에멀션.

4. 친유성 POE-POP 블록 공중합체가 약 35 % (w/w) 이하의 에틸렌 옥시드를 포함하는 문단 2의 에멀션.

5. 친수성 에톡시화 지방 알코올이 약 43 % (w/w) 초과의 에틸렌 옥시드 (EO)를 포함하는 문단 2의 에멀션.

6. 친수성 POE-POP 블록 공중합체가 약 55 % (w/w) 이상의 에틸렌 옥시드를 포함하는 문단 1의 에멀션.

7. 에톡시화 지방 알코올이 탄소수 9 내지 22의 지방 알코올이고, 유리하게는 올레일, 세틸, 스테아릴, 이소스테아릴, 라우릴 알코올 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 유리하게는 올레일 알코올이고, 더욱 유리하게는 EO가 1 내지 4 개인 에톡시화 올레일 알코올인 문단 3의 에멀션.

8. 에톡시화 지방 알코올이 탄소수 9 내지 22의 지방 알코올이고, 유리하게는 올레일, 세틸, 스테아릴, 이소스테아릴, 라우릴 알코올 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 유리하게는 올레일 알코올이고, 더욱 유리하게는 EO가 5 내지 21 개인 에톡시화 올레일 알코올인 문단 5의 에멀션.

9. POE-POP 블록 공중합체의 MW가 약 1000 내지 약 8000인 문단 4의 에멀션.

10. POE-POP 블록 공중합체의 MW가 약 3000 내지 약 16000인 문단 6의 에멀션.

11. 비이온성 친수성 계면활성제가 에톡시화 지방 알코올인 문단 1 내지 10 중 어느 한 문단의 에멀션.

12. 에톡시화 지방 알코올이 Brij^? 76, Brij^? 56, Brij^? 96/97, Brij^? 98, Brij^? 721, Brij^? 58, Brij^? 35, Brij^? 78 (Uniqema), Volpo^? N5, Volpo^? CS6, Volpo^? CS12, Volpo^? CS20, Volpo^? CS25, Volpo^? CS23 (Croda), BL9-EX, BC-7, BT-5, BT-7, BT-9, BT-12, BD-10, BO-7V, BC5.5, BT-5, BL-21, BL-25, BC-15TX, BC-23, BC-25TX, BO-15V, BO-50V, BB-20 (Nikko Chemicals) 또는 이의 임의의 조합인 문단 11의 에멀션.

13. 비이온성 친수성 계면활성제가 POE-POP 블록 공중합체인 문단 1 내지 12 중 어느 한 문단의 에멀션.

14. POE-POP 블록 공중합체가 Lutrol^? F127 [폴록사머 407], Lutrol^? F68 [폴록사머 188], Lutrol^? F108 [폴록사머 338], Lutrol^? F98 [폴록사머 278], Lutrol^? F87 [폴록사머 227], Lutrol^? F88 [폴록사머 228], Lutrol^? F77 [폴록사머 207], Lutrol^? F38 [폴록사머 108] (BASF), Tetronics^?T1307, Tetronics^?T1107, Tetronics^?T908 (BASF) 또는 이의 임의의 조합인 문단 13의 에멀션.

15. 비이온성 친유성 계면활성제가 에톡시화 지방 알코올인 문단 1 내지 14 중 어느 한 문단의 에멀션.

16. 에톡시화 지방 알코올이 Brij^? 30, Brij^? 92/93, Brij^? 72, Brij^? 52 (Uniqema), Volpo^? L3, Volpo^? N3, Volpo^? L4 (Croda), BS-4, BD-2, BD-4, BT-3 (Nikko Chemicals) 또는 이의 임의의 조합인 문단 15의 에멀션.

17. 비이온성 친유성 계면활성제가 POE-POP 블록 공중합체인 문단 1 내지 16 중 어느 한 문단의 에멀션.

18. POE-POP 블록 공중합체가 Pluronic^? L121 [폴록사머 401], Pluronic^? L101 [폴록사머 331], Pluronic^? L81 [폴록사머 221], Pluronic^? L62 [폴록사머 182], Pluronic^? L43 [폴록사머 123], Pluronic^? P103 [폴록사머 333], Pluronic^? L123 [폴록사머 403], Lutrol^? L63 [폴록사머 183], Lutrol^? P122 [폴록사머 402], Lutrol^? L92 [폴록사머 272], Lutrol^? L72 [폴록사머 202], Lutrol^? L42 [폴록사머 122], Lutrol^? L61 [폴록사머 181] (BASF), Tetronics^?T1301, Tetronics^?T701, Tetronics^?T901 (BASF) 또는 이의 임의의 조합인 문단 17의 에멀션.

19. 계면 활성제의 총 농도가, 에멀션의 부피 당 중량으로, 약 0.2 % 내지 약 6.5 %, 특히 약 1 % 내지 약 6 %, 유리하게는 약 1.5 % 내지 약 5 %, 더욱 유리하게는 약 2 % 내지 약 3 %인 문단 1 내지 18 중 어느 한 문단의 에멀션.

20. 하기를 포함하는 수중유 (O/W) 에멀션:

(2) 비이온성 친유성 에톡시화 지방 알코올;

(3) 광물성 오일;

(4) 약 43 % 초과 및 약 71 % (w/w) 미만의 에틸렌 옥시드 (EO) 를 포함한 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올;

(5) 약 71 % (w/w) 이상의 에틸렌 옥시드 (EO) 를 포함한 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올.

21. 약 43 % 초과 및 약 71 % (w/w) 미만의 에틸렌 옥시드 (EO) 를 포함한 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올이 EO가 5 내지 14 개인 에톡시화 올레일 알코올인 문단 20의 에멀션.

22. 약 71 % (w/w) 이상의 에틸렌 옥시드 (EO) 를 포함한 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올이 EO가 15 개 이상인 에톡시화 올레일 알코올인 문단 20 또는 21의 에멀션.

23. 약 43 % 초과 및 약 71 % (w/w) 미만의 에틸렌 옥시드를 포함한 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올의 농도가 약 1.0 % 내지 약 5.0 %, 특히 약 1.5 % 내지 약 4.5 %, 더욱 유리하게는 약 2.0 % 내지 약 3.5 % (백분율은 에멀션의 부피에 대한 중량 (w/v) 으로 나타냄) 인 문단 20 내지 22 중 어느 한 문단의 에멀션.

24. 약 71 % (w/w) 이상의 에틸렌 옥시드 (EO) 를 포함한 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올의 농도가 약 0.01 % 내지 약 3.0 %, 특히 약 0.05 % 내지 약 2.5 %, 더욱 유리하게는 약 0.1 % 내지 약 2.0 % (w/v) 인 문단 20 내지 23 중 어느 한 문단의 에멀션.

25. 비이온성 친유성 에톡시화 지방 알코올의 농도가 약 0.1 % 내지 약 2.5 %, 특히 약 0.2 % 내지 약 2.0 %, 유리하게는 약 0.2 % 내지 약 1.5 %, 더욱 유리하게는 약 0.2 % 내지 약 1.2 % (w/v) 인 문단 20 내지 24 중 어느 한 문단의 에멀션.

26. 하기를 포함하는 수중유 (O/W) 에멀션:

(2) 비이온성 친유성 에톡시화 지방 알코올;

(3) 광물성 오일;

(4) 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올;

27. 친수성 에톡시화 지방 알코올이 유리하게는 약 43 % 초과 및 약 71 % (w/w) 미만의 에틸렌 옥시드를 포함한 에톡시화 지방 알코올인 문단 26의 에멀션.

28. 지방 알코올이 EO가 5 내지 14 개인 에톡시화 올레일 알코올인 문단 27의 에멀션.

29. 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올의 농도가 약 1.0 % 내지 약 5.0 %, 특히 약 1.5 % 내지 약 4.5 %, 더욱 유리하게는 약 2.0 % 내지 약 3.5 % (백분율은 에멀션의 부피에 대한 중량 (w/v) 으로 나타냄) 인 문단 26 내지 28 중 어느 한 문단의 에멀션.

30. 비이온성 친수성 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체의 농도가 약 0.01 % 내지 약 2.0 %, 더욱 특히 약 0.1 % 내지 약 1.5 % (w/v) 인 문단 26 내지 29 중 어느 한 문단의 에멀션.

31. 비이온성 친유성 에톡시화 지방 알코올의 농도가 약 0.1 % 내지 약 2.5 %, 특히 약 0.2 % 내지 약 2.0 %, 유리하게는 약 0.2 % 내지 약 1.5 %, 더욱 유리하게는 약 0.2 % 내지 약 1.2 % (w/v) 인 문단 26 내지 30 중 어느 한 문단의 에멀션.

32. 에멀션의 상전이 온도 (PIT) 가 25 ℃ 이상인 문단 1 내지 31 중 어느 한 문단의 에멀션.

33. PIT가 약 28 ℃ 내지 약 65 ℃, 더욱 특히 약 33 ℃ 내지 약 60 ℃인 문단 32의 에멀션.

34. 에멀션이, 에멀션의 부피 당 부피로 (v/v), 약 2 % 내지 약 50 %의 오일(들) 및 계면활성제를 포함한 오일상, 특히 약 4 % 내지 약 40 %, 유리하게는 약 8 % 내지 약 35 %, 더욱 유리하게는 약 15 % 내지 약 30 %의 오일상을 포함하는 문단 1 내지 33 중 어느 한 문단의 에멀션.

35. 오일이 광물성 오일인 문단 34의 에멀션.

36. 광물성 오일이 이소파라핀 오일 및/또는 나프텐 오일과 같은 파라핀 오일, 스쿠알란, 스쿠알렌, 프리스탄, 폴리이소부텐, 수소화 폴리이소부텐, 폴리데센, 폴리이소프렌, 폴리이소프로펜 등인 문단 35의 에멀션.

37. 광물성 오일이 탄소수 15 초과, 유리하게는 15 내지 32이고 방향족 화합물이 없는 선형 또는 분지형 탄소 사슬을 포함하는 문단 34 또는 35의 에멀션.

38. 오일이 MARCOL^? 52 또는 MARCOL^? 82 (Esso,) 또는 "DRAKEOL^? 6VR" (Penreco,) 이라는 명칭 하에 시판되는 문단 37의 에멀션.

39. 오일이 임의의 비율로 2 이상의 오일을 포함한 오일의 혼합물인 문단 34 내지 38 중 어느 한 문단의 에멀션.

40. 오일의 혼합물이 하나 이상의 식물성 오일을 포함하는 문단 39의 에멀션.

41. 식물성 오일이 오일상의 약 0.1 % 내지 약 33 %, 유리하게는 약 5 % 내지 약 15 % v/v 를 나타내는 문단 40의 에멀션.

42. 식물성 오일이 땅콩 오일, 견과 오일, 해바라기 오일, 홍화 오일, 대두 오일, 달맞이꽃 오일 등인 문단 40 또는 41의 에멀션.

43. 파라핀 오일; 비이온성 친유성 계면활성제로서 EO가 2 내지 3 개인 에톡시화 올레일 알코올; 비이온성 친수성 계면활성제로서 EO가 5 내지 6 개인 에톡시화 올레일 알코올; 및 비이온성 친수성 계면활성제로서 EO가 약 70 내지 80 %이고 MW가 약 9800 내지 16000인 POE-POP 블록 공중합체를 포함하는 에멀션.

44. 파라핀 오일의 농도가 약 5 % 내지 약 50 %, 유리하게는 약 15 % 내지 약 30 % (v/v) 이고; EO가 2 내지 3인 에톡시화 올레일 알코올의 농도가 0.1 % 내지 1.5 %, 유리하게는 0.1 % 내지 1.2 % (w/v) 이고; EO가 5 내지 6 개인 에톡시화 올레일 알코올의 농도가 1 % 내지 5 %, 유리하게는 1 % 내지 4 % (w/v) 이며; EO가 약 70 내지 80 %이고 MW가 약 9800 내지 16000인 POE-POP 블록 공중합체의 농도가 0.01 % 내지 2 %, 유리하게는 0.05 % 내지 1.5 % (w/v) 인 문단 43의 에멀션.

45. 파라핀 오일; 비이온성 친유성 계면활성제로서 EO가 2 내지 3 개인 에톡시화 올레일 알코올; 비이온성 친수성 계면활성제로서 EO가 10 개인 에톡시화 올레일 알코올; 및 비이온성 친수성 계면활성제로서 EO가 약 70 내지 80 %이고 MW가 약 9800 내지 16000인 POE-POP 블록 공중합체를 포함하는 에멀션.

46. 파라핀 오일의 농도가 5 % 내지 50 %, 유리하게는 15 % 내지 30 % (v/v)이고; EO가 2 내지 3 개인 에톡시화 올레일 알코올의 농도가 0.2 % 내지 3 %, 유리하게는 0.5 % 내지 3 % (w/v) 이고; EO가 10 개인 에톡시화 올레일 알코올의 농도가 0.2 % 내지 3 %, 유리하게는 0.5 % 내지 3 % (w/v) 이며; EO가 약 70 내지 80 %이고 MW가 약 9800 내지 16000인 POE-POP 블록 공중합체의 농도가 0.01 % 내지 2 %, 유리하게는 0.05 % 내지 1.5 % (w/v)인 문단 45의 에멀션.

47. 파라핀 오일, 비이온성 친유성 계면활성제로서 EO가 2 내지 3 개인 에톡시화 올레일 알코올 및 비이온성 친수성 계면활성제로서 EO가 5 내지 6 개인 에톡시화 올레일 알코올을 포함하는 에멀션.

48. 파라핀 오일의 농도가 5 % 내지 50 %, 유리하게는 15 % 내지 35 % (v/v) 이고; EO가 2 내지 3 개인 에톡시화 올레일 알코올의 농도가 0.1 % 내지 3 %, 유리하게는 0.5 % 내지 2 % (w/v) 이며; EO가 5 내지 6 개인 에톡시화 올레일 알코올의 농도가 1 % 내지 5 %, 유리하게는 2.0 % 내지 4.5 % (w/v) 인 문단 47의 에멀션.

49. 숙주 내에서 면역 반응을 유도할 수 있는 백신 항원 또는 면역원과 문단 1 내지 48 중 어느 한 문단의 에멀션을 혼합하는 것을 포함하는 백신 조성물 제조 방법.

50. 문단 1 내지 48 중 어느 한 문단의 에멀션 또는 문단 49의 백신 조성물을 숙주에게 투여하는 것을 포함하는 숙주 내에서 면역 반응을 유도하는 방법.

51. 문단 1 내지 48 중 어느 한 문단의 에멀션 또는 문단 49의 백신 조성물을 포함한, 문단 49 또는 50의 방법을 수행하기 위한 키트 및 상기 방법을 수행하기 위한 설명.

본 발명의 유리한 구현예를 이와 같이 상세히 기재하였고, 상기 문단의 다수의 자명한 변형이 본 발명의 정신 또는 범주에 벗어나지 않으면서 가능한 경우, 상기 문단으로 정의된 본 발명은 전술된 특정 상세한 설명에 제한되지 않는다고 이해될 것이다.

Claims

하기를 포함하는 수중유 (oil-in-water) (O/W) 에멀션:

(1) 비활성 바이러스 및 박테리아에서 선택되는, 숙주 내에서 면역 반응을 유도할 수 있는 백신 항원 또는 면역원을 함유한 수용액;

(2) 비이온성 친유성 에톡시화 지방 알코올;

(3) 광물성 오일;

(4) 에톡시화 지방 알코올인 비이온성 친수성 계면활성제;

상기 계면활성제의 총 농도가, 에멀션의 부피 당 중량으로, 0.2 % 내지 6.5 % 이고,

상기 에멀션은, 에멀션의 부피 당 부피 (v/v) 로, 2 % 내지 50 % 의, 오일 및 계면활성제를 포함한 오일상을 포함함.
제 1 항에 있어서,

친유성 에톡시화 지방 알코올이 분자량의 0 % 내지 43 % (w/w) 의 에틸렌 옥시드 (EO) 를 포함하거나;

친유성 에톡시화 지방 알코올이 분자량의 0 % 내지 43 % (w/w) 의 에틸렌 옥시드 (EO) 를 포함하고, 에톡시화 지방 알코올이 올레일, 세틸, 스테아릴, 이소스테아릴, 라우릴 알코올 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소수 9 내지 22 의 지방 알코올이거나;

친수성 에톡시화 지방 알코올이 43 % 내지 100 % (w/w) 의 에틸렌 옥시드를 포함하거나;

친수성 에톡시화 지방 알코올이 43 % 내지 100 % (w/w) 의 에틸렌 옥시드를 포함하고, 에톡시화 지방 알코올이 올레일, 세틸, 스테아릴, 이소스테아릴, 라우릴 알코올 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소수 9 내지 22 의 지방 알코올이거나;

비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올이 스테아레트-10, 세테트-10, 올레트-10, 올레트-20, 스테아레트-21, 세테트-20, 라우레트-23, 스테아레트-20, 올레트-5, 세테아레트-6, 세테아레트-12, 세테아레트-20, 세테아레트-25, 세테아레트-23, 라우레트-9, 세테트-7, C12-14 파레트-5, C12-14 파레트-7, C12-14 파레트-9, C12-14 파레트-12, C12-15 파레트-10, 올레트-7, 세테트-6, 라우레트-21, 라우레트-25, 세테트-15, 세테트-23, 세테트-25, 올레트-15, 올레트-50, 베헤네트-20 또는 이의 조합이거나;

비이온성 친유성 에톡시화 지방 알코올이 라우레트-4, 올레트-2, 스테아레트-2, 세테트-2, C12-13 파레트-3, 올레트-3, C12-13 파레트-4, 스테아레트-4, C12-15 파레트-2, C12-15 파레트-4, C12-14 파레트-3 또는 이의 조합이거나;

계면활성제의 총 농도가, 에멀션의 부피 당 중량으로, 1 % 내지 6 % 인 에멀션.
제 2 항에 있어서, 지방 알코올이 올레일 알코올이고, 계면활성제의 총 농도가, 에멀션의 부피 당 중량으로, 1.5 % 내지 5 % 인 에멀션.
제 2 항에 있어서, 지방 알코올이 EO 가 1 내지 4 개인 에톡시화 올레일 알코올이고, 계면활성제의 총 농도가, 에멀션의 부피 당 중량으로, 2 % 내지 3 % 인 에멀션.
제 1 항에 있어서, 지방 알코올이 EO 가 5 내지 21 개인 에톡시화 올레일 알코올인 에멀션.
제 1 항에 있어서, 비이온성 친수성 계면활성제가 43 % 내지 71 % (w/w) 의 에틸렌 옥시드 (EO) 를 포함한 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올 및 71 % 내지 100 % (w/w) 의 에틸렌 옥시드 (EO) 를 포함한 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올을 포함하는 에멀션.
제 6 항에 있어서,

43 % 내지 71 % (w/w) 의 에틸렌 옥시드 (EO) 를 포함한 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올이 EO 가 5 내지 14 개인 에톡시화 올레일 알코올이거나;

71 % 내지 100 % (w/w) 의 에틸렌 옥시드 (EO) 를 포함한 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올이 EO 가 15 개 이상인 에톡시화 올레일 알코올이거나;

43 % 내지 71 % (w/w) 의 에틸렌 옥시드 (EO) 를 포함한 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올의 농도가 1.0 % 내지 5.0 % (백분율은 에멀션의 부피에 대한 중량 (w/v) 으로 나타냄) 이거나;

71 % 내지 100 % (w/w) 의 에틸렌 옥시드 (EO) 를 포함한 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올의 농도가 0.01 % 내지 3.0 % (w/v) 이거나;

비이온성 친유성 에톡시화 지방 알코올의 농도가 0.1 % 내지 2.5 % (w/v) 인 에멀션.
제 7 항에 있어서, 43 % 내지 71 % (w/w) 의 에틸렌 옥시드를 포함한 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올의 농도가 1.5 % 내지 4.5 % (w/v) 인 에멀션.
제 8 항에 있어서, 43 % 내지 71 % (w/w) 의 에틸렌 옥시드를 포함한 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올의 농도가 2.0 % 내지 3.5 % (w/v) 인 에멀션.
제 7 항에 있어서, 71 % 내지 100 % (w/w) 의 에틸렌 옥시드를 포함한 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올의 농도가 0.05 % 내지 2.5 % (w/v) 인 에멀션.
제 10 항에 있어서, 71 % 내지 100 % (w/w) 의 에틸렌 옥시드를 포함한 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알코올의 농도가 0.1 % 내지 2.0 % (w/v) 인 에멀션.
제 7 항에 있어서, 비이온성 친유성 에톡시화 지방 알코올의 농도가 0.2 % 내지 2.0 % (w/v) 인 에멀션.
제 12 항에 있어서, 비이온성 친유성 에톡시화 지방 알코올의 농도가 0.2 % 내지 1.5 % (w/v) 인 에멀션.
제 13 항에 있어서, 비이온성 친유성 에톡시화 지방 알코올의 농도가 0.2 % 내지 1.2 % (w/v) 인 에멀션.
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